9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Protein Whey Protein whey diketahui ada sekitar 18-20% dari

keseluruhan komposisi susu. Protein whey memiliki 4 protein utama, yaitu: β-laktoglobulin (β-Lg), α-lactalbumin (α-La), bovine serum albumin (BSA) dan immunoglobulin (lg), masing-masing memiliki persentase berbeda dalam protein whey, yaitu 20%, 50% dan 10%. Selain itu, ada komponen minor protein, yaitu laktoferin, blood transferrin, laktolin dan fraksi protease-pepton. Whey protein bersifat labil pada kondisi panas karena protein pada whey mengalami denaturasi. Kebalikan dari kasein, protein whey akan mengalami denaturasi setelah 5 menit pemanasan dengan suhu 900C (Jovanovic, Barac and Mcej, 2005).

Sifat fungsional protein pada pangan yang utama antara lain meningkatkan busa, pengemulsi, pembentuk gel dan mengikat air. Protein pada bahan pangan terserap pada permukaan cairan antara fase cair dan gas sehingga menstabilkan struktur pangan (Charoen, Anuvat, Kamolwan, Thepkunya, Onanong and David, 2010). Protein susu yaitu protein whey ini sudah diterima oleh masyarakat sebagai pangan fungsional yang digunakan dalam penambahan bahan pangan yang bertujuan untuk penanganan penyakit kronis, kardiovaskular dan diabetes (Korhonen, 2009).

Protein whey memiliki sifat fungsional dan gizi sehingga banyak digunakan pada industri makanan. Gelasi protein merupakan salah satu sifat yang

10

penting. Gelasi protein whey dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain konsentrasi, suhu, pH, kekuatan ion, laju pemanasan dan adanya ion tertentu (Li, Li and Zhao, 2009).

Keragaman reaksi terjadi antara aktivitas antioksidan polifenol pada teh dan melibatkan protein sekunder pada α- dan β-kasein (Hasni, Bourassa, Hamdani, Samson, Carpentier dan Tajmir-Riahi., 2011). Tanaman yang mengandung polifenol membentuk interaksi kuat dengan globula-globula protein pada susu dan membuka struktur protein. Polifenol seperti katekin bereaksi dengan protein mampu membentuk kompleks tidak larut. Kemampuan polifenol dan protein susu bereaksi berpengaruh terhadap ukuran dan tergantung dengan ukuran keduanya (Liang and Xu, 2003). Protein whey memiliki komponen penting yang mendukung sifat fungsionalnya. Dimana komponen yang ada adalah β-laktoglobulin, α-lactalbumin, immunoglobulin, laktoferin, laktoperosidase, serum albumin dan glikomakropeptida. Kandungan bahan-bahan penting tersebut memiliki komposisinya . Komposisi protein whey menurut Hurley (2012) dapat disajikan pada Tabel 1.

Interaksi antara protein whey dan senyawa bioaktif antioksidan terjadi melibatkan struktur dan komposisi asam amino pada protein susu yang kaya akan prolin akan bereaksi baik dengan struktur polifenol dan berpengaruh pada ukuran molekul. Keduanya bereaksi secara terbuka dan fleksibel (Schwarz and Hofmann, 2008). Pada suhu 85oC, struktur tersier dari WPI akan dapat diidentifikasi yang diikuti sifat hidrofobik. Dua bagian yang dominan dari WPI: α-lactalbumin dan β-

11

laktoglobulin akan mengalami denaturasi pada suhu 64,3oC (Boye and Ali, 2000) dan 79,8oC (Haugh, Skar, Vegarud, Langsrud and Draget, 2009). Tabel 1. Komponen penting penyusun protein whey (Hurley, 2012) Sumber Protein whey (%) Ukuran

molekul (kDa)

Bahan baku

Protein whey

β-laktoglobulin ~50-55 apolipoprotein α-lactalbumin 20-25 Albumin Immunoglobulin 10-15 Glikoprotein Laktoferin 1-2 Glikoprotein Laktoperoksidase 0,5 Glikoprotein Serum albumin 5-10 Albumin Glikomakropeptida 10-15 phospoprotein

2.1.1. β-laktoglobulin (β-Lg)

β-Lg terkandung dalam protein whey sebanyak 2,7-3,0 g/L, dengan berat molekul 18,3 KDa dan titik isoelektriknya ada pada 5,2. Secara biologis β-Lg berfungsi sebagai pembawa retinol dan mengikat asam lemak (Vicente, 2007).

β-Lg merupakan protein globuler terbanyak dalam susu sapi. Komponen utama β-Lg adalah asam amino hidrofobik. β-Lg mampu membawa komponen hidrofobik (vitamin D, asam lemak dan kolesterol) dalam rongganya. Hal ini dikarenakan adanya ikatan-ikatan sulfidril yang terbuka. Adanya kelompok sulfidril pada β-Lg memungkinkan adanya perubahan intra dan

12

intermolekuler pada disulfida. Struktur ini sensitif terhadap pH dan perubahan suhu (Swaishgood, 2008). Struktur β-Lg dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Struktur β-Lg (Kanakis et al., 2011)

Dalam pengolahan pangan, perlakuan

panas dapat mengubah struktur asli dari β-Lg. Perlakuan pemanasan dapat menyebabkan denaturasi secara tidak langsung. Hal ini disebabkan oleh konsentrasi β-Lg, garam dan gula, pH dan kekuatan ion. Tahap pertama denaturasi β-Lg terjadi pada suhu 58-60oC yang mempengaruhi struktur α-heliks. Perubahan struktur secara langsung di daerah yang mengandung asam amino Lys8-Try19 pada suhu 65oC dan kemudian menuju daerah yang mengandung asam amino Thr125-Lys135. Perubahan struktur secara tidak langsung terjadi pada suhu 800C. Perlakuan pemanasan akan menyebabkan rantai intra disulfida pecah dan

13

kelompok sulfidril bebas sehingga berikatan dengan komponen lain (Rytkonen, 2006). β-Lg merupakan kelompok protein lipocalin karena tinggi afinitas atau kemampuan membentuk ikatan dengan senyawa lain. β-Lg memiliki inti hidrofobik sehingga memungkinkannya untuk berikatan dengan molekul hidrofobik yang kecil. Kemampuan ini menjadikan β-Lg sebagai pembawa nutrisi hidrofobik yang sangat penting dalam meningkatkan sifat bioavabilitasnya (Li, Chui, Ngadi and Ma, 2015).

Denaturasi panas di atas 65oC membuka struktur globuler β-Lg. β-Lg kaya lisin, leusin, asam glutamat dan aspartat. Molekul β-Lg terdiri atas dua rantai peptida yang dihubungkan satu sama lain pada beberapa titik pada rantai dan mengandung gugus ujung yang sama, yaitu leusin terminal-N dan isoleusin terminal-C. Protein ini merupakan satu-satunya protein susu yang mengandung sistein dan karena itu mengandung gugus sulfhidril bebas yang berperan dalam pembentukan bau-rasa masak pada susu yang dipanaskan (deMan, 1997).

2.1.2. α-lactalbumin (α-La)

α-La terkandung dalam protein whey sebanyak 0,7-1,2 g/L, dengan berat molekul 14,2 KDa dan titik isoelektriknya ada pada 4,5-4,8. Secara biologis berperan dalam mendukung

14

biosisntesis laktosa (Vicente, 2007). Struktur α-La dapat disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur α-La (Permyakov and Berliner., 2000)

α-La merupakan salah satu protein susu yang mengikat Ca2+ yang sangat penting sebagai salah satu penyusun lactose synthase yang mengkatalis biosintesis laktosa dalam kelenjar mammary dan mempunyai sisi yang kuat dalam pengikatan Ca2+. Pengikatan kalsium dapat menstabilkan α-La terhadap tekanan. Pengikatan kation logam juga dapat meningkatkan stabilitas α-La terhadap agen denaturasi.

2.2. Katekin

Katekin merupakan senyawa flavonoid yang dapat ditemukan pada teh hijau, teh hitam, gambir, anggur dan tanaman pangan yang lainnya. Katekin merupakan senyawa yang tinggi akan kandungan polifenol

15

(Pambayun, Gardjito, Sudarmadji dan Rahayu, 2007), flavonoid dan tinggi total fenol (Kassim, et al., 2011) serta memiliki aktivitas antioksidan (Rahmawati, Fernando dan Wachyuni, 2013). Ekstrak Gambir mengandung senyawa fungsional yang termasuk dalam golongan senyawa polifenol dan senyawa ini merupakan hasil metabolit sekunder tanaman yang menyusun golongan tanin. Salah satu yang termasuk dalam senyawa polifenol adalah flavanoid. Katekin bagian senyawa golongan tanin oligomeric procyanidin (OPC). Secara farmakologi, OPC dan monomernya bersifat seperti flavonoid dan sering disebut flavonoid (Isnawati, Raini, Sampurno, Mutiatikum, Widowati dan Gitawati, 2012).

Tanaman gambir atau Uncaria gambir (Roxb.) adalah tanaman yang tersebar di Indonesia dan Malaysia. Tanaman in mudah ditemui dan merupakan famili Rubiaceae dan genus Uncaria (Heitzman, Neto, Winiarz, Vaisberg and Hammond, 2005). Taniguchi, Kuroda, Doi, Inada, Yoshikado, Yoneda, Tanabe, Shibata, Yoshida, Hatano (2007) menyatakan bahwa pada daun dan ranting muda dari U. gambir (Roxb.) dapat diekstrak dengan rata-rata 76% darinya adalah katekin, dimana katekin ini merupakan komponen polifenol dengan struktur flavonoid. Manfaatnya sebagai antioksidan dan antibakteri dan juga sebagai bahan dasar dalam dunia farmasi dan produk kosmetik.

Polifenol memiliki kemampuan yang baik untuk bereaksi dengan protein susu dan dinilai stabil terhadap pemanasan. Epigallokatekin yang merupakan salah satu komponen senyawa katekin dan β-lg dari protein whey

16

akan terjadi ikatan hidrofobik dan kompleks yang distabilisasi oleh ikatan hidrogen (Wu, Dey, Wu, Liu, He and Zeng, 2013).

Evaluasi aktivitas antioksidan pada gambir dianggap penting karena berkaitan dengan adanya senyawa fenolik. Senyawa fenolik ini merupakan salah satu antioksidan yang paling efektif. Total kandungan fenol yang tinggi pada gambir disebabkan oleh adanya katekin. Sifat antioksidan katekin didasarkan pada kemampuannya untuk menghambat radikal bebas (Apea-Bah, Hanafi, Fajriah, Darmawan, Artanti, Lotulung, Ngadymang and Minarti, 2009). Tanin diklasifikasikan menjadi tannin terhidrolisa dan cenderung memiliki viskositas yang kental. Tanin yang terhidrolisa ini ditandai dengan memiliki beberapa kelompok asam galat, kemudian dipersatukan pada ikatan ester. Tanin terkondensasi merupakan polimer dari flavan-3-ols (Anggraini, Tai, Yoshino and Itani, 2011). Pada Tabel 2 akan disajikan konsentrasi katekin, epikatekin dan asam caffeic pada ekstrak gambir. Tabel 2. Konsentrasi katekin, epikatekin dan asam caffeic

pada gambir (Anggraini et al., 2011). Ekstrak

gambir Katekin (µg/ml)

Epikatekin (µg/ml)

Asam caffeic (µg/ml)

GC 104,5 0,80 0,99 GU 101,2 0,62 -

GRm 99,4 0,49 0,98 GRg 108 0,74 -

17

Aplikasi penambahan katekin dari tanaman Gambir pada WPI belum dipraktekan dalam dunia pangan. Adapun beberapa aplikasi penambahan katekin pada WPI sebagai berikut, menurut Thongkaew, Gibis, Hinrich dan Weiss (2014) menyatakan bahwa bubuk WPI (5% berat/volum) dan pectin dari apel (2% berat/volum) dilarutkan pada 10 Mm buffer sodium fosfat (pH 7). Setelah itu dipanaskan dengan suhu sebesar 65oC 40 menit kemudian didinginkan dan ditambah polifenol dari 4 sumber yang berbeda yaitu katekin, ekstrak biji anggur, ekstrak hibiskus dan asam tannin pada beberapa konsentrasi berbeda masing-masing 0, 0,1, 0,3 dan 0,5% (berat/volum). Berdasarkan keempat perlakuan yang diberikan tidak memberikan pengaruh pada ukuran diameter dan pengendapan dari protein. Rodriguez et al (2015) menambahkan polifenol pada β-lg murni. Hasilnya pada konsentrasi polifenol rendah (0,125 dan 0,125%) distribusi intensitas sesuai dengan dimer β-lg sesuai dengan aglomerasi antara protein yang dihubungkan oleh polifenol. Dengan meningkatnya konsentrasi polifenol, distribusi bergeser ke ukuran yang lebih tinggi. Konsentrasi polifenol yang rendah 0,125% dan 0,25% sebagian besar mempertahankan ukuran dimer β-lg. Kemudian dijelaskan oleh penulis lain Poncet-Legrand, Edelmann, Putaux, Cartalade, Sarni-Manchado and Vernhet (2006) menyatakan bahwa penambahan polifenol pada β-lg sebesar 0,5% atau diatasnya akan membentuk partikel yang berukuran 30nm dan membentuk partikel nano yang stabil. Pengikatan anatara protein whey dan polifenol telah dicirikan sebagai interaksi pengikatan non-kovalen,

18

yang terdiri dari interaksi hidrofobik, van der Waals, jembatan hydrogen dan ionik (Nagy, Courtet-Compondu, Williamso, Rezzi, Kussmann and Rytz, 2012). 2.3 Mikrostruktur

Pengamatan mikroskopis dilakukan untuk mengamati sesuatu yang berukuruan kecil dan tidak dapat dilihat dengan menggunakan mata telanjang. Pengujian mikroskopis dapat dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut mikroskop (Surh, Vladisavijevic, Mun dan McClements, 2007). Mikrostruktur yang dihasilkan menunjukkan penampakan matriks protein yang memiliki struktur seperti spons dengan ukuran dan bentuk globula lemak yang bervariasi dan terdistribusi dalam matrik protein. Dalam mikrostruktur dapat diketahui penyebaran matriks protein dan globula lemak yang merata. Mikrostruktur dipengaruhi oleh kuatnya ikatan antar matriks protein (Andriani, Sawitri, Awwaly dan Manab, 2010).

Gambar 4. Mikrostruktur fluorescence dari WPI secara in

vitro (Rytkonen, 2006)

19

Pada Gambar 4 nampak warna hijau (β-Lg) dan biru (Caco-2) dimana ini merupakan pengamatan pengaruh β-Lg secara in vitro. Analisis secara kualitatif menunjukkan β-Lg saat terdenaturasi memiliki kemampuan dibawa sel Caco-2 dan melalui sel M (Rytkonen, 2006).

Keasaman dapat mempengaruhi struktur dari protein whey. Dapat dilihat pada Gambar 5. Studi ini menjelaskan tentang pengaruh ekstruksi bahan pangan protein whey isolat. Keterangan untuk Gambar 5. adalah A) WPI tanpa perlakuan; B) WPI dengan perlakuan ekstruksi dengan air deionisasi pada pH 6,8; C) WPI dengan perlakuan ekstruksi pada pH 2 dengan penambahan 2 N HCL dan D) WPI dengan perlakuan ekstruksi pada pH 13,2 dengan penambahan 3 N NaOH. C dan D menujukkan indikasi terbentuknya agregat yang lebih struktural. Pada C atau pH 2 (asam) ditemukan persebaran matriks protein yang lebih kecil dan merata (Onwulata, Isobe, Tomasula, and Cooke, 2006).

Gambar 5. Mikrostruktur WPI pada pH berbeda dengan

menggunakan mikroskop fluorescence (Onwulata, Isobe, Tomasula, and Cooke, 2006).

20

2.4 Sedimentasi Perlakuan pemanasan pada susu menyebabkan

denaturasi protein. Denaturasi protein sangat mempengaruhi sifat fungsional yang sangat penting pada produk olahan susu. Perlakuan pemanasan menyebabkan perubahan struktur protein yang memiliki dampak positif dan negatif pada susu tersebut. Pemanasan akan menyebabkan protein whey dalam susu menjadi tidak stabil sehingga mengurangi kelarutan dan terdapat banyak endapan (sedimen). Sedangkan sedimen sendiri merupakan endapan yang tidak dapat larut air dalam air yang biasanya mengandung protein yang rusak atau mengalami denaturasi, partikel yang hangus dan lengket, partikel yang sukar larut dan bahan campuran. (Widodo, Rachmawati dan Budisatria, 2012).

Hasan, El Din and Ali (2013) menyatakan bahwa reaksi antara polifenol dan protein terjadi secara langsung dan bolak balik melalui reaksi hidrogen, hidrofobik dan van der wals, dimana reaksi ini akan mengubah sifat larutan protein dan perubahan protein melalui modifikasi tetapi bersifat permanen. Reaksi ini dapat menyebabkan terbentuknya endapan yang diindikasikan sebagai protein yang mengendap. Adanya endapan ini disebabkan oleh komposisi ionik dan pH.

2.5 Indeks Aktivitas Emulsi

Indeks aktivitas emulsi atau Emulsion Activity Index (EAI) mencerminkan kemampuan produk isolat dalam berinteraksi dengan air dan minyak selama pembentukan emulsi. Peningkatan nilai EAI produk interaksi disebabkan gugus hidrofobik dan hidrofil yang

21

semula terlindungi lebih mudah bergerak ke permukaan. Deformasi makromolekul tersebut menyebabkan respon permukaan (respons surface) menjadi lebih besar untuk berinteraksi dengan pelarut non polar dan polar seperti minyak dan air melalui interaksi hidrofobik dan hidrogen yang dibuktikan dengan angka oil holding capacity (OHC) dan kelarutan produk interaksi. Besar kecilnya nilai EAI berhubungan dengan sifat hidrofobitas protein (Soekamto, Aulanni’am dan Sudiyono, 2009).

Aktivitas pengemulsian berhubungan dengan kemampuan protein untuk menutupi antar permukaan minyak-air. Aktivitas pengemulsian protein tergantung dari luas antar permukaan globula minyak yang distabilisai protein. Kemampuan emulsifikasi protein yang tinggi dapat ditunjukkan oleh nilai EAI yang tinggi. EAI menunjukkan kemampuan protein untuk menstabilisasi antar permukaan minyak-air. EAI yang berhubungan dengan luas permukaan ini apabila semakin tinggi EAI maka ukuran globula minyak dalam emulsi semakin kecil. Nilai EAI akan mengalami penurunan dikarenakan peningkatan ukuran globula minyak dalam emulsi (Estiasih dan Ahmadi, 2008).

Upaya pemanfaatan protein dalam industri pangan selain berfungsi sebagai zat gizi juga selalu dikaitkan dengan sifat-sifat fungsionalnya. Sifat fungsional ini adalah sifat yang dapat mempengaruhi karakteristik produk. Sifat fungsional tersebut diantaranya adalah daya emulsi. Dengan mengetahui daya emulsi dapat memperluas pemanfaatan protein whey sebagai salah satu komposisi dalam formulasi produk pangan. Daya emulsi dapat dinilai berdasarkan IAE yang

22

mencerminkan kemampuan dari produk isolat dalam berinteraksi dengan air dan minyak selama pembentukan emulsi. (Legowo, 2005).

2.6 Gugus Fungsi

Dalam menganalisa gugus fungsi menggunakan analisa Fourier Transform Infra Red (FTIR) untuk menganalisa gugus fungsi yang terdapat pada sampel. Adanya senyawa flavonoid pada sampel akan menunjukkan adanya gugus fungsi tertentu yaitu –OH terikat, C-H alifatik, C=C, CH3 bengkokan (Sumarlin, Muawanah, Wardhani dan Masitoh, 2014).

Katekin merupakan gugus fungsi yang penting diamati dan terletak pada daerah tangkapan air 500-1900 cm-1. Proses pemanasan daun teh yang mengandung katekin dapat menggeser letak tangkapan katekin (Rahayu, Purwadi, Radiati, dan Manab, 2015). Menurut Maoela et al. (2009) bahwa spektrofotometer inframerah dapat menentukan katekin ekstrak teh hijau, jumlah gelombang spektrum FTIR 3400-3100 cm-1, 1.600 cm-1, 1150-1010 cm-1 ditempati untuk OH, C = C, C-O.

Pada Gambar 6. merupakan hasil spektra infrared pada tanaman gambir yang mengandung katekin dan epikatekin (Andasurya, Purwanto, Budiastra dan Syamsu,2013. Chen, Zhao, Caitep dan Guo (2009) katekin memiliki beberapa puncak spektrum terjadi pada daerah 4000-8500 cm-1 (2500-1176 nm).

23

Gambar 6. Hasil spektra tanaman gambir (Andasurya et al.,2013). Whey protein merupakan hasil samping produksi keju, dimana bahan ini jumlahnya melimpah. Sifat fungsional whey protein pada makanan terus dikaji secara ekstensif. Banyak upaya untuk mengembangakan melalui metode modifikasi dengan menambah properti bahannya seperti antioksidan, cross-linking (via perlakuan panas atau reaksi enzimatis) dan hidrolisis. Hasil spektra inframerah whey protein isolat berkisar antara 1650 dan 1540 cm-1. Hasil ini menunjuk pada gugus C=O dan C-N vibrasi renggangan amida I dan II (Wen-qiong, Yi-hong and Ying, 2013).

24