Carlos Eduardo Cardoso Fedeli

Expresso de um gene codificador de cistena proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e

avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino

Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

So Paulo 2007

Carlos Eduardo Cardoso Fedeli

Expresso de um gene codificador de cistena proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e

avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino

Orientadora: Profa. Dra. Clara Lcia Barbiri Mestriner

Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

So Paulo 2007

Fedeli, Carlos Eduardo Cardoso Expresso de um gene codificador de cistena

proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino/Carlos Eduardo Cardoso Fedeli. -- So Paulo, 2007.

xv, 71f.

Tese (Mestrado) Universidade Federal de So Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Ps-Graduao em Microbiologia e Imunologia.

Ttulo em ingls: Expression in bacteria of a gene

encoding a cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and evaluation of the immune responses induced by the recombinant protein in a murine model.

1. Leishmania (L.) amazonensis. 2. leishmaniose cutnea.

3. cistena proteinase. 4. resposta imune.

Trabalho realizado na Disciplina de Parasitologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, com auxlios financeiros concedidos pela Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP).

Agradecimentos

minha orientadora Profa. Dra. Clara Lcia Barbiri Mestriner pelo apoio,

dedicao, pacincia e por ter aberto um novo mundo para mim. Agradeo tambm

por transmitir seu conhecimento tornando-me um profissional melhor.

Profa. Dra. Ieda Maria Longo Maugri, Juliana S. Mussalem e Carla

Cristina Squaiella pela ajuda imprescindvel nos experimentos de citometria de fluxo.

Profa. Dra. Mrcia Regina Machado dos Santos e Luciana Girotto Gentil

pelo auxlio nos experimentos de subclonagem e expresso do gene Lacys24.

Aos amigos do laboratrio rico, Josie, Paulo, Simone e Suzana que sempre

me ajudaram na realizao desse trabalho. Agradeo pelo apoio, confiana e pelas

risadas que demos juntos.

Aos meus pais Marcelo e Lgia que sempre fizeram de tudo para que eu e

meus irmos nos tornssemos acima de tudo pessoas de bem e por sempre nos

terem incentivado ao estudo.

Aos meus queridos irmos Marcelo, Cludia, Teresa, Lus e Ceclia que

sempre me ajudaram e me aconselharam nos momentos mais difceis de minha

vida.

Aos meus sobrinhos Bruna, Mateo, Marcela, Alexandre, Felipe, Gabriel e

Teresa.

Ao meu av Carlos. Aos meus avs Guilhermo, Maria e Tsca, in memorian.

Aos meus tios, Otvio, Carlito, Teresa, Vera, Maringela, e Lus.

A todos os meus primos.

Aos meus cunhados Maurcio, Shirlei e Paulinha que se tornaram meus

irmos tambm.

Aos Professores da Disciplina de Parasitologia da Universidade Federal de

So Paulo, Dra. Nobuko Yoshida, Dr. Renato Arruda Mortara, Dr. Jos Franco da

Silveira, Dr. Maurcio Martins Rodrigues e Dr. Michel P. Rabinovitch.

A todos os amigos da Disciplina de Parasitologia Fernando, Ketna, Kendi,

Solange, Miriam, Cludio, Ceclia, Emanuelle, Vanessa, Mauro, Daniele, Charles,

Silene, Renata Baida, Renata Torres, Luciana, Esteban, Roberto, Fbio, Marjorie,

Fanny, Adilson, Sandrinha, Cidinha, Dona Ftima, Mrcia e Regiane.

Aos meus irmos de escolha Joo, Bruno, Sandro, Alexandre, Andrey,

Juliana, Tita e Rogrio, que sempre fizeram parte da minha vida.

Aos meus amigos Mnica, Joo e Thays por terem me deixado escrever estes

agradecimentos em horrio de servio.

minha sogra Vera e ao meu cunhado Maurcio.

Aos animais de laboratrio que contribuem para o desenvolvimento da

pesquisa.

CAPES pelo apoio financeiro para a realizao desse estudo.

Para encerrar agradeo especialmente a Deus, minha esposa Renata e ao

meu filho Pedro.

Abreviaturas

ACF Adjuvante completo de Freund

AcMo Anticorpo monoclonal

AM Amastigota

CM Controle: clulas + meio

DAB Diaminobenzidina

DMSO Dimetilsulfxido

DNA cido desoxirribonuclico

DO Densidade ptica

EDTA cido etileno diamino tetractico

ELISA Ensaio imunoenzimtico

g Grama

g Acelerao da gravidade (9,8 m/s2)

h Hora

IFN- Interferon-gama

IL-4 Interleucina-4

IL-10 Interleucina-10

IPTG Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo

kDa Kilodalton

l Litro

LB Luria Bertani

LBamp LB contendo ampicilina 100g/mL

LPS Lipopolissacardeo

min Minuto

M Molar

mA Miliamper

mg Miligrama

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

ml Mililitro

mM Milimolar

mV Minivolt

ng Nanograma

OPD O-fenilenodiamina

P. acnes Propionibacterium acnes

PAGE-SDS Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

PBS Salina em tampo fosfato 10 mM, pH 7,2

PCR Reao da polimerase em cadeia

rpm Rotaes por minuto

RNA cido ribonuclico

SDS Dodecil sulfato de sdio

seg Segundo

TEMED N, N, N, N - tetrametilenodiamina

Th1 Linfcito T helper 1

Th2 Linfcito T helper 2

TNF- Fator de necrose tumoral-alfa

Tris Tris [hidroximetilaminometano]

U Unidade

UV Luz ultravioleta

v Volume

V Volt

g Micrograma

l Microlitro

M Micromolar

Sumrio

Resumo.................................................................................................................. 001 Abstract...................................................................................................................004 Introduo...............................................................................................................007 1. Aspectos gerais....................................................................................................008

2. Respostas imunes nas leishmanioses.................................................................010

3. Respostas imunes L. (L.) amazonensis em modelo murino..............................012

4. Antgenos protetores nas leishmanioses..............................................................014

5. Cistena proteinases de Leishmania....................................................................016

Objetivos.................................................................................................................020 Materiais e Mtodos...............................................................................................022 1. Obteno de formas amastigotas de L. (L.) amazonensis...................................023

2. Animais de experimentao.................................................................................023

3. Extrao de cidos nuclicos...............................................................................024

4. Amplificao da regio codificadora do clone Lacys24 de L. (L.) amazonensis por

PCR..........................................................................................................................024

5. Bactrias e plasmdios.........................................................................................025

5.1. Bactrias.................................................................................................025

5.2. Plasmdios..............................................................................................026

6. Clonagem gene Lacys24 no vetor Topo 2.1 e subclonagem no vetor de expresso

pHIS..........................................................................................................................026

6.1. Preparao das bactrias competentes.................................................027

6.2. Transformao das bactrias competentes com o DNA plasmidial.......027

6.3. Purificao do DNA plasmidial................................................................027

7. Seqenciamento dos clones recombinantes Topo 2.1/Lacys24......................... 028

7.1. Preparao do gel para o sistema ABI/Prisma 377................................029

8. Expresso e purificao da protena recombinante 029

8.1. Anlise de protenas por eletroforese em gel de poliacrilamida

com SDS (PAGE-SDS)............................................................................030

9. Reatividade da protena recombinante com anticorpos anti-cistena proteinase.030

9.1. Produo de anticorpos policlonais anti-rLacys24.................................030

9.2. ELISA..........................................................................................