AΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΣΥΝΔΕΣΗ LIGAND - ΥΠΟΔΟΧΕΑ · Web viewΤο κριτήριο...

Φαρμακοδυναμική: Σύνδεση φαρμάκου - υποδοχέα

Υποδοχείς. Ιστορία - κριτήρια ………………….……………………………………………………………….………..56Αλληλεπίδραση υποδοχέα-προσδέτη …………………………………………………………………………..…..58Γενικά χαρακτηριστικά των ραδιοπροσδετών ……………………………………………………………………………...58Ειδική σύνδεση (Specific binding) …………………………………………………………………………………………….….59Καμπύλη κορεσμού (saturation curve) …………………………………………………………………………………….……62Αντιστρεπτή σύνδεση προσδέτη - υποδοχέα και υπολογισμός της συγγένειας(Κd) ………………..65Δύο παραδείγματα ειδικής σύνδεσης υποδοχέα – προσδέτη ………………………………………………………69Συνέργια (cooperativity) - Συντελεστής του Hill: πόσες θέσεις σύνδεσης υπάρχουν σε έναν υποδοχέα ………………………………………………….……………………………………………..72Η σχέση δόσης - απόκρισης για τα φάρμακα………………………………..…………………………………74Η σύζευξη υποδοχέα - τελεστή και οι εφεδρικοί υποδοχείς…….…………………….

……………………………75Συναγωνιστικοί και μη συναγωνιστικοί (αλλοστερικοί) ανταγωνιστές……….………77Υπολογισμός της συγγένειας συναγωνιστικών ανταγωνιστών – Διάγραμμα Schild…………………80Μερικοί αγωνιστές……………………………...…………………………………………………………………….……………….80

3

56 Κεφάλαιο 3

Πειράματα συναγωνισμού (competition experiments) για τον προσδιορισμό της συγγένειας μη σημασμένου προσδέτη – αναστολέα………………………….…………..………82 Όταν η συγκέντρωση του ραδιοπροσδέτη [L*] είναι σταθερή και μεταβάλλουμε

τη συγκέντρωση του συναγωνιστικού αναστολέα [Ι]………………………………..…………………………….…..83

Μη συναγωνιστική αναστολή (non competitive inhibition)…………………………………………………………87Μη αντιστρεπτοί ανταγωνιστές…………………………………………………………………………………………….88Διαχωρισμός αγωνιστών – ανταγωνιστών στους οπιοειδείς υποδοχείς με τη βοήθεια πειραμάτων σύνδεσης……………………………………………………………………………….………88Χαρακτηρισμός ενός «ορφανού» υποδοχέα με τη βοήθεια πειραμάτων σύνδεσης …………………………………………………………………………………………………………………………………………90Αντίστροφος αγωνισμός………………………………………………………………………………………………………….92Η ταυτοποίηση της agouti ή AgRP ως ενδογενούς αντίστροφου αγωνιστή προσδίδει φυσιολογική σημασία στον αντίστροφο αγωνισμό…………………………………………………………………………96

Το 40% των φαρμάκων προκειμένου να δράσουν συνδέονται σε πρωτεΐνες των κυττάρων που ονομάζονται υποδοχείς. Οι υποδοχείς αυτοί βρίσκονται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη (μεμβρανικοί υποδοχείς), και ένα μικρότερο ποσοστό στο κυτταρόπλασμα (πυρηνικοί υποδοχείς). Στο κεφάλαιο αυτό, θα μελετήσουμε τους τρόπους σύνδεσης των φαρμάκων με τους υποδοχείς τους (Φαρμακοδυναμική), ενώ τους υποδοχείς ως μοριακούς στόχους, τη δομή τους, τα μεταγωγικά μονοπάτια που χρησιμοποιούν και τα είδη των φαρμάκων που συνδέονται θα μελετήσουμε στο Κεφάλαιο 4.

Υποδοχείς – Ιστορία και κριτήριαΗ έννοια του υποδοχέα προτάθηκε από τον φυσιολόγο του Cambridge John Newport

Langley (1852-1925) και τον Γερμανό ανοσολόγο Paul Ehrlich (1854-1915).

Εικόνα 3.1 John Newport Langley (αριστερά) και Paul Ehrlich (δεξιά).

Φαρμακοδυναμική: Σύνδεση φαρμάκου - υποδοχέα 57

Η έρευνα του Langley ήταν εστιασμένη στη φυσιολογική δράση των αλκαλοειδών. Το 1870, στα αρχικά του πειράματα με σιελογόνους αδένες γάτας, έδειξε μια αμοιβαία ανταγωνιστική δράση ανάμεσα στα αλκαλοειδή πιλοκαρπίνη που επάγει την έκκριση σιέλου, και ατροπίνη που την σταματά. Ο Langley συμπέρανε πως πρέπει να υπάρχει μια "υποδεκτική ουσία" (receptive), στην οποία τα δύο αλκαλοειδή έχουν την ικανότητα να συνδέονται.

"….there is some substance or substances in the nerve ending or gland cell with which both atropine and pilocarpine are capable of forming compounds."

Το 1880, ο Langley έστρεψε την έρευνά του στο νευρομυϊκό σύστημα, στη μελέτη της δράσης δύο άλλων αλκαλοειδών, της νικοτίνης και του κουράριου, γιατί υπήρχε αντικρουόμενη άποψη για το αν τα αλκαλοειδή αυτά δρουν απευθείας στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα ή στις νευρικές απολήξεις που καταλήγουν σε αυτά. Ο Γάλλος φαρμακολόγος Claude Bernard είχε προτείνει λίγα χρόνια πριν (1840-50) ότι το κουράριο προκαλεί παράλυση των σκελετικών μυών δρώντας στο επίπεδο των νευρικών απολήξεων. Το 1905, ο Langley αντέκρουσε αυτήν την υπόθεση δείχνοντας πως η νικοτίνη προκαλεί τη σύσπαση των μυών ακόμη και μετά από εκφυλισμό των κινητήριων νεύρων. Τα πειραματόζωα που χρησιμοποίησε ήταν κοτόπουλα, στα οποία η ένεση νικοτίνης οδηγούσε σε χαρακτηριστική τονική σύσπαση των μυών του ποδιού, η οποία συνεχίζονταν και μετά την απονεύρωση του μυ. Η ένεση κουραρίου στα κοτόπουλα σταματούσε τη σύσπαση, ωστόσο, αν μετά την ένεση κουραρίου ακολουθούσε ηλεκτρική διέγερση του μυ, ο μυς συσπόταν. Ο Langley συμπέρανε ότι το κουράριο και η νικοτίνη δεν δρουν σε μια ουσία, η οποία προκαλεί τη σύσπαση αλλά σε μια συμπληρωματική ουσία, την οποία ονόμασε "υποδεκτική", η οποία δέχεται το μήνυμα του νευρώνα και το μεταφέρει μέσα στο μυϊκό κύτταρο ενεργοποιώντας τον μηχανισμό της σύσπασης. Επιπλέον παρατήρησε ότι η ένταση της σύσπασης του μυός ήταν ανάλογη της συγκέντρωσης της νικοτίνης, και ότι αυτή η "υποδεκτική" ουσία διέφερε ανάλογα με το είδος του οργανισμού, καθώς η νικοτίνη δεν προκαλούσε σύσπαση των μυών στις καραβίδες.

Ο Paul Ehrlich ανέπτυξε ανεξάρτητα την ιδέα περί υποδοχέα, ξεκινώντας από την παρατήρηση ότι πολλές οργανικές χρωστικές βάφουν επιλεκτικά συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους, προτείνοντας ότι η εξειδίκευση προέρχεται από την αλληλεπίδραση των χρωστικών με τα συγκεκριμένα κύτταρα. Το 1885, πρότεινε ότι τα κύτταρα έχουν “πλευρικές αλυσίδες” (lateral chains) ή υποδοχείς (receptors), με τους οποίους τα φάρμακα ή οι τοξίνες ή οι χρωστικές πρέπει να συνδεθούν για να προκαλέσουν τις δράσεις τους. Ο ίδιος ο Ehrlich στην ομιλία του στην απονομή του βραβείου Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής το 1908 παρατηρεί

“…I therefore assumed that the tetanus toxin must unite with certain chemical groupings in the protoplasm of cells…As these receptors, which may be regarded as lateral chains of the

protoplasm … become occupied by the toxin, the relevant normal function of this group is eliminated…”.

Στην τελική ανάπτυξη της θεωρίας του περί υποδοχέων, ο Ehrlich ήταν ο πρώτος που έδειξε ότι η ταχύτατη αναστροφή της δράσης των αλκαλοειδών οφείλονταν στην απουσία ισχυρών ομοιοπολικών χημικών δεσμών κατά τη σύνδεσή τους με τους υποδοχείς, ενώ η χημική φύση αυτού του είδους σύνδεσης αποσαφηνίστηκε μόλις τα τελευταία χρόνια.

Σήμερα, οι υποδοχείς θεωρούνται από τους σημαντικότερους μοριακούς στόχους των φαρμάκων. Για να χαρακτηριστεί ένα μόριο υποδοχέας πρέπει να πληροί ορισμένα κριτήρια:

1. Κορεσμός (saturability)Η συγκέντρωση των υποδοχέων που ανιχνεύεται σε βιολογικό υπόστρωμα πρέπει να είναι

περιορισμένη. Για παράδειγμα, η συγκέντρωση των υποδοχέων των νευροδιαβιβαστών στο


ΚΝΣ είναι της τάξης των 10-500 fmoles/mg prot. Το κριτήριο αυτό θεσπίστηκε όταν η μέτρηση των υποδοχέων γινόταν με μελέτες σύνδεσης εξειδικευμένων ραδιενεργών προσδετών (μελέτες binding). Καθώς οι ραδιενεργοί προσδέτες έχουν την τάση να δεσμεύονται όχι μόνο στους ανάλογους υποδοχείς, αλλά και σε μη ειδικές θέσεις σύνδεσης (non specific binding sites), έπρεπε να θεσπιστεί ένα κριτήριο αξιολόγησης της συγκέντρωσης των υποδοχέων που καταγράφεται. Συνεπώς, η σύνδεση του προσδέτη στον υποδοχέα πρέπει να είναι κορέσιμη, προσομοιάζοντας την κινητική Michaelis-Menten.

2. Στερεοεξειδίκευση (stereospecificity) Ανάμεσα στον προσδέτη (ή πρόσδεμα, ligand) και στον υποδοχέα πρέπει να υπάρχει η σχέση κλειδιού/κλειδαριάς (lock/key) που προτάθηκε από τους Ehrlich και Langley, στις αρχές του 20ου αιώνα. Γι’ αυτό για ουσίες που υφίστανται ως οπτικά ισομερή, πρέπει να δειχθεί ότι η σύνδεση παρουσιάζει στερεοεξειδίκευση, για παράδειγμα, η D-μορφίνη συνδέεται πιο ισχυρά στους οπιοειδείς υποδοχείς, από την L-μορφίνη.

3. Αναστρεψιμότητα (reversibility)Ο υποδοχέας πρέπει να μπορεί να απενεργοποιείται, δηλ. μετά τη δημιουργία του

συμπλόκου προσδέτη-υποδοχέα (Ligand-Receptor, LR), ο προσδέτης πρέπει να αποσυνδέεται και η βιολογική δραστηριότητα που ακολουθεί να διακόπτεται.

Η αντίδραση L+R L-R είναι αμφίδρομη. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγγένεια (affinity) του προσδέτη για τον υποδοχέα, τόσο μεγαλύτερος είναι ο χρόνος αντιστρεπτότητας, ο χρόνος δηλ. κατά τον οποίο παραμένουν συνδεδεμένοι προσδέτης και υποδοχέας. Έτσι πχ. οι περισσότερες ορμόνες που ρυθμίζουν το μεταβολισμό έχουν υψηλή συγγένεια για τους υποδοχείς τους (Κd=10-10 M) και συνεπώς ημιδιάρκεια αντιστρεπτότητας σχετικά μεγάλη (10-30 min), σε αντίθεση με ορισμένους νευροδιαβιβαστές (ακετυλοχολίνη) που έχουν χαμηλή συγγένεια με τους υποδοχείς τους (Κd=10-4 M) και γρήγορη αντιστρεπτότητα της δραστηριότητας (μυϊκή σύσπαση), της τάξης των μερικών msec.

4. Εξειδικευμένη κατανομήΟ υποδοχέας πρέπει να παρουσιάζει συγκεκριμένη κατανομή στις διάφορες περιοχές του

οργανισμού, η οποία εξηγεί και την εξειδικευμένη δράση του. Πχ. ο σεροτονεργικός υποδοχέας 5-ΗΤ1Α στον εγκέφαλο, βρίσκεται σε μεγάλη συγκέντρωση στις μεταιχμιακές περιοχές (ιππόκαμπος, διάφραγμα), σε μικρότερη στον εγκεφαλικό φλοιό και σε ελάχιστη ποσότητα στο χοροϊδικό πλέγμα. Η κατανομή αυτή είναι συνεπής με το ρυθμιστικό ρόλο που έχει ο υποδοχέας αυτός στη διάθεση και το άγχος.

5. Φαρμακολογικά κριτήριαΠρέπει να υπάρχουν ουσίες (αγωνιστές ή ανταγωνιστές) ικανές σε χαμηλή συγκέντρωση

συνδεθούν στον υποδοχέα, καθώς και να εκτοπίσουν το ραδιενεργό προσδέτη (drug displacement), να συναγωνιστούν δηλ. για τη σύνδεσή τους με τον υποδοχέα.

Πρέπει επίσης να υπάρχει μία συσχέτιση ανάμεσα στη συγκέντρωση με την οποία το προσδέτης αναγνωρίζει τον υποδοχέα in vitro και στη συγκέντρωση του προσδέτη, η οποία απαιτείται για την εμφάνιση του φυσιολογικού αποτελέσματος in vivo.

6. Μοριακή ταυτοποίησηΣήμερα, μελέτες της μοριακής βιολογίας επιτρέπουν τον καθορισμό της μοριακής δομής

της πρωτεΐνης του υποδοχέα καθώς και του γονιδίου που τον κωδικοποιεί. Χάρη σε αυτήν τη δυνατότητα μπορούμε να εκφράσουμε τον υποδοχέα σαν ανεξάρτητη λειτουργική μονάδα σε ένα ζωντανό κύτταρο (πχ. ωοκύτταρο βατράχου) ή σε ένα τεχνητό θρεπτικό μέσο με το κατάλληλο σύστημα μεταγωγής έτσι ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της λειτουργίας του σε κυτταρικό επίπεδο.


Η αλληλεπίδραση υποδοχέα-προσδέτηΜε δεδομένο ότι πάρα πολλά φάρμακα για να εκδηλώσουν τη δράση τους, πρέπει να

συνδεθούν με κάποιον υποδοχέα είτε ενεργοποιώντας (αγωνιστές) είτε αναστέλλοντάς τον (ανταγωνιστές), είναι απολύτως απαραίτητο να γνωρίζουμε τα χαρακτηριστικά της σύνδεσης κατ' αναλογία με τις κινητικές σταθερές που χαρακτηρίζουν την σύνδεση ενζύμου - υποστρώματος. Ο προσδιορισμός γίνεται κυρίως με χρήση ραδιενεργά σημασμένων προσδετών, με μια γενική διεργασία που περιγράφεται παρακάτω.

Γενικά χαρακτηριστικά των ραδιοπροσδετώνΗ σήμανση των προσδετών συνήθως γίνεται με 3Η ή 125Ι. Τα πλεονεκτήματα της

σήμανσης με 3Η είναι ότι ο προσδέτης παραμένει βιολογικά αναλλοίωτος και άρα δεν ξεχωρίζει βιολογικά από τον μη σημασμένο, διατηρώντας τα ίδια χαρακτηριστικά σύνδεσης, και ότι έχει μεγάλο χρόνο ημιζωής (χρόνος κατά τον οποίο μετασχηματίζεται ο μισός αριθμός ραδιοϊσοτόπων), περίπου 12 χρόνια, ενώ του 125Ι είναι μόλις 60 ημέρες. Τα πλεονεκτήματα του 125Ι είναι η υψηλότερη ειδική του ραδιενέργεια (2.175 Ci/mmol σε αντίθεση με του 3Η που κυμαίνεται μεταξύ 30 και 100 Ci/mmol), ενώ παρουσιάζει το μειονέκτημα ότι όντας μεγάλο μόριο μπορούμε με δυσκολία να το συνδέσουμε σ’ένα νευροδιαβιβαστή ή σ’ένα μικρό πεπτίδιο γιατί ρισκάρουμε να μεταβάλουμε τη βιολογική του δραστηριότητα.

Ο ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΟΣ ΠΡΟΣΔΕΤΗΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΧΕΙ ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΗ ΡΑΔΙΕΝΈΡΓΕΙΑ (SPECIFIC RADIOACTIVITY)1. Υψηλή ειδική ραδιενέργεια θεωρείται πάνω από 10 Ci/mmole και επιτρέπει την ανίχνευση του συμπλέγματος ραδιενεργού προσδέτη-υποδοχέα, δηλ. την ανίχνευση υποδοχέων που βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση στην κυτταρική μεμβράνη. Μπορούμε δηλαδή να ανιχνεύσουμε 100-1.000 υποδοχείς ανά κύτταρο ή 100-1.000 fmoles/mg πρωτεϊνών της μεμβράνης.

Για να υπολογίσουμε με ακρίβεια τη συγκέντρωση ενός υποδοχέα (που είναι περίπου 10 -12

Μ) πρέπει το δείγμα που θα τοποθετήσουμε στο μετρητή ραδιενέργειας, ο οποίος μετράει cpm (counts per min: χτύπους ανά λεπτό), να περιέχει το λιγότερο 1.000 cpm ραδιενέργειας. Άρα χρειαζόμαστε ένα ραδιενεργό μόριο με minimum ειδική ραδιενέργεια 10 Ci/mmole γιατί:

Eφόσον 1 Ci = 2,2 1012 dpm (διασπάσεις/λεπτό: disintegrations per min) 10 Ci ανά mmole 22 ∙1012 dpm ανά 1 mmole (10-3 M) προσδέτη x = 2.200 dpm 100 fmoles (10-13 M)

Επειδή στο μετρητή ραδιενέργειας μετράμε cpm (1cpm = 2dpm), τα 2.200 dpm αντιστοιχούν σε 1.000 περίπου cpm.

Αντίστροφα τώρα, αν ο μετρητής ραδιενέργειας έχει ένδειξη 2.000 cpm μπορούμε εύκολα να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση του υποδοχέα μας, γνωρίζοντας την ειδική ραδιενέργεια του προσδέτη που χρησιμοποιήσαμε (έστω 10 Ci/mmole), ως εξής: 10 Ci ανά 1 mmole 22 ∙1012 dpm ανά 1 mmole (10-3 M) Tα 2.000 cpm είναι 4.000 dpm x = 200 fmoles

Ειδική Σύνδεση (Specific Binding)Ο προσδιορισμός της ειδικής σύνδεσης αποτελεί έναν από τους πιο κρίσιμους παράγοντες

που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη σε κάθε πείραμα σύνδεσης ραδιοσημασμένων προσδετών.

1 Ραδιενέργεια: είναι η ακτινοβολία που εκλύουν ορισμένα άτομα όταν ο πυρήνας τους, χωρίς καμιά εξωτερική επίδραση, εκπέμπει ένα σωμάτιο από τα συστατικά του και μετατρέπεται σε διαφορετικό πυρήνα. Ειδική ραδιενέργεια ενός μορίου είναι η ραδιενέργεια που το χαρακτηρίζει. Μονάδα μέτρησης είναι το Becquerel (1 Bq = 1 μετατροπή πυρήνα/sec), και το Curie (1 Ci = 3,7 1010 Bq).


Ως ειδική σύνδεση ορίζεται η σύνδεση μόνο στον υπό εξέταση υποδοχέα. Ο σημασμένος προσδέτης όμως έχει την τάση να συνδέεται και σε μη ειδικές θέσεις σύνδεσης, σε άλλες δηλαδή πρωτεΐνες που βρίσκονται σε περίσσεια στη μεμβράνη, με πολύ χαμηλότερη βέβαια συγγένεια σύνδεσης. Συνεπώς, η σύνδεση που μετράμε παρουσία ραδιενεργού προσδέτη είναι η λεγόμενη ολική σύνδεση (total binding) που περιλαμβάνει την ειδική και την μη ειδική σύνδεση.

Ως μη ειδική σύνδεση (nonspecific binding) είναι η σύνδεση του σημασμένου προσδέτη σε άλλες θέσεις, διάφορες του υποδοχέα, εξαιτίας των υδρόφοβων ή ηλεκτρόφιλων έλξεων που δημιουργούνται. Σε αντίθεση με τη συγκέντρωση των υποδοχέων των νευροδιαβιβαστών, η οποία είναι πολύ μικρή (100-1.000 fmoles/mg prot.), η συγκέντρωση των μη ειδικών αυτών θέσεων είναι σχεδόν άπειρη. Για να διακρίνουμε λοιπόν την ειδική από την μη ειδική σύνδεση παίρνουμε τις ακόλουθες προφυλάξεις:

• Χρησιμοποιούμε προσδέτες που έχουν υψηλή συγγένεια για τον υποδοχέα (nM), διευκολύνοντας έτσι την ειδική σύνδεση σε σχέση με τη μη ειδική (η συγγένεια του προσδέτη για τις μη ειδικές θέσεις είναι μικρή).

• Χάρη στην τεχνική της γρήγορης διήθησης υπό κενό απομακρύνεται, μετά από πλύσιμο των φίλτρων, μια σημαντική ποσότητα ραδιενέργειας συνδεδεμένης σε μη ειδικές θέσεις (Χ), γιατί ο ραδιενεργός προσδέτης (L*) αποχωρίζεται πολύ πιο γρήγορα από αυτές τις θέσεις σύνδεσης απ’ότι από τους υποδοχείς (R), εφόσον η αντιστρεπτότητα του συμπλόκου XL* είναι μεγαλύτερη από αυτή του συμπλόκου RL*.

• Προσθέτουμε επιπλέον μη σημασμένο “κρύο” προσδέτη (L) σε πολύ υψηλή συγκέντρωση, 1.000 με 10.000 φορές υψηλότερη από αυτή του ραδιενεργού προσδέτη (αν π.χ. χρησιμοποιούμε 10 nΜ ραδιενεργού προσδέτη, η συγκέντρωση του μη σημασμένου προσδέτη για τον προσδιορισμό της μη ειδικής σύνδεσης είναι 10 μΜ). Με τον τρόπο αυτό εμποδίζουμε την ειδική σύνδεση του ραδιενεργού προσδέτη με τους υποδοχείς εφόσον η πολύ μικρή ποσότητα υποδοχέων που υπάρχει στο διάλυμα θα συνδεθεί με τον μη σημασμένο προσδέτη, ο οποίος αφενός έχει μεγάλη συγγένεια για τους υποδοχείς αυτούς και αφετέρου βρίσκεται σε περίσσεια. Ο ραδιενεργός προσδέτης θα συνδεθεί λοιπόν μόνο στις μη ειδικές θέσεις. Βέβαια, ο μη σημασμένος προσδέτης θα συνδεθεί και σε μη ειδικές θέσεις σύνδεσης, επειδή όμως ο αριθμός των θέσεων αυτών είναι τεράστιος και η ταχύτητα αποσύνδεσης πολύ γρήγορη λόγω της πολύ μικρής συγγένειας, δεν επηρεάζει τον υπολογισμό. Από την όλη πειραματική διαδικασία προκύπτουν δύο τιμές (σε cpm) από τις οποίες θα υπολογίσουμε τη συγκέντρωση του υποδοχέα:

i. Η συνολική σύνδεση (Total binding, BT): που περιλαμβάνει την ειδική σύνδεση και την μη ειδική σύνδεση, η οποία παρέμεινε στο φίλτρο μετά τη γρήγορη διήθηση.

ii. Η μη ειδική σύνδεση (Non specific binding): η οποία προκύπτει από το δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει πλεόνασμα μη ραδιενεργού προσδέτη.

Έστω η συνολική σύνδεση είναι 1.500 cpm και η μη ειδική σύνδεση είναι 500 cpm .

η ειδική

σύνδεση = 1.000 cpm

Aν και οι τιμές αυτές είναι αυθαίρετες δεν είναι μακριά από την πραγματικότητα. Η ειδική σύνδεση αντιπροσωπεύει το 50-80% της συνολικής σύνδεσης.


Εικόνα 3.2 Α. Ένας προσδέτης συνδέεται εξειδικευμένα στον υποδοχέα του, για τον οποίο έχει μεγάλη συγγένεια (ειδική σύνδεση), ταυτόχρονα όμως μπορεί να συνδεθεί και σε μη ειδικές θέσεις σύνδεσης. Β. Όταν δύο προσδέτες συναγωνίζονται για τη σύνδεση στην ίδια θέση στον υποδοχέα ονομάζεται συναγωνιστικός ανταγωνισμός.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΌΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΌΣ THΣ ΕΙΔΙΚΉΣ ΣΎΝΔΕΣΗΣ

Ο πειραματικός προσδιορισμός της ειδικής σύνδεσης γίνεται ως εξής: 1. Το παρασκεύασμα που περιέχει τους υπό εξέταση υποδοχείς (π.χ. ένα ομογενοποίημα

μεμβρανών στην περίπτωση που μελετάται κάποιος μεμβρανικός υποδοχέας), επωάζεται με τον ραδιενεργό προσδέτη στην κατάλληλη θερμοκρασία (συνήθως 22 - 37οC), μέχρις ότου επιτευχθεί κατάσταση ισορροπίας R+L* RL*.

2. Το ομογενοποίημα, στην κατάσταση ισορροπίας, περιέχει τον ελεύθερο προσδέτη L* και τον δεσμευμένο στους υποδοχείς (RL*), αλλά και στις μη ειδικές θέσεις (ΧL*). Για το διαχωρισμό της ελεύθερης από τη δεσμευμένη ραδιενέργεια χρησιμοποιείται ειδικό φίλτρο, το οποίο συγκρατεί τα μεγάλα πρωτεϊνικά μόρια, δηλ. τα σύμπλοκα RL* και XL*, και αφήνει να περάσουν τα μικρά αδέσμευτα μόρια L*.

3. Για το διαχωρισμό αυτό, σημαντικό ρόλο παίζει η τεχνική της γρήγορης διήθησης υπό πίεση στο κενό (rapid filtration under vacuum), με τη βοήθεια της οποίας, το φίλτρο πλένεται πολύ γρήγορα. Η ταχύτητα είναι απαραίτητη ώστε αφενός να αποφευχθεί η αποσύνδεση του συμπλόκου RL* (ο προσδέτης έχει μεγάλη συγγένεια με τον υποδοχέα, άρα μεγάλο χρόνο αντιστρεπτότητας), και αφετέρου να αποσυνδεθεί το σύμπλοκο XL* (ο προσδέτης έχει μικρή συγγένεια με τις μη ειδικές θέσεις, άρα μικρό χρόνο αντιστρεπτότητας). Σαν αποτέλεσμα, στο φίλτρο παραμένει μόνο η δεσμευμένη στον υποδοχέα ραδιενέργεια (RL*).

4. Στο φίλτρο προστίθεται κατόπιν ένα υγρό σπινθηρισμού και η ραδιενέργεια που περιέχει μετρείται σ’ένα μετρητή υγρού σπινθηρισμού (Liquid Scintillation Counter).

Β.


Εικόνα 3.3 Μια τυπική πορεία ενός πειράματος σύνδεσης. Σε ομογενοποίημα μεμβρανών προστίθεται ραδιενεργός προσδέτης (L*), και επωάζεται στους 22οC, μέχρι να επέλθει η ισορροπία R+L* RL*. Στη συνέχεια, ο ελεύθερος ραδιοπροσδέτης L*, ο ειδικά δεσμευμένος RL* και ο μη ειδικά δεσμευμένος XL* τοποθετούνται σε φίλτρο που συγκρατεί μεγαλομόρια. Στο διαχωρισμό δεσμευμένης και αδέσμευτης ραδιενέργειας σημαντικό ρόλο παίζει η τεχνική της γρήγορης διήθησης στο κενό, που αποτρέπει την αποσύνδεση του συμπλόκου RL*, ενώ επιτρέπει την αποσύνδεση του XL*. Το «*» δηλώνει μόριο σημασμένο με ραδιενέργεια.

Χρόνος, θερμοκρασία, pH επώασης

Είδαμε ότι όταν ένα παρασκεύασμα υποδοχέων επωάζεται με έναν ραδιοσημασμένο προσδέτη μετά από κάποιο χρονικό διάστημα επέρχεται χημική ισορροπία. Άρα, ο χρόνος επώασης πρέπει να είναι αρκετός ώστε να επέλθει η κατάσταση ισορροπίας στο υπό μελέτη σύστημα. Οι συνήθεις χρόνοι επώασης κυμαίνονται από 20 - 60 min. Αυτό προσδιορίζεται σχετικά απλά με επώαση σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα 10, 20, 30, 40 και 60 min. Εάν η σύνδεση είναι σταθερή μεταξύ π.χ. 40 και 60 min, η επιλογή 50 min ως χρόνου επώασης είναι ικανοποιητική.

Μη συνδεδεμένος ραδιοπροσδέτης

Τοποθέτηση στο φίλτρο

Μέτρηση ραδιενέργειας

Επώαση 22oC

Φίλτρο διήθησης

Γρήγορη διήθηση υπό κενό

Ραδιο-προσδέτης

2Προσθήκη ραδιοπροσδέτη

στο ομογενοποίημα τωνμεμβρανών

Ολική Σύνδεση (Total Binding)

1

2

34

5

XL**

XL*RL* * * *

***

X X


Εικόνα 3.4 Καμπύλη ειδικής σύνδεσης του ραδιενεργού προσδέτη σε συνάρτηση με το χρόνο επώασης. Η ισορροπία επέρχεται όταν ο ρυθμός σύνδεσης του ραδιοπροσδέτη στον υποδοχέα είναι ίσος με το ρυθμό αποσύνδεσής του. Πειραματικά, αρκεί να προσδιορίσουμε τον χρόνο μετά τον οποίο η συνδεδεμένη ραδιενέργεια (B, Bound) σταματά να αυξάνεται, μια κατάσταση που ονομάζεται “σταθερή κατάσταση” (steady-state). Η σταθερή κατάσταση προσδιορίζεται μετρώντας την ποσότητα του συνδεδεμένου ραδιοπροσδέτη στον υποδοχέα του σε διάφορους χρόνους επώασης. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται σε ένα διάγραμμα, με άξονα του x τη διάρκεια επώασης (min) και στον άξονα του y το συνδεδεμένο ραδιοπροσδέτη. Όταν η ποσότητα του συνδεδεμένου ραδιοπροσδέτη σταματήσει να αυξάνεται με το χρόνο έχουμε «σταθερή κατάσταση». Στο πείραμα που απεικονίζεται, η σταθερή κατάσταση είναι ανάμεσα στα 40 -60 min.

Όσον αφορά τη θερμοκρασία, η επιλογή των 22οC είναι η πιο πρακτική (θερμοκρασία δωματίου), αν και υπάρχει η άποψη πως οι 37οC (φυσιολογική θερμοκρασία) είναι καλύτερη επιλογή. Έχει αναφερθεί επίσης και η προτίμηση των 4οC για πιο επαναλήψιμα αποτελέσματα (με μεγαλύτερο χρόνο επώασης) λόγω μειωμένης αποικοδόμησης του ραδιοπροσδέτη, χαμηλότερης μη ειδικής σύνδεσης και στο γεγονός πως ορισμένα προσδέματα έχουν υψηλότερη συγγένεια σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Σε αρκετές περιπτώσεις, η συγγένεια προσδέτη – υποδοχέα εξαρτάται από τη θερμοκρασία.

Τέλος το pH στα πειράματα κυμαίνεται στις φυσιολογικές τιμές μεταξύ 7 και 8.

Συγκέντρωση παρασκευάσματος υποδοχέων

Για να προσδιορίσουμε με τη βοήθεια ενός πειράματος σύνδεσης, τη συγγένεια του προσδέτη για τον υποδοχέας του (Κd) ή τη μέγιστη συγκέντρωση του υποδοχέα στον συγκεκριμένο ιστό (Bmax), η συγκέντρωση παρασκευάσματος υποδοχέων που θα χρησιμοποιήσουμε πρέπει να είναι τέτοια ώστε να εργαζόμαστε στη γραμμική περιοχή απόκρισης σε ένα διάγραμμα συγκέντρωσης παρασκευάσματος υποδοχέων (άξονας x)/ ειδικής σύνδεσης (άξονας y).

Ως πηγή υποδοχέων μπορεί να χρησιμοποιήσουμε μεμβράνες, άθικτα κύτταρα ή λεπτές φέτες ιστού κάποιου οργάνου. Ακολουθώντας την πειραματική διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω, χρησιμοποιούμε σταθερή ποσότητα ραδιενεργού προσδέτη και αυξανόμενες συγκεντρώσεις του παρασκευάσματος των υποδοχέων ώστε να προσδιορίσουμε τις συγκεντρώσεις του παρασκευάσματος, στις οποίες η απόκριση παρασκεύασμα / ειδική σύνδεση είναι γραμμική. Καθορίζοντας την καμπύλη αυτή γνωρίζουμε σε ποια περιοχή συγκεντρώσεων του παρασκευάσματος πρέπει να κινούμαστε σε κάθε πείραμα περαιτέρω χαρακτηρισμού του υποδοχέα (π.χ πειράματα εκτόπισης, λειτουργικότητας, κ.α.).


Εικόνα 3.5 Καμπύλη ειδικής σύνδεσης σε σχέση με τη συγκέντρωση πρωτεϊνών του παρασκευάσματος των υποδοχέων. Στο πείραμα αυτό, ένα παρασκεύασμα μεμβρανών που αραιώθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις με βάση το πρωτεϊνικό του περιεχόμενο (άξονας x), επωάζεται με σταθερή συγκέντρωση ραδιοσημασμένου προσδέτη και προσδιορίζεται η ειδική σύνδεση (άξονας y).

Καμπύλη κορεσμού (saturation curve)Όταν ένα παρασκεύασμα υποδοχέων επωάζεται με ένα ραδιοσημασμένο προσδέτη (όπου

έχουμε φροντίσει βεβαίως να βρισκόμαστε στη γραμμική περιοχή απόκρισης με βάση τη καμπύλη απόκρισης του παρασκευάσματος των υποδοχέων) μετά από κάποιο χρονικό διάστημα επέρχεται ισορροπία, που περιγράφεται από την εξίσωση:

R + L RL

Σε ένα πείραμα κορεσμού, μετράμε την ποσότητα του συμπλόκου υποδοχέα - ραδιενεργού προσδέτη (RL, ή B, bound) ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του ελεύθερου ραδιενεργού προσδέτη (L, ligand ή F, free). Οι παράμετροι που λαμβάνονται είναι η συγγένεια, προσδέτη -υποδοχέα, η οποία εκφράζεται συνήθως με τη σταθερά αποδέσμευσης Kd (dissociation constant) και ο μέγιστος αριθμός των θέσεων σύνδεσης, Bmax (maximal binding).

Η μαθηματική εξίσωση που συνδέει τη συγκέντρωση του συνδεδεμένου σημασμένου προσδέτη στον υποδοχέα (B) με τη συγκέντρωση του ελεύθερου – ασύνδετου προσδέτη (F) είναι η:

B=B max FK d+F

Η καμπύλη είναι υπερβολή της μορφής y = α x

β+x , και απεικονίζεται στην Εικόνα 3.6.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΌΣ ΤΗΣ ΚΑΜΠΎΛΗΣ ΚΟΡΕΣΜΟΎ

Είδαμε ότι ένα από τα κριτήρια αναγνώρισης ενός υποδοχέα και διαφοροποίησής του από έναν απλό δέκτη, είναι ο κορεσμός της ειδικής σύνδεσης (RL*) παρά τη συνεχιζόμενη αύξηση του ραδιενεργού προσδέτη (L*). Αυτό υποδηλώνει ότι με περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης του προσδέτη, δεν αυξάνεται η σύνδεση διότι απλά δεν υπάρχουν άλλα

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση

(pM

)

[Παρασκεύασμα υποδοχέων] mg/ml


διαθέσιμα μόρια υποδοχέα. Αντίθετα, η μη ειδική σύνδεση (ΧL*) αυξάνεται γραμμικά με την αύξηση της συγκέντρωσης του L*.

Για να πραγματοποιήσουμε την καμπύλη κορεσμού (saturation curve) του υποδοχέα από τον ραδιενεργό προσδέτη προσθέτουμε στο ομογενοποίημα αυξανόμενες συγκεντρώσεις ραδιενεργού προσδέτη (0,1 – 10 nM), παρουσία ή απουσία μιας σταθερής υψηλής συγκέντρωσης (π.χ. 1 μΜ) μη ραδιενεργού προσδέτη, ο οποίος διαθέτει υψηλή συγγένεια για τον συγκεκριμένο υποδοχέα

Εικόνα 3.6 Γραφική παράσταση της καμπύλης κορεσμού. Στον άξονα των x τοποθετείται η συγκέντρωση του ελεύθερου ραδιενεργού προσδέτη [F] και στον άξονα των y η ειδική σύνδεση (δηλαδή η συγκέντρωση των υποδοχέων). H τιμή τoυ [F] που αντιστοιχεί στο μισό αριθμό των ολικών υποδοχέων αντιπροσωπεύει την Κd (στο παράδειγμα η Kd = 1nM).

Οι τιμές της συνδεδεμένης ραδιενέργειας που προκύπτουν μετά από μέτρηση των ραδιενεργών διασπάσεων (σε counts per minute, cpm) σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού (liquid scintillation counter) τοποθετούνται στον άξονα των y, και οι διάφορες συγκεντρώσεις του ραδιενεργού προσδέτη (0,1 – 10 nM) στον άξονα των x. Χωρίς την προσθήκη μη ραδιενεργού προσδέτη προκύπτει η καμπύλη της ολικής σύνδεσης (ΒT: total binding), καθώς ο ραδιενεργός προσδέτης συνδέεται εκτός από τους υποδοχείς και σε μη ειδικές θέσεις σύνδεσης, ενώ παρουσία μη ραδιενεργού προσδέτη προκύπτει η ευθεία της μη ειδικής σύνδεσης, καθώς ο μη ραδιενεργός προσδέτης έχει καταλάβει όλους τους υποδοχείς. Από τη διαφορά των δύο τιμών προκύπτει η ειδική σύνδεση RL* (Β), η οποία σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του L* (F) δίνει την καμπύλη ειδικής σύνδεσης ή καμπύλη κορεσμού (Εικόνα 3.7).

Στη συνέχεια, οι τιμές της δεσμευμένης ραδιενέργειας μετατρέπονται από cpm σε συγκέντρωση του υποδοχέα. Από τη νέα καμπύλη κορεσμού που θα προκύψει (στον άξονα των x θα βρίσκονται οι συγκεντρώσεις του ραδιενεργού προσδέτη, ενώ στον άξονα των y οι συγκεντρώσεις του υποδοχέα), μπορούμε να υπολογίσουμε εύκολα τη συγγένεια (affinity) του προσδέτη για τον υποδοχέα, η οποία αντιπροσωπεύεται από την Κd (Dissociation constant: σταθερά αποδέσμευσης).

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση

(%)

100

50

[Ελεύθερος Ραδιοπροσδέτης, F] (nM)


Εικόνα 3.7 Γραφική παράσταση της καμπύλης ειδικής σύνδεσης ή καμπύλης κορεσμού, της καμπύλης ολικής σύνδεσης και της ευθείας της μη ειδικής σύνδεσης. Στον άξονα των x τοποθετούμε τη συγκέντρωση του ελεύθερου ραδιενεργού προσδέτη (Free) και στον άξονα των y τη δεσμευμένη ραδιενέργεια (Bound).

Αντιστρεπτή σύνδεση προσδέτη – υποδοχέα και υπολογισμός της συγγένειας (Κd)

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η δέσμευση του προσδέτη (L, ligand) στον υποδοχέα του (R: receptor) είναι μια αντιστρεπτή αντίδραση:

R + L RL

Η ταχύτητα δημιουργίας του συμπλόκου προσδέτη-υποδοχέα (RL):

v1 = k1[R][L]

H ταχύτητα αποδέσμευσης (dissociation) του προσδέτη από τον υποδοχέα:

v2 = k2[RL]

Στην κατάσταση ισορροπίας ν1 = ν2 k1[R][L] = k2[RL]

Στην κατάσταση ισορροπίας, ο συνολικός αριθμός των υποδοχέων (RT: Total Receptors) είναι το άθροισμα των ελεύθερων υποδοχέων (R) και των δεσμευμένων (RL):

Η Κd (dissociation constant) είναι η σταθερά αποδέσμευσης

του συμπλόκου RL σε R και L

[ R ][ L ][RL ]

= k 2

k 1 = Kd


[RT] = [R] + [RL] → [R] = [RT] - [RL]

επίσης [RL] Kd =[R][L] }

[RL] Kd = ([RT] - [RL])[L] = [RT][L] - [RL][L] [RL] Kd + [RL][L] = [RT][L] [RL](Kd +[L]) = [RT][L]

[RL] =

[ R T ] [ L ]K d+[ L ] ή Β =

B max FK d+F , όπου Β=[RL], Βmax=[RT], F=[L]

Οι συμβολισμοί Β (bound), Βmax και F (free) είναι αυτοί που έχουν επικρατήσει στη

βιβλιογραφία. H γραφική παράσταση της εξίσωσης αυτής είναι μια υπερβολή y =

axβ+x , και

μοιάζει με την σχέση Michaelis-Menten για την ταχύτητα μιας ενζυματικής αντίδρασης.

Β = Bmax F K d+F (εξίσωση κορεσμού) Vo =

Vmax[ S ] K m+[ S ] (Michaelis – Menten)

Μια σημαντική στιγμή της καμπύλης είναι όταν F = Kd, όταν δηλ. ο αριθμός των αδέσμευτων υποδοχέων [R] ισούται με τον αριθμό των δεσμευμένων [RL], ή Β (bound). Στην ειδική αυτή περίπτωση η εξίσωση γίνεται:

Β = B max FF+F

=12

B max

ΑΝΆΛΥΣΗ ΚΑΤΆ SCATCHARD (πιο σπάνια αναφέρεται και ως ανάλυση ROSENTHAL)

Ο George Scatchard το 1948, μετέτρεψε την εξίσωση της καμπύλης κορεσμού, Β=

B max FK d+F

σε μια γραμμική σχέση, από την οποία εύκολα, και με ακρίβεια, μπορούμε να υπολογίσουμε το συνολικό αριθμό των υποδοχέων (Bmax):

Η Κd είναι ίση με τη συγκέντρωση του προσδέτη [F] όταν αυτός καταλαμβάνει τους

μισούς από τον συνολικό αριθμό των υποδοχέων

Εικόνα 3.8 Ο George Scatchard (1892-1973), μετέτρεψε την εξίσωση της καμπύλης κορεσμού σε γραμμική σχέση.


BF

=[ R ]K d

=−[RL ]K d

+ B max

K d

Η γραφική παράσταση αυτής της εξίσωσης είναι μια ευθεία γραμμή y = αx+β. Το σημείο τομής της ευθείας στον άξονα

των x (όταν δηλ. ΒF = 0) είναι το Bmax, ενώ η Kd ισούται με το

αντίθετο αντίστροφο της κλίσης της ευθείας Scatchard, που

είναι −1K d

.

Εικόνα 3.9 Γραφική παράσταση της σχέσης Scatchard.Στον άξονα των x βρίσκεται η συγκέντρωση του δεσμευμένου ραδιενεργού προσδέτη (Β, Bound), ενώ στον άξονα των y τοποθετούμε το κλάσμα της συγκέντρωσης των δεσμευμένων προς τους αδέσμευτους προσδέτες (B/F, Bound/Free). Το σημείο τομής της ευθείας στον άξονα των x είναι η Bmax, ενώ από την κλίση της ευθείας (-1/Κd) υπολογίζουμε την Κd.

Η σχέση του Scatchard ισχύει μόνο στην περίπτωση που ο ραδιενεργός προσδέτης είναι τόσο εξειδικευμένος ώστε να δεσμεύεται σ’ένα μόνο είδος υποδοχέων. Στην περίπτωση που το μόριο δεσμεύεται σε δύο ή περισσότερα είδη υποδοχέων, οι οποίοι έχουν διαφορετικές Κd

και Βmax, η γραφική παράσταση της σχέσης Scatchard δεν είναι ευθεία γραμμή, αλλά κοίλη υπερβολή. Η σχέση του Scatchard είναι λοιπόν επιπλέον χρήσιμη στην ανακάλυψη νέων υποτύπων του υποδοχέα.

[Δεσμευμένος ραδιοπροσδέτης, Β] (nM)

Δεσμ

ευμέ

νος/

ελεύ

θερο

ς (

Β/F)

BF

=- 1K d

B+ B max

K d

Η Κd είναι ίση με το αντίθετο-αντίστροφο της κλίσης της γραμμικής συνάρτησης του

Β/F ως προς το Β

Δεσμευμένος προσδέτης

Δεσμευμένος/ελεύθερος (Β/F)


ΔΥΟ ΕΙΔΗ ΑΝΕΞΑΡΤΗΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ: Στην περίπτωση που ο ραδιενεργός προσδέτης δεσμεύεται σε δύο υποδοχείς (R1, R2) που είναι ανεξάρτητοι και διαφορετικοί μεταξύ τους ισχύουν οι σχέσεις:

R1 + L R1L Kd1 = [R1L] =

R2 + L R2L Kd2 =

Β = [R1L] + [R2L]

Αντικαθιστώντας προκύπτει: B = + ή B =

[ B max1 ][ F ]K d1+[ F ] +

[ B max2 ][ F ]K d2+[ F ]

Η γραφική παράσταση της σχέσης Scatchard είναι μια κοίλη υπερβολή με δύο ασύμπτωτες, η καθεμιά από τις οποίες περιγράφει τα χαρακτηριστικά μεγέθη της ειδικής σύνδεσης (Κ d, Bmax) του κάθε είδους υποδοχέων.

Για τον R1:

Για τον R2: Από την κλίση της κάθε ασύμπτωτης προκύπτουν οι τιμές των δύο Κd (-1/kd1, -1/Kd2) και από τα σημεία τομής τους στον άξονα των χ προκύπτουν οι δύο Βmax (Bmax1, Bmax2). Η γραμμή με τη μεγαλύτερη κλίση (Bmax1) αντιστοιχεί στη θέση σύνδεσης με υψηλότερη συγγένεια.

Εικόνα 3.10 Γραφική παράσταση της σχέσης Scatchard, στην περίπτωση που o ραδιενεργός προσδέτης δεσμεύεται σε δύο διαφορετικά είδη υποδοχέων (R1, R2). Στην περίπτωση αυτή, από την εξίσωση Scatchard προκύπτει μια κοίλη υπερβολή, οι δύο ασύμπτωτες της οποίας περιγράφουν τα χαρακτηριστικά μεγέθη των δύο υποδοχέων (Κd1 και Bmax1, Κd2 και Bmax2).

Δύο παραδείγματα ειδικής σύνδεσης υποδοχέα - προσδέτη

1o ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: ΣΎΝΔΕΣΗ ΤΗΣ ΣΕΡΟΤΟΝΊΝΗΣ (5-ΗΤ) ΣΤΟΥΣ

ΥΠΟΔΟΧΕΊΣ ΤΗΣ


Για τη μελέτη της ειδικής σύνδεσης (specific binding) της σεροτονίνης (5-ΗΤ) στους υποδοχείς της, χρησιμοποιούμε [3Η]5-ΗΤ με ειδική ραδιενέργεια 16,2 Ci/mmol και ομογενοποίημα εγκεφαλικού φλοιού. Κάθε δοκιμαστικός σωλήνας περιέχει 2 mg πρωτεΐνης σε τελικό όγκο αντίδρασης 1ml. Η μη ειδική σύνδεση προσδιορίζεται παρουσία 10 -5Μ μη σημασμένης 5-ΗΤ. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες με το μίγμα της αντίδρασης επωάζονται στους 22oC για 30 min. Ακολουθεί διήθηση και μέτρηση σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού (LSC). Οι μετρήσεις δίνονται στον ακόλουθο πίνακα δεδομένων.

[[33Η]5-ΗΤΗ]5-ΗΤ (F)(F)

(nM)(nM)

Ολική σύνδεσηΟλική σύνδεση(TΒ)(TΒ)

(cpm)(cpm)

Μη ειδική σύνδεσηΜη ειδική σύνδεση(NSB)(NSB)(cpm)(cpm)

1 1717 4321.5 2241 6482 2655 865

2.5 3163 10813 3781 12794 4451 17295 5023 21616 5571 25947 6502 30268 7018 34589 7491 389110 8023 4323

Με βάση τα δεδομένα αυτά, καθώς και ότι 1Ci = 2,2 1012dpm και 1cpm = 2dpm, θα παρασταθεί γραφικά η καμπύλη κορεσμού και θα υπολογιστούν οι κινητικές παράμετροι της σύνδεσης (Bmax και Kd).

Από τις τιμές του προηγούμενου πίνακα των μετρήσεων κατασκευάζεται ο επόμενος πίνακας αποτελεσμάτων, από όπου προκύπτει η ειδική σύνδεση (SB, specific binding: TΒ, total binding – NSB, non specific binding) αλλά και η τιμή B/F (που αντιστοιχεί στον άξονα ψ της ανάλυσης κατά Scatchard).

Βmax

KD SΒ

100005000

T

F (nM) B/

F (x

10

3 ) Bmax-1/KD

B (cpm x 103)

0 2 4 6

2

1

a. β.

F F TTBB NSBNSB SB = TSB = TBB-NSB-NSB B/FB/F1 1717 432 1285 12851.5 2241 648 1593 10622 2655 865 1790 8952.5 3163 1081 2082 8333 3781 1279 2502 8344 4451 1729 2722 6815 5023 2161 2862 5726 5571 2594 2977 4967 6502 3026 3476 4978 7018 3458 3560 4459 7491 3891 3600 40010 8023 4323 3700 370


Καμπύλη κορεσμού (α) και ανάλυση κατά Scatchard (β) βάση των τιμών του πίνακα αποτελεσμάτων.

Από την καμπύλη κορεσμού, αλλά και από την ανάλυση κατά Scatchard προκύπτει πως Bmax ~ 5000 cpm 10000 dpm = 104 dpm

Επειδή 2,2 ∙ 1012dpm είναι 1Ci 104dpm είναι χ = 0,45∙10-8 Ci

Όμως, από την ειδική ραδιενέργεια της [3Η]5-ΗΤ προκύπτει πως:

Τα 16,2 Ci υπάρχουν σε 10-3molΤα 0,45 ∙10-8 Ci υπάρχουν σε χ = 0,27∙10-12Μ ή 0,27 pM = 27 fmol.

Άρα, τα 27 fmols υπάρχουν σε 2 mg πρωτεΐνης (ανά δοκιμαστικό σωλήνα), οπότε τελικά έχουμε 13,5 fmol/mg πρωτεΐνης. H Kd προσδιορίζεται γραφικά από τις προηγούμενες καμπύλες και έχει τιμή περίπου 3 nM.

2o ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: OΙ ΕΠΙΠΤΏΣΕΙΣ ΤΗΣ ΧΟΡΉΓΗΣΗΣ ΜΡΤΡ

Η ΜΡΤΡ (1-μεθυλο-4-φαινυλο-1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη) είναι μια ουσία που καταστρέφει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες που καταλήγουν στο ραβδωτό σώμα. Προκαλεί όμοια κλινικά συμπτώματα με αυτά της νόσου του Parkinson.

Η ουσία χορηγείται σε ποντίκια για 10 ημέρες (30mg/kg/ημέρα) και ακολούθως μετρούνται οι ντοπαμινεργικοί μετασυναπτικοί υποδοχείς D2 του ραβδωτού σώματος στα ποντίκια αυτά καθώς και σε ποντίκια – μάρτυρες χρησιμοποιώντας ως ειδικό προσδέτη τη [3Η]σπιπερόνη. Η μη ειδική σύνδεση γίνεται με 10-5Μ μη σημασμένης σπιπερόνης. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων δίνονται στον παρακάτω πίνακα δεδομένων.

Με βάση τον πίνακα αυτό, προκύπτουν τα αποτελέσματα σε ένα διάγραμμα ανάλυσης κατά Scatchard.

Ποντίκια – μάρτυρες Ποντίκια με ΜΡΤΡ[3Η] σπιπερόνη

(nM)Ολική σύνδεση

(fmol/mg)Μη ειδική σύνδεση

(fmol/mg)Ολική σύνδεση

(fmol/mg)Μη ειδική σύνδεση

(fmol/mg)0.1 3.9 0.2 5.4 0.20.3 8.1 0.5 11.4 0.5

Βmax/2

NSBΒ

(cpm

)

0 5 10


0.4 9.5 0.7 13.3 0.70.6 11.5 1 16.1 1.11 14 1.6 19.3 1.72 17.4 3.2 23.7 3.4

Όπως και στην προηγούμενη άσκηση κατασκευάζεται πίνακας αποτελεσμάτων με τις τιμές της ειδικής σύνδεσης (SB) και B/F.

Ποντίκια – μάρτυρες Ποντίκια με ΜΡΤΡ

F T - NSB = SB B/F T - NSB = SB B/F0.1 3.9 - 0.2 = 3.7 37 5.4 - 0.2 = 5.2 520.3 8.1 - 0.5 = 7.6 25 11.

4- 0.5 = 10.

936.3

0.4 9.5 - 0.7 = 8.8 22 13.3

- 0.7 = 12.6

31.5

0.6 11.5 - 1 = 10.5

17.5 16.1

- 1.1 = 15.0

25

1 14 - 1.6 = 12.4

12.4 19.3

- 1.7 = 17.6

17.6

2 17.4 - 3.2 = 14.2

7.1 23.7

- 3.4 = 20.3

10.1

Καμπύλη κορεσμού (α) και ανάλυση κατά Scatchard (β) των τιμών του πίνακα αποτελεσμάτων για τα ποντίκια-μάρτυρες ( ) και αυτά που εκτέθηκαν στη δράση του ΜΡΤΡ ( ).

Παρατηρείται πως η χορήγηση του ΜΡΤΡ δεν επηρέασε τη διαμόρφωση των υποδοχέων, αφού η τιμή της Kd παρέμεινε ίδια και στους μάρτυρες, αύξησε όμως τον αριθμό τους στο ραβδωτό σώμα. Αυτό είναι αποτέλεσμα της up-regulation των υποδοχέων λόγω μείωσης της συγκέντρωσης της ντοπαμίνης που απελευθερώνεται στο ραβδωτό σώμα καθώς έχουν καταστραφεί οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες. Ο οργανισμός προσπαθεί να ανταπεξέλθει στην έλλειψη της ντοπαμίνης με αύξηση του αριθμού των υποδοχέων της.

0 1 2

20

10

0F (nM) 0 5 10 15 20

25

50

25

0

B (pmol/mg)

B/F

KD1=0.4 nMKD2=0.4

Bmax2Bmax1

α β

Εικόνα 3.12 Ο Archibald Vivian Hill (1886-1977), πήρε το βραβείο Nobel Ιατρικής, το 1922. Ο συντελεστής του Hill (n) φανερώνει το βαθμό συνέργιας μεταξύ των θέσεων σύνδεσης ενός υποδοχέα.


Συνέργια (cooperativity) – Συντελεστής του Hill: πόσες θέσεις σύνδεσης υπάρχουν σε έναν υποδοχέα

Στην περίπτωση που ο υποδοχέας είναι μακρομόριο και αποτελείται από περισσότερες υπομονάδες, είναι πιθανό να υπάρχουν περισσότερες από μία θέσεις σύνδεσης για τον ενδογενή προσδέτη. Για παράδειγμα, ο υποδοχέας GABAA αποτελείται από 5 υπομονάδες (α2β2γ) και έχει δύο θέσεις σύνδεσης για τον ενδογενή νευροδιαβιβαστή γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA), μία σε κάθε α-υπομονάδα. Σε αυτήν την περίπτωση, όταν η σύνδεση του προσδέτη στη μία θέση επηρεάζει τη συγγένεια των άλλων θέσεων, η σύνδεση ονομάζεται συνεργιακή. Η συνέργια μπορεί να είναι θετική συνέργια (positive cooperativity), όταν η σύνδεση του προσδέτη στη μία θέση διευκολύνει, επιταχύνει την περαιτέρω σύνδεσή του στις άλλες θέσεις, αυξάνει δηλαδή τη συγγένεια των άλλων θέσεων, ή αρνητική συνέργια (negative cooperativity) όταν επιβραδύνει, δυσκολεύει τη σύνδεση στις άλλες θέσεις, μειώνει δηλαδή τη συγγένεια των άλλων θέσεων σύνδεσης.

Στις περιπτώσεις συνέργιας, η καμπύλη κορεσμού δεν είναι η γνωστή υπερβολή, αλλά μια σιγμοειδής καμπύλη.

Καμπύλη κορεσμού: ΥΠΕΡΒΟΛΗ Καμπύλη κορεσμού: ΣΙΓΜΟΕΙΔΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗ

Εικόνα 3.11 Όταν η σύνδεση του προσδέτη στον υποδοχέα του δεν επηρεάζει την περαιτέρω σύνδεση των υπολοίπων μορίων, τότε η καμπύλη της ειδικής σύνδεσης – καμπύλη κορεσμού είναι μια υπερβολή (α). Όταν η σύνδεση του προσδέτη στον υποδοχέα είναι συνεργιακή, η καμπύλη ειδικής σύνδεσης είναι σιγμοειδής (β).

Το 1910, ο Archibald Hill (1886-1977), βραβείο Nobel Ιατρικής, το 1922, προσπάθησε να ερμηνεύσει την σιγμοειδή καμπύλη που προέκυπτε από τη σύνδεση του Ο2 στην αιμοσφαιρίνη, η οποία αποτελείται από 4 υπομονάδες. Θεώρησε την περίπτωση όπου ο υποδοχέας έχει δύο θέσεις σύνδεσης για τον προσδέτη, οι οποίες καλύπτονται ταυτόχρονα. Τότε ισχύουν οι παρακάτω εξισώσεις:

R + 2L RL2 άρα η Κd =

Aν λογαριθμίσουμε: log(Kd) = 2log[L] - log log

= 2log[L] - log(Kd)

Oπως ξέρουμε: [RT] = [RL2] + [R] [R] = [RT] - [RL2]

Αντικαθιστώντας προκύπτει:


log

[RL2 ][ R T ]−[ RL2 ] = 2log[L] - log(Kd)

Aν γενικεύσουμε την εξίσωση αυτή για n θέσεις σύνδεσης (n του Hill) και αντικαταστήσουμε όπου [RL]: B (Bound), [L]: F (Free) και [RT]: Bmax, προκύπτει η εξίσωση του Ηill:

Η γραφική παράσταση αυτής της εξίσωσης είναι μια ευθεία γραμμή με κλίση n. Ο συντελεστής n είναι ο δείκτης της συνέργειας. Όταν n = 1 δεν υπάρχει συνέργια, ο προσδέτης συνδέεται συναγωνιστικά και αντιστρεπτά, σε όλες τις θέσεις (εάν υπάρχουν περισσότερες από μια), δηλαδή η σύνδεση στη μία θέση σύνδεσης δεν επηρεάζει τη συγγένεια των υπολοίπων θέσεων στον υποδοχέα.Όταν ο n διαφέρει σημαντικά από τη μονάδα, σημαίνει ότι υπάρχει μια πιο πολύπλοκη αντίδραση ανάμεσα στον προσδέτη και τον υποδοχέα. Όταν n > 1, ο υποδοχέας περιέχει πάνω από μία θέση σύνδεσης, μεταξύ των οποίων υπάρχει αλληλεπίδραση. Επιπλέον η σύνδεση του προσδέτη επιταχύνει τη σύνδεση των υπολοίπων μορίων (υπάρχει θετική συνέργια). Όταν n < 1, ο υποδοχέας περιέχει πάνω από μία θέση σύνδεσης, και επιπλέον η σύνδεση του προσδέτη επιβραδύνει τη σύνδεση των υπολοίπων μορίων (υπάρχει αρνητική συνέργια). Εικόνα 3.13 Σταθερά του Ηill.

Η κλίση της ευθείας μας δίνει την n του Ηill, η οποία δείχνει σε πόσες θέσεις σύνδεσης του υποδοχέα συνδέεται ο προσδέτης. Αν n=1, συνδέεται σε μια θέση, οπότε δεν υπάρχει συνέργια. Αν n=2, συνδέεται σε δύο θέσεις σύνδεσης και αφετέρου η σύνδεση του προσδέτη επιταχύνει τη σύνδεση των υπολοίπων εφόσον πρόκειται για θετική συνέργια.Αν n=-2, συνδέεται σε δύο θέσεις σύνδεσης και αφετέρου η σύνδεση του προσδέτη επιβραδύνει τη σύνδεση των υπολοίπων εφόσον πρόκειται για αρνητική συνέργια.Το σημείο τομής της ευθείας του Hill με τον άξονα των x είναι ο logKd.

Καμπύλη κορεσμού Διάγραμμα του Hill

n=1

Log[F]

log = n log(F) - log(Kd) y = α x + β


Εικόνα 3.14 Συντελεστής του Hill ως δείκτης συνέργιας. Όταν δεν υπάρχει συνέργια, η καμπύλη κορεσμού είναι υπερβολή και ο συντελεστής του Hill, n = 1. Όταν υπάρχει συνέργια μεταξύ των θέσεων σύνδεσης του υποδοχέα, η καμπύλη κορεσμού είναι σιγμοειδής και ο συντελεστής του Hill, n≠1 (παράδειγμα n = 1,8 σημαίνει ότι υπάρχουν 2 θέσεις σύνδεσης που αλληλεπιδρούν).

Η σχέση δόσης – απόκρισης για τα φάρμακαΤο βιολογικό αποτέλεσμα ή απόκριση που προκαλεί ένα φάρμακο σε πειραματόζωα ή

ασθενείς αυξάνεται ευθέως ανάλογα με τη δόση. Ωστόσο, μετά από κάποιο σημείο αύξησης της δόσης, το βιολογικό αποτέλεσμα σταματά να αυξάνεται. Η σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του φαρμάκου και της δράσης του περιγράφεται από μια καμπύλη σε σχήμα υπερβολής. Η συγκέντρωση του φαρμάκου με την οποία πετυχαίνουμε το μισό της μέγιστης απόκρισης ονομάζεται EC50 (Effective concentration).

Εικόνα 3.15 Γραφική παράσταση της σχέσης που συνδέει τη συγκέντρωση του φαρμάκου με το αποτέλεσμα που προκαλεί (Α) και με τη σύνδεσή του στον υποδοχέα (Β). Η συγκέντρωση του φαρμάκου στην οποία έχουμε το μισό του μέγιστου αποτελέσματος είναι η EC50, ενώ η συγκέντρωση του φαρμάκου στην οποία έχουν καταληφθεί οι μισοί υποδοχείς καλείται Kd.


Την απόκριση ενός φαρμάκου μπορούμε να την μετρήσουμε: in vitro, μετρώντας την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μορίων που συνδέονται με

τον υποδοχέα, πχ την ενεργοποίηση της αδενυλοκυκλάσης (μετρώντας τα επίπεδα του cAMP), της φωσφολιπάσης C (μετρώντας τα επίπεδα της IP3), των πρωτεϊνικών κινασών (PKA, PKC…) αν πρόκειται για GPCRs, τη μετακίνηση ιόντων κατά μήκος της μεμβράνης αν πρόκειται για κανάλια, κλπ.

in vivo, μετρώντας την απόκριση σε φυσιολογικές λειτουργίες του πειραματόζωου, πχ την αύξηση της θερμοκρασίας του, της όρεξής του, της κινητικότητάς του, κλπ., ή στη συμπεριφορά του χρησιμοποιώντας ειδικά μοντέλα μέτρησης συμπεριφοράς.

Η σύζευξη υποδοχέα-τελεστή και οι εφεδρικοί υποδοχείςΌταν ένας υποδοχέας καταλαμβάνεται από έναν αγωνιστή, αλλάζει η διαμόρφωσή του στο

χώρο και ξεκινά η μεταγωγή σήματος, η απόκριση του υποδοχέα. Η διαδικασία μεταξύ της κατάληψης και της απόκρισης ονομάζεται σύζευξη. Το πόσο αποτελεσματική θα είναι η σύζευξη εξαρτάται από την αρχική αλλαγή στη στερεοδιάταξη του υποδοχέα. Συνεπώς, ένας πλήρης αγωνιστής οδηγεί στη μέγιστη σύζευξη.

Εικόνα 3.16 Πειραματική απόδειξη της ύπαρξης εφεδρικών υποδοχέων, με τη χρήση ενός αγωνιστή απουσία και παρουσία ενός μη αντιστρέψιμου ανταγωνιστή, σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις.

Απόκριση του αγωνιστή απουσία μη αναστρέψιμου ανταγωνιστή (Α), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων μη αναστρέψιμου ανταγωνιστή (Β, Γ, Δ, Ε). Στις περιπτώσεις Β και Γ παρατηρούμε ότι παρότι μεγάλο μέρος των υποδοχέων είναι κατειλημμένοι μη αντιστρεπτά, αυξάνοντας τη συγκέντρωση του αγωνιστή μπορούμε να πετύχουμε μέγιστη απόκριση. Στην περίπτωση Δ και Ε, όπου δεν υπάρχουν πλέον εφεδρικοί υποδοχείς και ο μη αντιστρεπτός ανταγωνιστής έχει αρχίσει να καταλαμβάνει και τους μη εφεδρικούς υποδοχείς, ο αγωνιστής, δεν μπορεί να πετύχει τη μέγιστη απόκριση. Σε αυτές τις δύο περιπτώσεις (Δ, Ε) η ΕC50 είναι περίπου ίδια με την KD.

[Γ] ΕC50 = KD [Δ, Ε]


Συνήθως, η Κd ενός αγωνιστή είναι ίση με την EC50. Δηλαδή, η ίδια συγκέντρωση του φαρμάκου που καταλαμβάνει τους μισούς υποδοχείς, προκαλεί τη μισή απόκριση.

Παρατηρήθηκαν όμως περιπτώσεις, όπου η Κd ήταν πολύ μεγαλύτερη από την EC50. Δηλαδή, η μισή της μέγιστης απόκρισης μπορεί να επιτευχθεί σε μια συγκέντρωση στην οποία ο αγωνιστής καταλαμβάνει πολύ λιγότερους από τους μισούς υποδοχείς. Συνεπώς, καταλαμβάνοντας μια μικρή μόνο μερίδα υποδοχέων έχουμε τη μέγιστη απόκριση. Για παράδειγμα, καταλαμβάνοντας μόνο το 10% των β-αδρενεργικών υποδοχέων στην καρδιά έχουμε τη μέγιστη απόκριση του καρδιακού μυός στις κατεχολαμίνες. Το γεγονός αυτό εξηγήθηκε με την ύπαρξη εφεδρικών υποδοχέων (spare receptors).

Η ύπαρξη εφεδρικών υποδοχέων, σε πειραματικό επίπεδο, αποκαλύπτεται με τη χρήση μη αντιστρεπτών ανταγωνιστών, οι οποίοι παρεμποδίζουν τη σύνδεση του αγωνιστή με ένα ποσοστό των υποδοχέων.

Εικόνα 3.17 Ύπαρξη ή όχι εφεδρικών υποδοχέων. Στην περίπτωση Α δεν υπάρχουν εφεδρικοί υποδοχείς, οπότε η συγκέντρωση του φαρμάκου που καταλαμβάνει τους μισούς υποδοχείς (2 από τους 4) είναι η ίδια που απαιτείται για τη μισή απόκριση (2 από τους 4 συζευγμένους υποδοχείς). Στην περίπτωση Β υπάρχουν εφεδρικοί υποδοχείς (συνολικός αριθμός υποδοχέων: 40), οπότε η συγκέντρωση του φαρμάκου που καταλαμβάνει τους μισούς υποδοχείς (20 από τους 40) είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή που απαιτείται για τη μισή απόκριση (2 από τους 4 συζευγμένους υποδοχείς).

Τι είναι όμως οι εφεδρικοί υποδοχείς; Οι εφεδρικοί υποδοχείς δεν διαφέρουν ποιοτικά από τους μη εφεδρικούς. Δεν είναι κρυμμένοι ή μη διαθέσιμοι και όταν καταλαμβάνονται είναι σε θέση να συζευχθούν και να αποκριθούν.

Με ποιον τρόπο λοιπόν μπορούμε να εξηγήσουμε τον λόγο της ύπαρξής τους; Μια υπόθεση είναι ότι η συγκέντρωση ή η ποσότητα ενός κυτταρικού συστατικού περιορίζει τη σύζευξη της κατάληψης των υποδοχέων με την απόκριση. Για παράδειγμα, έστω ότι ένας υποδοχέας συνδέεται με ένα ένζυμο ενός σηματοδοτικού μονοπατιού, το οποίο προκαλεί μια απόκριση στο κύτταρο, και έστω ότι υπάρχουν 40 μόρια υποδοχέων αλλά μόνο 4 μόρια του ενζύμου είναι απαραίτητα για την πρόκληση πλήρους απόκρισης. Οι περισσότεροι υποδοχείς είναι εφεδρικοί. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η Κd (η συγκέντρωση του αγωνιστή που καταλαμβάνει τους μισούς υποδοχείς - 20) να είναι πολύ μεγαλύτερη από την EC50 (η


συγκέντρωση του αγωνιστή που πετυχαίνει τη μισή απόκριση, για την οποία απαιτούνται 2 υποδοχείς). Στην περίπτωση αυτή: EC50 << Kd

Συναγωνιστικοί και μη συναγωνιστικοί (αλλοστερικοί) ανταγωνιστέςΟι ανταγωνιστές ενός υποδοχέα συνδέονται με αυτόν αλλά δεν τον ενεργοποιούν,

εμποδίζουν τη σύνδεση των αγωνιστών με τους υποδοχείς τους και συνεπώς εμποδίζουν τη δράση των αγωνιστών. Οι ανταγωνιστές μόνοι τους, δεν έχουν καμία βιολογική δράση. Συνεπώς για να διακρίνουμε αν ένα φάρμακο δρα ως αγωνιστής ή ανταγωνιστής απαιτούνται πειράματα δόσης – απόκρισης παρουσία αγωνιστή, και όχι πειράματα σύνδεσης. Με τα πειράματα σύνδεσης μπορούμε να υπολογίσουμε μόνο στη συγγένεια του φαρμάκου για τον υποδοχέα του (Kd), όχι το φυσιολογικό του ρόλο.

Εικόνα 3.18 Όταν ένα φάρμακο μιμείται τη δράση του ενδογενούς προσδέτη, δηλαδή συνδέεται στην ίδια θέση σύνδεσης και προκαλεί το ίδιο αποτέλεσμα ονομάζεται αγωνιστής. Όταν το φάρμακο απλώς εμποδίζει τη δράση του ενδογενούς προσδέτη ή του αγωνιστή) χωρίς να έχει από μόνο του καμία βιολογική δράση ονομάζεται ανταγωνιστής.

Οι ανταγωνιστές διακρίνονται σε δυο κατηγορίες: τους συναγωνιστικούς ανταγωνιστές, οι οποίοι συνδέονται στην ίδια θέση σύνδεσης με τον αγωνιστή και τους μη συναγωνιστικούς ή αλλοστερικούς ανταγωνιστές, οι οποίοι συνδέονται σε διαφορετική θέση σύνδεσης από αυτή

Ο ενδογενής προσδέτης συνδέεται στον υποδοχέα του και παράγει ένα αποτέλεσμα.

Όταν ένα φάρμακο δρα ως ανταγωνιστής έχει ανάλογη δομή με τον αγωνιστή, συνδέεται στον υποδοχέα στην ίδια θέση σύνδεσης, αλλά η σύνδεση δεν είναι ικανή ώστε ο υποδοχέας να ενεργοποιηθεί. Συνεπώς, ο ανταγωνιστής απλώς εμποδίζει τη σύνδεση του αγωνιστή και άρα τη δράση του.

Όταν ένα φάρμακο δρα ως αγωνιστής συνδέεται στον υποδοχέα στην ίδια θέση σύνδεσης με τον ενδογενή προσδέτη, και παράγει το ίδιο με αυτόν αποτέλεσμα.

ΕC50 ΕC50

Φυσιολογική απόκριση (%)

Δόση της μορφίνης Δόση της μορφίνης


του αγωνιστή, μεταβάλλουν τη διαμόρφωση του υποδοχέα και εμποδίζουν τη σύνδεση του αγωνιστή.

Εικόνα 3.19 Καμπύλη δόσης-απόκρισης ενός αγωνιστή (μορφίνης), απουσία ή παρουσία

ενός συναγωνιστικού ανταγωνιστή (αριστερά) και μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή (αριστερά). Όταν ο ιστός, πριν τη χορήγηση μορφίνης, προεπωαστεί με υψηλή σταθερή συγκέντρωση ενός συναγωνιστικού ανταγωνιστή (ο οποίος συνδέεται στην ίδια θέση σύνδεσης με τη μορφίνη), απαιτούνται υψηλότερες δόσεις μορφίνης για να επιτευχθεί το μέγιστο αποτέλεσμα. Όταν όμως προεπωαστεί με υψηλή σταθερή συγκέντρωση ενός μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή (ο οποίος δεν συνδέεται στην ίδια θέση σύνδεσης με τη μορφίνη), τότε η διαμόρφωση του υποδοχέα μεταβάλλεται και η μορφίνη, ακόμη και σε υψηλές δόσεις δεν μπορεί να επιφέρει το μέγιστο αποτέλεσμα.

Εικόνα 3.20 Ο συναγωνιστικός ανταγωνιστής συνδέεται στην ίδια θέση σύνδεσης με τον φυσικό προσδέτη (ή τον αγωνιστή) και εμποδίζει τη σύνδεσή του στον υποδοχέα, και άρα τη δράση του. Προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων συναγωνιστικού αγωνιστή, αναστέλλει το 100% του αποτελέσματος του αγωνιστή. Ο μη συναγωνιστικός ανταγωνιστής συνδέεται σε διαφορετική θέση σύνδεσης και αλλάζοντας τη διαμόρφωση του υποδοχέα εμποδίζει τη σύνδεση του φυσικού προσδέτη. Προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων μη συναγωνιστικού αγωνιστή, δεν μπορεί αναστείλει το 100% του αποτελέσματος του αγωνιστή.

Σε μια καμπύλη δόσης - απόκρισης, προεπώαση με συναγωνιστικό ανταγωνιστή, αυξάνει την EC50 του αγωνιστή (τη συγκέντρωση του αγωνιστή που προκαλεί το μισό της

Προεπώαση με συναγωνιστικό ανταγωνιστή Προεπώαση με

μη-συναγωνιστικό ανταγωνιστή

ΑνταγωνιστέςΣυναγωνιστικός ανταγωνιστής

Μη συναγωνιστικ

ός ανταγωνιστή

[συγκέντρωση φυσικού

προσδέτη][συγκέντρωση ανταγωνιστή]

[συγκέντρωση ανταγωνιστή]

Σύνδεση ανταγωνιστήΣύνδεση

ανταγων.

απόκρισηαπόκριση

Σύνδεση &

απόκριση


μέγιστης απόκρισης). Ωστόσο, ο αγωνιστής σε αυξημένη δόση μπορεί να προκαλέσει τη μέγιστη απόκριση, γιατί αγωνιστής και ανταγωνιστής συναγωνίζονται μεταξύ τους για την ίδια θέση σύνδεσης.

Εικόνα 3.21 Καμπύλες δόσης – απόκρισης ενός αγωνιστή, παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων συναγωνιστικού ανταγωνιστή. Εmax είναι η μέγιστη απόκριση του υποδοχέα. Παρατηρούμε ότι όταν ο ανταγωνιστής είναι συναγωνιστικός όσο και αν αυξήσουμε τη συγκέντρωσή του ([C] = KD έως 1000ΚD), ο αγωνιστής μπορεί να πετύχει μέγιστη απόκριση, σε υψηλότερες όμως συγκεντρώσεις. Η EC50 του αγωνιστή από 10-6Μ (απουσία συναγωνιστικού ανταγωνιστή) αυξάνεται σε 10-3Μ (όταν χρησιμοποιούμε συγκέντρωση ανταγωνιστή 1000 φορές την ΚD του).

Αντίθετα, όταν ο ιστός προεπωαστεί με μη συναγωνιστικό ανταγωνιστή, ο οποίος συνδέεται σε διαφορετική θέση σύνδεσης από τον αγωνιστή, ο αγωνιστής δεν μπορεί να προκαλέσει μέγιστη απόκριση όσο και αν αυξήσουμε τη συγκέντρωσή του.

Εικόνα 3.22 Καμπύλες δόσης – απόκρισης ενός αγωνιστή, παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή. Εmax είναι η μέγιστη απόκριση του υποδοχέα. Παρατηρούμε ότι όταν ο αναστολέας είναι μη συναγωνιστικός, όσο αυξάνουμε τη συγκέντρωσή του μειώνεται η μέγιστη απόκριση που μπορεί να προκαλέσει ο αγωνιστής, όσο κι αν αυξήσουμε τη δόση του.

Υπολογισμός της συγγένειας συναγωνιστικών ανταγωνιστών – Διάγραμμα Schild

log[Αγωνιστή], (nΜ)

Εmax

(%)

[C] = συγκέντρωση συναγωνιστικού ανταγωνιστή[C]= 0, χωρίς συναγωνιστικό αναστολέα[C]= Κd[C]= 10Kd[C]=100Kd[C]= 1000Kd

[C] = συγκέντρωση μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή[C]= 0, χωρίς μη συναγωνιστικό αναστολέα[C]= ΚD [C]= 10KD

[C]=100KD

[C]= 1000KD

Εικόνα 3.23 O Heinz Otto Schild (1906-1984) προσδιόρισε με ακρίβεια τη συγγένεια συναγωνιστικών ανταγωνιστών (pA2).


Χρησιμοποιώντας το διάγραμμα του Schild (Schild plot) μπορούμε να υπολογίσουμε τη συγγένεια (pA2) ενός συναγωνιστικού ανταγωνιστή. Το διάγραμμα του Schild αναφέρεται συχνά και ως pA2 ανάλυση. Για την κατασκευή του διαγράμματος Schild, απαιτείται πρώτα η κατασκευή των καμπυλών δόσης – απόκρισης ενός αγωνιστή, οι οποίες κατασκευάζονται παρουσία μιας ολοένα και μεγαλύτερης συγκέντρωσης του συναγωνιστικού ανταγωνιστή. Από τις καμπύλες αυτές υπολογίζουμε το λόγο Α΄/Α (Α΄είναι η EC50 του αγωνιστή παρουσία του συναγωνιστικού ανταγωνιστή Β, και Α η EC50 του αγωνιστή απουσία συναγωνιστικού ανταγωνιστή Β). Ο λόγος αυτός προσδιορίζεται για διάφορες συγκεντρώσεις του ανταγωνιστή. Στη συνέχεια στον άξονα των y τοποθετούμε τον log((A'/A) -1) και στον άξονα των x τον αρνητικό λογάριθμο της συγκέντρωσης του Β (-log[B]).

Εάν η σχέση μεταξύ του log ((A'/A) -1) και του -log B είναι ευθύγραμμη, με κλίση -1, φανερώνει ότι ο ανταγωνισμός είναι συναγωνιστικός και κατά συνέπεια, αγωνιστής και ανταγωνιστής συναγωνίζονται για την ίδια θέση σύνδεσης. Το σημείο τομής της ευθείας με τον άξονα των x προσδιορίζει την pA2 του

ανταγωνιστή, που είναι η σταθερά αποσύνδεσης στην κατάσταση ισορροπίας. Εάν η κλίση είναι ≠1, ο ανταγωνιστής είναι μη συναγωνιστικός, που σημαίνει ότι ο υποδοχέας διαθέτει πολλές θέσεις σύνδεσης, οι οποίες βρίσκονται σε αλληλεπίδραση. Το διάγραμμα του Schild έχει μακρά ιστορία στη Φαρμακολογία, καθώς όπως είδαμε στο 1ο Κεφάλαιο έπαιξε σημαντικό ρόλο στη λειτουργική εκτίμηση των ιδιοτήτων των υποδοχέων.

Εικόνα 3.24 Κατασκευή του διαγράμματος Schild και προσδιορισμός της συγγένειας του συναγωνιστικού ανταγωνιστή, με τη βοήθεια των καμπυλών δόσης – απόκρισης του αγωνιστή.

Μερικοί αγωνιστές


Με βάση τη μέγιστη φαρμακολογική απόκριση, η οποία παρατηρείται όταν είναι κατειλημμένοι όλοι οι υποδοχείς, οι αγωνιστές μπορούν να διακριθούν σε δυο κατηγορίες: τους μερικούς και τους πλήρεις αγωνιστές. Οι μερικοί αγωνιστές προκαλούν μια μικρότερη βιολογική απόκριση, μετά από πλήρη κατάληψη των υποδοχέων, από ότι οι πλήρεις αγωνιστές.

Εικόνα 3.25 Ένα φάρμακο μπορεί να δρα ως πλήρης αγωνιστής, όταν προκαλεί τη μέγιστη φυσιολογική απόκριση, ως μερικός αγωνιστής, όταν προκαλεί μικρότερη φυσιολογική απόκριση, ακόμη και μετά την πλήρη κατάληψη των υποδοχέων.

Πειράματα σύνδεσης έδειξαν ότι οι μερικοί αγωνιστές μπορούν να καταλάβουν όλες τις θέσεις των υποδοχέων, σε συγκεντρώσεις οι οποίες δεν μπορούν να προκαλέσουν μια μέγιστη απόκριση, συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρείται με τους πλήρεις αγωνιστές. Η ικανότητα κατάληψης όλων των υποδοχέων φαίνεται από το γεγονός ότι μπορούν να αναστείλουν πλήρως την απόκριση που προκαλούν οι πλήρεις αγωνιστές (Εικόνα 3.25Α).

Η αποτυχία των μερικών αγωνιστών να προκαλέσουν πλήρη απόκριση δεν οφείλεται ούτε στη μειωμένη τους συγγένεια με τον υποδοχέα. Αν και δεν μπορούμε να εξηγήσουμε με ακρίβεια τη δράση των μερικών αγωνιστών σε μοριακό επίπεδο, μπορεί να γίνει ευκολότερα κατανοητή δεχόμενοι ότι ο υποδοχέας μπορεί να πάρει τις εξής διαμορφώσεις: την αδρανή διαμόρφωση (R) και την ενεργή (R΄) με ή χωρίς προσδέτη (L).

Αυτό σημαίνει ότι ο υποδοχέας ταλαντεύεται ανάμεσα σε δυο διαμορφώσεις (αν και η συγκέντρωση της R΄ είναι πολύ χαμηλή) ακόμη και απουσία προσδέτη. Όταν ο προσδέτης

Φυσι

ολογ

ική

απόκ

ριση

των

οπ

ιοει

δών

Δεν πρέπει να ξεχνούμε ότι οι ανταγωνιστές δεν έχουν καμιά φυσιολογική απόκριση, όταν χρησιμοποιούνται μόνοι τους. Εμποδίζουν μόνο τη δράση του αγωνιστή.

Log[Οπιοειδούς]


είναι πλήρης αγωνιστής θα συνδεθεί με τη διαμόρφωση R΄ πολύ πιο ισχυρά (LR΄), ενώ ο μερικός αγωνιστής προτιμά να συνδεθεί με τον R΄ αλλά διατηρεί αρκετή συγγένεια και για τον R. Έτσι η σχετική αποτελεσματικότητα ενός μερικού αγωνιστή εξαρτάται από τις σχετικές συγγένειές του για τις δυο μορφές R και R΄. Οι ανταγωνιστές συνδέονται στους R με πολύ υψηλότερη συγγένεια από ότι στους R΄ και έτσι εξηγείται το γεγονός ότι δεν ενεργοποιούν τον υποδοχέα.

Εικόνα 3.26 Τρόπος δράσης των μερικών αγωνιστών.Α. Με μελέτες σύνδεσης αποδεικνύεται ότι ο μερικός αγωνιστής μπορεί να καταλάβει

το συνολικό αριθμό των υποδοχέων διότι μπορεί να πετύχει τη μέγιστη σύνδεση (-□-), την ίδια που πετυχαίνει ο πλήρης αγωνιστής και επιπλέον μπορεί να εκτοπίσει πλήρως τον πλήρη αγωνιστή από το συνολικό αριθμό των υποδοχέων (-■-).

Β. Όταν καθένα από τα δυο φάρμακα (πλήρης και μερικός) χρησιμοποιείται μεμονωμένα και μετράται η φυσιολογική απόκριση, ο μερικός αγωνιστής (-□-) ακόμη και σε μεγάλες συγκεντρώσεις δεν μπορεί να πετύχει την πλήρη απόκριση.

Γ. Όταν χρησιμοποιούμε μια συγκέντρωση του πλήρη αγωνιστή (-■-) και προσθέτουμε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του μερικού, παρατηρούμε ότι σταδιακά η απόκριση ελαττώνεται μέχρι να εξαφανιστεί τελείως, γιατί ο μερικός αγωνιστής μπορεί να καταλάβει όλους τους υποδοχείς. Με (-□-) συμβολίζεται η απόκριση μόνο στον μερικό αγωνιστή, σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Με (-▲-) συμβολίζουμε το άθροισμα των αποκρίσεων των δυο φαρμάκων, το οποίο σταδιακά μειώνεται, προσεγγίζοντας την τιμή που προκαλείται μόνο με το μερικό αγωνιστή.

Πειράματα συναγωνισμού (competition experiments) για τον προσδιορισμό της συγγένειας μη σημασμένου προσδέτη – αναστολέα


Τα πειράματα συναγωνισμού επιτρέπουν τον προσδιορισμό της συγγένειας ενός προσδέτη, του οποίου η ραδιοσήμανση είτε δεν είναι διαθέσιμη, είτε δεν είναι εφικτή, λόγω της απώλειας της φυσιολογικής του δράσης. Η βασική ιδέα είναι πως εάν στο παρασκεύασμα των υποδοχέων προστεθεί ένας μη ραδιενεργός προσδέτης - αναστολέας (I), ο οποίος συνδέεται με τον υποδοχέα R, αυτό θα οδηγήσει σε μικρότερο αριθμό υποδοχέων, διαθέσιμων για σύνδεση με το ραδιοπροσδέτη (L*), μειώνοντας τον πληθυσμό των συμπλόκων L*R. Ο προσδέτης I συναγωνίζεται με το ραδιοπροσδέτη L* για τη σύνδεση στον υποδοχέα.

Τα κύρια είδη συναγωνισμού – αναστολής της σύνδεσης του ραδιοπροσδέτη είναι τρία:

Συναγωνιστική αναστολή (competitive inhibition), όταν ο αναστολέας και ο ραδιοπροσδέτης συναγωνίζονται για την ίδια θέση σύνδεσης στον υποδοχέα. Αυτό σημαίνει πως η αναστολή αίρεται με αύξηση της συγκέντρωσης του ραδιοπροσδέτη.

Μη συναγωνιστική αναστολή (non competitive inhibition), όταν ο αναστολέας και ο ραδιοπροσδέτης συνδέονται στον ίδιο υποδοχέα αλλά σε διαφορετικές θέσεις. Η σύνδεση του ραδιοπροσδέτη σε αυτή την περίπτωση δεν αναστέλλεται πλήρως.

Ασυναγώνιστη αναστολή (uncompetitive inhibition), είναι μια θεωρητική περίπτωση, όπου ο αναστολέας συνδέεται μόνο αν έχει δημιουργηθεί το σύμπλοκο υποδοχέα -ραδιοπροσδέτη. Θεωρούμε σε αυτήν την περίπτωση ότι ο προσδέτης προκαλεί αλλαγή της διαμόρφωσης του υποδοχέα επιτρέποντας τη σύνδεση του αναστολέα.

O όρος εκτόπιση (displacement) που χρησιμοποιείται συχνά δεν είναι ο κατάλληλος γιατί ο αναστολέας (Inhibitor) δεν εκτοπίζει το ραδιοπροσδέτη L*, και οι δύο συναγωνίζονται για τις ίδιες θέσεις δέσμευσης του υποδοχέα R. Η αντίδραση που πραγματοποιείται έχει την εξής μορφή:

[R] +[L*] + [I] [RL*] + [RI]

Όταν η συγκέντρωση του ραδιοπροσδέτη [L*] είναι σταθερή και μεταβάλλουμε τη συγκέντρωση του συναγωνιστικού αναστολέα [Ι]

Όταν η συγκέντρωση του ραδιοπροσδέτη διατηρείται σταθερή και μεταβάλλουμε τη συγκέντρωση του «κρύου» αναστολέα Ι, τότε αύξηση της συγκέντρωσης του [Ι] σημαίνει αύξηση της συγκέντρωσης του συμπλόκου [RI] και ελάττωση της ειδικής σύνδεσης [RL*]. Όταν αυτή η ελάττωση φτάσει στο 50%, η συγκέντρωση του [Ι] που προκαλεί αυτή την ελάττωση ονομάζεται IC50 (inhibitory concentration of 50%). Άρα:

Για να προσδιορίσουμε την ΙC50 κατασκευάζουμε ένα διάγραμμα τοποθετώντας στον

άξονα των x το λογάριθμο της συγκέντρωσης του συναγωνιστικού αναστολέα log[I], και στον άξονα των y το επί τοις εκατό % της ειδικής σύνδεσης σταθερής συγκέντρωσης (ίσης με την Kd) του ραδιοπροσδέτη [RL*].

H IC50 είναι η συγκέντρωση του συναγωνιστικού αναστολέα [Ι], η οποία προκαλεί 50% ελάττωση της ειδικής σύνδεσης RL*


Εικόνα 3.27 Καμπύλη συναγωνιστικής αναστολής (competition curve). Στον άξονα y απεικονίζεται η ειδική σύνδεση του ραδιοπροσδέτη (ο οποίος προστίθεται σε σταθερή συγκέντρωση ίση με την Kd του) και στον άξονα x, η συγκέντρωση του αναστολέα. Η προβολή της τιμής της ειδικής σύνδεσης στο 50% δίνει την IC50. Στο παράδειγμα η IC50 είναι 3,4 ∙10-9Μ.

Εικόνα 3.28 Μείωση της ειδικής σύνδεσης ενός ραδιενεργού προσδέτη (100%) από τρεις διαφορετικούς συναγωνιστικούς αναστολείς (Α, Β, C), καθένας από τους οποίους έχει διαφορετική συγγένεια για τον υποδοχέα. Η συγγένεια του κάθε συναγωνιστικού αναστολέα δίνεται από την IC50 του. Όσο μικρότερη η IC50 τόσο μεγαλύτερη η συγγένεια. Ο Α εμφανίζει τη μεγαλύτερη συγγένεια (IC50 10-8Μ) και ο C τη μικρότερη (IC50 10-5Μ). Με τα πειράματα σύνδεσης δεν μπορούμε να ξέρουμε αν ο συναγωνιστικός αναστολέας (αναστολέας γιατί αναστέλλει τη σύνδεση του ραδιοπροσδέτη) έχει βιολογική δράση αγωνιστή ή ανταγωνιστή.

[Συναγωνιστικός αναστολέας], Μ

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση (%

)

IC50

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση (%

)

Log[συναγωνιστικού αναστολέα] (M)


Όπως είδαμε και για την τιμή της ΚD, η IC50 είναι δύσκολο να μετρηθεί με ακρίβεια, βάση της καμπύλης. Γι’ αυτό, στον άξονα των y αντί για το % της ειδικής σύνδεσης (%Β)

τοποθετείται ο log1

100-B . Στον άξονα των x παραμένει ο log[I].

Η νέα γραφική παράσταση ονομάζεται διάγραμμα logit-log και είναι μια ευθεία γραμμή από την οποία εύκολα και με ακρίβεια υπολογίζουμε την ΙC50.

Εικόνα 3.29 Διάγραμμα logit-log για τον υπολογισμό της IC50.

Όπως ο βαθμός συγγένειας του ραδιοπροσδέτη L* για τον υποδοχέα του αντιπροσωπεύεται από την Κd (dissociation constant), έτσι και ο βαθμός συναγωνισμού του αναστολέα Ι και συνεπώς η συγγένειά του για τον υποδοχέα αντιπροσωπεύεται από την Κi

(inhibition constant). Αυτή η σταθερά υπολογίζεται ως εξής:

[R] + [L] [RL] για την αντίδραση αυτή η Kd =

[R] + [I] [RI] για την αντίδραση αυτή η Ki =

Όπου [R] αντικαθιστούμε: [R] = [RT] - [RL] - [RI], και προκύπτει:

[RL] = Mε την αγγλική ορολογία η εξίσωση μετατρέπεται:

Είναι η εξίσωση της συναγωνιστικής αναστολής.

log1

100−Β

[Β] =

α β


Στην περίπτωση που [Ι] = ΙC50 και λύσουμε την εξίσωση ως προς Ki προκύπτει η εξίσωση των Cheng και Prusoff (1973), η οποία επιτρέπει τον υπολογισμό της Κi με τη βοήθεια της ΙC50:

Για να απλοποιήσουμε ακόμη περισσότερο τον υπολογισμό της Κi, χρησιμοποιούμε στις μελέτες μας σταθερή συγκέντρωση ραδιενεργού προσδέτη ίση με την Κd (F = Kd), οπότε η Κi που προκύπτει είναι ίση με την ΙC50/2.

Μη συναγωνιστική αναστολή (non competitive inhibition)Ο μη συναγωνιστικός ή αλλοστερικός αναστολέας (non competitive blocker) δεσμεύεται

σε μια θέση σύνδεσης διαφορετική από αυτήν του ραδιενεργού προσδέτη L* και προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης του υποδοχέα, εμποδίζοντας τη σύνδεση του ραδιοπροσδέτη. Ο μη συναγωνιστικός αναστολέας καθώς δεν συναγωνίζεται με το ραδιοπροσδέτη για την ίδια θέση σύνδεσης, ακόμη και αν προστεθεί σε μεγάλες συγκεντρώσεις, δεν μπορεί να αναστείλει πλήρως τη σύνδεση του ραδιοπροσδέτη. Όταν δε ο ραδιοπροσδέτης χρησιμοποιείται σε μεγάλη συγκέντρωση (πχ 10Κd), ο μη συναγωνιστικός αναστολέας δεν έχει σχεδόν καμία επίδραση.

Εικόνα 3.30 Με τη βοήθεια ενός πειράματος συναγωνισμού, σύγκριση της επίδρασης ενός συναγωνιστικού (α) και ενός μη συναγωνιστικού – αλλοστερικού αναστολέα (β) στην ειδική σύνδεση ενός ραδιοπροσδέτη. Ο ραδιενεργός προσδέτης (L) προστέθηκε σε δυο συγκεντρώσεις ([L] = 10KD και [L] = 0.001KD), ενώ ο συναγωνιστικός και ο μη συναγωνιστικός (μη ραδιενεργός) αναστολέας σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Παρατηρούμε ότι ο συναγωνιστικός αναστολέας συναγωνίζεται και εκτοπίζει πλήρως το ραδιενεργό προσδέτη, ενώ ο μη συναγωνιστικός αναστολέας δεν εκτοπίζει καθόλου την υψηλή συγκέντρωση ραδιοπροσδέτη, και εκτοπίζει μερικώς τη χαμηλή.

Στα πειράματα συναγωνισμού, ο ραδιοπροσδέτης μπορεί να είναι αγωνιστής ή ανταγωνιστής, όπως και ο αναστολέας, γιατί δεν μελετάμε τη φυσιολογική δράση των φαρμάκων αλλά τη συγγένειά τους ως προς τον υποδοχέα. Σε ειδικές μόνο περιπτώσεις, τα πειράματα σύνδεσης μας επιτρέπουν να διακρίνουμε έναν αγωνιστή από έναν ανταγωνιστή, όπως παρατίθεται στη συνέχεια.

log[Συναγωνιστικού αναστολέα] log[Μη συναγωνιστικού αναστολέα]

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση (%

)

Ειδι

κή σ

ύνδε

ση (%

)

Κi =

Ki =


Μη αντιστρεπτοί ανταγωνιστέςΟι μη αντιστρεπτοί ανταγωνιστές συνδέονται με τους υποδοχείς με ομοιοπολική σύνδεση

ή έχουν τόσο υψηλή συγγένεια και συνδέονται τόσο ισχυρά ώστε η αποσύνδεση είναι πρακτικά μηδενική σε σχετικό χρόνο, συνεπώς συνδέονται με τρόπο μη αναστρέψιμο και ο υποδοχέας παύει να είναι διαθέσιμος για τη σύνδεσή του με τον αγωνιστή.

Με πόσους υποδοχείς θα συνδεθεί ο μη αντιστρεπτός ανταγωνιστής εξαρτάται επίσης και από τον χρόνο επώασης. Όταν αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αγωνιστή επωάζονται με σταθερή συγκέντρωση μη αντιστρεπτού ανταγωνιστή, αλλά με αυξανόμενο τον χρόνο επώασης με τον μη αντιστρεπτό ανταγωνιστή, η μέγιστη απόκριση που προκαλεί ο αγωνιστής μειώνεται όσο περισσότερο αυξάνεται ο χρόνος επώασης (Εικόνα 3.30).

Εικόνα 3.31 Η καμπύλη δόσης - απόκρισης ενός αγωνιστή μετατοπίζεται προς τα δεξιά (αύξηση της EC50) και η Εmax ελαττώνεται όσο αυξάνεται ο χρόνος προ-επώασης με τον μη αντιστρεπτό ανταγωνιστή. Εξήγηση στο γεγονός δίνει η ύπαρξη εφεδρείας υποδοχέων και το γεγονός ότι η μέγιστη απόκριση απαιτεί μια μικρή μόνο ποσότητα του συνολικού αριθμού των υποδοχέων.

Η μέγιστη απόκριση που προκαλεί ο αγωνιστής σε μια καμπύλη δόσης - απόκρισης μειώνεται επίσης, παρουσία αυξανόμενων δόσεων του μη αντιστρεπτού αγωνιστή.

Εικόνα 3.32 Η καμπύλη δόσης - απόκρισης ενός αγωνιστή μετατοπίζεται προς τα δεξιά (αύξηση της EC50) και η Εmax ελαττώνεται όσο αυξάνεται η δόση προ-επώασης του μη αντιστρεπτού ανταγωνιστή. Εάν συγκρίνουμε το αποτέλεσμα του μη αντιστρεπτού ανταγωνιστή με αυτό του μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή (Βλπ Εικόνα 3.21) παρατηρούμε ότι είναι όμοιο.

10 min 20

min

30 min

40 min

Log[Αγωνιστή] (Μ)

Απόκ

ριση

(%)

100

50

0

Εmax

Log[Αγωνιστή]

100 Απουσία ανταγωνιστή

Παρουσία δύο δόσεων ενός μη αντιστρεπτού ανταγωνιστή


Θεραπευτικά, οι μη αντιστρεπτοί ανταγωνιστές παρουσιάζουν διαφορετικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τους αντιστρεπτούς ανταγωνιστές. Η διάρκεια της δράσης ενός μη αντιστρεπτού ανταγωνιστή είναι ανεξάρτητη από το ρυθμό της απομάκρυνσής του και εξαρτάται από το ρυθμό αναγέννησης των μορίων του υποδοχέα, καθώς το σύμπλοκο υποδοχέας – μη αντιστρεπτός ανταγωνιστής εσωτερικεύεται. Για παράδειγμα, η φαινοξυβενζαμίνη είναι ένας μη αντιστρεπτός ανταγωνιστής των α-αδρενεργικών υποδοχέων που χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της υπέρτασης λόγω υπερέκκρισης κατεχολαμινών (αδρεναλίνης και νοραδρεναλίνης) από το φαιοχρωμοκύττωμα (έναν όγκο του μυελού των επινεφριδίων). Με τη χορήγηση φαινοξυβενζαμίνης μειώνεται η αρτηριακή πίεση καθώς ο αποκλεισμός των υποδοχέων διατηρείται ακόμα και όταν ο όγκος απελευθερώνει κατά κύματα μεγάλες ποσότητες κατεχολαμινών.

Αναγνώριση αγωνιστών - ανταγωνιστών με πειράματα σύνδεσης, στους οπιοειδείς υποδοχείς

Ο διαχωρισμός των αγωνιστών από τους ανταγωνιστές των οπιοειδών υποδοχέων είναι σημαντικός για θεραπευτικούς λόγους. Ένα παράδειγμα είναι η ναλορφίνη, ένας ισχυρός ανταγωνιστής των οπιοειδών υποδοχέων, ο οποίος χορηγούνταν αρχικά ως αντίδοτο σε υπερβολικές δόσεις μορφίνης. Όμως από ανεξάρτητες κλινικές μελέτες των Lasagna και Beecher (1954) και αργότερα των Houde και Wallenstein (1956), φάνηκε πως το φάρμακο είχε και ιδιότητες αγωνιστή. Μικρές δόσεις ναλορφίνης ανέστειλαν τη δράση της μορφίνης, ενώ υψηλότερες δόσεις προκαλούσαν αναλγησία. Οι παρατηρήσεις αυτές έδωσαν ώθηση στη φαρμακοβιομηχανία να αναπτύξει ουσίες με μικτή δράση αγωνιστή – ανταγωνιστή (όπως η ναλορφίνη), οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν πιθανόν όπως τα οπιοειδή αλλά χωρίς προβλήματα εθισμού. Οι πρώτες προσπάθειες διαχωρισμού αγωνιστών από ανταγωνιστές οπιοειδών υποδοχέων, έγιναν με βάση τις συγγένειες σύνδεσης ζευγών Ν-μεθυλ-(αγωνιστών) και Ν-αλλυλ-(ανταγωνιστών), όπως για παράδειγμα το ζεύγος μορφίνης-ναλορφίνης (Εικόνα 3.32). Επειδή όμως αυτές ήταν παρόμοιες, ο διαχωρισμός ήταν αδύνατος μ’ αυτόν τον τρόπο.

Εικόνα 3.33 Δομές της μορφίνης (α) και της ναλορφίνης (β). Η μορφίνη όπως και όλοι οι αγωνιστές φέρουν μεθυλομάδα (CH3) σε αντίθεση με τους ανταγωνιστές (πχ. ναλορφίνη) οι οποίοι στη θέση της μεθυλομάδας φέρουν την ομάδα αλλύλιο (CH2-CH=CH2). Η σύγκριση της συγγένειας σύνδεσής τους με τον υποδοχέα δεν μπορούσε να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα σχετικά με το αν αυτές ήταν αγωνιστές ή ανταγωνιστές.

Εξετάζοντας την επίδραση των ιόντων, βρέθηκε πως παρουσία ιόντων Na+, η σύνδεση της

[3Η]ναλοξόνης (ανταγωνιστής) αυξήθηκε κατά 45%, ενώ αυτή της [3Η]διϋδρομορφίνης αυξήθηκε κατά 70%. Σε παρασκευάσματα υποδοχέων, προσθέτονταν μια σταθερή συγκέντρωση [3Η]ναλοξόνης και αυξανόμενες συγκεντρώσεις μιας μη σημασμένης ουσίας (αγωνιστής ή αγωνιστής) και μετρούνταν το IC50 (η συγκέντρωση της μη σημασμένης ουσίας που απαιτείται ώστε να μειωθεί η σύνδεση της [3Η]ναλοξόνης στους υποδοχείς κατά 50%)

α.β.

ΝαλορφίνηΜορφίνη

CH3CH2CH=CH2


(Πίνακας 3.1). Αυτή η διαδικασία γινόταν απουσία και παρουσία NaCl. Έτσι βρέθηκε μια κρίσιμη συγκέντρωση 100 m Μ Ν aCl , όπου τα ιόντα Na + δεν επηρέαζαν την σύνδεση των ανταγωνιστών, μείωναν όμως την σύνδεση των αγωνιστών μέχρι και 99%. Ουσίες, οι οποίες είχαν μικτή δράση αγωνιστή-ανταγωνιστή επηρεάζονταν μέτρια.

Πίνακας 3.1 Αποτελέσματα των πειραμάτων εκτόπισης [3Η]ναλοξόνης με μια μη σημασμένη ουσία (αγωνιστή ή ανταγωνιστή). Η εκτόπιση της [3Η]ναλοξόνης από καθαρούς μη σημασμένους ανταγωνιστές όπως ναλοξόνη, ναλτρεξόνη και διπρενορφίνη δεν επηρεάστηκε από τα ιόντα Na+, ενώ η εκτόπισή της από τους καθαρούς αγωνιστές μειώθηκε μέχρι και 99%.

Μη σημασμένοΜη σημασμένο ICIC5050 (nM) (nM)Λόγος Λόγος ICIC5050**οπιοειδέςοπιοειδές Απουσία Απουσία NaClNaCl 100mM NaCl100mM NaCl

Ναλοξόνη 1.5 1.5 ανταγωνιστής

1.0

Ναλτρεξόνη 0.5 0.5 ανταγωνιστής

1.0

Διπρενορφίνη 0.5 0.5 ανταγωνιστής

1.0

Κυκλαζοκίνη 0.9 1.5 αγων/ανταγ.

1.7

Λεβαλλορφάν 1.0 2.0 αγων/ανταγ.

2.0

Ναλορφίνη 1.5 4.0 αγων/ανταγ.

2.7

Πενταζοκίνη 15 50 αγωνιστής 3.3Ετροφίνη 0.5 6.0 αγωνιστής 12Μεπεριδίνη 3000 50000 αγωνιστής 17Λεβορφανόλη 1.0 15 αγωνιστής 15Οξυμορφόνη 1.0 30 αγωνιστής 30Διϋδρομορφίνη 3.0 140 αγωνιστής 47Προπυξυφένη 200 12000 αγωνιστής 60Φεναζοκίνη 0.6 80 αγωνιστής 133

*Λόγος IC50: ορίζεται ως το κλάσμα της τιμής IC50 παρουσία 100mM NaCl προς την τιμή IC50 απουσία NaCl. Όταν το κλάσμα αυτό ισούται με 1.0, τότε η μη σημασμένη ουσία που εξετάζεται είναι ανταγωνιστής. Όταν λίγο αποκλίνει από το 1.0 (π.χ. 2.0, 2.7) είναι μεικτός αγωνιστής-ανταγωνιστής, ενώ όταν είναι πολύ μεγαλύτερο του 1.0, η ουσία είναι καθαρός αγωνιστής (από Trends in Pharmacological sciences, 2003, 24: 198-205).

Μία σημαντική απόρροια αυτών των παρατηρήσεων αφορούσε στην ανάπτυξη των φαρμάκων. Συγκεκριμένα, πριν από αυτές τις παρατηρήσεις ο μόνος τρόπος να μελετηθεί η δράση χημικά τροποποιημένων ουσιών που θα μπορούσαν να δράσουν ως μικτοί αγωνιστές – ανταγωνιστές και να διακριθούν από ένα αγωνιστή ήταν να γίνουν τα πειράματα σε ζωντανά τρωκτικά. Αυτό όμως έχει τη δυσκολία ότι αφενός μπορεί να εκτιμηθεί μόνο ένας περιορισμένος αριθμός ουσιών ανά εβδομάδα εργασίας (που σημαίνει χρειάζεται μεγάλο χρονικό διάστημα για να ελεγχθούν εκατοντάδες ή και χιλιάδες υποψήφιες ουσίες), αφετέρου απαιτεί τη σύνθεση των ουσιών σε ποσότητες γραμμαρίων και κατά τρίτο και κυριότερο λόγο, απαιτεί τη χρήση πειραματόζωων. Σε αντίθεση, τα πειράματα σύνδεσης απαιτούν μικρογραμμάρια της υποψήφιας ουσίας και μπορούν να δώσουν μια πρόβλεψη για το αν αυτή η ουσία μπορεί να συμπεριφερθεί ως αγωνιστής και/ή ως ανταγωνιστής.

Μετά την ανακάλυψη της μεθόδου διαχωρισμού με τα ιόντα Na+, αναπτύχθηκαν και άλλες μέθοδοι διαχωρισμού. Έτσι ο διαχωρισμός μπορεί να γίνει και με: 1/ δισθενή κατιόντα, όπως Mg2+, Mn2+, τα οποία ενισχύουν την σύνδεση του αγωνιστή, 2/ ήπια πέψη με πρωτεολυτικά ένζυμα ή σουλφυδρυλικά αντιδραστήρια, τα οποία μειώνουν την σύνδεση του


αγωνιστή αφού μεταβάλλουν την τριτοταγή δομή των υποδοχέων και 3/ διεξαγωγή των πειραμάτων σύνδεσης σε διάφορες θερμοκρασίες, με χαμηλότερες θερμοκρασίες να ευνοούν την σύνδεση του ανταγωνιστή.

Όλες οι παραπάνω μελέτες σύνδεσης βρήκαν εφαρμογή στην παραγωγή νέων φαρμάκων. Οι δράσεις των νέων ουσιών που παράγονταν (αγωνιστές ή ανταγωνιστές των οπιοειδών υποδοχέων), μπορούσαν να εξακριβωθούν εύκολα, γρήγορα και με ακρίβεια με τη διεξαγωγή πειραμάτων σύνδεσης.

Έρευνες έδειξαν ότι τα ιόντα Na+ μπορούν να διαχωρίσουν αγωνιστές από ανταγωνιστές και σε άλλους GPCRs, εκτός των οπιοειδών υποδοχέων. Ένα τέτοιο παράδειγμα αποτελεί ο α2 αδρενεργικός υποδοχέας, στον οποίο βρέθηκε ότι τα ιόντα Na+ επιδρούν σ’ ένα αμινοξύ του, (Asp79), μεταβάλλοντας τη διαμόρφωσή του. Αυτή η αλλαγή στη διαμόρφωση του υποδοχέα μειώνει την σύνδεση των ανταγωνιστών, ενώ επηρεάζει και την αλληλεπίδραση G πρωτεΐνης-τελεστή (αδενυλική κυκλάση) στον ενδοκυτταρικό χώρο. Παρόλα αυτά δεν είναι ακόμη σαφές πώς τα ιόντα Na+ ή άλλα μονοσθενή ιόντα ρυθμίζουν φυσιολογικά τη διαμόρφωση του υποδοχέα.

Χαρακτηρισμός ενός “ορφανού” υποδοχέα με τη βοήθεια πειραμάτων σύνδεσης

Ο ORL1 ήταν ένας ορφανός υποδοχέας GPCR. Ορφανός υποδοχέας καλείται ο υποδοχέας για τον οποίο δεν έχει βρεθεί κάποιος προσδέτης και έχει απομονωθεί με βάση την ομολογία της αλληλουχίας και της ταύτισης της δομικής του οργάνωσης με άλλους γνωστούς υποδοχείς. Ο ORL1 ενώ έχει σημαντική ομολογία με τους υπόλοιπους τρεις γνωστούς οπιοειδείς υποδοχείς, δ, κ και μ, οι γνωστοί προσδέτες των οπιοειδών υποδοχέων δεν εμφανίζουν συγγένεια γι’αυτόν τον υποδοχέα.

Η νοσισεπτίνη (nociceptin από το λατινικό nocere = τραυματίζω, nociceptive = αυτός που δέχεται ή μεταδίδει ερεθίσματα πόνου) ή ορφανίνη FQ, είναι ένα ενδογενές δεκαεπταπεπτίδιο, το οποίο παρά την υψηλή ομολογία με οπιοειδή πεπτίδια, έχει πολύ χαμηλή συγγένεια για τους οπιοειδείς υποδοχείς. Η ορφανίνη αναγνωρίστηκε ως ο ενδογενής προσδέτης του υποδοχέα ORL1 (Opioid Receptor-Like 1 receptor).

Προσδιορισμός ειδικής σύνδεσης [3Η]νοσισεπτίνης στον εγκέφαλο και στο νωτιαίο μυελό αρουραίωνΗ καμπύλη ειδικής σύνδεσης της [3Η]νοσισεπτίνης (0,01 – 0,6 nM), που

πραγματοποιήθηκε σε μεμβράνες από το νωτιαίο μυελό και τον εγκέφαλο αρουραίων στους 25οC, είναι κορεσμένη, φθάνοντας σε κορεσμό περίπου στα 0,3 nM [3Η]νοσισεπτίνης. Αφ’ετέρου, η μη ειδική σύνδεση αυξάνεται γραμμικά με τη συγκέντρωση της [3Η]νοσισεπτίνης.

Η ανάλυση Scatchard αποκάλυψε μια γραμμική σχέση, προτείνοντας ένα μόνο τύπο υποδοχέα με τις τιμές Kd 0,63 nM στον εγκέφαλο και 0,31 nM στο νωτιαίο μυελό. Η μέγιστη συγκέντρωση των υποδοχέων που συνδέονται με τη [3Η]νοσισεπτίνη είναι Bmax 160 fmol/mg πρωτεΐνης στον εγκέφαλο, και 48 fmol/mg πρωτεΐνης στο νωτιαίο μυελό. Άρα, η συγγένεια (Kd) και ο μέγιστος αριθμός υποδοχέων (Bmax) για την [3Η]νοσισεπτίνη στο νωτιαίο μυελό είναι σημαντικά χαμηλότερα από τις τιμές στον εγκέφαλο, προτείνοντας την ύπαρξη λιγότερων υποδοχέων υψηλής συγγένειας στο νωτιαίο μυελό.


Εικόνα 3.34 Καμπύλη ειδικής και μη ειδικής σύνδεσης της [3Η]νοσισεπτίνης σε μεμβράνες από εγκέφαλο και νωτιαίο μυελό αρουραίων. Η ειδική σύνδεση () προσδιορίσθηκε ως η διαφορά μεταξύ της ολικής (δεν φαίνεται στο σχήμα) και της μη ειδικής σύνδεσης (○), απουσία και παρουσία 1μΜ νοσισεπτίνης στους 25oC. Στο ένθετο σχήμα φαίνεται η απεικόνιση κατά Scatchard, με βάση τα δεδομένα της ειδικής σύνδεσης. Από Biol. Pharm. Bull., Vol. 24, No. 8, 902-905 (2001).

Αφού δείχθηκε ότι η σύνδεση ήταν κορεσμένη, στη συνέχεια πρέπει να δειχθεί ότι είναι και αντιστρεπτή. Στους 25οC, η ισορροπία επέρχεται μετά από περίπου 15 min στον εγκέφαλο και 30 min στο νωτιαίο μυελό, και η ειδική σύνδεση [3Η]νοσισεπτίνης παραμένει σταθερή για τουλάχιστον 90 min. Αν αφού επέλθει ισορροπία προστεθεί μη σημασμένη νοσισεπτίνη παρατηρείται αποσύνδεση της [3Η]νοσισεπτίνης από τους ORL1 υποδοχείς.

Εικόνα 3.35 Καμπύλη χρόνου ειδικής σύνδεσης (●) και αποσύνδεσης (○) της [3Η]νοσισεπτίνης στον εγκέφαλο και νωτιαίο μυελό αρουραίων. 0.3 nM [3Η]νοσισεπτίνης προστέθηκαν σε παρασκευάσματα μεμβρανών ως συνάρτηση του χρόνου. Μετά την πάροδο 60 min (βέλος) προστέθηκε 1 μΜ μη σημασμένης ("κρύας") νοσισεπτίνης και μετρήθηκε και πάλι η ειδική σύνδεση.

Εγκέφαλος Νωτιαίος μυελόςΣύ

νδεσ

η [3 Η

] νοσ

ισεπ

τίνη

ς(fm

ol/m

g πρ

ωτεΐ

νης)

[3Η] νοσισεπτίνη, nM [3Η] νοσισεπτίνη, nM

Eιδι

κή σ

ύνδε

ση [3 Η

] νοσ

ισεπ

τίνη

ς(fm

ol/m

g πρ

ωτεΐ

νης)

ΕγκέφαλοςΝωτιαίος μυελός

Χρόνος (min) Χρόνος (min)

B/F

B/F

Β

Scatchard Scatchard

Β


EΚΤΌΠΙΣΗ ΤΗΣ ΕΙΔΙΚΉΣ ΣΎΝΔΕΣΗΣ ΤΗΣ [3Η]ΝΟΣΙΣΕΠΤΊΝΗΣ ΑΠΌ ΜΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΉ ΝΟΣΙΣΕΠΤΊΝΗ, ΑΠΌ ΤΟ ΑΝΆΛΟΓΌ ΤΗΣ [Phe1Ψ(CH2-NH)-Gly2]νοσισεπτίνη(1-13)ΝΗ2 ΚΑΙ ΑΠΌ ΟΠΙΟΕΙΔΕΊΣ ΠΡΟΣΔΈΤΕΣ. Εξετάστηκαν διάφοροι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των οπιοειδών προσδετών, για τη δυνατότητά τους να αναστείλουν την ειδική σύνδεση στις μεμβράνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού. Οι τιμές της Κi και της σταθεράς του Hill των ανταγωνιστών της σύνδεσης [3Η]νοσισεπτίνης παρατίθενται στον παρακάτω Πίνακα 3.2, και από τη σύγκρισή τους βγάζουμε συμπεράσματα για το αν η σύνδεση της νοσισεπτίνης στον εγκέφαλο και το νωτιαίο μυελό έχει τα ίδια χαρακτηριστικά.

Εικόνα 3.36 Εκτόπιση της ειδικής σύνδεσης της [3Η]νοσισεπτίνης σε μεμβράνες εγκεφάλου από νοσισεπτίνη (), [Phe1Ψ(CH2-NH)-Gly2]νοσισεπτίνη(1-13)ΝΗ2 (), ναλοξόνη (), ναλτρινδόλη (), νορ-βιναλτορφιμίνη () και CTOP (). Από Biοl. Pharm. Bull., Vol. 24, No. 8, 902-905 (2001).

Πίνακας 3.2 Παρεμπόδιση της σύνδεσης της [3Η]νοσισεπτίνης από νοσισεπτίνη, το ανάλογό της ([Phe1Ψ(CH2-NH)-Gly2]νοσισεπτίνη(1-13)ΝΗ2) και οπιοειδείς προσδέτες σε παρασκευάσματα μεμβρανών από εγκέφαλο και νωτιαίο μυελό αρουραίων.

ΦάρμακοΦάρμακο KKii (nM) (nM)Εγκέφαλος Νοσισεπτίνη 0.027 ± 0.008 [Phe1Ψ(CH2-NH)-Gly2]νοσισεπτίνη(1-13)ΝΗ2 1.03 ± 0.09 Ναλοξόνη 722 ± 83 Ναλτρινδόλη 8435 ± 581 Νορ-βιναλτορφιμίνη 34958 ± 2681Νωτιαίος μυελός Νοσισεπτίνη 0.12 ± 0.01 [Phe1Ψ(CH2-NH)-Gly2]νοσισεπτίνη(1-13)ΝΗ2 0.58 ± 0.03 Ναλοξόνη 375 ± 33 Ναλτρινδόλη 4310 ± 202 Νορ-βιναλτορφιμίνη 10737 ± 1140

Όπως φαίνεται στον πίνακα, οι τιμές του Ki για τη νοσισεπτίνη, το ανάλογό της και τους οπιοειδείς προσδέτες είναι σημαντικά χαμηλότερες στο νωτιαίο μυελό από τον

Eιδι

κή σ

ύνδε

ση [3 Η

] νο

σισε

πτίν

ης(%

)

-log [φαρμάκου], (Μ)


εγκέφαλο. Άρα η [3Η]νοσισεπτίνη είναι πιο εύκολο να συνδεθεί στις εγκεφαλικές μεμβράνες από τις αντίστοιχες του νωτιαίου μυελού. Ακόμη, οι μελέτες έδειξαν πως η νοσισεπτίνη και το ανάλογό της είναι πιο ισχυροί ανασταλτικοί παράγοντες από ότι τα οπιοειδή για την ειδική σύνδεση [3Η]νοσισεπτίνης αφού η σύνδεση ακόμα και για σχετικά υψηλή συγκέντρωση των οπιοειδών προσδετών έμεινε σχεδόν ανεπηρέαστη. Τα στοιχεία αυτά λοιπόν συνηγορούν πως η [3Η]νοσισεπτίνη σηματοδοτεί επιλεκτικά τους ORL1 υποδοχείς στον εγκέφαλο αρουραίων και το νωτιαίο μυελό, συμπέρασμα με το οποίο συμφωνούν μελέτες συμπεριφοράς που έδειξαν τις αποκρίσεις του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού από απώλεια νοσισεπτίνης.

ΔΙΑΣΠΟΡΆ ΤΗΣ ΕΙΔΙΚΉΣ ΣΎΝΔΕΣΗΣ ΤΗΣ [3Η]ΝΟΣΙΣΕΠΤΊΝΗΣ. Η σχετική πυκνότητα της ειδικής σύνδεσης [3Η]νοσισεπτίνης (0,6 nM) συγκρίθηκε σε επτά περιοχές του εγκεφάλου και στο νωτιαίο μυελό των αρουραίων. Στον εγκεφαλικό φλοιό, τον ιππόκαμπο, το θάλαμο και το μεσεγκέφαλο είχαμε υψηλή πυκνότητα σύνδεσης, στο ραβδωτό σώμα και το εγκεφαλικό στέλεχος είχαμε μέση πυκνότητα σύνδεσης και στην παρεγκεφαλίδα είχαμε τη χαμηλότερη πυκνότητα.

Εικόνα 3.37 Διασπορά της ειδικής σύνδεσης [3Η]νοσισεπτίνης (0,6 nM) σε παρασκευάσματα μεμβρανών διαφόρων περιοχών του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού αρουραίων. Από Biol. Pharm. Bull., Vol. 24, No. 8, 902-905 (2001).

Συμπερασματικά λοιπόν, η ειδική σύνδεση της [3Η]νοσισεπτίνης στους μεμβρανικούς υποδοχείς στον εγκέφαλο αρουραίων, έδειξε ότι οι ORL1 υποδοχείς συγκεντρώνονται στον εγκεφαλικό φλοιό, τον ιππόκαμπο, το θάλαμο και το μεσεγκέφαλο, με τις μέτριες έως χαμηλές πυκνότητες περιοχών συνδέσεων [3Η]νοσισεπτίνης σε άλλες εγκεφαλικές περιοχές.

Ιδιοσύστατη δραστηριότητα υποδοχέων και αντίστροφος αγωνισμόςΓια πρώτη φορά το 1989, οι Costa και Herz, παρατήρησαν απουσία αγωνιστή, συνεχή

δραστηριότητα ενός αγρίου τύπου υποδοχέα, του δ-οπιοειδούς, σε μεμβράνες κυττάρων νευροβλαστώματος NG108-15. Ωστόσο, η παρατήρηση αυτή αγνοήθηκε λόγω της δυσκολίας να μετρηθεί δραστηριότητα ανεξάρτητη από αγωνιστή σε φυσιολογικά συστήματα. Το 1993, στο εργαστήριο του Robert Lefkowitz ανακαλύφθηκε η ύπαρξη ενός μεταλλαγμένου α1

αδρενεργικού υποδοχέα, με συνεχή ή ιδιοσύστατη (constitutive) δραστηριότητα ανεξάρτητα από την παρουσία αγωνιστή. Οι μεταλλαγμένοι αυτοί υποδοχείς, γνωστοί ως ‘ιδιοσύστατα ενεργά μεταλλάγματα’ (Constitutive Αctive Μutants, CAMs), μπορούν να λάβουν μια διαμόρφωση που τους επιτρέπει να ενεργοποιούν μια G πρωτεΐνη και να έχουν συνεχή

Φλοι

ός

Ραβδ

ωτό

σώμα

Ιππό

καμπ

ος

Θάλα

μος

Στέλ

εχος

Μεσ

εγκέ

φαλο

ς

Παρε

γκεφ

αλίδ

α

Νωτι

αίος

μυε

λόςΕιδι

κή σ

ύνδε

ση [3 Η

] νο

σισε

πτίν

ης(fm

ol/m

g πρ

ωτεΐ

νης)

Αντίστροφος αγωνιστής Αγωνιστής

α. Δράση τυπικού αγωνιστή που οδηγεί σε ενεργοποίηση του υποδοχέα

Μη ενεργή διαμόρφωσηυποδοχέα Αγωνιστής

Σύνδεση του αγωνιστή επάγει την ενεργή διαμόρφωση του υποδοχέα και αλληλεπίδραση με G πρωτεΐνη


δράση. Σήμερα γνωρίζουμε ότι ένας μεγάλος αριθμός φυσικών ή μεταλλαγμένων υποδοχέων GPCRs (σεροτονίνης, οπιοειδών, ισταμίνης κλπ) εμφανίζουν βασική ιδιοσύστατη δραστηριότητα.

Η εξήγηση της ιδιοσύστατης δραστηριότητας των υποδοχέων βασίζεται στο δυαδικό μοντέλο (binary model), σύμφωνα με το οποίο οι υποδοχείς βρίσκονται σε ισορροπία ανάμεσα σε δύο διαμορφώσεις, μιας ανενεργής (R, inactive ή ground state) και μίας τουλάχιστον, ενεργής (R*) διαμόρφωσης. Το γεγονός ότι πολλοί υποδοχείς εμφανίζουν ιδιοσύστατη δραστηριότητα, σημαίνει ότι ένα ποσοστό του πληθυσμού των υποδοχέων αυθόρμητα υφίσταται μια αλλαγή διαμόρφωσης, αποκτά τη διαμόρφωση R*, η οποία μπορεί να συνδέσει και να ενεργοποιήσει G-πρωτεΐνες ή τα εναλλακτικά μεταγωγικά μονοπάτια. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η δραστηριότητα αυτή είναι συνήθως χαμηλή επειδή το κλάσμα των μη δεσμευμένων υποδοχέων που βρίσκεται σε ενεργή διαμόρφωση είναι μικρό.

Αλλαγή στη διαμόρφωση του υποδοχέα και μετατόπιση της ισορροπίας προς την ενεργή ή την ανενεργή διαμόρφωση προκαλεί η σύνδεση του προσδέτη. Ένας προσδέτης χαρακτηρίζεται από τη συγγένεια (Kd) και την εσωτερική του δραστικότητα, την αποτελεσματικότητά του δηλαδή στην απόκριση του υποδοχέα, η οποία εξαρτάται από το είδος της αλλαγής που επιφέρει στη διαμόρφωση του υποδοχέα.

Η σύνδεση ενός αγωνιστή ενεργοποιεί τον υποδοχέα, προκαλεί θετική δραστηριότητα, μετακινώντας την ισορροπία προς την ενεργοποιημένη R* διαμόρφωση. Ο αντίστροφος αγωνιστής (inverse agonist) έχει αρνητική βιολογική δράση καθώς συνδέεται στον ιδιοσύστατα ενεργό υποδοχέα και σταθεροποιεί την R διαμόρφωση, αναστέλλοντας την αυθόρμητη και ανεξάρτητη από αγωνιστές δραστηριότητά του. Η σύνδεση ενός ανταγωνιστή εμποδίζει τη σύνδεση και συνεπώς τη δραστηριότητα ενός αγωνιστή ή ενός αντίστροφου αγωνιστή. Ο ανταγωνιστής έχει μηδενική βιολογική δραστηριότητα.

Στην περίπτωση που οι υποδοχείς δεν εμφανίζουν ιδιοσύστατη δραστηριότητα, ο αντίστροφος αγωνιστής μπορεί να παίξει το ρόλο του συναγωνιστικού ανταγωνιστή. Πολλά φάρμακα, τα οποία είχαν χαρακτηριστεί ως ανταγωνιστές (β-αναστολείς, αντισταμινικά) εμφανίζουν και δράση αντίστροφου αγωνιστή.

Εικόνα 3.38 Το μοντέλο ενός υποδοχέα που βρίσκεται σε ισορροπία ανάμεσα σε δυο διαμορφώσεις, την ενεργή (R*) και την ανενεργή (R). Ο αγωνιστής μετακινεί την ισορροπία προς την ενεργή διαμόρφωση, επάγοντας τη δραστηριότητα του υποδοχέα. Ο αντίστροφος αγωνιστής μετακινεί την ισορροπία προς την ανενεργή διαμόρφωση, αναστέλλοντας την ιδιοσύστατη δραστηριότητα του υποδοχέα, απουσία αγωνιστή. Ο ανταγωνιστής εμποδίζει τη σύνδεση του αγωνιστή και του αντίστροφου αγωνιστή, χωρίς να έχει τη δυνατότητα από μόνος του να προκαλέσει βιολογική δραστηριότητα.Οι Cotecchia και συν. (2003) πρότειναν ο όρος αντίστροφος αγωνιστής να αναφέρεται σε

προσδέτες που σταθεροποιούν το σύμπλοκο GPCR - Gα σε ανενεργή διαμόρφωση.

Ανταγωνιστής

Πλήρης αντίστροφος αγωνιστήςΜερικός αντίστροφος αγωνιστήςΑνταγωνιστής

Πλήρης αγωνιστήςΜερικός αγωνιστής Υπερ- αγωνιστής

-100% 0% 100%Αποτελεσματικότητα – Βιολογική απόκριση


Εικόνα 3.39 Μοντέλο δράσης ενός αγωνιστή (α) και ενός αντίστροφου αγωνιστή (β).

Εικόνα 3.40 Σύγκριση της φυσιολογικής απόκρισης του αντίστροφου αγωνιστή με τις αποκρίσεις του πλήρη και του μερικού αγωνιστή. Βλέπουμε ότι ο ανταγωνιστής δεν έχει καμιά φυσιολογική απόκριση, ο πλήρης αγωνιστής έχει θετική πλήρη βιολογική απόκριση σε σχέση με τον μερικό αγωνιστή που προκαλεί μόνο ένα 50% της μέγιστης απόκρισης, και ο αντίστροφος αγωνιστής έχει αρνητική απόκριση (εμποδίζει την ιδιοσύστατη ενεργοποίηση του υποδοχέα).


Εικόνα 3.41 Κατάταξη φαρμάκων ανάλογα με την αποτελεσματικότητά τους - τη

φυσιολογική τους απόκριση.

Η ταυτοποίηση των πεπτιδίων agouti και AgRP ως ενδογενών αντίστροφων αγωνιστών προσδίδει φυσιολογική σημασία στον αντίστροφο αγωνισμό

Ο αντίστροφος αγωνισμός συνεισέφερε σημαντικά στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της ρύθμισης της λειτουργίας των υποδοχέων, αλλά και στην ανάπτυξη νέων φαρμάκων.

Η ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ AGOUTI ΩΣ ΦΥΣΙΚΟΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΟΣ ΑΓΩΝΙΣΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΠΌΘΕΣΗ ΧΡΩΣΤΙΚΉΣ ΣΤΟ ΤΡΊΧΩΜΑ ΤΩΝ ΑΡΟΥΡΑΊΩΝ.

Επειδή το χρώμα του τριχώματος των ζώων είναι εύκολο να παρατηρηθεί, έχουν ταυτοποιηθεί πολλές γονιδιακές περιοχές, οι οποίες επηρεάζουν το χρώμα. Ανάμεσα σε αυτές είναι η περιοχή αgouti, από την οποία παράγεται η πρωτεΐνη agouti, η περιοχή που κωδικοποιεί τους υποδοχείς της μελανοκορτίνης MC1R και η περιοχή που περιέχει το γονίδιο της POMC (προ-οπιομελανοκορτίνης), το πρόδρομο μόριο από το οποίο απελευθερώνεται το τριδεκαπεπτίδιο μελανοκορτίνη ή α-MSH (melanocyte-stimulating hormone). Η α-MSH είναι ο ενδογενής αγωνιστής των MC1R και προκαλεί μελανογένεση.

Η διαφορά στο χρώμα του δέρματος ανάμεσα σε σκούρο και ανοιχτό δεν οφείλεται στον αριθμό των μελανοκυττάρων του δέρματος, αλλά στο επίπεδο δραστηριότητας των υποδοχέων MC1, το οποίο καθορίζει την ποσότητα ευμελανίνης και φαιομελανίνης που παράγεται από τα μελανοκύταρα. Υψηλή δραστηριότητα των MC1Rs οδηγεί στην παραγωγή της σκούρας χρωστικής ευμελανίνης, ενώ χαμηλή δραστηριότητα οδηγεί στην παραγωγή της κίτρινης ή κόκκινης φαιομελανίνης.

Τα ποντίκια άγριου τύπου, στα οποία εκφράζονται ο υποδοχέας MC1, η α-MSH, και η agouti, παράγουν χρωστική ευμελανίνη στα κύτταρα του δέρματος και έχουν μαύρο τρίχωμα.

Τα ποντίκια που έχουν υποστεί αρνητική μετάλλαξη στο γονίδιο της POMC δεν παράγουν την α-MSH (τον ενδογενή αγωνιστή των υποδοχέων MC1) και παρόλα αυτά έχουν μαύρο χρώμα. Δηλαδή, οι υποδοχείς MC1, ακόμη και απουσία του αγωνιστή, έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιήσουν την παραγωγή αρκετής ποσότητας χρωστικής ευμελανίνης, οπότε συμπεραίνουμε ότι ο MC1 παρουσιάζει συνεχή ιδιοσύστατη δράση απουσία αγωνιστή.

Τα ποντίκια που έχουν υποστεί μια θετική μετάλλαξη που οδηγεί στην υπερέκφραση του γονιδίου agouti έχουν κίτρινο χρώμα, καθώς δεν είναι ικανά να παράγουν τη χρωστική ευμελανίνη. Η πρωτεΐνη agouti, δηλαδή, αναστέλλει πλήρως τη δραστηριότητα των υποδοχέων MC1, ακόμη και την ιδιοσύστατη απουσία αγωνιστή, οπότε δρα ως αντίστροφος αγωνιστής (Εικόνα 3.41α).

Οι υποδοχείς MC1 είναι GPCRs, συνδέονται δηλαδή μέσω της πρωτεΐνης G με μια αδενυλική κυκλάση, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιείται και μετατρέπει το ATP σε cAMP. Απουσία αγωνιστή, οι MC1R ενεργοποιούν την παραγωγή μικρής ποσότητας cAMP. Ο αγωνιστής α-MSH εντείνει τη δράση τους, με αποτέλεσμα επιπλέον αύξηση του cAMP και παραγωγή της σκούρας χρωστικής ευμελανίνης, αντί της κίτρινης φαιομελανίνης. Αντίθετα, η


agouti δρα ως αντίστροφος αγωνιστής των MC1 υποδοχέων, οδηγεί σε μείωση της σηματοδότησής τους και παραγωγή φαιομελανίνης (Εικόνα 3.42β).

Εικόνα 3.42 Το σύστημα μελανοκορτίνης στη ρύθμιση του χρώματος του δέρματος.

α) Πειράματα in vitro σε ποντίκια, μέσω των οποίων προσδιορίστηκε ο ρόλος της agouti και η συνεχής δράση των MC1 υποδοχέων. Αy: μετάλλαξη που οδηγεί σε υπερέκφραση της γονιδιακής περιοχής agouti, POMC-/-: αρνητική μετάλλαξη και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου POMC, MC1R-/-: αρνητική μετάλλαξη και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου του υποδοχέα μελανοκορτίνης MC1R.Το γεγονός ότι τα ποντίκια που έχουν υποστεί μετάλλαξη στο γονίδιο POMC είναι μαύρα, δηλαδή είναι ικανά να παράγουν ευμελανίνη απουσία α-MSH, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο MC1 υποδοχέας μπορεί να λειτουργεί απουσία αγωνιστή. Το γεγονός ότι η διασταύρωση MC1R-/- ποντικιών με Αy μας δίνει γκρίζα ποντίκια οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η agouti δεν δρα απουσία του MC1 υποδοχέα.β) Μηχανισμός δράσης του υποδοχέα μελανοκορτίνης στο χρώμα του δέρματος. Η σύνδεση του αγωνιστή α-MSH στον MC1R αυξάνει τα επίπεδα του cAMP, και οδηγεί στην παραγωγή της σκούρης χρωστικής (ευμελανίνη), ενώ η σύνδεση του αντίστροφου αγωνιστή agouti αναστέλλει τη δράση του MC1R, μειώνει τα επίπεδα cAMP και οδηγεί στην παραγωγή της κίτρινης χρωστικής (φαιομελανίνη). Από Adan and Kas 2003.

AΝΑΚΆΛΥΨΗ ΤΗΣ AGRP ΚΑΙ ΑΝΤΊΣΤΡΟΦΟΣ ΑΓΩΝΙΣΜΌΣ ΣΤΗ ΡΎΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΣΩΜΑΤΙΚΟΎ ΒΆΡΟΥΣ Τα ποντίκια που έχουν υποστεί τη θετική μετάλλαξη Αy, η οποία οδηγεί στην υπερέκφραση του γονιδίου agouti, εκτός από την εμφάνιση κίτρινου χρώματος, είναι και παχύσαρκα. Η παχυσαρκία είναι αποτέλεσμα της αναστολής της δράσης των υποδοχέων μελανοκορτίνης MC4 στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Στο ΚΝΣ, το ρόλο της πρωτεΐνης agouti, η οποία φυσιολογικά εκφράζεται μόνο στο δέρμα, παίζει το AgRP (Agouti-related peptide).

Το AgRP ανταγωνίζεται τη δράση της α-MSH, η οποία είναι ο φυσικός αγωνιστής των MC3 και MC4 υποδοχέων, και παράλληλα, αναστέλλει τη συνεχή ιδιοσύστατη (απουσία αγωνιστή) δράση τους, γεγονός που το καθιστά αντίστροφο αγωνιστή και όχι ουδέτερο ανταγωνιστή. Η ισορροπία μεταξύ των διεγερμένων AgRP και α-MSH νευρώνων καθορίζει την έκταση της ενεργοποίησης των υποδοχέων μελανοκορτίνης σε νευρώνες που δέχονται τις απολήξεις των AgRP και α-MSH νευρώνων.

Το AgRP (ορεξιγόνο πεπτίδιο) και η α-MSH (ανορεξιγόνο) εκφράζονται σε νευρώνες του τοξοειδούς πυρήνα του υποθαλάμου. Οι νευρώνες αυτοί καταλήγουν σε άλλους πυρήνες του

(α) (β)

Άγριου τύπου

MC1R-/- Ay

POMC-/- Ay , MC1R-/- Σκούρη χρωστική

(ευμελανίνη)

Κίτρινη χρωστική

(φαιομελανίνη)

agouti


υποθαλάμου (στον πλάγιο πυρήνα, στον παρακοιλιακό, στο μεσοραχιαίο), όπου δημιουργούν συνάψεις με νευρώνες που περιέχουν υποδοχείς MC4. Η πυκνότητα των MC4R είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης των ενδογενών προσδετών (α-MSH και AgRP). Ωστόσο, στον μεσοκοιλιακό πυρήνα παρότι δεν καταλήγουν νευρικές απολήξεις ούτε από τους νευρώνες που παράγουν AgRP, ούτε από τους νευρώνες που παράγουν α-MSH, υπάρχουν υποδοχείς MC4. Η πυκνότητα των υποδοχέων αυτών αυξάνει κατά την διάρκεια νηστείας, ρυθμίζεται δηλαδή, ανεξάρτητα των ενδογενών προσδετών. Αυτή είναι μια απόδειξη ότι ο MC4R έχει ιδιοσύστατη δράση.

Εικόνα 3.43 Συνάψεις των πυρήνων του υποθαλάμου. Ρόλος του συστήματος μελανοκορτίνης.

Από τον τοξοειδή πυρήνα ξεκινούν νευρώνες που παράγουν α-MSH (ενεργοποιούνται όταν αυξάνεται η πρόσληψη τροφής και τα επίπεδα λεπτίνης και ινσουλίνης) και νευρώνες που παράγουν AgRP (ενεργοποιούνται όταν μειώνεται η πρόσληψη τροφής και τα επίπεδα λεπτίνης και ινσουλίνης). Οι παραπάνω νευρώνες καταλήγουν στον πλάγιο πυρήνα, στον παρακοιλιακό και στον μεσοραχιαίο, αλλά όχι στο μεσοκοιλιακό πυρήνα. Εκεί δημιουργούν συνάψεις με νευρώνες που περιέχουν υποδοχείς MC4. Από Adan and Kas, 2003.

Κατά τη διάρκεια δίαιτας υψηλής σε λιπαρά, αυξάνεται η μάζα του λιπώδους ιστού, με αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης της λεπτίνης. Η λεπτίνη είναι μια ορμόνη που παράγεται από κύτταρα του λιπώδους ιστού και μεταφέρεται στον εγκέφαλο, στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου, όπου οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων της MSH και μείωση των επιπέδων του AgRP, περιορίζοντας την πείνα.

Αντίθετα, κατά τη διάρκεια νηστείας του οργανισμού, το λίπος στον λιπώδη ιστό «καίγεται», με συνέπεια τη μείωση των επιπέδων λεπτίνης στο πλάσμα του αίματος, την αύξηση της δραστηριότητας των νευρώνων του τοξοειδούς πυρήνα που παράγουν AgRP, τη μείωση της δραστηριότητας των νευρώνων που παράγουν MSH, αυξάνοντας την όρεξη.

την μείωση της δράσης των MC4 υποδοχέων με αποτέλεσμα τη μειωμένη παραγωγή cAMP και κατά συνέπεια την αύξηση της πρόσληψης τροφής και την μείωση της ενεργειακής δαπάνης

Πλάγιος πυρήνας υποθαλάμου

Παρακοιλιακός πυρήνας

Μεσοκοιλιακός πυρήνας

Μεσοραχιαίος πυρήνας

MC4

MC4

MC4

MC4MC4

MC4


Για να αποδειχθεί ότι και η AgRP δρα ως αντίστροφος αγωνιστής in vivo, έπρεπε να υπάρχουν νευρώνες με MC4R, στους οποίους να καταλήγουν μόνο νευρώνες που παράγουν AgRP και όχι α-MSH. Πράγματι, στους νευρώνες TRH του παρακοιλιακού πυρήνα καταλήγουν απολήξεις μόνο νευρώνων AgRP. Το γεγονός αυτό προσδίδει στο AgRP επιπλέον ιδιότητες εκτός του ανταγωνισμού του με την α-MSH.

ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΉ ΣΗΜΑΣΊΑ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΈΝΟΥ ΤΟΥ ΑΝΤΊΣΤΡΟΦΟΥ ΑΓΩΝΙΣΜΟΎΌπως περιγράφτηκε παραπάνω, το AgRP είναι ένας ενδογενής αντίστροφος αγωνιστής

που συμμετέχει στη ρύθμιση του σωματικού βάρους και τα επίπεδα έκφρασής του ρυθμίζονται έτσι ώστε να διατηρήσουν την ενεργειακή ισορροπία. Η AgRP καταστέλλει την ιδιοσύστατη δράση των υποδοχέων MC4 και ταυτόχρονα ανταγωνίζεται τη δράση της α-MSH. Ένας τέτοιος ρυθμιστικός μηχανισμός που περιλαμβάνει δύο προσδέτες για να αυξήσει ή να αναστείλει την ιδιοσύστατη δράση ενός υποδοχέα, επιτρέπει τη λεπτή ρύθμιση της δράσης του.

ΣυμπεράσματαΠολλά φάρμακα όπως η αλοπεριδόλη, η σιμετιδίνη και η πραζοσίνη, τα οποία αρχικά

χαρακτηρίστηκαν ως αγωνιστές τώρα έχουν χαρακτηριστεί ως αντίστροφοι αγωνιστές και η μελέτη τους έχει μεγάλη σημασία καθώς ασθένειες που πιθανόν να σχετίζονται με συνεχή δράση υποδοχέων, μπορούν να θεραπευτούν με φάρμακα που λειτουργούν ως αντίστροφοι αγωνιστές.

Ο ρόλος του AgRP στα μονοπάτια του ενεργειακού ισοζυγίου, αποτελεί ένα πρώτο παράδειγμα αντίστροφου αγνισμού ως έναν ενδογενή μηχανισμό ρύθμισης σε φυσιολογικές διαδικασίες. Η ανακάλυψη ενδογενών αντίστροφων αγωνιστών δίνει μια νέα κατεύθυνση στον σχεδιασμό φαρμάκων. Πρέπει να λαμβάνεται υπ’ όψιν ότι η δράση των ουδέτερων αγωνιστών που σχεδιάζονται για την αντιμετώπιση ασθενειών έχει αντίκτυπο και στην φυσιολογική δράση των ενδογενών αντίστροφων αγωνιστών.

Βιβλιογραφία

Adan R. and Kas M. Inverse agonism gains weight. Trends Pharmacol Sci 24: 315-321 (2003).

Bouaboula M, Perrachon S, Milligan L, Canat X, Rinaldi-Carmona M, Portier M, Barth F, Calandra B, Pecceu F, Lupker J, Maffrand JP, Le Fur G and Casellas P. A selective inverse agonist for central cannabinoid receptor inhibits mitogen-activated protein kinase activation stimulated by insulin or insulin-like growth factor I. Evidence for a new model of receptor/ligand interactions. J Biol Chem 272: 22330–22339 (1997).

Bylund DB and Snyder SH. Beta adrenergic receptor binding in membrane preparations from mammalian brain. Mol. Pharmacol. 12: 568-580 (1967).

Ceresa BP and Limbird LE. Mutation of an aspartate residue highly conserved among G-protein coupled receptors results in nonreciprocal disruption of alpha 2-adrenergic receptor-G-protein interactions. A negative charge at amino acid residue 79 forecasts alpha 2A adrenergic receptor sensitivity to allosteric modulation by monovalent cations and fully effective receptor/G-protein coupling. J Biol Chem 269: 29557-29564 (1994).


Clark AJ. The antagonism of acetylcholine by atropine. J Physiol (Lond) 61: 547–556 (1926).

Clark AJ. The reaction between acetylcholine and muscle cells. Part II. J Physiol (Lond). 64:123–143 (1927).

Costa Τ and Herz Α. Antagonists with negative intrinsic activity at delta opioid receptors coupled to GTP-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 86: 7321–7325 (1989).

Cotecchia S, Exum S, Caron MG and Lefkowitz RJ: Regions of a1-adrenergic receptor involved in coupling to phosphatidylinositol hydrolysis and enhanced sensivity of biological function. Proc Natl Acad Sci U S A 87:2896–2900 (1990).

Cotecchia S, Fanelli F and Costa T. Constitutively active G protein-coupled receptor mutants: implications on receptor function and drug action. Assay Drug Dev Technol. 1: 311-6 (2003).

Duhl DM, Vrieling H, Miller KA, Wolff GL and Barsh GS. Neomorphic agouti mutations in obese yellow mice. Nat Genet 8: 59-65 (1994).

Dryga TP, Berson EL, Rao VR and Oprian DD: Heterozygous missense mutation in the rhodopsin gene as a cause of congenital stationary night blindness. Nat Genet 4: 280–283 (1993).

Ehrlich P (1908) Nobel lecture on partial functions of the cell. The Collected Papers of P. Ehrlich, Vol III, (Himmelweit F, Marquardt M, Dale HH eds) pp 183–194, Oxford, Pergamon Press.

Feldman RS., Meyer JS., Quenzer LF., Principles of Neuropsychopharmacology, Sinauer Associates Inc. (1997).

Hollenberg MD. Receptor Binding and Agonist Efficacy: New Insights from Mutants of the Thrombin Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1). Mol Pharmacol 58 : 1175-1177. (2000).

Houde RW and Wallenstein SL (1956) Clinical studies of morphine-nalorphine combinations. Fed. Proc. 15: 440-441 (1956).

Katzung B.C., Εισαγωγή στη Φαρμακολογία, Ιατρικές Εκδόσεις Πασχαλίδη (2005).

Kusaka T, Yamada S and Kimura R. Characterization of specific [3Η]Nociceptin binding in rat brain and spinal cord. Biol Prarm Bull 24: 902-905 (2001).

Lambert DG., Drugs and Receptors, Continuing Education in Anaestesia, Critical Care and Pain, Volume 4: 181-184 (2004).

Langley JN. On nerve endings and on special excitable substances in cells. Proc R Soc B Biol Sci. 70:170–194 (1906).

Lasagna L and Beecher HK. Analgesic effectiveness of nalorphine and nalorphine-morphine combinations in man. J Pharmacol Exp Ther. 112: 356-363 (1954).

Lu D, Willard D, Patel IR, Kadwell S, Overton L, Kost T, Luther M, Chen W, Woychik RP, Wilkison WO and Cone CD. Agouti protein is an antagonist of the melanocyte-stimulating-hormone receptor. Nature 371: 799-802 (1994).

Maehle A-H, Prüll C-R Halliwell RE. The emergence of the drug receptor theory. Nat Rev Drug Discov 1: 637-641 (2002).

Mathews CK, van Holde KE and Ahern KG. Biochemistry, 3η έκδοση. Εκδόσεις Wesley-Longman (2000).


Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvinerie P, Butour JL, Guillemot JC, Ferrara P, Monsarrat B, Honoré Mazarguil, Vassart G, Parmentier Μ and Costentin J. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377: 532-5 (1995).

Nijenhuis WA, Oosterom J and Adan RAH. AgRP(83-132) acts as an inverse agonist on the human-melanocortin-4 receptor. Mol Endocrinol. 15: 164-71 (2001).

Page et al. "Ποσοτική έκφραση δράσης φαρμάκων" στο: Φαρμακολογία. Επιμέλεια Ελληνικής έκδοσης Π. Γαλανοπούλου-Κούβαρη και Χ. Λιάπη. Εκδόσεις Πασχαλίδη (2000).

Robinson PR, Cohen GB, Zhukovsky EA and Oprian DD. Constitutively active mutants of rhodopsin. Neuron 9: 719–725 (1992).

Rosenthal ΗE. A graphic method for the determination and presentation of binding parameters in a complex system. Anal. Biochem. 20: 525-532 (1967).

Schwartz MW, Woods SC, Porte D Jr, Seeley RJ, Baskin DG. Central nervous system control of food intake. Nature 404: 661-671 (2002).

Snyder SH and Pasternak GW. Historical review: Opioid receptors. Trends Pharmacol Sci. 24: 198-205 (2003).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11145747

AΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΣΥΝΔΕΣΗ LIGAND - ΥΠΟΔΟΧΕΑ · Web viewΤο κριτήριο...

Documents

Transcript of AΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΣΥΝΔΕΣΗ LIGAND - ΥΠΟΔΟΧΕΑ · Web viewΤο κριτήριο...