9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ£ΗΜΕΙΩΣΕΙΣ... ·...

of 27/27
Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης © Καλογεράκης 2003 74 9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Ο Μεταβολισμός εξαρτάται από την μεταφορά θρεπτικών ουσιών από το εξωτερικό του κυττάρου μέσο μεμβρανών στο εσωτερικό του κυττάρου. Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί συστατικών μέσω μεμβρανών: 1. Παθητική Διάχυση (passive diffusion): Είναι η συνηθισμένη διάχυση που προκαλείται από την διαφορά συγκεντρώσεων εκτός και εντός του κυττάρου. Επομένως έχουμε μεταφορά μόνον όταν S o > S i . Η διαφορά ελεύθερης ενέργειας είναι αρνητική: ΔG = RTln(S i /S o ) Ο ρυθμός μεταφοράς μάζας δίνεται από τον σχέση: N S = k S (S o - S i ) (mol/cm 2 s) όπου k S είναι ο συντελεστής διαπερατότητας (permeability coefficient, cm/s). Παθητική διάχυση χρησιμοποιείται για την πρόσληψη ύδατος και οξυγόνου. Λιπίδια και άλλες υδρόφοβες ενώσεις έχουν σχετικά υψηλό συντελεστή διάχυσης διαμέσου μεμβρανών (~10 -8 cm 2 /sec) που συνεπάγεται ότι η παθητική διάχυση μπορεί να επιτύχει σημαντική μεταφορά θρεπτικών ουσιών. 2. Διάχυση με Διευκόλυνση (facilitated diffusion): Όταν έχουμε την μεταφορά ηλεκτρικά φορτισμένων μορίων και πολικών ουσιών που δεν είναι λιποδιαλυτές, τότε απαιτείται η χρήση ειδικών ενώσεων (μεταφορείς) που βοηθούν στην μεταφορά μέσω της μεμβράνης με την δημιουργία συμπλόκου. Οι μεταφορείς είναι ένζυμα και ονομάζονται περμιάσες. Η συσχέτιση του ρυθμού μεταφοράς και τις συγκεντρώσεις εντός και εκτός του κυττάρου είναι της μορφής: Συγκέντρωση εξωτερικά του κυττάρου (S ο ) Συγκέντρωση εσωτερικά του κυττάρου (S i )
  • date post

    06-Mar-2020
  • Category

    Documents

  • view

    2
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of 9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ£ΗΜΕΙΩΣΕΙΣ... ·...

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 74

    9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Ο Μεταβολισμός εξαρτάται από την μεταφορά θρεπτικών ουσιών από το εξωτερικό του κυττάρου μέσο μεμβρανών στο εσωτερικό του κυττάρου. Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί συστατικών μέσω μεμβρανών: 1. Παθητική Διάχυση (passive diffusion): Είναι η συνηθισμένη διάχυση που προκαλείται από την διαφορά συγκεντρώσεων εκτός και εντός του κυττάρου. Επομένως έχουμε μεταφορά μόνον όταν So > Si. Η διαφορά ελεύθερης ενέργειας είναι αρνητική: ΔG = RTln(Si/So) Ο ρυθμός μεταφοράς μάζας δίνεται από τον σχέση: NS = kS(So - Si) (mol/cm2s) όπου kS είναι ο συντελεστής διαπερατότητας (permeability coefficient, cm/s). Παθητική διάχυση χρησιμοποιείται για την πρόσληψη ύδατος και οξυγόνου. Λιπίδια και άλλες υδρόφοβες ενώσεις έχουν σχετικά υψηλό συντελεστή διάχυσης διαμέσου μεμβρανών (~10-8 cm2/sec) που συνεπάγεται ότι η παθητική διάχυση μπορεί να επιτύχει σημαντική μεταφορά θρεπτικών ουσιών. 2. Διάχυση με Διευκόλυνση (facilitated diffusion): Όταν έχουμε την μεταφορά ηλεκτρικά φορτισμένων μορίων και πολικών ουσιών που δεν είναι λιποδιαλυτές, τότε απαιτείται η χρήση ειδικών ενώσεων (μεταφορείς) που βοηθούν στην μεταφορά μέσω της μεμβράνης με την δημιουργία συμπλόκου. Οι μεταφορείς είναι ένζυμα και ονομάζονται περμιάσες. Η συσχέτιση του ρυθμού μεταφοράς και τις συγκεντρώσεις εντός και εκτός του κυττάρου είναι της μορφής:

    Συγκέντρωση εξωτερικά του κυττάρου (Sο)

    Συγκέντρωση εσωτερικά του κυττάρου (Si)

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 75

    ⎥⎦

    ⎤⎢⎣

    ⎡+

    −+

    =iST

    i

    oST

    oSS SK

    SSK

    SNN max,

    Όταν είναι So > Si έχουμε μεταφορά από το εξωτερικό του κυττάρου στο εσωτερικό και αντίστροφα. Η μεταφορά των ουσιών γίνεται από την ψηλή συγκέντρωση προς την χαμηλή και επομένως είναι θερμοδυναμικά ευνοούμενη. Διάχυση με διευκόλυνση παρατηρείται συχνά στην μεταφορά σακχάρων και άλλων οργανικών ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους (κυρίως σε ευκαρυωτικά κύτταρα). Κλασσικό παράδειγμα διάχυσης με διευκόλυνση σε προκαρυωτικά κύτταρα είναι η μεταφορά της γλυκερόλης (glycerol) σε εντερικά βακτήρια (E. coli). 3. Ενεργός Μεταφορά (active transport): Σε πολλές περιπτώσεις απαιτείται η πρόσληψη ουσιών από το κύτταρο ακόμα και όταν η συγκέντρωση της ουσίας στο εσωτερικό του κυττάρου είναι πολλές φορές μεγαλύτερη της εξωτερικής (> 100 φορές). Η μεταφορά αυτή μπορεί να γίνει εάν καταναλωθεί ενέργεια από το κύτταρο μεγαλύτερη της θερμοδυναμικά απαιτούμενης ΔG = RTln(Si/So). Όταν τα μόρια είναι φορτισμένα, τότε απαιτείται επιπλέον ενέργεια (+zFΔΨ). Η ενεργός μεταφορά είναι πού σημαντική για την μεταφορά των ιόντων νατρίου και καλλίου (Na+, K+). Η ενεργός μεταφορά μοιάζει με την διάχυση με διευκόλυνση ως προς την απαιτούμενη παρουσία πρωτεϊνών που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη αλλά διαφέρει διότι γίνεται ενάντια στην ψηλή συγκέντρωση. Ο ρυθμός δίνεται από την σχέση:

    oST

    oSS SK

    SNN

    += max,

    4. Μεταφορά με Χημική Μετατροπή (group translocation): Ο τρόπος αυτός είναι σημαντικός για την μεταφορά πολλών σακχάρων σε βακτήρια. Αντί να χρησιμοποιείται πολύ ενέργεια για την μεταφορά ανέπαφου του συστατικού, συνδυάζεται η μεταφορά με χημική μετατροπή (που θα γινόταν ούτως η άλλως εντός του κυττάρου για τον καταβολισμό του εισερχόμενου συστατικού). Κλασσικό παράδειγμα είναι το σύστημα μεταφοράς σακχάρων με την σύγχρονη φωσφορυλίωση του σακχάρου (phosphotransferase system).

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 76

    10. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μοριακή Βιολογία = η μελέτη του τρόπου διάδοσης και ρύθμισης γενετικών πληροφοριών. Η γενετική πληροφορία του κυττάρου περιέχεται στο DNA (= ένας διπλός έλικας που αποτελείται από δύο κλώνους πολυ-δεσόξυ-ριβοζο-νουκλεοτιδίων). Το DNA χωρίζεται σε γονίδια (genes). Κάθε γονίδιο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης ή τμήματος της. Το δόγμα της μοριακής βιολογίας = Το DNA δρα ως εκμαγείο (template) για την αναπαραγωγή του (replication) καθώς και για την μεταγραφή πληροφοριών σε RNA για την παραγωγή RNA το οποίο εν συνεχεία χρησιμοποιείται για την παραγωγή πρωτεϊνών. Η παραγωγή μιας πρωτεΐνης (≡ έκφραση της πληροφορίας του γονιδίου, gene expression) γίνεται σε δύο στάδια (ι) μεταγραφή (transcription) και (ιι) μετάφραση (translation). Ο Γενετικός Κώδικας: Για την μεταφορά πληροφοριών χρειάζεται μία γλώσσα. Κάθε ζωντανός οργανισμός (από βακτήρια έως ανθρώπους) χρησιμοποιεί 4 γράμματα που αντιστοιχούν στα 4 νουκλεοτίδια που απαρτίζουν το DNA (βάσεις: A, adenine | G, guanine | T, thymine | C, cytosine) ή το RNA (βάσεις: A, adenine | G, guanine | U, uracil | C, cytosine). Κάθε τριάδα από νουκλεοτίδια του mRNA αποτελεί μία λέξη (κωδικόνιο) που αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο αμινοξύ. Με τέσσερις βάσεις και τρεις θέσεις έχουμε 43=64 πιθανές λέξεις (codons) που είναι υπεραρκετά δεδομένου ότι έχουμε 20 αμινοξέα που εμφανίζονται στο DNA. Η αποκωδικοποίηση της αντιστοιχίας λέγεται γενετικός κώδικας και επιτεύχθηκε το 1961-1966. Προφανώς ο κώδικας αυτός είναι "εκφυλισμένος" (degenerate) δεδομένου ότι πάνω από ένα κωδικόνιο αντιστοιχεί σε ένα αμινοξύ. Τρία κωδικόνια UAA, UAG & UGA δεν αντιστοιχούν σε αμινοξέα αλλά στο STOP (τέλος της μεταγραφής). Ο γενετικός κώδικας ισχύει σχεδόν πάντοτε. Υπάρχουν μόνο ελάχιστες εξαιρέσεις (ιδιαίτερα στα μιτοχόνδρια για την πρόσληψη σπανίων αμινοξέων).

    DNA

    Replication αντιγραφή

    RNA Πρωτεΐνη

    Transcription μεταγραφή

    Translation μετάφραση

    Reverse

    Transcription

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 77

    Δεύτερη βάση

    Πρώτη βάση U C A G

    U UUU phe

    φαινυλαλανίνη UCU ser σερίνη

    UAU tyr τυροσίνη

    UGU cys Κυστείνη

    UUC phe UCC ser UAC tyr UGC cys UUA leu

    λευκίνη UCA ser UAA STOP UGA STOP

    UUG leu UCG ser UAG STOP UGG try

    C CUU leu CCU pro προλίνη

    CAU his ιστιδίνη

    CGU arg αργινίνη

    CUC leu CCC pro CAC his CGC arg CUA leu CCA pro CAA glu-N

    γλουταμίνη CGA arg

    CUG leu CCG pro CAG glu-N CGG arg

    A AUU ileu ισολευκίνη

    ACU thr θρεονίνη

    AAU asp-N ασπαρτίνη

    AGU ser

    AUC ileu ACC thr AAC asp-N AGC ser AUA ileu ACA thr AAA lys AGA arg AUG met

    μεθιονίνη ACG thr AAG lys

    λυσίνη AGG arg

    G GUU val

    βαλίνη GCU ala αλανίνη

    GAU asp Ασπαρικό οξύ

    GGU gly γλυκίνη

    GUC val GCC ala GAC asp GGC gly GUA val GCA ala GAA glu

    γλουταμινικό οξύ GGA gly

    GUG val GCG ala GAG glu GGG gly

    ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ (Transcription): Μεταγραφή είναι η παραγωγή ενός μορίου, mRNA (messanger RNA), χρησιμοποιώντας σαν εκμαγείο ένα κλώνο DNA. Η διαδικασία παραγωγής αρχίζει με την προσκόλληση του ενζύμου RNA polymerase σε συγκεκριμένη θέση του DNA (εκεί που βρίσκεται ο υποκινητής γονιδίου, promoter και ενώνεται με την πρωτείνη σ του ενζύμου). Μια συγκεκριμένη σειρά βάσεων στο DNA δίνει το μήνυμα τερματισμού της παραγωγής του mRNA.

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 78

    Ενζυμική ρύθμιση της παραγωγής πρωτεϊνών Το κύτταρο χρησιμοποιεί δύο διεργασίες για την ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Διέγερση (Enzyme Induction): χρησιμοποιείται κυρίως για την ρύθμιση του καταβολισμού (π.χ., ρύθμιση σύνθεσης του ενζύμου β-γαλακτοσιδάση). Καταστολή (enzyme repression): χρησιμοποιείται κυρίως για την ρύθμιση της βιοσύνθεσης (π.χ. η ρύθμιση του βασικού ενζύμου που απαιτείται για την βιοσύνθεση της ιστιδίνης).

    RNA polymerase

    Repressor

    Transcription permitted.. Μεταγραφή επιτρέπεται…

    Υποκινητής Ρυθμιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3

    RNA polymerase

    Repressor

    Co-repressor Συγκαταστολέας

    Transcription blocked….. Μεταγραφή δεν γίνεται…

    Υποκινητής Ρυθμιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3

    RNA polymerase

    Repressor Transcription blocked….. Μεταγραφή δεν γίνεται…

    Υποκινητής Ρυθμιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3

    RNA polymerase

    Repressor

    Transcription permitted.. Μεταγραφή επιτρέπεται…

    Υποκινητής Ρυθμιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3

    Inducer διεγέρτης

    DNA

    DNA

    DNA

    DNA

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 79

    ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ (Translation) To m-RNA ενώνεται σε ένα ριβοσωμάτιο (που αποτελείται από r-RNA και πρωτεΐνη). Τα μεταγωγά RNA (t-RNA) μεταφέρουν τα αντίστοιχα αμινοξέα. Κάθε t-RNA έχει μία τριάδα νουκλεοτιδίων (αντικωδικόνιο, anticodon) που είναι συμπληρωματική του κωδικονίου που αντιστοιχεί στο αμινοξύ που μεταφέρει. Μόλις σχηματιστεί ο πεπτιδικός δεσμός απελευθερώνεται το άδειο t-RNA ενώ το m-RNA προχωράει κατά μία θέση μέσα στο ριβόσωμα. ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA (DNA replication) Η διεργασία αντιγραφής του DNA ξεκινά με την προσκόλληση του ενζύμου DNA-polymerase που κινείται πάνω στον ένα κλώνο του DNA (με κατεύθυνση 5' 3') παράγοντας ένα συμπληρωματικό κλώνο. Απαιτείται η παρουσία ενός RNA primer (που φτιάχνεται από το ένζυμο RNA polymerase) για να αρχίσει η αντιγραφή του DNA. Το ένζυμο DNA-ligase (DNA-λιγκάση) ενώνει τα κομμάτια του DNA που έχουν αντιγραφθεί.

    m-RNA

    t-RNA

    anticodon

    αμινοξύ

    πρωτεΐνη

    ριβόσωμα

    άδειο t-RNA

    UA

    AU

    ileu

    κυκλικό DNA

    DNA replication fork

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 80

    Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA (Recombinant DNA technology) Η επανάσταση στην βιοτεχνολογία έχει επέλθει τα τελευταία χρόνια με την ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής. Η βασική ιδέα είναι η μεταφορά και ενσωμάτωση κάποιου γονιδίου από έναν οργανισμό σε έναν άλλο ο οποίος μπορεί να εκφράζει το γονίδιο αυτό. Κλασσικό παράδειγμα είναι η παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης από βακτήρια. Η διαδικασία παραγωγής r-DNA γίνεται σε δύο στάδια.

    1) Απομονώνουμε το γονίδιο (ξένο DNA) που μας ενδιαφέρει να εκφράσουμε. Διαλέγουμε ένα κατάλληλο φορέα (πλασμίδιο) και του κάνουμε μία τομή. Προσθέτουμε το γονίδιο που μας ενδιαφέρει και το συνενώνουμε (ανασυνδυάζουμε) παράγοντας το ανασυνδυασμένο DNA (r-DNA).

    2) Εισάγουμε το r-DNA σε κάποιο ξενιστή οργανισμό (π.χ. E. coli). Απομονώνουμε και καλλιεργούμε εκφράζοντας το νέο γονίδιο.

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 81

    Τα βασικά εργαλεία που χρειαζόμαστε είναι: Ι) Ενδονουκλεάσες υψηλής ειδίκευσης που κόβουν το DNA σε συγκεκριμένα

    μέρη. Π.χ. η ενδονουκλεάση ECORI του E.coli που κόβει την συγκεκριμένη αλληλουχία:

    Σημείωση: τα δύο άκρα που έχουν κοπεί έτσι μπορούν να επανασυνδεθούν με άλλα

    κομμάτια του DNA που έχουν κοπεί με τον ίδιο τρόπο. II) DNA-ligase για την συγκόλληση κομματιών DNA. III) DNA-polymerase για την αντιγραφή του DNA. IV) Reverse transcriptase (αντιστροφη τρανσκριπτάση) που χρησιμεύει για την

    παραγωγή DNA από m-RNA. V) Τερματική τρανσφεράση (terminal transferase) που προσθέτει

    ομοιοπολυμερικές ουρές (-Α-Α-Α-Α-Α-Α ή -Τ-Τ-Τ-Τ-Τ-Τ). VI) Με την χρήση χλωραμφενικόλης που αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση, μπορούμε

    να αυξήσουμε σημαντικά τον αριθμό των αντιγράφων του πλασμιδίου που παράγονται εντός του κυττάρου (π.χ. από 30 σε 1000 αντίγραφα).

    VΙΙ) Πρέπει ο φορέας να περιέχει κάποιο σηματοδότη επιλογής (π.χ., αντίσταση σε συγκεκριμένο αντιβιοτικό). Το πιο συνηθισμένο πλασμίδιο είναι το pBR322 (χαρακτηρίζεται από δύο θέσεις για ενδονουκλεάσες EcoRI & BamHI, έχει αντίσταση στα αντιβιοτικά αμπισιλίνη και τετρακυκλίνη, έχει σημείο έναρξης αντιγραφής DNA ανεξάρτητα από το κυτταρικό DNA). Σημείωση: Υπάρχει η δυνατότητα χρησιμοποίησης ρυθμιζόμενου υποκινητή (που τίθεται εντός / εκτός λειτουργίας με προσθήκη διεγέρτη ή αλλαγή θερμοκρασίας κτλ.). Η παραγωγή της ξένης πρωτεΐνης επιβαρύνει το κύτταρο και επομένως ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων είναι χαμηλότερος.

    …G-A-A-T-T-C… …C-T-T-A-A-G…

    …G- …C-T-T-A-A-

    -A-A-T-T-C… -G…

    +

    EcoRI

    EcoRI

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 82

    Ln(XV)

    Ln(XV0)

    μ+1

    μ+2

    μ-

    t

    ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ: 1) Γενετική Αστάθεια (genetic

    instability): Η συνεχής καλλιέργεια οδηγεί στην δημιουργία απογόνων που περιέχουν μικρότερο αριθμό πλασμιδίων λόγω του μεγαλύτερου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης των.

    2) Οι πρωτεάσες (=ένζυμα

    που διασπούν πρωτεΐνες) του ξενιστή μπορεί να προσβάλλουν την παραγόμενη πρωτεΐνη.

    3) Μεταλλάξεις του ξενιστή (mutations of the host cells) που τον καθιστούν λιγότερο αποδοτικό για την παραγωγή της συγκεκριμένης πρωτεΐνης.

    4) Δομική αστάθεια του πλασμιδίου: Μερικά κύτταρα διατηρούν τα πλασμίδια αλλά τα μετατρέπουν έτσι ώστε να μειώσουν την επίδραση που έχει το πλασμίδιο στο κύτταρο.

    5) Παρόλο που το E.coli είναι ο ευκολότερος ξενιστής, αν απαιτείται η έκφραση ενός

    ευκαρυωτικού γονιδίου, πρέπει να χρησιμοποιηθεί ευκαρυωτικός ξενιστής (π.χ., S. cerevisiae) για να μπορέσει να απαλλείψει τα εσώνια (introns) κατά την παραγωγή του m-RNA (η διεργασία καλείται RNA-splicing). Τα εσώνια αντιστοιχούν σε περιοχές του DNA που δεν πρέπει να μεταφραστούν.

    6) Εάν απαιτείται η παραγωγή εξαιρετικά πιστής πρωτεΐνης, δηλ. απαιτείται η

    δημιουργία μετατροπών μετά την μετάφραση (posttranslational modifications), τότε είμαστε αναγκασμένοι να χρησιμοποιήσουμε ζωικά κύτταρα (mammalian cells) σαν ξενιστή.

    ΠΥΡΗΝΑΣ

    DNA Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3

    Primary RNA Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3

    Mature RNA Exon1 Exon2 Exon3

    RNA Splicing (removal of Introns)

    Μεταφορά στο κυτταρόπλασμα

    Μετάφραση

    ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ

    Πρωτεΐνη

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 83

    11. ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Κάθε μικροοργανισμός μπορεί να θεωρηθεί σαν ένα ανοικτό σύστημα όπου χημικές ενώσεις εισέρχονται και εξέρχονται από το κύτταρο συνοδευόμενες από έκλυση θερμότητας (+). Το κύτταρο μπορεί να θεωρηθεί ότι αυξάνει στο μέγεθος μέχρι να διαχωριστούν τα θυγατρικά κύτταρα. Οι μικροοργανισμοί ανάλογα με την πηγή ενέργειας ή τα θρεπτικά συστατικά που χρησιμοποιούν διαχωρίζονται ως εξής: Ισοζύγια C,O,H,N: Η στοιχειομετρία της ανάπτυξη μικροοργανισμών μπορεί να γραφτεί ως αCΗnΟm + βΝΗ3 + γΟ2 CΗaΟbΝc + δCΗpΟqΝr + εΗ2Ο + κCΟ2 πηγή C πηγή Ν κύτταρο προϊόν Τα ατομικά ισοζύγια για τα βασικά στοιχεία έχουν ως εξής:

    κύτταρο Εξερχόμενες χημικές ουσίες (προϊόντα μεταβολισμού, Pj)

    Εισερχόμενες χημικές ουσίες (υποστρώματα,

    Sj)

    Θυγατρικά κύτταρα

    Θερμότητα

    Πηγή ενέργειας Φως

    Χημική ενέργεια (διάσπαση δεσμών)

    Φωτότροφοι [Phototrophs] Χημειότροφοι [Chemotrophs] 1. organotrophs (οξείδωση

    οργανικών ενώσεων) 2. Lithotrophs (οξείδωση

    ανόργανων ουσιών)

    Αυτότροφοι [Autotrophs] (χρήση CO2)

    Ετερότροφοι [Heterotrophs]

    (από οργανικές ουσίες)

    Πηγή άνθρακα

    } } } }

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 84

    C: α = 1+δ+κ Η: nα + 3β = a + pδ + 2ε Ο: mα + 2γ = b + qδ + ε + 2κ N: β = c + rδ Θεωρώντας τον εμπειρικό τύπο της κυτταρικής μάζας γνωστό, θα θέλαμε να προχωρήσουμε στον υπολογισμό των υπολοίπων παραμέτρων. Οι έξη (6) στοιχειομετρικοί συντελεστές (α, β, γ, δ, ε & κ) δεν μπορούν να υπολογιστούν με τα τέσσερα (4) παραπάνω ισοζύγια. Για αερόβιους οργανισμούς μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε το αναπνευστικό κλάσμα (respiratory quotient), RQ που ορίζεται ως

    RQ = γκ

    h)][mM/(L2OςκαταναλωσηΡυθμος

    h)][mM/(L2COπαραγωγηςΡυθμος =⋅

    Επιπλέον εξισώσεις μπορούν να γραφούν για την δημιουργία ΑΤΡ (το «ενεργειακό νόμισμα» του κυττάρου) και NADH (μεταφορέας ηλεκτρονίων στο κύτταρο) βασισμένοι στην οξείδωση της πηγής του άνθρακα CΗnΟm. Κατά την οξείδωση του υποστρώματος ηλεκτρόνια μεταφέρονται στο NAD+ με την μορφή ατόμων υδρογόνου. Βεβαίως αν θεωρούσαμε περισσότερα εξερχόμενα προϊόντα μεταβολισμού, η απροσδιοριστία θα ήταν πολύ μεγαλύτερη. Επίσης επειδή η σύσταση του μικροοργανισμού μεταβάλλεται όταν μεταβάλλεται η πηγή του άνθρακα, η προσέγγιση αυτή δεν είναι επαρκής. Έχει όμως χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για την αυτόματη ρύθμιση μικροβιακών ζυμώσεων (συνεχούς λειτουργίας ή ημιδιαλείποντος έργου) στην βιομηχανία τροφίμων και την φαρμάκων. Συντελεστές απόδοσης (yield coefficients): Ο συνήθης τρόπος αντιμετώπισης της στοιχειομετρίας στην κυτταρική ανάπτυξη είναι με την χρησιμοποίηση «συντελεστών απόδοσης» που είναι ο λόγος της ποσότητας του παραχθέντος προϊόντος ή βιομάζας ως προς την ποσότητα του υποστρώματος που καταναλώθηκε. O περισσότερο γνωστός συντελεστής απόδοσης είναι ο ΥX/S

    ΥX/S = srxr

    ΔS/ΔtΔX/Δt

    ΔSΔX

    οςυποστρωματντοςκαταναλωθεg

    βιομαζαςεισαςδημιουργηθg===

    − (

    x/sY xr

    sr = )

    Ο συντελεστής αυτός δεν παραμένει σταθερός αλλά αλλάζει όταν αλλάζουν οι συνθήκες ανάπτυξης. Ο κύριος λόγος είναι ότι μέρος του υποστρώματος χρησιμοποιείται για συντήρηση των μικροοργανισμών, μέρος για βιοσύνθεση νέων κυττάρων και εκλυόμενων κυτταρικών προϊόντων και μέρος για την παραγωγή ενέργειας (ΑΤΡ). Δηλαδή, το υπόστρωμα καταναλίσκεται ως εξής: ΔS = ΔSbiomass + ΔSbiosynthesis + ΔSgrowth_energy + ΔSmaintenace_energy Άλλοι συντελεστές απόδοσης που χρησιμοποιούνται ευρέως είναι οι εξής:

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 85

    ΥΡ/S = srpr

    ΔS/ΔtΔP/Δt

    ΔSΔP

    οςυποστρωματντοςκαταναλωθεg

    προιοντοςεντοςδημιουργηθg===

    − ( p/sYrr SP = )

    ΥΧ/Ο = O2O2O2 rxr

    t/ΔMΔX/Δt

    ΔMΔX

    2Oντοςκαταναλωθεg

    βιομαζαςεισαςδημιουργηθg===

    Δ (

    x/oY xrrO2 = )

    ΥΑΤΡ = ΥΧ/ΑΤΡ = ATPrxr

    Δ[ATP]ΔX

    ATPντοςκαταναλωθεmol

    βιομαζαςεισαςδημιουργηθg==

    Για αερόβιους μικροοργανισμούς το μέρος του άνθρακα που καταναλίσκεται για την παραγωγή ενέργειας μπορεί να είναι αρκετά μεγάλο. Το τυπικό διάστημα τιμών του ΥΑΤΡ για αερόβιους οργανισμούς είναι 8,3 έως 12,6 [g-cells/mol-ATP] με μέση τιμή του ΥΑΤΡ=10.7 [g-cells/mol-ATP]. Άλλοι δύο συντελεστές απόδοσης που χρησιμοποιούνται είναι: Yavg-e και Υkcal.

    Yavg-e = YΧ/avg-e = S/eavg

    S/XY

    Y

    όπου Yavg-e/S είναι ο αριθμός των ηλεκτρονίων διαθέσιμα στο υπόστρωμα, υπολογιζόμενα ως εξής:

    Yavg-e/S = {moles O2 για τέλεια καύση} x 4 παραδείγματος χάρη, Yavg-e/γλυκόζη = 6 x 4 = 24. Γενικά η μέση τιμή του Yavg-e = 3,07 [g-cells/avg-e] Τελικά, ο συντελεστής απόδοσης Υkcal συσχετίζει την παραγωγή βιομάζας με την ποσότητα θερμότητας που εκλύεται,

    Υkcal = QX

    kcalg

    ΔΔ

    θερμοτηταςεκλυομενηςβιομαζαςεισαςδημιουργηθ

    =−

    όπου

    ΔQ = )mass)(H( ii

    i∑ − ΔΔ (-ΔHi) = θερμότητα τέλειας καύσης (heat of combustion) της ουσίας i

    (υπολογίζεται από πίνακες). (-ΔHx) = θερμότητα τέλειας καύσης βιομάζας ≈ 5,41 kcal/g-cells.

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 86

    Κινητική μικροβιακής ανάπτυξης (growth kinetics): Προφανώς έχουμε να κάνουμε με ένα εξαιρετικά πολύπλοκο σύστημα βιοχημικών αντιδράσεων όπου είμαστε αναγκασμένοι να κάνουμε σημαντικές απλοποιήσεις για να μπορέσουμε να καταλήξουμε σε απλοποιημένα μοντέλα που συσχετίζουν μεταβλητές που μπορούν να μετρηθούν. Ένα κινητικό μοντέλο που αποβλέπει σε λεπτομερή περιγραφή των αναπτυσσόμενων κυττάρων (μικροοργανισμών) θα πρέπει να είναι:

    1. Δομημένο (structured model) λαμβάνοντας υπόψη την δομημένη δομή του κυττάρου (π.χ., ένα χημικά δομημένο μοντέλο χωρίζει την κυτταρική μάζα σε διαφορετικές ουσίες, οι οποίες μπορούν να αλλάζουν σχετική συγκέντρωση σαν απόκριση του μοντέλου σε αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες).

    2. Διαχωρητικό (segregated model) λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι τα κύτταρα δεν είναι ίδια μεταξύ τους (π.χ., διαφορετική ηλικία των κυττάρων – έχει ιδιαίτερη σημασία στην ανάπτυξη κυττάρων που περιέχουν πλασμίδια).

    Ένα μη δομημένο μοντέλο (unstructured model) θεωρεί ότι η χημική σύσταση του κυττάρου παραμένει σταθερή. Η παραδοχή αυτή οδηγεί στην παραδοχή της «εξισορροπημένης ανάπτυξης» (balanced growth), όπου τα συστατικά του κυττάρου αλλάζουν με ανάλογους ρυθμούς. Η παραδοχή αυτή μπορεί να γίνει όταν οι αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες είναι μικρές και αργές (σε σχέση με την δυναμική απόκριση του κυττάρου). Στις περισσότερες περιβαλλοντικές εφαρμογές η χρήση «μη δομημένων και μη διαχωρητικών» μοντέλων είναι ικανοποιητική. Τα μοντέλα αυτά είναι τα πιο απλά και επομένως τα πιο εύκολα στην χρήση τους. Σε αυτές τις περιπτώσεις μιλάμε για το «μέσο κύτταρο» και η ποσοτικοποίηση της βιομάζας γίνεται από μία μεταβλητή (x) που αντιπροσωπεύει είτε το ξηρό βάρος (dry-weight) ή τον αριθμό των κυττάρων (cell number). On-line μέτρηση μπορεί να γίνει με φασματο-φωτόμετρο ορατού φωτός (όπου έχει ήδη συσχετίσει την οπτική πυκνότητα με την συγκέντρωση βιομάζας, g-dry weight/L) ή με νεφελόμετρο (turbidity meter). 1. Φάσεις μικροβιακής ανάπτυξης σε κλειστό σύστημα (growth patterns in batch culture): Κατά την διάρκεια καλλιέργειας μικροοργανισμών σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου μπορούμε να παρατηρήσουμε τις εξής πέντε φάσεις:

    i Φάση καθυστέρησης (lag phase) όπου οι μικροοργανισμοί «εγκλιματίζονται» στις υπάρχουσες συνθήκες ανάπτυξης. Συνήθως η φάση της καθυστέρησης εμφανίζεται όταν οι μικροοργανισμοί μεταφέρονται σε μεγαλύτερο αντιδραστήρα όπου υπάρχουν «φρέσκα» θρεπτικά μείγματα ανάπτυξης. Οι εσω-κυτταρικές συγκεντρώσεις διαφόρων συμπαραγόντων (cofactors, π.χ., βιταμίνες), αμινοξέων και κατιόντων (π.χ., Mg2+, Ca2+, κτλ) μπορούν να μειωθούν σημαντικά λόγω της μεταφοράς των στο διάλυμα διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. Εάν αυτά δεν είναι στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 87

    μπορεί να έχουμε σημαντική μείωση ενζυματικών αντιδράσεων και τα κύτταρα είναι υποχρεωμένα να αποικοδομήσουν την πηγή του άνθρακα για να αναπληρώσουν τις ελλείψεις τους προτού συνεχίσουν με την παραγωγή νέων κυττάρων.

    ii Φάση εκθετικής ανάπτυξης (exponential phase) όπου η ανάπτυξη γίνεται στο

    μέγιστο δυνατό ρυθμό και η παραδοχή της «ισορροπημένης ανάπτυξης» ισχύει. iii Φάση της επιβράδυνσης (declining growth phase / deceleration phase) όπου το

    υπόστρωμα λιγοστεύει σημαντικά ή έχουμε την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης κάποιου αναστολέα / παρεμποδιστή (συνήθως κάποιο «τοξικό» παραπροϊόν της αντίδρασης). Σε μία τυπική καλλιέργεια βακτηρίων, η φάση αυτή είναι πολύ μικρής διάρκειας. Οι γρήγορα μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες οδηγούν σε «μη ισορροπημένη ανάπτυξη» (unbalanced growth).

    iv Φάση στασιμότητας (stationary phase) όπου δεν έχουμε ανάπτυξη ή

    ακριβέστερα ο ρυθμός ανάπτυξης είναι ίσος με τον ρυθμό νέκρωσης. Σε αυτή την φάση τα κύτταρα είναι ακόμα μεταβολικά ενεργά και παράγουν δευτερογενή προϊόντα (που δεν είναι συνδεδεμένα με τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων). Η σύνθεση ορισμένων αντιβιοτικών έχει τον μέγιστο ρυθμό παραγωγής σε αυτή την φάση.

    v Φάση θανάτου (death phase) όπου έχουμε λύση των μικροοργανισμών που

    οδηγεί στην μείωση της βιομάζας και ακολουθεί συνήθως κινητική πρώτης τάξης (rd=-kdx).

    2. Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (specific growth rate): Η παραγωγή θυγατρικών κυττάρων γίνεται κυρίως κατά την φάση της εκθετικής ανάπτυξης όπου η παραδοχή της «ισορροπημένης ανάπτυξης» ισχύει. Γενικά τα κύτταρα αναπτύσσονται σαν μία γεωμετρική πρόοδο: 20, 21, 22, 23, 24, …, 2m, μετά από m διχοτομήσεις. Δηλαδή, αν ξεκινώντας είχαμε Ν0 κύτταρα, μετά από m γενεές θα έχουμε 2m·Ν0 κύτταρα.

    Χρόνος (h)

    Log (x)

    Φάση καθυστέρησης

    Φάση εκθετικής ανάπτυξης

    Φάση επιβράδυνσης

    Φάση στασιμότητας

    Φάση θανάτου

    Log (x0)

    tlag

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 88

    Γι’ αυτό το λόγο σε βιολογικά συστήματα χρησιμοποιούμε πολύ συχνά τους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης κυττάρων ή παραγωγής προϊόντων κτλ. Εάν rx είναι ο ρυθμός ανάπτυξης βιομάζας [g-biomass/(L·h)] και x είναι η συγκέντρωση της βιομάζας στον αντιδραστήρα [g-biomass/L], τότε ορίζουμε τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (specific growth rate), μ, ως

    μ = xrx [h-1]

    Από το ισοζύγιο βιομάζας (σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου) έχουμε:

    μxdtdx

    rdtdx

    x =⇒=

    Με αρχική συνθήκη: x(tlag) = xo Εάν υποθέσουμε ότι ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι σταθερός (μ=const.), ολοκλήρωση της παραπάνω διαφορικής εξίσωσης μας δίνει, )lagtμ(toexx(t)

    −=

    ή μtoexx(t) = εάν μετράμε τον χρόνο από το τέλος της φάσης της καθυστέρησης. Η εξίσωση προφανώς προβλέπει συνεχή αύξηση της βιομάζας δεδομένου ότι δεν λαμβάνει υπόψη την κατανάλωση του υποστρώματος. Η εξίσωση αυτή μπορεί να μας δώσει τον χρόνο διπλασιασμού (doubling time) της καλλιέργειας, td. ⇒== dμtood ex2x)x(t

    μ2

    te2 ddμt ln=⇒=

    3. Λογιστική καμπύλη ανάπτυξης (logistic equation): Δεδομένου ότι η καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης είναι σιγμοειδής (sigmoidal growth curve) η ανάγκη δημιουργίας απλών μοντέλων που παρουσιάζουν αυτήν την συμπεριφορά οδήγησαν στην χρησιμοποίηση της έννοιας της «φέρουσας ικανότητας» (carrying capacity). Με άλλα λόγια, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι ανάλογος του υπολειπόμενης φέρουσας ικανότητας, δηλ.,

    ⎟⎟

    ⎜⎜

    ⎛−=

    ∞x

    x1kμ

    και επομένως το ισοζύγιο μάζας σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου γίνεται,

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 89

    ⎟⎟

    ⎜⎜

    ⎛−=

    ∞x

    x1kx

    dtdx

    Ολοκλήρωση της παραπάνω διαφορικής εξίσωσης με αρχική συνθήκη x(0)=xo, οδηγεί στην «λογιστική καμπύλη»,

    )e(1

    xx

    1

    exx(t)

    kto

    kto

    −−=

    Η μέγιστη χωρητικότητα, x∞, πρέπει να προσδιοριστεί για τις συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες που γίνεται η ανάπτυξη των κυττάρων. Συχνά, χρησιμοποιείται η προσέγγιση της μεγίστης χωρητικότητας σαν τρόπος περιγραφής της επίδρασης τοξικών παραπροϊόντων… Είναι προφανές ότι η μέγιστη ικανότητα, x∞, μπορεί να συσχετιστεί με την μέγιστη συγκέντρωση υποστρώματος (που είναι η αρχική, S0) με βάση την σχέση

    Δx/ΔS = Yx/s

    (x-x0) = Yx/s (S0-S)

    (x∞-x0) = Yx/s (S0-0)

    x∞ = x0 + Yx/sS0

    Η παραπάνω σχέση υποθέτει ότι η μικροβιακή αύξηση συνεχίζεται μέχρι την εξάντληση του περιοριστικού υποστρώματος, S.

    Μικροβιακή ανάπτυξη με περιορισμό υποστρώματος (substrate-limited growth)

    1. Εξίσωση Monod: Με βάση πειραματικά δεδομένα έχει διαπιστωθεί ότι ο ρυθμός μικροβιακής ανάπτυξης είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος κατά παρόμοιο τρόπο με αυτό που είδαμε στις ενζυματικές αντιδράσεις. Η λεγόμενη κινητική έκφραση του Monod είναι:

    [S]K[S]μ

    μS

    max

    +=

    x∞

    xο χρόνος

    [S] KS

    μmax

    μmax/2

    μ

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 90

    όπου η σταθερά κορεσμού ΚS αντιστοιχεί στην συγκέντρωση υποστρώματος που ο ρυθμός ανάπτυξης είναι στο μισό του μεγίστου. Η φυσική σημασία της κινητικής έκφρασης Monod γίνεται προφανής αν θεωρήσουμε ότι οι επί μέρους βιοχημικές αντιδράσεις που λαμβάνουν μέρος στην ανάπτυξη ενός κυττάρου είναι ενζυματικές και μία από αυτές θα είναι εκείνη που ελέγχει τον ρυθμό ανάπτυξης. Για τον υπολογισμό των παραμέτρων (μmax, KS) μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε όλες τις μεθόδους που αναφέραμε σε προηγούμενο κεφάλαιο για ενζυματικές αντιδράσεις. 2. Εξίσωση Tessier:

    ⎟⎟⎟

    ⎜⎜⎜

    ⎛−=

    −SK

    [S]

    max e1μμ

    3. Εξίσωση Moser:

    n

    S

    nmax

    [S]K[S]μ

    μ+

    =

    4. Εξίσωση Contois:

    [S]xK[S]μ

    μcs

    max

    += ουσιαστικά έχουμε KS που είναι συνάρτηση του x.

    5. Εξίσωση Blackman:

    ⎪⎪⎩

    ⎪⎪⎨

    >

    =BsB

    s

    max

    Bsmax

    2K[S]2K

    [S]μ

    2K[S] μ

    μ

    6. Εξίσωση Konak: O Konak πρότεινε μια διαφορική εξίσωση που συνδέει τον ρυθμό ανάπτυξης με την συγκέντρωση του υποστρώματος,

    ( )pmax μμkdSdμ

    −=

    S

    μ

    μmax

    Bs2K

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 91

    όπου k & p είναι παράμετροι. Όταν p=1 η λύση καταλήγει στην εξίσωση του Tessier. H λύση για p≠1 είναι ( ) p)k[S](1μμμ p1maxp1max −=−− −− όπου για p=2 καταλήγουμε στην έκφραση του Monod. 7. Εξίσωση Dabes:

    μμ

    μλμλ[S]

    max

    21 −

    +=

    Λογιστική καμπύλη ανάπτυξης (logistic equation): Συσχέτιση ειδικού ρυθμού ανάπτυξης με την κατανάλωση υποστρώματος:

    Δx/ΔS = Yx/s

    (x-x0) = Yx/s (S0-S)

    x = x0 + Yx/s (S0-S) Αντικαθιστώντας στην εξίσωση

    ⎟⎟

    ⎜⎜

    ⎛−=

    ∞x

    x1kμ

    προκύπτει η σχέση

    ⎟⎟⎟

    ⎜⎜⎜

    +

    −+−=

    0Sx/sY0x

    S)0(Sx/sY0x1kμ ⎟⎟⎟

    ⎜⎜⎜

    +=

    0Sx/sY0x

    Sx/sYkμ

    S0Sx/sY0x

    x/skYμ⎟⎟⎟

    ⎜⎜⎜

    += μ = kx S

    Άρα όταν δεχόμαστε την λογιστική καμπύλη ανάπτυξης ουσιαστικά υποθέτουμε ότι έχουμε κινητική πρώτης τάξης ως προς το υπόστρωμα. Η παραδοχή αυτή είναι σωστή μόνον όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι μικρή (π.χ., όταν S < KS/2, υποθέτοντας κινητική Monod).

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 92

    12. ΠΟΛΛΑΠΛΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ - ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ – ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ

    Μικροβιακή Ανάπτυξη με Πολλαπλά Υποστρώματα: Το μοντέλο του Monod και οι παραλλαγές που αναφέραμε προηγούμενα είναι σε θέση να περιγράψουν τα πειραματικά δεδομένα όταν έχουμε μόνο ένα υπόστρωμα που ελέγχει την κινητική μικροβιακής ανάπτυξης "περιοριστικό υπόστρωμα" (single limiting substrate). Υπάρχουν όμως πολλές περιπτώσεις όπου διαφορετικά υποστρώματα ελέγχουν ταυτόχρονα τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης. Αυτό συμβαίνει όταν περισσότεροι του ενός μεταβολίτες εισέρχονται ένα μεταβολικό μονοπάτι (metabolic pathway) και κάθε μεταβολίτης ελέγχεται από διαφορετικό ένζυμο. Π.χ., γλυκόζη και οξυγόνο μπορούν να ελέγχουν την κυτταρική ανάπτυξη. Σε κυτταροκαλλιέργειες (ζωικών κυττάρων), γλυκόζη και γλουταμίνη (glutamine) είναι γενικά απαραίτητα. Τα μοντέλα που έχουν προταθεί για να περιγράψουν την ανάπτυξη από δύο υποστρώματα είναι: (α) Ταυτόχρονης χρήσης (multiplicative):

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+⎟

    ⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+

    =22S

    2

    11S

    1SK

    SSK

    Smaxμμ

    ή γενικότερα για n υποστρώματα

    ∏= +

    =n

    1i iSi

    imax SK

    Sμμ όταν για κάποιο υπόστρωμα έχουμε Sj > 10KSj, τότε

    1SK

    S

    jSj

    j ≈+

    (β) Διαδοχικής χρήσης (additive kinetics): Μπορεί να περιγράψει την διαυξητική

    ανάπτυξη (diauxic growth) δηλ. όταν καταναλίσκεται διαδοχικά η κάθε πηγή άνθρακα.

    22S

    22max

    11S

    11maxSKS

    SKS

    ++

    +=

    μμμ

    ή γενικότερα για n υποστρώματα

    ∑= +

    =n

    1i iSi

    iimaxSKSμ

    μ

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 93

    Μία περαιτέρω γενίκευση μπορεί να γίνει όταν διαχωρίσουμε τα υποστρώματα σε αναγκαία (essential substrates) και σε υποστρώματα πού απλά ενισχύουν την ανάπτυξη (growth enhancers).

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    +⎟⎟

    ⎜⎜

    ++= ∏∑

    i iSi

    i

    j jSj

    jj0max SK

    SSK

    Skμμ

    Η παράμετρος μmax0 είναι ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης όταν δεν υπάρχουν υποστρώματα ενίσχυσης μικροβιακής ανάπτυξης. Υπάρχουν και μοντέλα που περιγράφουν την παρατηρούμενη «αδράνεια» στην μετάβαση από μία πηγή άνθρακα σε άλλη.

    ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Παρεμπόδιση Υποστρώματος: Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μικροοργανισμών μπορεί να μειωθεί όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι υψηλή κατά τρόπο ανάλογο της παρεμπόδισης υποστρώματος σε ενζυματικές αντιδράσεις. Ένας τρόπος μοντελοποίησης της παρεμπόδισης υποστρώματος είναι ο εξής: X + S XS νέα κύτταρα XS + S XSS όπου το αντιστρεπτό διπλό σύμπλοκο XSS δεν μπορεί να δημιουργήσει καινούργια κύτταρα. Ο ρυθμός κυτταρικής ανάπτυξης είναι: rx = k[XS] και ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης : μ = k[XS]/[X]. Χρησιμοποιώντας τις εκφράσεις «ισορροπίας»

    ]XS[]S][X[KS = και ]XSS[

    ]S][XS[KI =

    αναγκαία υποστρώματα

    υποστρώματα ενίσχυσης

    kKS

    KI

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 94

    καταλήγουμε στην σχέση

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛++

    =

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+

    +

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+

    =

    I

    2

    S

    max

    I

    S

    I

    max

    KSSK

    S

    KS1

    KS

    KS1

    S

    μ

    μ

    μ

    Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης αυξάνει μέχρι μία μεγίστη τιμή και μετά μειώνεται. Η συγκέντρωση του υποστρώματος (S*) που αντιστοιχεί στο μέγιστο ρυθμό ανάπτυξης βρίσκεται από την σχέση:

    ISKK*S0dSd

    =⇒=μ

    Μέγιστη τιμή μ:

    1IKSK2

    maxμ*μ

    +

    =

    Παρεμπόδιση Αναστολέα: Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μικροοργανισμών μπορεί επίσης να μειωθεί όταν η αυξηθεί η συγκέντρωση ενός παραπροϊόντος («τοξίνης») που δρα ανασταλτικά ή έχουμε προσθήκη κάποιου αναστολέα που βρίσκεται στην τροφοδοσία στον βιοαντιδραστήρα. Οι εκφράσεις που χρησιμοποιούνται είναι της μορφής (μείωση μόνο του μmax):

    ( )]I[K1 I0maxmax −= μμ ή

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+

    =

    I

    0maxmax

    K]I[1

    μμ

    ή

    ]I[IK0maxmax e−= μμ

    Παρεμπόδιση Προϊόντος: Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μικροοργανισμών μπορεί επίσης να μειωθεί όταν η Μία διαφορετική αντιμετώπιση για την ποσοτικοποίηση της παρεμπόδισης προϊόντων είναι

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 95

    βασισμένη σε πειραματικές μετρήσεις της συγκέντρωσης του προϊόντος (Pj,max) που αναστέλλει παντελώς τον ρυθμό μικροβιακής ανάπτυξης (μ=0). Τα αντίστοιχα μοντέλα που έχουν προταθεί είναι:

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+⎟

    ⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛−=

    SKS

    PP

    1Smax,j

    jmaxμμ

    ή

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+⎟

    ⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛−=

    SKS

    PP

    1Smax,j

    jmax

    β

    μμ

    ή

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛+⎟⎟

    ⎜⎜⎜

    ⎟⎟⎠

    ⎞⎜⎜⎝

    ⎛−=

    SKS

    PP

    1Smax,j

    jmax

    γ

    μμ

    όπου οι παράμετροι β και γ υπολογίζονται από πειραματικές μετρήσεις. Είναι αρκετά γενικές και μπορούν να καλύψουν πολλές περιπτώσεις. ΡΥΘΜΟΙ ΑΝΑΛΩΣΗΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

    Ειδικός Ρυθμός Κατανάλωσης Υποστρώματος (substrate uptake rate): Ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης του υποστρώματος S συμβολίζεται με το qS και ισούται με το άθροισμα του ρυθμού κατανάλωσης που χρησιμοποιείται για

    (ι) κυτταρική ανάπτυξη (S X), (ιι) παραγωγή προϊόντων (S Pj), και (ιιι) συντήρηση (S ενέργεια συντήρησης):

    ∑++=−

    =j SPj

    Pj

    SX

    SS xY

    rm

    Yxr

    q//

    )( μ => και θεωρώντας

    x

    rq PjPj = έχουμε

    ∑++=j S/Pj

    Pj

    S/XS Y

    qm

    Yq μ

    Η μεταβλητή qS έχει μονάδες [g-S/(h·g-drycells)]. Εάν ο ρυθμός παραγωγής εξωκυτ-ταρικών προϊόντων είναι χαμηλός, η παραπάνω σχέση απλοποιείται ως εξής (Pirt):

    mY

    qS/X

    S +=μ

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 96

    Επομένως η εξάρτηση του qS από το S είναι παρόμοια (τύπου-Monod) του μ από το S. Επίσης παρατηρούμε ότι ακόμα και όταν ο ρυθμός μικροβιακής ανάπτυξης είναι μηδενικός (μ=0), υπάρχει κατανάλωση υποστρώματος για συντήρηση. Εάν ορίσουμε τον φαινομενικό συντελεστή απόδοσης (apparent yield coefficient, appS/XY ) ως

    app

    S/XS

    Yq μ=

    καταλήγουμε στην σχέση

    μm

    Y1

    Y1

    S/Xapp

    S/X

    +=

    Ο φαινομενικός συντελεστής απόδοσης υπολογίζεται εύκολα όταν έχουμε πειραματικά δεδομένα της συγκέντρωσης του υποστρώματος (S) και της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου (x) εκ των οποίων υπολογίζουμε το qS και μ. Δηλ.,

    ΔSΔx

    Sqμapp

    X/SYΔtΔS

    x1

    dtdS

    x1

    SqκαιΔtΔx

    x1

    dtdx

    x1μ ≈=⇒≈=≈=

    Επομένως από μία σειρά πειραμάτων όπου ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κρατείται σε διαφορετικά επίπεδα (μ1, μ2,…), μπορούμε να υπολογίσουμε τον πραγματικό συντελεστή απόδοσης (YX/S) και τον συντελεστή συντήρησης (m) με μία γραμμική παλινδρόμηση του 1/ appS/XY ως προς 1/μ. Τέλος, όταν έχουμε σημαντική έλλειψη υποστρώματος πρέπει να λάβουμε υπόψη και τον ενδογενή μεταβολισμό. Η ενέργεια που απαιτείται για την διατήρηση των κυττάρων βρίσκεται από κύτταρα που «πεθαίνουν» (βλέπε και νέες θεωρίες για programmed cell death σε μονοκυτταρικούς οργανισμούς). Σε αυτή την περίπτωση η κατανάλωση υποστρώματος είναι λιγότερη.

    1/ appS/XY

    1/μ

    1/ΥΧ/S

    m

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 97

    ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ

    I. Growth Associated:

    Για προϊόντα πρωτογενούς μεταβολισμού που συσχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, ο ρυθμός παραγωγής τους είναι ανάλογος του ρυθμού ανάπτυξης (growth associated product formation), rp = λ1 rx εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθμός παραγωγής προϊόντος είναι

    μλλ 1Px1PP qxr

    xr

    q =⇒==

    Εάν θεωρήσουμε ότι έχουμε κινητική Monod

    SK

    Sq

    SKSμλ

    qS

    maxp,

    S

    max1p +

    =+

    =

    II. Non-Growth Associated:

    Πολλά προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού δεν συσχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, ο ρυθμός παραγωγής τους είναι ανάλογος της συγκέντρωσης βιομάζας μόνον (non-growth associated product formation), rp = λ2 x εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθμός παραγωγής προϊόντος είναι σταθερός

    2P2P

    P qxx

    xr

    q λλ =⇒==

    III. Partially-Growth Associated:

    Τέλος πολλά προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού έχουν βρεθεί ότι συσχετίζονται με τον ρυθμό κυτταρικής ανάπτυξης και με την συγκέντρωση βιομάζας (partially-growth associated product formation),

    rp = λ1 rx + λ2 x

    εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθμός παραγωγής προϊόντος είναι σταθερός

    qp

    S

    qp,max

    KS

    qp,max/2

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 98

    21P2x

    1P

    P qxx

    xr

    xr

    q λμλλλ +=⇒+==

    Βασικά σε αυτή την περίπτωση ταξινομούμε όλες τις «δύσκολες» περιπτώσεις μοντελοποίησης του ρυθμού παραγωγής προϊόντος. Δομημένα μοντέλα είναι η πιο σοβαρή λύση όπου λαμβάνεται υπόψη το μεταβολικό μονοπάτι.

    Ενδεικτικά αναφέρουμε ένα άλλο απλό μοντέλο που ανήκει σε αυτή την κατηγορία (ισχύει για την παραγωγή πενικιλίνης):

    ⎩⎨⎧

    ≤≥

    =crit1

    critmaxPP

    qq

    μμμλμμ

    qp

    μcrit μ

    qp,max

    qp

    Scrit S

    qp,max

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 99

    13. ΕΙΔΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ανάπτυξη Μυκήτων (fungi growth) σε στερεά υποστρώματα:

    Όταν η ανάπτυξη των μυκήτων γίνεται σε στερεά υποστρώματα, π.χ., σε δίσκους με άγαρ (agar plate), έχει παρατηρηθεί ότι η ακτίνα του μικροβιακής αποικίας αυξάνεται με σταθερό ρυθμό. Δηλαδή,

    θ=dtdR

    όπου η παράμετρος θ είναι σταθερή.

    Εάν θεωρήσουμε μία κυκλική αποικία σταθερού ύψους (h) και πυκνότητας ρ, η βιομάζα είναι:

    Χ = πR2hρ

    ρπhXR =⇔

    Ο ρυθμός αύξησης της βιομάζας βρίσκεται συναρτήσει του ρυθμού αύξησης της ακτίνας,

    dtdRRh2

    dtdX ρπ=

    και εφόσον η ακτίνα αυξάνεται με σταθερό ρυθμό,

    Rh2dtdX ρθπ=

    αντικαθιστώντας το R από την προηγούμενη σχέση, καταλήγουμε στην διαφορική εξίσωση για την αύξηση της βιομάζας:

    ρπ

    ρθπhXh2

    dtdX

    =

    Χρησιμοποιώντας την αρχική συνθήκη X(t=0) = X0, επίλυση της διαφορικής δίνει

    ( )20Xt)t(X += λ ~ t2 όπου ρπθλ h=

    Συμπερασματικά η ανάπτυξη βιομάζας σε υπόστρωμα από άγαρ είναι τετραγωνική συναρτήσει του χρόνου (quadratic growth).

    Rh

  • Αρχές Βιοχημικής Μηχανικής Πολυτεχνείο Κρήτης

    © Καλογεράκης 2003 100

    Σωματιδιακή Ανάπτυξη Μυκήτων (fungal pellet growth):

    Σε αυτή την περίπτωση η ακτίνα του μικροβιακού σωματιδίου (σφαίρας) αυξάνεται με σταθερό ρυθμό, θ. Ξεκινώντας από την συνολική βιομάζα, Χ=(4/3)πρR3, καταλήγουμε:

    ( )33 0Xt)t(X += γ ~ t3 όπου 3 363 πρθγ =

    Προβλήματα οξυγόνωσης των κυττάρων στο κέντρο του σωματιδίου. Για ευρωτομύκητες η μέγιστη ακτίνα (Rcrit) είναι περίπου 0.7 mm όπου το κέντρο έχει D.O. μηδέν.

    R