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Carlos Eduardo Cardoso Fedeli
Expresso de um gene codificador de cistena proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e
avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino
Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo 2007
Carlos Eduardo Cardoso Fedeli
Expresso de um gene codificador de cistena proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e
avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino
Orientadora: Profa. Dra. Clara Lcia Barbiri Mestriner
Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo 2007
Fedeli, Carlos Eduardo Cardoso Expresso de um gene codificador de cistena
proteinase de Leishmania (Leishmania) amazonensis em sistema bacteriano e avaliao das respostas imunes induzidas pela protena recombinante em modelo murino/Carlos Eduardo Cardoso Fedeli. -- So Paulo, 2007.
xv, 71f.
Tese (Mestrado) Universidade Federal de So Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Ps-Graduao em Microbiologia e Imunologia.
Ttulo em ingls: Expression in bacteria of a gene
encoding a cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and evaluation of the immune responses induced by the recombinant protein in a murine model.
1. Leishmania (L.) amazonensis. 2. leishmaniose cutnea.
3. cistena proteinase. 4. resposta imune.
Trabalho realizado na Disciplina de Parasitologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, com auxlios financeiros concedidos pela Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP).
Agradecimentos
minha orientadora Profa. Dra. Clara Lcia Barbiri Mestriner pelo apoio,
dedicao, pacincia e por ter aberto um novo mundo para mim. Agradeo tambm
por transmitir seu conhecimento tornando-me um profissional melhor.
Profa. Dra. Ieda Maria Longo Maugri, Juliana S. Mussalem e Carla
Cristina Squaiella pela ajuda imprescindvel nos experimentos de citometria de fluxo.
Profa. Dra. Mrcia Regina Machado dos Santos e Luciana Girotto Gentil
pelo auxlio nos experimentos de subclonagem e expresso do gene Lacys24.
Aos amigos do laboratrio rico, Josie, Paulo, Simone e Suzana que sempre
me ajudaram na realizao desse trabalho. Agradeo pelo apoio, confiana e pelas
risadas que demos juntos.
Aos meus pais Marcelo e Lgia que sempre fizeram de tudo para que eu e
meus irmos nos tornssemos acima de tudo pessoas de bem e por sempre nos
terem incentivado ao estudo.
Aos meus queridos irmos Marcelo, Cludia, Teresa, Lus e Ceclia que
sempre me ajudaram e me aconselharam nos momentos mais difceis de minha
vida.
Aos meus sobrinhos Bruna, Mateo, Marcela, Alexandre, Felipe, Gabriel e
Teresa.
Ao meu av Carlos. Aos meus avs Guilhermo, Maria e Tsca, in memorian.
Aos meus tios, Otvio, Carlito, Teresa, Vera, Maringela, e Lus.
A todos os meus primos.
Aos meus cunhados Maurcio, Shirlei e Paulinha que se tornaram meus
irmos tambm.
Aos Professores da Disciplina de Parasitologia da Universidade Federal de
So Paulo, Dra. Nobuko Yoshida, Dr. Renato Arruda Mortara, Dr. Jos Franco da
Silveira, Dr. Maurcio Martins Rodrigues e Dr. Michel P. Rabinovitch.
A todos os amigos da Disciplina de Parasitologia Fernando, Ketna, Kendi,
Solange, Miriam, Cludio, Ceclia, Emanuelle, Vanessa, Mauro, Daniele, Charles,
Silene, Renata Baida, Renata Torres, Luciana, Esteban, Roberto, Fbio, Marjorie,
Fanny, Adilson, Sandrinha, Cidinha, Dona Ftima, Mrcia e Regiane.
Aos meus irmos de escolha Joo, Bruno, Sandro, Alexandre, Andrey,
Juliana, Tita e Rogrio, que sempre fizeram parte da minha vida.
Aos meus amigos Mnica, Joo e Thays por terem me deixado escrever estes
agradecimentos em horrio de servio.
minha sogra Vera e ao meu cunhado Maurcio.
Aos animais de laboratrio que contribuem para o desenvolvimento da
pesquisa.
CAPES pelo apoio financeiro para a realizao desse estudo.
Para encerrar agradeo especialmente a Deus, minha esposa Renata e ao
meu filho Pedro.
Abreviaturas
ACF Adjuvante completo de Freund
AcMo Anticorpo monoclonal
AM Amastigota
CM Controle: clulas + meio
DAB Diaminobenzidina
DMSO Dimetilsulfxido
DNA cido desoxirribonuclico
DO Densidade ptica
EDTA cido etileno diamino tetractico
ELISA Ensaio imunoenzimtico
g Grama
g Acelerao da gravidade (9,8 m/s2)
h Hora
IFN- Interferon-gama
IL-4 Interleucina-4
IL-10 Interleucina-10
IPTG Isopropil--D-tiogalactopiranosdeo
kDa Kilodalton
l Litro
LB Luria Bertani
LBamp LB contendo ampicilina 100g/mL
LPS Lipopolissacardeo
min Minuto
M Molar
mA Miliamper
mg Miligrama
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
ml Mililitro
mM Milimolar
mV Minivolt
ng Nanograma
OPD O-fenilenodiamina
P. acnes Propionibacterium acnes
PAGE-SDS Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
PBS Salina em tampo fosfato 10 mM, pH 7,2
PCR Reao da polimerase em cadeia
rpm Rotaes por minuto
RNA cido ribonuclico
SDS Dodecil sulfato de sdio
seg Segundo
TEMED N, N, N, N - tetrametilenodiamina
Th1 Linfcito T helper 1
Th2 Linfcito T helper 2
TNF- Fator de necrose tumoral-alfa
Tris Tris [hidroximetilaminometano]
U Unidade
UV Luz ultravioleta
v Volume
V Volt
g Micrograma
l Microlitro
M Micromolar
Sumrio
Resumo.................................................................................................................. 001 Abstract...................................................................................................................004 Introduo...............................................................................................................007 1. Aspectos gerais....................................................................................................008
2. Respostas imunes nas leishmanioses.................................................................010
3. Respostas imunes L. (L.) amazonensis em modelo murino..............................012
4. Antgenos protetores nas leishmanioses..............................................................014
5. Cistena proteinases de Leishmania....................................................................016
Objetivos.................................................................................................................020 Materiais e Mtodos...............................................................................................022 1. Obteno de formas amastigotas de L. (L.) amazonensis...................................023
2. Animais de experimentao.................................................................................023
3. Extrao de cidos nuclicos...............................................................................024
4. Amplificao da regio codificadora do clone Lacys24 de L. (L.) amazonensis por
PCR..........................................................................................................................024
5. Bactrias e plasmdios.........................................................................................025
5.1. Bactrias.................................................................................................025
5.2. Plasmdios..............................................................................................026
6. Clonagem gene Lacys24 no vetor Topo 2.1 e subclonagem no vetor de expresso
pHIS..........................................................................................................................026
6.1. Preparao das bactrias competentes.................................................027
6.2. Transformao das bactrias competentes com o DNA plasmidial.......027
6.3. Purificao do DNA plasmidial................................................................027
7. Seqenciamento dos clones recombinantes Topo 2.1/Lacys24......................... 028
7.1. Preparao do gel para o sistema ABI/Prisma 377................................029
8. Expresso e purificao da protena recombinante 029
8.1. Anlise de protenas por eletroforese em gel de poliacrilamida
com SDS (PAGE-SDS)............................................................................030
9. Reatividade da protena recombinante com anticorpos anti-cistena proteinase.030
9.1. Produo de anticorpos policlonais anti-rLacys24.................................030
9.2. ELISA..........................................................................................