Charakterisierung von Osteoprotegerin (OPG) und Wirkung von TSH auf die Expression von RANKL und OPG...

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  • Aus der Klinik fr Innere Medizin

    Schwerpunkt Gastroenterologie und Endokrinologie

    Direktor: Prof. Dr. R. Arnold

    des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universitt Marburg

    und des Universittsklinikums Gieen und Marburg

    Standort Marburg

    Charakterisierung von Osteoprotegerin (OPG) und

    Receptor Activator of NFB-Ligand (RANKL) in der

    Schilddrse

    Inaugural-Disseration zur Erlangung

    des Doktorgrades der gesamten Medizin

    dem Fachbereich Medizin

    der Philipps-Universitt Marburg

    vorgelegt von

    Sibylle Kluger aus Marburg

    Marburg 2005

  • Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin

    der Philipps-Universitt Marburg

    am 08.12.2005

    gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs

    Dekan: Prof. Dr. B. Maisch

    Referent: PD Dr. L. C. Hofbauer

    Koreferent: Prof. Dr. P. Barth

  • Meinen Eltern

  • Inhaltsverzeichnis

    1

    Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1

    1. Einleitung 3

    1.1 Anatomie und Physiologie der Schilddrse 3

    1.2 Die chronisch-lymphozytre Thyreoiditis vom Typ Hashimoto 4

    1.3 Die Immunthyreopathie vom Typ Morbus Basedow 5

    1.4 Mitglieder der TNF-Liganden und-Rezeptorenfamilie und ihre Funktionen 6

    1.5 Regulation der Apoptose durch TNF-Mitgliegder 6

    1.6 RANKL, RANK-Rezeptor und OPG 7

    1.7 Osteoprotegerin (OPG) 8

    1.8 Receptor activator of nuclear factorB ligand (RANKL) 8

    1.9 Receptor activator of nuclear factorB (RANK) 9

    1.10 Dendritische Zellen und ihre Rolle im Immunsystem 9

    2. Fragestellung 11

    3. Material und Methoden 12

    3.1 Materialien 12

    3.1.1 Prparate 12

    3.1.2 Arbeitsmaterialien 12

    3.1.3 Puffer und Standardlsungen 14

    3.2 Zellkultur 14

    3.3 RNA-und Poly-A-mRNA-Isolierung aus Zellen 15

    3.4 RNA-Isolierung aus Schilddrsengewebe 16

    3.5 Gelelektrophorese und Northern-Blot 17

    3.6 Radioaktive Markierung der cDNA (Random Priming) 18

    3.7 Hybridisierung 19

    3.8 Dehybridisierung 20

    3.9 OPG-ELISA 21

    3.10 Isolierung und Kultivierung von dendritischen Zellen 21

    3.11 Berechnung der Proteinwerte und Statistische Auswertung 22

  • Inhaltsverzeichnis

    2

    4. Ergebnisse 23

    4.1 Expression von OPG-und RANKL-mRNA in verschiedenen endokrinen

    und nicht endokrinen Geweben 23

    4.2 Analyse der OPG-mRNA-Expression und OPG-Proteinsekretion in humanen

    Schilddrsenkarzinomzellen (XTC) 26

    4.3 Modulation der RANKL-Genexpression in XTC-Zellen 32

    4.4 OPG-Proteinsekretion in primren Schilddrsenzellen 33

    4.5 OPG-mRNA-Expression in humanen Schilddrsenresektaten 34

    4.6 Biologische Wirkung von OPG auf dendritische Zellen 35

    5. Diskussion 38

    5.1 Intra-und extraskeletale Expression von RANKL und OPG 38

    5.2 Wirkung von proinflammatorischen und immunmodulatorischen Zytokinen

    auf das OPG-RANKL-System 40

    5.3 Wirkung von TSH auf die Expression von RANKL und OPG 43

    5.4 Regulation von RANKL und OPG durch andere Faktoren 44

    5.5 OPG-mRNA-Expression in Schilddrsen-Prparaten von Patienten mit

    Schilddrsenerkrankungen 45

    5.6 Dendritische Zellen als Zielzellen fr das RANKL-OPG-System 47

    6. Zusammenfassung 50

    7. Literaturverzeichnis 52

    8. Abkrzungsverzeichnis 66

    9. Anhang 67

    9.1 Danksagung 67

    9.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer 68

  • Einleitung

    3

    1. Einleitung

    1.1 Anatomie und Physiologie der Schilddrse

    Die Schilddrse beeinflusst die Stoffwechselaktivitt zahlreicher Organe und Gewebe. Sie ist

    als schmetterlingsfrmiges Organ, bestehend aus zwei Lappen und einem Isthmus, am

    Schildknorpel des Kehlkopfes angeheftet. Das Schilddrsengewebe besteht aus Follikeln,

    funktionelle Einheiten aus Thyreozyten, die von einschichtigem kubischen Follikelepithel

    ausgekleidet sind. Im Lumen der Schilddrsenfollikel befindet sich das Kolloid, welches im

    Wesentlichen aus Thyreoglobulin besteht. Zwischen den Basalmembranen der Follikel liegen

    die calcitoninbildenden C-Zellen. Zentrale Aufgabe der Schilddrse ist die Synthese und

    Sekretion der Hormone L-3,5,3`-Trijodthyronin (T3) und L-3,5,3`,5`-Tetrajodthyronin

    (Thyroxin/T4). Beide werden aus der Aminosure Thyrosin durch Anlagerung von

    elementarem Jod gebildet. Durch die Schilddrsenhormone kommt es zu einer Steigerung der

    Glukoneogenese, der Glykogensynthese und der Glykogenolyse. Besonders fr die normale

    Skelettreifung sind T3 und T4 unerlsslich. So kann eine Hypothyreose im Kindesalter zum

    Minderwuchs, eine Hyperthyreose hingegen zum Gigantismus fhren. Die besondere

    Bedeutung fr die Entwicklung des ZNS zeigt sich im Bild des Kretinismus, bei dem es durch

    Schilddrsenhormonmangel in der Fetalzeit zu Minderwuchs und geistiger Retardierung

    kommt. Die Synthese und Sekretion der Schilddrsenhormone unterliegen dem

    hypothalamisch-hypophysren Regelkreis, im Besonderen dem stimulierenden Einfluss des

    im Hypophysenvorderlappen produzierten Thyroidea-stimulierendem Hormon oder

    Thyrotropin (TSH), welches wiederum als Antwort auf die Sekretion des Thyrotropin-

    releasing hormone (TRH) durch den Hypothalamus beeinflusst wird. Dadurch, dass die freien

    Schilddrsenhormone fT3 und fT4 im Serum einen hemmenden Einfluss auf die Sekretion von

    TSH haben, wird dieses System zu einem Regelkreis mit positivem und negativem Feedback-

    Mechanismus. In der Pathogenese autoimmuner Schilddrsenerkrankungen wie des Morbus

    Basedow und der Hashimoto-Thyreoiditis spielen pro- und anti-apoptotische Prozesse, eine

    gesteigerte Aktivitt intrathyroidaler dendritischer Zellen und proinflammatorische Zytokine,

    in erster Linie die Mitglieder der TNF-Liganden und-Rezeptorenfamilie eine wichtige Rolle

    (Palazzo et al., 2000; Yamazaki et al., 2000; Bretz et al., 1999).

  • Einleitung

    4

    1.2 Die chronisch-lymphozytre Thyreoiditis vom Typ Hashimoto

    Die lymphozytre Thyreoiditis oder Hashimoto-Thyreoiditis gehrt zusammen mit der

    Immunthyreopathie vom Typ Morbus Basedow zum Formenkreis der

    Autoimmunerkrankungen der Schilddrse. Das histologische Bild der Hashimoto-Thyreoiditis

    zeichnet sich durch eine ausgeprgte lymphozytre und plasmazellulre Infiltration aus. Nach

    einer diffusen meist schmerzlosen Vergrerung in der Anfangsphase kommt es im Verlauf

    der Thyreoiditis zu einer fortschreitenden Zerstrung des Schilddrsengewebes mit

    Funktionseinbuen bis hin zur manifesten Hypothyreose. Charakteristisch sind die hohen

    Titer schilddrsenspezifischer Autoantikrper gegen die thyreoidale Peroxidase (TPO-AK)

    sowie gegen Thyreoglobulin (Tg-AK), welche im Verlauf der Erkrankung abfallen knnen. In

    seltenen Fllen sind auch Antikrper gegen TSH-Rezeptoren (TSH-R-AK) beschrieben

    worden. Die Hashimoto-Thyreoiditis ist die hufigste Form der Thyreoiditis und kann mit

    anderen endokrinen und nicht endokrinen Autoimmunerkrankungen wie einem Typ 1

    Diabetes mellitus, einem Hypogonadismus, einer Sprue, einer pernizisen Anmie, einer

    Nebenniereninsuffizienz, einer Vitiligo oder einer Myasthenia gravis assoziiert sein.

    Abb. 1: Mikroskopisches Bild einer Schilddrse mit Hashimoto-Thyreoiditis.

    Die lymphozytre Infiltration mit Bildung eines Lymphfollikels ist deutlich im rechten

    Zentrum zu erkennen.

  • Einleitung

    5

    1.3 Die Immunthyreopathie vom Typ Morbus Basedow

    Die Immunhyperthyreose vom Typ Morbus Basedow (im angelschsischen Graves Disease

    genannt) kann sich sowohl thyreoidal als auch extrathyreoidal manifestieren. Extrathyreoidale

    Manifestationen sind die endokrine Orbitopathie, das prtibiale Myxdem oder eine

    Akropathie. Thyreoidale Manifestationen sind die Struma diffusa und die Hyperthyreose. Wie

    auch bei der Hashimoto-Thyreoiditis findet sich im histologischen Bild des Morbus Basedow

    eine ausgeprgte lymphozytre Infiltration. Grundlage der Immunhyperthyreose sind

    Autoantikrper gegen den TSH-Rezeptor (TSH-R-AK). Diese Autoantikrper binden an den

    TSH-Rezeptor der Schilddrsenzellen und aktivieren diesen (Rapoport et al., 1999). Neben

    den TSH-R-AK finden sich beim Morbus Basedow auch Antikrper gegen die

    Schilddrsenperoxidase (TPO-AK) und in seltenen Fllen gegen das Thyreoglobulin (Tg-

    AK). Das klinische Bild des Morbus Basedow ist klassischerweise durch eine Hyperthyreose

    sowie die sog. Merseburger Trias mit ihren Symptomen Tachykardie, Exophthalmus und

    Struma charakterisiert.

    Abb. 2: Klinisches Bild eines Patienten mit Morbus Basedow:

    Symmetrische Struma diffusa und Exophthalmus.

  • Einleitung

    6

    1.4 Mitglieder der TNF-Liganden und-Rezeptorenfamilie und ihre Funktionen

    Die Mitglieder der TNF-Liganden (TNF) und-Rezeptoren (TNFR) Superfamilie regulieren

    das berleben und die Apoptose in verschiedenen endokrinen und nicht-endokrinen Zellen

    (Smith et al., 1994). Zu den TNF-Liganden zhlen RANKL, FasL, TRAIL, CD40L und

    CD30L (Wong et al., 1997). Als Typ 2-Membranproteine wirken sie entweder als gebundene

    Membranproteine oder als lsliche Proteine. RANKL spielt als Mitglied dieser Familie eine

    entscheidende Rolle in der Regulation des Immunsystems und der Knochenentwicklung.

    Indem es von aktivierten T-Zellen prsentiert wird und dendritische Zellen aktiviert, scheint

    RANKL die Interaktion zwischen T-Zellen und dendritischen Zellen whrend der

    Immunantwort zu beeinflussen. Dies geschieht ber den RAN