Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος

Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ

Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Από το 1985 και μέχρι σήμερα η διαγνωστική διαδικασία

που ακολουθείται προκειμένου να καθοριστεί η HIV

λοίμωξη είναι:

�η αναζήτηση αντισωμάτων έναντι του ιού με ανοσοενζυμική μέθοδο (EIA)

και ακολουθεί σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος

� η επιβεβαίωση με τη μέθοδο Western Blot (W.Bl.).

Ο έλεγχος ξεκινάει πάντα με την ανοσοενζυμική

δοκιμασία διαλογής που ανιχνεύει την παρουσία

αντισωμάτων έναντι του ιού HIV

και έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύσει όσο το δυνατόν

περισσότερες HIV περιπτώσεις .

Χρησιμοποιούνται ευρέως, λόγω της υψηλής

ευαισθησίας και καταλληλότητάς τους για τον έλεγχο

μεγάλου αριθμού δειγμάτων, ιδιαίτερα στις

αιμοδοσίες.

Ο πρωταρχικός ρόλος της επιβεβαιωτικής δοκιμασίας

είναι η εξασφάλιση ότι τα δείγματα που βρίσκονται

anti-HIV θετικά με τις δοκιμασίες διαλογής είναι

πραγματικά θετικά ή αρνητικά για τη HIV λοίμωξη.

Η δοκιμασίαW.Blot ( ή ανοσοαποτύπωση)

στην πραγματικότητα είναι παρόμοια με τη δοκιμασία ΕΙΑ

με την έννοια ότι ανιχνεύουν στο δείγμα αντισώματα έναντι

των ειδικών πρωτεϊνών του ιού.

• Η δοκιμασία Western Blot είναι η πιο διαδεδομένη

επιβεβαιωτική μέθοδος που εφαρμόζεται στα Κέντρα

Αναφοράς AIDS μέχρι και σήμερα στη χώρα μας και

στην Ευρώπη.

Επιβεβαιωτική δοκιμασία (Western Blot).

Οι ιικές πρωτεΐνες (αντιγόνα) χωρίζονται ανάλογα με το

μοριακό βάρος τους μέσω ηλεκτροφόρησης και

μεταφέρονται σε μια μεμβράνη, η οποία στη συνέχεια

χρησιμοποιείται ως μία ταινία για κάθε δείγμα και

επωάζεται με τον ορό ή πλάσμα του αντίστοιχου

δείγματος.

Western blot

strip

5

min

PATIENT SAMPLE

2 H

CONJUGATE

1 H

CHROMOGEN

6 to 15

min

New Lav Blot I / II protocol

Ανάλογα με τα αντισώματα που υπάρχουν στο δείγμα

αντίστοιχες μπάντες εμφανίζονται στην ταινία.

Οι διάφορες πρωτεΐνες του HIV ταξινομούνται σε δύο

λειτουργικές ομάδες, που παράγονται από τρείς

γονιδιακές περιοχές του HIV (gag, env, pol):

"p" - πρωτεΐνες,

"gp" – γλυκοπρωτεΐνες

p66/51

p17

Western blot

HIV1 HIV2

HIV Confirmation : New Lav Blot I / II • Με τη δοκιμασία W. Bl.

συνήθως αναζητούμε τα

αντισώματα έναντι των

ακόλουθων πρωτεινών του

ιού HIV:

• πρωτεινες του

περιβλήματος:

gp41, gp120/160

• πρωτεινες του πυρήνα:

p18, p24, p55

• ένζυμα του ιού:

p31, p51, p66.

Για να θεωρηθεί ένα δείγμα θετικό με Western Blot

σύμφωνα με τα προτεινόμενα κριτήρια κατά CDC για

την HIV-1 και HIV-2 λοιμώξεις απαιτείται η παρουσία

αντίστοιχων αντισωμάτων έναντι δύο τουλάχιστον

πρωτεϊνών από τις παρακάτω:

p24 p26

gp41 gp31

gp120/160 gp125/140

Οι επιβεβαιωτικές δοκιμασίες αυξάνουν σημαντικά την

εξειδίκευση της ανίχνευσης, όταν χρησιμοποιούνται σε

συνδυασμό με τις δοκιμασίες διαλογής.

Στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι τουλάχιστον

τόσο ευαίσθητες όσο και οι συγκεκριμένες δοκιμασίες

διαλογής.

Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα αποτελέσματα

είναι είτε σαφώς θετικά ή αρνητικά.

Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Είναι δυνατόν η επιβεβαιωτική δοκιμασία ενός

θετικού με EIA δείγματος να δώσει αρνητικό

ή ακαθόριστο αποτέλεσμα.

• Στην εικόνα παρουσιάζονται

δυο δείγματα με τη δοκιμασία

W. Blot, που ελέγχθηκαν μετά

από 15-30 ημέρες.

Σε κανένα δείγμα δεν είχε

αλλάξει το προφίλ κλασμάτων

που παρατηρήθηκε σε

αρχικές λήψεις.

Η σωστή και γρήγορη αντιμετώπιση των

ακαθόριστων αποτελεσμάτων, όπως φαίνεται, δεν

μπορεί να γίνει με συμβατικές στρατηγικές

(επιβεβαίωση θετικού anti-HIV αποτελέσματος με τη

δοκιμασία Western Blot).

Θα μπορούσε να εφαρμοσθεί η αναζήτηση του p24 Ag HIV στον ορό,

που επιτυγχάνεται σε 2-4 εβδομάδες

πριν από την εμφάνιση των αντισωμάτων,

περίπου τη 14 η -15 η ημέρα μετά την

μόλυνση με τον HIV.

Η ανίχνευση του p24 AgHIV στον ορό

αποτελεί μάλλον ένα ασταθές εύρημα,

δεδομένου ότι η δοκιμασία στερείται

ευαισθησίας για τη διάγνωση

της HIV πρωτολοίμωξης,

αφού ανιχνεύεται μόνο στο 75% των

περιπτώσεων οξείας HIV λοίμωξης

και η περίοδος αντιγοναιμίας είναι σύντομη και μετά την ανάπτυξη

αντισωμάτων συνήθως δεν

ανιχνεύεται.

Αν η δοκιμασία ανίχνευσης

του p24 Ag HIV έχει

περιορισμένες δυνατότητες,

οι δοκιμασίες ανίχνευσης του

HIVRNΑ έχουν πολύ υψηλή

ευαισθησία και όλο πιο

συχνά εφαρμόζονται στις

μέρες μας.

Για την επίλυση των

περιπτώσεων με ακαθόριστα

αποτελέσματα οι

καταλληλότερες μέθοδοι είναι

η ανίχνευση του

HIV RNA και του p24 AgHIV

Πιστεύουμε ότι η προσθήκη της δοκιμασίας

ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων (HIVRNA) και AgHIV

είναι πλέον επαρκής για να μας επιτρέπουν

να συμπεράνουμε ότι αυτή η μορφή των δοκιμών

θα πρέπει να είναι ένα πρότυπο εργαλείο για την

πρόληψη και την επιτήρηση της HIV λοίμωξης

και για τη φροντίδα των οροθετικών ατόμων.

Ανάλογα με την κλινική εικόνα του ασθενούς και τους παράγοντες κινδύνου προτείνεται η εξής πορεία δράσης:

1) για ασθενείς με χαμηλούς παράγοντες κινδύνου συνιστάται η

επανάληψη της δο