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  • Charakterisierung von KCNQ-Kaliumkanälen und ihren β-Untereinheiten

    Vom Fachbereich Biologie der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg

    zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften angenommene Dissertation

    vorgelegt von

    Karin Dedek geboren am 18.08.1972

    in Hemer

    http://docserver.bis.uni-oldenburg.de/publikationen/dissertation/2003/dedcha03/dedcha03.html

  • Referent: apl. Prof. Dr. Josef Ammermüller Koreferent: Prof. Dr. Dr. Thomas J. Jentsch Tag der Disputation: 25. März 2003

  • Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung 1 1.1 Zellul̈are Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Ionentransport und Membranpotential . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.3 Ionenkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.4 Spannungsabhängige Ionenkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.5 Spannungsabhängige Kationenkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.6 Die Familie der Kv-Kanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

    1.6.1 Diversität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.6.2 Struktur und Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    1.7 EAG-̈ahnliche Kanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.8 KCNQ-Kanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

    1.8.1 Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.8.2 Diversität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.8.3 KCNQ1 und seine β-Untereinheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.8.4 KCNQ2 und KCNQ3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.8.5 KCNQ4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.8.6 KCNQ5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

    1.9 Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

    2 Material und Methoden 21 2.1 Chemikalien und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.2 Filme und bildgebende Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3 Puffer, Lösungen und Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.4 Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.5 Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.6 Eukaryontische Kulturzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.7 DNA- und RNA-Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

    2.7.1 Restriktion von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Isolierung von DNA aus Agarosegelen 25 2.7.3 Ligation von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.7.4 Transformation von Bakterien durch Elektroporation . . . . . . . . . 25 2.7.5 Isolation von DNA aus Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

    iii

  • Inhaltsverzeichnis

    2.7.6 Sequenzierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.7.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.7.8 Einführung von Punktmutationen in cDNA durch rekombinante PCR 27 2.7.9 Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden . . . . . . . . . . . . . 28 2.7.10 Isolierung von Total-RNA aus Gewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.7.11 Northern Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.7.12 Herstellung von cRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.7.13 Herstellung radioaktiv-markierter RNA-Sonden . . . . . . . . . . . . . 30 2.7.14 Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden . . . . . . . . . . . . 30 2.7.15 In situ Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden . . . . . . . . 30

    2.8 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.8.1 Transiente Transfektion von Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.8.2 Herstellung eines Zelllysats aus HEK293-Zellen . . . . . . . . . . . . . 31

    2.9 Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.9.1 Oberflächenbiotinylierung von Xenopus laevis Oozyten . . . . . . . . . 31 2.9.2 Affinitätsreinigung von Antikörpern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.9.3 Diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und

    Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 2.9.4 Immunfluoreszenz an Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.9.5 Immunfluoreszenz an Gewebeschnitten . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

    2.10 Elektrophysiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.10.1 Präparation und cRNA-Injektion von Xenopus laevis Oozyten . . . . . 33 2.10.2 Zwei-Elektroden Voltage clamp von Xenopus laevis Oozyten . . . . . . . 34 2.10.3 Patch clamp Messungen an transfizierten HEK293-Zellen . . . . . . . . 34 2.10.4 Präparation der Maus-Cochlea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.10.5 Patch clamp Messungen an äußeren und inneren Haarzellen in der

    Maus-Cochlea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

    3 Ergebnisse 37 3.1 KCNQ1 und seine β-Untereinheiten im Gastrointestinaltrakt . . . . . . . . . . 37

    3.1.1 Expression von KCNQ1, KCNE2 und KCNE3 . . . . . . . . . . . . . 37 3.1.2 Zellul̈are und subzellul̈are Lokalisation von KCNQ1 und KCNE3 im

    Darm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.1.3 Zellul̈are und subzellul̈are Lokalisation von KCNQ1 und KCNE2 im

    Magen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.1.4 Elektrophysiologische Eigenschaften von heteromeren Kaliumkanälen

    aus KCNQ1 und KCNE2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.2 Untersuchung einer Mutation im Spannungssensor von KCNQ2 . . . . . . . 43

    3.2.1 Klinische Charakterisierung der BFNC/Myokymie-Patienten . . . . . . 44 3.2.2 Genetische Charakterisierung der BFNC/Myokymie-Patienten . . . . . 46 3.2.3 Lokalisation von KCNQ2 und KCNQ3 im Rückenmark . . . . . . . . 46

    iv

  • Inhaltsverzeichnis

    3.2.4 Elektrophysiologische Analyse der R207W-Mutation in KCNQ2 . . . 48 3.2.5 Oberflächenexpression der R207W-Mutation in KCNQ2 . . . . . . . . 54 3.2.6 Effekt der S4-Mutation auf die Offenwahrscheinlichkeit anderer KCNQ-

    Kanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 3.3 Analyse von Mausmodellen für DFNA2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

    3.3.1 Erscheinungsbild und Hörvermögen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 3.3.2 Expression von KCNQ4 im Cortischen Organ . . . . . . . . . . . . . 60 3.3.3 Das Ruhemembranpotential in den äußeren Haarzellen der Cochlea . 60 3.3.4 Ströme in den äußeren Haarzellen der Cochlea . . . . . . . . . . . . . 62 3.3.5 Das Ruhemembranpotential in den inneren Haarzellen der Cochlea . 69 3.3.6 Ströme in den inneren Haarzellen der Cochlea . . . . . . . . . . . . . 71

    3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

    4 Diskussion 75 4.1 KCNQ1 und seine β-Untereinheiten im Gastrointestinaltrakt . . . . . . . . . . 75

    4.1.1 KCNQ1 und KCNE3 vermitteln den basolateralen cAMP-abhängigen Kaliumstrom in Kryptzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

    4.1.2 KCNQ1 und KCNE2 lokalisieren in einem Subtyp von Magendrüsen- zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

    4.1.3 KCNE2 moduliert den Strom von KCNQ1 . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.1.4 KCNQ1/KCNE2-Heteromere sind möglicherweise an der Magensäure-

    Sekretion beteiligt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.1.5 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

    4.2 Analyse einer Mutation im Spannungssensor von KCNQ2 . . . . . . . . . . . 80 4.2.1 Myokymie und BFNC werden durch eine Mutation im Spannungs-

    sensor von KCNQ2 verursacht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.2.2 Die Myokymie entsteht vermutlich durch die Übererregbarkeit der un-

    teren Motoneurone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 4.2.3 Die R207W-Mutation in KCNQ2 hat einen dominant-negativen Ef-

    fekt auf KCNQ2-Ströme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.2.4 BFNC und Implikationen für eine genotypspezifische Therapie . . . . 85 4.2.5 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

    4.3 Analyse von Mausmodellen für die progrediente Ertaubung DFNA2 . . . . . . 86 4.3.1 KCNQ4 vermittelt den IK,n -Strom äußerer Haarzellen . . . . . . . . . 88 4.3.2 Die Rolle von KCNQ4 in den inneren Haarzellen . . . . . . . . . . . 91 4.3.3 Die Pathophysiologie von DFNA2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 4.3.4 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

    5 Zusammenfassung 99

    6 Kollaborationen 103

    v

  • Inhaltsverzeichnis

    7 Veröffentlichungen 105

    vi

  • Abbildungsverzeichnis

    1.1 α-Untereinheiten spannungsabhängiger Kaliumkanäle. . . . . . . . . . . . . . 6 1.2 Dendrogramm der KCNQ- und der KCNE-Familie. . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.3 Kalium-Recycling in der Scala media des Innenohrs. . . . . . . . . . . . . . . . 16

    2.1 Schematische Darstellung der gerichteten in vitro Mu