Doctorand: dr. Silvia Filipiuc

Îndrumător: Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

DETERMINAREA CONCENTRAŢIILOR

MINIME INHIBITORII PENTRU

TULPINI DE NEISSERIA GONORRHOEAE

PRIN E-TEST

RAPORT ŞTIINŢIFIC

OBIECTIV:

stabilirea tipului de rezistenţă a tulpinilor de

Neisseria gonorrhoeae, utilizând benzi E-test,

la bolnavi cu gonoree din judeţul Suceava, în

perioada 2009-2010.

DESIGN: studiul prezentat este unul analitic(observaţional etiologic), de cohortă, prospectiv.

LOC: investigarea, în laboratorul de Microbiologie alDSP Suceava şi Laboratorul de Microbiologie alDisciplinei de studiu Microbiologie din cadrulU.M.F. Iaşi.

PARTICIPANŢI: pacienţii care se încadrează îndefiniţiile de caz şi care au fost de acord cu consimţă-mântul informat, aprobat de către Comitetul de Eticăal Universităţii.

PACIENŢI SI METODE:

au fost testaţi 32 pacienţi (6 femei, 26 bărbaţi);

perioada studiului: octombrie 2009- august

2010;

s-au recoltat probe de secreţie uretrală / endo-

cervicală.

PACIENŢI SI METODE:

frotiu direct colorat Gram şi albastru de

metilen, examinat la microscopul cu obiectivul

cu imersie,

izolare (însămânţare pe 2 plăci cu mediu

selectiv şi neselectiv);

identificare (microscopică, testul oxidazei,

identificare biochimică, utilizând truse mini-

API);

PACIENŢI SI METODE:

S-a determinat CMI pentru tulpinile izolate, la: penicilină,tetraciclină, amoxicilină, augmentin, claritromicină,ciprofloxacină, ceftriaxonă, spectinomicină, utilizând benzi E–test, tehnică recomandată de O.M.S, cu respectarea criteriilorde interpretare şi control CLSI 2008.

Asigurarea calităţii prin utilizarea de tulpini de referinţă de N.gonorrhoeae ATCC 49226 pentru verificarea calităţii nutritivea mediilor de cultură şi a corectitudinii antibiogramei;

prelucrarea datelor pentru cazurile de gonoree depistate şiconfirmate (EpIData, EpiInfo).

Principiul E-test

Pe suprafaţa unei plăci de mediu agarizat, însămânţată maiîntâi cu tulpina testată în condiţii standardat, se aplicălanghetele cu antibiotic care sunt depuse radiar, sau în paralel.

După incubare, CMI este indicată de intersecţia dintre zonaeliptică de inhibiţie a culturii şi scala de gradient a langhetei.

Testul permite:

- determinarea concomitentă, pe aceeaşi placă, a CMI pentrumai multe antibiotice, atât pentru bacterii aerobe cât şianaerobe;

- supravegherea pacienţilor pe parcursul terapiei antimicrobiene,pentru a surprinde selectarea de clone rezistente.

E-test CMI

http://www.biomerieux-diagnostics.com/upload/Etest2

Sao Paulo Med. J. vol.112 no.4 São Paulo Oct./Dec. 1994

Avantajele E-test

Poate determina CMI pentru bacterii fastidioase.

Detectează/confirmă fenotipuri de rezistenţă deosebite (ESBL,

MBL, AmpC, sau GISA/hGISA).

Detectează rezistenţe de nivel scăzut.

Util în testarea antibioticelor noi sau care nu sunt testate de

rutină.

Confirmă rezultatele “echivoce” obţinute prin antibiograma

difuzimetrică.

Cultură primară de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC bază +

1% hemoglobină + 1% supliment nutitiv IsoVtalex, VITOX +

supliment selectiv (VCN).

Cultură pură de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC bază +

1% hemoglobină + 1% supliment nutitiv IsoVtalex,

VITOX + supliment selectiv (VCN).

Teste biochimice galerii API –NH Biomerieux, tulpină β-

lactamaza pozitivă.

Teste biochimice galerii API –NH Biomerieux, tulpină

β-lactamaza negativă.

Criteriile de interpretare conform

CLSI 2008

Antibiotic Tulpină sensibilă

CMI (µg/mL)

Tulpină intermediar

sensibilă

CMI (µg/mL)

Tulpină

rezistentă

CMI (µg/mL)

Penicilină 0.06 0.12-1 >2

Ceftriaxonă 0.25 Nu există limite

CLSI

Nu există limite

CLSI

Ciprofloxacin 0.06 0.12-05 >1

Spectinomicină 32 64 128

Tetraciclina 0.25 0.5-1 2-32

Rezultate

E-test pe mediu GC agar bază, completat cu 1% IsoVitaleX, fară

hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108 UFC/ml)

pentru ceftriaxonă si ciprofloxacin.

E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX,

fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108

UFC/ml) pentru claritromicina si tetraciclina.

E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108

UFC/ml) pentru penicilină şi tetraciclină.

E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX, farăhemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108 UFC/ml)pentru penicilină si amoxicilină.

Rezultate

Valorile CMI pentru antibioticele utilizate au fosttransformate în rate de rezistenţă (%): sensibil, intermediar, şitulpini rezistente (Tabelul1).

Din totalul tulpinilor 53,1%, 43,75%, 40,6%, 34,4%, 59,4%,34,4%,0% au fost rezistente la penicilină, respectiv laamoxicilină, augmentin, claritromicină, tetraciclină,ciprofloxacin, ceftriaxonă si spectinomicina; 7 tulpini (21,8%)au fost ß-lactamază pozitive;

49% tulpini au fost multirezistente.

În timp ce pentru penicilină, tetraciclină, ceftriaxonă şiciprofloxacin sunt criterii clare în ghidul pentru interpretare alsensibilităţii (CLSI 2008), pentru amoxicilină, augmentin, siclaritromicină nu sunt bine definite.

TABEL 1. Rezultatele testării prin E-test pentru tulpini de

Neisseria gonorrhoeae izolate in perioada 2009-2010

Antibiotic Rezistent

% (pozitiv/total)

Intermediar

% (pozitiv/total)

Sensibil

% (pozitiv/total)

Ceftriaxona 0 (0/32) 3,1 (1/32) 96.9 (31/32)

(CMI =0,25μg/ml)

Penicilina 53,1 (17/32)

(CMI >2 μg/ml)

15,6 (5/32)

(CMI =0,12-1μg/ml)

31.2 (10/32)

(CMI =0,06μg/ml)

Tetraciclina 59,4 (19/32)

(CMI >2 μg/ml)

9,4 (3/32)

(CMI =0,5 - 1μg/ml)

31.2 (10/32)

(CMI =0,25μg/ml)

Amoxicilina 43.7 (14/32) 21,9 (7/32) 34,4 (11/32)

Augmentin 40,6 (13/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32)

ClaritroCMIina 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32)

Ciprofloxacina 34,4 (11/32)

(CMI >1 μg/ml)

28,1 (9/32)

(CMI =0,12-0.5μg/ml)

37,5 (12/32)

(CMI =0,06μg/ml)

Spectinomicină 0 (0/32)

(CMI =128 μg/ml)

3,1 (1/32)

(CMI =64μg/ml)

96.7 (31/32)

(CMI =32μg/ml)

Criterii de interpretare (CLSI)

Am folosit definiţiile, conform CLSI 2008:

sunt definite ca tulpini de Neisseriei gonorrhoeae rezistentela penicilină (PPNG), tulpinile β-lactamază pozitive;

în cazul rezistenţei mediate cromosomal, se consideră, pentruNeisseria gonorrhoeae ( CMRNG), tulpinile care au CMI >2µg/mL şi sunt β-lactamază negative; (mecanism principal derezistenţă: modificări ale PLP1 şi PLP2 (Roop, 2002);

tulpini de Neisseriei gonorrhoeae rezistente la tetracicline

(TRNG): sunt tulpinile care au CMI la tetraciclină >16 µg/mL(rezistenţă înaltă legată de prezenţa genelor – tetA-E, culocalizare plasmidică, care codifică sistemul de pompă-eflux-(Roberts,1997);

- Neisseria gonorrhoeae cu rezistenţa cromosomală latetraciclină (tetR): CMI la tetraciclină 2-8 µg/mL şi CMI lapenicilină <1 µg/mL.

Quinolone –rezistance Neisseria gonorrhoeae (QRNG): sunttulpinile care au CMI la ciprofloxacin > 1µg/Ml, rezistenţafiind mediată de mutaţiiale genelor gyr A sau par C;

Ceftriaxone -resistance Neisseria gonorrhoeae (CRNG): sunttulpinile care au CMI > 0.125µg/mL; sunt descrise variante deb-lactamaze TEM şi SHV care conferă rezistenţa la noilecefalosporine (Philippon 1989; Jacoby si Medeiros 1991);

Spectinomycine-resistance Neisseria gonorrhoeae (SRNG):tulpini cu CMI > 128µg/mL;

Multirezistenţa a fost definită pentru: QRNG şi PPNG;QRNG şi TRNG; QRNG, PPNG şi TRNG;

sistemul de gene MtrC-MtrD-MtrE a fost primul sistem efluxdescris la Neisseria gonorrhoeae care determină rezistenţa lapenicilină, tetraciclină, macrolide si fluoroquinolone (Hagman1995).

Rezultate

Pentru penicilină: 7 tulpini (21,8%) au avut rezistenţă înaltă,corelată cu rezistenţa plasmidică PPNG, iar 8 tulpini (25%),CMRNG, au avut rezistenţă mediată cromosomal ( CMI >2µg/mL) (tabelul 1).

Pentru tetraciclină: 19 tulpini au fost rezistente (tabelul 1);

11 tulpini(37.5%) au avut rezistenţă mediată cromosomaltetR (CMI >8 µg/mL), iar

4 tulpini (12.5%) au fost TRNG (CMI.>16 µg/mL), avândrezistenţă înaltă, mediată plasmidic (tabelul 1).

Rezultate

Pentru ciprofloxacină: 11 tulpini (34.4%) au avut rezistenţăînaltă (tabelul 1), fiind QRNG (CMI>1 µg/mL), 9 tulpini(28,1%) au prezentat o reducere a sensibilităţii la ciprofloxacin(tabelul 1).

Pentru ceftriaxonă: 1 tulpină (3,1%) a prezentat o reducere asensibilităţii (tabelul 1).

- Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI>0.125 µg/mL) (tabelul 1), 0 tulpini au prezentat rezistenţă laceftriaxonă.

Pentru spectinomicină:1tulpină (3,1%) a prezentat o reducerea sensibilităţii (tabelul 1).

- Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI>128µg/mL), 0 tulpini au prezentat rezistenţă la spectinomicină.

TABEL 1. Rezultatele testării prin E-test pentru tulpini de

Neisseria gonorrhoeae izolate in perioada 2009-2010

Antibiotic Rezistent

% (pozitiv/total)

Intermediar

% (pozitiv/total)

Sensibil

% (pozitiv/total)

Ceftriaxona 0 (0/32) 3,1 (1/32) 96.9 (31/32)

(CMI =0,25μg/ml)

Penicilina 53,1 (17/32)

(CMI >2 μg/ml)

15,6 (5/32)

(CMI =0,12-1μg/ml)

31.2 (10/32)

(CMI =0,06μg/ml)

Tetraciclina 59,4 (19/32)

(CMI >2 μg/ml)

9,4 (3/32)

(CMI =0,5 - 1μg/ml)

31.2 (10/32)

(CMI =0,25μg/ml)

Amoxicilina 43.7 (14/32) 21,9 (7/32) 34,4 (11/32)

Augmentin 40,6 (13/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32)

ClaritroCMIina 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32)

Ciprofloxacina 34,4 (11/32)

(CMI >1 μg/ml)

28,1 (9/32)

(CMI =0,12-0.5μg/ml)

37,5 (12/32)

(CMI =0,06μg/ml)

Spectinomicină 0 (0/32)

(CMI =128 μg/ml)

3,1 (1/32)

(CMI =64μg/ml)

96.7 (31/32)

(CMI =32μg/ml)

TABEL 2. CMI 50 şi CMI 90 si limitele de sensibilitate ale

CMI, pentru antibioticele testate prin E-test pentru 32 izolate

de Neisseria gonorrhoeae

Antibiotic CMI (µg/mL)

Limite

CMI (µg/mL)

50%

CMI (µg/mL)

90%Ceftriaxona 0.02-0.25 0.08 0.25

Penicilina 0.03-3.4 0.03 16

Tetraciclina 0.25-4 2 32

Amoxicilina 0.047-8 0.25 16

Augmentin 0.02-32 0.25 8

ClaritrOMICINAina 0.016-12 0.38 12

Ciprofloxacina 0.02-4 0.06 32

Spectinomicină 0.064-64 8 64

Analiza datelor

Acest studiu a urmărit optimizarea

diagnosticului microbiologic al gonoreei cu

implementarea controlului de calitate al testării

sensibilităţii la antibiotice prin E-test, într-un

laborator de microbiologie, judeţean.

Rezistenţa prin producere de penicinilaze la

Neisseriei gonorrhoeae este variabilă în

funcţie de zona geografică, ajungând la 80% în

numeroase ţări din sudul şi sud-estul Asiei şi în

Vestul Pacificului (Way 2005).

Analiza datelor

Procente ridicate sunt semnalate în diferite ţări din

Africa (ex 98%, în Nigeria, Tadese 2002).

Valori mai reduse, se înregistrează, în Franţa, în zona

Parisului 15% sau în Germania 21,5% (Enders 2006)

În perioada 1991-1998 s-a inregistrat un declin

semnificativ al tulpinilor Neisseriei gonorrhoeae

producătoare de penicinilaze, dar a crescut procentul

tulpinilor cu rezistenţa mediată cromosomal la

penicilină şi tetraciclina (Shigemura 2005)

Analiza datelor

Un număr mare de tulpini (62.5%) au fost rezistente laciprofloxacin, respectiv, 34.4%, cu rezistenţa de nivel înalt(QRNG) şi 28.1% cu o scădere a sensibilităţii;

Din aceste motive, ciprofloxacina nu mai este recomandă catratament util în gonoree în regiunea noastră, utilizarea sa fiindindicată numai după efectuarea antibiogramei şi demonstrareasensibilităţii izolatelor.

PENTRU URMATOARELE TREBUIE GRAFIC

Alte zone care au raportat rezistenţă cu nivele inalte: Asia63%; Europa de Vest ( Austria 53.1%, Belgia 46.9%, Suedia48%(Martin I.M.C. 2006); Rusia 50% (Kubanova A.2006);Iaşi 59.2% (Badescu A. 2007); India 86.6% (Manju B.2007);Australia 50%(Tapsall JW.1998); Japonia 81.6%(Ito M.2005);

Tabel 3. Rata de rezistenţă la antibiotice şi gradele de comparaţie cu alte

state Europene, Japonia si Australia pentru tulpini de Neisseria

gonorrhoeae testate prin metoda E-testª ( Martin I.M.C.2006)

Ţara Ceftriaxonă QRNG % CMRNG % PPNG % TRNH % TetR %

Austria 0 53.1 3.1 15.5 1 46.9

Belgia 0 46.9 10.9 4.7 12.5 35.9

Danemarca 0 46 11.2 1 5.1 43.9

Anglia 0 12 8 1 6 20

Franţa 0 32.7 10.9 15 6.7 57.4

Grecia 0 7.6 3.8 8.9 6.3 40.5

Italia 4.8 33.3 9.5 9.5 0 42.9

Neterland 0 16 0 8.6 8.6 33.3

Portugalia 0 17.6 0 11.8 35.3 35.3

Scoţia 0 30.3 17.2 7.1 1 25.3

Spania 0 15.2 2.2 6.5 6.5 43.5

Suedia 1 48 7.3 9.6 8.3 40.6

Japonia 30,3 78.3 59.3 1 2.2 68.8

Australia 38 34 12

Ro/Suceava 0 34.42 25 21.8 12.5 37.5

TABEL 4. CMI 50 şi CMI 90 si limitele CMI de sensibilitate pentru

antibioticele testate pentru Neisseria gonorrhoeae in Europa deVest

MartinI.M.C. 2006)

Antibiotic CMI (µg/mL)

Limite

CMI (µg/mL)

50%

CMI (µg/mL)

90%

Ceftrixonă 0.02-0.25 0.002 0.015

Penicilină 0.03-3.4 0.125 1

Tetraciclină 0.25-4 2 32

Ciproflo-

xacină

0.02-4 0.015 32

Spectino-

micină

0.064-64 8 64

Discuţii Pană în prezent tulpinile de Neisseria gonorrhoeae au

dezvoltat o rezistenţă crescută la penicilină, tetraciclină,quinolone în diferite ţări (India, China, Japonia) punând oserioasă problemă de management în gonoree (Manju B.2008).

La ceftriaxonă nu am izolat nicio tulpină rezistentă, însă otulpină a fost moderat sensibilă, în timp ce în alte regiuni aufost raportate tulpini ca rezistente în Italia 4.8%, America(semnalate sporadic), Africa 13%; Rusia 3% (KubanovaA.2006), Iasi 0% (Badescu A); India 5.5% (Manju.B2007);Japonia 30.3% (Ito M2005); Italia 4.8%; Suedia 1% (MartinI.M.C.2006).

Fa grafic cu aceste date!!!! Este greu de urmarit in acest format

Din pacate informaticina mea nu este acasa si nu te pot ajutacu grafice

Daca nu le poti face spuen ca sa caut pe cineva sa le faca sau lefac eu

Discuţii

Nu am izolat nicio tulpină rezistentă laspectinomicină.

Datorită păstrării sensibilităţii la acestantibiotic, o singură doză, de 2 g esteconsiderată utilă, tratamentul de primă linie înzona noastră.

Au fost raportate tulpini rezistente în ţărilePacificului de Vest ( Martin I.M.C.2006).

Concluzii In zona noastră, penicilina, tetraciclina,

ciprofloxacina, claritromicina, amoxicilina şiaugmentinul nu mai pot fi folosite în tratamentul deprimă intenţie a gonoreei, testarea lor fiindobligatorie.

In ţara noastră se impune optimizarea, standardizareaşi introducerea controlului de calitate al testăriisensibilităţii la antibiotice pentru tulpinile de N.gonorrhoeae izolate, în toate labortoarele.

Continuarea la nivel regional şi naţional asupravegherii sensibilităţii la antibiotice este crucialăîn detectatea emergenţei noilor rezistenţe;monitorizarea variaţiei pattern-urilor de sensibilitateva face posibilă adaptarea schemelor terapeutice.

Concluzii

Evoluţia sensibilităţii la cefalosporine trebuie

monitorizată obligatoriu, (fiind singura clasă de

antibiotice disponibilă în momentul de faţă pentru

terapia sindromică în uretrita gonococică), pentru

surprinderea apariţiei tulpinilor rezistente.

Pentru stabilirea mecanismelor de rezistenţa şi a

modului lor de transmitere sunt necesare studii

microbiologice extinse, inclusiv prin utilizarea

markerilor de epidemiologie moleculară.

Vă mulţumesc!