Εισαγωγή στην Μοριακή

διαγνωστική για τον HPV

Ιωαννίδης Αναστάσιος BSc, MD, PhD

Επίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας

Πανεπιστήμιο Πελοποννήσου

Επιστημονικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Medisyn

Κλασικ

ή έ

ναντι

μορια

κής

διά

γνω

σης

Η επανάσταση στη μοριακή βιολογία έχει επηρεάσει:

• Επιστήμες

• Ιατρική

• Κοινωνία

• Διάγνωση / Κλινική διαχείριση

Μοριακά Διαγνωστικά

Εξατομικευμένη ιατρική

Πρόκληση για τον 21ο αιώνα

DNA

➢ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΔΥΟ

ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ

ΠΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΥΝ ΣΤΟ ΧΩΡΟ

ΜΙΑ ΔΕΞΙΟΣΤΡΟΦΗ ΕΛΙΚΑ

➢ Η ΚΑΘΕ ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ

ΑΠΟ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ

ΛΕΓΟΝΤΑΙ

ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ

Στις βάσεις του DNA βρίσκεται αποθηκευμένη η γενετική πληροφορία

RNA

➢ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ MIA

ΠΟΛΥΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚH ΑΛΥΣΙΔA

➢ Η ΑΛΥΣΙΔΑ AYTH ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ

ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ ΠΟΥ ΛΕΓΟΝΤΑΙ

ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΑ

Διαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση

Κλινικό Δείγμα

Λύση-Καθαρισμός

Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος

mRNA

Ιϊκό RNA

rRNA

ΗλεκτροφόρησηΠροϊόντα

Κλωνοποίηση

RT-PCR

Αλληλούχηση

Γενωμικό DNA

cDNA

PCR

• Σπάσιμο των κυττάρων

• Απελευθέρωση των πυρηνικών οξέων σε διαλυτή μορφή

• Προστασία των πυρηνικών οξέων από την αποικοδόμηση

• Διαχωρισμός των πυρηνικών οξέων, από κυτταρικά

Υπολείμματα, πρωτεΐνες και ένζυμα

• Το DNA δεν διαλύεται στην αιθανόλη

• Συμπύκνωσή τους σε μικρό όγκο

• Συλλογή σε υδατικό περιβάλλον

Απομόνωση πυρηνικών οξέων

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης

PCR

• DNA (0,01 – 0,1 μg)

• PRIMER 1-FORWARD (20 pmol)

• PRIMER 2-REVERSE (20 pmol)

• Tris – HCL (20mM, pH 8)

• MgCl2 (2 mM)

• 50μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

• ΘΕΡΜΟΑΝΘΕΚΤΙΚΗ DNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ (2 IU)

• dH2O ΕΩΣ 50-100 μl ΣΥΝΟΛΙΚΟΥ ΟΓΚΟΥ.

ΟΡΓΑΝΟ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ : ΘΕΡΜΟΚΥΚΛΟΠΟΙΗΤΗΣ (THERMOCYCLER)

1. DNA ΑΠΟΔΙΑΤΑΞΗ 94ο C. 30 sec

PCR

PCR

2. DNA ANNEALING (ΕΠΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ – ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΜΕ ΤΙΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΕΣ

ΑΛΥΣΙΔΕΣ DNA) 45ο - 60ο C (30 sec)

PCR

3. DNA EXTENSION (ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ) 72Ο C (1 min)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ 1ου ΚΥΚΛΟΥ

2 ΔΙΚΛΩΝΑ ΜΟΡΙΑ DNA

RT - PCR

RT – PCR

Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση

χρησιμοποιεί ένα συμπληρωματικό

ολιγονουκλεοτίδιο για να ξεκινήσει

την σύνθεση DNA από ένα μόριο

RNA. Η μονόκλωνη αλυσίδα του DNA

που παράγεται, χρησιμοποιείται σαν

«μητρική» για τη σύνθεση και μιας

δεύτερης αλυσίδας DNΑ.

Τα προϊόντα PCR αναλύονται σε μια ξεχωριστή

διαδικασία που πραγματοποιείται μετά το τέλος της PCR

ή κατά την διάρκεια αυτής, ανάλογα με το είδος της

αντίδρασης

Πρόληψη επιμολύνσεων

Διαχωρισμός χώρων πραγματοποιήσεως PCRΚαλή εργαστηριακή πρακτικήΦυσικές μέθοδοι διαχωρισμούΠαρασκευή DNA/RNA σε BSC ή hood ή PCR-workstationΦίλτρα στα tips

Yπεριώδης ακτινοβολίαΑντιδραστήρια PCR σε μικρές ποσότητες Χρησιμοποίηση μαρτύρωνΑδρανοποίηση προϊόντων πολλαπλασιασμού μεχημικές/βιοχημικές μεθόδουςΚλειστά συστήματα

DNA του Ιου είναι~8 kbp

Πάνω από 200 HPV γονότυποι

Διαφέρουν μεταξύ τους κατά τουλάχιστον

κατά 10% στο επίπεδο ακολουθίας DNA

• WHITE, E. A. 2019. Manipulation of Epithelial Differentiation by HPV Oncoproteins.

Viruses, 11.

• ZHU, Y., WANG, Y., HIRSCHHORN, J., WELSH, K. J., ZHAO, Z., DAVIS, M. R. &

FELDMAN, S. 2017. Human Papillomavirus and Its Testing Assays, Cervical Cancer

Screening, and Vaccination. Adv Clin Chem, 81, 135-192.

ESCOBAR-ESCAMILLA, N., RAMIREZ-GONZALEZ, J. E., CASTRO-ESCARPULLI, G. & DIAZ-QUINONEZ, J. A. 2018. Utility of high-

throughput DNA sequencing in the study of the human papillomaviruses. Virus Genes, 54, 17-24.

http://cvc.dfci.harvard.edu/hpv/HTML/classification.html

** *

*

* HR Status not certain

HR-HPV

LR-HPV

Ασθένεια Τύπος του HPV

Απλά Κονδυλώματα 2, 7

Πελματικά Κονδυλώματα 1, 2, 4

Δερματικά Κονδυλώματα 3, 10

Γενετικά Κονδυλώματα 6,11,40,42,43,44,55,61,70,72,81,83,84,89

Δυσπλασίες (καρκίνος) γεννητικών οργάνων16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,7

0,73,82,85

Στοματική Ενδοεπιθηλιακή Υπερπλασία 13, 32

Κονδυλώματα του στόματος 6, 7, 11, 16, 32

Τύπος 6

Τύπος 11

Τύπος 16

Συχνότεροι HPV τύποι

Τύπος 18

Οι τύποι 6,11 προκαλούν το

90% των κονδυλωµάτων

Οι τύποι 16,18 προκαλούν

το 70% των καρκίνων του

τραχήλου

Η μόλυνση με τον HPV μεταδίδεται σεξουαλικά

Ο ιός διεισδύει στον τράχηλο

Uterus

HPVinfection

Vagina

Cervix

Layers of epithelial cells

Papillomavirus

WHITE, E. A. 2019. Manipulation of Epithelial

Differentiation by HPV Oncoproteins. Viruses, 11.

Ο HPV ΚΑΙ Ο ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ

• Προκαλείται από στελέχη HPV υψηλού κινδύνου

• E6 και E7 είναι τα κύρια HPV ογκογονίδια

• E6 και E7 ογκογονίδια εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα και η συνεχής έκφραση τους είναι απαραίτητη για τη συντήρηση του κακοήθους φαινοτύπου

KIM, K. Y., LEWIS, J. S., JR. & CHEN, Z. 2018. Current status of clinical testing for human papillomavirus in

oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Pathol Clin Res, 4, 213-226.

Η μέχρι χθες κατάσταση

Απαρχή ΚλινικήΦυσιολογικές συνθήκες της νόσου

Υποκλινική νόσος νόσος

Προχωρημένη νόσος

Τεστ Παπανικολάου

Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη

ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ:

ΝΕΑ ΕΠΟΧΗ ΣΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΟΥ

ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ

Απαρχή ΚλινικήΦυσιολογικές

συνθήκες της νόσου

Υποκλινική

νόσος νόσος

Προχωρημένη

νόσος

HPV Εμβόλιο HPV DNA test Τεστ Παπανικολάου

Πρωτογενής πρόληψη Δευτερογενής πρόληψη

Ευαισθησία της κυτταρολογίας για τηνανίχνευση CIN2+

(όλες οι ηλικίες)

HART

Tuebingen

Hannover

Jena

French Public

French Private

Seattle

Canada

Combined

0% 100%10% 30% 50% 70% 90%

Cytology Positivity

CIN 2+

Ευαισθησία του HPV Test για τηνανίχνευση CIN2+

(όλες οι ηλικίες)

HART

Tuebingen

Hannover

Jena

French Public

French Private

Seattle

Canada

Combined

0% 100%10% 30% 50% 70% 90%

HPV Positivity

CIN 2+

Self-Collection Instruction Guide

TSAKOGIANNIS, D., GARTZONIKA, C., LEVIDIOTOU-STEFANOU, S. & MARKOULATOS, P. 2017. Molecular approaches for HPV genotyping and HPV-DNA physical status.

Expert Rev Mol Med, 19, e1.

• ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ DNA

• ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ (Microarray Comparative Genomic Hybridization –MCGH)

• ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ (Whole-Genome Sequencing-WGS)

(Mahmoodi et al., 2019)

HPV testing

ως μέθοδος πληθυσμιακού ελέγχου

• Λιγότερο εκτεθειμένο σε ανθρώπινα λάθη

• Πιο ευαίσθητο στην ανίχνευση CIN2+

• Πιο ασφαλές για την γυναίκα

• Επιτρέπει την διεύρυνση των χρονικών μεσοδιαστημάτων μεταξύ δύο εξετάσεων

• Θα οδηγήσει σε ελάττωση του κόστους

• Συνολικά θα οδηγήσει στην βελτίωση της ποιότητας και της αποτελεσματικότητας του πληθυσμιακού ελέγχου (screening)

Nobel Price for Medicine 2008

to Harald zur Hausen…

…for the proof that cervical cancer is

induced by Human Papillomaviruses (HPV)

Success story of medicine