HOLOTYPE HLA™ Δ A1 CE/A2 CE/A3 CE/A4 CE ΟCE+User+Manuals+in... · 0086 Προετοιμάζει...

0086ΠροετοιμάζειDNAγιαανάλυσηαλληλούχισηςστοIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™24/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗA1&CE/A2

&CE/A3&CE/A4&CEΟΔΗΓΙΕΣΧΡΗΣΗΣ

ΕΚΔΟΣΗΣ12018/05/02

Γιαinvitroδιαγνωστικήχρήση

OmixonHolotype24/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗ|A1&CE/A2&CE/A3&CE/A4&CE|Οδηγίεςχρήσηςv1.Γιαinvitroδιαγνωστικήχρήση.Copyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Εμπιστευτικόκαιαποκλειστικήςκυριότητας

Σελίδα2│52

ΠίνακαςπεριεχομένωνΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ..................................................................................................................7

ΥΠΟΜΝΗΜΑΣΥΜΒΟΛΩΝ..........................................................................................................................7

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑΤΟΥΚΙΤHOLOTYPEHLA-24/11ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗA1&CE/A2&CE/A3&CE/A4&CE.............8

ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣΤΟΙΧΕΙΟΥΕΚΚΙΝΗΤΗ.....................................................................................................................................8ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑΣΤΟΙΧΕΙΟΥΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ..................................................................................9ΠΛΑΚΑΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΩΝ96ΠΗΓΑΔΙΩΝ.............................................................................................................................9ΒΙΒΛΙΟΕΡΓΑΣΙΑΣEXCEL................................................................................................................................................10ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ–OMIXONHLATWIN.................................................................................................................................10

ΑΠΟΣΤΟΛΗΚΑΙΦΥΛΑΞΗ..........................................................................................................................10

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣΚΑΙΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ......................................................................................................10

ΓΝΩΣΤΟΙΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙΤΟΥΠΡΟΪΟΝΤΟΣ...........................................................................................................................11

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣΑΣΦΑΛΕΙΑΣ......................................................................................................................11

ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙΑΠΟΔΟΣΗΣ.........................................................................................................................11

ΤΕΧΝΙΚΗΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ..............................................................................................................................12

Τηλεφωνικήεξυπηρέτηση:..............................................................................................................................12

ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ,ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑΚΑΙΑΝΑΛΩΣΙΜΑ.....................................................................................13

ΤΕΧΝΙΚΕΣΣΥΣΤΑΣΕΙΣΚΑΙΣΥΣΤΑΣΕΙΣΣΧΕΤΙΚΑΜΕΤΟΝΕΞΟΠΛΙΣΜΟ..........................................................................................13ΣΥΣΤΑΣΕΙΣΣΧΕΤΙΚΑΜΕΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ............................................................................................................13

ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq..............................................................................................................14ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΑΑΝΑΛΩΣΙΜΑ..........................................................................................................................................14

ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗΝΟΜΙΚΟΥΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ................................................................................................15

ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗΧΡΗΣΗ.........................................................................................................................15

ΣΗΜΑΝΤΙΚΗΣΗΜΕΙΩΣΗΠΡΙΝΑΠΟΤΗΝΕΝΑΡΞΗ......................................................................................16

ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΗΑΠΟΜΟΝΩΣΗΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥDNA........................................................................................................16

ΑΡΧΗΤΗΣΜΕΘΟΔΟΥ...............................................................................................................................17

ΣΥΝΟΨΗΤΩΝΒΗΜΑΤΩΝ.........................................................................................................................18

ΓΛΩΣΣΑΡΙ/ΟΡΙΣΜΟΙ..................................................................................................................................19

ΒΗΜΑ1–ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΚΥΡΙΟΥΜΕΙΓΜΑΤΟΣΕΝΙΣΧΥΣΗΣHLA..............................................................20

ΛΙΣΤΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ...............................................................................................................................................20ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................................................20

Κύριομείγμα:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1...........................................................21Κύριομείγμα:HLA-DRB4..................................................................................................................................21Κύριομείγμα:HLA-DQB1Σετ3........................................................................................................................21

ΒΗΜΑ2–ΕΝΙΣΧΥΣΗHLAΤΑΞΗΣIΚΑΙII....................................................................................................23


ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1...............24ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-DQB1σετ3.......................................................................................24ΕνίσχυσηΤάξηςI(HLA-A,BκαιC)....................................................................................................................24


Σελίδα3│52

ΕνίσχυσηΤάξηςII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1καιDQB1).........................................25Αναμενόμεναμεγέθηαμπλικονίων.................................................................................................................25

ΒΗΜΑ3–ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΚΑΙΚΑΝΟΝΙΚΟΠΟΙΗΣΗΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ(ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟΠΛΑΚΑΣ).....................................................................................................................26


Ομαδοποίησηαμπλικονίων.............................................................................................................................28ΚαθαρισμόςPCRExoSAP-ITExpress.................................................................................................................28

ΒΗΜΑ4–ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ.................................................................................................30


Κύριομείγμακατακερματισμού......................................................................................................................31Πρόγραμμακατακερματισμού........................................................................................................................31Κύριομείγμαεπιδιόρθωσηςάκρων................................................................................................................32Πρόγραμμαεπιδιόρθωσηςάκρων...................................................................................................................32Κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάση..................................................................................................................33Πρόγραμμασύνδεσηςμελιγάση.....................................................................................................................34Ομαδοποίησηκαικαθαρισμόςβιβλιοθήκης...................................................................................................34

ΒΗΜΑ5–ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΕΠΙΛΕΓΜΕΝΟΥΜΕΓΕΘΟΥΣ..................................................................................36


ΒΗΜΑ6–ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣΜΕΤΟΟΡΓΑΝΟQPCR.........................................37


ΜείγμαεκκινητήqPCR.....................................................................................................................................37ΚύριομείγμαqPCR...........................................................................................................................................38

ΒΗΜΑ7–ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣΤΟILLUMINAMISEQ.......................................................................................40

ΛΙΣΤΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ...............................................................................................................................................40ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq..............................................................................................................40

ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................................................40

ΒΗΜΑ8–ΑΝΑΛΥΣΗΤΩΝΔΕΔΟΜΕΝΩΝΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣHLA..................................................................42

ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ............................................................................................................................42ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................42Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................42

ΜΗΑΥΤΟΜΑΤΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΔΙΑΚΟΜΙΣΤΗ.....................................................................................................................42ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................42Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................42

ΜΗΑΥΤΟΜΑΤΟΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ.....................................................................................................................43ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT............................................................................................................................43Πρωτόκολλοανάανάλυση..............................................................................................................................43

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣΕΙΚΟΝΕΣ..................................................................................................................44

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣΓΙΑΤΗΝΠΛΑΚΑΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ,ΠΛΑΚΑΕΝΙΣΧΥΣΗΣ,ΠΛΑΚΑΑΡΑΙΩΣΗΣ,ΠΛΑΚΑΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ(ΓΙΑΕΝΑΓΕΝΕΤΙΚΟΤΟΠΟ)ΚΑΙΠΛΑΚΑΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ........................................................................................44ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΠΡΟΤΥΠΩΝ............................................................................................44ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣQPCRΠΟΣΟΤΙΚΟΥΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣKAPA......................................................................45


Σελίδα4│52

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ1:PIPPINPREP....................................................................................................................46

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣΤΟΥPIPPINPREP...........................................................................................................................46ΕΚΤΕΛΕΣΗΤΟΥPIPPINPREP..........................................................................................................................................46

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ2:ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝΜΕΤΟΟΡΓΑΝΟQPCR.............................49


ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ3:ΠΟΣΟΤΙΚΟΣΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣΜΕΧΡΗΣΗΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΗΣΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑΣΧΡΩΣΤΙΚΗΣDSDNA...........................................................................................................51



Σελίδα5│52

Ιστορικόεγγράφου–Σημαντικέςσημειώσειςκαιενημερώσεις

Έκδοση Ημερομηνία Συντάκτης Σύνοψηαλλαγών Εγκρίθηκεαπό Hμερομηνίαέκδοσης

V1 29/11/2017 TündeVágó πρώτηέκδοση EfiMelista 02/05/2018


Σελίδα6│52

Δήλωσηαποποίησηςευθυνών

Η Omixon έχει καταβάλλει κάθε προσπάθεια, ώστε οι παρούσες Οδηγίες χρήσης να είναιακριβείς. Η Omixon δεν φέρει καμία ευθύνη για τυχόν ανακρίβειες ή παραλείψεις πουενδεχομένωςέχουνπροκύψει.ΟιπληροφορίεςστιςπαρούσεςΟδηγίες χρήσηςυπόκεινταισεαλλαγήχωρίςπροειδοποίηση.ΗOmixonδεναναλαμβάνεικαμίαευθύνηγιατυχόνανακρίβειεςπουενδέχεταιναπεριλαμβάνονταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.

ΗOmixonδιατηρείτοδικαίωμαναβελτιώνειτιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσηςή/καιταπροϊόνταπουπεριγράφονταισεαυτές,ανάπάσαστιγμή,χωρίςπροειδοποίηση.

Σε περίπτωση που εντοπίσετε πληροφορίες στο παρόν εγχειρίδιο που είναι εσφαλμένες,παραπλανητικέςήελλιπείς,θαεκτιμούσαμετασχόλιακαιτιςπροτάσειςσας.Μπορείτενατιςστείλετεστηδιεύθυνση[email protected].


Σελίδα7│52

ΠληροφορίεςκατασκευαστήΌνομαεταιρείας:OmixonBiocomputingLtd

Διεύθυνσηεπίσκεψης:Fehérváriút50-52/6

Πόλη:Βουδαπέστη

Τ.Κ.:H-1117

Χώρα:Ουγγαρία

Υπόμνημασυμβόλων

Αριθμόςπαρτίδας

Αριθμόςαναφοράς/καταλόγου

ΣυμβουλευτείτετιςΟδηγίεςχρήσης

Περιέχει αντιδραστήριο για Ν αριθμόεξετάσεων

Νόμιμοςκατασκευαστής.Ηημερομηνίασεσυνδυασμόμεαυτότοσύμβολοαναφέρεταιστηνημερομηνίακατασκευής

Συνιστώμενηθερμοκρασίαφύλαξης

Ημερομηνίαλήξης

Invitroδιαγνωστικήιατροτεχνολογικήσυσκευή

ΠεριέχειανταλλακτικόΑνταλλακτικό


Σελίδα8│52

ΠεριεχόμενατουκιτHolotypeHLA-24/11ΔιαμόρφωσηA1&CE/A2&CE/A3&CE/A4&CEΗ ενότητα αυτή περιγράφει τα περιεχόμενα των διάφορων διαθέσιμων διαμορφώσεων τουπροϊόντοςHolotypeHLA24/11ωςεξής:

Τύποςπροϊόντος ΑΡ.ΑΝΑΦ. ΑντιδράσειςHolotypeHLA24/11ΔιαμόρφωσηA1&CE

H52 24

HolotypeHLA24/11ΔιαμόρφωσηA2&CE

H56 24


H59 24


H53 24

ΛάβετευπόψηότιησυσκευασίαΣτοιχείουεκκινητήκαιησυσκευασίαΣτοιχείουαντιδραστηρίωνπροετοιμασίας βιβλιοθήκης είναι ίδιες σε κάθε διαμόρφωση προϊόντος. Το στοιχείο Πλάκαςπροσαρμοστών96πηγαδιώνμεδείκτεςδιαφέρειωςπρος τοεπίπεδοαλληλουχίαςδείκτησεκάθεδιαμόρφωση.ΑνατρέξτεστηνΕνότητα«Πλάκαπροσαρμοστών96πηγαδιών»παρακάτωγιαπερισσότερεςπληροφορίες.

ΣυσκευασίαστοιχείουεκκινητήΗσυσκευασίαστοιχείουεκκινητήπαρέχεισυγκεκριμένα,έτοιμαγιαχρήση,διαλύματαεκκινητήγιαστοχευμένηενίσχυσηPCRμεγάλουεύρουςτωνγονιδίωνHLAA,B,C,DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4καιDRB5.Επιπλέον,περιέχειδύοτύπουςπρόσθετωνPCR(Ενισχυτή1καιΕνισχυτή2).

Μείγμαεκκινητή ΑΡ.ΑΝΑΦ.

Αντιδράσεις

Όγκος/σωληνάριο

Αρ.σωληναρίων

Χρωματικόςκώδικας

HLA-A P013 24 60μL 1 ΚίτρινοHLA-B P023 24 60μL 1 ΚόκκινοHLA-C P033 24 60μL 1 ΠορτοκαλίHLA-DRB1/DRB3 P043.1 24 60μL 1 ΠράσινοHLA-DRB4 P103 24 60μL 1 ΛευκόHLA-DRB5 P113 24 60μL 1 ΡοζHLA-DPA1 P133 24 60μL 1 ΜαύροHLA-DPB1 P073 24 60μL 1 ΜοβHLA-DQA1 P083 24 60μL 1 ΚαφέHLA-DQB1(Σετ3) P123 24 60μL 1 ΜπλεΕνισχυτής1 E01 96 1100μL 1 ΔιαφανέςΕνισχυτής2 E02 96 300μL 1 Διαφανές


Σελίδα9│52

ΣυσκευασίαστοιχείουαντιδραστηρίωνπροετοιμασίαςβιβλιοθήκηςΗ συσκευασία στοιχείου προετοιμασίας βιβλιοθήκης περιέχει αντιδραστήρια για τηνπροετοιμασία βιβλιοθήκης (κατακερματισμός, άμβλυνση και αδενυλίωση των άκρων τωναμπλικονίωνκαισύνδεσημελιγάσητωναλληλουχιώνπροσαρμοστώνμεδείκτεςσεαυτά)απόαμπλικόνιαHLA.

Αντιδραστήριο ΑΡ.ΑΝΑΦ.

Αντιδράσεις

Όγκος/σωληνάριο

Αρ.σωλη-ναρίων


Ένζυμοκατακερματισμού(Α) R12 24 70μL 1 ΚίτρινοΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β)

R22 24 70μL 1 Κόκκινο

Ένζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) R32 24 41μL 1 ΠράσινοΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ)

R42 24 82μL 1 Πορτοκαλί

Ένζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) R52 24 81μL 1 ΜπλεΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ)

R62 24 900μL 2 Μαύρο

Πλάκαπροσαρμοστών96πηγαδιώνΤο στοιχείο της πλάκας προσαρμοστών 96 πηγαδιώνμε δείκτες περιέχει έτοιμους για χρήσηπροσαρμοστέςNGSμεδείκτες(ολιγονουκλεοτίδιαDNAδιπλήςέλικας)σεδιάλυμα5μLγιατηδημιουργίαμεμονωμένωνβιβλιοθηκώνNGS.Ηπλάκαπροσαρμοστών96πηγαδιώνμεδείκτεςπεριέχειεπαρκείςπροσαρμοστέςμεδείκτεςγιατηδημιουργία24μεμονωμένωνβιβλιοθηκώνNGSκαιγιααναγνώρισηδείγματοςκαθοδικά.

Τύποςπροϊόντος Αντίστοιχοαντιδραστήριο

ΑΡ.ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Όγκος/

πηγάδιΑρ.

πλακώνHolotypeHLA24/11ΔιαμόρφωσηA1&CE(ΑΝΑΦ:H52)

ΠλάκαπροσαρμοστώνΑ1(i1-24)

N4 24 5μL 1

HolotypeHLA24/11ΔιαμόρφωσηA2&CE(ΑΝΑΦ:H56)


N7 24 5μL 1



N8 24 5μL 1



N9 24 5μL 1


Σελίδα10│52

ΒιβλίοεργασίαςExcelΔιατίθεταιέναβιβλίοεργασίαςExcelγιατηνυποστήριξητουπρωτοκόλλουHolotypeHLA24/11,με υπολογισμούς, διατάξεις πλακών, καταγραφή στοιχείων, δημιουργία φύλλου δείγματοςMiSeq και πολλά άλλα. Εφόσον επιθυμείτε ένα αντίγραφο, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση[email protected].

Λογισμικό–OmixonHLATwinΕπικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]γιατιςπιστωτικέςμονάδεςτουOmixonHLATwinπουαντιστοιχούνστηναγοράτουκιτHolotypeHLA24/11.

Σημαντικήσημείωση:ΧρησιμοποιείτεκαιτατρίαστοιχείατουκιτOmixonHolotypeHLA24/11καιτολογισμικόOmixonHLA Twin στην ίδια ροή εργασιών με σκοπό τη δημιουργία μιας ροής εργασιών για in vitroδιαγνωστική χρήση. Ανατρέξτε στην Ενότητα «Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις» για τουςπεριορισμούςχρήσηςτουπροϊόντος.

Ανταλλακτικάδιατίθενταιέπειτααπόειδικήαίτηση τουχρήστη.ΛάβετευπόψηότιηOmixonπαρέχει ανταλλακτικά για τις συσκευασίες των στοιχείων, όχι για μεμονωμένα φιαλίδια.Επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]γιαπερισσότερεςπληροφορίες.

ΑποστολήκαιφύλαξηΑποστέλλονται πάνω συσκευασίες ξηρού πάγου, σε κουτί μεταφοράς από Styrofoam, ενώπρέπεινααποθηκεύονταιστους-20°Cκατάτηνάφιξη.Επικυρώστετηδιαδικασίαελέγχουκαιπαρακολούθησης της θερμοκρασίας των καταψυκτών σας και εκτελείτε τη συντήρησή τουςτακτικά.Ταακέραιακιτδιατηρούνταισταθεράέως τηνημερομηνίαλήξης τουκιτ (αναγράφεταιστηνετικέτατουκιτ),εφόσοναποθηκεύονταιστους-20°C.Μετάτοάνοιγματουπροϊόντος,συνιστώνταιέωςκαιτέσσερις(4)κύκλοιψύξης/απόψυξηςγιατηδιασφάλισητηςσταθερότηταςτουπροϊόντος.Ταανοιγμένακιτδιατηρούνταισταθεράέωςκαιγια3μήνες,εφόσοναποθηκεύονταιστους-20°C.

ΠροειδοποιήσειςκαιπροφυλάξειςΠεριορισμοίχρήσηςπροϊόντος

Γιαβέλτιστηαπόδοση, χρησιμοποιείτε τηροή εργασιών του κιτHolotypeHLA24/11 και τουλογισμικούOmixonHLATwinγιατηντυποποίησηHLAμεNGS,μεταυλικά,τααντιδραστήριακαιτονεξοπλισμόπουσυνιστάταιστηνενότητα«Εξοπλισμόςκαιαντιδραστήρια».Η χρήση διαφορετικών υλικών από εκείνα που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός καιαντιδραστήρια»πρέπειναεπαληθευτείκαιναεπικυρωθείαπότονχρήστη.Μηνανασυστήνετεήαραιώνετετααντιδραστήριασεδιαφορετικούςόγκουςαπόεκείνουςπουπεριγράφονται στις παρούσες Οδηγίες χρήσης. Μη χρησιμοποιείτε μικρότερο όγκο


Σελίδα11│52

αντιδραστηρίωναπόεκείνονπουκαθορίζεταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.Οιενέργειεςαυτέςμπορούνναοδηγήσουνσεσφάλματααπόδοσης.Η Omixon δεν μπορεί να παράσχει υποστήριξη για ενδεχόμενα προβλήματα, τα οποίαπροκύπτουναπότημητήρησητωνβημάτωντουπρωτοκόλλουπουπεριγράφεταιστιςπαρούσεςΟδηγίεςχρήσης.Μη χρησιμοποιήσετε το προϊόν σε περίπτωση που εντοπιστεί ζημιά σε στοιχεία (σπασμέναφιαλίδια,πλάκα,ξεβιδωμέναπώματα,κτλ.)

ΓνωστοίπεριορισμοίτουπροϊόντοςΑνατρέξτε στο έγγραφο Product Known Limitations Guide (Οδηγός γνωστών περιορισμώνπροϊόντος)γιατιςγνωστέςασάφειεςκαιτουςγνωστούςπεριορισμούςλογισμικούτουπροϊόντοςHolotypeHLA.ΟΟδηγόςπαρέχεταιμετιςΟδηγίεςχρήσης,ωστόσοδιατίθεταικαιστοδικτυακότόποτηςOmixon,στηνενότηταMyHolotype/SupportandServices/HLATwinInstructionsforUse,ήμπορείτενατονζητήσετεστηδιεύθυνση[email protected].

ΠληροφορίεςασφαλείαςΠροτού ξεκινήσετε, διαβάστε τις ενότητες «Πληροφορίες ασφαλείας» και «Σημαντικέςσημειώσεις» των αντιδραστηρίων ή κιτ που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός,αντιδραστήριακαιαναλώσιμα».Κατάτηνεργασίαμεχημικά,φοράτεπάντακατάλληληρόμπαεργαστηρίου,γάντιαμιαςχρήσηςκαι προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε τα κατάλληλαΔελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS) που διατίθενται από τον αντίστοιχο προμηθευτή τουπροϊόντος.ΜιαεπισκόπησητωνχημικώνσυστατικώντωναντιδραστηρίωντουπροϊόντοςδιατίθεταισταΔελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS) του κιτ Holotype HLA 24/11 και παρέχεται κατόπιναιτήματος.Απορρίπτετεταστοιχείατουπροϊόντοςωςγενικάιατρικάαπόβλητα.

ΠαράμετροιαπόδοσηςΤεκμηριωμένεςκύριεςπαράμετροιαπόδοσης,σύμφωναμετηνεπικύρωσητουπροϊόντος.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Ευαισθησία 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Ειδικότητα 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Ακρίβεια 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Ορθότητα 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Αναπαραγωγιμότητα 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Επαναληψιμότητα 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%


Σελίδα12│52

ΤεχνικήυποστήριξηΓιαγενικήυποστήριξη,όσοναφοράστοπαρόνπρωτόκολλο,επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected]

Τηλεφωνικήεξυπηρέτηση:ΗνωμένεςΠολιτείες|+1(617)500-0790Ευρώπη|+36705748001Υπόλοιποςκόσμος|+1(617)500-0790


Σελίδα13│52

Εξοπλισμός,αντιδραστήριακαιαναλώσιμα

Τεχνικέςσυστάσειςκαισυστάσειςσχετικάμετονεξοπλισμό§ Θερμικόςκυκλοποιητήςμεμορφή96πηγαδιών§ Φθορισμόμετροπλάκας(ήοποιοδήποτεόργανομεδυνατότηταανίχνευσηςφθορισμούσε

μορφήπλάκας96πηγαδιών,γιαχρήσημετοΣύστημαPromegaQuantiFluordsDNA)§ ΣύστημαPippinPrep(Αρ.κατ.PIP0001)ήBluePippin(Αρ.κατ.BLU0001)τηςSAGEScience§ ΌργανοqPCRμεμορφήπλάκας96ή384πηγαδιών§ ΦθορισμόμετροQubit(Αρ.κατ.Q33216,ThermoFisherScientific)(προαιρετικό)§ IlluminaMiSeq(Αρ.κατ.SY-410-1003)§ Υπολογιστής64-bitμετουλάχιστον4πυρήνεςκαι16GBRAM§ Χώροςμακροπρόθεσμηςαποθήκευσηςδεδομένων(περίπου2TBδεδομένωνανάMiSeq

ετησίως)

Συστάσειςσχετικάμεαντίστοιχααντιδραστήρια§ ΚιτLongRangePCRτηςQiagen(Αρ.κατ.206401,206402ή206403)

§ Κάθεδείγμααπαιτεί4,4μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206401,(20)περιέχει8μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206402,(100)περιέχει40μLTaqπολυμεράσης§ ΤοκιτLongRangePCR,Αρ.κατ.206403,(250)περιέχει100μLTaqπολυμεράσης

§ ExoSAP-ITτηςAffymetrix(Αρ.κατ.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLή75001-10ML)§ Κάθεομαδοποιημένοδείγμααπαιτεί4μLενζύμουExoSAP-IT§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-200περιέχει200μLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-1-MLπεριέχει1mLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-4X-1MLπεριέχει4mLενζύμουExoSAP-ITExpress§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.75001-10MLπεριέχει10mLενζύμουExoSAP-ITExpress

§ Κιτ ποσοτικοποίησης βιβλιοθήκης – Illumina/Universal της KAPA Biosystems (Αρ. κατ.KK4824)

§ ΚιτανάλυσηςQubitdsDNABR(Αρ.κατ.Q32850ήQ32853)(προαιρετικό)§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.Q32850περιέχει100αναλύσεις§ ΤοπροϊόνμεΑρ.κατ.Q32853περιέχει500αναλύσεις

§ ΣύστημαQuantiFluordsDNAτηςPromega(Αρ.κατ.E2670)§ ΣφαιρίδιαAgencourtAMPureXPτηςBeckmanCoulter(Αρ.κατ.A63880,A63881ήA63882)

§ ΚάθεεκτέλεσηHolotypeHLAαπαιτείτομέγιστο900μLσφαιριδίωνAMpureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63880περιέχει5mLσφαιριδίωνAMPureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63881περιέχει60mLσφαιριδίωνAMPureXP§ ΤοΑρ.κατ.A63882περιέχει450mLσφαιριδίωνAMPureXP

§ Κασέτα πηκτώματος, 1,5% αγαρόζης, χωρίς χρωστική με εσωτερικό πρότυπο (ΔείκτηςK/R2)γιατοPippinPrep/BluePippin(Αρ.κατ.CDF1510γιατοPippinPrepκαιBDF1510γιατοBluePippin)

§ Αιθανόληυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληληγιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας(άνυδρηαλκοόλη)


Σελίδα14│52

§ Νερόυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας(χωρίςDNaseκαιRNase)

§ Υδροξείδιοτουνατρίου§ ΡυθμιστικόδιάλυμαTE1×(pH8,0)§ ΚιταντιδραστηρίωνMiSeqτηςIllumina

ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq

ΚιταντιδραστηρίωνIlluminaMiSeq

ΧρόνοςΏρες

24/11δείγματα

Std500Cycle(MS-102-2003)

~39 24


~24 24

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 20

Nano500Cycle(MS-103-1003)

~28 8


~17 4

Συνιστώμενααναλώσιμα§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρου1,5mL§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρουχαμηλήςπρόσδεσης1,5mL§ Σωληνάριαμικροφυγόκεντρουχαμηλήςπρόσδεσης2,0mL(συνιστάταιτοEppendorfDNA

LoBindΑρ.κατ.022431048)§ Σωληνάριαλεπτούτοιχώματος0,5mLγιατοόργανοQubit (συνιστώνται τασωληνάρια

ανάλυσηςQubitΑρ.κατ.Q32856)§ Πιπέτεςρυθμιζόμενουόγκου(χωρητικότητα1,0–1000μL)§ Πιπέτεςρυθμιζόμενουόγκου8καναλιών(χωρητικότητα1,0–100μL)§ Πλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοθερμικόκυκλοποιητή§ Οπτικέςπλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοφθορισμόμετροπλάκας§ Πλάκες96πηγαδιώνσυμβατέςμετοόργανοqPCR§ Φύλλασφράγισηςπλακώνγιαγενικήχρήση§ Φύλλασφράγισηςπλακώνσυμβατάμεθερμικούςκυκλοποιητές (δοκιμασμένεςγιαPCR

μεγάλουεύρους)§ ΦύλλασφράγισηςοπτικώνπλακώνσυμβατάμετοόργανοqPCR(προαιρετικά)§ Μαγνητικήβάσησυμβατήμεσωληνάριαμικροφυγόκεντρου2mL§ Στατώψύξης96πηγαδιών(2τεμάχια)§ Κωνικάσωληνάρια50mL§ Δοχεία50mL


Σελίδα15│52

ΑνακοίνωσηνομικούπεριεχομένουΟιΟδηγίεςχρήσηςτουHolotypeHLA24/11καιόλατουςταπεριεχόμεναείναιαποκλειστικήςκυριότηταςτηςOmixonBiocomputingLimited(«Omixon»)καιπροορίζονταιαποκλειστικάγιατησυμβατικήχρήσηαπότονπελάτη,όσοναφοράστοπροϊόν(ήσταπροϊόντα)πουπεριγράφονταισεαυτέςκαιδενπροορίζονταιγιακανένανάλλοσκοπό.Απαγορεύεταιηχρήσηήδιανομήγιαοποιονδήποτεάλλοσκοπόή/καιηεπικοινωνία,αποκάλυψηήαναπαραγωγήμεοποιονδήποτετρόπο του παρόντος εγγράφου και των περιεχομένων του, χωρίς την προηγούμενη γραπτήσυγκατάθεση της Omixon. Η Omixon δεν παραχωρεί καμία άδεια ευρεσιτεχνίας, εμπορικούσήματος,πνευματικώνδικαιωμάτωνήδικαιωμάτωνκοινούδικαίουήπαρόμοιωνδικαιωμάτων,ταοποίαανήκουνστηνκυριότητάτης,σετρίταμέρημέσωτουπαρόντοςεγγράφου.

ΗάδειαχρήσηςτουOmixonHLATwin(«Λογισμικό»)παραχωρείταιστονπελάτη,σύμφωναμετους όρους και τις προϋποθέσεις της Άδειας χρήσης τελικού χρήστη του Omixon HLA Twin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Στηνπερίπτωσηπουδενσυμφωνείτεμετουςόρουςκαιτιςπροϋποθέσειςπουπεριλαμβάνονται σεαυτήν, ηOmixonδενσας εκχωρείάδεια χρήσης τουΛογισμικούκαιδενπρέπεινατοχρησιμοποιήσετεήνατοεγκαταστήσετε.

Οιοδηγίεςτουπαρόντοςεγγράφουπρέπεινατηρούνταιαυστηράκαιρητάαπόειδικευμένοκαικατάλληλαεκπαιδευμένοπροσωπικό,προκειμένουναδιασφαλιστείηορθήκαιασφαλήςχρήσητουπροϊόντος(ήτωνπροϊόντων)πουπεριγράφεταισεαυτό.Διαβάστεκαικατανοήστεπλήρωςόλα τα περιεχόμενα του παρόντος εγγράφου, πριν από τη χρήση του προϊόντος (ή τωνπροϊόντων).

ΣΕΠΕΡΙΠΤΩΣΗΠΟΥΔΕΝΔΙΑΒΑΣΤΟΥΝΠΛΗΡΩΣΚΑΙΔΕΝΤΗΡΗΘΟΥΝΡΗΤΑΟΛΕΣΟΙΟΔΗΓΙΕΣΠΟΥΠΕΡΙΕΧΟΝΤΑΙΣΤΟΠΑΡΟΝ,ΕΝΔΕΧΕΤΑΙΝΑΠΡΟΚΛΗΘΕΙΥΛΙΚΗΖΗΜΙΑΣΤΟΠΡΟΪΟΝ(ΉΤΑΠΡΟΪΟΝΤΑ),ΤΡΑΥΜΑΤΙΣΜΟΣ,ΤΟΣΟΤΟΥΧΡΗΣΤΗΟΣΟΚΑΙΤΡΙΤΩΝ,ΚΑΙΥΛΙΚΕΣΖΗΜΙΣΣΕΑΛΛΗΠΕΡΙΟΥΣΙΑ.

ΗOMIXONΔΕΝΑΝΑΛΑΜΒΑΝΕΙΚΑΜΙΑΕΥΘΥΝΗΠΟΥΝΑΠΡΟΚΥΠΤΕΙΑΠΟΛΑΝΘΑΣΜΕΝΗΧΡΗΣΗΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ (Ή ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ) ΠΟΥ ΠΕΡΙΓΡΑΦΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΑΡΟΝ (ΣΥΜΠΕΡΙΛΑΜ-ΒΑΝΟΜΕΝΩΝ ΜΕΡΩΝ ΑΥΤΩΝ Ή ΛΟΓΙΣΜΙΚΟΥ) Ή ΑΠΟ ΟΠΟΙΑΔΗΠΟΤΕ ΑΛΛΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΥΤΩΝ, Η ΟΠΟΙΑ ΔΕΝ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΣΤΟ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΡΗΤΩΝ,ΕΓΓΡΑΦΩΝΑΔΕΙΩΝΧΡΗΣΗΣΉΔΙΚΑΙΩΜΑΤΩΝΠΟΥΠΑΡΑΧΩΡΟΥΝΤΑΙΑΠΟΤΗΝOMIXON,ΣΕΣΧΕΣΗΜΕΤΗΝΑΠΟΚΤΗΣΗΤΕΤΟΙΩΝΠΡΟΪΟΝΤΩΝΑΠΟΤΟΝΠΕΛΑΤΗ.

ΓΙΑINVITROΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΧΡΗΣΗ©2017OmixonBiocomputingLtd.Μετηνεπιφύλαξηπαντόςδικαιώματος.

ΠροβλεπόμενηχρήσηΤοπροϊόνHolotypeHLA24/11–ΔιαμόρφωσηA1&CE/A2&CE/A3&CE/A4&CE(αναφέρεταιως«HolotypeHLA»)είναιέναςσυνδυασμόςαντιδραστηρίωνανάλυσηςγιαδιάγνωσηinvitroκαιλογισμικούανάλυσηςδεδομένων(OmixonHLATwin™),πουπροορίζεταιγιατηναναγνώρισηκαιτονορισμόανθρωπίνωνλευκοκυτταρικώναντιγόνων (HLA) τάξεως Iκαι II καιγιαχρήσηστηντυποποίησηHLA, χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα αλληλούχισης επόμενης γενιάς Illumina®MiSeq. ΤοHolotypeHLA παρέχει πληροφορίες ανθρώπινης ιστοσυμβατότητας των γενετικών


Σελίδα16│52

τόπωνHLAΤάξης I (A,BκαιC)καιΤάξης II (DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4καιDRB5),χρησιμοποιώνταςανθρώπινογονιδιωματικόDNA.

ΤολογισμικόOmixonHLATwin™,τοοποίοπεριλαμβάνεταιστοπροϊόνHolotypeHLA,προορίζεταιγια την ερμηνείακαιαντιστοίχισηδεδομένωναλληλούχισης,προερχόμενωναπό τοσύστημαIllumina® MiSeq, με αποτέλεσμα την υψηλής ακρίβειας, μονής διέλευσης, τυποποίηση HLAεπίπεδουαλληλίωνμεπολύχαμηλόποσοστόασαφειώνστοεπίπεδοπεδίου2.

Το προϊόν Holotype HLA προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση από επαγγελματικόπροσωπικόυγειονομικήςπερίθαλψης,όπωςτεχνολόγουςεργαστηρίωνκαιιατρούς,πουέχουνεκπαιδευτείστηντυποποίησηHLAσεδιαγνωστικάεργαστήριαμεπιστοποίησηEFIήASHIήπουμπορούνναεργάζονταισύμφωναμετιςπροδιαγραφέςEFIήASHI.

Σημαντικήσημείωσηπριναπότηνέναρξη

ΣυνιστώμενηαπομόνωσηγονιδιωματικούDNAΤο ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA πρέπει να προετοιμάζεται, χρησιμοποιώντας καλάδοκιμασμένα,εμπορικάδιαθέσιμακιτπροετοιμασίαςDNA,γιατηνεξασφάλισητηςσυνέπειαςστην προετοιμασία. Ανεξάρτητα από την προσέγγιση, απαιτείται ακριβής προσδιορισμός τηςσυγκέντρωσηςκαικαθαρότηταςγιατησωστήαπόδοσητηςανάλυσης.

ΤοDNAδενθαπρέπειναέχειμολυσματικέςουσίεςπουμπορείναεπηρεάσουναργότερατηνενίσχυση, την προετοιμασία βιβλιοθήκης και τα βήματααλληλούχισης (π.χ. αλκοόλη, άλατα,απορρυπαντικά,φορμαλδεΰδηκαιηπαρίνη).Τοαίμαδενπρέπεινασυλλέγεταισεηπαρινισμένασωληνάρια και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα αίματος από ασθενείς πουυποβάλλονταισεθεραπείαμεηπαρίνηκαιλιπαιμικάήαιμολυμέναδείγματα.

Το προετοιμασμένο γονιδιωματικό DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως, εάν έχειπροετοιμαστείσενερόχωρίςνουκλεάσηήέχειαποθηκευτείγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματαστους -20oCήχαμηλότερα.Συνιστάταιηχρήσηνερούγια τηνπροετοιμασίαgDNA,καθώςτοEDTAστορυθμιστικόδιάλυμαTEμπορείνακαταστείλειτιςαντιδράσειςPCRμεγάλουεύρους.Ηεπαναλαμβανόμενηψύξη–απόψυξηθαπρέπεινααποφεύγεται,καθώςμπορείναοδηγήσεισεαποδόμηση.

Συνιστάται συγκέντρωση DNA 20-30ng/μL για την παροχή 100-150 ng γονιδιωματικού DNAεισόδουανάενίσχυσηPCR.ΣυνιστάταιθερμάηχρήσημεθόδουποσοτικούπροσδιορισμούμεβάσητονφθορισμόγιατονκαθορισμότηςσυγκέντρωσηςgDNA.

Συνιστάταιλόγοςαπορρόφησης1,7–2γιατιμές260nm/280nmκαι260nm/230nm.

ΓιατηνενίσχυσητωνHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1καιHLA-DQB1,απαιτούνται1,0–1,5µggDNAγιακάθεδείγμα.


Σελίδα17│52

ΑρχήτηςμεθόδουΕδώ και πολλά χρόνια, η κοινότητα HLA εργάζεται για την ανάπτυξη μιας μεθόδου που θααναγνωρίζει με ακρίβεια τον εκτενή πολυμορφισμό των γονιδίων HLA και των γονιδιακώνπροϊόντων τους. Η έλευση της PCR, σε συνδυασμό με άλλες τεχνολογίες (αλληλούχιση κατάSanger,SSOP,SSP,Luminex),παρείχανέναντρόπογιατησημαντικήβελτίωσητηςανίχνευσηςτωνπολυμορφισμών των HLA, αν και με αρκετούς περιορισμούς, οι οποίοι εξακολουθούν ναδυσχεραίνουντηνικανότητάμαςναχαρακτηρίσουμεσυνολικάταγονίδιαHLA.Οιτεχνολογίεςπουέχουναναπτυχθείτατελευταίαχρόνια,πουονομάζονταισυνολικάαλληλούχισηεπόμενηςγενιάς (Next Generation Sequencing – NGS), έχουν παράσχει νέες ευκαιρίες, οι οποίεςεπιτρέπουντονπλήρηχαρακτηρισμότωνγονιδίωνHLAμεαπλοειδήτρόπο.ΗτεχνολογίαNGSέχει δύο ξεχωριστά χαρακτηριστικά, 1) κλωνική αλληλούχιση των θραυσμάτων DNA και 2)εξαιρετικάυψηλήκλίμακα.ΗτεχνολογίαNGSπαρέχειτηδυνατότητασταδιακήςεισαγωγήςτωνπολυμορφισμών,εξαλείφονταςμεαυτόντοντρόποκάθεασάφεια,ενώπαρέχειτυποποίησηHLAστο επίπεδοπεδίου τρία έως τέσσερα, χωρίς τηναυτόματη εκτέλεσηπρόσθετων εξετάσεων,παρουσιάζοντας, έτσι, μια δυνητικά συνολική λύση στο πρόβλημα τυποποίησης HLA. ΤοπρωτόκολλοπουπεριγράφεταιεδώαξιοποιείαυτήντηντεχνολογίακαισυνδυάζειτηνενίσχυσηPCRμεγάλουεύρουςτωνγονιδίωνHLAμεαλληλούχισηστηνπλατφόρμαIlluminaMiSeq.Πιοσυγκεκριμένα,ταγονίδιαHLAA,B,C,DPA1,DQA1καιDQB1ενισχύονταιγιαολόκληροτομήκοςκωδικοποίησήςτους,συμπεριλαμβάνονταςστοιχείααπότις5’και3’αμετάφραστεςπεριοχές,ενώταDRB1,DRB3καιDRB4ενισχύονταιαπότοεσώνιο1έωςτοεσώνιο4καιταDRB5καιDPB1ενισχύονταιαπό το εσώνιο1 έως την3'αμετάφραστηπεριοχή. Στησυνέχεια, τααμπλικόνιαυποβάλλονταισεεπεξεργασία,μέσααπόμιασειράβημάτωνπου:

1. ΚατακερματίζουντααμπλικόνιασεμέγεθοςκατάλληλογιατηναλληλούχισηστηνπλατφόρμαIllumina,

2. Πραγματοποιούνάμβλυνσηκαιαδενυλίωσητωνάκρωντωνκατακερματισμένωναμπλικονίων

3. Συνδέουν με λιγάση τις αλληλουχίες προσαρμοστών που χρησιμοποιούνται καθ' όλη τηδιαδικασίαστοMiSeqγια τηνκαταγραφή, τηνενίσχυσηκαι τηναλληλούχιση τουDNA.Οιπροσαρμοστέςπεριλαμβάνουν,επίσης,έναδείκτηπουείναιμιαμικρήαλληλουχία,μοναδικήγιακάθεπροσαρμοστή,πουπροσδιορίζειτηνπροέλευσητηςβιβλιοθήκης(δείγμα/τόπος).

Μετά από τη συγκέντρωση των βιβλιοθηκών με δείκτες, την επιλογή μεγέθους και τηνποσοτικοποίηση,τοδείγματοποθετείταιστοMiSeqγιααλληλούχιση.Ολόκληρηηδιαδικασίαδιαρκεί 3-5 ημέρες, ανάλογα με την επιλογή κυψελίδας ροής στην πλατφόρμα Illumina.Ησύνοψητωνβημάτωντουπρωτοκόλλουπαρουσιάζεταιστηνπαρακάτωεικόνα:


Σελίδα18│52

Σύνοψητωνβημάτων


Σελίδα19│52

Γλωσσάρι/ορισμοί§ Πλάκααμπλικονίων–Εναλλακτικόόνομαγιαμιαπλάκαενίσχυσης§ Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων – Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με το

φθορισμόμετρο πλάκας, όπου πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός τωναραιωμένωναμπλικονίων

§ Πλάκαενίσχυσης–ΠλάκαPCR96πηγαδιώνπουχρησιμοποιείταιγιατηνενίσχυσητωνγενετικώντόπωνHLA

§ Τελικήβιβλιοθήκη–Βιβλιοθήκηπουπεριλαμβάνειόλες τιςΒιβλιοθήκεςδείγματοςπουείναιέτοιμεςνααλληλουχιστούνσεμίαανάλυσηMiSeq

§ Πλάκα αντίδρασης – Πλάκα όπου πραγματοποιούνται οι διαδοχικές αντιδράσεις πουκατακερματίζουν,επιδιορθώνουνταάκρακαισυνδέουνμελιγάσητουςπροσαρμοστέςμεδείκτεςστιςΒιβλιοθήκεςδείγματος

§ Πλάκα αντιδραστηρίων – Πλάκα που χρησιμοποιείται για τη διανομή κλασμάτων τωνδιάφορωναντιδραστηρίωνπουχρησιμοποιούνταιγιατηνπροετοιμασίατωνβιβλιοθηκών

§ Βιβλιοθήκη δείγματος – Βιβλιοθήκη που παρασκευάζεται από τον συνδυασμό(ομαδοποίηση)όλωντωνγενετικώντόπωνHLAγιαδεδομένοδείγμα

§ Πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων –Πλάκα που περιέχει μια βιβλιοθήκη δείγματος(συνδυασμόςόλωντωνγενετικώντόπων)ανάπηγάδι

§ Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων – Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με τοφθορισμόμετρο πλάκας, όπου τοποθετούνται πρότυπα DNA για τον ποσοτικόπροσδιορισμόαμπλικονίων


Σελίδα20│52

Βήμα1–ΠροετοιμασίακύριουμείγματοςενίσχυσηςHLAΔιάρκεια:~45λεπτάΟ σκοπός αυτού του βήματος είναι η παρασκευή των κυρίων μειγμάτων που αφορούν σεσυγκεκριμένουςγενετικούςτόπους,προκειμένουναενισχυθείμεμονωμένακάθεστοχευμένοςγενετικόςτόποςHLA.Οιγενετικοίτόποιπουενισχύονταιαπόαυτότοπρωτόκολλοείναι:HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1καιHLA-DQB1.

Σημείωση:Τακύριαμείγματαπουπαρασκευάζονταισεαυτότοβήμαπεριλαμβάνουνόλατααντιδραστήριαπουαπαιτούνταιγιατηνενίσχυση,εκτόςαπότηνTaqπολυμεράση.

ΛίστααντιδραστηρίωνΣτοιχείο Φύλαξη Παρέχεταιαπότην

ΜείγμαεκκινητήHLA-A -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-B -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-C -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB1/DRB3 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB4 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DRB5 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DPA1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DPB1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DQA1 -20°C OmixonΜείγμαεκκινητήHLA-DQB1Σετ3 -20°C OmixonΕνισχυτής1 -20°C OmixonΕνισχυτής2 -20°C OmixonLongRangePCRBuffer(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMτοκαθένα) -20°C QiagenH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

-20°C Qiagen

Πρωτόκολλο1.1 –Αφαιρέστεόλαταμείγματαεκκινητή,τονενισχυτή1και2,τοdNTPsκαιτορυθμιστικό

διάλυμα PCR μεγάλου εύρους (10×) από τη φύλαξη και αποψύξτε σε θερμοκρασίαδωματίου.

1.2 –Παρασκευάστετονσυνδυασμένοενισχυτή:προσθέστε132μLενισχυτή2στοσωληνάριοτου ενισχυτή 1. Αλλάξτε την ετικέτα του σωληναρίου του ενισχυτή 1 σε συνδυασμένοενισχυτή.ΦυλάξτετονυπόλοιποΕνισχυτή2γιαναχρησιμοποιηθείστηναντίδρασηPCRμεγάλουεύρουςτουDRB4.


Σελίδα21│52

1.3 –Παρασκευάστεένακύριομείγμαγιακάθεμείγμαεκκινητή,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες:

Κύριομείγμα:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1καιDQA1

Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/γενετικόςτόπος

Όγκος/24δείγματα/γενετικόςτόπος

Μείγμαεκκινητή 2μL 51μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 63,8μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 31,9μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

13,85μL 353,2μL

Συνολικόςόγκος 19,6μL 499,9μL

Κύριομείγμα:HLA-DRB4



Μείγμαεκκινητή 2μL 51μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 63,8μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 31,9μLΕνισχυτής2 0,6μL 15,3μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

13,25μL 337,9μL


Κύριομείγμα:HLA-DQB1Σετ3



Μείγμαεκκινητή 2μL 51μLLongRangePCRBuffer(10×) 2,5μL 63,8μLΜείγμαdNTPs(10mMτοκαθένα) 1,25μL 31,9μLΣυνδυασμένοςενισχυτής 5,6μL 142,8μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

7,85μL 200,2μL


1.4 – Υποβάλετε το κάθε κύριο μείγμα σε περιδίνηση και, στη συνέχεια, σε σύντομηφυγοκέντρισηγια1δευτερόλεπτο.Τοποθετήστετακύριαμείγματασεπάγο.

1.5 –ΑραιώστεόλαταgDNAσεσυγκέντρωσημεταξύ20-30ng/μL(οελάχιστοςόγκοςείναι55μL).


Σελίδα22│52

Σημείωση:ΤοHolotypeHLAπεριέχειεπαρκήαντιδραστήριαγια24αντιδράσεις,καθώς και πρόσθετο όγκο για απώλειες κατά τη διανομή με πιπέτα καιαποτυχημένηενίσχυση.


Σελίδα23│52

Βήμα2–ΕνίσχυσηHLAΤάξηςIκαιIIΔιάρκεια:~6ώρες50λεπτάΟσκοπόςτουβήματος2είναιηενίσχυσητωνγενετικώντόπωνHLA.ΟιενισχύσειςHLAΤάξηςIκαιΤάξηςIIέχουνβελτιστοποιηθεί,χρησιμοποιώνταςδύοδιαφορετικάσύνολασυνθηκώνPCR.Αφού ολοκληρωθούν οι αντιδράσεις PCR, η ενίσχυση επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σεπήκτωμααγαρόζης(προαιρετικά).

Γρήγορησυμβουλή–Ανκαιπροτείνεταιηηλεκτροφόρησησεπήκτωμααγαρόζης,δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου Holotype HLA.Όταν πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός των αμπλικονίων (Βήμα 3),οποιαδήποτε συγκέντρωση άνω των 50 ng/μL θεωρείται επιτυχής ενίσχυση.Ηηλεκτροφόρησησεπήκτωμααγαρόζηςαποτελείένασημαντικόβήμαποιοτικούελέγχουκαιδενπρέπειναπαραλείπεται,ότανδενυπάρχειεπαρκήςεμπειρίαμετοπλήρεςπρωτόκολλοHolotypeHLA.


ΚύριομείγμαHLA-A -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-B -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-C -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB1/DRB3 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB4 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DRB5 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DPA1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DPB1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DQA1 -20°C Βήμα1ΚύριομείγμαHLA-DQB1Σετ3 -20°C Βήμα1Taqπολυμεράση -20°C QiagengDNA 4°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

20°C Χρήστης

Πρωτόκολλο2.1 –ΑφαιρέστετηνTaqπολυμεράσηαπότηφύλαξη,φυγοκεντρίστεσύντομακαιπροσθέστε

τηνσεκάθεκύριομείγμα,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες,ξεπλένονταςσχολαστικάταρύγχητωνπιπετώνμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση:


Σελίδα24│52

Κύριο μείγμα με Taq πολυμεράση:HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1,DPB1καιDQA1



Κύριομείγμααπότοβήμα1 19,6μL 499,9μLTaqπολυμεράση 0,4μL 10,2μLΣύνολο 20μL 510,1μL

ΚύριομείγμαμεTaqπολυμεράση:HLA-DQB1σετ3



Κύριομείγμααπότοβήμα1 19,2μL 489,7μLTaqπολυμεράση 0,8μL 20,4μLΣύνολο 20μL 510,1μL

2.2 –ΥποβάλετεσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντρισηόλατακύριαμείγματαμεTaqπολυμεράση.Διανείμετε20μLκάθεκύριουμείγματοςμεTaqπολυμεράσησεξεχωριστάπηγάδιατωνπλακώνPCR96πηγαδιών.

Σημείωση:ΗενίσχυσηΤάξηςIκαιΤάξηςIIέχειβελτιστοποιηθεί,χρησιμοποιώνταςδύοδιαφορετικέςσυνθήκεςPCR,επομένωςτακύριαμείγματαΤάξηςIκαιΤάξηςIIδενπρέπειναβρίσκονταιστηνίδιαπλάκα.

2.3 – Προσθέστε 5 μL κάθε αραιωμένου gDNA στο κατάλληλο πηγάδι των πλακών πουπροετοιμάστηκανστοπροηγούμενοβήμα.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.Σφραγίστετιςμεθερμικόφύλλοσφράγισηςκαιεπιθεωρήστεοπτικάτοκάθεπηγάδι.Υποβάλετεόλεςτιςπλάκεςενίσχυσηςσεσύντομηφυγοκέντριση.

2.4 – Τοποθετήστε τις πλάκες ενίσχυσης σε θερμικούς κυκλοποιητές και εκτελέστε ταπρογράμματαγιατηνενίσχυσηΤάξηςIκαιΤάξηςII,σύμφωναμετουςπαρακάτωπίνακες:

ΕνίσχυσηΤάξηςI(HLA-A,BκαιC)

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 3λεπτά 95°C 15δευτερόλεπτα35 65°C 30δευτερόλεπτα 68°C 5λεπτά1 68°C 10λεπτά1 4°C ∞


Σελίδα25│52

ΕνίσχυσηΤάξηςII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1καιDQB1)

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 3λεπτά 93°C 15δευτερόλεπτα35 60°C 30δευτερόλεπτα 68°C 9λεπτά1 68°C 10λεπτά1 4°C ∞

Σημείωση:Ηεπιτυχίατηςενίσχυσηςμπορείναεπαληθευτεί,προσθέτοντας2μLαπόκάθεαμπλικόνιοσετυπικόπήκτωμααγαρόζης2%στα250Vγια30λεπτά.(Προαιρετικά)

Αναμενόμεναμεγέθηαμπλικονίων

ΓενετικόςτόποςHLA Αναμενόμενομέγεθοςαμπλικονίων(kb)HLA-A,BκαιC ~3HLA-DRB1/DRB3 ~4,3

HLA-DRB4 ~4,2HLA-DRB5 ~5HLA-DPA1 ~5,5HLA-DPB1 ~6,6HLA-DQA1 ~5,5

HLA-DQB1(Σετ3) ~6,5

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Τααμπλικόνιαμπορούννααποθηκευτούνστους 4 °C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 °C για μεγαλύτερο χρονικόδιάστημα.


Σελίδα26│52

Βήμα3–Ποσοτικόςπροσδιορισμόςκαικανονικοποίησηαμπλικονίων(χρησιμοποιώνταςφθορισμόμετροπλάκας)Διάρκεια:~40λεπτάΟποσοτικόςπροσδιορισμόςκαιηκανονικοποίησηαμπλικονίωνσυνιστάταιγιατηνεξασφάλισηεισόδου ακριβείας στο βήμα προετοιμασίας βιβλιοθήκης (προαιρετικό). Η συγκέντρωσηαμπλικονίων μετριέται, χρησιμοποιώντας το Σύστημα QuantiFluor dsDNA που περιέχει μιαφθορίζουσα χρωστικήπουδεσμεύειDNAκαι έναπρότυποDNAγια τον ευαίσθητοποσοτικόπροσδιορισμόμικρώνποσοτήτωνDNAδιπλήςέλικας(dsDNA).ΑνατρέξτεστοΠαράρτημα2γιαοδηγίεςσχετικάμετονποσοτικόπροσδιορισμόαμπλικονίων,χρησιμοποιώνταςόργανοqPCR.

Γρήγορησυμβουλή–Ανκαιπροτείνεταιοποσοτικόςπροσδιορισμόςαμπλικονίων,δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου Holotype HLA.Ηκανονικοποίησηαμπλικονίωνδεναπαιτείακριβήμέτρησητηςσυγκέντρωσηςτων αμπλικονίων. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια εκτίμηση τωνσυγκεντρώσεων αμπλικονίων με βάση την εμπειρία ή την ηλεκτροφόρηση σεπήκτωμα αγαρόζης. Ο ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίων δεν πρέπει ναπαραλείπεταιχωρίςσυνεχήεμπειρίαμετοπλήρεςπρωτόκολλοHolotypeHLA.


ΠλάκαενίσχυσηςΤάξηςI 4°C Βήμα2ΠλάκαενίσχυσηςΤάξηςII 4°C Βήμα2LambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C PromegaQuantiFluordsDNADye(200×) 4°C PromegaΡυθμιστικόδιάλυμαTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

20°Cέως25°C Χρήστης

ExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


Σελίδα27│52

Πρωτόκολλο3.1 –ΠαρασκευάστεπρότυπαDNAμέσωδιαδοχικώναραιώσεωντουπροτύπουDNAΛάμδα

(100 ng/μL) που παρέχεται στο κιτ QuantiFluor, σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακααραίωσης:

Ετικέταστοσωληνάριο DNAεισόδου ΌγκοςDNA(μL) Όγκος1xTE

(μL)Τελικήσυγκ.

(ng/μL)Πρότυπο1 DNAΛάμδα 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLΠρότυπο2 Πρότυπο1 250μL 250μL 0,75ng/μLΠρότυπο3 Πρότυπο2 250μL 250μL 0,38ng/μLΠρότυπο4 Πρότυπο3 250μL 250μL 0,19ng/μLΠρότυπο5 Πρότυπο4 250μL 250μL 0,09ng/μLΠρότυπο6 Πρότυπο5 250μL 250μL 0,05ng/μLΤυφλό Τυφλό 0μL 250μL 0ng/μL

3.2 –Προετοιμάστετιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).Διανείμετε99μLρυθμιστικούδιαλύματοςTE1xσταπηγάδιαμιαςοπτικήςπλάκας96πηγαδιώνγιατονσυνολικόαριθμότωναμπλικονίωνγιαταοποίαπραγματοποιείταιποσοτικόςπροσδιορισμός.

3.3 –Προσθέστε1μLαμπλικονίωναπότααντίστοιχαπηγάδιατωνπλακώναμπλικονίωνσεμεμονωμέναπηγάδιατωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

3.4 – Παρασκευάστε διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, χρησιμοποιώντας τονπαρακάτωτύπο:0,5μLχρωστικήςQuantiFluor(200X)+99,5μLρυθμιστικόδιάλυμαTE1×.ΠαρασκευάστεεπαρκέςδιάλυμαεργασίαςχρωστικήςQuantiFluor1×,ώστεκάθεδείγμα(σύνολοδειγμάτωνστιςπλάκεςαμπλικονίων)καιπρότυπο(14συνολικά)ναλάβειγνωστόκλάσμα100μL.

3.5 –Προετοιμάστεμιαπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνκαιπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμού αμπλικονίων. Διανείμετε 100 μL διαλύματος εργασίας της χρωστικήςQuantiFluor 1× στα πηγάδια της οπτικής πλάκας 96 πηγαδιών, που θα αποτελέσει τηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων,καιστιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίωναπότοΒήμα3.2.

3.6 –Χρησιμοποιώνταςταπρότυπαπουπαρασκευάστηκανπαραπάνω,προσθέστε100μLαπόκάθε πρότυπο, εις διπλούν, σε μεμονωμένα πηγάδια στην πλάκα ποσοτικούπροσδιορισμού προτύπων (14 πηγάδια συνολικά). Αναμείξτε με επανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

3.7 –Αναμίξτε,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

3.8 –Αναλύστετηνπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνστοφθορισμόμετροπλάκαςκαιέπειτατιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.


Σελίδα28│52

3.9 –ΥπολογίστετησυγκέντρωσηDNAστιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων,χρησιμοποιώντας δεδομένα RFUπου δημιουργήθηκαν από τοφθορισμόμετρο πλάκας.ΑνατρέξτεστηνκαρτέλαΑραίωση,στοπαρεχόμενοβιβλίοεργασίας,γιαβοήθειαμετουςυπολογισμούς.

3.10 –ΑραιώστεDNAστιςπλάκεςαμπλικονίωνμεH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκαικατάλληλογιαεφαρμογές μοριακής βιολογίας, ώστε η τελική συγκέντρωση DNA να είναι περίπου67ng/μL.

§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι150ng/μLήμεγαλύτερη:προσθέστε25μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι100-150ng/μL:προσθέστε10μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναιμικρότερηαπό100ng/μL:μηνπροσθέσετεH2O

Ομαδοποίησηαμπλικονίων3.11 – Ομαδοποιήστε όλους τους γενετικούς τόπους κάθε δείγματος σε μία πλάκα

ομαδοποιημένων αμπλικονίων. Συνδυάστε τους όγκους που παρατίθενται για κάθεγενετικότόποστονπαρακάτωπίνακα,γιαναλάβετετελικόόγκο35μL:

ΓενετικόςτόποςHLA ΟμαδοποιημένοςόγκοςA 3,5μLB 3,5μLC 3,5μL

DRB1/DRB3 3,5μLDRB4 3,5μLDRB5 3,5μLDPA1 3,5μLDPB1 3,5μLDQA1 3,5μL

DQB1σετ3 3,5μL

3.12 –Προσθέστε4μLExoSAP-ITExpressσεκάθεβιβλιοθήκηδείγματος.Εκπλύνετεταρύγχητωνπιπετώνμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση.Σφραγίστετηνπλάκαμεθερμικόφύλλοσφράγισηςκαιυποβάλετεσεσύντομηφυγοκέντριση.

3.13 – Τοποθετήστε τηνπλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίωνστοθερμικό κυκλοποιητή καιεκτελέστετοπαρακάτωπρόγραμμα:

ΚαθαρισμόςPCRExoSAP-ITExpress

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 37°C 4λεπτά1 80°C 1λεπτό1 4°C ∞


Σελίδα29│52

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Τααμπλικόνιαμπορούννααποθηκευτούνστους 4 °C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 °C για μεγαλύτερο χρονικόδιάστημα.


Σελίδα30│52

Βήμα4–ΠροετοιμασίαβιβλιοθήκηςΔιάρκεια:~3ώρεςΚατά τη διάρκεια αυτού του βήματος, τα ομαδοποιημένα αμπλικόνια προετοιμάζονται γιααλληλούχισηστοIlluminaMiSeq.Πραγματοποιείταιενζυμικόςκατακερματισμόςτωναμπλικονίων,επιδιόρθωσηκαιαδενυλίωσητωνάκρωνκαισύνδεσημελιγάσητωνπροσαρμοστώνμεδείκτεςστα άκρα. Στη συνέχεια, οι βιβλιοθήκες ομαδοποιούνται με ένα βήμα καθαρισμού καισυγκέντρωσηςπουεκτελείταιχρησιμοποιώνταςσφαιρίδιαAMPureXP.

Σημείωση:ΗOmixonσυνιστάόγκουςμεγαλύτερουςαπότουςαπαιτούμενουςγια24 δείγματα, καθώς πολλά από τα ένζυμα και τα ρυθμιστικά διαλύματα είναιιξώδη,μεαποτέλεσμαπρόσθετεςαπώλειεςκατάτηδιανομήμεπιπέτα.


Πλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίων 4°C Βήμα3Ένζυμοκατακερματισμού(Α) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β) -20°C OmixonΈνζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ) -20°C OmixonΈνζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) -20°C OmixonΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ) -20°C OmixonΠλάκαπροσαρμοστών -20°C OmixonΣφαιρίδιαAMPureXP 4°C BeckmanCoulterΑιθανόλη80%(πρόσφαταπαρασκευασμένη) 20°Cέως25°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


Πρωτόκολλο4.1 – Ενεργοποιήστε τον θερμικό κυκλοποιητή. Επιβεβαιώστε ότι το θερμαινόμενο καπάκι

θερμαίνεται.

Σημείωση:Υποβάλετεσεπεριδίνησητοένζυμοκατακερματισμού(Α)πριναπότηχρήση.

4.2 –Παρασκευάστετοκύριομείγμακατακερματισμού,σύμφωναμετονπαρακάτωπίνακα:


Σελίδα31│52

Κύριομείγμακατακερματισμού

Αντιδραστήριο Όγκοςανάβιβλιοθήκη(μL)

Συνιστώμενοιόγκοιγια24βιβλιοθήκες(μL)


Ένζυμοκατακερματισμού(Α) 2μL 55,2μL ΚίτρινοΡυθμιστικόδιάλυμακατακερματισμού(Β)

2μL 55,2μL Κόκκινο

Συνολικόςόγκος 4μL 110,4μL

4.3 –Προετοιμάστεμιαπλάκααντιδραστηρίων:τοποθετήστεμιανέαπλάκαPCR96πηγαδιώνσεέναστατώψύξηςκαιδιανείμετείσηποσότητατουκύριουμείγματοςκατακερματισμούσεκάθεπηγάδιμίαςστήλης.

Σημείωση:ΗαντίδρασηκατακερματισμούέχεισχεδιαστείώστεναπαρέχειτοιδανικόμέγεθοςDNAγιααλληλούχισηστοIlluminaMiSeq.Είναισημαντικό,τααντιδραστήριαναδιατηρηθούνσεχαμηλήθερμοκρασίαμέχριναξεκινήσειηαντίδρασηστοθερμικόκυκλοποιητή,προκειμένουνααποφευχθείουπερβολικόςκατακερματισμός.Συνιστάταιη χρήση πιπετών πολλών καναλιών για την ελαχιστοποίηση της πιθανότηταςυπερβολικούκατακερματισμού.

4.4 – Φυγοκεντρίστε την πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων για 10 δευτερόλεπτα καιτοποθετήστετηνσεπάγοήψυχρόμπλοκ.

4.5 – Προετοιμάστε μια πλάκα αντίδρασης: τοποθετήστε μια νέα πλάκα PCR 96 πηγαδιώνπάνωσεέναμπλοκψύξηςPCR.

4.6 –Προσθέστε4μLκύριουμείγματοςκατακερματισμούαπότηνπλάκααντιδραστηρίωνσταπηγάδια της πλάκας αντίδρασης, που αντιστοιχούν σε δείγματα στην πλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίων.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.

4.7 –Μεταφέρετε16μLκάθεαμπλικονίουαπότηνπλάκαομαδοποιημένωναμπλικονίωνστοαντίστοιχοπηγάδι της πλάκαςαντίδρασης, χρησιμοποιώνταςπιπέταπολλών καναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

4.8 – Καλύψτε τηνπλάκααντίδρασηςμεθερμικόφύλλοσφράγισης καιφυγοκεντρίστε για10δευτερόλεπτα.

4.9 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςσεθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμακατακερματισμού

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 37°C 10λεπτά1 70°C 15λεπτά1 4°C ∞


Σελίδα32│52

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους 4 °C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 °C για μεγαλύτερο χρονικόδιάστημα.

4.10 – Παρασκευάστε το κύριο μείγμα επιδιόρθωσης άκρων, σύμφωνα με τον παρακάτωπίνακα:

Κύριομείγμαεπιδιόρθωσηςάκρων

Αντιδραστήριο Όγκοςανάβιβλιοθήκη(μL)

Συνιστώμενοιόγκοιγια24βιβλιοθήκες(μL)


H2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

1,25μL 34,8μL

Ένζυμοεπιδιόρθωσηςάκρων(Γ) 1,25μL 34,8μL ΠράσινοΡυθμιστικόδιάλυμαεπιδιόρθωσηςάκρων(Δ)

2,5μL 69,6μL Πορτοκαλί

Συνολικόςόγκος 5μL 139,2μL

4.11 – Διανείμετε ίση ποσότητα κύριου μείγματος επιδιόρθωσης άκρων σε μία στήλη τηςπλάκαςαντιδραστηρίωνπουδεχρησιμοποιείται.

4.12 –Φυγοκεντρίστετηνπλάκααντίδρασης(πουπεριέχειτακατακερματισμέναδείγματα)για10δευτερόλεπτα.Προσθέστε5μLκύριουμείγματοςεπιδιόρθωσηςάκρωναπότηνπλάκααντιδραστηρίων σε κάθε πηγάδι της πλάκας αντίδρασης. Συνιστάται η χρήση πιπέταςπολλώνκαναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.


4.14 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςσεθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμαεπιδιόρθωσηςάκρων


Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν νααποθηκευτούνστους4°Cκατάτηδιάρκειατηςνύχταςήστους-20°Cγιαμεγαλύτεροχρονικόδιάστημα.

4.15 – Βγάλτε την πλάκα προσαρμοστών με δείκτες από τη φύλαξη και αποψύξτε σεθερμοκρασίαδωματίου,μετάτηνεκκίνησητουπρογράμματοςεπιδιόρθωσηςάκρωνστον


Σελίδα33│52

θερμικόκυκλοποιητή.Μόλιςηπλάκαπροσαρμοστώνμεταβείσεθερμοκρασίαδωματίου,φυγοκεντρίστεγια3λεπτάστις3.000στροφέςανάλεπτό.

4.16 – Αφαιρέστε προσεκτικά το φύλλο σφράγισης από την πλάκα προσαρμοστών. Μηνανακινήσετετηνπλάκαπροσαρμοστώναφούαφαιρεθείτοφύλλοσφράγισης,προκειμένουνααποφευχθείηδιασταυρούμενημόλυνση.

4.17 – Μεταφέρετε όλο τον όγκο κάθε πηγαδιού από την πλάκα αντίδρασης (25 μL) στοαντίστοιχοπηγάδιτηςπλάκαςπροσαρμοστών.

Σημείωση: Εφόσον ΔΕΝ πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ολόκληρη η πλάκαπροσαρμοστών, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μόνο τον απαραίτητο αριθμόπροσαρμοστών. Κόψτε το φύλλο σφράγισης μεταξύ των πηγαδιών που θαχρησιμοποιηθούνκαιτωνπηγαδιώνπουθαδιατηρηθούν.Αφαιρέστεπροσεκτικάτοφύλλοσφράγισηςαπότηνπλάκαπροσαρμοστών,αφήνοντάςτοστηθέσητουπάνωαπόταπηγάδιαπουθαδιατηρηθούν.

α.Μεταφέρετε25μLαπόκάθεδείγμαμεεπιδιορθωμέναάκρααπότηνπλάκααντίδρασηςσεέναπηγάδιστηνΠλάκαπροσαρμοστών,αναμιγνύονταςκαλάμετηνπιπέτα,μεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυση.

β. Μεταφέρετεόλοτονόγκοκάθεδείγματοςαπότηνπλάκαπροσαρμοστώνστοαρχικόπηγάδιτηςπλάκαςαντίδρασης.

γ. Σφραγίστεπάλιτηνπλάκαπροσαρμοστώνκαιεπαναφέρετέτηνστους-20°C.Χρησιμοποιήστετηνπλάκααντίδρασηςαντίγιατηνπλάκαπροσαρμοστώνγιαταυπόλοιπαβήματατουεγχειριδίου.

4.18 – Παρασκευάστε το κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση. Παρασκευάστε επαρκές κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάσηγιατοκάθεδείγμα.

Κύριομείγμασύνδεσηςμελιγάση

Αντιδραστήριο Όγκος(μL) Συνιστώμενοιόγκοιγια24βιβλιοθήκες(μL)


Ένζυμοσύνδεσηςμελιγάση(Ε) 2,5μL 63,2μL ΜπλεΡυθμιστικόδιάλυμασύνδεσηςμελιγάση(ΣΤ)

30μL 757,5μL Μαύρο

Συνολικόςόγκος 32,5 820,7μL

4.19 – Διανείμετε το κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση σε μια στήλη της πλάκαςαντιδραστηρίωνπουδεχρησιμοποιείται.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.

4.20 –Προσθέστε32,5μLκύριουμείγματοςσύνδεσηςμελιγάσησεκάθεπηγάδιτηςπλάκαςαντίδρασης.Συνιστάταιηχρήσηπιπέταςπολλώνκαναλιών.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.



Σελίδα34│52

4.22 –Επωάστετηνπλάκααντίδρασηςστοθερμικόκυκλοποιητήμετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Πρόγραμμασύνδεσηςμελιγάση


Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους 4 °C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 °C για μεγαλύτερο χρονικόδιάστημα.

Ομαδοποίησηκαικαθαρισμόςβιβλιοθήκης4.23 –ΑφήστετασφαιρίδιαAMPureXPναμεταβούνσεθερμοκρασίαδωματίου.Βεβαιωθείτε

ότι είναι ομοιογενή (δεν υπάρχουν συσσωματώματα ή ιζήματα). Προετοιμάστε 5 mLπρόσφαταπαρασκευασμένηςαιθανόλης80%(4mLEtOH+1mLH2O).

4.24 –ΔημιουργήστετηΒιβλιοθήκη,συνδυάζονταςτογνωστόκλάσμααπόκάθεομαδοποιημένοαμπλικόνιο, τώρα πλέον μια βιβλιοθήκη συγκεκριμένου δείγματος, σε ένα σωληνάριομικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης2,0mL.

I. Για 16 ή περισσότερα δείγματα – Υπολογίστε την ποσότητα κάθε βιβλιοθήκηςδείγματοςγιαομαδοποίησησεμίαΒιβλιοθήκησυνολικούόγκου900μL.Διαιρέστετα900μLμετοναριθμότωνβιβλιοθηκώνδείγματος.ΑυτόςείναιοόγκοςγνωστούκλάσματοςπουπρέπειναληφθείαπόκάθεβιβλιοθήκηδείγματοςκαιναπροστεθείμεπιπέταστηΒιβλιοθήκη.

II. Γιαλιγότερααπό16δείγματα–Μεταφέρετε60μLκάθεβιβλιοθήκηςδείγματοςσεμιαΒιβλιοθήκη.

4.25 – Προσθέστε 900 μL σφαιριδίων AMPure XP στο σωληνάριο Βιβλιοθήκης, αλλά μηνακουμπήσετετηΒιβλιοθήκημετορύγχοςτηςπιπέτας.Αναμίξτεσχολαστικάμεσύντομηπεριδίνησηκαιφυγοκέντριση.Μηνεπιτρέψετετοδιαχωρισμότωνσφαιριδίων.Επωάστετηβιβλιοθήκηγια10λεπτάσεθερμοκρασίαδωματίου.

Σημείωση: Εφόσον υπάρχουν λιγότερα από 900 μL βιβλιοθήκης στην τελικήομαδοποιημένηβιβλιοθήκη,προσθέστεισοδύναμηποσότητασφαιριδίωνAMPureXP.Θαπρέπειναυπάρχειαναλογία1:1τηςτελικήςομαδοποιημένηςβιβλιοθήκηςκαιτωνσφαιριδίωνAMPureXP.

4.26 – Τοποθετήστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης σε μια μαγνητική βάση και επωάστε για10λεπτά.


Σελίδα35│52

4.27 – Κρατώντας το σωληνάριο πάνω στη μαγνητική βάση, αφαιρέστε και απορρίψτεπροσεκτικά το υπερκείμενο από το σωληνάριο Βιβλιοθήκης, χωρίς να αγγίξετε τασφαιρίδια.

4.28 –Κρατώνταςτοσωληνάριοπάνωστημαγνητικήβάση,προσθέστε~1,5–2mLπρόσφαταπαρασκευασμένηςαιθανόλης80%στοσωληνάριοΒιβλιοθήκης.Οόγκος τηςαιθανόληςπουπροστίθεταιπρέπειναεπαρκείγιανακαλύψειτασφαιρίδια.

Σημείωση: Εφαρμόστε την αιθανόλη στο τοίχωμα του σωληναρίου χωρίςσφαιρίδια.

4.29 –ΕπωάστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςσεθερμοκρασίαδωματίουγια30δευτερόλεπτακαι,στησυνέχεια,αφαιρέστεκαιαπορρίψτεπροσεκτικάτουπερκείμενο.

4.30 –Επαναλάβετεταβήματα4.28και4.29.

4.31 –ΥποβάλετεγρήγορασεσύντομηφυγοκέντρισητοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςκαιτοποθετήστετοξανάστημαγνητικήβάσημετοκαπάκιανοικτό.Αφαιρέστετηνυπολειπόμενηαιθανόλημεμιαπιπέτα.Μηνακουμπήσετετασφαιρίδια.

Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι το ίζημα σφαιριδίων δεν περιέχει υπολειπόμενηαιθανόλη. Ενδεχομένως να απαιτηθεί η περιστροφή του σωληναρίου στημαγνητικήβάσηγιατηναπομάκρυνσητηςαιθανόλης,χωρίςναδιαταραχθείτοίζημασφαιριδίων.

4.32 –Αφήστετασφαιρίδιαναστεγνώσουνστοναέραγια5-8λεπτάστημαγνητικήβάση,μέχριναστεγνώσειτοίζημασφαιριδίων.

4.33 –ΑφαιρέστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςαπότημαγνητικήβάσηκαιδιενεργήστεέκλουσητηςΒιβλιοθήκηςμε31μLνερούυψηλήςκαθαρότητας,κατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας.Μηνεπιτρέψετεστορύγχοςτηςπιπέταςναακουμπήσειτασφαιρίδια,διότιθακολλήσουνεπάνωσεαυτό.

4.34 – Υποβάλετε σε περιδίνηση τη Βιβλιοθήκη, ώστε να επανεναιωρηθούν τα σφαιρίδια.Φυγοκεντρίστε σύντομα, εφόσον στα πλαϊνά τοιχώματα παραμένουν σταγονίδια.Βεβαιωθείτεότιτασφαιρίδιαπαραμένουνσεεναιώρημα.

4.35 –ΕπωάστετηΒιβλιοθήκησεθερμοκρασίαδωματίουγια2λεπτά.

4.36 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοΒιβλιοθήκηςστημαγνητικήβάσηγια2λεπτά.

4.37 Συλλέξτετηβιβλιοθήκη:Διατηρώνταςτοσωληνάριοτελικήςβιβλιοθήκηςστημαγνητικήβάση, συλλέξτε 31 μL του υπερκείμενου σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1.5mL.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.


Σελίδα36│52

Βήμα5–ΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςΔιάρκεια:~1ώραΤοβήμα5παίρνειτηΒιβλιοθήκηαπότοβήμα4καιδιενεργείεπιλογήμεγέθους,χρησιμοποιώνταςτοPippinPrep.ΤοPippinPrepμπορείναεπιλέξειαυτόματαέναεύροςμεγεθώνθραυσμάτωνDNAκαιναδιενεργήσειέκλουσησεέναθάλαμοσυλλογής.Σημείωση:ΤοBluePippinμπορείναχρησιμοποιηθείαντίγιατοPippinPrep.ΑνατρέξτεστοΠαράρτημα1γιατιςΟδηγίεςχρήσηςτουPippinPrep.

Λίστααντιδραστηρίων

Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεταιαπότην

Κασέταπηκτώματοςαγαρόζης1,5%,χωρίςχρωστική 20°Cέως25°C SageScienceΜείγμαδιαλύματοςφόρτωσης/δείκτηPippin(δείκτηςΚ)

4°C SageScience

Ομαδοποιημένηβιβλιοθήκη 4°C Βήμα4

Σημείωση:Ο Δείκτης Κ χρησιμοποιείται, συνήθως, με το Pippin Prep. Το BluePippinχρησιμοποιείτοΔείκτηR2.

Πρωτόκολλο5.1 –ΦέρτετοδιάλυμαφόρτωσηςΔείκτηΚσεθερμοκρασίαδωματίου.

5.2 – Συνδυάστε 31 μL της ομαδοποιημένης βιβλιοθήκης με 10 μL διαλύματος φόρτωσηςΔείκτηΚ.

5.3 –Αναμίξτε,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

5.4 –ΔιαμορφώστετοPippinPrep,έτσιώστενασυλλέξειθραύσματαDNAμεγέθουςμεταξύ650και1300bps.Φορτώστετοδείγμα40μLστηθύραδείγματοςκαιαναλύστε.Οχρόνοςανάλυσηςείναι45-50λεπτά.

5.5 –Συλλέξτεόλοτοπεριεχόμενο(περίπου40μL)απότηθύραέκλουσηςτουPippinPrepκαιμεταφέρετέτοσεένανέοσωληνάριομικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1,5mL.Αυτήείναιηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.


Σελίδα37│52

Βήμα6–Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκηςμε τοόργανοqPCRΔιάρκεια:~1ώρα15λεπτάΗποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθους είναι απαραίτητη για τη βέλτιστηχρήσητηςεξόδουτηςσυσκευήςαλληλούχισηςIlluminaMiSeq.ΗσυγκέντρωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςμπορείναμετρηθείμεακρίβειαμέσωqPCR.Προαιρετικά,μπορείτεναχρησιμοποιήσετετοκιτQubitdsDNABRκαιμιασυσκευήQubitγιατημέτρησησυγκέντρωσηςτηςβιβλιοθήκης.Γιααυτότοπρωτόκολλο,βλ.Παράρτημα3.


10×IlluminaPrimerPremix -20°C KAPABiosystems2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix -20°C KAPABiosystemsStd1(20.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0.20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0.02pM) -20°C KAPABiosystemsIlluminaDNAStandards -20°C KAPABiosystemsH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


ΡυθμιστικόδιάλυμαTE1×(pH8,0) 20°Cέως25°C ΧρήστηςΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους 4°C Βήμα5

Πρωτόκολλο1 –ΠαρασκευάστετομείγμαεκκινητήqPCR,χρησιμοποιώνταςτο10×IlluminaPrimerPremix

καιτο2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix:

Σημείωση:ΤααντιδραστήριατουκιτKAPASYBRFASTqPCR(κύριομείγμαqPCR,προμείγμαεκκινητήκαιδιαλύματαROX)συνδυάζονταικατάτηνπρώτηχρήσητουκιτ. Αυτό το συνδυασμένο διάλυμα διατηρείται σταθερό για τουλάχιστον30 κύκλους ψύξης/απόψυξης. Ακολουθήστε την τεκμηρίωση της KAPA για ναπροσδιορίσετεανταROXσυνιστώνταιγιατοόργανοqPCRσας.

ΜείγμαεκκινητήqPCR

Αντιδραστήριο Όγκος(mL)10×IlluminaPrimerPremix 1mL2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix 5mLΣυνολικόςόγκος 6mL


Σελίδα38│52

2 –ΠαρασκευάστετοκύριομείγμαqPCR.

ΚύριομείγμαqPCR

Αντιδραστήριο Όγκος(μL)ΜείγμαεκκινητήqPCR 228μLH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας

76μL

Συνολικόςόγκος 304μL

3 –Προετοιμάστεδιαδοχικήαραίωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους.

α. Παρασκευάστε διάλυμα 1:1000, προσθέτοντας 1 μL της βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθουςσε999μLρυθμιστικούδιαλύματοςTE1×(pH8,0),ξεπλένονταςσχολαστικάτορύγχοςτηςπιπέτας.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

β. Παρασκευάστε διάλυμα 1:2000, προσθέτοντας 100 μL του διαλύματος 1:1000 σε100μL τουρυθμιστικούδιαλύματοςTE1× (pH8,0). Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

4 – Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qPCR σε μια νέα πλάκα PCRσυμβατήμετοσύστημαqPCRσας.

5 –Διανείμετε16μLτουκύριουμείγματοςqPCRειςτριπλούνγιαταπρότυπα1-4,τοδιάλυμα1:1000καιτοδιάλυμα1:2000(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).

6 –Διανείμετε4μLτωνπροτύπων1-4,τουδιαλύματος1:1000καιτουδιαλύματος1:2000στααντίστοιχαπηγάδια.

7 – Σφραγίστε την πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qPCR και φυγοκεντρίστε την για10δευτερόλεπτα.

Σημείωση: Αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων στα πηγάδια της πλάκαςποσοτικού προσδιορισμού qPCR. Φυγοκεντρίστε, εφόσον απαιτηθεί για τηνεξάλειψητωνφυσαλίδων.

8 –Ορίστετατριπλότυπα1:1000και1:2000ωςστοχευμέναδείγματακαιορίστεταπρότυπα(σημεία: 4, συγκέντρωση έναρξης: 20 pM, αραίωση: 1:10). Εκτελέστε το παρακάτωπρόγραμμαστοόργανοqPCR,προκειμένουναπροσδιορίσετετησυγκέντρωσηDNAστηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους:

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 95°C 5λεπτά25

(χωρίςκαμπύλητήξης)95°C 30δευτερόλεπτα60°C 90δευτερόλεπτα(λήψηδεδομένων)

9 –ΓιατημετατροπήτουαποτελέσματοςqPCRαπόσυγκέντρωσηpMσεnM,καταχωρίστετααποτελέσματα«Quantitymean»(Μέσηποσότητα)τωνδύοαντιγράφωνβιβλιοθήκηςστηνκαρτέλα«LibraryQuantitation»(Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκης)τουΒιβλίουεργασίαςOmixon.


Σελίδα39│52

10 –Χρησιμοποιώνταςτουςόγκουςαπότοβιβλίοεργασίας,αραιώστε10μLτηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους,σεσυγκέντρωση2nM,μεαποστειρωμένοH2Oσενέοσωληνάριομικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL. Φυλάξτε την υπόλοιπη βιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςστους-20°C.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.Σεπερίπτωσημακρόχρονηςφύλαξης,συνιστάται ιδιαίτερα η εκ νέου ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πριν από τηνανάλυσηστοMiSeq.


Σελίδα40│52

Βήμα7–ΑλληλούχισηστοIlluminaMiSeqΔιάρκεια:~24ώρεςΤο IlluminaMiSeq αποτελεί ένα αυτοματοποιημένο όργανο NGS που μπορεί να διενεργήσειαλληλούχισητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςπουπαρασκευάστηκεσταπροηγούμεναβήματα.Ηδιαίρεσητωνδειγμάτωνμεδείκτεςσεξεχωριστάαρχείαγιακάθεδείκτη/δείγμα(de-multiplexing)πραγματοποιείταιαυτόματα,κατόπινολοκλήρωσηςτηςεκτέλεσηςτηςαλληλούχισης.

Γρήγορησυμβουλή–Μπορείτεναχρησιμοποιήσετεέναπρόσθετο(spike-in)1%PhiXως επιπλέον μάρτυρα για την παρακολούθηση της αντίδρασης αλληλούχισης.ΑνατρέξτεστηντεκμηρίωσητουIlluminaγιαπερισσότερεςπληροφορίεςσχετικάμετομάρτυραPhiX.


Φύσιγγααντιδραστηρίου -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaΚυψελίδαροήςMiSeq 4°C IlluminaΒιβλιοθήκηστα2nM 4°C Βήμα6NaOH1Nή2N 20°Cέως25°C ΧρήστηςH2Oυψηλήςκαθαρότηταςκατάλληλογιαεφαρμογέςμοριακήςβιολογίας


ΙκανότητακιταντιδραστηρίωνMiSeq

ΚιταντιδραστηρίωνIlluminaMiSeq

ΧρόνοςΏρες

24/11δείγματα


~39 24


~24 24

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 20


~28 8


~17 4

Πρωτόκολλο7.1 –ΠροετοιμάστετοMiSeqσύμφωναμετατυπικάπρωτόκολλαIllumina.


Σελίδα41│52

7.2 – Παρασκευάστε μια αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 1 nM: Συνδυάστε 10 μL πρόσφαταπαρασκευασμένου 0,2 N NaOH και 10 μL της αραιωμένης βιβλιοθήκης επιλεγμένουμεγέθους 2 nM σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.Επωάστεαυτήτηναποδιαταγμένηβιβλιοθήκη1nMσεθερμοκρασίαδωματίουγια5λεπτά.

7.3 –Παρασκευάστεμιααποδιαταγμένηβιβλιοθήκη20pM:Προσθέστε980μLψυχρούHT1στα20μLτηςαποδιαταγμένηςβιβλιοθήκης1nM.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

7.4 –Παρασκευάστεμιααποδιαταγμένηβιβλιοθήκη9pM:Προσθέστε550μLψυχρούHT1και450 μL της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 20 pM σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρουχαμηλήςδέσμευσης1,5mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

7.5 – Μεταφέρετε 600 μL της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 9 pM στο δοχείο φόρτωσηςδειγμάτωντηςφύσιγγαςαντιδραστηρίουτουMiSeq.

Γρήγορησυμβουλή–ΣυνιστάταιηχρήσητουπαρεχόμενουβιβλίουεργασίαςγιατηδημιουργίατουφύλλουδείγματοςπουαπαιτείταιαπότοMiseq.


Σελίδα42│52

Βήμα8–ΑνάλυσητωνδεδομένωναλληλούχισηςHLAΤοIlluminaMiSeqθαυποβάλλεισεεπεξεργασίατηνομαδοποιημένηβιβλιοθήκη9pMκαιθαδημιουργήσειδεδομένααλληλούχισηςωςαρχείαfastq.ΑνατρέξτεστοεγχειρίδιοτουHLATwinγιαβοήθεια,όσοναφοράστησωστήεγκατάστασητουHLATwin,όπωςκαιγιαπληροφορίεςσχετικάμετηνερμηνείατηςανάλυσηςπροσδιορισμούγονοτύπουτωνδεδομένωναλληλούχισης.Γιατηνεφαρμογήτουαυτοματοποιημένουπρωτοκόλλουκαιτωνθεμάτωνπουσχετίζονταιμετηνεγκατάστασηήανάλυσηδεδομένων,επικοινωνήστεμετηδιεύθυνση[email protected].

Αυτοματοποιημένοπρωτόκολλο

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT1. ΕγκαταστήστετοHLATwinServerστοΔιακομιστή.

§ Εγκαταστήστε το HLA Twin Client σε υπολογιστή-πελάτη. Στο διακομιστή μπορούν νασυνδεθούνπερισσότερααπόέναHLATwinClient.

§ ΕπικοινωνήστεμετηνΥποστήριξητηςOmixon([email protected])γιαεξατομικευμένεςοδηγίεςεγκατάστασηςγιααυτοματοποίηση.

Πρωτόκολλοανάανάλυση1. ΕκκινήστετοHLATwinClientκαισυνδεθείτε.

2. Τα δεδομένα έχουν ήδη υποβληθεί ή υποβάλλονται σε επεξεργασία. Ελέγξτε τααποτελέσματα,χρησιμοποιώνταςτοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.

3. Εξαγάγετετααποτελέσματαπροσδιορισμούγονοτύπουή/καιτιςσυναινετικέςαλληλουχίεςανάλογαμετιςαπαιτήσεις.

Μηαυτόματοπρωτόκολλοδιακομιστή

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT§ ΕγκαταστήστετοHLATwinServerστοΔιακομιστή.§ ΕγκαταστήστετοHLATwinClientσευπολογιστή-πελάτη.

Πρωτόκολλοανάανάλυση§ ΕκκινήστετοHLATwinClientκαισυνδεθείτε.§ Επιλέξτε τα δεδομέναMiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίηση

HolotypeHLA.§ Μόλις ολοκληρωθεί η τυποποίηση Holotype HLA, ελέγξτε τα αποτελέσματα,

χρησιμοποιώνταςτοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.§ Εξαγάγετετααποτελέσματαπροσδιορισμούγονοτύπουή/καιτιςσυναινετικέςαλληλουχίες

ανάλογαμετιςαπαιτήσεις.


Σελίδα43│52

Μηαυτόματοπρωτόκολλουπολογιστή

ΡύθμισηκαιδιαμόρφωσηIT§ ΕγκαταστήστετοHLATwinDesktop.

Πρωτόκολλοανάανάλυση6 ΕκκινήστετοHLATwinκαισυνδεθείτε.

7 Επιλέξτε τα δεδομέναMiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίησηHolotypeHLA.

8 Μόλις ολοκληρωθεί η τυποποίηση Holotype HLA, ελέγξτε τα αποτελέσματα, χρησιμο-ποιώνταςτοσύστημαφωτεινώνσηματοδοτώνστοHLATwin.

9 Εξαγάγετετααποτελέσματαπροσδιορισμούγονοτύπουή/καιτιςσυναινετικέςαλληλουχίεςανάλογαμετιςαπαιτήσεις.


Σελίδα44│52

Συμπληρωματικέςεικόνες

Παράδειγμαπλάκας για την πλάκααμπλικονίων, πλάκα ενίσχυσης,πλάκααραίωσης,πλάκαποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(γιαέναγενετικότόπο)καιπλάκααντίδρασης

Παράδειγμαπλάκαςποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων


Σελίδα45│52

Παράδειγμα πλάκας qPCR ποσοτικού προσδιορισμού βιβλιοθήκηςKAPA


Σελίδα46│52

Παράρτημα1:PippinPrep

ΠρογραμματισμόςτουPippinPrep1. ΚάντεκλικστηνκαρτέλαProtocolEditor(Επεξεργασίαπρωτοκόλλου)και,στησυνέχεια,

στοκουμπί«New»(Νέο).

2. ΚάντεκλικστοεικονίδιοφακέλουπουβρίσκεταιδίπλαστοπεδίοCassette(Κασέτα)καιεπιλέξτε«1.5%DFMarkerK»(ΔείκτηςΚDF1,5%)γιατοPippinPrepή«1.5%DFMarkerR2»(ΔείκτηςR2DF1,5%)γιατοBluePippin.

3. Στηστήληπουπρογραμματίζετε:

α. Επισημάνετετοπεδίο«Range»(Εύρος).β. Ορίστε την τιμή «Ref Lane» (Στήλη αναφοράς), ώστε να ταιριάζει με τον αριθμό

στήληςστονοποίοεργάζεστε.γ. Ορίστετοπεδίο«Start*»(Έναρξη*)στηντιμή650.δ. Ορίστετοπεδίο«End*»(Λήξη*)στηντιμή1300.

4. ΣτοπεδίοReferenceLane(Στήληαναφοράς),επιλέξτετηνστήληστηνοποίαεργάζεστε.

5. Κάντεκλικστοκουμπί«SaveAs»(Αποθήκευσηως)καιδώστεόνομαστοπρόγραμμάσας.

ΕκτέλεσητουPippinPrep1. Ενεργοποιήστε το Pippin Prep, πιέζοντας το κουμπί λειτουργίας στο πίσω μέρος της

συσκευής.

2. Επιθεωρήστεοπτικά τοPippinPrep.Βεβαιωθείτεότι οι 5 ενδεικτικές λυχνίες LEDείναιαναμμένεςκαιότιτοεσωτερικότηςσυσκευήςείναικαθαρόκαιστεγνό.

3. ΚάντεκλικστολογότυποSageScienceστηνκάτωδεξιάγωνίατηςοθόνης.Θασαςζητηθείνα καταχωρήσετε έναν κωδικό πρόσβασης. Ο εργοστασιακά προεπιλεγμένος κωδικόςπρόσβασηςείναι«pips».

4. ΚάντεκλικστηνκαρτέλαFactorySetup(Εργοστασιακήρύθμιση)καιβεβαιωθείτεότιητιμήBase-to-Threshold(Βάσηέωςκατώφλι)έχειοριστείσε0,02.

5. Τοποθετήστε τη διάταξη βαθμονόμησης στο εσωτερικό του Pippin Prep, φροντίζονταςώστεησκούραλωρίδαναείναιστραμμένηπροςτακάτωκαιπάνωαπότιςενδεικτικέςλυχνίεςLED.

6. ΣτηνκαρτέλαMain(Κύρια),κάντεκλικστοκουμπί«Calibration»(Βαθμονόμηση).

7. Στο παράθυροCalibration (Βαθμονόμηση), βεβαιωθείτε ότι το πεδίο «Target I pHmA»(ΣτόχοςIpHmA)έχειοριστείστηντιμή0,80(0,60γιατοBluePippin)και,στησυνέχεια,πιέστετοκουμπί«Calibration»(Βαθμονόμηση).

8. Μεταβείτε στην καρτέλα Protocols (Πρωτόκολλα). Κάντε κλικ στο κουμπί «Load»(Φόρτωση)καιεπιλέξτετοπρόγραμματουHolotypeHLAκαιτησυγκεκριμένηστήληπουθαχρησιμοποιήσετε.Βεβαιωθείτεότι:


Σελίδα47│52

α. Ησωστήστήληείναιενεργοποιημένηβ. Ηένδειξηεπιλογήςευρέωςφάσματοςείναιενεργοποιημένηγ. Ηστήληαναφοράςείναιηίδιαμετηστήληπουθαεκτελεστεί.

9. ΜεταβείτεστηνκαρτέλαMain(Κύρια).Βεβαιωθείτεότι:

α. Τοπρόγραμμαπουέχετεφορτώσειείναιτοεπιλεγμένο.β. Έχειεπιλεγείηκατάλληληστήληαναφοράςκαιότιείναιεπίσηςηστήληόπουθα

αναλυθείτοδείγμα.

10. Επιθεωρήστε την κασέτα. Προτού αφαιρέσετε την ταινία που σφραγίζει τα πηγάδια,βεβαιωθείτεότιδενυπάρχουνφυσαλίδεςπίσωαπότηθύραέκλουσης.Σεπερίπτωσηπουυπάρχουν φυσαλίδες πίσω από τη θύρα έκλουσης, χτυπήστε ελαφρά και κυλήστε τηνκασέταστοχέρισας,έτσιώστενααπομακρυνθούνοιφυσαλίδες.

11. Τοποθετήστετηνκασέτα,διατηρώνταςτηνταινίαπάνωαπόταπηγάδια,στοεσωτερικότουPippinPrep.

12. Αφαιρέστεπροσεκτικά την ταινία,φροντίζοντας να τηναπομακρύνετεαπό την καθαρήπλευράτηςκασέτας(στήλη5)προςτηχρησιμοποιημένηπλευρά(στήλη1).Προσέξτεναμηχυθείυγρόκατάτηναφαίρεσητηςταινίας,προκειμένουνααποφευχθείημόλυνση.

13. Αφαιρέστεόλοτονόγκοτουρυθμιστικούδιαλύματοςαπότηθύραέκλουσηςτηςστήληςπου θα χρησιμοποιήσετε και προσθέστε 40 μL νέου ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτρο-φόρησηςσεεκείνητηθύραέκλουσης.

14. Προσθέστεμιαστενήλωρίδαταινίαςπάνωστιςθύρεςέκλουσης.

15. Οιτυχόνδεξαμενέςπουείναιπλήρειςλιγότεροαπότα3/4πρέπεινασυμπληρωθούνμερυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Μην παραγεμίσετε τα πηγάδια! Το άκρο τουρυθμιστικούδιαλύματοςπρέπειναφτάνειοριακάτοπλαστικό,ναμηνείναιυψηλότερο,γιατηναποφυγήμετακίνησηςκατάτηνολίσθησητουκαπακιού.Εφαρμόστερυθμιστικόδιάλυμααπότακαθαράπηγάδια(Στήλη5)σταχρησιμοποιημέναπηγάδια(Στήλη1).

16. Βεβαιωθείτε ότι τα πηγάδια φόρτωσης (πηγάδια με αγαρόζη) έχουν πληρωθεί μερυθμιστικόδιάλυμαηλεκτροφόρησης.Τορυθμιστικόδιάλυμαπρέπειείναιοριακάπάνωαπότηναγαρόζηκαιεντελώςεπίπεδο.

17. Κλείστε το Pippin Prep αργά, φροντίζοντας, ώστε το ρυθμιστικό διάλυμα να μηνακουμπήσειτοκαπάκικαθώςκλείνετετησυσκευή.

18. Εκτελέστετηδοκιμήσυνέχειας.Μόλιςστεγνώσουνελαφρώςοιαισθητήρες,ηαποτυχίατηςδοκιμήςσυνέχειαςμιαφοράαποτελείσυνηθισμένοφαινόμενο.Εφόσοναποτύχειηδοκιμήσυνέχειας,εκτελέστετηνμίαακόμηφορά.Μόλιςολοκληρωθείηδοκιμήσυνέχειας,ανοίξτε αργά το Pippin. Φροντίστε να μην υπάρξει μεταφορά υγρού κατά μήκος τηςκασέταςαπότοκαπάκιτουPippinPrep.

19. Υποβάλετε το διάλυμα φόρτωσης Δείκτη Κ σε σύντομη περιδίνηση και σύντομηφυγοκέντριση.Προσθέστε10μLδιαλύματοςφόρτωσηςΔείκτηΚστηβιβλιοθήκη~30μL.

20. Υποβάλετετηβιβλιοθήκησεσύντομηπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.


Σελίδα48│52

21. Αφαιρέστε 40 μL ρυθμιστικού διαλύματος από το πηγάδι δείγματος που θαχρησιμοποιήσετε.

22. Προσθέστε 40 μL της βιβλιοθήκης με τον Δείκτη Κ στο πηγάδι δείγματος που θαχρησιμοποιήσετε.

23. Σημειώστετααρχικάτουτεχνικούκαιτηνημερομηνίαστηστήληπουχρησιμοποιείτε.

24. ΚλείστετοPippinPrepκαικάντεκλικστοκουμπί«Start»(Έναρξη).Βεβαιωθείτεότιέχειενεργοποιηθείηκατάλληληστήλη.Τοδείγμαθαυποβληθείσεεπεξεργασίαγιαπερίπου45λεπτά.

25. Μόλιςολοκληρωθείηεπεξεργασία,ανοίξτεπροσεκτικάτοPippinPrep.Προσέξτεναδείτεεάντοκαπάκιμεταφέρειτυχόνυγρόκατάμήκοςτηςκασέτας.

26. Αφαιρέστετηνταινίααπότιςθύρεςέκλουσης,προσέχονταςναμηνπιτσιλιστείυγρό.

27. Μεταφέρετε όλο τον όγκο από τη θύρα έκλουσης σε ένα νέο σωληνάριο χαμηλήςδέσμευσης1,5mL.

28. Καλύψτε όλα τα ανοικτά πηγάδια με δύο κομμάτια της ταινίας σφράγισης πλακών.Θυμηθείτε να αφήσετε μια προεξοχή στην καθαρή πλευρά. Αυτή θα διευκολύνει τηναφαίρεσητηςταινίαςαπότηνκαθαρήπροςτηχρησιμοποιημένηπλευρά.

29. Τοποθετήστετησφραγισμένηκασέταστηθήκητηςκαιαφήστετηνστηνάκρη.

30. ΠάρτετηνκασέταπλύσηςκαιγεμίστετηνμενερόMiliQ.ΚλείστεπροσεκτικάτοκαπάκιτουPippinPrep,προσέχονταςναμημεταφέρετευγρόκατάμήκοςτηςκασέταςπλύσης.

32. ΔιατηρείστετοPippinPrepκλειστόγιααρκετάδευτερόλεπτα.

33. Ανοίξτε το Pippin Prep, προσέχοντας να μη μεταφέρετε υγρό κατά μήκος της κασέταςπλύσης.

34. Αφαιρέστετηνκασέταπλύσης,αδειάστετονερόκαιαφήστετηνναστεγνώσει.

35. ΣκουπίστετυχόννερόαπότοPippinPrepκαικλείστετοπροσεκτικά.

36. Επιλέξτετοκουμπί«ShutDown»(Τερματισμόςλειτουργίας)στομενούτουPippinPrep.


Σελίδα49│52

Παράρτημα 2: Ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίωνμετοόργανοqPCRΔιάρκεια:40λεπτά


ΡυθμιστικόδιάλυμαTE20×(pH7,5) 4°C PromegaLambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C PromegaΧρωστικήQuantiFluordsDNA200× 4°C PromegaΑποστειρωμένοH2O 20°Cέως25°C ΧρήστηςΠλάκα(ες)ενίσχυσηςΤάξηςI 4°C Βήμα2Πλάκα(ες)ενίσχυσηςΤάξηςII 4°C Βήμα2

Πρωτόκολλο2. Δημιουργήστεμιαδιαδοχικήαραίωση,χρησιμοποιώνταςσωληνάριαμικροφυγόκεντρου

1,5 mL και το πρότυπο DNA Λάμδα της QuantiFluor (100 ng/μL). Ακολουθήστε τονπαρακάτωπίνακααραίωσης:

Ετικέταστοσωληνάριο DNAεισόδου ΌγκοςDNA

(μL)Όγκος1xTE

(μL)Τελικήσυγκ.

(ng/μL)Πρότυπο1 DNAΛάμδα 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLΠρότυπο2 Πρότυπο1 250μL 250μL 0,75ng/μLΠρότυπο3 Πρότυπο2 250μL 250μL 0,38ng/μLΠρότυπο4 Πρότυπο3 250μL 250μL 0,19ng/μLΠρότυπο5 Πρότυπο4 250μL 250μL 0,09ng/μLΠρότυπο6 Πρότυπο5 250μL 250μL 0,05ng/μLΠρότυπο7,Τυφλό Τυφλό 0μL 250μL 0ng/μL

3. Προετοιμάστετιςπλάκεςποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες). Διανείμετε 49,5μL ρυθμιστικούδιαλύματος TE1xσταπηγάδιαμιας καθαρήςπλάκας 96 πηγαδιών για τον συνολικό αριθμό των αμπλικονίων για τα οποίαπραγματοποιείταιποσοτικόςπροσδιορισμός.

4. Προσθέστε0,5μLαμπλικονίωναπότααντίστοιχαπηγάδιατωνπλακώναμπλικονίωνσεμεμονωμέναπηγάδιατωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων.Αναμείξτεμεεπανειλημμένηαναρρόφησηκαιέγχυσημετηνπιπέτα.

5. Παρασκευάστε διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, χρησιμοποιώντας τονπαρακάτωτύπο:0,25μLχρωστικήςQuantiFluor(200X)+49,75μLρυθμιστικόδιάλυμαTE1×. Παρασκευάστε επαρκές διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1×, ώστε κάθε


Σελίδα50│52

δείγμα(σύνολοδειγμάτωνστιςπλάκεςαμπλικονίων)καιπρότυπο(14συνολικά)ναλάβειγνωστόκλάσμα50μL.

6. Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων και πλάκες ποσοτικούπροσδιορισμού αμπλικονίων. Διανείμετε 50 μL διαλύματος εργασίας της χρωστικήςQuantiFluor1×σεπηγάδιαοπτικώνπλακών96πηγαδιών,χρησιμοποιώνταςτημορφήτηςπλάκαςποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπωνκαιτωνπλακώνποσοτικούπροσδιορισμούαμπλικονίων(βλ.συμπληρωματικέςεικόνες).

7. Χρησιμοποιώνταςταπρότυπαπουπαρασκευάστηκανπαραπάνω,προσθέστε50μLαπόκάθε πρότυπο, εις διπλούν, σε μεμονωμένα πηγάδια στην πλάκα ποσοτικούπροσδιορισμούπροτύπων(14πηγάδιασυνολικά).

8. Αναμίξτεσχολαστικά,υποβάλλονταςσεπεριδίνησηκαισεσύντομηφυγοκέντριση.

9. ΤοποθετήστεκάθεπλάκαποσοτικούπροσδιορισμούστοόργανοqPCR,μίακάθεφορά,καιεκτελέστετοπαρακάτωπρόγραμμα:

Αριθμόςκύκλων Θερμοκρασία Χρόνος1 25°C 10δευτερόλεπτα 25°C 15δευτερόλεπτα2 25°C 30δευτερόλεπτα(λήψηδεδομένων)

10. Υπολογίστε τη συγκέντρωση DNA στις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων,χρησιμοποιώνταςταανεπεξέργασταδεδομέναRFUπουδημιουργήθηκαναπότοόργανοqPCR.

11. Αραιώστε DNA στις πλάκες αμπλικονίων με αποστειρωμένο H2O, έτσι ώστε η τελικήσυγκέντρωσηDNAναείναιπερίπου67ng/μL.

§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι150ng/μLήμεγαλύτερη:προσθέστε25μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναι100-150ng/μL:προσθέστε10μLH2O§ ΕάνησυγκέντρωσηDNAείναιμικρότερηαπό100ng/μL:προσθέσετε0μLH2O


Σελίδα51│52

Παράρτημα 3: Ποσοτικός προσδιορισμός βιβλιοθήκηςμε χρήση παρεμβαλλόμενης φθορίζουσας χρωστικήςdsDNAΔιάρκεια:~15λεπτάΗσυγκέντρωσητηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθουςμπορείναμετρηθείμεακρίβεια,μέσωπαρεμβαλλόμενηςφθορίζουσαςχρωστικήςdsDNA,όπωςηSYBRgreenήισοδύναμη.Ταεμπορικάδιαθέσιμακιτκαιόργαναγιααυτόντονσκοπόπεριλαμβάνουν,ενδεικτικά,τησυσκευήανάγνωσηςQubitτηςThermoFisher(χρησιμοποιείτοκιτανάλυσηςQubitBroad-RangedsDNA),τησυσκευήανάγνωσηςQuantusτηςPromega(χρησιμοποιείτηφθορίζουσαχρωστικήdsDNAQuantifluor)και άλλα. Εδώ περιγράφεται η μέθοδος Qubit, καθώς είναι το όργανο που χρησιμοποιείταισυνήθως. Σε περίπτωση που χρησιμοποιείται άλλο όργανο και κιτ, ακολουθήστε τις τυπικέςοδηγίεςτουκατασκευαστή.

Σημείωση:ΑυτήηφθοριομετρικήμέθοδοςdsDNAείναιέναςγρήγορος,ωστόσοαρκετάακριβής,τρόποςκαθορισμούτηςσυγκέντρωσηςτηςτελικήςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους.ΜετράειόλοτοdsDNAπουβρίσκεταιστηβιβλιοθήκη.


ΚιτανάλυσηςQubitdsDNABR θερμοκρασίαδωματίου ThermoFisherΠρότυπαQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherΒιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθους 4°C Βήμα5

Πρωτόκολλο6.1 – Φέρτε τα Πρότυπα Qubit σε θερμοκρασία δωματίου. Προετοιμάστε τα σωληνάρια

ανάλυσηςQubit(500μL,λεπτούτοιχώματος)γιατηβιβλιοθήκη,ειςδιπλούν,καιγιαταδύοπρότυπα.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαιφυγοκέντρισηταπρότυπακαιτηβιβλιοθήκη.

6.2 – Προσθέστε 995 μL ρυθμιστικού διαλύματος και 5 μL χρωστικής σε σωληνάριοφυγοκέντρισης1,5mL.Υποβάλετεσεπεριδίνησηκαισύντομηφυγοκέντριση.

6.3 –Μεταφέρετε190μLαπότομείγμααντιδραστηρίωνστασωληνάριαQubit για ταδύοπρότυπα.Μεταφέρετε198μLαπότομείγμααντιδραστηρίωνσταδύοσωληνάριαQubitγιαταδιπλότυπατηςβιβλιοθήκης.

6.4 –Προσθέστε10μLτουπροτύπου1στοαντίστοιχοσωληνάριοQubitκαιυποβάλετέτοσεπεριδίνησηγια2δευτερόλεπτα.Επαναλάβετεμετοπρότυπο2.

6.5 –Προσθέστε2μLτηςβιβλιοθήκηςσταδύοαντίστοιχασωληνάριαQubitκαιυποβάλετεσεπεριδίνησηγια2δευτερόλεπτα.


Σελίδα52│52

6.6 –ΕπωάστετασωληνάριαQubitσεθερμοκρασίαδωματίουγια2λεπτά.

6.7 –ΕνεργοποιήστετοόργανοQubitκαιεπιλέξτεπρωτόκολλοBR.

6.8 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοQubitμετοπρότυπο1καιπιέστεGO.Επαναλάβετεμετοπρότυπο2.

6.9 –ΤοποθετήστετοσωληνάριοβιβλιοθήκηςστοQubitκαιπιέστεGO.Επαναλάβετεγιατοαντίγραφο.

6.10 –ΓιατημετατροπήτουαποτελέσματοςQubitαπόσυγκέντρωσηng/μLσεnM,καταχωρίστετη μέση συγκέντρωση των δύο αντιγράφων βιβλιοθήκης στην καρτέλα «LibraryQuantitation»(Ποσοτικόςπροσδιορισμόςβιβλιοθήκης)τουΒιβλίουεργασίαςOmixon.

6.11 – Χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα από τη μέτρηση Qubit, αραιώστε 10 μL τηςβιβλιοθήκηςεπιλεγμένουμεγέθους,σεσυγκέντρωση2nM,μεαποστειρωμένοH2Oσενέοσωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL. Φυλάξτε την υπόλοιπηβιβλιοθήκηεπιλεγμένουμεγέθουςστους-20°C.

Ασφαλέςσημείοδιακοπήςτηςδιαδικασίας.Οιβιβλιοθήκεςμπορούννααποθηκευτούνστους-20°Cγιαμεγάλαχρονικάδιαστήματα.Σεπερίπτωσημακρόχρονηςφύλαξης,συνιστάται ιδιαίτερα η εκ νέου ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πριν από τηνανάλυσηστοMiSeq.

HOLOTYPE HLA™ Δ A1 CE/A2 CE/A3 CE/A4 CE ΟCE+User+Manuals+in... · 0086 Προετοιμάζει...

Documents

Transcript of HOLOTYPE HLA™ Δ A1 CE/A2 CE/A3 CE/A4 CE ΟCE+User+Manuals+in... · 0086 Προετοιμάζει...