Ing. Edith Coronel Bonifacio

Extracción por acción biocatalitica y dióxido de carbono supercrítico de capsaicinoides y

carotenoides del Capsicum chínense y análisis por cromatografía liquida de alta eficiencia

(HPLC)

capsaicina

dihidrocapsaicina

nordihidrocapsaicina

Capsaicinoides

βCaroteno

β Criptoxantina

Zeaxantina

Capsantina

Carotenoides

Extracción de y cuantificación de biocomponentes

Métodos de extracción de capsaicinoides y carotenoides

Enzimática

EXTRACION POR FLUIDO SUPERCRITICOLa extracción con fluidos supercríticos es una técnica de separación de sustancias disueltas o incluidas dentro de una matriz, basada fundamentalmente en la capacidad que tienen determinados fluidos en estado supercrítico (FSC) de modificar su poder disolvente

Densidad (g/mL) Viscosidad (g/cmxs) Difusividad (cm2/s)Gas

10-3 10-4 10-1

Liquido1 10-2 10-6

Fluido supercrítico0,2-0,9 10-4 10-3

Fuente: Mohamed (1997).

Diagrama de flujo de extracción de oleorresina por fluido supercrítico CO2

 

Ají

Lavado

Despepitado

Cortado

Secado

Molienda

Tamizado

Extracción supercrítica

Despresurización

Evaporación

Oleorresina

Facto A: Presión: 200 y 400 barFacto B :Temperatura: 35 y 55ºC

Facto C Tiempo: 1.5 y 3 h

Cant. 25 g ( muestra: 80 vol del extractor)

En aros de 5 mm de espesor de ají

Tamaño de partícula (mm): 1 < Ǿ < de 0.425

A 40 ºC, tiempo: 38 – 50 horasHumedad final: 10- 12 %

Rota evaporador a 40 ºCy a 500mmg Hg

Recolectada en envases de vidrio de color ámbar y almacenada a -25ºC

METODOLOGIA 

HIDROLISIS enzimática Y EXTRACCION POR LIXIVIACION

Sustrato- tejido de ají

Enzima - CELULASA

Complejo enzima-sustrato(ES)

FIJACION

TRANSFORMACION E HIDROLISIS

MAYOR DISPONIBILIDAD

HEXANO/ ETANOL

CAPSAICINOIDES Y CAROTENOIDES

RESIDUOSLIXIVIACION

Celulosa de ají

Diagrama de flujo de extracción de oleorresina por fluido supercrítico CO2 

Ají

Lavado

Despepitado

Cortado

Secado

Molienda

Tamizado

Extracción supercrítica

Despresurización

Evaporación

Oleorresina

Facto A: Presión: 200 y 400 barFacto B :Temperatura: 35 y 55ºC

Facto C Tiempo: 1.5 y 3 h

Cant. 25 g ( muestra: 80 vol del extractor)

En aros de 5 mm de espesor de ají

Tamaño de partícula (mm): 1 < Ǿ < de 0.425

A 40 ºC, tiempo: 38 – 50 horasHumedad final: 10- 12 %

Rota evaporador a 40 ºCy a 500mmg Hg

Recolectada en envases de vidrio de color ámbar y almacenada a -25ºC

RESULTADOS y DISCUSIONES Extracción por fluido supercrítico CO2 : capsaicinoides

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min0

25

50

75

100

125

mAU280nm,4nm (1.00)

Perfil cromatográfico de capsaicinoides extraídos por SC- CO2: (a) estándar (40 ppm), (b) ají ojo de pez y (c) ají habanero peruano.

(a)

(b)

(c)

Capsaicinoides Estándar (40 ppm) Ají ojo de pez Ají habaneroTiempos de retención(min)

Área(mUA2)

% de área Tiempo de retención(min)

Área(mUA2)

% de área Tiempo de retención(min)

Área(mUA2)

% de área

Nordihidrocapsaicina(NDHC)

7,85 – 7,9 14003 0,93 7,97 58447 3,8 7,9 9455 0,8

Capsaicina(Cap )

8,44- 8,55 703193 49,1 8,5 5923107 80,0 8,5 200377,5 85,4

Dihidrocapsaicina(DHC)

12,39 - 12,43 730654 50,4 12,4 953905 16,3 12,4

40753,5 13,8

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU280nm,4nm (1.00)

C

NDHC

NDHC

NDHC

C

C

DHCDHC

DHC

Extracción por fluido supercrítico CO2 : carotenoides

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

50

100

150

200

250

300mAU447nm,4nm (1.00)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

25

50

75

100mAU447nm,4nm (1.00)

Perfil cromatográfico de carotenoides extraídos por extracción con SC-CO2: a) Estándar (20 ppm), b) Ají ojo de pez y c) Ají habanero.

a)

b)

c)

Carotenoides

Estándar (20 ppm)

Ají ojo de pez

Ají habanero

Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área

Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área

Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área

β- caroteno2,984 – 3,123 3011296 21,3 3,01 2191049 57,2 3,11 826172,5 80,7

β-criptoxantina5,995 – 6,507 7705210 54,9 5,95 665910 17,4 5,94 97155 9,5

zeaxantina 10,0- 10,2 1697201 11,7 10,03 637183 16,6 10,02 52877,5 5,2capsantina 15,01-15,43 1827600 12,1 15,20 338807 8,8 15,18 47897,5 4,7

β-ca

r

β-ca

rβ-

car

β-cr

ip

β-cr

iβ-

crip

caps

caps

caps

zea

zea

zea

CAPSAICINOIDES

Estándar (20 ppm) Ají ojo de pez Ají habanero

Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área Tiempos de retención(min)

Área(mUA2)*

% de área

Nordihidrocapsaicina(NDHC)

7,85 – 7,89 14 003 0,97 7,884

6044,05 0,7 7,861

8852,5 3,6

Capsaicina(C )

8,44- 8,55 703 193

48,6 8,534 752725 88,2 8,46

189116 76,7

Dihidrocapsaicina(DHC)

12,39 - 12,43

730 654

50,7 12,39 93752 10,1 12,39

48588,5 19,7

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU280nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min0

10

20

30

40

50

60

70

80

mAU280nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

mAU280nm,4nm (1.00)

Cromatogramas de capsaicinoides extraído por acción biocatalítica: a) Estándar (20 ppm), b) Ají ojo de pez y c) Ají habanero

a) b)

c)

Cromatogramas de capsaicinoides por extracción enzimática- lixiviación con solvente orgánico

DHC

DHC

DHC

C

C

NDHC

NDHCNDHC

C

Carotenoides

Muestra estándar Ají ojo de pez Ají habaneroTiempos de

retención(min)Área

(mUA2)% de área Tiempos de

retención(min)Área

(mUA2)% de área Tiempos de

retención(min)Área

(mUA2)% de área

β -caroteno 2,984 – 3,123 3011296 21,3 3,11 535420 45,3 3,11 159277,5 58,4β-criptoxantina 5,995 – 6,507 7705210 54,9 5,245 326058 27,6 5,245 45748 16,8

zeaxantina 10,0- 10,2 1697201 11,7 10,051 274112 23,2 10,021 48625 17,8

capsantina 15,01-15,43 1827600 12,1 15,313 46851 4,0 15,183 19194,5 7,0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0mAU447nm,4nm (1.00)

Cromatogramas de carotenoides del estándar (20 ppm) (a) y los extraídos por acción biocatalítica de ají ojo de pez (b) y habanero (c).

(a)

(b)

(c)

β-ca

r

β-ca

rβ-

car

β-cr

ip

β-cr

ip

β-cr

ip

caps

caps

caps

zea

zea

zea

Cromatogramas de carotenoides por extracción enzimática- lixiviación con solvente orgánico

Biocomponentes

Tipos de extracción

Extracción convencional(soxhlet)

Extracciónbiocatalitica

Extracción por SF-CO2

Ají ojo de pez Ají habanero Ají ojo de pez Ají habanero Ají ojo de pez Ají habanero

Carotenoides (mg/100 g ms)

870,70

207,94

924,54

450,60

2520,73

750,07

Capsaicinoides (mg/100 g ms)

1494,50

1945,21

12841,06

3885,62

29965,16

5954,31

SHU 224175,44 291781,94 1926157,34 582843,46 4449774,17 893147,04Donde: SHU son unidades Scoville.

Capsaicinoides y carotenoides totales obtenidas en cada extracción y muestra.

CONCLUSIONES

En e extracción con SC- CO2 el T4 en el ají ojo de pez tuvo la mayor cantidad de: nordihidrocapsaicina (278,42 mg/100 g ms), capsaicina (25 131,71mg/100 g ms) y dihidrocapsaicina (4 255,03 mg/100 g ms), por ende se extrajo 29665,16 mg de capsaicinoides totales/100g ms y con pungencia de 4 449 774,17 SHU y en el T8 tuvo la mayor cantidad de : β -caroteno (1 281,82 mg/100 g ms), β -criptoxantina (179.59 mg/100 g ms), zeaxantina (820,57 mg/100 g ms) y capsantina (238,76 mg/100 g ms); finalmente se extrajo 2520,73 mg de carotenoides totales /100 g ms.

En extracción con SC- CO2 el T3 en el ají habanero se tuvo la mayor cantidad de: nordihidrocapsaicina (232.34 mg/100gms), capsaicina (4 405,76 mg/100 g ms) y dihidrocapsaicina (1 316,21 mg/100 g ms), por ende se extrajo 5 954,31 mg de capsaicinoides totales /100 g ms y con pungencia de 893 147,04 SHU y en el T8 tuvo las mayores cantidades de: β-caroteno (330.55 mg/100 g ms), β -criptoxantina (64,47 mg/100 g ms), zeaxantina (223.11 mg/100 g ms) y capsantina (131.94 mg/100 g ms), finalmente se extrajo 750,07 mg de carotenoides totales /100 g m

En la extracción biocatalitica en el T6 del ají ojo de pez, se obtuvo las cantidades máximas de capsaicina (11 177,39 mg/100 g ms) y dihidrocapsaicina (1 496,81mg/100 g ms), en el T5 se extrajo mayor nordihidrocapsaicina (172,03 mg/100 g ms); finalmente se obtuvo 12 841 mg/100 g ms capsaicinoides totales y una pungencia de 1 926 157,34 SHU y T7 tuvo la cantidad máxima de β caroteno (364.99 mg/100 g ms), β criptoxantina (153,57 mg/100 g ms), zeaxantina (359,05 mg/100 g ms) y capsantina (46,94 mg/100 g ms), finalmente 924,54 mg carotenoides totales /100 g ms.

En el T7 de la extracción biocatalitica del ají habanero, se obtuvieron las cantidades máximas de nordihidocapsaicina (208,25 mg/100 g ms), capsaicina (2 866,42 mg/100 g ms) y dihidhocapsaicina (810,96 mg/100 g ms), en consecuencia se obtuvo 3 885,62 mg de capsaicinoides totales /100 g ms y con una pungencia de 582 843,46 SHU y T7 la cantidad máxima de β criptoxantina (102.60 mg/100 g ms) y zeaxantina (132,03 mg/100 g ms); β caroteno (178,24 mg/100 g ms) y capsantina (31,24 mg/100 g ms), finalmente se extrajo 450.60 mg de carotenoides totales /100 g ms

La extracción convencional extrajo menor cantidad de biocomponentes que la biocatalitica y extracción por SC-CO2, esta ultima tecnología permite obtener oleorresina sin residuos de solventes orgánicos por lo que cuyos extractos podrían ser destinados a la industrias farmacéutica.

REFENCIAS BIBLIOGRAFICASoAlani, F., Anderson, W. & Moo-Young, M.(2008). New isolate of St reptomyces sp. with novel thermoal kalo tolerant cellulases. Biotechnol Lett. 30, 123-126oDel Valle, Jimenez, M. y De la Fuente J.C. (2003)” Extraction kinetics of pre-pelletized Jalapeño peppers with supercritical CO2 “.Department of Chemical and Bioprocess Engineering, Pontificia Universidad Catolica (PUC) de Chile, Vicuña Mackenna 4860, Macul, Santiago, Chile.oKanokphom S. Piyapom P.Nisa P. y Pongnarin A. (2011) “Application treatment ton carotenoids extraction from chili ( Capsicum annuum L). Africal Journal of Microbiology Research Vol.5 (28), pp 5057-5061, Novenmer 2011.oNaranjo, M.S. y Salinas, D.C. (2009) “Oxidacion enzimatica de Capsaicina para la recuperacion de carotenoides a partir de Capsicum ANNUM, Instituto tecnologico S.A. MEXICO Mrtin j Lenis La. OROSCO M.SOLARTE C. Extraccion del pigmento de ají.oSalgado-Roman, M.; Botello A. E.; Rico, R. M.; Jim, E. H .I.; Cardenas M y Navarrete, B. J.,(2008) “Enzymatic Treatment To Improve Extraction of Capsaicinoids and Carotenoids from Chili (Capsicum annuum) Fruits” Departamento de Ingenierı´a Quı´mica-Bioquı´mica, Instituto Tecnolo´gico de Celaya, Avenida Tecnolo´gico s/n, C.P. 38010, Celaya, Gto., MexicooVillena, G.K. y Gutiérrez-Correa, M. (2007a) ”Morphological pattern of Aspergillus niger biofilms and pellets related to lignocellulolytic enzyme productivities”. Lett. Appl. Microbiol.45: 231-237.oZhang, Y.; Himmel, M. y Mielenz, J. (2006) ”Outlook for cellulase ¡mprovement: Screening and selection strategies”. Biotechnology Advances.24:452-481.

GRACIAS Ing. Edith Coronel Bonifacio

RPM:#956402071

Correo: edly1734@Hotmail.com

Diseño experimental estadístico: Extracción enzimática

Variables independientes:

Hidrólisis

FACTOR A: Enzima/ Sustrato: 1/15 y 1/20

FACTOR B: Velocidad de agitación para hidrólisis: 170 y 190 rpm

FACTOR C:Tiempo de hidrolisis: 2 y 4 h

Variables dependientes

Rendimiento de oleorresina (%)

Cantidad de capsaicinoides y carotenoides representativos o predominante (mg/100 g muestra seca)

Variables intervinientes

Temperatura de hidrólisis: 35º C.

Tamaño de partícula: < 0, 425 mm de muestras

de ají habanero y ojo de pez

Yijkl : Cantidad de capsaicinoides totales ( mg/ 100 g ms)µ : Media generalAi : Efecto del factor A (Enzima/ Sustrato:(1/15) y (1/20)).Bj : Efecto del factor B (Velocidad de agitación: 170 y 190 rpm).Ck : Efecto del factor C (Tiempo de hidrolisis: 2 y 4 h).

AC)ik : Efecto de la interacción de los factores A y C.(BC)jk : Efecto de la interacción de los factores B y C.

(ABC)ijk : Efecto de la interacción de los factores A, B y C.

Eijkl : Error experimental.

Modelo estadístico para la extracción biocatalitica para capsaicinoides totalesYijkl: µ +Ai+Bj + Ck + (AB)ij +AC)ik +(BC)jk +(ABC)ijk + Eijkl

:

Para el análisis de los resultados obtenidos se utilizó un Diseño completamente aleatorio (DCA) con un arreglo factorial 23 y para el procesamiento de datos, se realizo un ANOVA con un α = 5% y la prueba de comparación de rangos múltiples entre tratamientos por DUNCAN, para determinar la significancia de las variables de estudio en el proceso e extracción.El procesamiento de datos se realizó usando un paquete estadístico (software) de Estadistical Análisis System (SAS) versión 9.