Clostridioides difficile 630Δerm in silico

und in vivo: Reannotation und quantitative

metabolische Modellierung

Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

der Technischen Universität Carolo Wilhelmina zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

genehmigte

D i s s e r t a t i o n

von Henning Dannheim aus Braunschweig

1. Referent: Professor Dr. Dietmar Schomburg 2. Referent: Professor Dr. Karsten Hiller eingereicht am: 29.03.2017 mündliche Prüfung (Disputation) am: 12.06.17

Druckjahr 2017

Vorveröffentlichungen der Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebens-

wissenschaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab

veröffentlicht:

Publikationen

Henning Dannheim, Thomas Riedel, Meina Neumann-Schaal, Boyke Bunk, Isabel

Schober, Cathrin Spröer, Cynthia Maria Chibani, Sabine Gronow, Heiko Liesegang,

Jörg Overmann, Dietmar Schomburg. „Manual curation and reannotation of the

genomes of Clostridium difficile 630Δerm and Clostridium difficile 630“. Journal of

Medical Microbiology 66.3 (2017), 286-293.

Henning Dannheim, Sabine Eva Will, Dietmar Schomburg, Meina Neumann-

Schaal. „Clostridioides difficile 630Δerm in silico and in vivo - quantitative growth

and extensive polysaccharide secretion“. FEBS OpenBio 7.4 (2017), 602-615.

Thomas Riedel, Daniela Wetzel, Julia Danielle Hofmann, Simon Paul Erich Ot-

to Plorin, Henning Dannheim, Mareike Berges, Ortrud Zimmermann, Boyke

Bunk, Isabel Schober, Cathrin Spröer, Heiko Liesegang, Dieter Jahn, Jörg Overmann,

Uwe Groß, Meina Neumann-Schaal. „High metabolic versatility of different toxigenic

and non-toxigenic Clostridioides difficile isolates.“ International Journal of Medical

Microbiology (2017), doi:10.1016/j.ijmm.2017.05.007.

I

Tagungsbeiträge

Henning Dannheim, Meina Neumann-Schaal, Dietmar Schomburg. „Metabolic

modeling gives new insightsinto the metabolism of Clostridium difficile“ (Poster).

6th European Conference on Prokaryotic and Fungal Genomics (2015); Göttingen

Marcus Ulbrich, Henning Dannheim, Birte Fredrich, Helge Stark, Dietmar Schom-

burg. „Metabolic Models: To Understand and Redesign Cellular Wiring and Trade

Flows“ (Poster). BRICS Opening Symposium (2016); Braunschweig

III

Abstract

Clostridioides difficile causes antibiotic-associated infections of the colon with symp-

toms ranging from diarrhea to pseudomembranous colitis and sepsis. The virulence

is mainly associated with the toxins, whose productions are tightly connected to

the metabolism. Thus a contemporary high quality genome annotation as well a

metabolic model are an important basis for the comprehension of the organism.

In this work, the genomes of the strains 630 and 630Δerm were manually reannotated.

Therefore, either gene names, gene product names or assigned EC numbers for 57%

of the genes were modified. In addition, completely new gene functions were proposed

based on genomic analysis. The annotation of strain 630Δerm was used for the

construction of the genome-scale metabolic model iHD992. Combined bioinformatical

analyses and laboratory experiment led to the discovery of a previously unknown exo-

polysaccharide, whose structure and biosynthesis pathway could be postulated. Using

dynamic flux balance analysis and including the production of the exopolysaccharide,

quantitative and time-resolved simulations of growth and product formation were

possible. In minimal medium, the polysaccharide secretion and growth are coupled,

suggesting a connection to capsule and biofilm formation. Based on the production of

organic acids in silico and in vivo, the importance of the Wood-Ljungdahl pathway,

the propanoate fermentation pathway and the stoichiometry of the ATP-synthases

are discussed.

iHD992 is the first model, which is capable to simulate quantitative growth and can

therefore be used for the simulation of in situ behavior. The results of this work

extend the comprehension of the organism, supporting projects in systems biology as

well as the whole research on C. difficile and make new research projects possible.

IV

Kurzfassung

Clostridioides difficile verursacht Antibiotika-assoziierte Infektionen des Dickdarms,

deren Symptome von Durchfall bis zu pseudomembranöser Kolitis und Sepsis reichen.

Da die Virulenz hauptsächlich auf den Toxinen beruht, deren Produktion eng an den

Metabolismus gekoppelt ist, stellen eine aktuelle und hochwertige Genomannotation

sowie ein metabolischen Modell eine wichtige Grundlage für ein besseres Verständnis

des Organismus dar.

Das Genom der Stämme 630 und 630Δerm wurde im Zuge dieser Arbeit manuell

reannotiert, wobei bei 57% der Gene Genname, Produktname oder EC-Nummer

geändert wurden. Außerdem wurden, basierend auf genomischen Analysen, voll-

ständig neue Genfunktionen vorgeschlagen. Die Annotation des Stammes 630Δerm

wurde für die Erstellung des genomweiten metabolischen Modells iHD992 verwen-

det. Bioinformatische Analysen in Kombination mit Laborexperimenten führten

zur Entdeckung eines zuvor unbekannten Exopolysaccharids, dessen Struktur und

Biosyntheseweg postuliert werden konnte. Unter Einbeziehung der Exopolysaccharid-

Produktion konnten mittels dynamischer Flussbilanzanalyse quantitative und zeitauf-

gelöste Simulationen des Wachstums und der Produktbildung durchgeführt werden.

In Minimalmedium sind Wachstum und Sekretion des Polysaccharids gekoppelt.

Dies legt eine Verbindung zur Kapsel- und Biofilmbildung nahe. Basierend auf der

Produktion von organischen Säuren in silico und in vivo werden die Bedeutung des

Wood-Ljungdahl-Wegs, der Fermentationsweg zu Propanoat und die Stöchiometrie

der ATP-Synthasen diskutiert.

iHD992 ist das erste Modell, das quantitative Simulationen von Clostridioides difficile

erlaubt und somit für in situ-Simulationen verwendet werden kann. Die Ergebnisse

dieser Arbeit erweitern das Verständnis des Organismus, wodurch systembiologische

Projekte aber auch die gesamte Forschung an C. difficile profitieren und neue

Forschungsansätze möglich werden.

V

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Stamm 630 und seine Derivate . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1.2 Die Sporen von Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1.3 Die Toxine von Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Der Metabolismus von Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2.1 Der Rnf-Komplex und Elektronen-Bifurkation . . . . . . . . . 5

1.2.2 Stickland-Reaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.3 Wood-Ljungdahl-Weg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.2.4 Fermentation zu Butanoat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.3 Genomannotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4 Metabolische Modellierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.4.1 Flussbilanzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4.2 Flussvarianzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4.3 Dynamische Flussbilanzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.5 Motivation und Ziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2 Material und Methoden 18

2.1 Vorhersage von Genfunktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.2 Reannotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3 Modellerstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.4 Zusammensetzung der Biomasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.5 Energiebedarf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.6 Datenanalyse für metabolische Modellierung . . . . . . . . . . . . . . 24

2.7 (Zeitaufgelöste) Simulation des Metabolismus . . . . . . . . . . . . . 25

VII

Inhaltsverzeichnis

3 Ergebnisse und Diskussion 27

3.1 Reannotation von Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.1.1 Der unvollständige Tricarbonsäurezyklus . . . . . . . . . . . . 28

3.1.2 Carboxylierung von 5-Aminophosphoribosylimidazol . . . . . . 30

3.1.3 Lactatmetabolismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.1.4 Abbau von 4-Hydroxyprolin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.1.5 Abbau von Histidin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.1.6 Essenzielle Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.1.7 Vitamin B12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1.8 Detoxifikation reaktiver Sauerstoffspezies . . . . . . . . . . . . 40

3.1.9 Purinabbau in Clostridioides difficile . . . . . . . . . . . . . . 41

3.1.10 Gallensäurenmetabolismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.2 Modellierung von