BIOTEHNOLOGIJA 2

izv. prof. dr. sc. Sunčica Beluhan

ak. god. 2016/17.

ŠKROB I HIDROLIZA ŠKROBNIH

SIROVINA

ŠKROB

ugljikohidrat - polisaharid (opće formule (C6H10O5)n)

izgrađen od jedinica glukoze povezanih α-1,4 i α-1,6 vezama

nastaje kao produkt asimilacije (fotosinteze) u lišću zelenih biljaka

biljke ga skladište kao rezervnu hranu.

u prirodi se javlja u obliku granula (zrnaca)

većina škroba unosi se konzumacijom žitarica (proizvodi na bazi brašna),

voća, povrća i njihovih prerađevina

sladila na bazi škroba (glukozni, fruktozni i dr. sirupi) konditorski proizvodi,

bezalkoholna pića i dr.

4.12.2016. 3

GRAĐA I SVOJSTVA BILJNOG ŠKROBA

- granule ili zrnca, nalaze se u stanicama endosperma (fotosinteza)

- okrugla ili nepravilna, od 1 do 100 m dužine

-sadržavaju sferokristale sastavljene od molekula amiloze i amilopektina

Granule škroba: a) kukuruz; b) voštani kukuruz; c) pšenica; d) krumpir;

e) visokoamilozni kukuruz

Ječam Riža Kukuruzzrnca nepravilna oblika

i različite veličine

krupna i poliedarska

zrnca

sitna zrnca

4.12.2016. 4

ŠKROB

- polimer monosaharida glukoze

- sastoji se od 20 do 30 % dugih ravnolančanih molekula amiloze (u

hladnom reagiraju s jodom – plavo obojenje)

- 70-80 % razgranatih molekula amilopektina (u toploj vodi prelaze u

škrobni lijepak – ljubičasto obojenje)

- strukturno različiti ugljikohidrati - jednaka bruto formula (C6H10O5)n

- amiloza - glukozne jedinice povezane a-1,4 glikozidnom vezom

- Mm od 4 ∙ 103 do 1,5 ∙ 105 (25 do 1000 glukoznih jedinica)

- amilopektin – 3000 glukoznih jedinica – Mm od 107 do 109

-na mjestu grananja a-1,6 glikozidne veze (4-6 %), ogranci

sadržavaju 20-25 glc jedinica

4.12.2016. 5

ŠKROBNO ZRNCE (GRANULA)

molekule amiloze i amilopektina povezane vodikovim vezama

(kompaktna struktura)

jedan dio molekula amilopektina izgrađuju kristalična, a drugi dio

zajedno s amilozom amorfna područja

oblik i veličina razlikuju se s obzirom na botaničko porijeklo škroba

veličina škrobne granule iznosi od 1 do 100 μm

nativni škrobovi nisu topljivi u hladnoj vodi, što omogućava laku

ekstrakciju granula škroba iz biljnog materijala (kukuruz, pšenica,

krumpir, riža, ječam)

škrobna granula, ovisno o porijeklu, sadrži 1-2 % lipida, slobodnih

masnih kiselina, proteina i minerala

Posebne vrste škroba:

- voštani škrobovi (sadrže preko 85 % amilopektina)

- visokoamilozni (sadrže 50 - 80 % amiloze)

4.12.2016. 6

4.12.2016. 7

- različita građa amiloze i amilopektina – kiselinskom i

enzimskom hidrolizom škroba dobivaju se glukoza, maltoza i

dekstrini:

(C6H10O5)n + n H2O → n C6H12O6 (glukoza)

(C6H10O5)n + n/2 H2O → n/2 C12H22O11 (maltoza)

(C6H10O5)n + (n-x) H2O → x (C12H22O11)n/x (dekstrini)

- kiselinskom i toplinskom hidrolizom pretežito se dobivaju

dekstrini (nisko-, srednje- i visokomolekulski)

4.12.2016. 8

AMILOZA

- polimer D-glukoze (n = 25-1000)

- a-1,4 glikozidne veze (C-1 atom povezan sa C-4 atomom druge glukoze)

- sadrži mali udio i bočnih lanaca, vezanih na glavni lanac α-1,6 glikozidnim

vezama.

- topljiva u hladnoj vodi

4.12.2016. 9

STRUKTURA AMILOZE

•a-1,4 glikozidne veze u

amilozi izazivaju

formiranje uzvojnice

(heliksa)

•uzvojnica amiloze formira

kompleks s molekularnim

jodom (jodna proba)

4.12.2016. 10

AMILOPEKTIN - netopljivi dio (frakcija) škroba

- a-1,6 glikozidne veze na mjestu grananja

- najčešće grananje nakon 12-20 glukoznih jedinica

4.12.2016. 11

GRANANJE AMILOPEKTINA

• prikaz orijentacije

molekula amiloze i

amilopektina u škrobnom

zrncu

4.12.2016. 12

RAZGRADNJA ŠKROBA

- 3 uzastopne faze (preklapanje): prevođenje škroba u škrobni lijepak

(klajsterizacija ili želatinacija), smanjenje viskoznosti (likvefakcija) i

ošećerenje komine

- prevođenje škroba u škrobni lijepak:

- vezanjem vode škrobna zrnca bubre

- povećanjem volumena pucaju

- škrob prelazi u otopinu (ljepljiva, viskozna) – škrobni lijepak

- likvefakcija i ošećerenje:

- dugačke lance amiloze i amilopektina a-amilaza cijepa u kraće jedinice –

viskoznost se smanjuje (brza reakcija)

- b-amilaza –odcjepljuje po 2 glc jedinice (maltoza) s kraja škrobne molekule

(spora reakcija)

- hidroliza prestaje kada se lanci amilopektina razgrade do ostataka

sastavljenih od 2-3 molekule glc ispred 1,6 veze (a i b-amilaza ih ne mogu

razgraditi)

- sladovina uvijek sadržava te, tzv. granične dekstrine

- jodna proba (0,2 M otopina joda i K-jodida u EtOH)

- završetak ošećerenja – „jod normalne boje“

4.12.2016. 13

SEM fotografije škroba iz kukuruza (a i b) i pšenice (c i d) u vodenoj otopini

nakon toplinske obrade pri 35 oC i 85 oC

4.12.2016. 14

Dekstrini

- Hidrolizom škroba se proizvodi vrlo velik broj različitih proizvoda (sirupa)

koji se razlikuju prema dekstroznom ekvivalentu (DE).

DE – dekstrozni ekvivalent – izražava postotak reducirajućih šećera

računato kao D-glukoza na suhu tvar (100 g s.tv.) - pokazatelj stupnja

razgrađenosti škroba, odnosno postotak hidroliziranih glikozidinih veza u

škrobu

- DE vrijednost škroba je 0

DE: glukoza 100

fruktoza 100

maltoza 50

saharoza 0

invertirana saharoza 100

maltotrioza 100:3

manoza 100

celobioza 50

4.12.2016. 15

Proizvodi enzimske hidrolize škroba i nadzor hidrolize s jodnom otopinom.

a - amilaza b - amilaza Razgradni proizvodi Reakcija s jodom

Amiloza i amilopektin

Toplina

Klajsterizirani škrob

Makromolekulski dekstrini

Srednje makromolekulski

dekstrini

Niskomolekulski dekstrini

Plava boja

Ljubičasta

do crvena boja

Maltotrioza

Maltoza

Glukoza

Jod - normalna boja

(ţuto - smeĎa boja)

4.12.2016. 16

ENZIMSKA HIDROLIZA ŠKROBNIH SIROVINA

Hidrolizirati se moţe:

-čitavo zrno polisaharidne sirovine (primjer: proizvodnja žitnog

etanola),

-suho mljevena ili usitnjena polisaharidna sirovina (ječmena,

pšenična, ražena, kukuruzna prekrupa), samljeveni krumpir -

primjena u proizvodnji žitnih rakija, mliječne kiseline, antibiotika,

žitnih šećernih sirupa…),

- škrob izdvojen iz polisaharidne sirovine po mokrom ili

suhom postupku prerade (proizvodnja šećernih sirupa i škrobnih

šećera).

4.12.2016. 17

Opća shema hidrolize neslađenih škrobnih sirovina

ŠKROBNE SIROVINE

PRIPREMA

MLJEVENJE

ČIŠĆENJE

UKOMLJAVANJE Voda

ŢELATINACIJA

LIKVEFAKCIJA

Amilolitički enzimi

OŠEĆERENJE

SLATKA KOMINA

HRANJIVA

PODLOGA

FILTRACIJA Trop HRANJIVA

PODLOGA

TEKUĆA FAZA

PROČIŠĆAVANJE

UPARAVANJE ŠEĆERNI SIRUPI

C - izvor

ŠEĆER I

C - izvor SUŠENJE

4.12.2016. 18

Mikrobni enzimi (hidrolaze) za hidrolizu škrobnih sirovina

Kinetika procesa ošećerenja:

- nadzor postupnom promjenom temperature

- zadržavanje komine određeno vrijeme na optimalnim temperaturama za

enzime

Enzim Supstrat pH

optimum

Temperaturni

optimum (oC)

bakterijska

a-amilaza

(standardna)

želatinirani škrob 5.5-7.0 60-80

bakterijska

a-amilaza

(termostabilna)

želatinirani škrob

5.5-8.0 75-90

fungalna a i

b-amilaza

želatinirani škrob

dekstrini

4.0-6.0 45-60

pululanaza dekstrini 4.0-6.0 55-65

4.12.2016. 19

PROIZVODNJA ŠEĆERNIH SIRUPA I ŠEĆERA IZ ŠKROBNIH SIROVINA

Usporedni prikaz proizvodnje šećernog sirupa mokrim i polusuhim postupkom.

KUKURUZ

MOČENJE VLAŢENJE

OTKLICAVANJE

PROSIJAVANJE

PRANJE

IZDVAJANJE

GLUTENA KRUPICA

PRANJE ŠKROBA

ŢELATINACIJA

(klajsterizacija) ŢELATINACIJA

(klajsterizacija)

C.S.L.

GRUBO

MLJEVENJE GRUBO

MLJEVENJE LJUSKA

MOKRI POSTUPAK POLUSUHI POSTUPAK

KLICA KLICA OTKLICAVANJE

FINO

MLJEVENJE FINO

MLJEVENJE

PROSIJAVANJE VLAKNA BRAŠNO S

MALO MASTI

GLUTEN

OŠEĆERENJE

PROČIŠĆAVANJE

UPARAVANJE ŠEĆERNI SIRUP

4.12.2016. 20

DOBIVANJE ŠEĆERA IZ ŠKROBA

- višestupanjski proces koji zahtijeva stupnjevitu primjenu različitih

mikrobnih enzima

1. ţelatinacija i prevođenje u vodotopljiv oblik pomoću termostabilne

bakterijske a-amilaze (B. licheniformis) pri pH 6,0 - 6,5. Nastaju dekstrini i

mali udjel oligosaharida.

2. ošećerenje dekstrina u drugom stupnju glukoamilazama plijesni (A.

niger), koje kataliziraju hidrolizu različitih polimera do glukoze. Kada se želi

dobiti maltoza, za hidrolizu se rabi biljna ili fungalna b-amilaza. U cilju

dobivanja većeg udjela glukoze ili maltoznog sirupa dodaje se bakterijska

(B. acidopullulyticus) pululanaza.

3. proizvodnja visokofruktoznog sirupa - izvrsna zamjena za saharozu,

temelji se na konverziji glukoze u fruktozu s pomoću bakterijske (B.

coagulans) glukozne izomeraze. Enzim ima optimalnu aktivnost pri pH 7,5 -

8,0 i 65 C, pa proces treba uskladiti s tim uvjetima.

4.12.2016. 21

ŢELATINACIJA

- na početku zagrijavanja suspenzije škroba dolazi do apsorpcije vode u granulu – bubrenje granule (reverzibilne hidratacije u amorfnim dijelovima granule škroba gdje su prisutne slabe vodikove veze)

- daljnjim zagrijavanjem započinje razaranje amorfnih dijelova granule te dolazi do dodatnog bubrenja

- povišenjem temperature granule kontinuirano primaju vodu do određene

granice nakon koje naglo ekspandiraju

- djelovanjem sila naprezanja (miješanjem) dolazi do raskidanja veza i u

kristalnom području, potpuna razgradnja granule i otapanja molekula

4.12.2016. 22

Biokonverzija škroba u različite šećerne sirupe

SUSPENZIJA ŠKROBA

(35 % s. tv.)

I. Ţelatinacija, pH = 6,5

a-amilaza

105 C, 5 min; 95 C, 2 h

Ca2+

= 50 mg L-1

MALTODEKSTRIN

DE = 5 - 10

II. Ošećerenje

48 - 72 h

b-amilaza / pululanaza

55 C, pH 5,5

glukoamilaza / pululanaza

60 C, pH 4,5

GLUKOZNI SIRUP

DE= 95 - 97

III. Izomerizacija

izomeraza glukoze

65 C, pH 8,0, 1 - 4 h

MALTOZNI SIRUP

DE = 45 - 60 FRUKTOZNI SIRUP

4.12.2016. 23

Proizvodnja glukoznog i maltoznog sirupa 4.12.2016. 24

RETROGRADACIJA

hlađenjem želatiniranog sustava škrob/voda sustav spontano prelazi u stanje s manjim sadržajem energije.

retrogradacija - molekularne interakcije između otopljenih molekula škroba, odnosno povezivanje molekula

povezivanje i kristalizacija otopljenih molekula škroba izaziva razdvajanje faza polimera i otapala (odvajanje škroba i vode - sinereza).

molekule amiloze imaju znatno veću tendenciju retrogradacije zbog ravnolančane strukture

4.12.2016. 25

Retrogradacija amiloze 4.12.2016. 26