CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA...

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  • Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

    UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

    PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

    CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA-DEAÇÚCAR NA

    LEVEDURA Pichia pastoris

    ILÍTIA GANAÊ DE OLIVEIRA COSTA

    Agosto – 2016

    Goiânia - GO Brasil

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  • 1

    ILÍTIA GANAÊ DE OLIVEIRA COSTA

    CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA-DE-

    AÇÚCAR NA LEVEDURA

    Pichia pastoris

    Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

    Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade

    Federal de Goiás, como exigência para obtenção do título de

    Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.

    Orientador:

    Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

    Coorientador:

    Profa. Dra. Fabrícia Paula de Faria

    GOIÂNIA, GO – Brasil

    2016

  • 2

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    “Tudo neste mundo tem o seu tempo;

    Cada coisa tem a sua ocasião.

    Há tempo de nascer e tempo de morrer;

    Tempo de plantar e tempo de arrancar;

    Tempo de matar e tempo de curar;

    Tempo de derrubar e tempo de construir.

    Há tempo de ficar triste e tempo de se alegrar;

    Tempo de chorar e tempo de dançar;

    Tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntá-las;

    Tempo de abraçar e tempo de afastar.

    Há tempo de procurar e tempo de perder;

    Tempo de economizar e tempo de desperdiçar;

    Tempo de rasgar e tempo de remendar;

    Tempo de ficar calado e tempo de falar.

    Há tempo de amar e tempo de odiar;

    Tempo de guerra e tempo de paz.

    O que é que a pessoa ganha com todo o seu trabalho?

    Eu tenho visto todo o trabalho que Deus dá às pessoas

    para que fiquem ocupadas.

    Deus marcou o tempo certo para cada coisa. ”

    Eclesiastes 3: 1-11a (NTLH)

  • 4

    Dedico este trabalho aos meus pais, Ana e

    Jander, e meus irmãos, Ádila e Jander Felipe

    que SEMPRE me apoiaram nessa jornada.

    Ofereço a todos aqueles que persistem e nunca

    desistem da ciência, meus companheiros de

    laboratório e sala de aula.

  • 5

    “A ingratidão azeda o nosso coração, nos distancia de Deus e nos enche de cobiça. ”

    Pra. Helena Tannure

    Eu quero agradecer primeiramente a Deus, por ser tão lindo e maravilhoso na minha

    vida, e por ter me guiado a escolher um curso tão fantástico como a Biologia. Lembro como se

    fosse hoje o dia da minha inscrição para o vestibular. Ao longo desses anos eu aprendi tanto,

    principalmente a nunca dizer nunca. Quando me formei, eu disse que eu NUNCA ia trabalhar

    com DNA, e hoje estou maravilhada com a Biologia Molecular. Então eu só tenho a agradecer

    pela oportunidade que tive de conhecer esse universo!

    Quero agradecer à minha família por todo o apoio que recebi, pela compreensão e

    estímulos nos dias difíceis. Agradeço a meus pais, Ana e Jander por terem acreditado e investido

    em mim, e aos meus irmãos, por serem sempre meus fiéis e leais amigos. Foi sempre a minha

    família que ouviu minhas lamentações nos dias ruins, mas que também fez festas comigo

    quando um experimento funcionava, mesmo quando eles não entendiam que o resultava

    significava. Quero agradecer todas às minhas amigas de vida que sempre me encorajaram e

    motivaram: Fernanda, Byancarine, Gabi, Samara, Obrigada!! Justin, thank you so so so much

    for all your care, support and encouragement, your words made the difference!!

    Quero agradecer à professora Fabrícia por ter aberto as portas do laboratório na

    época da iniciação científica e me ajudado a descobrir a Biotecnologia dentro da Biologia:

    Obrigada! Agradeço profundamente ao professor Alexandre por ter me dado a oportunidade de

    fazer esse mestrado, que mesmo sem me conhecer antes do processo seletivo acreditou em mim

    e me apoiou. Sou muito grata!!

    Agradeço profundamente aos meus eternos companheiros do Laboratório de

    Biotecnologia de Fungos (LBF) que fizeram com que essa experiência fosse muito, muito,

    muito, mas muito mais divertida!!! Alex, Aline, Amanda, Carol, Doug, Fernanda, Francieli,

    Francielly, Isabelle, Izadora, Léo, Lorena, Ludmylla, Lucas, Natânia, Saulo, Syd, Thatielly,

    Thuana (que já está em seu novo e lindo laboratório) e professora Rosália - vocês foram minha

    motivação diária nesse laboratório. Vocês são minha segunda família!!!! O que tenho que

    agradecer a cada um de vocês não cabe aqui, mas faço questão de dizer pessoalmente. Também

    agradeço a Tia Divina pelo cuidado que sempre teve com a gente. Ela também faz parte da

    AGRADECIMENTO

  • 6

    família LBF!!

    Agradeço aos professores Luiz Artur, Guilherme e Ivan por sempre terem deixado

    a porta do laboratório aberta para mim, e terem me ensinado nos momentos que eu buscava

    ajuda. Agradeço ao professor Cirano e seu laboratório pela parceria e por estarem sempre

    prontos a nos ajudar. Obrigada professora Raphaela por se mostrar sempre pronta a me ajudar!

    Sou muito grata.

    Quero agradecer imensamente aos meus companheiros do Laboratório de Genética

    e Genômica de Plantas. Ivone, Stella, Rewther, Isabella - muito obrigada por sempre me ajudar,

    principalmente nessa reta final. Lud, muito obrigada de todo o coração por ter me auxiliado

    nessa última fase de experimento, contar com sua ajuda foi fundamental.

    Agradeço a todos meus colegas de disciplinas, principalmente Ariany e Bárbara que

    foram minhas duplas de tantos estudos e trabalhos.

    Agradeço à professora Leila por ter me incentivado a prestar o processo seletivo no

    PGMP, eu não acreditava que eu seria capaz, mas a senhora me convenceu. Kellen e Jack, vocês

    sempre estiveram prontas a me ajudar e escutar, desde antes entrar no PGMP. Sou muito mais

    do que grata.

    Agradeço à UFG, ICB e EA por me dar a oportunidade de ter conhecido

    maravilhosos professores, até o que eu não gostava, mas aprendi a admirar.

    Acho que poderei ser injusta se esqueci o nome de alguém aqui. Mas nessa reta

    final minha mente está tão ruim. Não é por maldade que poderei esquecer, mas sou grata por

    cada pessoa que fez parte desse processo. Só foi possível executar esse trabalho, porque tive

    ajuda, e ajuda em todas as áreas da minha vida: familiar, emocional, profissional, espiritual,

    intelectual, social.

    E por último, mas não menos importante quero agradecer à banca por ter aceitado

    o convite de me avaliar. Sou muito grata por poder aprender e crescer com vocês!!

  • 7

    SUMÁRIO

    LISTA DE FIGURAS

    LISTA DE TABELAS

    RESUMO

    ABSTRACT

    10

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    14

    15

    1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 16

    2 OBJETIVOS ........................................................................................ 18

    2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 18

    2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................. 18

    3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................... 19

    3.1 CANA DE AÇÚCAR NO BRASIL E NO MUNDO ............................. 19

    3.2 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DA CANA-DE-AÇÚCAR ........ 21

    3.3 VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR ........................................... 21

    3.4 PRODUÇÃO DE ETANOL NO BRASIL ............................................. 23

    3.5 LIGNOCELULOSE .............................................................................. 24

    3.5.1 Celulose ................................................................................................ 26

    3.5.2 Hemicelulose ........................................................................................ 27

    3.5.3 Lignina .................................................................................................. 29

    3.6 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA LIGNOCELULÓSICA .................... 29

    3.7 CARBOHYDRATE-ACTIVE ENZYME (CAZY) ................................... 31

    3.8 EXPANSINAS ...................................................................................... 32

    3.8.1 β-expansinas (EXPB) ........................................................................... 35

    3.9 SINERGISMO ...................................................................................... 36

    3.10 EXPRESSÃO HETERÓLOGA EM Pichia pastoris........................... 38

    4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 41

    4.1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE expb11................................................... 41

    4.2 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL DE CANA-DE-AÇÚCAR ................. 41

    4