A β amyloid progresszió hatása a mitokondriális proteomra és...

A β-amyloid progresszió hatása a mitokondriális proteomra és

oxidatív metabolizmusra - a szinaptikus mitokondriumok

kitüntetett szerepe

Doktori (Ph.D.) értekezés

Völgyi Katalin

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar,

Biológia Doktori Iskola, Molekuláris sejt- és neurobiológiai doktori program

A Doktori iskola vezetője: Dr. Erdei Anna

Programvezető: Dr. Sass Miklós

Témavezető: Dr. Juhász Gábor

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar,

Biológiai Intézet, Proteomikai Laboratórium

Budapest

2015

2

Rövidítésjegyzék ...................................................................................................................................................................... 4

1. BEVEZETÉS ....................................................................................................................................................................... 6

1.1. A neurodegeneratív betegségek .............................................................................................................................. 7

1.2. Az Alzheimer-kór patomechanizmusa ................................................................................................................. 9

1.3. Az Alzheimer-kór altípusai.................................................................................................................................... 11

1.4. Az APP hasítási folyamata: az Aβ és más hasítási termékek képződése................................................... 13

1.5. A β-amyloid aggregációja ...................................................................................................................................... 16

1.6. Az Alzheimer-kór kutatásában használt emlős modelleken elért legfőbb eredmények és

felhasználhatóságuk a gyógyszerkutatás ban ............................................................................................................ 17 1.6.1. Spontán modellek ................................................................................................................................................17 1.6.2. Farmakológ iai, kémiai és lézió-indukált rágcsáló modellek........................................................................18 1.6.3. Az Aβ-kezelt rágcsáló modellek.......................................................................................................................19 1.6.4. Transzgenikus rágcsáló modellek .....................................................................................................................22

1.6.4.1. Transzgenikus egér modellek ....................................................................................................................22 1.6.4.2. Transzgenikus patkány modellek .............................................................................................................26

1.7. Az Alzheimer-kór hipotézisei ................................................................................................................................ 28

1.8. A mitokondriumok ál talános jellemzése ............................................................................................................ 29 1.8.1. A mitokondriumok felép ítése ............................................................................................................................29 1.8.2. A mitokondriális genom.....................................................................................................................................30 1.8.3. A mitokondriális proteom ..................................................................................................................................31

1.9. A β-amyloid által okozott mitokondriális elváltozások .................................................................................. 33 1.9.1. A β -amylo id mitokondriális lokalizációja és legfőbb fehérjeinterakció i ...................................................33 1.9.2. A mitokondriális energiametabolizmus Alzheimer -kórban .........................................................................34 1.9.3. A mitokondriális oxidatív stressz Alzheimer-kórban....................................................................................36 1.9.4. Csökkent mitokondriális dinamika és transzport Alzheimer-kórban .........................................................37

1.9.4.1. Mitokondriális dinamika ............................................................................................................................37 1.9.4.2. Mitokondriális transzport...........................................................................................................................40

1.9.6. A szinaptikus mitokondriumok érintettsége Alzheimer-kórban..................................................................43

1.10. A mitokondriumok proteomikai kutatása Alzheimer-kórban .................................................................. 45

2. CÉLKITŰZÉS EK ............................................................................................................................................................ 46

3. ANYAGOK, MÓDS ZEREK ......................................................................................................................................... 48

3.1. Különböző Aβ aggregátumok fiziológiai hatásának összehasonlítása ....................................................... 48 3.1.1. Homogén aggregáltsági fokú amylo id oldatok előállítása ...........................................................................48 3.1.2. Az aggregációs fok ellenőrzése a kísérletben alkalmazott oldatokban ......................................................49

3.1.2.1. Atomerő mikroszkópia (AFM) .................................................................................................................49 3.1.2.2. Thioflavin-T fluoreszcencia ......................................................................................................................49

3.1.3. Patkány hippocampális populációs tüzelésének vizsgálata ..........................................................................50

3.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra, a

szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepe .................................................................................................... 52 3.2.1. A mitokondriális kísérletekben felhasznált állatmodellek ...........................................................................52

3.2.1.1. Balb/c egérmodell .......................................................................................................................................52 3.2.1.2. APP/PS1 egérmodell ..................................................................................................................................52

3.2.2. A β -amylo id progresszió kimutatása 3, 6, illetve 9 hónapos egéragyban..................................................52 3.2.3. Szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok izolálása.........................................................................53 3.2.4. A mitokondrium minták t isztaságának ellenőrzése .......................................................................................54

3.2.4.1. Elektronmikroszkópia ................................................................................................................................54 3.2.4.2. Fluoreszcencia akt ivált sejt analízis és szortolás (FACS) ....................................................................55

3

3.2.5. Proteomikai analízis kétdimenziós differenciál gélelektroforézissel (2D-DIGE) ....................................55 3.2.6. Preparatív kétdimenziós gélelekt roforézis ......................................................................................................58 3.2.7. Fehérjeazonosítás tömegspektrometriával (nanoUHPLC-MS/MS) ...........................................................58 3.2.8. Funkcionális csoportosítás .................................................................................................................................59 3.2.9. A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása Western blot technikával (WB) ......................................60 3.2.10. A Sucla2, Idh3a és C1qbp fehérjék lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata ..........................61 3.2.11. A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációjának immun-elektronmikroszkópiai v izsgálata......................62 3.2.12. Az APP/PS1 – B6 modellek összehasonlítása során kapott mitokondriális fehérjeváltozások

bioinformat ikai analízise ...............................................................................................................................................63 3.2.13. A mitokondriális oxigénfogyasztás összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban .................................64 3.2.14. A mitokondriális H2O2 termelés összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban ......................................64

4. EREDMÉNYEK ............................................................................................................................................................... 65

4.1. A különböző Aβ aggregátumok sejtek excitabilitására gyakorolt fiziológiai hatásának eredményei65 4.1.1. Az Aβ oldatok in vitro karakterizálása ............................................................................................................65 4.1.2. Elektrofizio lógiai eredmények ..........................................................................................................................66

4.2. A szinaptikus én nem szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának eredményei 68 4.2.1. A mitokondrium preparátumok t isztaságának igazolása elektronmikroszkópiával .................................68 4.2.3. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közötti fehérjekülönbségek ....................................70 4.2.4. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása ..............................................................................................74 4.2.5. A szignifikánsan megváltozott fehérjék validálása .......................................................................................77

4.3. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt hatásának

eredményei ......................................................................................................................................................................... 80 4.3.1. Az Aβ plakkok eloszlása ....................................................................................................................................80 4.2.2. A mitokondrium minták oxigén fogyasztásának összehasonlítása .............................................................81 4.2.3. A mitokondrium minták H2O2 termelődésének összehasonlítása ...............................................................81 4.2.5. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása ..............................................................................................89 4.2.7. Az APP/PS1 és B6 egerek közötti mitokondriális fehérjeváltozások bioinformatikai analízise ...........92 4.2.8. A Htra2 és Ethe1 fehérjeváltozások validálása Western blottal..................................................................94

5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA ............................................................................................................................ 95

5.1. A szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepének molekuláris hátterének vizsgálata - a

szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlítása ........................................... 95

5.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra –

3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának és oxidatív

metabolizmusának összehasonlítása. ........................................................................................................................102

6. KONKLÚZIÓ ..................................................................................................................................................................109

Irodalomjegyzék ..................................................................................................................................................................112

Összefoglalás.........................................................................................................................................................................134

Summary ...............................................................................................................................................................................135

Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................................................................136

Publikációs lista ...................................................................................................................................................................137

4

Rövidítésjegyzék

Aβ: β-amyloid

ABAD Aß kötő alkohol dehidrogenáz (Aß-binding alcohol dehydrogenase)

AICD: APP intracelluláris domén

AK: Alzheimer-kór

ALS: amiotrófiás laterálszklerózis

APP: amyloid prekurzor protein

BACE: β-szekretáz, β-site APP-cleaving enzyme

CK: citrát-kör / citromsav-ciklus / trikarbonsav-ciklus

CTFα: APP C-terminális fragmens

CTFβ: membrán-kötött C-terminális fragmens

CypD: ciklofilin D (cyclophilin D)

Drp1: dinaminszerű protein 1 (dynamin-related protein 1)

Ethe1: perszulfid dioxigenáz Ethe1 (persulfide dioxygenase ETHE1, ethylmalonic

encephalopathy protein 1, hepatoma subtracted clone one protein, sulfur

dioxygenase ETHE1)

ER: endoplazmatikus retikulum

ETL: elektrontranszportlánc

FDG-PET: fluor-18-dezoxi-glükóz pozitronemissziós tomográfia

Fis1 mitokondriális fission 1 fehérje (mitochondrial fission 1 protein)

HK: Huntington-kór

Htra2 szerin proteáz Htra2 (serine protease HTRA2)

iAβ: intracelluláris β-amyloid

αKGDH: α-ketoglutarát dehidrogenáz komplex

MAM: mitokondrium asszociált ER membrán

Sod2: Mn szuperoxid dizmutáz / szuperoxid dizmutáz 2

MAPK: mitogén-aktivált protein kináz

MCI: enyhe kognitív zavar (mild cognitive impairment)

MDH: malát dehidrogenáz komplex

Mfn1 mitofuzin-1

Mfn2 mitofuzin-2

mMP: mitokondriális membrán potenciál

MRI: mágneses rezonancia képalkotás (magnetic resonance imaging)

5

mtDNS: mitokondriális DNS

NFK: neurofibrilláris köteg (neurofibrillar tangle)

nsMito: nem-szinaptikus mitokondrium

Opa1: optikus atrófia fehérje 1

PAM: prekurzor fehérje transzlokáz asszociált motorfehérje (preprotein translocase-

associated motor)

PDH: piruvát dehidrogenáz komplex

PK: Parkinson-kór

PreP preszekvencia proteáz

PS1: preszenilin 1

PS2: preszenilin 2

ROS: oxigén eredetű szabadgyökök, reaktív oxigén fajták (reactive oxygen species)

sAPPα: szolubilis α APP fragmens

sAPPβ: szolubilis β APP fragmens

ς1R: ς-1 receptor

SDH: szukcinát dehidrogenáz

sMito: szinaptikus mitokondrium

SPECT: egyfotonos emissziós computer tomográfia (single photon emission computed

tomography)

Snca: α-szinuklein (α-synuclein)

TIM: belső membrán transzlokációs komplex (translocase of the inner membrane)

TOM: külső membrán transzlokáz (translocase of the outer membrane)

UPR: hibás konformációjú fehérje válasz (unfolded protein response)

Vdac1: feszültségfüggő anion csatorna 1 (voltage-dependent anion channel 1)

6

1. BEVEZETÉS

Az Alzheimer-kór (AK) egy progresszív neurodegeneratív betegség, mely

kialakulásának első lépései ismeretlenek, a kórképek megjelenésekor a betegség már

előrehaladott állapotú. Az AK-t megelőző állapot az ún. enyhe kognitív zavar (mild cognitive

impairment, MCI) nehezen definiálható és nem mindig vezet AK-hoz. Az AK tünetei a kor

előrehaladtával kialakuló spontán öregedési demencia felgyorsulásának is tekinthetőek,

emberben az AK és a demencia határai összemosódnak. Mindezek miatt szükség lenne

nagyon korai, még a tünetek megjelenése előtt kimutatható, diagnosztikus értékű markerek

illetve terápiás molekuláris célpontok feltárására. Kutatási munkánk ebbe a trendbe csatolható

be. Az AK első diagnosztizálható tünete a fluor-18-dezoxi-glükóz pozitronemissziós

tomográfia (FDG-PET) képalkotó eljárással mért anyagcsere csökkenés az agyban (Mosconi

és mtsai., 2007). Ebből kiindulva a neurodegeneratív betegségekben bekövetkező

mitokondriális anyagcsere változások megismerésére számos kutatás irányul (Moreira és

mtsai., 2010; Reddy és Reddy, 2011). Az eddigi AK modellek kísérleti eredményei (Eckert és

mtsai., 2008; Chou és mtsai., 2011), illetve a humán AK adatok egyértelműen igazolják, hogy

a mitokondriális anyagcsere, a mitokondriumokban folyó oxigén eredetű szabadgyök (ROS)

képződés jelentősen megváltozik AK során, ami a mitokondriumok molekuláris

átalakulásához vezethet (Chen és Yan, 2007). Ismertek olyan mitokondriális fehérjék is,

melyekhez az AK-ra jellemző kóros konformációjú β-amyloid (Aβ) fehérje nagy affinitással

kötődik (Olah és mtsai., 2011; Pagani és mtsai., 2011), így közvetlenül befolyásolja azokat.

Az AK korai szakaszának lehetséges molekuláris mechanizmusára tehát egyre elfogadottabb

elmélet az AK mitokondriális hipotézise (Swerdlow és mtsai., 2004). A mitokondriumok

molekuláris felépítése függ a környezetüktől illetve a sejten belüli pozíciójuktól (Johnson és

mtsai., 2007). A különbségek oka a különböző sejtrégiók eltérő metabolikus igénye. Az

idegrendszerben energetikailag kitüntetetten magas anyagcsere igényű a szinapszis, amit jelez

az a tény, hogy a szinaptikus régióban nagy számban találhatóak mitokondriumok igen kis

térfogatban. A szinaptikus mitokondriumok neurodegeneratív és pszichiátriai betegségekben

való érintettsége (Vos és mtsai., 2010) indokolttá teszi a részletesebb molekuláris

megismerésükre irányuló kutatásokat. AK-ban a szinapszisok száma csökken és kimutathatók

a szinaptikus működés zavarai (Marcello és mtsai., 2012). A tanulási zavarok egyfelől a

kevesebb szinapszisnak, másfelől a szinaptikus plaszticitás csökkenésének tudhatóak be

(Selkoe, 2008). A dolgozat munkahipotézisének alapja tehát, hogy a szinaptikus

mitokondriumokban nagyon korai, akár funkcionálisan kompenzált változások alakulhatnak

7

ki az AK-t megelőző MCI kezdeti fázisában molekuláris szinten. A változások oka az Aβ

nagy affinitású kötődése a szinapszis egyes fehérjéihez, melynek hatására bekövetkező

expressziós változásoknak a szinaptikus proteomban meg kell jelenniük. Feltételezzük, hogy a

proteomikai változások funkcionális következménnyel járhatnak, továbbá kialakulásuk időben

változó lehet, hiszen a korai hibákat a mitokondriális protein szintézis kompenzálni próbálja.

Úgy gondoljuk, hogy mivel a szinaptikus elektrogenezis energetikai kiszolgálása elsőbbséget

élvez a szinaptikus régió metabolikus szabályozásában, a kezdeti, talán még megfordítható

változások között értékes terápiás célpontok lehetnek. A kísérleti munkánkat erre a gondolatra

építettük fel.

1.1. A neurodegeneratív betegségek

A korai tünetek megjelenésétől fokozatosan súlyosbodó, végül elkerülhetetlenül

halálos kimenetelű neurodegeneratív betegségektől emberek milliói szenvednek.

Megjelenésük általában az élet késői szakaszaira tehető, így a napjainkban tapasztalható

átlagéletkor-növekedés a betegségben érintett emberek számának gyors növekedését vetíti

előre. A neurodegeneratív betegségek letalitása jelenleg magasabb, mint a legtöbb daganatos

betegségé. A betegek ápolása hatalmas pszichés, testi és anyagi terhet jelent a társadalom

számára (Thompson és mtsai., 2007).

Neurodegeneratív betegségeknek összefoglaló néven azokat a kórképeket nevezzük,

melyekben az elsődleges patológiás elváltozás a központi idegrendszer specifikus területein

az idegsejtek előrehaladott, a fiziológiás mértéket jóval meghaladó szelektív pusztulása.

Klinikai és neuropatológiai szempontból igen heterogén betegségcsoport, mely sok esetben

kevert tüneteket mutat. A rendellenes fehérjefeltekeredés a legtöbb neurodegeneratív betegség

velejárója, ilyenek az AK, Parkinson-kór (PK), Huntington-kór (HK), Lewy-testes demencia,

Pick demencia, az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), prion betegségek (Creutzfeldt-Jacob

demencia emberben, „scrapie” bárányban és a szivacsos agysorvadás marhában),

frontotemporális demencia és Pick-betegség.

Molekuláris szinten valamennyi kórkép hátterében az áll, hogy a sejtek fiziológiás

funkciójú fehérjéinek natív konformációja megváltozik, mely változás következményeként

aggregációra fokozottan hajlamos, részlegesen vagy teljesen proteáz rezisztens, patológiás

hatású peptidek halmozódnak fel (Kovács, 2014). Ezeket a betegségeket gyűjtőnéven

fehérjekonformációs betegségeknek nevezzük. A fehérjeaggregáció következtében

8

extracelluláris plakkok (AK), intracelluláris lerakódások (AK, PK, Lewy-testes demencia)

vagy akár intranukleáris aggregátumok is kialakulhatnak.

A neurodegeneratív betegségek osztályozása leginkább fehérje-alapú. Az 1. táblázat a

sporadikus neurodegeneratív betegségek osztályozását, és a hátterében álló hibás

konformációjú fehérjéket mutatja be (Völgyi és mtsai., 2015a).

1. táblázat A konformációs neurodegeneratív betegségek és a betegség hátterében álló kóros

fehérjeaggregátumok (Völgyi és mtsai., 2015a) .

A neurodegeneratív betegségekre jellemző hibás konformációjú fehérjék gyakran

átfednek (Sambamurti és mtsai., 2011). Habár az AK és PK klinikai és patológiai

szempontból jól elkülöníthető, számos közös mechanizmus jellemzi őket (Xie és mtsai.,

2014). Az AK-os betegek 50-60%-ban kóros konformációjú α-szinuklein (Snca) is

kimutatható az agyban, habár az α-szinuklein aggregátumokból stabilizálódó Lewy-test

zárványok a PK és a Lewy-testes demencia legfőbb patológiai elváltozásai (Kim és mtsai.,

2014). Másrészről számos adat igazolja, hogy az AK patológiájának több aspektusa

megfigyelhető PK-os és Lewy-testes demenciában szenvedő betegekben is (Irwin és mtsai.,

2013). A Lewy-testes demencia az AK és PK közötti átmenetet mutató betegség, melyet

klinikai képalkató eljárások eredményei és neurokémiai adatok igazolnak (Schade és mtsai.,

2014).

A hibásan feltekeredő fehérjék kialakulása és felhalmozódása igazolja, hogy az

endoplazmatikus retikulum (ER) által meghatározott fehérjefeltekeredés és kontrollálás

jelentős szerepet játszanak a neurodegeneratív betegségek patológiájában. A hibás

feltekeredés és az ER-stressz tehát szoros összefüggésben állnak. A leggyakoribb

neurodegeneratív betegségeket (AK, PK, HK, ALS, prion betegségek) az ER-stressz és a

NEURODEGENERATÍV BETEGSÉG FEHÉRJE-AGGREGÁTUM

β-amiloid (plakkok)

tau (neurofibrilláris kötegek)

α-szinuklein

TDP-43

2. Parkinson-kór, PK α-szinuklein / ubikvitin

5. Huntington-kór, HK poli-glutamin / ubikvitin

3. Lewy-testes demencia α-szinuklein

8. Amiotróf laterál szklerózis, ALS ubikvitin

6. Prion-betegség (Creutzfeld-Jacob kór) prion protein

4. Frontotemporális demencia (FTDP-17) tau (Pick-testek)

7. Pick-betegség tau (Pick-testek)

1. Alzheimer-kór, AK

9

szerkezet nélküli, vagy hibásan feltekeredett fehérje-válasz (”Unfolded Protein Response”

(UPR)) alapján kategorizálják (Kim és mtsai., 2008). Az UPR az ER-nek egy adaptív stressz

válasza, amit az ER-ben hibásan feltekeredett fehérjék felhalmozódása vált ki. Az UPR egy

túlélési válasz, mely során a sejt megpróbálja csökkenteni az ER lumenében található rosszul

feltekeredett fehérjék mennyiségét a fehérjeszintézis blokkolásával, illetve a hősokk-fehérjék

(dajkafehérjék, chaperonok) expressziójának fokozásával. Az ER funkciózavar vizsgálata

AK-ban (Li és mtsai., 2015) és más neurodegeneratív betegségekben intenzíven kutatott

terület (Roussel és mtsai., 2013; Hetz és mtsai., 2014).

A neurodegeneratív betegségekre jellemző, ER-stresszel és fehérjeaggregátumok

felhalmozódásával együtt járó, legfőbb korai elváltozás a mitokondriális zavar (Reddy és

mtsai., 2011), ami az AK kutatás napjaink egyik legígéretesebb területe (Selfridge és mtsai.,

2013; Picone és mtsai., 2014).

1.2. Az Alzheimer-kór patomechanizmusa

1. ábra Alois Alzheimer (A) és Auguste Deter nevű betegében megfigyelt amyloid plakkok (B, C) és

neurofibrilláris kötegek (D) (Bielschowsky-féle ezüstözés). A plakkok a cortex felső rétegeire jellemzőek (B)

(http://ibro.info/wp-content/uploads/2012/12/Alzheimer-Alois-2003.pdf).

Az AK súlyos memóriazavarokkal járó neurodegeneratív kórkép, melyet elsőként

Alois Alzheimer (1864-1915) írt le 1907-ben "Über eine eigenartige Erkankung der

Hirnrinde" címmel, melynek 1995-ben megjelent angol fordítása is (Alzheimer és mtsai.,

1995). A német ideggyógyász a betegség kognitív tüneteit Auguste Deter nevű 51 éves

nőbetegén tapasztalta meg, akit feledékenység, tájékozódási zavarok, hangulatingadozások és

hallucinációk jellemeztek. Alzheimer, bár a beteget meggyógyítani nem tudta, fokozatosan

súlyosbodó állapotát haláláig (1906) nyomon követte. Post mortem vizsgálatai alapján

egyenletes agyi atrófiát állapított meg. Bielschowsky ezüstözést alkalmazva fokozott

sejtpusztulást, az idegsejteken belül neurofibrilláris kötegek felgyülemlését és egy speciális

10

anyag (későbbi amyloid plakkok) extracelluláris lerakódását figyelte meg a cortexben.

Mindezek alapján a kórképet egy új betegségnek tekintette, amit később róla nevezték el

Alzheimer-kórnak (1. ábra).

Az AK a konformációs neurodegeneratív betegségek leggyakoribb formája, a betegek

száma a kor előrehaladtával öt évenként megduplázódik. Az Egészségügyi Világszervezet

népbetegséggé nyilvánította, a fejlett nyugati országokban a 65 év feletti lakosság több mint

10%-át, a 85 éven túliak több mint 40%-át érinti. 2012-es adat szerint világszerte ~45 millió

ember, Magyarországon pedig körülbelül 150.000 ember szenved AK-ban. Sajnos pontos

adatok azonban nincsenek, mivel rengeteg lehet a diagnosztizálatlan beteg. Az AK korlátozza

a betegeket a mindennapi tevékenységeik elvégzésében, továbbá számos kognitív zavarral jár,

mint a memóriavesztés, beszédzavar, vizuális diszfunkció, személyiség és hangulatváltozások

(apátia, agitáció, szorongás és depresszió) (Mega és mtsai., 1996). Az AK-os betegek agyában

felgyülemlő hidrofób aggregátumok kialakításában különböző polipeptidek és fehérjék

vesznek részt, ilyenek az Aβ fehérje 1-40, 1-42, 4-40, 3-42 és 4-42 formái, gyakran az α-

szinuklein és hiperfoszforilált tau-fehérjék. Az Aß peptid az amiloid prekurzor fehérje (APP)

hibás hasításának terméke. Neuropatológiailag az AK-t a hiperfoszforilált tau fehérjéből álló

intracelluláris neurofibrilláris kötegek (NFK), extracelluláris Aβ-plakkok, intracelluláris Aß

oligomerek, cerebrovaszkuláris elváltozások, asztrocita és mikroglia aktiváció, szinapszis és

idegsejt pusztulás a szeptum, bazális előagy és mediális temporális lebeny területén

(hippocampus, entorhinális kéreg és amygdala) jellemzik (Mattson, 2004) (2. ábra).

Több mint 100 év intenzív kutatás után az AK oka máig feltáratlan, továbbá nincs

hatékony gyógymód a kezelésére. Az AK etiológiájának kutatása számos hipotézist vetett fel

az idők során (ld. 1.6. fejezet), azonban máig nem tudják megválaszolni az összes kérdést a

kórkép kialakulását illetően. Az AK-os betegek 36%-át napjainkban is tévesen

diagnosztizálják, pontos diagnózist csak a post mortem mintákon elvégzett vizsgálatok adnak.

A neurodegeneratív betegségek kezelése legtöbbször az ismeretlen kórfejlődésének

köszönhetően megoldatlan. A diagnózis túlságosan későn történik, amikor az elpusztult sejtek

nagy száma miatt a folyamat már visszafordíthatatlan. Jelenleg csak olyan terápia áll

rendelkezésünkre, amely a kórlefolyás lassításával, a tünetek enyhítésével, megjelenésük

késleltetésével javíthatja az érintett emberek életminőségét, de megoldást nem nyújt a

betegségek okozati kezelésére. Az AK korai diagnózisa tehát az idegrendszeri kutatás fontos

kihívása. A gyógyszerfejlesztési törekvések legfőképpen az extracelluláris Aβ-t és Aβ-

plakkokat célozták meg. Később azonban egyre nagyobb figyelmet fordítottak az

idegsejtekben felgyülemlő intracelluláris Aβ (iAβ) formára is (LaFerla és mtsai., 2007).

11

2. ábra Az Alzheimer-kór neuropatológiai elváltozásai: hiperfoszforilált tau fehérjéből álló intracelluláris

neurofibrilláris kötegek (NFK), extracelluláris Aß-plakkok, intracelluláris Aß oligomerek, cerebrovaszkuláris

elváltozások, asztrocita és mikroglia aktiváció, szinapszis és idegsejt pusztulás (Mucke, 2009).

1.3. Az Alzheimer-kór altípusai

Jelen tudásunk szerint az AK egy heterogén, multifaktoriális betegség széles klinikai

spektrummal (Lam és mtsai., 2013), tehát nem releváns az „Alzheimer-kórról”, mint

egységes, prediktálható lefolyású betegségről beszélni (Jellinger és mtsai., 2015). Az AK

sokkal inkább egy olyan szindróma, ami különböző klinikai formákkal rendelkezik. A

neurofiziológiai és PET adatok illetve az AK patológiája alátámasztja az elképzelést,

miszerint jól elkülöníthető altípusai vannak a betegségnek (Friedland és mtsai., 1988; Fisher

és mtsai., 1997; Janocko és mtsai., 2012).

Az AK két fő formája a korai jelentkezésű, familiáris forma és a késői (65 éves kor

feletti) sporadikus forma. Az AK-os betegek kevesebb, mint 5%-át érinti a familiáris típus,

melynek hátterében az APP és γ-szekretáz komplex (preszenilin 1 és 2) öröklött mutációi

állnak (Chavez-Gutierrez és mtsai., 2012). Teljes genom asszociációs vizsgálatok (Genome

wide association studies, GWAS) kimutatták, hogy a familiáris AK patofiziológiájában

számos más gén és génkombináció is szerepet játszik (pl. apolipoproteinE ε4 allél (ApoEε4),

PICALM, BIN1, ABCA7, SORL1…).

12

További osztályozás alapján az AK felosztható a klinikai elváltozások szerint is. PET

hipometabolizmus vizsgálatok, nyelv és vizuoperceptív elváltozások és neuropszichológiai

vizsgálatok alapján a következő altípusokat állapították meg (Lam és mtsai., 2013):

1) Általános AK: késői AK szindróma amnéziás tünetekkel és főként hippocampális

és temporális-parietális atrófiával

2) Temporális (enyhén amnéziás) AK, lassú hanyatlással (3/A ábra)

3) Progresszív afázia bal oldali (nyelvi) formája, súlyosabb memória zavarok nélkül

(3/B ábra)

4) Jobb oldali (vizuoperceptív) AK (3/C ábra)

5) Frontális (executive) AK (3/D ábra)

3. ábra Az Alzheimer-kór különböző klinikai altípusainak MRI (bal oldal) és SPECT (jobb oldal) felvételei.

A: temporális altípus: erőteljes hippocampális atrófia (fehér nyilak) és meziotemporális hipoperfúzió (piros

nyilak) a hippocampus szintjén készült koronális felvételen (lent), míg a bazális ganglionok szintjén készült

axiális T1 MRI és SPECT felvételen nincs elváltozás (fent); B: nyelvi (bal oldali) altípus: erőteljes bal

parietális atrófia és oldalsó kamra tágulat (fehér nyíl), valamint parietális hipoperfúzió (piros nyíl) a bazális

ganglionok szintjén készült felvételen; C: jobb oldali (vizuoperceptív) altípus: jobb oldali temporális és

parietális atrófia (fehér nyíl), oldalsó kamra tágulat (bal) és hipoperfúzió (jobb) a középagy szintjén készült

felvételen (fent), ami kevésbé kifejezett a bazális ganglionok szintjén (lent); D: frontális (executive) altípus:

frontális atrófia (bal) és hipoperfúzió (jobb) a bazális ganglionok szintjén készült felvételen (Lam és mtsai.,

2013).

13

Az AK összes altípusának általános patológiai jellemzői az extracelluláris Aβ-plakkok

és intracelluláris NFK-ek jelenléte. Az AK progresszió mértékének karakterizálására tehát az

NFK akkumulációt („Braak tangle stages”) (Braak és mtsai., 1995) és Aβ lerakódást (Thal és

mtsai., 2002; Thal és mtsai., 2015) használják. A tau hiperfoszforiláció és Aβ aggregáció

szinergista módon hatnak az AK-os agyban (Nisbet és mtsai., 2015). Habár tény, hogy az Aβ

önmagában nem váltja ki az AK-t és léteznek tünetmentes, lokális Aβ-plakk felhalmozódást

mutató betegek is (Sambamurti és mtsai., 2011; Jellinger és mtsai., 2012), az Aβ-nak számos

toxikus formája ismert. Az APP hasítási folyamata tehát egy kulcsfontosságú tényező az AK

patomechanizmusában.

1.4. Az APP hasítási folyamata: az Aβ és más hasítási termékek képződése

Az APP az idegsejtekben fiziológiásan előforduló transzmembrán glikoprotein, amely

egy kisméretű intracelluláris C-terminális, egy nagyméretű extracelluláris N-terminális és egy

transzmembrán doménnel rendelkezik (Reinhard és mtsai., 2005). Az APP-nek 8 izoformája

ismert (695-770 aminosavas izoformák), melyek közül a 695 aminosavas izoforma nagy

mennyiségben expresszálódik a központi idegrendszerben. Az APP overexpresszió vizsgálata

során kiderült, hogy az APP pozitívan hat a sejtek túlélésére és növekedésére (Thinakaran és

mtsai., 2008), továbbá indukálja a neurit arborizációt szöveti sérülés során (Leyssen és mtsai.,

2005), valamint jelentős szerepet játszik a szinapszis fenntartásában és kialakításában (Roch

és mtsai., 1994; Turner és mtsai., 2003).

A központi idegrendszert ért traumák hatására az APP és ennek hibás hasítási terméke

az Aβ fokozatosan növekvő mértékben képződik. Az Aβ képződés folyamatának vizsgálata az

AK kutatásának egyik központi kérdése (Takami és mtsai., 2009; Xu, 2009; Sambamurti és

mtsai., 2011). Az APP fehérje legfőbb hasítását az α, β és γ-szekretázok végzik, azonban mára

már számos APP-t hasító enzimet írtak le (cink metallopreoteinázok: TACE/ADAM17,

ADAM9, ADAM10, MDC-9, aszpartil proteáz: β-szekretáz (BACE)) (Allinson és mtsai.,

2003). Az APP-nek két lebontási útvonala ismert: a 90%-ban bekövetkező fiziológiás / nem-

amyloidogén útvonal és a maradék 10%-ot érintő alternatív / amyloidogén útvonal (Zheng és

mtsai., 2006).

A fiziológiás útvonal során az α-szekretáz hasítása által az APP-ből vízoldható, nem

toxikus peptidek sokasága képződik (szolubilis α APP (sAPPα) és APP C-terminális fragmens

(CTFα)), melyek normál körülmények között nem mutatnak aggregációs hajlamot. A CTFα

14

peptidfragmens a γ-szekretáz által hasad tovább a p3 (3 kDa-os fragmens) és az APP

intracelluláris domén (AICD) fragmensekre. A γ-szekretáz egy nagy molekulatömegű

fehérjekomplex, ami többek között a preszenilinből (1 és 2), a preszenilin enhancerből

(PEN2), nikasztrinból és az Aph1-ből áll (Iwatsubo, 2004), azonban az alegységek listája

fokozatosan bővül az új molekulák azonosításával (Addya és mtsai., 1997; Chen és mtsai.,

2006) (4. ábra).

Az amyloidogén útvonal során azonban az APP-t először a BACE hasítja, melynek

következtében szolubilis β APP fragmens (sAPPβ) képződik. A BACE egy transzmembrán

aszpartil-proteáz, melyet a neuronok nagy mennyiségben expresszálnak (Hussain és mtsai.,

1999; Sinha és mtsai., 1999). A megmaradt membrán-kötött C-terminális fragmens (CTFβ) a

membránon belül hasad tovább a γ-szekretáz által, ami az AICD és az Aβ 40 vagy 42

aminosavas (Aβ1-40, Aβ1-42) formáinak képződéséhez vezet. Az Aβ1-42 a γ-szekretáz és a β-

szekretáz hatására keletkezik az APP-ből oly módon, hogy 14 aminosavnyi rész a fehérje

transzmembrán doménjéből, 28 aminosavnyi pedig az extracelluláris (N-terminális) részéből

hasítódik ki. Az Aβ1-42 erősen hidrofób, aggregációra hajlamos szerkezetű proteinfragmens,

amely extracellulárisan szenilis plakkokká aggregálódik (4. ábra).

Sejttenyészeten végzett kísérletekben kimutatták, hogy az Aβ által formált oligomerek

toxikus hatással bírnak (Walsh és mtsai., 2004). Máig nem tisztázott azonban, hogy melyik a

leginkább toxikus oligomer forma (dimer, trimer, tetramer, dodekamer). Az Aβ akkumuláció

jelentős patológiai folyamat az AK-ban, továbbá az Aβ degradáció és lebontás

kulcsfontosságúak az AK progressziójában (Baranello és mtsai., 2015).

Az APP szubcelluláris lokalizációja és hasítási folyamata nem teljesen tisztázott. Az

APP mind a plazmamembránban, mind az intracelluláris organellumok (Golgi készülékben,

ER, endoszóma, lizoszóma, mitokondrium) membránjában jelen levő fehérje (LaFerla és

mtsai., 2007). Kimutatták továbbá, hogy a nem-amyloidogén hasítási útvonal többnyire a

plazmamembránban lokalizálódik, míg az amyloidogén útvonal inkább intracellulárisan

jellemző (Lammich és mtsai., 1999).

Az APP bioszintézisét követően glikozilálódik az ER-ben, majd transzportálódik a

Golgi-készülékbe, ahol O-és N-glikozilálódik, foszforilálódik és szulfonálódik a tirozin

oldalláncokon (Lai és mtsai., 1995). In vitro munkák alapján elmondható, hogy az APP-k

csupán ~10%-a helyeződik ki a plazmamembránba, a többi intracellulárisan a Golgiban és

transz-Golgi hálózatban marad. A plazmamembránba épülő APP képes endocitózissal

internalizálódni a sejtbe (a “YENPTY” motívum jelenlétében), majd elérni az endoszómát

(Perez és mtsai., 1999). Számos szubcelluláris kompartment (transz-Golgi hálózat,

15

lizoszómák, ER, mitokondrium) szerepet játszik az APP intracelluláris hasításában. Újabb

kutatások szerint az APP retromer transzportálódik a korai endoszómából a transz-Golgi

hálózatba, ami jelentős az APP amyloidogén hasítási útvonalában (Choy és mtsai., 2012). Az

APP a Golgiból gyorsan a lizoszómába transzportálódik, ahol kihasad belőle az Aβ (Choy és

mtsai., 2012). Számos tanulmány igazolja az α- és ß-szekretázok jelenlétét az ER-ben,

lehetővé téve az APP ER-ben történő hasítási folyamatát (Chyung és mtsai., 1997; Shin és

mtsai., 2005).

Újabban kimutatták, hogy az APP, a preszenilin 1 és 2 (PS1, PS2) jelentős

felhalmozódást mutatnak a mitokondrium-asszociált ER membránban (MAM), továbbá azt is,

hogy a MAM régió mérete és a γ-szekretáz aktivitás megnő AK-ban (Area-Gomez és mtsai.,

2012). Feltételezik tehát, hogy a MAM egy kitüntetett szubcelluláris régiója az APP

amyloidogén hasítási folyamatának és az Aß képződésnek (Vetrivel és Thinakaran, 2010;

Placido és mtsai., 2014).

4. ábra Az amyloid prekurzor fehérje (APP) amyloidogén és nem amyloidogén/fiziológiás hasítási útvonala. Az

APP-t sematikus rajz ábrázolja (nem méretarányos). EC: extracelluláris, TM: transzmembrán, IC: intracelluláris

domén, APPsα és β: szolubilis α és β APP, CTFα és β: APP C-terminális fragmens α és β, AICD: APP

intracelluláris domén, p3: 3 kDa-os fragmens . A β-amyloid (Aβ) domént bordó szín jelöli (Zheng és mtsai.,

2006).

16

1.5. A β-amyloid aggregációja

Az Alzheimer kóros betegek agyában a peptidek másodlagos szerkezete megváltozik,

és a kórosan feltekeredett peptidek aggregációs hajlama megnő. Az Aβ magas koncentrációt

elérve folyamatosan aggregálódik, a keletkező aggregátumok toxikusak. A toxikus

aggregátumok a sejtfelülethez kötődve sejtelhalást okozhatnak, ami az idegszövet

pusztulásához vezet. Az Aβ keletkezésekor rendkívül „ragadós” felszínnel rendelkezik,

amelynek köszönhetően gyorsan oligomerizálódik, és szinte bármilyen membránfehérjén

képes megtapadni (Verdier és mtsai., 2004). Irodalmi adatokból ismert, hogy az Aβ

aggregátum preferáltan kötődik olyan sejtek membránjához, melyek nagyméretűek és nagy

felületű membránjukban sok proteint expresszálnak. Ilyen sejtek az emlősök agyában a

preoptikus area nagy kolinerg sejtjei, a kérgi piramissejtek, valamint a hippokampális

piramissejtek. Az APP-ből lehasadó amyloid monomerből egy hosszú oligomerizációs

folyamaton keresztül alakul ki a β-redő szerkezet (Nandi, 1996; Mager és mtsai., 2002; Stine

és mtsai., 2003), lerakódásuk az Alzheimer kóros betegek agyának limbikus és asszociatív

kérgi részére jellemző (Glenner és mtsai., 1984; Masters és mtsai., 1985).

5. ábra Aβ-oldatok aggregációjának vizsgálata dinamikus fényszórással (DLS). Az ábra jól mutatja az

aggregátumok különböző időben mért eloszlási profilját, mely Gauss eloszlást követ (bal oldal), valamint az

oligomerek képződésének kinetikáját (jobb oldal) (dH: oligomerek átlagmérete; 24, 60, 190: az Aβ-oldatok

aggregációjának ideje órában) (Penke Botond, Szeged – személyes közlés).

Az aggregáció egy folytonosan előrehaladó folyamat, melynek mértéke függ a kezdeti

amyloid koncentrációtól, hőmérséklettől, szennyeződésektől, stb. (Finder és mtsai., 2007;

Frieden, 2007). A fehérjék aggregációja többlépcsős, összetett folyamat, egy adott

17

időpillanatban egyszerre többféle amyloid forma van jelen, így nehéz eldönteni, hogy a

tapasztalt hatás pontosan mely formának tulajdonítható. Az aggregátumok dinamikus

fényszórással (DLS) történő vizsgálata egyértelműen mutatja, hogy az oldatok Gauss eloszlási

profillal rendelkeznek (5. ábra).

Az oligomerek átlagmérete (dH) az idő függvényében monoton módon növekszik. A

DLS-mérés látszólagos részecskeméretet határoz meg, feltételezve, hogy a vizsgált részecskék

gömb alakúak. Elnyújtott aggregátumok, vékony, hosszú amyloid szálak esetében ezért nehéz

a tényleges dimenziók megállapítása. Az előkísérleteink során is alkalmazott atomerő

mikroszkópia módszere alkalmasabb az Aβ oldatok karakterizálására, pontosabb képet

kapunk a különböző oldatok összetevőinek méreteloszlásáról és morfológiájáról.

1.6. Az Alzheimer-kór kutatásában használt emlős modelleken elért legfőbb eredmények

és felhasználhatóságuk a gyógyszerkutatásban

A humán AK-os minták hozzáférhetőségének limitációja miatt, illetve a betegség

korai fázisát tükröző humán agyminták hiánya következtében a korai AK diagnosztizálására

szolgáló biomarkerek kutatása állatmodelleken lehetséges. A megfelelő állatmodell

kiválasztása az AK korai molekuláris mechanizmusának kutatásában tehát egy

kulcsfontosságú tényező. A következőkben az AK kutatásában leggyakrabban használt emlős

modellek kerülnek bemutatásra spontán, farmakológiai, kémiai és lézió-indukált, Aβ-kezelt és

transzgenikus csoportok alapján. A dolgozatban bemutatásra kerülő kísérletek során

alkalmazott Aβ-kezelt és APP/PS1 modelleken elért eredményekről részletesebben

olvashatunk.

1.6.1. Spontán modellek

Néhány faj, mint a kutya (Cummings és mtsai., 1996; Rofina és mtsai., 2006), macska

(Head és mtsai., 2005; Gunn-Moore és mtsai., 2006), medve (Cork és mtsai., 1988; Uchida és

mtsai., 1995), kecske, bárány (Braak és mtsai., 1994), borz (Roertgen és mtsai., 1996),

valamint számos főemlős (Bons és mtsai., 1994; Gearing és mtsai., 1997) spontán

amyloidózist illetve ritkább esetben taupátiát mutat. Ezek a hisztopatológiai elváltozások

ráadásul kognitív zavarokkal is társulnak (Gunn-Moore és mtsai., 2006; Rofina és mtsai.,

18

2006). Ezeknek az állatoknak a felhasználása kísérleti célokra azonban hozzáférhetőségi,

gazdasági és etikai okokból erősen korlátozott.

Mindezek ellenére a kutya kimondottan alkalmas modell a humán öregedés, a

neurodegeneráció és az AK vizsgálatára (Sarasa és mtsai., 2009), mivel filogenetikailag

közelebb állnak az emberhez mint a rágcsálók, barázdált agyuk van, továbbá viselkedésbeli,

hisztopatológiai és molekuláris szinten is hasonlóságot mutatnak a klinikai AK-val. A kutya

Aβ1–42 fehérje aminosav szekvenciája azonos a humán homológgal, míg például a

rágcsálókban megtalálható Aβ1–42 három aminosavval eltér tőle. A kutyákban megjelenő

kognitív tünetek magába foglalják a normál öregedés, az enyhe mentális zavar (mild cognitive

impairment, MCI) és a korai/közép AK-ban megjelenő elváltozásokat. Ezen hasonlóságok

következtében a kutyákat gyakran használják preklinikai fázisban lévő gyógyszerek

tesztelésére. A kutyák továbbá ideálisak hosszútávú, krónikus kísérletekhez is, mint például

antioxidáns diéta vagy Aβ immunoterápia vizsgálatára (Cotman és mtsai., 2008).

Az idős patkányok nem mutatnak spontán AK-szerű hisztopatológiai elváltozásokat,

így nem használhatóak ezen változásokat megcélzó gyógyszermolekulák fejlesztésére sem.

Felhasználhatóak viszont az AK-ra jellemző neurokémiai és morfológiai elváltozások

tanulmányozására, melyek megjelennek az öregedéshez kötődő kognitív elváltozások és

viselkedésbeli változások szintjén az állatokban (Erickson és mtsai., 2003).

A természetes öregedéssel járó elváltozások fokozottan fordulnak elő az öregedés-

gyorsított, SAM egerekben („senescence-accelerated mouse”, SAM), amit fenotípus alapján

szelektáltak ki az AKR/J egerekből. A SAM törzseket számos öregedéssel együtt járó

betegség vizsgálatára használják. A SAMP8 altörzs igen jelentős a demenciával kapcsolatos

kutatásokban, mivel Aβ akkumulációval együtt járó korfüggő tanulási és memóriazavart

mutat (Yagi és mtsai., 1988).

1.6.2. Farmakológiai, kémiai és lézió-indukált rágcsáló modellek

A neurotranszmitter rendszerekben bekövetkező zavar jelentős szerepet játszik az AK-

ra jellemző kognitív és viselkedési tünetek patofiziológiájának kialakulásában. A legtöbb

ilyen jellegű állatmodell az AK egyik legrégebbi, kolinerg hipotézisének tanulmányozására

alkalmas (Francis és mtsai., 1999). A bazális előagyi Meynert magokban található kolinerg

idegsejtek, melyek axonjai elsődlegesen a neocortexbe vetülnek, az AK korai szakaszában

degenerálódnak (Davies és mtsai., 1976; Whitehouse és mtsai., 1981). A kolinerg rendszerben

illetve a kognitív tünetekben bekövetkező defektusok és az AK neuropatológiája közti

19

korrelációt számos munka igazolja (Martin és mtsai., 1987; Bierer és mtsai., 1995; Dournaud

és mtsai., 1995).

A legáltalánosabban használt farmakológiai AK modell a szkopolamin-indukált

amnézia modell (Sunderland és mtsai., 1986; Preston és mtsai., 1989), ami alkalmas a

kolinerg rendszer szerepének vizsgálatára a kognícióban, továbbá a kolinomimetikumokkal

történő tüneti kezelés hatékonyságának vizsgálatára, mint az acetilkolinészteráz gátlók

(Ahmed és mtsai., 2009; Wong és mtsai., 2010) vagy a muszkarin 1-es receptor agonisták

(Malviya és mtsai., 2008).

Az AK kolinerg hipotézisének vizsgálatára számos léziós modellt fejlesztettek ki. A

lézió történhet fokálisan neurotoxinok által, elektrolitikusan vagy mechanikai roncsolás útján

(Toledano és mtsai., 2004), továbbá érintheti a legfőbb kolinerg központokat vagy általánosan

a kolinerg neuronokat is (Contestabile, 2011). Ezek a modellek alkalmasak a kolinerg

beidegzésű területek vizsgálatára a kognitív zavarral járó betegségekben. Az AK-val társuló

memóriaproblémák szintén reprodukálhatók tanulás és memóriaspecifikus agyterületek

léziójával, mint a hippocampus vagy a striatális és corticális régiók (Gray és mtsai., 1983;

Glenn és mtsai., 2003; Sloan és mtsai., 2006; Castane és mtsai., 2010). Ezek a modellek

leginkább a memóriaproblémák idegi hátterének megértésében hasznosak, a betegség

progressziójának tanulmányozására azonban nem alkalmasak.

A különböző kémiai szerek által indukált modellek kizárólag egy adott, AK-ban

jelentős patofiziológiai útvonal tanulmányozására szolgálnak. Ezek a modellek alkalmasak

például az agyi gyulladás vagy az elégtelen glükóz/energia metabolizmus vizsgálatára

neurodegeneráció során. Az agyi gyulladás kiváltható különböző endotoxinok infúziójával,

ilyenek pl. a lipopoliszacharid (LPS) (Hauss-Wegrzyniak és mtsai., 1998) vagy a

proinflammatórikus citokinek (Wenk és mtsai., 2003). Az agyi metabolizmus elégtelen

működése a mitokondriális metabolikus útvonalak (Szabados és mtsai., 2004), illetve az idegi

inzulin szignáltraszdukciós útvonalak gátlásán keresztül vizsgálható (Ishrat és mtsai., 2009).

1.6.3. Az Aβ-kezelt rágcsáló modellek

Az AK amyloid-kaszkád hipotézise szerint mind a familiáris, mind a sporadikus AK

típusban az Aβ akkumulációja és aggregációja a betegség patogenezisének fő okozója, a

további, betegségre jellemző elváltozások (NFK-ek kialakulása, gyulladás) az Aβ

termelés/lebomlás-egyensúly felborulásának következménye. Újabban ez az elmélet

kiegészült annyival, hogy az AK patogenezisében leginkább toxikus formák a szolubilis Aβ

20

oligomerek, melyek képesek gátolni az LTP-t, ami memóriaromláshoz vezet (Gong és mtsai.,

2003; Lacor és mtsai., 2004; Walsh és mtsai., 2007).

Az AK-ban végbemenő Aβ akkumuláció jól modellezhető az Aβ patkány agyba

történő intracerebrális vagy intracerebroventrikuláris infúziójával. Az Aβ hatás vizsgálható

akutan, egyszeri, sztereotaxisba befogott állat agyába történő injektálással (Harkány és mtsai.,

1998) vagy krónikusan, ismételt kezelésekkel, beépített kanül (Yamada és mtsai., 2005),

ozmotikus mini-pumpa (Nakamura és mtsai., 2001; Olariu és mtsai., 2002), mikro-infúziós

pumpa (Nag és mtsai., 1999), vagy mikrodialízis (Harkány és mtsai., 2000) segítségével. Az

Aβ direkt intracerebrális injekciója tanulási és memóriadeficitet okoz, továbbá AK-ra

jellemző viselkedésbeli elváltozásokhoz, gyulladáshoz és mikroglia aktivációhoz, oxidatív

stresszhez és sejtpusztuláshoz vezethet (Frautschy és mtsai., 1996; Harkány és mtsai., 1998;

Weldon és mtsai., 1998; Sipos és mtsai., 2007).

Az Aβ kezelés memóriafolyamatokra gyakorolt fiziológiai hatásának vizsgálatára

rendkívül elterjedt az LTP („long-term potentiation”) vizsgálata. A perforáns pálya

ingerlésére elvezethető populációs kisülési válasz és mezőpotenciál gyors ingersorozat utáni

megnövekedése (LTP) a szinaptikus plaszticitás és a memória folyamatok elfogadott és

intenzíven tanulmányozott modellje.

Az Aβ oligomerek gátolják a szinaptikus hatékonyságot (Wang és mtsai., 2009),

továbbá számos kutatási eredmény szerint az Aβ oligomerek gátló hatással vannak az LTP-re

(Walsh és mtsai., 2002; Rowan és mtsai., 2004; Chang és mtsai., 2006; Townsend és mtsai.,

2006; Klyubin és mtsai., 2008; Shankar és mtsai., 2008), a toxikus hatással bíró oligomer

formát illetően azonban megoszlanak a vélemények. Az agykamrába injektált, aggregálódott

humán Aβ oligomer oldat gátolja a hippocampusban az LTP fenntartását patkányban in vivo

(Rowan és mtsai., 2003), továbbá Walsh és munkatársai kizárhatónak tekintik, hogy az LTP

in vivo blokkolásában bármilyen szerepet játszanának a monomer, vagy természetes fibrilláris

formájukban jelen lévő humán Aβ formák (Walsh és mtsai., 2002). Towsend eredményei

szerint az Aβ trimerek a legfőbb LTP-gátlók (Townsend és mtsai., 2006), míg későbbi

kutatások alapján már a dimerek bizonyultak a szinaptikus plaszticitást leginkább károsító

amyloid formáknak (Klyubin és mtsai., 2008). A kicsiny, protofibrilláris állapotú Aβ az N-

metil-D-aszpartát (NMDA) receptorokhoz kötődik elsősorban, míg a nagyobb méretű

fibrillumok szelektíven modulálják a nem-NMDA glutamát receptorok működését (Ye és

mtsai., 2004). Tanzi és munkatársai kidolgoztak egy feltételezett szignalizációs útvonalat,

amin keresztül az Aβ hathat az NMDA receptorra (Tanzi, 2005). Az amyloid LTP-re kifejtett

hatásáról az eddig felsoroltakkal ellentmondó eredmények is ismertek korábbi kísérletek

21

szerint: gyrus dentatusban Aβ kezelés vizsgálata során az LTP serkentését írták le in vitro,

amit az NMDA receptorok megnövekedett működésével magyaráztak (Wu és mtsai., 1995).

Későbbi in vitro kísérletek eredményei szerint azonban az Aβ oligomerek gátló hatással

vannak az LTP-re, mivel a mikroglia sejtekhez kötődve egy “stressz-kaszkádot” indítanak el,

ami blokkolja az LTP-t serkentő szignál útvonalat (Rowan és mtsai., 2004). Az Aβ

iontoforézissel való bejuttatásakor az NMDA válaszok szignifikánsan és irreverzibilisen

megnövekedtek az extracelluláris „single-unit” felvételek során in vivo (Molnár és mtsai.,

2004). 2008-as eredmények alapján az Aβ monomerek és oligomerek pikomólos

koncentrációban jelentősen megnövelik az LTP-t, míg nanomólos koncentrációban

lecsökkentették a szinaptikus potenciált (Puzzo és mtsai., 2008).

A szinaptikus rést sejtkapcsoló- extracelluláris mátrix molekulák, illetve a receptorok

és ioncsatornák extracelluláris láncai töltik ki, melyek erősen akadályozva az oldalirányú

diffúziót, befolyásolják a neurotranszmisszió hatékonyságát, és mintegy „gélszűrőként”

viselkedve méret szerint szelektálhatnak a különböző méretű amyloid aggregátumok között. A

kisméretű szolubilis oligomerek a szinaptikus résbe jutva képesek közvetlen befolyásolni a

szinaptikus plaszticitást, míg a nagyobbak kizáródnak, és az extracelluláris térben fejtik ki

degeneratív hatásukat. Az oligomerek szinaptikus transzmisszióra gyakorolt hatását az LTP

vizsgálata során kapott eredmények is alátámasztják (Selkoe, 2008).

Az Aβ aggregátum formák a sejtfelszíni proteinekhez kötődve direkt módon, vagy a

tau-fehérje hiperfoszforillációja kapcsán kialakuló axondegeneráción keresztül fejtik ki

citotoxikus hatásukat (Hardy és mtsai., 2002). Az Aβ oligomerek agyszövetbe való

injektálása során számos citotoxikus és immunológiai reakciót váltanak ki: az axonlefutások

nyomvonalának eltorzítását, dendritarborizáció zsugorodását, mikroglia-aktivációt, reaktív

szuperoxid gyökök felszabadulását eredményezik, végül sejthalált okoznak (Walsh és Selkoe,

2004). A pikomólos koncentrációjú Aβ hatása a szinaptikus plaszticitásra és memóriára

megemelkedett transzmitter felszabadulással jár, melyben az α7 nikotinos acetilkolin

receptorok játszanak szerepet (Puzzo és mtsai., 2008). Szintén pikomólos koncentrációjú kis

Aβ oligomerek azonban szinapszisvesztést indukálnak (Shankar, 2007). A kísérletekben

alkalmazott oldatok kémiai karaktere nem ismert.

A különböző méretű oligomereknek hatása tehát egy nyitott kérdés, aminek legfőbb

oka az aggregáció fokának bizonytalan és nehéz mérése in vivo. Felmerül tehát, hogy a

különböző Aβ aggregátumok eltérő fiziológiai hatással bírhatnak a sejtek aktivitására, melyet

előkísérleteink során vizsgáltunk meg.

22

1.6.4. Transzgenikus rágcsáló modellek

1.6.4.1. Transzgenikus egér modellek

Az AK-ban előforduló génmutációkat hordozó transzgenikus egértörzsek kifejlesztése

nagy áttörés volt az AK modern kutatásában. A következőkben, a terjedelmi korlátok végett

csak a legnépszerűbb, legtöbbet kutatott transzgenikus egérmodellek előnyeit és korlátait

szeretném bemutatni, legnagyobb hangsúlyt fektetve a doktori munkám során alkalmazott

APP/PS1 egértörzs bemutatására. A jelenleg forgalomban lévő transzgenikus egérmodellek

teljesebb körű leírása a következő weboldalon érhető el:

http://www.alzforum.org/res/com/tra/.

Amyloid-modellek

Az AK-t modellező transzgenikus egértörzs tanulmányozása az 1990-es évek

közepétől vette kezdetét az Indiana mutációt (V717F: Val717 → Phe) hordozó PDAPP

modell kifejlesztésével (Games és mtsai., 1995) amit a rákövetkező években a Swedish

(K670N/M671L: Lys670 → Asn és Met671 → Leu) mutációt hordozó Tg2576 (Hsiao és

mtsai., 1996) és az APP23 (Sturchler-Pierrat és mtsai., 1997) egérmodellek követtek. Az

APP23 modell ugyanazt a mutáns amyloid fehérjét expresszálja, mint a Tg2576 modell, csak

míg az utóbbi virális promóterrel (HCMV) rendelkezik, addig ebben rágcsáló Thy-1 promóter

irányítja az expressziót. Mindhárom említett modell fokozott Aβ-akkumulációt, cerebrális

amyloid angiopátiát, asztrocita és mikroglia aktivációt, hippokampális atrófiát, szinaptikus és

neurotranszmitter elváltozásokat, kognitív és viselkedésbeli AK tüneteket produkál,

alátámasztva az AK amyloid-kaszkád hipotézisét (Brendza és mtsai., 2003; Van Dam és

mtsai., 2005; Deacon és mtsai., 2009). Ezek a transzgenikus noninvazív modellek alkalmasak

különböző gyógyszerjelölt molekulák tesztelésére, lehetséges biomarkerek kutatására.

A familiáris AK-ra jellemző preszenilin gén mutáció felfedezésével indokolt volt a

preszenilin 1 és 2 (PS1, PS2) transzgenikus állatok kifejlesztése is. A PS1 vagy PS2 mutáció

hatására a γ-szekretáz specificitása megváltozik, így az Aβ1-42/Aβ1-40-es amyloid formák

képződésének aránya eltolódik a 42 aminosavas forma képződése felé (Borchelt és mtsai.,

1996). A megnövekedett Aβ1–42/Aβ1–40 arány ellenére ezekben az állatokban nem

találhatóak plakk-képződésre utaló nyomok, valamint csupán enyhe kognitív és viselkedésbeli

tüneteket mutatnak.

http://www.alzforum.org/res/com/tra/

23

Az APP/PS1 modell

A preszenilin modellek továbbfejlesztéséből kidolgozott APP/PS1 kétszeresen

transzgenikus egérben a korábban leírt Swedish (APP695swe) és PS1-dE9 mutációkat

kombinálták (Kurt és mtsai., 2001; Radde és mtsai., 2006), így ezek az állatok növekvő Aβ1–

42/Aβ1–40 arányú amyloid képződéssel és felgyorsult Aβ-patológiával rendelkeznek az

egyszeres APP állatokhoz képest, igazolva a preszenilin módosító hatását. Az Aβ toxicitással

együtt járó patológiai elváltozásokat intenzív gliózis (Malm és mtsai., 2007; Yan és mtsai.,

2009; Jardanhazi-Kurutz és mtsai., 2011), disztrófiás serkentő szinaptikus boutonok és tau

pozitív neuritek megjelenése kíséri. További AK-ra jellemző elváltozás a kor előrehaladásával

megjelenő neuropatológiai tünetek, illetve az egész agyat érintő atrófia (Delatour és mtsai.,

2006; Wirths és mtsai., 2006). A korábban említett modellekhez hasonlóan általános

nagymértékű sejtpusztulás nem figyelhető meg, csak kisebb, AK-ban is érintett

idegsejtpopulációk működésének zavara. A katekolaminerg neuronok száma a locus

coeruleusban csökkenést mutat a korral (O'Neil és mtsai., 2007), ami alátámasztja a

jelentőségét a kóros elváltozásokban (Jardanhazi-Kurutz és mtsai., 2011; Rey és mtsai., 2012;

Hammerschmidt és mtsai., 2013). Számos interneuron illetve Ca2+-kötő fehérje szintje szintén

csökkenést mutat a hippocampusban (Popovic és mtsai., 2008; Takahashi és mtsai., 2010).

Egy új képalkotó eljárással az APP/PS1 egerek különböző agyrégióiban az Aβ

felhalmozódással együtt járó bilaterális funkcionális konnektivitás-csökkenést detektáltak

(Bero és mtsai., 2012).

A rövidtávú memória sérülése az állatokban – hasonlóan az AK-ban szenvedő

betegekhez – a kórkép korai fázisában jelenik meg (Huntley és mtsai., 2010; Lagadec és

mtsai., 2012). További nem-kognitív tünetek - mint a napi ciklus zavara, a motoros

funkciózavar, depresszió valamint a szorongás - szintén előfordulnak az APP/PS1 modellben

(Pugh és mtsai., 2007). Ismert humán adat, hogy a nők körében körülbelül kétszer annyi a

regisztrált Alzheimer-kóros betegek száma, mint a férfiaknál. Nemek közötti különbség az

APP/PS1 egerekben is megjelenik, ahol nőstényekben korábban figyelhetőek meg az Aβ

lerakódások, mint a hímekben (Wang és mtsai., 2003).

Az egyik fő különbség a humán patológiától az APP23 törzshöz hasonlóan a

foszforilált tau késői megjelenése, a hiperfoszforilált tau alacsony szintje, továbbá az NFK

képződés hiánya (Kurt és mtsai., 2003). Felmerült, hogy a tau patológia hiánya okozhatja a

limitált sejtpusztulást és az alac.sonyabb mértékű amyloidogén hasítását az APP-nek,

hasonlóan az eddig említett törzsekhez és a humán kórképhez (Leroy és mtsai., 2012). Az

amyloidogén hasításért felelős BACE gén kiütése esetén javult az APP/PS1 egerek

24

memóriafunkciója, a Tg2576 törzshöz hasonlóan (Ohno és mtsai., 2004). Az Aβ lerakódás

mértéke szignifikánsan korrelál a glükóz-transzporter-1 szintjével és a hippocampus

atrófiájával (Hooijmans és mtsai., 2007). Az Aβ lerakódás és a korai patológiai események

között kétirányú kapcsolat lehet: az Aβ akkumuláció elégtelen lizoszómális proteolízishez,

axonális transzporthoz és csökkent agyi konnektivitáshoz vezet, melyek tovább növelik az

APP amyloidogén hasításának mértékét (Bero és mtsai., 2012; Torres és mtsai., 2012).

A többi AK modellhez hasonlóan az amyloid progressziója erősen korrelál az idegi

gyulladás fokozódásával az APP/PS1 egerekben is (Biscaro és mtsai., 2012). Számos

komplement fehérje expresszálódik AK-os agyban (Walker és mtsai., 1992). A C1q

komplement fehérje deléciója csökkentette a patológiás elváltozások mértékét APP/PS1

egerekben (Fonseca és mtsai., 2004), ami a C1q fehérje kóros szerepére utal. A fokozott

mikroglia aktiváció és a csökkent mitokondriális aktivitás által okozott oxidatív stressz

(Trushina és mtsai., 2012) hozzájárul a csökkent idegsejtképződés és kognitív képességek

megjelenéséhez (Choudhry és mtsai., 2012; Hamilton és mtsai., 2012). A glia-aktivációt

jelentősen szabályozza a noradrenalin (NA), így a noradrenerg idegsejtek szelektív hiánya a

locus coeruleusban szintén hozzájárulhat a betegség progressziójához, amit a locus coeruleus

idegsejtek hiánya esetén tapasztalt, súlyosbodó AK-szerű tünetek is alátámasztanak

(Hammerschmidt és mtsai., 2013).

A környezeti faktorok hatását szintén tanulmányozták ebben a modellben: alumínium

terhelés hatására felgyorsult a kognitív hanyatlás (Zhang és mtsai., 2012), a fizikai

gyakorlatok viszont megelőzték a memóriazavarok kialakulását (Liu és mtsai., 2011), a

humán (Roach és mtsai., 2011) és Tg2576 egérnél tapasztaltakhoz hasonlóan (Parachikova és

mtsai., 2008). Általánosan elmondható, hogy az AK-os beteg esetében alkalmazott kezelések

hatékonyak voltak az APP/PS1 egerekben is: az NMDA receptor antagonista memantin

javította a speciális memóriát (Minkeviciene és mtsai., 2004) és csökkentette az Aβ-szintet in

vivo és idegsejtkultúrában is (Alley és mtsai., 2010). Az acetilkolin-észteráz aktivitás gátlása

az egyik legfőbb terápiás megközelítés az AK kezelésére. Az APP/PS1 egerekben az IQM-

622 acetilkolin-észeráz inhibitor csökkentette az Aβ lerakódást és neuroprotektíven hatott az

idegsejtekre (Antequera és mtsai., 2012). Végül a csökkent vas-homeosztázis szintén jelentős

szereppel bír az AK patogenezisében. A desferrioxamine nevű vaskelátor lelassítja a betegség

progresszióját humán agyban (McLachlan és mtsai., 1993) és APP/PS1 egerekben is (Guo és

mtsai., 2013a). Figyelemreméltó továbbá az eredmények listája a különböző stratégiákról,

melyek hatékonyan lassítják a patológiai elváltozások progresszióját vagy javítják a

regenerálódás mértékét az APP/PS1 egerekben: többek között az őssejt terápia (Lee és mtsai.,

25

2012), kalória csökkentés (Mouton és mtsai., 2009), a retinsavas kezelés (Ding és mtsai.,

2008), fluparoxan α2-adrenoreceptor antagonista (Scullion és mtsai., 2011) vagy a BDA-140

kalpain inhibitoros kezelés (Trinchese és mtsai., 2008; Liu és mtsai., 2011).

Tau-modellek

Az előző fejezetben említett transzgenikus egerek közös vonása, hogy nincs bennük

NFK-képződés. A (mutáns) humán tau egerekben, illetve APP/tau egerekben az Aβ lerakódás

tovább fokozódik, továbbá NFK-szerű képződés is tapasztalható (Gotz és mtsai., 2004; Ribe

és mtsai., 2005), ugyanakkor az Aβ-plakkok és NFK-k nem mutatnak kolokalizációt. A tau

patológia további tanulmányozására ma már számos tau-KO és egyszeres transzgenikus tau

modell áll rendelkezésünkre. A tau-KO egerek fizikailag egészségesek, szaporodásra képesek,

nem mutatnak idegrendszeri elváltozásokat, ami arra utal, hogy a tau hiánya kompenzálható

más mikrotubulus-asszociált fehérjék által. A frontotemporális demenciában (FTDP-17)

megjelenő tau mutáció felfedezésével számos új tau-modellt fejlesztettek ki, melyek számos

fenotípust hordoznak. A legjelentősebb elváltozás a motoros deficit, a memóriazavar illetve

fokozott neurofibrilláris és gliofibrilláris köteg megjelenése (Gotz és mtsai., 2007).

Amyloid-tau kombinált modellek

A 3xTg a két transzgén konstrukciót (mutáns APP és tau) homozigóta mutáns PS1

egér egysejtes embriójába injektálták, elkerülve az APP és tau gének szegregációját a későbbi

generációknál (Oddo és mtsai., 2003). Ezekben a 3xTg egekben az Aβ plakkok az NFK

patológia előtt alakulnak ki, továbbá gyulladási folyamatok, szinaptikus funkciózavar és

kognitív romlás is megfigyelhető bennük (Sy és mtsai., 2011).

2006-ban kifejlesztettek egy 5 különböző mutációt hordozó, 5xTg egértörzset a késői

tünetek hatékonyabb tanulmányozása céljából. Az 5xTg Alzheimer modell az Aβ

overexpressziót biztosító Swedish (K670N/M671L), az APP amyloidogén hasítási útvonalát

tovább fokozó Florida (I716V) és London (V717I), valamint a PS1 (M146 L + L286V)

mutációkat hordozza (Oakley és mtsai., 2006). Ebben az egértörzsben az Aβ akkumuláció

már 1,5 hónapos korban megjelenik, jóval megelőzve a többi egértörzsben leírtakat, azonban

a törzs gyakorlati terápiás kutatásokban való alkalmasságáról még csak keveset tudunk.

Eddigi bíztató eredmények, hogy a BACE1 aktivitás csökkentés, az icariin gyógynövény

illetve a DCP-LA foszfokináz-C ε-specifikus aktivátor javította a szinaptikus plaszticitást és

26

csökkentette az Aβ által okozott hisztológiai elváltozások mértékét az 5xTg egerekben

(Kimura és mtsai., 2010; Urano és mtsai., 2010; Hongpaisan és mtsai., 2011).

1.6.4.2. Transzgenikus patkány modellek

Plakk nélküli amyloid modellek

A kétezres évek elejétől kezdve az AK-ban érintett géneket kifejező transzgenikus

patkányok is egyre jobban elterjedtek. Ezek a modellek fenotípusukat tekintve nagy

heterogenitást mutatnak.

Az első AK modellezésére kifejlesztett transzgenikus patkányban iAβ felhalmozódást,

továbbá szinaptikus funkciózavart írtak le, amyloid plakkok megjelenése nélkül. Az első

transzgenikus patkány modellek még nem mutatták az AK-ra jellemző klasszikus patológiai

elváltozásokat (Echeverria és mtsai., 2004), amit a mérsékelt APP kifejeződés okozhat. Az

UKUR25 és UKUR28 patkánytörzsek azonban jelentős intracelluláris Aβ felhalmozódást

mutatnak a hippocampus és a neocortex piramissejtjeiben. Az iAβ felgyülemlése befolyásolja

a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) szignalizációt (Echeverria és mtsai., 2005), fokozza

a tau foszforilációt, gátolja a tanulási folyamatokat (Echeverria és mtsai., 2004), továbbá

megváltoztatja a hippokampális proteomot (Vercauteren és mtsai., 2004). Ezek a modellek

tehát alátámasztják a nézetet, miszerint a kognitív hanyatlás nem az Aβ plakkokkal, hanem a

kis, Aβ oligomerekkel áll összefüggésben.

A TgAPPswe patkányban szintén nem detektálhatóak extracelluláris plakkok vagy

NFK-ek 18 hónapos korig (Ruiz-Opazo és mtsai., 2004; Agca és mtsai., 2009). Ezek az

állatok közepes APP mRNS szint növekedést mutatnak, továbbá az UKUR25 állatokkal

szemben jobban teljesítenek a viselkedési tesztekben, amit a genetikai hátterük különbözősége

okozhat.

Mivel az APP695 izoformát tipikusan az idegsejtek expresszálják az agyban, továbbá

AK-os betegekben igazolták az APP695 transzkriptomok vesztését, indokolt volt a hAPP695

overexpresszáló patkánymodell kifejlesztése (Gong és mtsai., 2006). Később azonban in vivo

és in vitro kísérletek is igazolták, hogy a hAPP751 overexpresszáló törzs patológiája jobban

hasonlít az AK kórképéhez.

Az APP21 és APP31 beltenyésztett törzsekben tovább növelték az APP expresszióját,

melyet hAPP695-t hordozó rekombináns lentivírus Swedish és Indiana mutációt hordozó

zigótába történő injektálásával állítottak elő (Agca és mtsai., 2008). A magas APP szint

ellenére azonban ezekre az állatokra se jellemző amyloid-plakk kifejeződés.

27

A Swedish mutációt tartalmazó hAPP695-t expresszáló Tg6590 patkánytörzs iAβ

akkumulációt mutat a cortex, hippocampus és cerebellum idegsejtjeiben, továbbá ezekben az

állatokban memóriahanyatlás is detektálható (Kloskowska és mtsai., 2010).

Az eddig említett patkánytörzsekről tehát összességében elmondható, hogy a

szolubilis Aβ forma hatásának vizsgálatára alkalmasak, azonban az AK késői fázisára

jellemző Aβ plakkok egyáltalán nem jellemzőek rájuk.

Plakkot kifejező amyloid modellek

Az első plakkot kifejező transzgenikus patkány modell a homozigóta kétszeresen

transzgenikus Tg487/Tg1116 törzs, ami expresszálja a Swedish és Swedish/London

mutációkat hordozó hAPP695 gént. Ezek az állatok csak 17-18 hónapos korukban mutatnak

Aβ-plakk felhalmozódást, melynek megjelenése a preszenilin gén mutációjának

hozzáadásával 9 hónapos korra rövidült a PSAPP (Tg478/Tg1116/Tg11587) patkányokban

(Liu és mtsai., 2008).

A McGill-R-Thy1-APP egyszeresen transzgenikus patkány modell kiterjedt AK-szerű

patológiával rendelkezik a Swedish és Indiana mutációkat hordozó hAPP751 gén

mutációjának hatására (Leon és mtsai., 2010). Ez a modell az említett génmutáció hatására

képes APP expresszióra az AK-ban érintett agyterületeken cerebelláris és perifériás szöveti

expresszió nélkül, így genetikailag a legkevésbé „agresszív” modellnek tekinthető a kétszeres

vagy többszörös transzgenikus modellekhez viszonyítva.

Nemrégiben kifejlesztettek TgF344-AD kétszeresen transzgenikus patkánytörzset is,

ami a Swedish mutációt hordozó hAPP695-öt és a PS1ΔE9 géneket expresszálja (Cohen és

mtsai., 2013). A TgF344-AD patkányok korfüggő cerebrális amyloidózist mutatnak, ami

megelőzi a taupátia, gliózis, apoptotózis és kognitív tünetek megjelenését.

Tau modellek

A patkányok az emberhez hasonlóan 6 tau izoformát fejeznek ki, így indokoltnak

bizonyult a már korábban említett tau egérmodellek mellett tau patológiát mutató

patkánytörzsek létrehozása is (Cente és mtsai., 2006; Zilka és mtsai., 2006; Hrnkova és

mtsai., 2007; Koson és mtsai., 2008). Az tau egérmodellekhez hasonlóan ezek a törzsek is

kiválóan alkalmasak a tau hiperfoszforiláció és az NFK-képződés hatásának vizsgálatára.

28

1.7. Az Alzheimer-kór hipotézisei

Az AK kutatásának túlnyomó része a már korábban említett kolinerg (Cummings és

mtsai., 1998; Francis és mtsai., 1999), vaszkuláris (de la Torre., 2010), tau (Fladby és mtsai.,

1999; Small és mtsai., 2008), prion (Lacor és mtsai., 2007), amyloid-kaszkád (Hardy és

mtsai., 1991) és mitokondriális kaszkád (Swerdlow és mtsai., 2004) hipotézisek köré

csoportosul, melyek közül terjedelmi korlátok miatt az utóbbi kettő, doktori témám alapját

képező elmélettel szeretnék a következőkben részletesen foglalkozni.

Az amyloid-kaszkád hipotézis az egyik leginkább elfogadott gondolkodásmód a

betegség etiológiáját illetően (Hardy és mtsai., 1991). E szerint az Aβ kóros felgyülemlése

jelentős biokémiai, hisztológiai és klinikai változásokat generál az AK-os betegekben. Ez az

elmélet az idők során tovább fejlődött, és világossá vált, hogy az Aβ formájának,

aggregáltsági fokának (Orbán és mtsai., 2010) és koncentrációjának (Puzzo és mtsai., 2008)

kulcsfontosságú szerepe van. Beigazolódott, hogy nem az extracelluláris Aβ lerakódások,

hanem a szolubilis Aβ1-42 oligomer a leginkább toxikus, betegség kialakításában

legjelentősebb amyloid forma (Gong és mtsai., 2003; Lacor és mtsai., 2004; Walsh és mtsai.,

2007). Az amyloid-kaszkád hipotézis azután alakult ki, miután a familiáris autoszómális

domináns AK-ban leírták elsőként az APP, majd később a preszenilin 1 és 2 gének mutációit.

Az autoszómás domináns AK-ban ezeknek a fehérjéknek a mutációja eltolja az APP hasítás

folyamatát az Aβ1-42 képződés irányába. Tulajdonképpen ezt a hipotézist extrapolálták a

sporadikus AK-ra is. A sporadikus AK-ban azonban nincs APP vagy PS mutáció, így a

fokozott Aβ1-42 képződés oka számos, napjainkban is kutatott egyéb korai mechanizmusra

vezethető vissza.

Swerdlow és Kan tanulmánya szerint a mitokondriális hipotézis magyarázza legjobban

a késői, sporadikus AK kialakulását (Swerdlow és mtsai., 2004), amit későbbi munkák is

megerősítettek (Manczak és mtsai., 2006; Swerdlow és mtsai., 2009). A hipotézis szerint a

sporadikus AK-ban a mitokondriális elváltozások az első események, melyek Aβ

lerakódáshoz, szinaptikus degenerációhoz és NFK kialakuláshoz vezetnek. A fő különbség a

sporadikus és a familiáris AK között az, hogy az utóbbinál az Aβ-t valószínűsítik az első

patológiai eseménynek, ami másodlagosan mitokondriális funkciózavarokhoz vezet (amyloid-

kaszkád hipotézis). Számos in vitro és in vivo és humán adat igazolja, hogy a mitokondriális

elváltozások általánosan jellemzőek az AK-ra, kísérleti munkám is a mitokondriális hipotézis

köré épül. Mivel ez egy rendkívül intenzíven kutatott terület, a következőkben a

29

mitokondriumok általános jellemzésére, majd a legfőbb AK mitokondriális elváltozásával

foglalkozó kutatási eredmények bemutatására fókuszálok dolgozatomban.

1.8. A mitokondriumok általános jellemzése

A mitokondriumok anyai ágon öröklődő sejtorganellumok, melyek szinte minden sejt

számára alapvető fontosságúak a fiziológiás működéshez. Számuk, alakjuk és méretük

fajonként és sejttípusonként eltérő lehet a sejtek differenciáltsága és energiaszükségletének

függvényében. A mitokondriumok az eukarióta sejtek energiatermelő központjának

tekinthetők, egyik legfőbb feladatuk az oxidatív foszforiláció során végbemenő ATP-

szintézis. Alapvető funkcióik közé tartozik továbbá a Ca2+-homeosztázis fenntartása, a

szinaptikus transzmisszió és plaszticitás biztosítása, az oxidatív metabolizmus valamint az

apoptotikus folyamatok szabályozása (Li és mtsai., 2004b; Hollenbeck, 2005; Kann és mtsai.,

2007).

1.8.1. A mitokondriumok felépítése

A mitokondriumokat a sima felületű külső (KMM), illetve a mély redőket képző belső

mitokondriális membrán (BMM) veszi körül. A KMM fehérje:lipid aránya a

plazmamembránéhoz hasonlóan 1:1. Nagy mennyiségben tartalmazza a nagyméretű hidrofil

csatornákat formáló 1-es típusú feszültségfüggő anion csatornát (Vdac1), vagy más néven

porin fehérjét, mely következtében ~5 kDa molekulatömegig rendkívül permeábilis a citoszol

molekulái számára (Colombini, 2004). A BMM 75%-ban fehérjéket tartalmaz, melyek között

kiemelt fontossággal bírnak az elektrontranszportlánc (ETL) fehérjekomplexei. Speciális,

erősen szigetelő lipid komponense a kardiolipin, ami biztosítja a membrán átjárhatatlanságát a

kis molekulák, illetve ionok számára. A BMM által alkotott mitokondriumok hossztengelyére

merőleges redők (kriszták), illetve rendezetlen lefutású csövek (tubulusok) nagy mértékben

megnövelik a membrán felszínét, melynek mérete arányos az oxidatív foszforiláció

intenzitásával. A két membrán közötti ~10 nm széles intermembrán tér (IMT) összefügg a

redők által határolt térrel. Itt találhatóak olyan jelentős apoptotikus faktorok, mint a citrokróm

c vagy a szerin proteáz Htra2 (Htra2). A BMM által határolt mitokondriális mátrixban

található a mitokondriális fehérjék közel kétharmada (melyek közül kulcsfontosságúak a

citrát-kör (CK) és a zsírsav-oxidáció enzimkomplexei), továbbá a mitokondriális genom (ld.

30

1.7.3. fejezet) és fehérjeszintetizáló rendszer (cirkuláris mitokondriális DNS (mtDNS) több

kópiában és a mitokondriális (70S) riboszómák). A KMM és BMM bizonyos transzlokáló

fehérjéi egymáshoz kapcsolódva összefüggő csatornákat alkotnak, melyek lehetővé teszik a

nukleáris DNS (nDNS) által kódolt, citoplazmában szintetizálódott mitokondriális fehérjék

importját (ld. 1.8.4. fejezet) (Picard és mtsai., 2011).

1.8.2. A mitokondriális genom

6. ábra A humán mitokondriális genom felépítése (fent), és az általa kódolt elektrontranszportlánc fehérjék

(lent) (kék: nDNS által kódolt alegységek, kivéve a DHOD enzimet; tovább i színek: mtDNS által kódolt

alegységek).

Rövidítések: Komplex I alegységek (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 és 6), komplex III citokróm b alegysége (Cyt b),

komplex IV citokróm c oxidáz alegységek (COX I, II és III), komplex V alegységek (A6, A8, F0 proton

transzportáló alegység, F1 katalitikus alegység), rRNS-ek (12S és 16S), tRNS-ek (egybetűs kódok), nehézlánc

replikációs origó (HC) és promóter (HSP), könnyűlánc replikációs origó (OL) és promóter (LSP), ubikinon

(koenzim Q, CoQ), citokróm c (Cyt c), dihidroorát dehidrogenáz (DHOD) (Schon és mtsai., 2012).

31

A humán mitokondriális genomot 37 génből álló cirkuláris, kétszálú mitokondriális

DNS (mtDNS) alkotja, mely akár többezres kópiaszámban is megtalálható a sejtekben. A 37

mitokondriális gén 7 különböző komplex I alegységet (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 és 6), egy komplex

III alegységet (citokróm b (Cyt b)), három komplex IV alegységet (citokróm c oxidáz) I, II és

III)), két komplex V alegységet (A6 és A8), két rRNS-t (12S és 16S) valamint 22 tRNS-t

(egybetűs kódok) kódol (6. ábra). Elmondható tehát, hogy a mtDNS által kódolt összesen 13

fehérje mind az oxidatív foszforilációs rendszer, azaz az ETL eleme, melynek további több

mint 50 alegységét a nDNS kódolja (Anderson és mtsai., 1981). A komplex I (NADH

dehidrogenáz-CoQ reduktáz), II (szukcinát dehidrogenáz), III (ubikinon-citokróm c

oxidoreduktáz) és IV (citokróm c oxidáz) ETL fehérjék végzik a NADH és FADH2-től

származó protonok pumpálását a mátrixból a belső mitokondriális membránon keresztül az

intermembrán térbe, ezáltal biztosítva a proton gradiens kialakulását. Ezzel egyidőben az

elektronok oxigénhez való transzportja révén víz keletkezik. A proton gradiens által

kialakított mitokondriális membránpotenciál (Δψm) ATP szintézisre fordítódik a komplex V

(ATP szintetáz) által, miközben az a belső membránon keresztül ellenkező irányú

protontranszportot hajt végre (6. ábra). A komplex I, III, IV és V ETL alkotók mind mtDNS,

mind nukleáris DNS (nDNS) által kódolt alegységeket tartalmaznak, míg a komplex II (ami

egyben CK komponens is) kizárólag nDNS által kódolt alegységekből áll. Fontos

megjegyezni, hogy az ubikinon (CoQ) a komplex I mellett a dihidroorotát dehidrogenáz

pirimidin szintézisért felelős enzimtől is kap elektronokat (Schon és mtsai., 2012).

1.8.3. A mitokondriális proteom

A mitokondriális fehérjék többsége a már említett nDNS által kódolt és a citoszolikus

riboszómákon szintetizálódik, majd egy rendkívül összetett, szigorúan szabályozott

transzportrendszeren keresztül jut a végső rendeltetési helyére. Legfontosabb útvonalait a 7.

ábra szemlélteti. A prekurzor fehérjék elsőként a külső mitokondriális membránban

lokalizálódó traszlokációs komplex (TOM, translocase of the outer membrane) Tom40

transzlokátorán haladnak keresztül (7. ábra/1), majd különböző szétválogató

fehérjekomplexek felé mehetnek tovább (2). A preszekvenciát hordozó mátrixfehérjék a

BMM-ban lokalizált TIM23 belső transzlokációs komplex (translocase of the inner

membrane, TIM) és a hozzá asszociált PAM nevű motorfehérje (preprotein translocase-

associated motor) által jutnak a mitokondriális mátrixba, ahol az MPP (mitochondrial

32

processing peptidase) nevű proteáz hasítja le az N-teminális szignálszekvenciát (3). A

fehérjék egy része laterálisan szabadul fel a TIM23 komplexből a BMM lipid fázisába (4). Az

IMT fehérjék importját és feltekeredését a mitokondriális IMT-ben lokalizált MIA

(mitochondrial intermembrane space assembly) apparátus irányítja (5). A Tim9-Tim10

chaperon komplex biztosítja a hidrofób prekurzor fehérjék IMT-en keresztül történő

transzportját a SAM (sorting and assembly machinery) komplexbe, majd onnan a már β-redős

szerkezetű fehérjék a külső (6), vagy a TIM22 csatornáján keresztül a belső mitokondriális

membránba jutnak (7). Az α-helikális KMM fehérjék nem használják a Tom40 csatornát,

helyette a Mim1 (mitochondrial import 1) nevű fehérjén át jutnak a rendeltetési helyükre (8).

A mitokondriális mátrix riboszómáin szintetizálódó ETL fehérjealegységek az OXA (oxidase

assembly) komplexen keresztül jutnak a végső helyükre (9) (áttekintő összefoglalók:

(Chacinska és mtsai., 2009; Schmidt és mtsai., 2010)).

7. ábra A mitokondriális fehérjetranszport legfőbb útvonalai a mátrix fehérjék (1, 2, 3), belső membrán fehérjék

(1, 2, 4), intermembrán fehérjék (1, 2, 5), β-redős külső (1, 2, 6) illetve belső membrán fehérjék (1, 2, 7), α-

helikális külső membrán fehérjék (1, 8) illetve mitokondriális riboszómákon szintetizálódott fehérjék (9)

esetében.

Rövidítések: TOM: translocase of the outer membrane, TIM23, 22: translocases of the inner membrane, PAM:

preprotein translocase-associated motor, MPP: mitochondrial processing peptidase, MIA: mitochondrial

intermembrane space assembly, SAM: sorting and assembly machinery, Tim9-10: chaperone complex (Schmidt

és mtsai., 2010).

33

1.9. A β-amyloid által okozott mitokondriális elváltozások

1.9.1. A β-amyloid mitokondriális lokalizációja és legfőbb fehérjeinterakciói

Számos adat igazolja az Aβ és az APP mitokondriális jelenlétét jóval az amyloid

plakkok megjelenése előtt (Takahashi és mtsai., 2002; Caspersen és mtsai., 2005; Manczak és

mtsai., 2006; Pagani és Eckert, 2011). Az APP felgyülemlik a mitokondriális import

csatornákban, továbbá komplexet alkot a Tom40 és TIM23 fehérjékkel

(Anandatheerthavarada és mtsai., 2003). A csatornákban felgyülemlett APP gátolja a

sejtmagban kódolt mitokondriális fehérjetranszportot. A citokróm c-oxidáz IV-es és Vb

alegységek transzportjának gátlása csökkent citokróm oxidáz aktivitást és fokozott ROS

termelést eredményez (Devi és mtsai., 2006).

A mitokondriális intermembrán térben lokalizálódó Htra2 direkt hasítja az APP-t in

vitro és in vivo, ami elhárítja az APP felhalmozódás következtében kialakuló mitokondriális

funkciózavart. A Htra2 aktivitásának szabályozása tehát egy lehetséges terápiás célpont lehet

Alzheimer-kórban (Park és mtsai., 2006). A proteáz aktivitása mellett a Htra2 képes

késleltetni az Aβ1-42 intracelluláris aggregációját (Kooistra és mtsai., 2009).

A mitokondriumban felhalmozódott Aβ származhat az ER/Golgi rendszerből, de

közvetlenül a mitokondriális membránban lokalizálódó APP-ből is (Caspersen és mtsai.,

2005). Az Aβ számos mitokondriális fehérjéhez képes kötődni (Keil és mtsai., 2006; Pagani

és mtsai., 2011; Pavlov és mtsai., 2011). Microarray módszerrel több mint 2000 Aβ oligomer

kötőpartnert írtak le, köztük számos mitokondriális fehérjével, mint pl. a Prdx5, Hspd1, Aco2,

Atp5a1, Atp5h és Gpam (Olah és mtsai., 2011).

Az Aβ kötő alkohol dehidrogenáz (ABAD) és Aβ fehérjék közvetlen

intramitokondriális kapcsolódása Alzheimer-kórban emelkedett ROS képződést,

mitokondriális funkciózavart és sejthalált vált ki, alátámasztva Aβ mitokondriumra gyakorolt

toxikus hatását (Lustbader és mtsai., 2004). Az ABAD-Aβ interakció gátlása in vitro és in

vivo védelmet nyújt a mitokondriális funkciózavarokkal szemben, továbbá javítja a tanulási és

memória folyamatokat transzgenikus APP mutáns egérben (Yao és mtsai., 2011). Egyes

szintetizált ABAD inhibitorok jó gyógyszerjelölt tulajdonsággal rendelkeznek, mivel képesek

átjutni a vér-agy gáton (Kooistra és mtsai., 2009; Vangavaragu és mtsai., 2014). Az ABAD-

Aβ interakció befolyásolása tehát egy lehetséges irány lehet az AK elleni terápiában.

A ciklofilin D fehérje (CypD), a belső membránban lokalizálódó Vdac1 és a külső

membránban elhelyezkedő adenozin nukleotid transzlokáz (ANT) a mitokondriális

34

permeábilitási tranzíciós pórus (mPTP) komponensei. Az Aβ kötődik a CypD-hez, ami

fokozza a szabadgyök termelést, szinaptikus funkcióvesztést indukál, továbbá fokozza a

mPTP nyitódását ami apoptózishoz vezet. A CypD hiány védelmet nyújt az idegsejtek

számára az Aβ- és oxidatív stressz-indukált sejthalállal szemben, továbbá javítja a tanulás és

memória folyamatokat és szinaptikus funkciót Alzheimer-kór transzgenikus egérmodellben

(Du és mtsai., 2008; Du és mtsai., 2011).

A mitokondriális mátrixban lokalizálódó preszekvencia proteáz (PreP) a

preszekvenciák illetve szerkezet nélküli fehérjék lebontásáért felel, mint például az Aβ (Pinho

és mtsai., 2014). A PreP jelentős szerepet játszik az intracelluláris Aβ eltávolításában. A PreP

csökkent szintet illetve aktivitást mutat Alzheimer-kóros agyban illetve transzgenikus

egérmodellekben (Falkevall és mtsai., 2006). Kis benzimidazol származékok aktiválják a

PreP-t, mely szintén egy ígéretes irány lehet az Alzheimer-kór kezelésére (Vangavaragu és

mtsai., 2014). Az Alzheimer-kórban felgyülemlő Aβ és hiperfoszforilált tau fehérjék

kötődnek a Vdac1-hez, gátolva azok működését (Manczak és Reddy, 2012).

Összességében elmondható, hogy az Aβ számos mitokondriális fehérjével képes

interakcióba lépni, ami az energiametabolizmusban, oxidatív anyagcserében és mitokondriális

dinamikában olyan zavarokat indukál, ami végső soron az idegsejtek degenerációjához vezet.

A következő fejezetekben az Aβ által okozott mitokondriális zavarok mechanizmusa kerül

részletes bemutatásra.

1.9.2. A mitokondriális energiametabolizmus Alzheimer-kórban

Az energiametabolizmus a mitokondriumok egyik legjelentősebb funkciója minden

sejttípusban, különösen a rendkívül magas energiaszükségletű idegsejtekben (Raichle, 2010).

Az agyi metabolizmus csökkenése korrelál az AK-ban bekövetkező klinikai tünetekkel. Az

Aβ hatása az agyi energiatermelés folyamatára már évtizedek óta ismert (Gibson és mtsai.,

1998), a részletes molekuláris háttere azonban napjainkig intenzíven kutatott terület. A

mitokondriális funkciózavarok az egyik lehetséges kiváltói az AK-ra jellemző, csökkent

energiatermelésnek. Számos kutatás igazolta, hogy AK során a mitokondriális ETL és CK

működése súlyos zavart szenved (Hroudova és mtsai., 2014). A mitokondriális ETL és CK a

glükóz lebontás két szabályozott folyamata, ami biztosítja a proton gradiens kialakulását a

mitokondriális belső membránon keresztül, ami az ATP termeléshez szükséges.

35

A citokróm oxidáz az ETL végső enzime (IV-es komplex), mely a citokróm-c-ről

kapja elekronjait. Parker és munkatársai írták le elsőként a IV-es komplex csökkent aktivitását

Alzheimer-kóros betegek vérében, amit később számos kutatás megerősített (Parker és mtsai.,

1990; Cardoso és mtsai., 2004a). A citokróm oxidáz aktivitás csökkenését MCI-ben is

kimutatták, melyet az Alzheimer-kór korai stádiumának tartanak (Reddy és Reddy, 2011). Az

APP transzgénikus egérben a citokróm oxidáz gének expressziója emelkedett szintet mutat 2

hónapos korban (Reddy és mtsai., 2004). Az Aβ1-42 peptid kötődik a citokróm oxidáz 1-es

alegységéhez, ami magyarázhatja a IV-es komplex enzimaktivitás csökkenését és ennek

következtében kialakuló metabolikus zavart AK-ban (Hernandez-Zimbron és mtsai., 2012).

Az Aβ gátolja az I-es komplexet, melynek hatására a ROS szint megemelkedik (Bobba és

mtsai., 2013).

A mitokondriális mátrixban lokalizált piruvát dehidrogenáz (PDH) és α-ketoglutarát

dehidrogenáz komplexek (αKGDH) a CK fontos sebesség meghatározó („rate-limiting”)

enzimjei, melyek terápiás célpontok lehetnek az öregedéssel járó neurodegeneratív

betegségekben (Gibson és mtsai., 2005; Stacpoole, 2012). A PDH és αKGDH komplexek

aktivitásának csökkenését leírták AK-os post mortem mintákban (Bubber és mtsai., 2005),

továbbá a PDH aktivitásának és fehérjeszintjének csökkenését is igazolták 3 hónapos 3x

transzgenikus AK egérmodellben is (Yao és mtsai., 2009). Az αKGDH komplex gátlásával

megnövekedett az amyloid plakkok és NFK-ek mennyisége, az Aβ oligomerek szintje és

felgyorsult a tanulási és memóriafolyamatok romlása Tg 19959 egérben (Dumont és mtsai.,

2009). A CK enzimjeinek aktivitásával foglalkozó átfogó tanulmány igazolta bizonyos CK

enzimkomplexek aktivitásának csökkenését (PDH, αKGDH és ICDH), illetve növekedését

(szukcinát dehidrogenáz (SDH) és malát dehidrogenáz (MDH)), míg egyes enzimek aktivitása

nem mutatott változást (akonitáz) (Bubber és mtsai., 2005).

Az Aβ kötődése a glükóz metabolizmus sebesség meghatározó enzimjeihez nemcsak

csökkent ATP termeléshez, hanem a glükóz metabolitok elégtelen oxidatív lebontásához

vezet, valamint a toxikus reaktív metabolitok felgyülemlésével további mitokondriális

zavarok kialakulását idézheti elő.

36

1.9.3. A mitokondriális oxidatív stressz Alzheimer-kórban

A reaktív szabadgyökök a metabolikus folyamatok természetes résztvevői, melynek

legfőbb forrásai a mitokondriumok. Az oxidatív stressz kialakulása a ROS termelés és

eltávolítás közti egyensúly felborulásának következménye. Számos krónikus betegségre

jellemző az emelkedett ROS szint, ilyenek a mitokondriális (Enns és mtsai., 2012) és

neurodegeneratív betegségek (Jomova és mtsai., 2010). A mitokondriális funkciózavarok és

az oxidatív stressz alapvető szerepet játszanak az AK és más neurodegeneratív betegségek

patogenezisében (Moreira és mtsai., 2006) továbbá az MCI-ben (Torres és mtsai., 2011).

Mitokondriális sérülést és fokozott oxidatív metabolizmust mind az idegsejtekben,

mind az asztrocitákban kimutattak, igazolva, hogy mindkét sejttípus zavart szenved az

oxidatív stressz hatására AK-ban (Abramov és mtsai., 2004; Zhu és mtsai., 2006). Az oxidatív

stressz perifériás markerei szintén emelkedett szintet mutatnak AK-ban, tehát a patológiás

zavar nem korlátozódik az agy területére (Ghanbari és mtsai., 2004; Lopez és mtsai., 2013). A

fiziológiás ROS képződés legfőbb helyszíne a legtöbb sejttípusban a mitokondriális ETL, így

a mitokondriumok rendkívül érzékenyek az oxidatív stresszre (Venditti és mtsai., 2013). A

mitokondriális Aβ korrelál a csökkent mitokondriális metabolizmussal és megnövekedett

ROS képződéssel (Manczak és mtsai., 2006; Zhu és mtsai., 2006), továbbá károsítja a

mitokondriális lipidek és fehérjék szerkezetét (Rodrigues és mtsai., 2001), gátolja a

mitokondriális légzést a kulcsenzimek aktivitásának gátlásán keresztül, ami megnövekedett

membrán permeabilitáshoz és citokróm-c felszabaduláshoz vezet (Casley és mtsai., 2002).

Számos tanulmány igazolja a mitokondriális fehérjék oxidációját AK-ban. A

mitokondriális membránban lokalizálódó ATP szintetáz α-lánc és a Vdac1 fehérjék

oxidációját kimutatták a hippocampus régióban AK modellben, melyek csökkent aktivitásuk

révén szerepet játszhatnak a neurodegeneráció folyamatában (Sergeant és mtsai., 2003;

Sultana és mtsai., 2006). A mitokondriumok fiziológiás körülmények között hatékony

antioxidatív rendszerrel rendelkeznek, mely védelmet nyújt a ROS toxikus hatásaival

szemben. A mangán szuperoxid dizmutáz (Sod2 vagy MnSod) az egyik legfőbb antioxidáns

enzim, ami védi a mitokondriumot a szuperoxid támadásokkal szemben. Transzgénikus APP

mutáns egérben a mitokondriális Sod2 antioxidatív enzim hiány következtében jelentősen

megnő az Aβ szint és az Aβ-plakk lerakódás az agyban (Li és mtsai., 2004a) . Kettős

homozigóta APP-PS1 knock-in egérmodellben kimutatták a Sod2 a Aβ által okozott

nitrációját és inaktivációját (Anantharaman és mtsai., 2006). A Sod2 csökkent aktivitása

további ROS szint növekedéshez vezet és funkcionálisan károsítja a mitokondriumokat, ami a

37

mitokondriális membránpotenciál elvesztéséhez, emelkedett kaszpáz aktivitáshoz és végül

apoptózishoz vezet.

A glutation (GSH) szintén jelentős komponense a mitokondriális antioxidatív

rendszernek. A GSH szintézis kizárólag a citoszolban történik, azonban a fehérje zömében az

intracelluláris organellumokban (ER, MT, sejtmag) lokalizálódik biztosítva az organellum

specifikus funkciókat és a sejt túlélési folyamatát (Mari és mtsai., 2013). A mitokondriális

GSH hiányos APP/PS1 SREBP-2 overexpresszáló egérben megnövekedett mértékű

szinaptikus funkciózavart, sejtpusztulást és memóriahanyatlást figyeltek meg (Barbero-Camps

és mtsai., 2013). A Tg2576 transzgenikus egérmodellben megnövekedett lipid peroxidáció

megelőzi az amyloid plakkok kialakulását, ami az agyi oxidatív károsodásának Aβ lerakódás

előtti megjelenésére utal (Pratico és mtsai., 2001). Magzati tengerimalac idegsejtekben a

hidrogén-peroxid kezelés megnövelte az intracelluláris Aβ szintet, ami apoptozishoz vezetett

(Ohyagi és mtsai., 2000). Az oxidatív stressz által aktivált szignalizációs útvonalak képesek

befolyásolni az APP hasítási folyamatait, illetve a tau poszttranszlációs módosításait. Az

oxidatív stressz megnöveli a β-szekretáz expresszióját a cJun N-terminális kináz, és a p38

MAPK szignalizációs molekulákon keresztül (Tamagno és mtsai., 2005). Számos adat

alátámasztja a mitokondriális DNS (mtDNS) szerepét is az AK-ban kialakuló mitokondriális

funkciózavarokban. Az emelkedett ROS szint következtében kialakuló enzimoxidáció és az

Aβ akkumuláció következtében kialakuló mtDNS oxidáció csökkenti a mitokondriális

energiatermelés mértékét (Swerdlow, 2011).

1.9.4. Csökkent mitokondriális dinamika és transzport Alzheimer-kórban

1.9.4.1. Mitokondriális dinamika

A mitokondriumok mobilis és dinamikus organellumok, melyek méretüket és

alakjukat változtatva folytonos fragmentáción és fúzión mennek keresztül az axonális

transzport során (Van Der Bliek és mtsai., 2013). A mitokondriumok ún. "mitokondriális

hálózatot” alkotnak a nagy metabolikus aktivitású sejtekben, melyek bizonyos körülmények

hatására fragmentálódnak. Fiziológiás körülmények között a mitokondriális osztódás és a

fúzió folyamata egyensúlyban vannak. A mitokondriumok túlzott fragmentációja általánosan

jellemző a neurodegeneratív betegségekben, mint az AK (Knott és mtsai., 2008), melyben a

mitokondriumok túlzott fragmentációja következtében megnő az oxidatív metabolizmus

mértéke és a ROS termelődés fokozódik (Reddy, 2008).

38

A mitokondriumok szerkezeti, morfológiai és dinamikai elváltozásait kimutatták

human post mortem agymintákban, transzgenikus AK-os egérmodellben és mutáns, AK-ban

érintett génnel transzfektált idegsejtekben is (Cardoso és mtsai., 2004b).

Részletes morfometriai vizsgálatok igazolták, hogy AK-os agyban a mitokondriális

kriszták jelentős mértékben sérülnek (Hirai és mtsai., 2001), továbbá megváltozik a

mitokondriumok mérete is (Wang és mtsai., 2008). Különböző transzgenikus familiáris AK

egérmodellekben csökkent mitokondriális vándorlást és duzzadt mitokondriális morfológiát

írtak le. Ezen felül kimutatták a szinaptikus mitokondriumok szétesését és csökkent

energiatermelését jóval a memóriazavarok és amyloid lerakódások megjelenése előtt

(Trushina és mtsai., 2012). Sporadikus AK-os betegek fibroblasztjában a mitokondriumok

hosszú, elnyújtott morfológiát mutatnak, melyek sokszorosan összekapcsolódva hálózatot

alakítanak ki (Wang és mtsai., 2008).

A mitokondrális fúzió és “osztódás” folyamata máig nem teljesen ismert (8. ábra). A

mitokondriális fúzió megindításában jelentős szerepet játszó fehérjék a mitofuzinok (Mfn1,

Mfn2), melyek transzmembrán régióik segítségével a mitokondrium külső membránjában

rögzülnek, homo- vagy heterodimereket alkotva. A mitokondriális fúzió során a mitofuzinok

HR doménjeiken (heptad repeat) keresztül kapcsolódnak össze. A HR domének egymás mellé

rendeződve képesek arra, hogy a mitofuzin GTP-áz doménjének közreműködésével

felszabaduló energiát a membránok közelítésére fordítsák.

8. ábra A mitokondriális fúzió és osztódás folyamatában szerepet játszó fehérjék vázlatos felépítése. (Mfn1:

mitofuzin-1, Mfn2: mitofuzin-2, OPA-1: optikus atrófia fehérje 1, Drp1: dinaminszerű protein 1, Fis1:

mitokondriális fission 1 fehérje) (Chan, 2012).

39

A dynamin homológ Opa1 (optikus atrófia fehérje 1) elengedhetetlen a mitokondriális

membránok közötti kapcsolat kialakításában (Chan, 2012). A mitokondriális osztódásban

központi szerepet játszó fehérje a GTPáz aktivitással rendelkező citoszolikus Drp1

(dinaminszerű protein 1). A Drp1 a dynaminhoz hasonló szerkezettel rendelkezik, és nagy

mennyiségben expresszálódik a idegrendszerben. Az osztódás kezdetekor a Drp1 a

mitokondriális membránhoz kötődik, mely folyamatot a különböző poszttranszlációs

módosítások szabályozzák, mint például a foszforiláció (Chan, 2012). Egy 2015-ös munkában

kimutatták, hogy a glikogén szintetáz kináz 3β-szabályozott Drp1 foszforiláció gátlása

neuroprotektív hatással bír AK-os egér illetve sejtmodellekben (Yan és mtsai., 2015). A Drp1

membránhoz való kötődését külső mitokondriális fehérjék biztosítják (ilyen például a Fission

1 (Fis1) fehérje).

Számos irodalmi adat igazolja, hogy AK-ban a mitokondriális fúzió illetve „osztódás”

zavart szenved (Wang és mtsai., 2009; Manczak és mtsai., 2011). Az Aβ-ből származó

diffúzibilis ligandum (ADDL) kezelés megrövidült, fragmentált mitokondriumokat

eredményez elsődleges hippokampális neuronokban, továbbá változást okoz a fúzióban és

osztódásban szerepet játszó fehérjék szintjén is (Wang és mtsai., 2009). Immunoblot

analízisek igazolták, hogy a Drp1 képes interakcióba lépni az Aβ monomer, illetve oligomer

formáival AK-os betegekben, továbbá az AK progresszióval nő az interakciók száma. Ezen

abnormális interakciók gátlása lehetséges terápiás célpont lehet a mitokondriális fragmentáció

gátlására, az idegi és szinaptikus sérülések megelőzésére, továbbá a kognitív tünetek

csökkentésére AK-ban (Manczak és mtsai., 2011). APP transzgenikus egér elsődleges

neuronokban és Aβ kezelt egér neuroblasztóma sejtekben a Drp1 és Fis1 mRNS szintje

megnő, míg az Mfn1, Mfn2 és Opa1 csökkent mRNS szintet mutat (Manczak és mtsai.,

2010). Mutáns APP-t expresszáló és Aβ-t termelő human neuroblasztóma sejtekben (M17) a

mitokondriumok fragmentált morfológiát mutatnak, továbbá a mitokondriális fúzióban

szerepet játszó fehérjék szintje lecsökken. Az Mfn2 génkiütött egerek mitokondriumai szintén

fragmentálódtak (Chen és mtsai., 2007). Oxidatív stressz hatására az Mfn2 expressziója

megnő enyhe kognitív zavarban (MCI: Mild cognitive impairment), továbbá az oxidatív

stressz gátlásával javulnak az MCI-ben érintett mitokondriális funkciók (Gan és mtsai., 2014).

Az oxidatív stressz által aktivált extracelluláris szignál-regulált kináz (ERK) hozzájárul az

MCI-ben zajló mitokondriális dinamikai zavarokhoz (Gan és mtsai., 2014).

Ezen eredmények alapján tehát megállapítható, hogy a mitokondriális Aβ által okozott

csökkent mitokondriális fúzió mitokondriális és az AK-ban érintett idegsejtek funkcionális

zavarához vezet. Az Mdivi (Cassidy-Stone és mtsai., 2008), P110 (Qi és mtsai., 2013) Drp1

40

inhibitor komponensek és a Dynasore (Macia és mtsai., 2006) dynamin inhibitor lehetséges

terápiás célpontok lehetnek a neurodegeneratív betegségek kezelésében.

1.9.4.2. Mitokondriális transzport

A mitokondriális transzport kétirányú folyamat, amit számos motorfehérje biztosít

(Hollenbeck, 1996; Hollenbeck és Saxton, 2005). A mitokondriumok képesek gyorsan

transzportálódni az idegsejteken belül a magas energiaszükségletű helyekre (Hollenbeck,

1996; Macaskill és Kittler, 2010). A mitokondriális transzport kulcsfontosságú a szinapszis és

a dendrittüskék fejlődésében, stabilitásában és funkciójában (Li és mtsai., 2004b; Mattson és

mtsai., 2008). A mitokondriális transzport sérülése számos neurodegeneratív betegségre

jellemző, ilyenek a Huntington-kór (Shirendeb és mtsai., 2011), Parkinson-kór (Sterky és

mtsai., 2011), ALS (De Vos és mtsai., 2007) és AK (Wang és mtsai., 2008).

A mitokondriumok anterográd transzportjáért a kinezin (Zinsmaier és mtsai., 2009),

míg a retrográd transzportjáért a dinein motorfehérjék felelősek (Pilling és mtsai., 2006),

(Hollenbeck, 1996). Ismertek továbbá olyan adaptor fehérjék (Miro, Milton, syntabulin..),

melyek fontos szerepet játszanak a mitokondriumok kinezinekhez való kötésében (Liu és

Hajnoczky, 2009). Az idegsejtek komplex felépítésének köszönhetően speciális

transzportmechanizmusok alakultak ki az egyes régiókban a mitokondriumok célba

juttatására, illetve a célterületen való megfelelő energiaellátás és Ca2+-homeosztázis

biztosítására. A 9. ábra a preszinaptikus, axonális és dentrittüskében zajló mitokondriális

transzportot mutatja be (Sheng és Cai, 2012). A sejttesttől a disztális axonig, illetve dendritig

tartó mitokondriális transzport jelentősen függ a mikrotubulusok polaritásától és

organizációjától. Az axonális mikrotubulusok pozitív vége disztálisan, míg negatív vége

proximálisan, azaz a sejttest felé helyezkedik el (9/A ábra). A mitokondriumok dokkolása

biztosítja a mitokondriumok megfelelő eloszlását a sejttest és axon mentén (9/A). A

dentrittüskékben a mikrotubulusok vegyes irányultságúak, így a kinezin és dinein

motorfehérjék képesek proximális és disztális irányba is transzportálni a mitokondriumokat a

mikrotubulusok polaritásától függően (9/B ábra). A dendrittüskékben és a preszinaptikus

végződésben az aktin formálja a fő citoszkeletális rendszert, továbbá a miozin motorfehérje

biztosítja a rövidtávú transzportot (9/B, C ábra). A statikus és dinamikus mitokondriális

készlet között biztosított egyfajta átjárás, ami a mikrotubulushoz dokkoló szintafilin receptor

vagy az aktin kihorgonyzó rendszerének dinamikus interakciói révén valósul meg (9/C ábra).

A Ranvier-féle befűződések területén magas a Na+-csatornák és a Na+/K+ ATP-ázok

41

denzitása, ami biztosítja a gyors ingerületvezetést (9/D ábra). A kinezin és dinein

motorfehérjék biztosítják az anterográd és retrográd mitokondriális transzportot a befűződés

felé. A mobilis mitokondriumok a befűződésnél mozdulatlanná válnak, és biztosítják a

megfelelő energiaellátást a Na+-csatornáknak és Na+/K+ ATP-ázoknak.

9. ábra A mitokondriális transzportmechanizmus az idegsejtek különböző régióiban. A: Anterográd illetve

retrográd axonális mitokondrium transzport illetve dokkolás. B: Változó polaritású mikrotubulusok a

dentrittüskében. B-C: Miozin motorfehérje által biztosított rövidtávú transzport a preszinaptikus végződésben és

dendrittüskében. C: A statikus és dinamikus mitokondriális készlet közötti átjárás. D: mitokondriális transzport a

Ranvier-féle befűződés területén (Sheng és Cai, 2012).

A mitokondriális transzport tehát alapvető fontosságú az idegsejtek működésében,

elégtelen működése számos neurodegeneratív betegségre jellemző. Az Aβ fehérje gátolja a

mitokondriális transzportot hippocampális idegsejtekben (Calkins és mtsai., 2011). A

mitokondriumok mennyisége, hossza illetve anterográd transzportjuk mértéke jelentősen

lecsökken alacsony koncentrációjú, 200 nM-os Aβ oligomerrel kezelt idegsejtekben is (Du és

mtsai., 2010), míg 20 μM-os koncentrációban kizárólag az anterográd transzport érintette

(Calkins és Reddy, 2011). A mitokondriális transzport csökkenését transzgenikus AK

egérmodellekben (Pigino és mtsai., 2003; Du és mtsai., 2010; Calkins és Reddy, 2011) és Aβ

kezelt sejtkultúrákban is kimutatták (Rui és mtsai., 2006).

A ciklofilin D fehérje a mPTP tagja. A mPTP egy Ca2+ számára szabadon átjárható,

mindkét mitokondriális membránt átérő csatorna, melynek nyitásakor a mitokondriumba jutó

proapoptotikus faktorok beindítják az apoptózis mitokondriális útvonalát. A CypD megvonás

42

védelmet nyújt az Aβ mitokondriális motilitást és dinamikát károsító hatásával szemben (Guo

és mtsai., 2013b).

A mitokondriumok mennyiségének drasztikus csökkenése, illetve transzportjának

alulműködése magyarázhatja a nagymértékű szinaptikus degenerációt AK-ban, mivel nagy

mennyiségű aktív mitokondrium szükséges a magas energiaigényű szinaptikus régió

megfelelő ATP ellátásához. Mindezek alapján elmondható, hogy a mitokondriális

transzportfolyamatok kulcsfontosságúak az AK patogenezisében.

1.9.5. A mitokondriumok kitüntetett szerepe a szinapszisban

Az idegi szinapszisok a sejttesttől funkcionálisan és metabolikusan erősen elkülönült

sejtkompartmentumok (Kittel és mtsai., 2006). A szinapszis térfogatra vonatkoztatott

energiafelhasználása rendkívül magas, ami biztosítja a membránpotenciál fenntartását (Meir

és mtsai., 1999), a megfelelő neurotranszmissziót (Billups és mtsai., 2002) és lokális

fehérjeszintézist (Gardiol és mtsai., 2001; Villanueva és mtsai., 2001; Sutton és mtsai., 2006).

A szinapszis metabolikus szükségletének biztosítása céljából a szinapszist gliális végződések

veszik körül (Wyss és mtsai., 2011). A szinapszis intenzív és dinamikus ATP termelését, az

intenzív oxigén transzportot és specifikus metabolikus folyamatait a szinaptikus

mitokondriumok határozzák meg (Ames, 2000; Erecinska és mtsai., 2004; Kann és mtsai.,

2007). A preszinaptikus végződésekben és periszinaptikus gliatalpakban található

transzporterek és enzimek lehetővé teszik a glutamát és GABA neurotranszmitterek gliális

felvételét és cserébe a szinapszis folyamatos glutamin ellátásának biztosítását az asztrociták

által (Schousboe és mtsai., 2013; Tani és mtsai., 2014). A szinaptikus mitokondriumok

neurotranszmisszióban betöltött specifikus szerepe alapján feltételezhető a szinaptikus és

sejttestekben lokalizálódó mitokondriumok jelentős különbözősége.

A hatalmas jelentősége ellenére a szinaptikus mitokondriumok fehérjekészletéről

meglehetősen keveset tudunk. A szinaptikus mitokondriális proteomot a magi genom által

kódolt mitokondriális fehérjék transzportja, a mitokondriális génexpresszió és az

intramitokondriális fehérjeszintézis határozza meg (Chacinska és mtsai., 2009). A

preszinaptikus idegvégződésben a mitokondriális fehérjeszintézis mellett egy lokális

citoszolikus fehérjeszintetizáló rendszer is létezik, ami az mRNS transzport által fenntartott

szinaptikus mRNS populációk átíródásáért felel (Hollenbeck és mtsai., 2005; Wang és mtsai.,

2009; Hirokawa és mtsai., 2010; MacAskill és mtsai., 2010). A szinaptikus mRNS készlet

transzlációja kulcsfontosságú tényező a szinaptikus mitokondriumok működésében (Gioio és

43

mtsai., 2001; Giuditta és mtsai., 2002; Hillefors és mtsai., 2007; Kaplan és mtsai., 2009). A

szinapszisokban zajló proteinszintézis, és a keletkezett fehérjék szinaptikus

mitokondriumokba történő transzportja alapján felmerül, hogy a szinaptikus mitokondriumok

egy sajátos, specifikus proteinkészlettel rendelkeznek. Az azonban, hogy a szinaptikus

mitokondriális fehérjék milyen szinapszisra specifikus metabolikus funkcióval rendelkeznek,

nem ismert.

Mindezek alapján szükség lenne egy átfogó szinaptikus mitokondriális proteomikai

analízisre a szinaptikus működés fiziológiás és patológiás működésének megértéséhez. A

szinaptikus mitokondriális proteom tanulmányozásához elengedhetetlen egy alaposan validált,

tiszta szinaptikus mitokondrium preparátum előállítása, és elválasztása az összes többi,

sejttestekben lokalizált mitokondrium frakciótól. Az egyik ilyen első kísérleti munka

bemutatása a doktori disszertáció részét képezi (ld. 4.2. fejezet).

1.9.6. A szinaptikus mitokondriumok érintettsége Alzheimer-kórban

A neurodegeneratív és pszichiátriai betegségeket a szinapszisok fokozott

sérülékenysége és funkcionális elváltozása jellemzi, amiben az sMito-knak nagy jelentőséget

tulajdonítanak (Leenders és mtsai., 1986; Kudin és mtsai., 2002; Mosconi és mtsai., 2005;

Mattson és mtsai., 2008; Hattingen és mtsai., 2009). Du és munkatársai igazolták, hogy a

szinaptikus mitokondriumokban nagyobb mennyiségben és előbb halmozódik fel az Aβ1-40 és

Aβ1-42 formája a nem-szinaptikus mitokondriumokhoz képest (Du és mtsai., 2010), jóval

megelőzve az extracelluláris plakkok kialakulását (10. ábra). Aβ25–35 kezelt patkány

szinaptoszómákban megváltozik a szinaptoszómák szerkezete, az sMito-k megduzzadnak és

lecsökken a szinaptikus vezikulák száma (Mungarro-Menchaca és mtsai., 2002). Aβ1–40

kezelés hatására a C57B egerekből izolált szinaptoszómákban lokalizált mitokondriumokban

csökkent a membránpotenciál, megemelkedett a mitokondriális Ca2+-szint és a szabadgyök

képződés (Keller és mtsai., 2000). Az sMito-kban magasabb a CypD szintje, így

érzékenyebbek a Ca2+-inzultusra (Brown és mtsai., 2006; Naga és mtsai., 2007). A sMito-k

hosszú életűek, azonban sérülékenyebbek a fehérjeaggregátumok hatásaira, mint a nem

szinaptikusak. Aβ hatására csökken a mitokondriális légzés, a citokróm-c oxidáz aktivitás, nő

az oxidatív stressz mértéke, a mPTP nyitás valószínűsége és a CypD és ABAD fehérjék

expressziója (Du és mtsai., 2010). A mitokondriális funkciózavar az AK-os agy különböző

régióiban nem egyenletes. A hippocampális és corticális mitokondriumok érintettebbek a

káros hatásokkal szemben, mint a striatum és amygdala régiók 12 hónapos APP/PS1 és

44

APPsw egérmodellekben (Dragicevic és mtsai., 2010). Az sMito-k energiatermelésének

zavara korrelál a kardiolipin profil változással 3x transzgenikus egérmodellben (Monteiro-

Cardoso és mtsai., 2014).

Jól látható tehát, hogy a sMito-k károsodása az AK progressziójának korai elváltozása,

és jelentős szerepet játszik az Aβ mediált mitokondriális és idegsejtes toxikus hatásokban.

10. ábra Az Aβ fokozott felgyülemlése Tg mAPP egér szinaptikus mitokondriumában. Korfüggő Aβ 1-40 és

Aβ1-42 felhalmozódás a szinaptikus (sMito) és nem-szinaptikus mitokondriumokban (nsMito) 4 és 12 hónapos

kontroll (Ctr) és APP transzgenikus (Tg mAPP) egerekben (A és B). Az Aβ szint összehasonlítása sMito és

nsMito között 4 hónapos TgmAPP egerekben (C). Immunarany elektronmikroszkópos képek specifikus Aβ 1-42

primer és aranyszemcse-konjugált (18 nm) szekunderrel, melyek jól szemléltetik az Aβ intramitokondriális

felhalmozódását (fekete pontok) 12 hónapos Tg mAPP egerekben. A nyilak a mitokondriumokat, a csillagok a

szinapszist jelölik (Mérce = 200 nm.) (Du és mtsai., 2010).

45

1.10. A mitokondriumok proteomikai kutatása Alzheimer-kórban

A proteomika a sejtek, szövetek és a szervezet fehérjeállomány (proteom)

vizsgálatával foglalkozik, melynek célja a sejtfolyamatok, valamint az ismeretlen betegség

mechanizmusok megértése, különböző fehérjék funkcionális meghatározása, biomarker-

kutatás és gyógyszerfejlesztés (Wilkins, 2009). A fehérjeszintézist a transzláción felül a

transzkripció, a degradációs, akkumulációs és transzlokációs folyamatok is befolyásolják. A

gének száma az alternatív promóter, illetve splicing következtében jelentősen különbözik a

fehérjék számától. A fehérjék a különböző intracelluláris folyamatok során poszt-transzlációs

módosulásokon mennek keresztül, melyek tovább növelik a fehérjék heterogenitását

(Harrison és mtsai., 2002).

A korai, diagnosztikus értékű biomarkerek kutatása elengedhetetlen fontosságú a

neurodegeneratív betegségek kimutatása, progressziójának követése, illetve a megfelelő

kezelési stratégiák kidolgozása érdekében. Az utóbbi évek humán agyi, cerebrospinális

folyadék, illetve plazma proteomikai kutatásai jelentősen megnövelték a biomarker jelöltek

találati hatékonyságát, azonban a neurodegeneratív betegségek kialakulásának megértéséhez a

korai, tünetmentes humán minták hiánya miatt állatmodellek szükségesek.

A teljes agyszöveti proteomikai vizsgálatok során a mintában jelen levő fehérje

komponensek mennyisége széles tartományban mozog, így gyakran a nagy mennyiségben

jelen levő fehérjék elfedik az alacsony kópiaszámban jelen levő fehérjéket. A nagy áteresztő

képességű proteomikai technikák szubcelluláris frakcionálási módszerekkel való kombinálása

azonban lehetővé tette az organellum-szintű proteomikai vizsgálatokat (Gatto és mtsai.,

2010), így a kis mennyiségben jelen levő kulcsfontosságú szabályozó fehérjék vizsgálata is

elérhetővé vált (Huber és mtsai., 2003).

A már korábban részletesen bemutatott, AK-ra jellemző szinaptikus funkcióvesztés,

továbbá a szinaptikus mitokondriumok fokozott érintettsége jól tanulmányozható az

agyszövetből előállítható szinaptoszóma preparátumokon. A szinaptoszóma az agyszövet

homogenizálása és gradiens centrifugálása során előállított, idegsejtek végződését tartalmazó

frakció, ami a szinaptikus mitokondriumokat és vezikulákat tartalmazó preszinaptikus

végződésekből, valamint a posztszinaptikus membránból és denzitásból áll (Hebb és

Whittaker, 1958; Gray és Whittaker, 1962). A szinaptoszóma preparátum roncsolásával

felszabadíthatóak és tovább tisztíthatók a szinaptikus mitokondriumok (Gillardon és mtsai.,

2007; Du és mtsai., 2010), melyek részletes proteomikai jellemzése, valamint AK-ban való

érintettségük a doktori értekezés fő témáját alkotják.

46

2. CÉLKITŰZÉSEK

Mint ahogy a bevezetőben bemutatásra került, az AK molekuláris és celluláris

mechanizmusa igen összetett, a rendelkezésre álló több mint százezer irodalom alapján

annyira szerteágazó, hogy a disszertáció keretei között teljességre törekedni lehetetlen.

Elsőként ezért összegeznénk, hogy a kísérleti munka során milyen AK kutatási eredmények és

hipotézisek alapján alakítottuk ki saját munkahipotézisünket:

A. Az AK nem egy homogén betegség, inkább egy számos altípussal rendelkező

betegségcsoport, melyek közös jellemzője az amyloid felhalmozódással és tau

hiperfoszforilációval járó demencia.

B. Az AK molekulárisan hamarabb indul, mint ahogy a tünetek jelentkeznek a tanulás

vagy a térbeli tájékozódás szintjén. Maga a kezdeti molekuláris mechanizmus

ismeretlen és feltehetőleg heterogén az AK egyes altípusa iban.

C. Az Aβ leginkább toxikus formáját nem a plakkok, hanem a szolubilis oligomerek

jelentik, melyek különböző aggregációs formái eltérő fiziológiai hatással bírhatnak,

amit előkísérleteink során igazoltunk in vivo.

D. Az AK-ban megfigyelhető neuronális funkcionális deficit már jóval az extracelluláris

Aβ aggregátumok felhalmozódása előtt, az intracelluláris Aβ hatására elkezdődik.

E. Az intracelluláris Aβ egyik fontos támadáspontja a mitokondriális anyagcsere, de a

pontos mitokondriális molekuláris mechanizmus feltáratlan, gyakran egymásnak

ellentmondó eredményekkel.

F. Az idegrendszeri elváltozások szempontjából a szinaptikus mitokondriumok szerepe

speciális, mivel a szinaptikus potenciálra és a neurotranszmisszióra kifejtett direkt

hatása miatt a szinaptikus átvitel hatékonyságát közvetlenül képes befolyásolni.

G. A mitokondriális korai változások és az Aβ felhalmozódás előrehaladtával végbemenő

további molekuláris átrendeződések megismerése csak „unbiased” stratégiával

lehetséges, mert a mitokondrium molekuláris összetétele az AK-ban nagyon komplex

módon sérül.

H. A korai változások megismerésére irányuló kutatást csak állatmodelleken lehet

végezni, mivel a magatartási tünetek megjelenése előtti, korai stádiumú AK-os

betegekből agyminta nem áll rendelkezésre még familiáris AK esetében sem.

I. A betegség csak bizonyos aspektusaival rendelkező állatmodellekből kulcsfontosságú

az Aβ progresszió vizsgálatára megfelelő állatmodell kiválasztása, amin lehetséges

korai molekuláris változásokat kimutatni és reprodukálni.

47

Mindezek alapján a kialakult munkahipotézisünkre támaszkodva egy átfogó

mitokondriális AK mechanizmus kutatást indítottunk el, mely során az alábbi kérdéseket

céloztuk meg:

I. A szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepének molekuláris hátterének

vizsgálata - a szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai

összehasonlítása.

Ennek érdekében célunk volt:

Tiszta, metabolikusan aktív szinaptikus, és nem-szinaptikus mitokondrium

preparátumok előállítása Balb/c egerek agyszövetéből.

A preparátumok tisztaságának ellenőrzése.

A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok fehérjekészletének

összehasonlítása.

A kapott fehérjekülönbségek funkcionális csoportosítása.

A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása független módszerekkel.

II. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív

metabolizmusra – 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális

proteomjának és oxidatív metabolizmusának összehasonlítása.

Ennek érdekében célunk volt:

Tiszta, metabolikusan aktív szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium

preparátum előállítása 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek

agyszövetéből.

3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális proteomjának

összehasonlítása a szinaptikus, illetve nem-szinaptikus mitokondriumok

szintjén.

3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális oxidatív

metabolizmusának összehasonlítása különböző szubsztrátok hatására a

szinaptikus, illetve nem-szinaptikus mitokondriumok szintjén.

A kapott fehérjekülönbségek funkcionális csoportosítása.

A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása független módszerrel.

A mitokondriális fehérjeváltozások közötti kapcsolatok bioinformatikai

elemzése.

48

3. ANYAGOK, MÓDSZEREK

A kísérletek során felhasznált állatokat 12 órás fény-sötét ciklusban tartottuk (fényben

8.00-20.00-ig tartózkodtak) 22 ± 2 ºC-os légkondícionált szobában, biztosítottuk a megfelelő

folyadék és táplálékbevitelt, továbbá törekedtünk a felhasznált állatok számának

minimalizálására.

A kísérletek során az Európai Közösségek Tanácsa 86/609/EEC direktívában, illetve

az 1998. évi XXVIII az állatok védelméről és kíméletéről szóló törvényben, a 243/1998 az

állatkísérletek végzéséről szóló kormányrendeletben és az egyetemi állatvédelmi előírásokban

foglaltak szerint jártunk el, továbbá mindent elkövettünk az állatok szenvedésének és

számának csökkentése érdekében.

3.1. Különböző Aβ aggregátumok fiziológiai hatásának összehasonlítása

Az Aβ elektrofiziológiai hatásának vizsgálatát Dr. Orbán Gergely kollégámmal

közösen végeztem. Az eredmények részletes megvitatása a „Különböző oligomerizációs fokú

β-amyloid aggregátumok hatása a neuronális excitabilitásra, az Alzheimer-kór, az epilepszia

és a gyulladási reakciók komplex, szinergikus mechanizmusa” című doktori dolgozata tárgyát

alkotja. Dolgozatom a közösen végzett módszerek és eredmények rövid bemutatását

tartalmazza, ami fontos fiziológiai előzménye az értekezésem fő témáját adó proteomikai

vizsgálatoknak.

3.1.1. Homogén aggregáltsági fokú amyloid oldatok előállítása

A kísérletekhez az Aβ peptid 42 aminosav hosszúságú formáját használtuk, melyet Dr.

Penke Botond (SZTE, Orvosi Vegytani Intézet) bocsátott rendelkezésünkre. A szilárd fázisú

peptidszintézissel előállított Aβ1-42 peptidet (Zarandi és mtsai., 2007) először 100 %-os

hexafluoro-izopropanolban (HFIP) oldottuk fel (6 óra oldódási idő). A módszer előnye

egyrészt, hogy a feloldás során az esetleges Aβ aggregátumok disszociálnak, és így monomer

oldatot tudunk előállítani, másrészt az, hogy amennyiben a minta tartalmaz sót, az rosszul

oldódik és kicsapódik HFIP-ben, így szűréssel vagy centrifugálással megszabadulhatunk tőle.

Ennek érdekében a mintákat asztali Eppendorf centrifugában 10.000 g-n 10 percig

centrifugáltuk, majd a felülúszóval dolgoztunk tovább. A HFIP-ben oldott Aβ1-42 mintákat

folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, liofilizáltuk, majd további felhasználásig -80°C-on

49

tároltuk. Az aggregátumok előállításához a liofilizált mintákat mesterséges cerebrospinális

folyadékban (ACSF) oldottuk fel, majd szobahőmérsékleten 0, 24, illetve 72 órát inkubáltuk.

3.1.2. Az aggregációs fok ellenőrzése a kísérletben alkalmazott oldatokban

3.1.2.1. Atomerő mikroszkópia (AFM)

Az ACSF-ben oldott 0, 24, illetve 72 órás amyloid aggregátumok méretét és alakját

atomerő mikroszkópia (atomic force microscope, AFM) segítségével határoztuk meg. A

mérések a Semmelweis Egyetem Biofizika és Sugárbiológiai Intézetében történtek Dr.

Kellermayer Miklós, Dr. Murvay Ünige és Dr. Kardos József közreműködésével. A módszer,

amely akár néhány Å mérettartomány felbontásra is képes, alkalmas volt arra, hogy képet

kapjunk az aggregátumok méret szerinti eloszlásáról.

Munkánk során egy Molecular Force Probe 3D (Asylum Research, Santa Barbara,

CA) típusú műszert használtunk „tapping” módban. „Tapping” módban a tűt rezgetjük, így az

csak az idő kis részében érintkezik a mintával, azt kevésbé károsítja, és kisebb a pásztázás

közben fellépő ellenállás is. A mért eredmény ábrázolásánál egy színskála segítségével

tesszük érzékelhetővé a harmadik dimenziót, ami lehet a „z” magasság, de lehet a

visszacsatolási áram, vagy a rezgő piezo-kristály és a rezgő lapka közötti fáziskülönbség,

esetleg ezek kombinációja. A mérésekhez a 0, 24, illetve 72 órás mintákat ~500-szorosára

hígítottuk vízben, a vékony csillámlemez (mica) felszínére felvittük, majd 2 perces inkubálás

után desztillált vízzel leöblítettük. A mintát 0,5-1 Hz-en szkenneltük végig. A képeket 200

egyedi aggregátum magasságának lemérésével értékeltük ki MFP-3D szoftver segítségével

(Asylum Research, Santa Barbara, CA). A nagyobb objektumokat, melyek különböző

aggregátumok összetapadásából keletkezhettek, nem vettük bele az analízisbe.

3.1.2.2. Thioflavin-T fluoreszcencia

A thioflavin-T (ThT, Sigma-Aldrich Co., Budapest, Magyarország) fokozottan

kötődik az Aβ fibrillumokhoz, míg a monomerekhez, illetve egyéb aggregátumokhoz kisebb

mértékben (Naiki, 1989). Az Aβ fibrillumok jelenlétét ThT fluoreszcenciával vizsgáltuk a

mintáinkban. A mérések során 3 μl Aβ mintát (0, 24, 72h) 1 ml 5 µM ThT oldattal kevertük

össze 50 mM glicinben és 100 mM NaCl-ban (pH 8,5). A ThT fluoreszcencia intenzitását 485

50

nm-en monitoroztuk 445 nm gerjesztőfénnyel 25°C-on Fluromax segítségével (SPEX

Industries, Edison, NJ, USA). A gerjesztő és emissziós rést 5 illetve 10 nm-re állítottuk be.

3.1.3. Patkány hippocampális populációs tüzelésének vizsgálata

Vizsgálataink során patkány hippocampusban regisztrálható pop-spike amplitúdó

változását (Andersen és mtsai., 1971), illetve az fEPSP meredekségét vizsgáltuk kontroll

(ACSF-vel kezelt), és különböző aggregáltságú amyloid oldatok beadása után akut illetve

krónikus állatokon. A kísérleteket körülbelül 250 g-os hím Sprague-Dawley (SPRD)

patkányokon végeztük (Charles River Laboratories, Hungary).

Az akut kísérletekben (n = 20) a kísérleti állatokat intraperitoneálisan uretánnal

altattuk, 1 g/testtömeg kg dózissal (Sigma-Aldrich Co., Budapest, Hungary). Az Aβ hatás

altatás során kialakult módosulásának kiküszöbölésére méréseinket szabadon mozgó

állatokon is elvégeztük. 15 állatba az akut mérésekkel megegyező koordinátákkal ültettünk be

elektródokat, mely során 0,6%-os halotánt használtunk az altatáshoz (Narcotane, Lecive,

Prague, Czech Republic). Ezeken az állatokon egy hét regenerációs idő után végeztünk

méréseket. Az állatok hőmérsékletét kisállati műtétekhez gyártott fűtőtesttel tartottuk állandó

szinten (TMP-5b, SuperTech Inc, Pécs, Magyarország).

A populációs tüzelés kiváltását a perforáns pálya (AP:-8,3 L:4,8 DV:3,4) bipoláris

elektróddal (California Fine Wire, stainless steel 316LVM, NY Bond, bifilar) történő

ingerlésével végeztük Supertech BioStim stimulátorral (11/B ábra). Percenként ingereltünk,

az ingerszélesség 0,1 ms-os volt. Az ingererősséget minden kísérlet során egyedileg

határoztuk meg úgy, hogy a regisztrátumon a pop-spike amplitúdója a maximális amplitúdó

~50%-a volt (11/A ábra).

Mind az akut, mind a szabadon mozgó kísérletet Nihon-Kohden EEG készülékkel

(Tokyo, Japan, időállandó: 5.0 s, mintavételezés: 0-10 kHz, érzékenység: 300 μV/mm), CED

1401 A/D konverter (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK) segítségével és

Signal 1.9 szoftverrel regisztráltuk. A regisztráló elektródot a ventrális hippocampus gyrus

dentatus hilus régiójába (AP:-4,8 L:4,5 DV:4,5) juttattuk be (11/B ábra). A bipoláris elektród

két aktív felszínének távolsága 0,6-0,8 mm volt. Az elektródok pontos helyzetét Paxinos és

Watson sztereotaxis koordinátái alapján határoztuk meg (Paxinos és Watson, 1982). Az

elektród helyes pozícióját a válasz alakjával és nagyságával ellenőriztük.

Az amyloidot illetve ACSF-et egy fém csőbe (kanülbe) illesztett „fused silica”

kapillárison keresztül adtuk be (Fused Silica Capillary TSP075150) (11/B ábra). A kapilláris

51

hegye ~0,5 mm-re volt a regisztráló bipoláris elektród fölött. Az amyloid oldat koncentrációja

200 μM volt, az oldatból 1 µl–t injektáltunk a dorzális hippocampusba (KD Scientific

pumpa). A beadás sebessége 0,033 µl/perc volt, a hirtelen megnövekedett nyomás- illetve

térfogatváltozásból adódó műtermék elkerülése érdekében. A helyes koncentrációt egy

kísérletsorozat során állítottuk be. Az amyloid oldatok aggregációs fokát az előkísérletek

(n=10) eredményei, illetve az irodalmi adatok alapján határoztuk meg.

Minden kísérlet elején 30 perces kontroll felvételt készítettünk, ami az adott kísérlet

„alapvonalául” szolgált. Az első 30 percben regisztrált kiváltott válaszok átlaga adta az adott

kísérlet „kontroll” populációs tüzelését és mezőpotenciálját, mely amplitúdójának és

meredekségének százalékában fejeztük ki a kapott értékeket.

A különböző minták beinjektálása a 30 perces kontroll felvétel után történt. 1 µl

amyloidot adtunk be 30 perc alatt. A beadás megkezdésétől számítva 100 percig regisztráltuk

az oldatok hatását. Minden közölt amplitúdó érték 10 regisztrátumon mért amplitúdó átlaga.

Az adatok kiértékelése Origin 7.0 szoftverrel történt.

11. ábra Hippocampus gyrus dentatus régiójából elvezetet t populációs tüzelés regisztrátuma a vizsgált

paraméterek feltüntetésével (A). Az ingerlő, regisztráló és amyloid beadórendszer sztereotaxikus műtéti

elrendezése (B). A regisztrátumon kékkel jelöltük a populációs tüzelés amplitúdóját, pirossal a mezőpotenciál

(fEPSP) meredekségét. A beépítés során készült felvételen jól látszódnak a kisagyba épített földelés céljára

szolgáló csavarelektródok, a perforáns pályába épített bipoláris ingerlő elektród, valamint a gyrus dentatusba

épített kanüllel kombinált elvezető elektród.

52

3.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív

metabolizmusra, a szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepe

3.2.1. A mitokondriális kísérletekben felhasznált állatmodellek

3.2.1.1. Balb/c egérmodell

A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok fehérjekészletének

összehasonlításához (n=12), elektronmikroszkópos (n=5) és fénymikroszkópos (n=4)

vizsgálatokhoz 3 hónapos Balb/c egereket használtunk (n=12).

3.2.1.2. APP/PS1 egérmodell

Az Aβ akkumuláció hatásának proteomikai (n=36), funkcionális (n=30) és

fénymikroszkópos (n=12) vizsgálatához 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és C57BL/6 (B6)

kontrol egereket használtunk fel. Az APP/PS1 kétszeresen transzgenikus modell előnye a

többi APP modellel szemben, hogy növekvő Aβ1–42/Aβ1–40 arányú amyloid képződéssel és

felgyorsult Aβ-patológiával rendelkeznek, valamint a tau patológia hiányának következtében

alkalmasak az Aβ progresszió hatásának kizárólagos vizsgálatára, így a kapott

fehérjeváltozások egyértelműbb értelmezésére.

A korcsoportok kiválasztása során célom volt 3 jól definiált, viselkedési és szövettani

elváltozások szintjén elkülöníthető időpontot választani. Az APP/PS1 állatok teljesítése

fokozatosan romlik 3-12 hónapos korig Morris water maze viselkedési tesztben (Gimbel és

mtsai., 2010). Három hónapos korban az állatok tehát még nem mutatnak se viselkedési, se

szövettani elváltozást. Hat hónapos korban már megjelennek az első Aβ plakkok a cerebrális

cortexben, míg 9 hónapos korban kiterjedt plakk felhalmozódást írtak le a hippocampus és a

cerebrális cortex területén (Jankowsky és mtsai., 2004).

3.2.2. A β-amyloid progresszió kimutatása 3, 6, illetve 9 hónapos egéragyban

Az összes mikroszkópos munkában felhasznált anyag Sigma-Aldrich termék. A

mikroszkópos vizsgálatokra 12 egeret használtunk fel (2 állat/csoport). Az agyakat

transzkardiálisan perfundáltuk fiziológiás sóoldattal, majd 4%-os formaldehid, 0.05%-os

glutáraldehid és 0,2%-os szaturált pikrinsavat tartalmazó 0,1M-os foszfát pufferrel (pH 7,4,

PB) 25 percig. Ezt követően az agyakat a koponyában hagytuk másnap reggelig.

53

A dorzális hippocampust tartalmazó blokkokból 50 µm-es metszeteket készítettünk

VT 1000S (Leica) vibratómmal és 0,05% nátrium-azidos 0,1M PB-ben tároltuk. A

metszeteket 0,1M-os nátrium-kakodiláttal mostuk és redukált ozmiummal utófixáltuk (0,5%

ozmium tetroxid, 0,75% kálium hexaciano-ferrát 0,1M nátrium-kakodilátban) 60 percig, “en

bloc” festettük félig telített vizes uranil acetáttal, dehidráltuk és Durcupan gyantába ágyaztuk

(Fluka). A metszeteket Cc1 kamerával felszerelt Zeiss AxioImager Z1 mikroszkóppal (Zeiss)

vizsgáltuk és fényképeztük.

Az elektronmikroszkópos munkához a fedőlemezt eltávolítottuk, a szomatoszenzoros

kéreg és dorzális hippocampus egy kis darabját újra ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket (70

nm) 300 mesh hálóméretű réz mikrorostélyra (grid-re) helyeztük és uranil acetáttal 5 percig,

majd ólom-citráttal 30 másodpercig kezeltük. A metszeteket JEOL JEM 1011 elektron

mikroszkóppal (JEOL) vizsgáltuk. A képeket Olympus Morada 11 megapixel kamerával

(Olympus) és iTEM szoftverrel rögzítettük (Olympus). A β-amyloid progresszió

kimutatásához végzett mikroszkópos munkák Kis Viktor közreműködésével történtek (ELTE,

Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék).

3.2.3. Szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok izolálása

A metabolikusan aktív szinaptikus (sMito) illetve nem-szinaptikus mitokondriumok

(nsMito) izolálását már korábban leírt protokollok (Gillardon és mtsai., 2007; Du és mtsai.,

2010) módosításával végeztük (Völgyi és mtsai., 2015b) (12. ábra). Az egereket

(n=6/csoport) dekapitáltuk, az agyakat eltávolítottuk, ACSF-ben mostuk, majd azonnal

szárazjégben lefagyasztottuk, elkerülve az agyi proteomban bekövetkező változásokat. Az

agyszövetet (200 mg / állat) 700 µl jéghideg izolációs pufferben (225 mM mannitol, 75 mM

szaharóz, 20 mM HEPES-KOH pH=7.2, 1 mM EGTA, proteáz és foszfatáz inhibitor koktélok

(Sigma-Aldrich)) homogenizáltuk előre lehűtött Dounce homogenizálóval (Kontes Glass Co.;

8 strokes Large Clearance + 8 strokes Small Clearance). Minden lépést 4°C-on jégen, illetve

jéghideg oldatokkal végeztünk. A kapott homogenizátumokat lecentrifugáltuk (1300 g, 5

perc). A felülúszókat összegyűjtöttük (1 ml), majd azonos mennyiségű (1 ml) 30%-os Percoll

oldattal kiegészítettük. A kapott 15%-os mintákat lépcsős Percoll gradiensre vittük fel (2 ml

40%, 24% és 15% Percoll oldat az alsó, középső és felső réteg), majd ismét lecentrifugáltuk

(34,000 g, 8 perc). A centrifugálást követően a 15 és 24%-os réteg közötti határfelületnél

összegyűlt sMito („band 2”), illetve a 24 és 40%-os réteg közötti határfelületnél („band 3”)

összegyűlt nsMito frakciókat 2 ml-es fecskendőre helyezett szűk ámérőjű tűvel (26 gauge)

54

nyertük ki. A mintákat ezt követően ugyanazzal a fecskendőtű használatával nagy sebességgel

egy másik centrifugacsőbe juttattuk, ötszörösére higítottuk, majd ismét lecentrifugáltuk

(34,000 g, 8 perc). Ahogy a szinaptoszómák nagy sebességgel keresztül haladtak a szűk

átmérőjű tűn, mechanikailag roncsolódtak, a szinapszis-specifikus struktúrák szétestek, a

szinapszisban lokalizált mitokondriumok szabaddá váltak. Mivel a mitokondriumok átmérője

és térfogata a szinapszisénál jóval kisebb, a mechanikai roncsolás következtében integritásuk

és metabolikus aktivitásuk nem károsodott. A centrifugálást követően mindkét mitokondrium

populáció leülepedett, míg a szinaptikus törmelékek a felülúszóban maradtak. Az sMito-okat

illetve nsMito-okat tartalmazó laza csapadékokat kinyertük és tovább tisztítottuk izolációs

pufferben való feloldást követő centrifugálással (8000 g, 15 perc). A proteomikai munkákhoz

a kapott sMito és nsMito mintákat jéghideg acetonban precipitáltuk másnap reggelig.

12. ábra A szinaptikus (sMito), illetve nem-szinaptikus mitokondriumok (nsMito) izolálásának főbb lépései.

3.2.4. A mitokondrium minták tisztaságának ellenőrzése

3.2.4.1. Elektronmikroszkópia

Az sMito, illetve nsMito csapadékokat 2% formaldehid és 0,5% glutáraldehid tartalmú

0,1M-os nátrium-kakodilát oldatban fixáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. A minták

utófixálása 0,5%-os ozmium tetroxiddal és 0,75%-os kálium hexacianoferráttal történt 45

percen át. Ezt követően az en bloc festés félig telített vizes uranil acetáttal, a dehidrálás és

beágyazás LR White gyantában történt. Az ultravékony (70 nm) metszeteket a már korábbi

elektronmikroszkópos vizsgálatokkal megegyezően, JEOL JEM 1011 elektron

mikroszkóppal, és Olympus Morada 11 megapixel kamrával és iTEM szoftverrel végeztük.

Az elektronmikroszkópiai vizsgálatok Kis Viktor közreműködésével történtek. A kapott

képek kvantálásához 25-25 sMito és nsMito felvételt készítettünk a preparátumokról (5 kép /

55

preparátum). Az összesített mitokondriális területet az összes jelölt terület (mitokondrium,

törmelék és szennyeződés) százalékában adtuk meg Image J szoftver segítségével (NIH,

Bethesda).

3.2.4.2. Fluoreszcencia aktivált sejt analízis és szortolás (FACS)

A agyi mitokondrium minták (ugyanazok a minták, melyeket a szinaptikus és nem-

szinaptikus mitokondriális 2D-DIGE összehasonlításánál használtunk) kettős jelöléséhez

NAO (nonyl acridine orange) és DiIC1 (1,1′,3,3,3′,3′-hexamethylindodicarbo - cyanine

iodide; Life Technologies) festékeket használtunk. A NAO festéket (Ex 488 nm, Em 525 nm)

a mitokondriális belső membránban felhalmozódó kardiolipin szelektív jelölésére (Petit és

mtsai., 1994), a membránpotenciál szenzitív DiIC1-et (Ex 635 nm, Em 660 nm) a

mitokondriumok integritásának és metabolikus aktivitásának ellenőrzésére használtunk.

A NAO (100 nM) és DiIC1 (10 nM) festékek hozzáadását követően a mintákat fénytől

védve jégen inkubáltuk 30 percig. Negatív kontrollként jelöletlen, azonos körülmények között

tárolt mintákat használtunk. A festékek koncentrációját irodalmi adatok alapján határoztuk

meg (Mattiasson és mtsai., 2003), elkerülve az aspecifikus jelölődés veszélyét. A

mintavételezéshez FACS Aria III (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) műszert

használtunk. A fluoreszcens festékeket 488 nm-en Argon, 635 nm-en piros dióda lézerrel

gerjesztettük. A kiértékeléshez FACS Diva szoftvert használtunk. A NAO jelölődés

fluoreszcens emisszióját 502-es felüláteresztő filterrel szűrtük és 530/30 sávszűrővel

detektáltuk. A DiIC1 fluoreszcens jelét 660/20-as sávszűrővel vizsgáltuk. Mintánként 50.000

eseményt regisztráltunk és Flow Jo 7.6.1. szoftverrel analizáltuk (Ashland, OR, USA). A

FACS Aria III műszeres mérések Dr. Matkó János és Tóth Eszter közreműködésével történtek

(ELTE, Immunológiai Tanszék).

3.2.5. Proteomikai analízis kétdimenziós differenciál gélelektroforézissel (2D-DIGE)

A 2D-DIGE analízist az összes kísérleti összeállításban (2. táblázat) egységesen, a

már korábban publikált protokoll alapján végeztem (Szegő és mtsai., 2010; Györffy és mtsai.,

2013). A mérések során GE Healthcare Little Chalfont, UK eszközöket, vegyszereket és

szoftvert használtam. A minták jelölése 2D-DIGE „Saturation Labeling” módszerrel történt.

Az acetonnal precipitált mitokondrium mintákat lízis pufferben reszuszpendáltuk (lízis

puffer összetétele: 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris, 5 mM magnézium-

56

acetát). A minták pH-ját 8,0-ra állítottuk be, koncentrációjukat 2D-Quant Kittel határoztuk

meg. Az 5µg fehérjemennyiségű mitokondrium minták jelölésére CyDye DIGE Fluor

Saturation Labeling Kit-et használtunk a gyártó utasításait követve. A „Saturation Labeling”

(vagy más néven „Full stain”) előnye, hogy két különböző fluoreszcens festékkel (Cy3 és

Cy5) jelölt mintát tudunk ugyanazon a gélen elválasztani (13. ábra). Az egyik minta mindig a

belső standard („pool”), mely az összes vizsgált mintát ugyanolyan koncentrációban

tartalmazza. A másik minta az általunk összehasonlítani kívánt csoportok mintáinak egyike

(az 1. kísérleti elrendezésben pl. az sMito vagy az nsMito). Mivel a belső standard mintával

egyszerre csak egy minta futtatható egy gélen, a 12 minta (6-6 csoportonként) elválasztása két

sorozatban történik (mivel egy futtató tankba egyszerre 6 gél tehető). A kísérlet során

esetlegesen előforduló belső hibák lecsökkentése végett a két futási sorozatban variáltuk az

összehasonlítandó csoportok mintáit (az 1. kísérletben tehát: 3sMito és 3 nsMito futott együtt)

(Marouga és mtsai., 2005).

2. táblázat 2D-DIGE-val végzett proteomikai analízisek listája. (sMito: szinaptikus mitokondrium; nsMito:

nem-szinaptikus mitokondrium; Balb/c, APP/PS1, B6: egértörzsek; Cy5: CyDye 5 fluoreszcens festék; Cy3:

CyDye 3 fluoreszcens festék; pool: az összehasonlítandó csoportokba tartozó minták mindegyikét egyenlő

mennyiségben tartalmazó köztes standard).

cél modell csoportok jelölés minta (db) gél (db)

sMito Cy5 6

nsMito Cy5 6

"pool" Cy3 12

APP/PS1 sMito Cy5 6

B6 sMito Cy5 6

"pool" Cy3 12

APP/PS1 nsMito Cy5 6

B6 nsMito Cy5 6

"pool" Cy3 12

APP/PS1 sMito Cy5 6

B6 sMito Cy5 6

"pool" Cy3 12


B6 nsMito Cy5 6

"pool" Cy3 12

APP/PS1 sMito Cy5 6

B6 sMito Cy5 6

"pool" Cy3 12


B6 nsMito Cy5 6

"pool" Cy3 12

Balb/c1. kísérlet

3 hónapos

APP/PS1

B6

2. kísérlet

sMito és nsMito

fehérjekészletének

összehasonlítása

3 hónapos APP/PS1

és B6 sMito


összehasonlítása

12

12

12

12

12

12

3. kísérlet

4. kísérlet

5. kísérlet

6. kísérlet

7. kísérlet

3 hónapos

APP/PS1

B6

12

6 hónapos

APP/PS1

B6

6 hónapos

APP/PS1

B6

9 hónapos

APP/PS1

B6

9 hónapos

APP/PS1

B6

3 hónapos APP/PS1

és B6 nsMito


összehasonlítása

6 hónapos APP/PS1

és B6 sMito


összehasonlítása

6 hónapos APP/PS1

és B6 nsMito


összehasonlítása

9 hónapos APP/PS1

és B6 sMito


összehasonlítása

9 hónapos APP/PS1

és B6 nsMito


összehasonlítása

57

Az első dimenzióban zajló izoelektromos fókuszáláshoz 24 cm-es IPG strippet (pH 3–

10 NL (nem lineáris)) használtunk. Az elválasztás 24 órán át Ettan IPGphor készülékben a

következő protokoll alapján történt: 30 V / 3 órás lépés, 500 V / 5 órás gradiens, 1000 V / 6

órás gradiens, 8000 V / 3 órás gradiens, 8000 V / 6 órás step mód. A fókuszált fehérjéket

ekvilibráló oldatban redukáltuk 20 percig (ekvilibráló oldat összetétele: 6 M urea, 50 mM Tris

(pH 8,8), 30% (v/v) glicerin, 2% (w/v) nátrium dodecil szulfát (SDS), brómfenol kék és 1%

(w/v) merkaptoetanol). Ezt követően az IPG stripeket 10%-os 24x20 cm-es saját öntésű

poliakrilamid gélekre helyeztük (gél összetétele: 10% akrilamid, 0,3% N,N-metilén-

biszakrilamid, 1,5 M Tris, 0,1% SDS, 0,1% TEMED, 0,05% ammóniumperszulfát, pH 8,8),

0,5%-os agarózzal rögzítettük, majd SDS-PAGE elválasztást végeztünk “Ettan DALT Six

System” rendszerben. A futtatáshoz SDS-glicin-Tris puffert használtunk (1% SDS, 14,4%

glicin, 3% Tris). A molekulatömeg szerinti elválasztás a következő protokoll alapján történt: 1

óra – 2 W/gél, 3 óra – 12 W/gél. Az elválasztás végén a géleket TyphoonTRIO+ szkennerrel

detektáltuk a megfelelő lézer és szűrő beállításokat alkalmazva (Cy3: 548/560 nm, Cy5:

641/660 nm abszorpciós/emissziós maximum). A gélképeket ImageQuant TL szoftver

segítségével tettük láthatóvá.

13. ábra A 2D-DIGE munkafolyamat fő lépései Full stain fluoreszcens jelölés alkalmazásával (1-4).

A fehérjekülönbségek analízisére DeCyderTM 2D szoftver 7.0 Differential In-gel

Analysis (DIA) és Biological Variation Analysis (BVA) modulokat használtunk. A DIA

modul segítségével határoztuk meg az azonos gélen futtatott mintákban található (egyedi

58

minta és belső standard) fehérje foltok intenzitásainak hányadosait. A BVA modulban a

különböző gélek egymásnak megfeleltethető foltjait párosítottuk, a fehérje foltok fluoreszcens

intenzitását a minden gélen jelen levő megfelelő köztes standard minta értékeire

normalizáltuk. A szignifikáns fehérje mennyiség különbségeket független Student t-próbával

határoztuk meg minden egyes fehérje foltra.

3.2.6. Preparatív kétdimenziós gélelektroforézis

A szignifikáns változást mutató fehérjefoltokban levő fehérjék azonosítására

preparatív 2D gélelektroforézist végeztünk, összesen 800 µg fehérje / gél felhasználásával. A

második dimenziós elválasztást követően a géleket metanol és foszforsav tartalmú oldatban

fixáltuk (60 perc). Az elválasztott fehérjefoltokat Colloidal Coomassie Blue G-250 (Merck,

Darmstadt, Germany) festékkel tettük láthatóvá (0,05% G-250, 1% H3PO4, 8% (NH4)2SO4,

20% metanol). A festék eltávolítása 0,1 M Tris-oldattal (3 perc, pH 6,5), majd 25%-os

metanol-oldattal történt (1 perc). A géleket a fehérjefoltok kiszedéséig 20%-os (NH4)2SO4-

oldatban tároltuk.

3.2.7. Fehérjeazonosítás tömegspektrometriával (nanoUHPLC-MS/MS)

A fehérjék tripszines emésztése a gyártó utasításai illetve egy már korábban publikált

protokoll alapján történt (Ghafari és mtsai., 2014). A szignifikáns változást mutató fehérje

foltokat pipettaheggyel vágtuk ki a Coomassie-val festett preparatív gélből, majd ddH2O

illetve ddH2O/acetonitril 1:1 (v/v) pufferben feséktelenítettük a mintákat (2x15 perc). A

folyadék eltávolítása után annyi acetonitrilt adtunk a mintákhoz, hogy a géldarabokat éppen

ellepje, majd miután a géldarabok összeestek, eltávolítottuk az acetonitrilt. Ezt követően 100

mM-os ammónium-trikarbonáttal rehidráltuk (5 perc), majd azonos mennyiségű acetonitril

hozzáadásával inkubáltuk a mintákat (15 perc), végül vákuumcentrifugával szárítottuk be a

géldarabokat 51 °C-on. Ezt követően a mintákat tripszinoldattal rehidráltuk (Promega), majd

inkubáltuk 45 percig. A tripszinoldat eltávolítását követően másnapig emésztőpufferben

inkubáltuk a mintákat 37 °C-on. Másnap a peptid extrakcióhoz annyi 50mM ammónium-

trikarbonátot adtunk a mintákhoz, hogy a géldarabokat ellepje, majd 15 perces inkubálás

következett. Azonos mennyiségű acetonitril hozzáadásával a mintákat tovább inkubáltuk (15

perc), majd még kétszer megismételtük az extrakciót 1 % hangyasav/acetonitril 1:1 (v/v)

oldatban. A minták beszárítását követően a peptideket 30 µl 0,1%-os hangyasavban vettük fel.

59

A megemésztett fehérjék azonosítását Waters NanoAcquity UPLC rendszerrel

kapcsolt Micromass Q-TOF premier tömegspektrométerrel végeztük. A mintákat egyenként

(5 µl-t) injektálva vittük fel az előoszlopra, majd “A” eluenssel 10 µl/perces áramlási

sebességgel mostuk (3 perc). Az “A” mobil fázis 0,1%-os hangyasav/víz, a “B” mobil fázis

0,1%-os hangyasav/acetonitril volt 350 nl/perc áramlási sebességgel, Waters BEH130 C-18

75 µm x 250 mm-es oszlopon, 1,7 µm-es szemcseméretű C-18-as töltettel. A lineáris gradiens

3-10%-os (0-1 perc), 10-30%-os (1-20 perc), 30-100%-os (20-21 perc), 100% (1 perc), majd

végül 3%-OS “B” eluens volt (1 perc). Az oszlop újra ekvilibrálása a kezdeti körülmények

között zajlott (22 perc). Az elválasztás 45 °C-on történt. A tömegspektrométert DDA módban

lockmass korrekcióval használtuk, 30 ppm névleges tömegpontossággal. A méréseket pozitív

ion módban végeztük 1 Hz-es adatrögzitéssel, 400-1990-ig terjedő tömeg/töltés (m/z)

tartományban MS, valamint 50-1990-ig terjedő MS/MS beállításokkal. A ionforrás

hőmérséklete 85°C volt, porlasztógázként nitrogént használtunk (0,5 bár). A kapilláris és

belépő rés feszültségét 3,3 kV illetve 26 V-ra állítottuk. A megemésztett fehérjék azonosítása

Gulyássy Péter (MTA, MS Proteomika Kutatócsoport) és Dr. Szabó Zoltán (SZTE, Orvosi

Vegytani Intézet) közreműködésével történt.

Az adatokat WATERS Proteinlynx GlobalServer 2.4 szoftver segítségével dolgoztuk

fel. A fehérjeazonosításhoz Mascot 2.2 (Matrix Science, London, UK) szoftvert használtunk,

a keresést Swissprot adatbázison, tripszines emésztési specificitást megkövetelve végeztük. A

keresés során 0,15 Da fragmens és 30 ppm anyaion tömegtoleranciával dolgoztunk. A

metionin oxidációja volt a megadott variábilis módosítás. Az MS/MS alapú peptid és fehérje

adatok validálására Scaffold (version Scaffold 3.62, Proteome Software Inc., Portland, OR)

programot használtunk. Az azonosított fehérjét akkor fogadtuk el, ha a találati valószínűsége

95% fölötti volt és legalább 2 peptiddel azonosítottuk. A fehérjék valószínűségét Protein

Prophet algoritmussal határoztuk meg.

3.2.8. Funkcionális csoportosítás

A szignifikánsan megváltozott fehérjéket UniProt (http://www.uniprot.org/) és

GeneOntology (http://geneontology.org/) adatbázisok alapján csoportosítottuk. A fehérjék

csoportosítása a legrelevánsabb sejtes funkcióik alapján történt. Az APP/PS1-B6

összehasonlítás során kapott fehérjeváltozásokat az irodalom alapján ismert humán AK-os

mintákban leírt változásokkal is összevetettük (3. táblázat).

60

3.2.9. A legjelentősebb fehérjeváltozások validálása Western blot technikával (WB)

A WB mérésekhez ugyanazokat a mintákat használtuk, mint a 2D-DIGE módszer

során. A mintákat kétszeres koncentrált pufferben vettük fel (8% SDS, 3% ditiotreitol (DTT),

24% glicerol, 0.2% brómfenol kék, 100 mM Tris-HCl, pH 6,8), majd Tricines-SDS-

poliakrilamid gél elektroforézissel választottuk el 4%-os koncentráló, illetve 15%-os

elválasztó poliakrilamid gélen. Az elválasztást követően a fehérjéket HybondTM-LFP PVDF

(GE Healthcare) membránra vittük át. A membránokat 5% BSA tartalmú Tween 20/Tris

pufferben (TBS-T) blokkoltuk 60 percig, majd TBS-T-ben mostuk 4x5 percig.

A Sucla2, Idh3a, C1qbp és Sod2 fehérjék validálása

Az sMito – nsMito összehasonlítás során az sMitoban felgyülemlő fehérjék közül a

Sucla2 és C1qbp, az nsMitoban felgyülemlő fehérjék közül az Idh3a és Sod2 fehérjéket

validáltuk. A membránokat a következő elsődleges antitestekben inkubáltuk: nyúl anti-Sucla2

(1:2500 hígításban, 12627-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA), nyúl anti Idh3a (1:2500

hígítás; 15909-1-AP; Proteintech), nyúl anti-C1qbp (1:1000 hígítás, sc-48795; Santa Cruz

Biotechnology) és nyúl anti-Sod2 (1:1000 hígítás; ab68155; Abcam).

A Htra2 és Ethe1 fehérjék validálása

Az APP/PS1 és B6 sMito összehasonlításban a legjelentősebb, mindhárom

korcsoportban megjelenő változást a szinaptikus mitokondriumokban megváltozó Htra2 és

Ethe1 adta, mely változásokat WB technikával is megerősítettünk. A membránokat a

következő elsődleges antitestekben inkubáltuk: nyúl anti-Htra2 poliklonális antitest (15775-1-

AP, Proteintech) 1:1000-es hígításban, nyúl anti-Ethe1 poliklonális antitest (ab154041;

Abcam) 1:500-as hígításban.

A membránokat 4x5 percig mostuk TBS-T-ben, majd ECL Plex CyDye konjugált anti-

nyúl IgG másodlagos antitestet használtunk (GE Healthcare). Ismételt TBS-T-s mosást

követően Tris pufferes mosás következett, majd a membránokon jelenlévő specifikus

fehérjéket TyphoonTRIO+ szkennerrel tettük láthatóvá. A fluoreszcens intenzitásokat

ImageQuant TL szoftverrel kvantáltuk. A blottolást követően a PVDF membránokat 0,1%-os

Coomassie R-250 festékben inkubáltuk 1 percig (oldószer: 50% metanol), majd 40% metanol

és 10% ecetsav tartalmú oldatban festéktelenítettük 4x5 percig, majd végül dH2O-ban 5

percig. Az egyes fehérjecsíkok denzitás értékeit a felvitt minta összfehérje mennyiségére

normáltuk. Ez a normálási módszer alkalmas az olyan minták kiértékelésére, melyeknél az

általános loading kontrollként alkalmazott fehérjék (Actb, Vdac1) nincsenek jelen vagy

61

változnak (Eaton és mtsai., 2013). A fehérjeintenzitások közti különbségek statisztikai

analíziséhez Student t-próbát végeztünk.

3.2.10. A Sucla2, Idh3a és C1qbp fehérjék lokalizációjának immunhisztokémiai

vizsgálata

Az sMito – nsMito összehasonlítás során az sMitoban felgyülemlő fehérjék közül a

Sucla2 és C1qbp, az nsMitoban felgyülemlő fehérjék közül az Idh3a fehérjéket

immunhisztokémiával is vizsgáltuk. Az immunfestéshez a három hónapos Balb/c egereket

(n=4) túlaltattuk, majd transzkardiálisan perfundáltuk 25 ml fiziológiás sóoldattal, majd 70 ml

4%-os paraformaldehiddel (oldószer: 0,1M foszfát puffer, pH=7,4). Az agyakat eltávolítottuk

és 4%-os paraformaldehidben poszt-fixáltuk 24 órán keresztül, majd 20% szaharózt

tartalmazó foszfát pufferbe tettük két napra. Az agymintákból 40 μm vastagságú koronális

metszetsorozatot készítettünk szánkamikrotóm segítségével. Az agymetszeteken a Sucla2 és

Idh3a fehérjékre dupla fluoreszcens immunjelölést, a C1qbp fehérjére DAB-os immunjelölést

alkalmaztunk. Az immunfestés összes lépése rázóinkubábor használatával történt

szobahőmérsékleten. Az immunfestéshez az agyszeleteket elsőként 0,1M-os foszfát pufferben

(PB) átmostuk (3x10 perc), majd előkezeltük 0,5% triton és 0,05% nátrium-azid tartalmú 3%-

os marha szérum albumin (BSA) (oldószer: foszfát puffer) oldatban (60 perc) az aspecifikus

kötőfelszínek lefedése érdekében, majd 15 perces 3%-os H2O2-os kezelést végeztünk az

endogén peroxidázok leblokkolása céljából. (A PB-s mosási lépéseket minden további lépés

között elvégeztük, melyet külön nem tüntetek fel).

Ezt követően a dupla fluoreszcens immunjelöléshez a metszeteket anti-Sucla2 (1:200

hígítás) illetve anti-Idh3a (1:40 hígítás) elsődleges antitestekben inkubáltuk másnapig (a

Sucla2 és Idh3a antitestek megegyeztek a WB során használt antitestekkel). Másnap

biotinilált, kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitestben (1:1000 hígítás; Jackson

Immunoresearch, West Grove, PA, USA) inkubáltuk tovább a metszeteket (120 perc), majd

FITC (fluoreszcens izotiocianát)-tiramidos hívás következett: elsőként avidin-biotin peroxidáz

komplexben (1:500 higítás, ABC-komplex, Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories)

inkubáltuk a metszeteket 60 percig, majd 0.003% hidrogén-peroxidot tartalmazó FITC-

tiramidos erősítéssel tettük láthatóvá a jelet (hívás ideje: 6 perc, higítás: 1:8000, 50mM

Trizma pufferben, pH=8,0). A szinaptofizines (Syn) dupla jelöléshez a metszeteket anti-Syn

antitestben (1:1000 higítás, DAKO, Ely, UK) inkubáltuk tovább két napig, majd szamárban

termeltetett Alexa 594 anti-egér IgG másodlagos antitesttel (1:500, Molecular Probes,

62

Eugene, OR, USA) tettük láthatóvá (120 perc). Végül a metszeteket pozitívan töltött, nem-

zselatinozott tárgylemezre húztuk fel (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,

USA), majd a jel kifakulását meggátoló színtartó médiummal fedtük le (Prolong Antifade Kit,

Molecular Probes). A metszeteket Bio Radiance 2100 Laser Scanning System Nikon Eclipse

E800 konfokális mikroszkóppal vizsgáluk és fotóztuk le. A dupla immunjelölésű képeket

Image J szoftverrel (NIH, Bethesda) analizáltuk. Kvantifikáláshoz a (Sucla2/Idh3a - Syn

dupla jelölés) / (összes Syn jelölés) százalékos arányát adtuk meg 10-10 különböző képen,

ami a Sucla2-, illetve Idh3a-pozitív mitokondriumot tartalmazó preszinaptikus végződések

arányáról ad információt. A kolokalizációk számának összehasonlításához Student t-tesztet

végeztünk.

A DAB-os egyszeres immunjelöléshez a metszeteket nyúlban termeltetett anti-C1qbp

(sc-48795, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) antitestben (1:50-es hígítás) inkubáltuk másnapig,

majd biotinilált kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitestben inkubáltuk tovább a

metszeteket a kettős jelölésnél alkalmazott módon. Ezt követően avidin-biotin peroxidáz

komplexes (ABC-komplex, 1:500 higítás, Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) kezelés

következett 1 órán keresztül, majd a peroxidáz reakció kimutatásához a metszeteket 0,3

mg/ml 3,3’-diaminobenzidint (DAB), 1 mg/ml nikkel-ammónium-szulfátot és 15 μl 30 %-os

H2O2-t tartalmazó hívó oldatba helyeztük (hívás ideje: 4 perc, 0,05M-os TRIS pufferben).

Végül a metszeteket zselatinos tárgylemezre húztuk fel és DPX médiummal fedtük le (Sigma,

St. Louis, MO).

3.2.11. A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációjának immun-elektronmikroszkópiai

vizsgálata

Szövetpreparálás és alacsony hőmérsékletű beágyazás elektronmikroszkópiai immunjelölésre

Két Balb/c egeret túlaltattunk dietil éterrel majd transzkardiálisan perfundáltuk

fiziológiás sóoldattal 30 percig, majd 4% formaldehid, 0.05% glutáraldehid és 0.2% pikrinsav

tartalmú fixáló oldattal 60 percig (oldószer: 0.1M foszfát-puffer, pH=7.4). A perfúzió után a

cerebellum és a dorzális hippocampus területéből kivágott blokkokat 0.1M-os foszfát

pufferrel többször átmostuk. A szabad aldehidek a foszfát pufferben oldott 50-50 mM

ammónium-kloriddal és glicinnel elreagáltak. A blokkokat ezt követően 0.05M-os malát

pufferben mostuk háromszor (pH=5,5), majd 180 percig sötétben poszt-fixáltuk 1%-os uranil

acetátban (oldószer: 0.05M-os malát puffer). A poszt-fixálás után ismételt háromszori malát

pufferes mosás következett, majd a blokkokat dehidráltuk felszálló alkoholsorban. A mintákat

63

ezt követően átitattuk LR White gyantával (12 óra, -20∘C), majd 2% benzoil peroxid

katalizátort tartalmazó LR White gyantával (3 óra, -20∘C). A polimerizációt házilag készített

UV kamrában végeztük két DL-103 2x6W UV lámpa használatával (60 perc, -20∘C).

Beágyazás utáni immuncitokémia

A beágyazás utáni immunarany jelölés 400 mesh hálóméretű nikkel mikrorostélyra

helyezett ultravékony metszeteken (80 nm) történt. Az összes immunreakció parafilmmel

bevont 96 lyukú plate-en történt szobahőmérsékleten. A metszeteket a reagenscseppekbe

helyeztük, így mindkét oldaluk átjárhatóvá vált az immunreagensek számára. A jelölés során

0.9% nátrium-klorid tartalmú 0,05M-os Tris puffert (TBS, pH=7,5) használtunk. A következő

lépések szerint dolgoztunk: 5% hidrogén-peroxidos kezelés (2 perc), mosás kétszeresen

desztilált vízben (biDV, 3x5 perc), 0,05M TBS-ben oldott 0,3% nátrium borohidrid és 50mM

glicin oldatos kezelés (10 perc), mosás TBS-ben (3x5 perc), 10% normál kecske szérumot

(normal goat serum, NGS) és 1% BSA-t tartalmazó TBS-es kezelés (30 perc), 0,05% nátrium-

azidot tartalmazó NGS-TBS-ben oldott nyúl anti-Idh3a antitest (1:15 higítás) vagy nyúl anti-

Sucla2 antitest (1:25) kezelés (12 óra), mosás 2% NGS-TBS-ben (4x5 perc), 6, illetve 10 nm-

es aranyszemcse-konjugált kecskében termeltetett anti-nyúl másodlagos antitest kezelés (1:50

higítás, oldószer: 1% BSA-t tartalmazó TBS, 12 óra), mosás TBS-ben (3x5 perc), 2%

glutáraldehid tartalmú TBS kezelés (10 perc), mosás biDV-ben, szárítás levegőn, festés 1%

uranil acetát tartalmú 50%-os metanolban (30 perc) majd ólom-citrátban (30 másodperc),

szárítás levegőn. Az immun-elektronmikroszkópiai vizsgálatok Kis Viktor közreműködésével

történtek.

3.2.12. Az APP/PS1 – B6 modellek összehasonlítása során kapott mitokondriális

fehérjeváltozások bioinformatikai analízise

A szignifikáns mitokondriális fehérjeváltozások közti kapcsolatokat Ariadne

Genomics Pathway Studio® 9.0 szoftverrel (ResNet 9.0, 2010Q4, Ariadne Genomics, Inc,

Rockville, MD, USA) elemeztük. Az összes APP/PS1 modellben szignifikánsan megváltozott

mitokondriális fehérjére elvégeztük a “közös regulátor” és “közös célpont” analízist (az

összes 3, 6 és 9 hónapos sMito és nsMito fehérjékre). A kapott regulátor és célpont fehérjék

közül további analízisre azokat a fehérjéket választottuk ki, melyek minimum 7 kapcsolattal

rendelkeznek az általunk meghatározott szignifikánsan változó mitokondriális fehérjékkel.

64

3.2.13. A mitokondriális oxigénfogyasztás összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban

A mitokondriális oxigénfogyasztást Clark-típusú oxigén elektróddal vizsgálatuk

Oxigráf-2K magas felbontású respirációs rendszerben (Oroboros Instruments, Innsbruck,

Austria). A mérések 37˚C-on, 2 ml-es kevertetett kamrákban történtek. Az oxigén szenzorokat

levegővel telített oxigénmentes médiumban kalibráltuk. Az oxigén fluxust az

oxigénkoncentráció negatív, idő szerinti deriváltjaként számítottuk ki, (-dcO2/dt). Az oxigén

felhasználás mérésekhez a szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium preparátumokat

0,025 mg/ml-es végkoncentrációban használtuk, melyet 2D-Quant Kittel határoztuk meg. A

méréseket 3, 6, illetve 9 hónapos B6 és APP/PS1 egerek teljes agyszövetéből preparált

mitokondrium mintákban végeztük (n=6-6). A mitokondrium mintákat glutamáttal és maláttal

(5-5 mM) vagy szukcináttal (5 mM) energetizáltuk. Az oxigénfelvételt 10 µM, 20 µM és 2

mM adenozin difoszfát (ADP) és 2 µM karboxiatraktilozid (CAT) specifikus adenine-

nukleotid transzlokáz gátló hozzáadásával végeztük.

3.2.14. A mitokondriális H2O2 termelés összehasonlítása APP/PS1 és B6 állatokban

A peroxid-szint mérés Amplex UltraRed fluoreszcens festékkel (ThermoFisher

Scientific) történő H2O2 detektáláson alapul. Tormaperoxidáz jelenlétében az Amplex

Red/UltraRed reagens a H2O2-dal reakcióba lép 1:1 sztöchiometriával, ami erősen

fluoreszcens rezorufint képződésével jár. A peroxid szint mérésekben felhasznált sMito és

nsMito preparátumok megegyeztek a mitokondriális oxigénfogyasztás vizsgálatokban

alkalmazott csoportokkal (3, 6, illetve 9 hónapos B6, illetve APP/PS1 egerek). A 0,025

mg/ml-es mitokondrium mintákat 5 mM glutamát + malátot vagy 5 mM szukcinátot

tartalmazó standard médiumban inkubáltuk, majd hozzáadtuk a tormaperoxidáz (5U / 2 ml) és

Amplex UltraRed (2 μm) reagenseket. A H2O2 képződést 37°C-on PTI Deltascan (Photon

Technology International; Lawrenceville, NJ) fluoreszcens spekrofotométerrel detektáltuk. A

H2O2 termelődést 2 mM ADP, 1 µM rotenone (komplex I inhibitor) és 250 µM

trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon (FCCP) (elektrontranszport szétkapcsoló) hozzáadása

mellett követtük. A gerjesztési hullámhossz 550 nm volt, a fluorenszens emissziót 585 nm-en

detektáltuk. Minden mérés végén különböző mennyiségű H2O2 oldatok hozzáadásával

kalibrációs görbét vettünk fel. Az eredményeket relatív H2O2 szint értékekben adtuk meg (a

kontroll/B6 egerek kísérleti eredményeinek százalékában). A szignifikáns különbségek

megállapításához Student t-próbát végeztünk (p<0,05). Az oxigénfogyasztás és H2O2 szint

mérések Dr. Tretter László (SOTE, Orvosi Biokémiai Intézet) közreműködésével történtek.

65

4. EREDMÉNYEK

4.1. A különböző Aβ aggregátumok sejtek excitabilitására gyakorolt fiziológiai

hatásának eredményei

4.1.1. Az Aβ oldatok in vitro karakterizálása

A monomer Aβ1-42 fehérjét mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) oldott

formában használtuk fel az in vivo kísérletekhez. A különböző aggregátum típusok

előállításához az amyloid oldatokat szobahőmérsékleten inkubáltuk 0, 24, illetve 72 órán

keresztül. Az Aβ különböző méretű és morfológiájú aggregátumokat formál egy adott

oldatban, így az Aβ oldatok karakterizálása nehézkes.

Az aggregátumok méretét és alakját AFM segítségével határoztuk meg. A

csillámlemez felszínén mért magasságértéke az aggregátumnak arányos az aggregátum

vastagságával, átmérőjével. A 14. ábra az aggregátumok méret szerinti eloszlását mutatja

meg a 0, 24, illetve 72 órás mintákban. A 0 órás oldat jól láthatóan többnyire ~ 0.5 nm-es

magasságú monomereket tartalmaz. Az 0 órás Aβ oldat komponensei nagy affinitással

kötődnek a csillámlemez felszínéhez és egymáshoz az AFM minták preparálása során (14/C

ábra). A 24 órás inkubációnál döntően ~1-1,5 nm magasságú kis oligomereket és aspecifikus

aggregátumokat láthatunk, illetve kevesebb ~2-3 nm magas, nagyobb aggregátumot (14/D

ábra). A háttérben a csillámlemez felszíne tisztább, mint a 0 órás minta esetében, ami a

monomerek lecsökkent mennyiségét mutatja. A 72 órás mintában a kisebb oligomerek száma

lecsökkent, 2-4 nm magasságú nagyobb aggregátumok figyelhetőek meg (14/E ábra). A

méreteloszlást mutató grafikon alapján látszik, hogy a különböző aggregáltsági fokú oldatok

monomer oldatból történő előállítása lehetséges. A 2-3 nm magasságú oligomer méret

megegyezik Stine és mtsai által 2003-ban publikált, PB-ben történő oligomerizációs

eredményével (Stine és mtsai., 2003). Ezt a magasság tartományt protofibrillumnak is

karakterizálták, azonban a mi mintánkban az aggregátum szférikusnak vagy rövidebbnek

tűnik (<20-30 nm). A 72 órás oldat lokális maximum ~1, 2.4 és 3 nm magas volt a

mennyiségi eloszlás vizsgálata során (14/A ábra), ami az oldatban található különböző

oligomer formák jelenlétére utal, azonban meg kell jegyeznünk, hogy a pontos

oligomerizációs fok nem mérhető AFM-mel.

A thioflavin-T (ThT) fokozott intenzitással kötődik az Aβ fibrillumokhoz, míg a

monomerekhez, illetve egyéb aggregátumokhoz alacsonyabb mértékben (Naiki és mtsai.,

1989). Az Aβ fibrillumok jelenlétét ThT fluoreszcenciával vizsgáltuk a mintáinkban. A 0 órás

66

mintában alacsony a ThT fluoreszcencia, amiből arra következtethetünk, hogy a mintában

többnyire monomerek vannak jelen. A 24 órás, illetve a 72 órás mintában szignifikánsan

magasabbak a fluoreszcencia intenzitás értékek. A minták ThT fluoreszcencia intenzitása

tehát az inkubációs idővel növekszik, ami alátámasztja az aggregáció előrehaladását (14/B

ábra).

14. ábra A. Összetevők méret szerinti mennyiségi eloszlása (0, 24, 72h-s Aβ); B: Thioflavin-T fluoreszcencia

intenzitás (0, 24, 72h-s Aβ) ; C-E: AFM felvételek (0, 24, 72 órás Aβ) (Orbán és mtsai., 2010).

4.1.2. Elektrofiziológiai eredmények

Az urethánnal altatott állatokban a tisztán amyloid monomereket tartalmazó oldat (0

órás Aβ1-42, 1 μl, 200 μM) hatására a hippocampális populációs tüzelés vizsgálatakor nem

kaptunk szignifikáns változást. A 24 órán át szobahőmérsékleten aggregáltatott amyloid minta

(24 órás Aβ1-42) növelte, míg a 72 órán át aggregáltatott amyloid oldat (72 órás Aβ1-42)

csökkentette a populációs tüzelés amplitúdóját az ACSF-vel kezelt kontroll csoporthoz képest.

Az idegsejtek excitabilitására gyakorolt szignifikáns hatást 40 perccel az injektálást követően

tudtunk regisztrálni (15/A. ábra).

Szabadonmozgó állatokban a 24 és 72 órás Aβ1-42 oldatok hatása még kifejezettebb

volt. Az idegsejtek excitabilitására gyakorolt hatás már az injektálás megkezdésétől kezdve

megfigyelhető volt, szignifikáns különbséget 30 perccel az Aβ injektálást követően mutatott

(15/B. ábra). A kísérlet során végigkövettük a különböző oldatok hatását az excitatórikus

posztszinaptikus potenciál meredekségére (pEPSP), változást azonban nem tapasztaltunk

egyik aggregátum esetében sem (15/C, D).

67

15. ábra Altatott (A, C) illetve szabadon mozgó (B, D) kísérletek populációs tüzelés amplitúdójának és fEPSP

meredekségének változása (Orbán és mtsai., 2010).

Eredményeink feltárták, hogy a különböző aggregáltsági fokú amyloid oligomer

oldatok ellentétes hatással bírnak a sejtek excitabilitására in vivo. Az Aβ-infúziós modellek

előnye tehát, hogy míg a transzgenikus modellekben az APP overexpresszió hatására nem

csak az Aβ1–40 és/vagy Aβ1–42 akkumulálódik, hanem a többi APP fragmens is (melyek

neuroprotektív vagy neurotoxikus hatással rendelkezhetnek), addig az infúziós modellekkel a

különböző formájú Aβ kezelések kizárólagos hatását hasonlíthatjuk össze (ld. fentebb).

Másrészről viszont nem modellezik az öregedéssel együtt járó AK progressziót, továbbá az

Aβ kezelés hatására jóval magasabb Aβ-koncentráció alakul ki lokálisan az agyban, mint az

AK-os betegek agyában vagy a gerincvelői folyadékukban (Vickers és mtsai., 2000). Az

invazív Aβ-infúzió hatására ráadásul elkerülhetetlen az agyszövet sérülése, ami gyulladást

indukál, így részletes molekuláris vizsgálatokra kevésbé alkalmas. A további, dolgozatom fő

témáját alkotó proteomikai Aβ-hatás vizsgálatainknál ebből kifolyólag non-invazív,

transzgenikus egérmodellt alkalmaztunk (ld. 4.3. fejezet).

68

4.2. A szinaptikus én nem szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának

eredményei

4.2.1. A mitokondrium preparátumok tisztaságának igazolása elektronmikroszkópiával

Az elektronmikroszkópos képek alapján az sMito és nsMito preparátumok is tiszta

mitokondrium frakciókat tartalmaznak. A mitokondriumok morfológiája mindkét esetben

megőrződött, a mitokondriális membránok, illetve a mátrix jól láthatóak (16. ábra). A

mitokondriumok összterületének aránya az összes struktúra területének arányában 92,9 ±

0,6% volt az sMito és 97,7 ± 0,25% (n=25-25 kép) az nsMito preparátumokban.

16. ábra A mitokondrium preparátumok validálása elektronmikroszkópiával. Reprezentatív

elektronmikroszkópos képek a nem-szinaptikus (A1-3) és szinaptikus (B1-3) mitokondrium mintákról. Jól

látható, hogy a preparátumok szinte teljes egészét mitokondriumok alkotják. A mitokondriumok százaléka

(mitokondriumok összterülete / összes struktúra területe (mitokondrium + azonosíthatatlan törmelékek,

szennyeződések)) a szinaptikus (C) és nem-szinaptikus (D) mintákban. (Mércék = 1 µm az A1 és B1, 0.5 µm az

A2 és B2, továbbá 0,25 µm az A3 és B3) (Völgyi és mtsai., 2015b).

69

4.2.2. A mitokondrium preparátumok tisztaságának igazolása FACS technikával

A Balb/c sMito és nsMito mintákból (n=6-6) 50.000 eseményt analizáltunk FACS

Diva és Flow Jo 7.6.1. szoftverek segítségével. A tisztaság ellenőrzésére minden sMito és

nsMito preparátumot NAO és DIIC1 festékekkel jelöltünk. Minden preparátum több mint

95%-ban NAO-ra és több mint 92%-ban DiIC1-re pozitív volt a jelöletlen kontrollhoz képest

(17. ábra).

17. ábra A szinaptikus (A, B1, B2, D and F) és nem-szinaptikus (C and E) mitokondrium minták reprezentatív

FACS analízise (NAO: a mitokondrium belső membránjában felhalmozódó kardiolipint jelölő festék, DiIC1:

mitokondriális membrán potenciál szenzitív festék). Az FSC (forward scatter) / SSC (side scatter) dot plot ábra

(A) a mitokondrium partikulumok kapuzási stratégiáit jelentik, ami minden minta esetében ugyanaz volt.

Jelöletlen (B1) és NAO és DiIC1 festékekkel kétszeresen jelölt (B2) minták reprezentatív dot plot ábrája. A

kvadráns analízis a minta homogenitását/tisztaságát mutatja. A NAO pozitív (C, D), illetve DiIC1 pozitív (E, F)

partikulumok leválogatása szintén szelektív és homogén festődést mutat mind a szinaptikus (D, F), mind a nem-

szinaptikus mitokondriumok esetében (C, E) (Völgyi és mtsai., 2015b).

70

4.2.3. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közötti fehérjekülönbségek

(folytatódik)

Spotszám Génnév Azonosító Fehérje név (Uniprot) AR p érték lokalizáció (Uniprot)

citromsav-ciklus

115 Aco2 Q99KI0 Aconitate hydratase, mitochondrial -1,57 5,78E-03 mitokondrium, sejtmag



251 Dlat Q91VD9 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component

of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial

-1,64 7,12E-07 mitokondriális mátrix

254 Dlat Q99MR8 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component



257 Dlat Q8BMS1 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component



258 Dlat Q64521 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component



428 Pdhx P38647 Pyruvate dehydrogenase protein X component,

mitochondrial


433 Pdhx Q64521 Pyruvate dehydrogenase protein X component,

mitochondrial


478 Dlst P38647 Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase

component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex,

-1,71 3,04E-06 mitokondrium

568 Pdha1 P38647 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha,

somatic form, mitochondrial

2,24 5,00E-04 mitokondriális mátrix

729 Idh3a P38647 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha,

mitochondrial


734 Idh3a Q64521 Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha,

mitochondrial



mitochondrial



mitochondrial


782 Mdh1 P14152 Malate dehydrogenase, cytoplasmic -1,29 2,04E-04 mitokondrium

802 Mdh1 P14152 Malate dehydrogenase, cytoplasmic -1,56 4,80E-03 mitokondrium

840 Pdhb Q64521 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta,

mitochondrial


841 Pdhb P63017 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta,

mitochondrial


1691 Sucla2 P38647 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta,

mitochondrial

2,70 1,01E-07 mitokondrium

1692 Sucla2 P38647 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta,

mitochondrial


1693 Sucla2 Q8BMF4 Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta,

mitochondrial


protein transzport és feltekeredés

178 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial -1,59 2,62E-03 mitokondrium

183 Hspa9 P38647 Stress-70 protein, mitochondrial -1,42 1,27E-04 mitokondrium, sejtmag




206 Hspa8 Q9CZ13 Heat shock cognate 71 kDa protein 2,64 1,13E-06 citoplazma

210 Hspa8 Q9CZ13 Heat shock cognate 71 kDa protein 2,64 6,57E-07 citoplazma

213 Hspa8 Q9D0K2 Heat shock cognate 71 kDa protein 2,41 3,79E-08 citoplazma

216 Hspa8 P30275 Heat shock cognate 71 kDa protein 2,60 8,83E-09 citoplazma

331 Hspd1 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial -1,38 3,04E-03 mitokondriális mátrix





382 Cct2 P80314 T-complex protein 1 subunit beta -1,45 8,94E-03 citoplazma

387 Cct2 P80314 T-complex protein 1 subunit beta -1,46 2,06E-05 citoplazma

71

(folytatódik)


elektrontranszport-lánc

127 Ndufs1 Q8BMF4 NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit,

mitochondrial

-1,54 7,81E-05 mitokondriális belső

membrán368 Dld O08749 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial -2,11 6,75E-05 mitochondrion matrix

507 Uqcrc1 P63260 Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial -1,20 1,34E-02 mitokondriális belső

membrán519 Uqcrc1 Q9CZ13 Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial -1,26 5,39E-03 mitokondriális belső

membrán525 Uqcrc1 Q9CZ13 Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial 1,37 1,06E-02 mitokondriális belső

membrán1347 Ndufs8 P63038 NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8,

mitochondrial


1580 Cyb5a Q9D0K2 Cytochrome b5 1,50 1,37E-03 mitokondrium, ER,

membrán

1582 Fdx1l Q99MN9 Adrenodoxin-like protein, mitochondrial 1,98 8,10E-08 mitokondrium

1663 Cox5a P80314 Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial -1,36 1,76E-04 mitokondriális belső

membránATP metabolizmus

374 Pccb P62874 Propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial -2,13 6,83E-06 mitokondriális mátrix

494 Atp5b P56480 ATP synthase subunit beta, mitochondrial 2,82 7,10E-05 mitokondriális belső

membrán495 Atp5b P56480 ATP synthase subunit beta, mitochondrial 2,58 3,86E-07 mitokondriális belső

membrán515 Atp5a1 Q03265 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial 2,16 1,82E-05 mitokondriális belső

membrán1354 Ak1 Q9R0Y5 Adenylate kinase isoenzyme 1 1,64 2,96E-05 citoplazma

1386 Atp5h Q9DCX2 ATP synthase subunit d, mitochondrial -1,32 4,10E-04 mitokondriális belső

membrán1694 Ckb Q9WUK2 Creatine kinase B-type -1,61 2,87E-05 mitokondrium, citoplazma

553 Ckmt1 P18760 Creatine kinase U-type, mitochondrial -1,34 2,40E-03 mitokondriális belső

membrán560 Ckmt1 P08228 Creatine kinase U-type, mitochondrial -1,56 4,56E-04 mitokondriális belső

membránoxidatív stressz és apoptózis

1370 Sod2 P09671 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial -1,849 5,23E-07 mitokondrium

1372 Sod2 P09671 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial -1,4796 0,003439 mitokondrium

1377 Sod2 P09671 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial -1,66 0,000102 mitokondrium

1484 Prdx5 Q9R063 Peroxiredoxin-5, mitochondrial 3,08 2,57E-09 mitokondrium,

citoplazma, peroxiszóma1522 Sod1 P08228 Superoxide dismutase [Cu-Zn] 1,75 1,56E-08 citoplazma, sejtmag

1686 C1qbp Complement component 1 Q subcomponent-binding

protein, mitochondrial

3,70 3,95E-10 mitokondrium,

citoplazma, membrán, 1700 Htra2 Q9JIY5 Serine protease HTRA2, mitochondrial -1,85 5,01E-03 mitokondrium

citoszkeleton organizáció és sejtmozgás

843 Capza2 Q9Z2I9 F-actin-capping protein subunit alpha-2 -1,26 5,39E-03 citoplazma, membrán

1494 Cfl1 Q04447 Cofilin-1 2,90 8,63E-09 citoplazma

1690 Dpysl2 O08553 Dihydropyrimidinase-related protein 2 3,12 1,70E-07 mitokondrium, citoplazma

276 Dpysl2 Q9D6R2 Dihydropyrimidinase-related protein 2 3,15 1,01E-07 mitokondrium, citoplazma

280 Dpysl2 P14152 Dihydropyrimidinase-related protein 2 3,10 1,00E-08 mitokondrium, citoplazma

927 Mpst Q9JIY5 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase 1,60 3,47E-06 mitokondrium,

citoplazma, szinapszis590 Actg1 P63260 Actin, cytoplasmic 2 1,39 4,78E-02 citoplazma

609 Actg1 P63260 Actin, cytoplasmic 2 3,02 5,02E-07 citoplazma

iontranszport

393 Atp6v1b2Q60930 V-type proton ATPase subunit B, brain isoform 2,07 3,20E-06 membrán

402 Atp6v1b2Q60932 V-type proton ATPase subunit B, brain isoform 2,83 2,03E-08 membrán

910 Vdac2 Q9WUK2 Voltage-dependent anion-selective channel protein 2 2,19 6,03E-05 mitokondiális külső

membrán929 Vdac2 Q60930 Voltage-dependent anion-selective channel protein 2 -1,58 8,60E-06 mitokondiális külső

membrán941 Vdac1 Q60932 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 -1,59 1,31E-05 mitokondiális külső

membrán, membrán967 Vdac2 Q60930 Voltage-dependent anion-selective channel protein 2 -1,51 8,42E-04 mitokondiális külső

membrán

72

3. táblázat A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közötti fehérje különbségek funkcionális

osztályozása. A piros (növekvő) és kék (csökkenő) színgradiensek a szinaptikus mitokondriumban lokalizálódó

fehérjék arányát érzékeltetik a nem-szinaptikus mitokondriumhoz viszonyítva. (AR: „average ratio”, a fehérjék

változásának mértéke) (Völgyi és mtsai., 2015b).


glükóz metabolizmus

168 Gpd2 Q64521 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, mitochondrial -1,39 1,71E-02 mitokondriális belső

membrán


membrán


membrán

792 Gapdh P16858 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase -1,77 3,25E-03 citoplazma, sejtmag

alkohol metabolizmus

418 Aldh2 P19157 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial -1,97 2,03E-04 mitokondriális mátrix

419 Aldh2 Q8K3J1 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial -1,50 9,49E-05 mitokondriális mátrix

430 Aldh2 Q9R0Y5 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial -1,75 2,49E-06 mitokondriális mátrix

szinaptikus transzmisszió

1543 Snca O55042 Alpha-synuclein 2,90 2,88E-05 citoplazma, mitokondrium



aminosav metabolizmus

162 Mccc1 O08749 Methylcrotonoyl-CoA carboxylase subunit alpha,

mitochondrial

-1,53 1,32E-02 mitokondriális belső

membrán és mátrix

384 Aldh6a1 Q9D0K2 Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase

[acylating], mitochondrial


lipid metabolizmus

166 Hadha P80314 Trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial -1,67 2,18E-02 mitokondriális mátrix

170 Hadha Q8BMS1 Trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial -1,77 3,98E-03 mitokondriális mátrix

ketontest metabolizmus

374 Oxct1 P14152 Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1,

mitochondrial


384 Oxct1 P16125 Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1,

mitochondrial


laktát metabolizmus

803 Ldhb Q9CPW2 L-lactate dehydrogenase B chain 1,75 9,74E-05 mitokondrium, citoplazma

806 Ldhb P12787 L-lactate dehydrogenase B chain 2,49 1,39E-04 mitokondrium, citoplazma

szignáltranszdukció

829 Gnb1 O08553 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T)

subunit beta-1

-1,36 3,55E-05 -

837 Gnb1 Q9Z2I9 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T)

subunit beta-1

-1,53 1,96E-04 -

mitokondriális morfogenezis

792 Poldip2 P56395 Polymerase delta-interacting protein 2 -1,77 3,25E-03 mitokondrium, sejtmag

protein degradáció

959 Psma1 Q9R1P4 Proteasome subunit alpha type-1 -1,47 7,31E-04 citoplazma, sejtmag

fehérjeszintézis

968 Eif4h Q9WUK2 Eukaryotic translation initiation factor 4H -1,90 1,49E-08 citoplazma

transzkripció szabályozás

1070 Phb P67778 Prohibitin -1,41 3,73E-04 mitokondriális belső

membrán, sejtmag,

membrán

glutation metabolizmus

1332 Gstp1 P19157 Glutathione S-transferase P 1 2,37 6,95E-06 mitokondrium,

citoplazma, sejtmag

nukleotid metabolizmus

1523 Nme1 P15532 Nucleoside diphosphate kinase A 2,49 2,84E-08 citoplazma, sejtmag

73

Összesen ~1200-1300 értékelhető fehérjefoltot detektáltunk minden egyes 2D-DIGE

gélen, melyek közül 103 szignifikánsan különbözött a Balb/c egér agyi sMito és nsMito

mintákban. A 18. ábrán látható reprezentatív 2D-DIGE gélkép a szignifikáns fehérje foltokat

(p<0.05) szemlélteti. Az sMito mintákban 36 fehérjefolt intenzitása szignifikánsan magasabb,

míg 67 fehérjefolté szignifikánsan alacsonyabb volt az nsMito mintákhoz viszonyítva. A

fluoreszcencia intenzitások változásának mértéke („fold change”) -2,28 – 3,70-szeres

tartományba esett (19. ábra), ahol a negatív értékek a csökkent, a pozitívak a növekvő

fehérjemennyiségeket jelzik az sMitokban, az nsMitohoz képest. Harminckét több mint ±2-

szeres fehérjeváltozást kaptunk.

18. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok közti 103 szignifikáns fehérjefolt változás 2D-DIGE

reprezentatív gélképe. Minden azonosított fehérjét jelöltünk. A piros körök az emelkedett, a kék körök a

csökkent fehérjeszinteket jelzik az agyi szinaptikus mitokondriumokban a nem-szinaptikus mitokondriumokhoz

viszonyítva. A fehérjefoltok számát feltűntettük a gélképen, melyek MS-azonosításának eredményei

megtalálhatóak a 3. táblázatban (Völgyi és mtsai., 2015b).

74

Az összes szignifikáns változást mutató fehérjefolt fehérjéit azonosítottuk, mely során

56 különböző fehérjét írtunk le (3. táblázat). Néhány esetben egy fehérjefolt több fehérjét is

tartalmazott, továbbá voltak fehérjék, melyeket több fehérjefoltban is megtaláltunk. Ezek a

gél alapú proteomika jellemző sajátságai, ami különböző fehérjék azonos pozíciójából, illetve

egyazon fehérje különböző poszttranszlációs módosításaiból ered. A fehérjék MS/MS alapú

adatait Scaffold szoftver (Scaffold_3_05_00 verzió, Proteome Software Inc, Portland, OR)

segítségével validáltuk. Az azonosított fehérjéket és peptideket akkor fogadtuk el, ha a találati

valószínűségük több, mint 99.0% volt, továbbá minimum 2 peptidjét azonosítottuk.

A fehérjék mennyiségét a felvett MS/MS spektrumok számával, a szekvencia

lefedettséggel és az egyedi peptidek számával jellemeztük. Amennyiben egy foltban több

fehérjét is azonosítottunk, a legnagyobb mennyiségben jelen levő fehérjét vizsgáltuk tovább a

funkcionális csoportosításban.

4.2.4. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása

Az sMito és nsMito közti fehérjeváltozások funkcionális csoportosítását követően

elmondható, hogy a kapott fehérjék a CK (n=9), fehérje transzport és feltekeredés (n=4), ETL

(n=7), ATP metabolizmus (n=7), oxidatív stressz és apoptózis (n=5), citoszkeleton

organizáció és sejtmotilitás (n=5), iontranszport (n=3), glükóz metabolizmus (n=2), alkohol

metabolizmus (n=1), szinaptikus transzmisszió (n=1), aminosav metabolizmus (n=2), lipid

metabolizmus (n=1), ketontest metabolizmus (n=1), laktát metabolizmus (n=1),

szignáltranszdukció (n=1), mitokondriális morfogenezis (n=1), fehérje degradáció (n=1),

protein szintézis (n=1), transzkripciós regulátorok (n=1), glutation metabolizmus (n=1) és

nukleotid metabolizmus (n=1) folyamatait érintik. A fehérjeváltozások mértéke (19. ábra),

funkcionális csoportosítása (20. ábra) és lokalizációja összefoglalva az 3. táblázatban

látható.

Az sMitoban magasabb, illetve alacsonyabb szintet mutató fehérjéket külön-külön is

csoportosítottuk. Azok a fehérjék, melyek az sMitoban mutattak magasabb szintet, a

szinaptikus transzmisszió, laktát metabolizmus, glutation metabolizmus és nukleotid

metabolizmus folyamatában játszanak szerepet (21. ábra). Ezzel szemben, az sMitoban

alacsonyabb mennyiségben jelenlevő fehérjék a glükóz, alkohol, lipid és ketontest

metabolizmus, foszforiláció, szignál transzdukció, mitokondriális morfogenezis,

fehérjeszintézis és traszkripció folyamataiban játszanak szerepet (22. ábra). A további

funkcionális csoportok mind sMito, mind nsMitora jellemző fehérjéket tartalmazott.

75

A piruvát dehidrogenáz komplex 3 alegysége például alacsonyabb, 1 alegysége

magasabb szintet mutatott az sMitoban. Más, CK-ben részt vevő enzimek (n=5) szintén

alacsonyabb szintet mutattak, kivéve az ATP-képző beta alegységét a szukcinil-koenzim-A

ligáznak (Sucla2), aminek a szintje a szinaptikus mitokondriumokban volt magasabb.

19. ábra Az azonosított szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális fehérjefolt különbségek változásának

mértéke (Völgyi és mtsai., 2015b).

20. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális fehérjekülönbségek funkcionális eloszlása

(Völgyi és mtsai., 2015b).

76

21. ábra A szinaptikus mitokondriumokban fehérjeszint növekedést mutató fehérjék funkcionális eloszlása


22. ábra A szinaptikus mitokondriumokban fehérjeszint csökkenést mutató fehérjék funkcionális eloszlása


77

4.2.5. A szignifikánsan megváltozott fehérjék validálása

A CK jelentős fehérjéi közül a sMito-ban feldúsuló Sucla2 és az nsMito-ban feldúsuló

Idh3a fehérjéket, az oxidatív stresszre adott válaszban jelentős szereppel bíró fehérjék közül

az sMito-ban feldúsuló C1qbp-t és a nsMito-ban feldúsuló Sod2-t választottuk ki további,

Western blottal történő validálásra.

Az Idh3a, Sucla2, C1qbp és Sod2 fehérjék Western blot analízise

A Western blot analízis a 2D-DIGE munka során használt 6 sMito és 6nsMito

mintákból történt (23. ábra). A Sucla2, C1qbp és Sod2 fehérjék egy-egy helyen mutattak

immunreaktivitást, míg az Idh3a fehérje esetében dupla sávban kaptunk jelet. A két

immunreaktív jel hasonlóan változott, valószínűleg az Idh3a fehérje különböző

poszttranszlációs módosulásai, így a denzitometriás kiértékelés során együtt vizsgáltuk őket.

A Sucla2 (3,43 ± 0,52-szeres változás) és a C1qbp (1,52 ± 0,21-szeres változás) szintje

szignifikáns növekedés (p<0,001 a Sucla2 és p<0,01 a C1qbp esetében), míg az Idh3a (0,49 ±

0,10-szeres változás) és Sod2 (0,50 ± 0,05-szoros változás) szignifikáns csökkenést mutattak

az sMito-ban (p < 0,01 az Idh3a és p < 0,001 a Sod2 esetében).

23. ábra A Sucla2, Idh3a, C1qbp és Sod2 fehérjeváltozások Western blot analízissel történő validálása.

Immunpozitív fehérjecsíkok 50, 40, 33 és 25 kDa-nál voltak az említett fehérjék gélképein (A). A 4 fehérje

denzitometriás analízise (B-E). Az Idh3a esetében mindkét csíkot figyelembe vettük az analízis során. A Sucla2

(B) és C1qbp (D) szignifikáns növekedést, míg az Idh3a (C) és Sod2 (E) szignifikáns csökkenést mutatott a

szinaptikus mitokondriumokban, a nem szinaptikus mitokondriumokhoz képest. (***: p < 0,001) (Völgyi és

mtsai., 2015b).

78

A Sucla2 és Idh3a fehérjék szinaptikus lokalizációjának immunhisztokémiai és immun-

elektronmikroszkópiai analízise

Mivel a Sucla2 és Idh3a fehérjéket több különböző fehérjefoltból sikerül kimutatni,

továbbá kizárólag mitokondriális lokalizációval rendelkeznek, ezeket a fehérjéket vizsgáltuk

tovább immunhisztokémiai és immun-elektronmikroszkópiai módszerekkel.

24. ábra A Sucla2 és Idh3a fehérjék lokalizációja a preszinaptikus idegvégződésekben (A, B). A nagy nagyítású

konfokális képek a hippocampus CA1-es piramidális sejtrétegéből készültek. A kettős jelölés szinaptofizin

preszinaptikus marker (piros) és Sucla2 vagy Idh3a (zöld) antitestekkel készült. A Sucla2 és Idh3a

immunreaktivitások jelen vannak a sejttestben (zöld) és a szinaptikus végződésekben (sárga) egyaránt,

eloszlásuk mitokondriális lokalizációt mutat, a szinaptofizin kizárólag az idegsejtvégződéseket jelöli (piros).

Számos preszinaptikus végződés Sucla2-vel vagy Idh3a-val szintén jelölődött, melyek közül néhányat fehér

nyíllal jelöltünk. A beillesztett képek immunogold pozitív (fekete nyilak) szinaptikus mitokondriumokat jelölnek

(a nyílfejek a szinaptikus membránok találkozási régióját mutatják) az elektronmikroszkópos felvételen. Látható,

hogy a dupla pozitív szinaptikus végződések száma a Sucla2 esetében magasabb volt, mint az Idh3a esetében. A

szinaptofizin immunreaktív végződések 78,4%-a mutat kolokalizációt a Sucla2-vel, míg csak 32,9%-a az Idh3a-

val (C), ami szignifikáns különbséget jelent (***: p < 0,001). Mérce = 50 µm (Völgyi és mtsai., 2015b).

A Sucla2 immunreaktivitás az agy teljes területén megfigyelhető volt. A sejttestek,

illetve az idegsejt végződések is immunpozitívak voltak, míg a sejtmagok nem mutattak

immunreaktivitást. A Sucla2 immunreaktivitás a sejttesteken belül elnyújtott,

mitokondriumhoz hasonlító jelet adott. A jelölt sejtek denzitása tipikusan a

szürkeállományban volt magas, továbbá a teljes agy területén az idegsejtek mutattak

immunreaktivitást.

A Sucla2 és szinaptofizin kettős jelölése alapján elmondható, hogy a Sucla2 jelen van

a preszinaptikus végződésekben. A hippocampus CA1 régiójában 78,4% volt a Sucla2 és

szinaptofizin (Syn) dupla-pozitív preszinaptikus régió aránya az összes preszinapszishoz

79

képest (24/A ábra). A Sucla2-pozitív mitokondriumok lokalizációját a preszinaptikus

végződésben elektronmikroszkópiával is megerősítettük (24/A ábra). Az Idh3a jelölési

mintázata hasonló volt a Sucla2 fehérjéhez, azzal a különbséggel, hogy több sejttest és

kevesebb szinaptikus végződés mutatott Idh3a-immunreaktivitást. Habár a hippocampus CA1

régiójában a neuronok sejttestjei hasonló intenzitású immunreaktivitást mutattak Sucla2-re és

Idh3a-ra, a Syn-pozitív végződések 32,9%-a volt Idh3a pozitív (24/B ábra).

Összegezve tehát, a Sucla2-Syn dupla jelölésű preszinaptikus régiók száma

szignifikánsan magasabb volt, mint az Idh3a-Syn immunreaktivitást mutatóké (p<0,001).

A C1qbp fehérje mitokondriális és szinaptikus lokalizációjának immunhisztokémiai

analízise

25. ábra A C1qbp fehérje mitokondriális és szinaptikus lokalizációja a cortexben. A C1qbp immunreaktivitás a

sejttestekben és a nyúlványokban is megfigyelhető (A). A nagyobb nagyítású felvételen látható sejttestekben

(fekete nyíl) a C1qbp jelölés mitokondriumokra jellemző szemcsés eloszlást mutat (B). Ugyanezen a felvételen

szinaptikus végződésekre utaló immunreaktív jelek is megfigyelhetőek (piros nyílvég). Mérce = 100 µm (A), 20

µm (B).

A C1qbp immunreaktivitás jelenléte a corticális sejtek különböző régióiban

megfigyelhető volt. A szinaptikus mitokondriumokban való feldúsulásával összhangban a

fehérje a nyúlványokban és rostvégződésekben is lokalizálódott (25/A ábra). Nagyobb

nagyításon történő mikroszkópos vizsgálattal megfigyelhető volt a C1qbp mitokondriumokra

jellemző szemcsés lokalizációja a sejttestekben, valamint a szinaptikus végződésekre utaló

immunreaktív jelek is láthatóak voltak (25/B ábra).

80

4.3. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt

hatásának eredményei

4.3.1. Az Aβ plakkok eloszlása

Az eredményeink igazolták, hogy a 3 hónapos APP/PS1 egerek agyszövetében még

nincsenek Aβ plakkok (26/E ábra). Az Aβ plakkok megjelenését a 6 hónapos APP/PS1

egerek cerebrális cortexében és hippocampusában detektáltuk (26/F ábra), míg a plakkok

fokozott elterjedése a 9 hónapos állatok agyára volt jellemző (26/G ábra). A B6 kontroll

egerek a kor előrehaladtával egyáltalán nem mutattak Aβ-plakk felhalmozódást (26/A, B, C

ábra). Adataink tehát reprodukálják az irodalomban már közölt, Aβ-plakk kialakulásának

időzítését az APP/PS1 egerekben (Jankowsky és mtsai., 2004). Az Aβ-plakkot nagyobb

nagyításban is vizsgáltuk fény (26/D ábra), illetve elektronmikroszkópos szinten (1/H ábra).

26. ábra A 3, 6, illetve 9 hónapos B6 kontroll (A, B, C) és APP/PS1 transzgenikus egér hippocampus és

corticális agyrégiók (E, F, G) reprezentatív fénymikroszkópos képe. A fehér nyilak a redukált ozmiummal jelölt

amyloid plakkokat jelzik, melyek 6 hónapos korban már megjelennek, 9 hónapos korban pedig nagymértékben

elterjednek az APP/PS1 egerek említett régióiban. Az amyloid plakk nagyobb nagyítású fénymikroszkópos (D),

illetve kis nagyítású elektronmikroszkópos képe (H). Mérce: A-C, E-G – 500 µm, D, H - 20 µm (CA1: cornu

ammonis 1, DG: gyrus dentatus, cc: corpus callosum).

81

4.2.2. A mitokondrium minták oxigén fogyasztásának összehasonlítása

Amikor a mitokondriális légzést glutamát és malát tartalmú médiumban vizsgáljuk, az

elektronok a NADH-ról (nikotinamid adenine dinukleotid hidrid) a komplex I-en (NADH-

koenzim Q reduktáz vagy NADH dehidrogenáz) keresztül lépnek az ETL-ba. Abban az

esetben, ha az energetizáló szubsztrát a szukcinát, az elektronok a szukcinát-dehidrogenázról

érkeznek a komplex I-re és redukálják a koenzim Q-t (ubikinon, CoQ).

A 3, 6, illetve 9 hónapos egér sMito és nsMito oxigén fogyasztás vizsgálata során

nem volt se a glutamát és malát (27/A ábra), se a szukcinát esetében (27/B ábra) szignifikáns

különbség az APP/PS1és B6 egerek között.

Eredményeink alapján elmondható, hogy mind az sMito, mind az nsMito mintánk

metabolikusan aktív, intakt mitokondriumokat tartalmaz, továbbá a mitokondriális légzés nem

sérül az Aβ felhalmozódásával egyik mitokondrium populáció esetében sem.

27. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondrium reprezentatív oxigén fogyasztási regisztrátuma

glutamát és malát (A) vagy szukcinát (B) szubsztrátok esetében. A B6, illetve APP/PS1 állatok mitokondriális

oxigén fogyasztása nem mutatott szignifikáns különbséget (ADP: adenozin difoszfát; CAT: karboxiatraktilozid).

4.2.3. A mitokondrium minták H2O2 termelődésének összehasonlítása

Az izolált sMito és nsMito H2O2 termelését Amplex UltraRed fluoreszcens esszével

detektáltuk glutamát és malát (28/A ábra) vagy szukcinát energetizáló szubsztrátok

hozzáadásával (28/B ábra).

A mitokondrium minták a 3 hónapos APP/PS1 egerekben nem mutattak szignifikáns

változást a H2O2 termelésben (29/A ábra).

A H2O2 szint szignifikánsan megnövekedett a 6 hónapos sMito mintákban, mind a

szukcinát, mind a glutamát és malát szubsztráttal történő energetizálás esetén. A szukcinát

82

szubsztrát alkalmazása esetén közvetlenül a szukcinát kezelés után 122,43 ± 5,97 %, ADP

hozzáadását követően 122,45 ± 5,33 %, rotenone hozzáadását követően 132,81 ± 6,38 %,

FCCP hozzáadását követően 123,43 ± 6,44 % szignifikánsan növekvő értékeket kaptunk a B6

kontroll állatok százalékában. A glutamát és malát tartalmú médium esetében közvetlenül a

glutamát-malát kezelés után 123,73 ± 5,61 %, ADP hozzáadását követően 112,69 ± 3,09 %,

rotenone hozzáadását követően 142,58 ± 6,96 %, FCCP hozzáadását követően 139,06 ± 9,25

% szignifikánsan növekvő értékeket kaptunk a B6 kontroll állatok százalékában (29/B ábra).

A 6 hónapos nsMito mintákban ezzel szemben nem volt szignifikáns változás. A legnagyobb

változás a H2O2 termelésben a 6 hónapos sMito mintákban a komplex I rotenonnal történő

gátlását követően volt tapasztalható.

A 9 hónapos APP/PS1 egerekben a szukcinát kezelés után detektálható volt

szignifikáns növekedés mind az sMito (120,25 ± 6,37 %), mind az nsMito (130.14 ± 6.81 %)

minták esetében (29/C ábra). Ez a növekedés a további kezelések során azonban nem maradt

fenn. Szintén szignifikáns növekedés volt tapasztalható az sMito mintákban a glutamát és

malát szubsztrát tartalmú médiumok esetében közvetlen a rotenone és FCCP kezelések után

(glutamát és malát tartalmú médium esetében rotenon kezelést követően 127,92 ± 7,22 %,

FCCP kezelést követően 154,00 ± 7,95 %), az nsMito mintákban azonban ilyen jellegű

változás nem volt detektálható (29/C ábra).

28. ábra A mitokondriális H2O2 termelés reprezentatív görbéje glutamát és malát (A) vagy szukcinát

szubsztrátok esetében (B). (mit: mitokondrium, rot: rotenon, succ: szukcinát, g/m: glutamát és malát, FCCP:

trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon, cal: kalibráció; a nyilak a különböző kezelések beadási időpontjait jelölik).

83

29. ábra A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok H2O2 termelése 3(a), 6(b) és 9 hónapos APP/PS1

egerekben (c). Az APP/PS1 egerek H2O2 szintjét a kontrollok átlagának százalékában adtuk meg (rot: rotenon,

succ: szukcinát, g/m: glutamát és malát, FCCP: trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon, ADP: adenozin difoszfát).

84

4.2.4. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata az sMito és nsMito proteomjára

30. ábra Reprezentatív 2D-DIGE gélképek a szinaptikus (A) és nem-szinaptikus mitokondriumok

fehérjekészletéről (E), a B6 és APP/PS1 egerek közötti szignifikáns fehérjeváltozások lokalizációinak

feltűntetésével. A fehérjeváltozások mértéke a szinaptikus mitokondriumokban 3 (B), 6 (C) és 9 hónapos

egerekben (D), továbbá a nem-szinaptikus mitokondriumokban 3 (F), 6 (G) és 9 hónapos egerek (H) szintjén. Az

összes meghatározott fehérjét bekarikáztuk. Rózsaszín, türkiz és sárga színek jelzik a 3, 6, illetve 9 hónapos

korcsoportok szignifikáns fehérjeváltozásait.

85

(folytatódik)

Azonosító Génnév Fehérje név (Uniprot) 3nsm 6nsm 9nsm 3sm 6sm 9sm Humán Alzheimer-kóros agy

Citromsav-ciklus (mitokondriális mátrix)

1.17 -1.23 1.24

1.21 -1.13 1.29

P35486 Pdha1Pyruvate dehydrogenase E1 component

subunit alpha somatic form-1.34 1.56 Csökkent PDH aktivitás (1, 2)

Q9D051 PdhbPyruvate dehydrogenase E1 component

subunit beta1.18 1.27 Csökkent PDH aktivitás (1, 2)

-1.12 1.15 1.31 -1.27

-1.31

Q9D2G2 Dlst

Dihydrolipoyllysine-residue

succinyltransferase component of pyruvate

dehydrogenase complex, mitochondrial

-1.25 Csökkent PDH aktivitás (1, 2)

-1.21 1.40 -1.19 1.23

1.39 -1.21 1.31

-1.22 1.36

-1.22 1.41

1.41

Q9D6R2 Idh3a Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha -1.69 -1.19 -1.26 -1.31 1.44 Csökkent ICDH aktivitás (1, 5, 6)

O08749 DldDihydrolipoyl dehydrogenase (KGDHC E1

component)1.33 -1.22

Csökkent KGDHC aktivitás (1,

6, 7)

1.18 -1.18

1.15

-1.26 -1.62 -1.25 -1.29

-1.10

1.22

-1.42 1.11 1.72 -1.25

-1.40 1.20

-1.20

Elektrontranszport-lánc (belső mitokondriális membrán)

-1.29 1.16 1.50 -1.18

1.18 -1.38

Q91VD9 Ndufs1NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa

subunit1.23 1.28

Csökkent Ndufs1 szint a

parietális cortexben (8)

Q8K3J1 Ndufs8NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur

protein 8-1.28 1.33 1.77 Csökkent Komplex I szint (9)

Q7TMF3 Ndufa12NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha

subcomplex subunit 12-1.13 -1.20 Csökkent Komplex I szint (9)

-1.18 1.16 1.11

1.23

1.35

Q9CR68 Uqcrfs1Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske,

mitochondrial-1.14 nincs humán adat

P99028 Uqcrh Cytochrome b-c1 complex subunit 6 1.21 nincs humán adat

P12787 Cox5a Cytochrome c oxidase subunit 5A 1.19Csökkent citokróm c oxidáz

aktivitás (10, 11, 12)

1.15 1.38 -1.14 1.22

1.32 -1.26

-1.21 1.10 -1.17 1.10 1.10 -1.14

-1.17

Q9DCX2 Atp5h ATP synthase subunit d 1.14 -1.16Emelkedett Atp5h szint, ha a

Komplex I gátolt (15)

Q9DB20 Atp5o ATP synthase subunit O -1.17

Csökkent ATP szintáz aktivitás

az I/II-es Braak stádiumokban

(13)

-1.36 -1.16 -1.12 -1.13 -1.18

1.13

Q9DCW4 Etfb Electron transfer flavoprotein subunit beta -1.19 nincs humán adat

Q8K1Z0 Coq9 Ubiquinone biosynthesis protein COQ9 -1.24 nincs humán adat

Succinyl CoA ligase ADP forming subunit beta

ATP synthase subunit alpha

Malate dehydrogenase

Fumarate hydratase

Cytochrome b-c1 complex subunit 1

NADH dehydrogenase [ubiquinone]

flavoprotein 2

nincs humán adat

Sucla2Q05BC6

P97807

Q03265 Atp5a1

P08249 Mdh2

Fh

Q9CZ13 Uqcrc1

Q9D6J6 Ndufv2

P56480 Atp5b ATP synthase subunit beta

P67778 Phb Prohibitin

Q8BMF4 Dlat

Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase

component of pyruvate dehydrogenase

complex

Q99KI0 Aco2 Aconitate hydratase

Pyruvate dehydrogenase protein X componentPdhxQ8BKZ9

Csökkent PDH aktivitás (1, 2)

Csökkent Aco2 aktivitás (3);

Csökkent Aco2 szint a

substantia nigra-ban,

Emelkedett szint a cortexben

(4)

nincs humán adat

Csökkent ATP szintáz aktivitás

az I/II-es Braak stádiumokban

(13); Atp5a1 korrelál az NFK

degenerációval (14)

Csökkent Atp5b mRNA szint a

cortexben (14)

nincs humán adat

Csökkent PDH aktivitás (1, 2)

Emelkedett Mdh2 aktivitás (1, 6)

Csökkent Fh aktivitás a

frontális cortexben (2)

Csökkent Ndufv2 szint a

temporális és occipitális

cortexben (8)

86

(folytatódik)


Oxidatív stressz és apoptózis (mitokondriális mátrix, intermembrán tér, citoplazma)

Q9DCM0 Ethe1 Persulfide dioxygenase ETHE1 -1.38 1.78 -1.13 nincs humán adat

P08228 Sod1 Superoxide dismutase [Cu-Zn] -1.25 1.36Emelkedett plazma Sod1 szint

(13)

1.17 -1.19 -1.11 1.11

1.12

Q61171 Prdx2 Peroxiredoxin-2 1.19 Emelkdett Prdx2 szint (8)

1.10 1.31 1.24 -1.29 1.14

1.17

-1.20 1.38 1.19 -1.18 -1.27

-1.18 -1.10 1.24 -1.20

-1,18

-1.14

Q9JIY5 Htra2 Serine protease HTRA2 -1.41 1.80 -1.42 Emelkedett Htra2 aktivitás (19)

-1.56 1.21 1.34

-1.09 1.52 -1.26

Q60930 Vdac2Voltage-dependent anion-selective channel

protein 21.14

Emelkedett Vdac2 szint a

temporális cortexben (21)

Fehérjetranszport (külső/belső mitokondriális membrán)

1.48

1.39

Q9D880 Timm50Mitochondrial import inner membrane

translocase subunit TIM50-1.34 -1.18

Aβ transzport a TIM23

komplexen keresztül (23)

Mitokondriális fehérjeszintézis és feltekeredés (mitokondriális mátrix)

1.20 1.40 1.25

1.27 1.19

1.18

P38647 Hspa9 Stress-70 protein 1.23 1.39 Csökkent mRNS szint (24)

Q8BFR5 Tufm Elongation factor Tu -1.18 1.25HNE-módosított Tufm MCI-s

agyban (25)

Q3UGW4 ClppATP-dependent Clp protease proteolytic

subunit -1.19 nincs humán adat

Glikolízis, glükoneogenezis (mitokondriális mátrix)

-1.26

1.20

1.23

P17751 Tpi1 Triosephosphate isomerase -1.22Aβ indukált Tpi nitrotirozinálás

(26)

Nukleotid metabolizmus (mitokondrium)

Q9WUR9 Ak4 Adenylate kinase isoenzyme 4 (mátrix) 1.16 -1.12 Emelkedett Ak szint (27)

P15532 Nme4Nucleoside diphosphate kinase (intermembrán

tér)-1.27 Csökkent Nme4 aktivitás (28)

P30275 Ckmt1Creatine kinase U-type (belső mitokondriális

mátrix)-1.15

Csökkent Ckmt1 a substantia

nigrában és a cortexben (4)

Q8K4Z3 Apoa1bpNAD(P)H-hydrate epimerase

(Apolipoprotein A-I-binding protein)-1.16 nincs humán adat

Ketontest metabolizmus (mitokondriális mátrix)

Q9D0K2 Oxct1Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A

transferase 1-1.30 1.29 Emelkedett Oxct szint (29)

Q8QZT1 Acat1 Acetyl CoA acetyltransferase 1.32 1.17 nincs humán adat

Lipid metabolizmus (mitokondriális mátrix)

-1.30 -1.15 -1.19 -1.14

-1.15

-1.22 1.26

1.35

Aminosav metabolizmus (mitokondriális mátrix)

Q8QZS1 Hibch 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase -1.18 nincs humán adat

Q9CWS0 Ddah1N(G),N(G)-dimethylarginine

dimethylaminohydrolase 1-1.25

Oxidatívan módosult Ddah1

familiális AK-ban (31)

Aβ transzport a TOM

komplexen keresztül (22, 23)

nincs humán adat

Thioredoxin-dependent peroxide reductase

Peroxiredoxin-6Prdx6

P20108 Prdx3

P99029

Glycerol 3 phosphate dehydrogenase (mátrix)Gpd2Q64521

Voltage-dependent anion-selective channel

protein 1Vdac1

Q9CZW5 Tomm70a Mitochondrial import receptor subunit TOM70

Q60932

Prdx5

Sod2 Superoxide dismutase [Mn]P09671

Peroxiredoxin-5

Csökkent Vdac1 szint a

cortexben (20)

Csökkent Prdx3 szint (8, 17)

Emelkedett plazma Sod2 szint

(16)

Emelkedett Prdx6 szint az

asztocitákban (18)

Csökkent Hadha szint (30)

O08709

P63038 Hspd1 60 kDa heat shock protein

nincs humán adat

Enoyl-CoA hydratase

Q8BMS1 Hadha Trifunctional enzyme subunit alpha

Q8BH95 Echs1 nincs humán adat

Emelkedett Hspd1 szint, ha a

Komplex I gátolt (15)

87

4. táblázat Az APP/PS1 és B6 egerek közötti szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriális szignifikáns

fehérjeváltozások funkcionális csoportok szerint (p<0,05). A piros színgradiens a növekvő, a kék a csökkenő

fehérjeszint változást jelenti az APP/PS1 egerekben (a számok a változás mértékét mutatják, AR=average ratio).

A piros szöveg a növekvő, a kék a csökkenő fehérjeszinteket jelzi Alzheimer-kóros betegek agyában vagy

plazmájában (sm: szinaptikus mitokondrium, nsm: nem-szinaptikus mitokondrium, 3, 6, 9: az állatok kora

hónapban). A zöld színnel kiemelt fehérjéket Aβ oligomer kötőpartnerként is ismerjük. A sárga színnel kiemelt

fehérjék a legnagyobb mennyiségi változást mutató eredmények.

A táblázatban szereplő referenciák: 1-(Bubber és mtsai., 2005), 2-(Sorbi és mtsai., 1983), 3-(Raukas és mtsai.,

2012), 4-(Zahid és mtsai., 2014), 5-(Shiozaki és mtsai., 2004), 6-(Perry és mtsai., 1980), 7-(Gibson és mtsai.,

1998), 8-(Kim és mtsai., 2001), 9-(George és mtsai., 2010), 10-(Maurer és mtsai., 2000), 11-(Mancuso és mtsai.,

2003), 12-(Parker és mtsai., 1994), 13-(Terni és mtsai., 2010), 14-(Chandrasekaran és mtsai., 1997), 15-(Burte és

mtsai., 2011), 16-(Doecke és mtsai., 2012), 17-(Krapfenbauer és mtsai., 2003), 18-(Power és mtsai., 2008), 19-

(Westerlund és mtsai., 2011), 20-(Melanson és mtsai., 2006), 21-(Yoo és mtsai., 2001), 22-(Pinho és mtsai.,

2014), 23-(Hansson Petersen és mtsai., 2008), 24-(Silva és mtsai., 2014), 25-(Reed és mtsai., 2008), 26-(Guix és

mtsai., 2009), 27-(Park és mtsai., 2012), 28-(Kim és mtsai., 2002), 29-(Schonberger és mtsai., 2001), 30-(Choi

és mtsai., 2014), 31-(Butterfield és mtsai., 2006), 32-(Singh és mtsai., 2014), 33-(Hamilton, 2000), 34-(Marui és

mtsai., 2000), 35-(Larson és mtsai., 2012), 36-(Maki és mtsai., 2002).


Laktát metabolizmus (mitokondrium, citoplazma)

P16125 Ldhb L-lactate dehydrogenase B chain -1.42

Csökkent Ldhb szint a

cortexben és a

hippocampusban (4)

Glutation metabolizmus (mitokondrium, citoplazma)

P19157 Gstp1 Glutathione S-transferase P 1 -1.49

Gstp1 gén polimorfizmus

befolyásolja az AK

kialakulásának valószínűségét

(32)

Szinaptikus transzmisszió (mitokondrium, szinapszis)

O55042 Snca Alpha-synuclein -1.24

Emelkedett Snca szint az

amygdalában, a limbikus

területeken és a gyrus

temporalis inferiorban (33, 34,

35)

Szignáltranszdukció (mitokondrium, szinapszis)

O55042 Pebp1 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 -2.29 -1.15Csökkent Pebp mRNA szint a

hippocampusban (36)

Egyéb (mitokondrium, citoplazma)

D3Z0L4 Chchd3Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-

containing protein 3-1.17 nincs humán adat

Q9D172 D10Jhu81e ES1 protein homolog -2.04 1.47 -1.40 nincs humán adat

88

Összesen ~1200-1300 fehérjefoltot detektáltunk minden egyes 2D-DIGE gélen (full

stain jelölés) mind az sMito, mind az nsMito minták esetében a 3, 6 illetve 9 hónapos

APP/PS1 és B6 állatok összehasonlításában (6x12 gél). Összesen 43 különböző nsMito

fehérje (3 hónapos nsMito: 21; 6 hónapos nsMito: 30; 9 hónapos nsMito: 25) és 42 különböző

sMito fehérje (3 hónapos sMito: 24; 6 hónapos sMito: 19; 9 hónapos sMito: 19) mutatott

szignifikáns különbséget az APP/PS1 és B6 egerek között, nagyobb mint 1,1-szeres

fehérjeszint változás értékkel (a különböző csoportok között voltak közös fehérjék). A

reprezentatív 2D-DIGE gélképeken jól láthatóak a szignifikáns intenzitáskülönbséget mutató

sMito (30/A ábra) és nsMito (30/E ábra) fehérjefoltok. A fehérjefoltok intenzitáskülönbségei

a B6 és APP/PS1 egerek között az sMito minták esetében -1,41-től 1,80-szoros értékig (30/B-

D ábra), az nsMito minták esetében -2,29-től 1,52-szeres értékig terjednek (30/F-H ábra). A

szignifikánsan változást (p<0,05, DeCyderTM 2D 7.0 szoftver BVA modulja által kalkulált

Student t-próba) mutató fehérjefoltokban található fehérjéket LC/MS-MS módszerrel

azonosítottuk, melyekben összesen 60 különböző fehérjét detektáltunk (4. táblázat).

89

4.2.5. A fehérjeváltozások funkcionális osztályozása

(ábraaláírás a következő oldalon)

90

31. ábra A mitokondriális lokalizációja a megváltozott szinaptikus (a) és nem-szinaptikus (b) mitokondriális

fehérjéknek 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 egerekben. A zöld, citrom és narancssárga hátterek az egerek 3, 6

illetve 9 hónapos korcsoportjait jelzi (Glc: glükóz, Lac: laktát).

Az ábrán használt rövidítések (Uniprot adatbázis alapján):

Protein transzport - TOM: translocase of the outer membrane, Tim23: translocase of the inner membrane

subunit 23, MIA: mitochondrial intermembrane space assembly, SAM: sorting and assembly machinery, Tim22:

translocase of the inner membrane subunit 22; Protein szintézis és feltekeredés - Hsp70: 70 kDa heat shock

protein, Hsp60: 60 kDa heat shock protein, EFTu: Elongation factor Tu; Nukleotid metabolizmus - AK4:

adenylate kinase 4, NDK: nucleoside diphosphate kinase, U-MtCK: ubiquitous mitochondrial creatine kinase

Elektron transzport lánc - I: Complex I, II: Complex II, III: Complex III, Cytc: cytochrome complex, IV:

Complex IV, V: Complex V; Trikarbonsav ciklus - CS: citrate synthase, ACO: aconitase, ICDH: isocitrate

dehydrogenase, aKG: alpha-ketoglutarate, aKGDH: alpha-ketoglutarate dehydrogenase, Succ-CoA: Succinyl-

CoA, AcAc: acetoacetate, AcAc-CoA: acetoacetyl-CoA, SCOT: Succinyl-CoA:3-ketoacid CoA transferase,

Succ: succinate, FH: fumarate hydratese, MDH: Malate dehydrogenase, OAA: Oxaloacetic acid; Ketontest

metabolizmus - ACAT: acetyl-CoA acetyltransferase; Zsírsav metabolizmus - ACADH: Acyl-CoA

dehydrogenase, ECAH: enoyl-CoA hydratase, HADH: hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, KCAT: 3-

ketoacyl-CoA transferase; Apoptózis - Htra2: Serine protease HTRA2, Smac: second mitochondria-derived

activator of caspases, Oxidatív stressz - MnSOD: manganese superoxide dismutase, PRX3: peroxiredoxin 3,

PRX5: peroxiredoxin 5, ETHE1: Persulfide dioxygenase ETHE1; Ion transport - ANT: adenine nucleotide

translocase.

32. ábra Az APP/PS1 és B6 egerek közötti fehérjekülönbségek funkcionális eloszlása. (A funkcionális

csoportosítás során a 3, 6 és 9 hónapos korban megváltozott fehérjék összességét használtuk fel).

91

Az APP/PS1 és B6 egerek közti fehérjeváltozások funkcionális csoportosítását

követően elmondható, hogy a kapott fehérjék a CK (n=11), ETL (n=15), oxidatív stressz és

apoptózis (n=10), protein transzport (n=2), mitokondriális protein szintézis és feltekeredés

(n=4), glikolízis és glükoneogenezis (n=2), nukleotid metabolizmus (n=4), ketontest

metabolizmus (n=2), lipid metabolizmus (n=2), aminosav metabolizmus (n=2), laktát

metabolizmus (n=1), glutation metabolizmus (n=1), szinaptikus transzmisszió (n=1), szignál

transzdukció (n=1) és más, ismeretlen (n=2) folyamatokban vesznek részt (4. táblázat). A

fehérjeváltozások funkcionális eloszlását a 32. ábra szemlélteti.

A szignifikáns változást mutató szinaptikus (31/A ábra) és nem-szinaptikus (31/B

ábra) fehérjéket intramitokondriális lokalizációjuk és a mitokondriális biokémiai

folyamatokban való részvételük alapján is ábrázoltuk mindhárom vizsgált korcsoportban. Az

ábrán zöld színnel a 3, citromsárgával a 6, narancssárgával a 9 hónapos korcsoportban kapott

fehérjeváltozásokat jelöltük.

Az ETC fehérjéi változtak meg a legnagyobb mennyiségben. Az ETC fehérjék közül a

komplex I NADH dehidrogezáz [ubikinon] flavoprotein 2 (Ndufv2) (1,50-szeres) és NADH

dehidrogenáz [ubikinon] vas-kén protein 8 (Ndufs8) (1,77-szeres) fehérjék mutatták a

legnagyobb mértékű változást 6 hónapos sMito mintákban (4. táblázat). Összességében az

ETC fehérjéi növekvő és csökkenő fehérjeváltozást is mutattak az APP/PS1 álltok különböző

korcsoportjaiban.

A TCA fehérjeváltozásai nagy része csökkenő fehérjeszintet mutattak az APP/PS1

egerek 3 hónapos korcsoportjában, mind az sMito (31/A ábra), mind az nsMito (31/B ábra)

szintjén. Érdekes módon, 6 hónapos korban a fehérjeváltozások nagy része ellenkező irányú,

növekvő fehérjeszint változást mutatott, ami egy kompenzatórikus mechanizmus eredménye

lehet. A késői, 9 hónapos korosztályban a TCA fehérjék közel egyforma mértékben mutattak

csökkenő és növekvő változást. A változó fehérjék közül a piruvát dehidrogenáz E1

komponens alfa alegység – szomatikus forma (Pdha1) (1,56-szoros) és malát dehidrogenáz

(Mdh2) (1,72-szeres) mutatták a legnagyobb változásokat. Mindkét fehérje szintje

megnövekedett 6 hónapos korban az sMito mintában (31. ábra).

A Htra2 és Ethe1 fehérjék mutatták a legnagyobb változásokat az oxidatív stressz és

apoptózis folyamatában. Ezek a fehérjék hasonló dinamikával (↓↑↓ fehérjeszinttel) változtak

az Aβ akkumuláció előrehaladásával a szinaptikus mitokondriumokban. A 3 hónapos

csökkenő, illetve 6 hónapos korban való fehérjeszint növekedésüket WB technikával is

validáltuk (34. ábra).

92

4.2.7. Az APP/PS1 és B6 egerek közötti mitokondriális fehérjeváltozások

bioinformatikai analízise

(ábraaláírás a következő oldalon)

93

33. ábra A mitokondriális fehérjeváltozások közös regulátor (a) és célpont analízise (b). A kék élek a közös

regulátorok/célpontok és az általunk leírt mitokondriális fehérjeváltozások közti kapcsolatokat jelzik. Sárgával a

mitokondriális fehérjéket jelöltük, melyek szignifikánsan megváltoztak az APP/PS1 – B6 egerek

összehasonlításában (a fehérjék teljes neve a 4. táblázatban található).

Az ábrán használt rövidítések (Uniprot adatbázis alapján):

NFE2L2: nuclear factor erythroid 2-related factor 2, IL1B: interleukin-1 beta, MAPK1: mitogen-activated

protein kinase 1, TNF: tumor necrosis factor, AKT1: RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, APP: amyloid

beta A4 protein, AGT: angiotensinogen, TGFB1: transforming growth factor beta-1, MYC: myc proto-oncogene

protein, INS: insulin, PPARGC1A: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, SP1:

transcription factor Sp1, TP53: cellular tumor antigen p53, HSPA1A: heat shock 70 kDa protein 1A/1B,

PPARA: peroxisome proliferator-activated receptor alpha, TXN: thioredoxin, MAPK8: mitogen-activated

protein kinase 8, CASP9: caspase-9, CYCS: cytochrome-c, MAPK14: mitogen-activated protein kinase 14,

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, CASP3: caspase-3, BCL2: apoptosis regulator Bcl-2.

Összesen 17 közös regulátor fehérjét találtunk az analízis során. Az Uniprot és Gene

Ontology adatbázisok alapján a közös regulátorok jelentős citokinek (n=3), protein kinázok

(n=3), transzkripciós faktorok (n=3), aktivátorok (n=3), hormonok (n=2), inhibitorok (n=2) és

chaperon / hősokk fehérje (n=1). A szabályozó fehérjék közül a legtöbb kapcsolattal az Sp1

transzkripciós factor (Sp1), az inzulin (Ins), angiotenzinogén (Agt) és tumor nekrózis faktor

alfa (Tnf) rendelkeztek, ami sorban 9, 10, 10 és 14 reguláló kapcsolatot jelent az APP/PS1

állatokban megváltozott mitokondriális fehérjékkel (33/A ábra).

A közös célpont analízis során 10 különböző célpont célpont fehérjét találtunk. Az

Uniprot és Gene Ontology adatbázisok alapján a közös célpont fehérjék protein kinázok

(n=3), kaszpázok (n=2), anti-apoptotikus fehérjék (n=2), citokin (n=1), oxidoreduktáz (n=1)

és elektron transzporter (n=1) (33/B ábra). A célpont fehérjék közül a legmagasabb számú

kapcsolattal a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh), az apoptózis regulator Bcl-2

(oxidoreduktáz Bcl-2) és az anti-apoptotikus fehérje Cycs (citokróm c) elektron transzporter

voltak, ami sorban 9, 10, illetve 11 kapcsolatot jelent.

94

4.2.8. A Htra2 és Ethe1 fehérjeváltozások validálása Western blottal

A WB analízisekhez a 3, 6 és 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek szinaptikus

mitokondriális mintáit használtuk fel, melyek megegyeztek a 2D-DIGE munkák során

vizsgált mintákkal (n=6/csoport). Az Ethe1 fehérje szintje a 3 (0,74 ± 0,08-szoros változás,

p<0,001) és 9 hónapos korban (0,68 ± 0,05-szörös változás, p<0,001) szignifikáns csökkenést,

míg 6 hónapos korban (1,51 ± 0,16-szoros változás, p<0,001) szignifikáns növekedést

mutatott az APP/PS1 állatok szinaptikus mitokondriumában. Hasonló dinamikát mutatva a

Htra2 fehérje szintje a 3 (0,68 ± 0,08-szoros változás, p<0,01) és 9 hónapos korban (0,70 ±

0,06-szoros változás, p<0,001) szignifikáns csökkenést, míg 6 hónapos korban (1,28 ± 0,07-

szeres változás, p<0,001) szignifikáns növekedést mutatott az APP/PS1 állatok szinaptikus

mitokondriumában. A kapott fehérjeváltozások tehát megerősítették a 2D-DIGE analízis

eredményeit (34. ábra).

34. ábra Az Ethe1 és Htra2 fehérjék szinaptikus mitokondriális változásának Western blot analízise 3, 6, illetve

9 hónapos APP/PS1 egerekben. Az oszlopdiagrammok az Ethe1 és Htra2 fehérjék denzitometriás analízisének

eredményeit mutatják (n=6-6). Az Ethe1 és Htra2 fehérjék szintje szignifikáns csökkenést mutatott a 3 és 9, míg

szignifikáns növekedést a 6 hónapos szinaptikus mitokondriumokban APP/PS1 egerekben. A diagramok alatt az

immunpozitív jelek reprezentatív gélképe látható (Student’s t-teszt,**: p < 0,01, ***: p < 0,001).

95

5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

5.1. A szinaptikus mitokondriumok kitüntetett szerepének molekuláris hátterének

vizsgálata - a szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai

összehasonlítása

Az sMito és nsMito közötti számos fehérjeszint különbség alapján elmondhatjuk, hogy

a két mitokondrium populácó molekuláris összetétele különbözik. A következőkben elsőként

az „unbiased” megközelítésű proteomikai vizsgálat sajátságai, majd a szinaptikus

mitokondriumok sajátos proteomjának és lehetséges funkcionális specialitásainak legfőbb

jellemzői kerülnek megvitatásra.

Módszertani megvitatás

Az sMito proteomikai vizsgálat kulcsa az sMito preparátum nagyfokú tisztasága.

Számos különböző gradiens és differenciál centrifugálási protokoll létezik, amivel a

mitokondrium frakciót lehet feldúsítani az agyszövetből (ilyenek a szaharóz, Ficoll, Percoll

denzitás gradiens centrifugálások). Szintén többféle olyan módszer is elérhető, amivel a

szinaptoszómákat fel lehet tárni a szinaptikus mitokondriumok kinyerése céljából (nitrogén-

bomba, ozmotikus sokk, digitoninos kezelés) (Brown és mtsai., 2004; Brown és mtsai., 2006;

Kristian, 2010). Az említett módszerek azonban rendkívül heterogén mitokondrium frakciót

eredményeznek (Sims és Anderson, 2008).

Munkák során kidolgoztunk egy módosított Percoll gradiens centrifugálási eljárást

amivel egyazon agymintából sMito és nsMito frakciók állíthatók elő nagyfokú tisztasággal

(Dunkley és mtsai., 1986; Davey és mtsai., 1997; Gillardon és mtsai., 2007). A minták

tisztaságát elektronmikroszkóppal és FACS-szal is igazoltuk, melyek az elérhető módszerek

közül a legprecízebb és legmegbízhatóbb validálást teszik lehetővé.

Az elektronmikroszkópos eredményeink alapján elmondható, hogy az sMito

morfológiája megegyezett az nsMito-éval, tehát a szinaptoszóma feltárása közben intakt

maradt. A FACS eljárás során több mint 92%-ban mitokondriumra specifikus NAO és

membránpotenciál szenzitív DiIC1 dupla pozitív partikulumokat mutattunk ki mindkét

frakcióból. A preparálási eljárásunk tehát nemcsak magas tisztaságú, hanem metabolikusan

aktív mitokondrium frakciókat eredményezett, hiszen a membránpotenciál szenzitív festék

csak az intakt, működő organellumok esetében ad jelet. Ez a proteomikai munkákhoz

elengedhetetlen szempont, hiszen a sérült mitokondriumok esetében a megnövekedett

proteolitikus aktivitás okozhat fehérjekülönbségeket.

96

A mitokondrium frakciók tisztasága alapján alkalmasnak véltük az sMito és nsMito

mintákat egy „unbiased” proteomikai munka elvégzéséhez. Ezt a megállapításunk tovább

erősítette, hogy az azonosított fehérjéink jelentős része az Uniprot és GeneOntology

adatbázisok szerint mitokondriális lokalizációval rendelkezik.

Az eredmények értelmezésénél elengedhetetlen megjegyezni, hogy a minták

tisztaságának ellenére heterogén összetételű mitokondrium populációkat hasonlítottunk

össze. Az sMito preparátum mitokondriumai különböző típusú idegsejtek szinaptikus

régióiból származnak (pl. glutamáterg és GABAerg szinapszis), melyek különböző

molekuláris sajátságokkal rendelkezhetnek (Mckenna és mtsai., 2000). A szinaptoszóma

preparátum továbbá a szinaptikus régióhoz szorosan kapcsolódó gliavégződéseket is

tartalmazhatja, aminek következtében az sMito preparátumban előfordulhatnak gliális

mitokondriumok is. Az nsMito preparátum szintén nem csak az idegsejtek, hanem a

gliasejtek szómájából kinyert mitokondriumokat is tartalmazza. A mintáknak ez a fajta

heterogenitása elfedhet bizonyos fehérjeváltozásokat, azonban az ennek ellenére detektált

fehérjemennyiségi különbségek mindenképpen a sMito-k sajátságainak tekinthetőek.

A fehérjeváltozások validálására a jelentős változást mutató Sucla2 és Idh3a

fehérjéket két független módszerrel is megvizsgáltuk. Mindkét fehérje a CK-be tartozó

enzim, melyeket több különböző fehérjefoltból is azonosítottunk a proteomikai munka során,

továbbá minden egyes módosulatuk azonos irányú fehérjeszint változást mutatott. A Sucla2

fehérje nagyobb mennyiségben, míg az Idh3a fehérje alacsonyabb mennyiségben volt jelen az

sMito-ban a nsMito-hoz képest. Ezen fehérjék változását Western blot vizsgálatok

denzitometriás analízise során is megerősítettük, ahol hasonló irányú és mértékű változást

kaptunk. Immunhisztokémiai vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a Sucla2 és Idh3a

immunjelölések valóban csak mitokondriális lokalizációt mutatnak, továbbá a hippocampus

CA1 régiójának konfokális mikroszkópos analízisével igazoltuk, hogy a Sucla2

immunreaktív preszinaptikus végződések száma szignifikánsan magasabb, mint az Idh3a

pozitívaké. A sejttestben detektált immunreaktivitása az antitesteknek nem különbözött.

Habár a látszólagos immunreaktivitást nehezen lehet korreláltatni a fehérjemennyiségi

értékekkel, adataink szerint a CA1 régió preszinaptikus végződéseiben a Sucla2 mennyisége

magasabb, mint az Idh3a fehérje szintje, ami erősíti a proteomikai és Western blot analízissel

kapott eredményeinket.

97

A megváltozott mennyiségű szinaptikus mitokondriális fehérjék és lehetséges funkciói

Az sMito-k lokális ATP termelése kritikus fontosságú a szinaptikus régió egyenlőtlen

ioneloszlásának biztosításában, mivel az ehhez szükséges aktív ionpumpák ATP-áz

aktivitással rendelkeznek. A kémiai szinapszisok nagy mennyiségben tartalmaznak sMito-kat

(Palay, 1956; King, 1988), továbbá a szinaptikus mitokondriumok által szabályozott ATP

szint biztosítja a szinaptikus transzmissziót és megfelelő felépítést is (Ly és mtsai., 2006).

A piruvát dehidrogenáz alegységeinek csökkent szintje arra utal, hogy kevesebb

piruvát lép be a CK-be a szinapszisban, mint más sejtrégiókban. Ezt a gondolatmenetet

tovább erősíti az, hogy a CK kezdeti lépéseit biztosító enzimek, az akonitáz (Aco2) és az

Idh3a szintén csökkent mennyiséget mutatnak. Ez különösen érdekes, mivel az idegsejtek

mitokondriumaira magas piruvátfogyasztás jellemző. Már nagyon régóta ismert tény, hogy a

glükóz foszforilációs enzimei zömében az asztrocitákban expresszálódnak (Magistretti és

Pellerin, 1999; Barros és Deitmer, 2010) és az idegsejtek által felhasznált piruvát és laktátot a

környező asztrociták biztosítják (Magistretti és mtsai., 1994; Allen és mtsai., 2005; Wyss és

mtsai., 2011). Ezen felül az asztrociták további CK köztes termékkel is ellátják az

idegsejteket, mint például a citrát, alfa-ketoglutarát és szukcinát (Sonnewald és mtsai., 1994),

továbbá jelentősek az idegsejtek CK-ének kiegészítésében, melyben hiányzik a piruvát

dekarboxiláz (Shank és Campbell, 1984; Hassel, 2000). Mindemellett a legerősebb,

gliasejtekből a preszinaptikus végződésekbe irányuló transzport a glutamin transzport, amit a

neuronok a glutamát és GABA neurotranszmitterek előállítására használnak fel (Schousboe

és mtsai., 2013; Tani és mtsai., 2014). A glutamint továbbá mint energiaforrás is felhasználja

a preszinapszis, ahogy belép a CK-be mint α-ketoglutarát (Tiwari és mtsai., 2013), ily módon

fokozódik a glutamin - α-ketoglutarát átalakulás az sMito-ban (35. ábra).

A megnövekedett szintű Sucla2 az sMito-ban hozzájárulhat az extra alfa-ketoglutarát

szukcináttá majd később oxálacetáttá való átalakulásához. A megnövekedett mennyiségű

oxálacetát azonban nem képes a következő ciklusba belépni a preszinaptikus régióban, mivel

eredményeink alapján a szinaptikus mitokondriumokban csökkent mennyiségben található a

piruvát dehidrogenáz. Az oxálacetát képes alfa-ketoglutaráttá alakulni az aszpartát

aminotranszferáz enzim segítségével (Toney, 2014), ami ismerten nagy mennyiségben

található a preszinaptikus végződésekben (Yudkoff és mtsai., 1994) (35. ábra). Ez a modell

egybevág azzal a megállapítással, hogy nem a glikolízis, hanem az oxidatív foszforiláció az a

folyamat, ami az agyi információfeldolgozás szinaptikus mechanizmusát energetizálja (Hall

és mtsai., 2012).

98

35. ábra A preszinaptikus végződés és egy közeli asztrocita végződés legfőbb metabolikus interakciói.

A glikolízis többlépcsős folyamata során a glükóz piruváttá alakul, majd vagy laktáttá redukálódik a szinaptikus

mitokondriumokban emelkedett szintet mutató (piros nyíl) laktát dehidrogenáz (LDH) segítségével, vagy acetil-

koenzim A-vá (acetil-KoA) oxidálódik a szinaptikus mitokondriumban csökkent szintet mutató (kék nyíl)

piruvát dehidrogenáz komplex (PDH) által, ami ezt követően oxidálódik a citrát -körben. A citrát kör kezdeti

enzimjei (akonitáz - ACO, izocitrát dehidrogenáz - ICDH) szintén csökkent szintet mutatnak a szinaptikus

mitokondriumokban (kék nyíl). Az asztrocitákban a piruvát átalakulásának egy harmadik lehetősége, hogy

oxálacetáttá karboxilálódik a piruvát karboxiláz segítségével (PC). A glutamáterg szinapszisban a glutamát

(GLU) neurotranszmitterként felszabadul, a környező asztrocitákba jut, az asztrocitákban glutaminná

amidálódik (GLN) a glutamin szintetáz által (GS), végül visszajut az idegsejtekbe újrafelhasználásra (ez az ún.

glutamát-glutamin ciklus). Az idegsejtekben a GLN GLU-tá alakul a mitokondriális foszfát-aktivált glutamináz

által (PAG). A GABAerg szinapszisban hasonló folyamat zajlódik le a környező asztrocitákban, azonban a

GABA szénlánca képes belépni a citrát-körbe, majd egy kétlépéses folyamattal szukcináttá alakul a GABA-

transzamináz (GABA-T) és a szukcinát szemialdehid dehidrogenáz (SSADH) által. A GABA -T által katalizált

reakció α-ketoglutarátból (α-KG) GLU képződéséhez vezet, ami a GLN és a GABA szintézis alapanyaga (az az

ún. GABA shunt az asztrocitákban). A GABAerg idegsejtekben a GABA GLU-ból szintetizálódik a glutamát

dekarboxiláz segítségével (GAD). Készült: (Dadsetan és mtsai., 2011; Schousboe és mtsai., 2013; Toney, 2014)

irodalmi adatok és saját eredményeink alapján.

99

A fő nehézség, amivel ennek a sérült, gliális eredetű glutamin által vezérelt szinaptikus

CK-nek meg kell birkózni, a keletkezett ammónia eltávolítása (Hertz és Kala, 2007; Cooper,

2012). Ennek a leghatékonyabb módja a piruvát alaninná való átalakítása, majd az alanin

asztrocitákba való transzportálása (Dadsetan és mtsai., 2011) (35. ábra).

A proteomikai analízis során igazoltuk az L-laktát dehidrogenáz (Ldhb)

megemelkedett szintjét a szinaptikus mitokondriumokban, ami felveti a laktát dehidrogenáz

emelkedett aktivitását a szinapszisban (megjegyzendő, hogy a fehérje mennyiségi növekedése

és aktivitásának fokozódása nem feltétlenül jár együtt, ezért ez a felvetés igazolásra vár a

jövőben). A laktát dehidrogenáz aktivitásának fokozódása azonban indokolt lenne az

asztrocitákból érkező laktát piruváttá való átalakításának katalizálásában.

A fentebb említett felhasználása a piruvátnak az ammónia szinapszisból való

eltávolítása céljából egybevág a máskülönben ellentmondónak tűnő eredményeinkkel,

miszerint a Ldhb szintje megnőtt, míg a piruvát dehidrogenáz szintje lecsökkent a szinaptikus

mitokondriumokban. Az sMito glutamin és részben CK preferenciája szintén egybevág az

általunk kapott csökkent szinaptikus mitokondriális szintet mutató glükóz, alkohol, aminosav

és ketontest metabolizmusban résztvevő fehérjékkel.

Néhány, oxidatív stresszben jelentős szerepet játszó fehérje csökkent szintet mutatott

az sMito-ban, beleértve a mitokondriális szuperoxid dizmutázt (Sod2), ami az sMito-k

csökkent védekező képességére utal a reaktív szabadgyökökkel szemben (ROS). A

mitokondriális mátrixban lokalizálódó Sod2 az egyik legfőbb antioxidáns enzim, ami

eltávolítja a ROS-t (főként a szuperoxidokat), és védelmet nyújt a mitokondriális

károsodásokkal szemben (Miao és St Clair, 2009). A Sod2 hiányos egerek hamar meghalnak

a születést követően, azonban Sod2/kataláz mimetikummal való kezelés hatására

meghosszabítható az életük, és csökkenhetőek a oxidatív-stresszel kapcsolatos patológiai

elváltozások (Melov és mtsai., 2001). A Western blottal is megerősített csökkent szinaptikus

mitokondriális Sod2 szint, melyet 3 különböző fehérjefoltból is kimutattunk, az sMito-k

oxidatív stresszel szembeni fokozottabb érzékenységére utal. Lehetséges, hogy az sMito-k

feláldozzák védelmi rendszerük egy részét az oxidatív stresszel szemben, hogy megfelelő

ATP termelésre legyenek képesek ebben a specifikus morfológiai és metabolikus

környezetben, és ne váljanak még sérülékenyebbé.

A komplement komponens 1Q alegység kötő fehérje (C1qbp) mutatta a legnagyobb

mennyiségű fehérjeszintet az összes sMito fehérje közül, ami 3,7-szeres növekedést jelent az

sMito-ban az nsMito-hoz képest. A C1qbp fehérjét eredetileg plazmamembrán receptorként

írták le, ami képes a C1q megkötésére a sejtek felszínén (Ghebrehiwet és mtsai., 2001).

100

Később kimutatták számos szubcelluláris kompartmentumban (Ghebrehiwet és mtsai., 2001;

Sunayama és mtsai., 2004; Sengupta és mtsai., 2005).. McGee és munkatársai igazolták, hogy

a C1qbp szolubilis fehérje a mitokondriális mátrixban lokalizálódik, továbbá egy új

komponense a mPTP-nek, melynek nyitási mechanizmusa jelentős lépés a mitokondriális

apoptotikus útvonal folyamatában (Mcgee és Baines, 2011). Munkánk során

immunhisztokémiailag megerősítettük a C1qbp mitokondriális lokalizációját, valamint a

szinaptikus végződésekben is kimutattuk jelenlétét, mennyiségi eloszlásának szövettani

vizsgálata a különböző mitokondrium populációk között azonban még további vizsgálatokat

igényel. Irodalmi adatok alapján a C1qbp fehérje overexpressziója növeli a mitokondriális

ROS képződést, csökkenti a mitokondriális membránpotenciált, ami citokróm-c

felszabaduláshoz és végül sejthalálhoz vezet (Chowdhury és mtsai., 2008). Az sMito-ban

megnövekedett C1qbp expresszió tehát arra enged következtetni, hogy az sMito-k

érzékenyebbek a mitokondriális ROS termelés és oxidatív stressz indukált sejthalállal

szemben.

A citoszkeleton organizációban, sejtmotilitásban, ion transzportban és szinaptikus

transzmisszióban szerepet játszó megváltozott fehérjék legtöbbször nem kizárólag a

mitokondriumban lokalizálódnak. Például az α-szinuklein (Snca) fehérjét, amit több mint

kétszeres mennyiségben mutattunk ki az sMito-ban az nsMito-hoz képest, három különböző

proteinfoltban is detektáltuk. A 14 kDa molekulatömegű Snca az agyban rendkívül nagy

mennyiségben van jelen, mennyisége a citoszolikus fehérjék ~1%-át teszi ki (Iwai és mtsai.,

1995). Az Snca a neurodegeneratív betegségekben és szinukleopátiákban jelentős szerepet

játszó fehérje (Ma és mtsai., 2003), így diagnosztikai szempontból is rendkívül kutatott. A

preszinaptikus végződésekben és a neuronális sejtmagban szignifikánsan nagyobb

mennyiségben írták le más szubcelluláris organellumokhoz képest, azonban a

sejtorganellumok között a mitokondriumban dúsul fel legnagyobb mennyiségben (Li és

mtsai., 2007; Zhang és mtsai., 2008). Az oxidatív stressz egy jelentős tényező lehet az Snca

intramitokondriális transzportjának kiváltásában (Cole és mtsai., 2008), ami lehetséges oka

lehet az általunk meghatározott, emelkedett szinaptikus mitokondriális Snca szintnek. Az

Snca lokalizálódhat a külső mitokondriális membránban, az intermembrán térben, a

krisztákban és a mitokondriális mátrixban is (Zhang és mtsai., 2008). Az Snca hiányos egerek

lipidanyagcsere-zavarral és csökkent ETL működéssel rendelkeznek (Ellis és mtsai., 2005),

továbbá az Snca mutációja mitokondriális morfológiai és funkcionális változásokkal jár

együtt (Martin és mtsai., 2006). Mindezek alapján elmondható, hogy a megnövekedett Snca

101

szint az sMito-ban hozzájárulhat az ETL stabilitásának és az sMito felépítésének

megőrzéséhez.

A szinaptikus mitokondriumra jellemző fehérjék lehetséges forrásai

A sMito-ok messze helyezkednek el a szinapszishoz tartozó sejttesttől. A szinaptikus

végződést az axonális transzporton keresztül érik el (Macaskill és Kittler, 2010), melynek

ismert részletei a bevezető 1.8.4.2.-es alfejezetében kerültek bemutatásra. A kapott sMito-ra

jellemző fehérjekészlet többféle módon alakulhat ki: a mitokondriális proteom változhat a

sejttesten belül, az axonális transzport során, illetve a szinaptikus végződésekben is. A

mitokondriális fehérjék legnagyobb része a citoszolikus riboszómákon szintetizálódik, majd

az intramitokondriális transzportmechanizmusok révén jut a végső rendeltetési helyére

(részletesebben ld. bevezető 1.7. alfejezet). A fehérjék kisebb hányada mitokondriális DNS

által kódolt, melyek expresszióját intramitokondriális körülmények határozzák meg. A

megváltozott mitokondriális génátírás, illetve a mitokondriális fehérjetranszport

mechanizmusok együttese eredményezheti tehát az általunk kapott sMito-ra jellemző

fehérjeváltozásokat. A transzlokázok által katalizált mitokondriális fehérjeimport

mechanizmust a mitokondriális membránpotenciál (mMP), az ATP termelés, illetve a redox

reakciók nagy mértékben befolyásolják. A fehérjeimportban jelentős szerepet játszanak a

molekuláris chaperonok és fehérje összeszerelő komplexek, melyek direkt interakcióba

lépnek az érkező fehérjékkel, biztosítva megfelelő szerkezetüket és végső rendeltetési helyük

elérését (Chacinska és mtsai., 2009).

102

5.2. Az Aβ progresszió hatásának vizsgálata a mitokondriális proteomra és oxidatív

metabolizmusra – 3, 6, illetve 9 hónapos APP/PS1 és B6 egerek mitokondriális

proteomjának és oxidatív metabolizmusának összehasonlítása.

Eredményeink az sMito és nsMito fehérjehálózatának APP és Aβ progresszió hatására

bekövetkező változását tárták fel különböző korú és APP/PS1 egerekben. Összesen 60

különböző APP/PS1 és B6 egerek közötti szignifikáns változást mutató fehérjét írtunk le a

proteomikai analízis során (4. táblázat). A szignifikáns változást mutató fehérjék többsége az

energia metabolizmus (ETL és CK), oxidatív stresszválasz és apoptózis folyamataiban vesz

részt (32. ábra).

A megváltozott mitokondriális (sMito és nsMito változások együtt) fehérjék közös

regulátor és célpont vizsgálata alapján elmondhatjuk, hogy a regulátor és célpont fehérjék

zöme gyulladási és apoptotikus folyamatokban szerepet játszó molekula (33. ábra).

A bioinformatikai analízis során megállapítottuk, hogy a Tnf-α citokin rendelkezik a

legtöbb kapcsolattal az APP/PS1 egerekben megváltozott mitokondriális fehérjékkel. A Tnf-

α-t továbbá nem csak közös regulátorként, hanem közös célpontként is leírtuk, tehát

kapcsolata az említett mitokondriális fehérjékkel kétirányú. Mindezek alapján feltételezhető a

Tnf-α szerepe az Aβ hatására megváltozó mitokondriális fehérjék szabályozásában AK-ban.

A Tnf-α egy proinflammatorikus citokin, ami a gyulladási folyamatok egyik fő iniciátora az

agyban, továbbá szerepet játszik a neurotoxicitásban, a sejthalálban és az idegsejtek

funkcionális elváltozásaiban (Feldmann és Maini, 2003). A Tnf-α az „extrinsic”/külső

apoptotikus útvonal egyik iniciátora, mely a TNFR1 (Tnf receptor 1) halálreceptorhoz való

kötődésen keresztül hat. A TNFR1 aktivációja a TRADD-RIP-TRAF2 (TNFR halál domén –

receptor interakciós protein – TNF asszociált faktor 2) komplex kialakulását idézi elő, ami az

NF-κB (nukleáris faktor-κB) sejt-túlélési útvonalat vagy a JNK (c-Jun-N-terminális kináz)

apoptotikus útvonalat aktiválja. A RIP fehérje aktiválja a prokaszpáz 2-t és hasítja a BID

fehérjét (BCL2 (B-sejt limfóma-2)-inerakciás agonista). A TRADD-FAD-FLICE (TNFR

halál domén – FAS asszociált halál domén – FADD szerű interleukin-1 β) komplex aktiválja a

prokaszpáz 8-at, ami apoptózist indukál a kaszpáz 3-on keresztül vagy a BID tBID-dé

(trunkált/csonkolt BID) való hasításán át (37. ábra). Számos irodalmi adat igazolja a Tnf-α

szerepét humán AK-ban. Kimutatták, hogy az Aβ serkenti a Tnf-α szekrécióját (Klegeris és

mtsai., 1997; Combs és mtsai., 2001) és más gyulladási faktorok felszabadulását az agyban

(Rosenberg, 2005; Ralay Ranaivo és mtsai., 2006). Az Aβ továbbá gyulladást indukál az

idegszövetben, ami a neurodegeneráció folyamatának egyik korai lépése (Craft és mtsai.,

103

2006). Az eddig említett eredményekkel összhangban áll az AK-os betegek cerebrospinális

folyadékjában mért 25-szörösére növekedett Tnf-α szint (Tarkowski és mtsai., 2003). A Tnf-α

szint tehát jól korrelál az AK klinikai progressziójával (Tarkowski és mtsai., 2003). A Tnf-α

szignalizáció gátlása lassítja az Aβ-hoz köthető patológiai elváltozások megjelenését, a

kognitív hanyatlást továbbá a AK-ra jellemző fokozott idegsejtpusztulást (Mcalpine és mtsai.,

2009). Alzheimer-kóros betegeken végzett anti-Tnf terápia hatékony volt a kognitív

képességek javításában (Tobinick és mtsai., 2006; Tweedie és mtsai., 2007; Tobinick, 2009).

Eredményeink alapján elmondható, hogy a Tnf-α hozzájárulhat a mitokondriális

fehérjeváltozások korai megjelenéséhez, továbbá felmerül a Tnf-α, mint korai indikátor

lehetősége az Aβ felhalmozódásának kezdeti fázisában. Utóbbi felvetés további vizsgálatához

AK-os betegek Tnf-α szintjének noninvazív vizsgálatára lenne szükség. Az APP/PS1 egerek

fehérjeváltozásainak funkcionális elemzése alapján elmondhatjuk, hogy a Htra2 és Ethe1

oxidatív stresszben és apoptózisban szerepet játszó fehérjék szintje a kor előrehaladtával

jellegzetes dinamikát mutat a B6 egerekhez képest (3 hónapos korban:↓, 6 hónapos korban:↑,

9 hónapos korban:↓), így felmerül, hogy alkalmasak lehetnek az AK progressziójának

követésére. Ezen felül jelentős változást tapasztaltunk az apoptózisban szintén jelentős

szabályozó funkcióval rendelkező, AK-hoz köthető Pebp1 illetve Vdac1 fehérjéknél is. A

továbbiakban ezen fehérjék AK-hoz, illetve a Tnf-α közös regulátorfehérjéhez köthető

szabályozási mechanizmusai kerülnek bemutatásra.

A szerin proteáz Htra2 fehérje a HtrA (high-temperature requirement) oligomer szerin

proteázok fehérjecsaládjának tagja, mely többek között a mitokondriális funkciók ellátásában,

az autofágiában és apoptózis intrinsic/mitokondriális útvonalában vesz részt. Az apoptózis

mitokondriális útvonalát különböző iniciátorok válthatják ki. A mitokondriális membrán

permeabilizációját a BH3 domént tartalmazó, „BH3-only” proteinek idézik elő, melyek

megkötik és serkentik a BAX fehérjéket (B-sejt limfóma 2-asszociált fehérje X) a BCL2

fehérjék gátlásán keresztül, lehetővé téve ezáltal a BAX fehérjék transzlokációját, továbbá

számos apoptotikus faktor, mint a Htra2 fehérje felszabadulását (Benn és Woolf, 2004). A

Htra2 felszabadulása DNS fragmentációhoz, majd végül apoptózishoz vezet (36. ábra).

Számos tanulmány igazolja, hogy a Htra2 fehérje jelentős szerepet játszik a PK-ban (Strauss

és mtsai., 2005; Plun-Favreau és mtsai., 2007), az AK-ban betöltött szerepe azonban nem

tisztázott. A Htra2 enzimatikus aktivitása fokozódik AK-os betegek frontális cortexében

(Moreira és mtsai., 2007), továbbá mennyisége jelentősen megnő a cerebrális cortexben és

hippocampusban, valamint kimutatható a plakkok és NFK-ek területén is (Kawamoto és

mtsai., 2010). A Htra2 közvetlenül hasítja az APP-t (Anandatheerthavarada és mtsai., 2003;

104

Park és mtsai., 2006), továbbá közvetlenül kötődik az Aβ-hoz hozzájárulva annak

proapoptotikus aktivitásához (Park és mtsai., 2004). Az APP Htra2 általi hasítása az

egészséges agy fiziológiás folyamata (Park és mtsai., 2006). A mitokondriális Htra2 képes

kötődni a PS1-hez (Gray és mtsai., 2000; Martins és mtsai., 2002; Gupta és mtsai., 2004;

Kuninaka és mtsai., 2007; Behbahani és mtsai., 2010), továbbá a PS1-ből származó

peptidfragmens a Htra2 PDZ doménjéhez kötődve serkenti annak apoptózis inhibitor

fehérjékre (IAP) irányuló proteolitikus aktivitását, ami Htra2-függő apoptózist indukál (Gupta

és mtsai., 2004) (36. ábra). Elképzelhető tehát, hogy a Htra2 fehérjeszint emelkedése növeli a

Htra2-mediált APP hasítási útvonal arányát az amyloidogén hasítással szemben, ami

lelassíthatja az Aβ felhalmozódását a 6 hónapos APP/PS1 egerekben. Ez alapján a Htra2

átmenetileg képes védelmet nyújtani a további Aβ felhalmozódással szemben a 6 hónapos

állatokban.

Eredményeink alapján a másik Aβ felhalmozódás követésére alkalmas molekulajelölt

a perszulfid dioxigenáz Ethe1 fehérje. Az Ethe1 fehérje (alternatív nemzetközi nevei:

ethylmalonic encephalopathy protein 1, hepatoma subtracted clone one protein (HSCO),

sulfur dioxygenase ETHE1) jelentős szerepet játszik a hidrogén szulfidok katabolizmusában.

Az Ethe1 egy anti-apoptotikus fehérje, ami a hiszton deacetilázzal való specifikus kötődése

révén növeli annak p53-ra irányuló aktivitását, ezáltal gátolva az apoptózist (Higashitsuji és

mtsai., 2007). Az Ethe1 gátolja az NF-κB szignalizációt a RelA megkötésén keresztül, ami

fokozza annak sejtmagból a citoplazmába irányuló exportját, továbbá a kaszpáz-9 gátlásán

keresztül is kifejti antiapoptotikus hatását (Higashitsuji és mtsai., 2002) (36. ábra). Az Ethe1

hiánya halálos kimenetelű szulfid toxicitást okoz etil-malonát enkefalopátia során, ami egy

autoszómális recesszív, gyógyíthatatlan, halálos kimenetelű betegség (Tiranti és mtsai., 2009).

Az Aβ felhalmozódás patomechanimzusában még nem írták le az Ethe1 lehetséges szerepét.

Az adatalapú munkahipotézisünk szerint a megemelkedett Ethe1 szint a 6 hónapos állatok

szinaptikus mitokondriumában megelőzheti az Aβ által kiváltott apoptotikus folyamatokat,

ami az Aβ felhalmozódás egyfajta kompenzáló mechanizmusa lehet.

A foszfatidiletanolamin-kötő fehérje (phosphatidylethanolamine-binding protein 1

(Pebp1) / Raf kinase inhibitor protein (RKIP)) egy multifunkcionális fehérje, ami a

hippokampális kolinerg neurostimuláló fehérje (hippocampal cholinergic neurostimulating

peptide, HCNP) prekurzora is egyben. Számos tanulmány igazolta, hogy a Pebp1 kiterjedt

szabályozási funkcióval rendelkező sejtszignalizációs molekula. Ismert továbbá, hogy a

Pebp1 gátolja a Ras/Raf-1/MEK/ERK MAPK szignalizációs útvonalat a Raf-1

foszforilációjának és aktivációjának gátlásán keresztül (Fougner és mtsai., 2008), a Tnf-α által

105

36. ábra Az apoptózis Tnf-α által szabályozott külső (extrinsic) és az Aβ hatására jelentős változást mutató

mitokondriális apoptotikus faktorok (Htra2, Pebp1, Ethe1 és Vdac1) által szabályozott belső (intrinsic)

útvonalainak lehetséges kapcsolódása. Az ábrán használt rövidítések: Aβ: β-amyloid, AIP: ASK1-kötő protein 1,

ASK1: apoptózis-szignál-reguláló kináz-1, BID: BCL2 (B-sejt limfóma-2)-inerakciás agonista, tBID: trunkált

(csonkolt) BID, BAX: B-sejt limfóma 2–asszociált fehérje X, pJNK: foszfo-JUN N-terminális kináz, AP1:

aktivátor protein-1, c-jun: c-Jun-N-terminális kináz, CypD: ciklofilin-D, Ethe1: perszulfid dioxigenáz Ethe1,

FAD: FAS asszociált halál domén, FLICE: FADD szerű interleukin -1 β, Htra2: szerin proteáz Htra2, NIK: NF-

κB-indukált kináz, IKK: IkappaB kináz, IκB: NF-κB inhibitoros alegység, IAP: apoptózis inhibitor fehérjék

családja, Pebp1: foszfatidiletanolamin-kötő fehérje, PS1: preszenilin-1, RIP: receptor interakciós protein,

TNFR1: Tnf receptor 1, TRADD: TNFR halál domén, TRAF: TNF asszociált faktor 2, Vdac1: feszültség-függő

anion-szelektív csatorna-1. Készült: (Purves és Mcmahan, 1972; Shimizu és mtsai., 2000; Yeung és mtsai., 2001;

Higashitsuji és mtsai., 2002; Gupta és mtsai., 2004) irodalmi adatok és saját eredményeink alapján.

106

aktivált NF-κB útvonalat az NF-κB-indukált kináz (NIK) és IkappaB kináz (IKK) enzimek

gátlásán keresztül (Yeung és mtsai., 2001) (36. ábra). A Pebp1 fehérje AK-ban betöltött

szerepét számos tanulmány alátámasztja, mRNS szintje csökken sporadikus AK-ban szenvedő

betegek hippocampusának CA1 régiójában. Mivel a HCNP fehérje köztudottan aktiválja a

kolinerg aciltranszferázt az idegsejtekben, AK-os betegekben kimutatott alacsony expressziós

szintje magyarázhatja a kolinerg neuronok leszabályozódását, ami memóriazavarokhoz vezet

AK-ban (Maki és mtsai., 2002). A Pebp1 fehérjeszintje Tg2576 egerek hippocampusában

szintén szignifikáns csökkenést mutatott az Aβ progresszió hatására (George és mtsai., 2006).

Munkánkban a Pebp1 fehérje szintje jelentős csökkenést mutatott 9 hónapos APP/PS1 egerek

nsMito-ában, amikor az Aβ plakk felhalmozódás már rendkívül előrahaladott az agyban. 3

hónapos korú APP/PS1 állatok sMito-ában, ahol még nem mutatható ki Aβ-plakk lerakódás,

minimális fehérjeszint csökkenést tapasztaltunk. Adataink tovább erősítik a Pebp1 AK-ban

való jelentőségét, valamint alátámasztják a Tnf-α szabályozó szerepét az Aβ-által érintett

mitokondriális fehérjékre.

A már korábban említett feszültség-függő anion-szelektív csatorna-1 (Vdac1) számos

metabolit (pl. ATP/ADP) transzportját biztosító pórusformáló fehérje, ami erőteljesen

befolyásolja a mitokondriumok metabolikus működését. A Bcl-2 fehérjecsalád Bax

proapoptotikus tagja olyan pórus formálására képes közösen a Vdac1 fehérjével, melynek

áteresztőképessége jóval meghaladja a Vdac1 csatornáét (Shimizu és mtsai., 2000), így az

IMT-ben lokalizált apoptotikus faktorok felszabadulásának mértéke megnő (36. ábra). Ezzel

szemben a Bid proapoptoikus fehérje a Vdac1 csatorna záródását idézi elő, ami gátolja a

mitokondrium megfelelő működését (Rostovtseva és mtsai., 2004). A Vdac1 szintje

szignifikáns csökkenést mutat a temporális és frontális cortexben, valamint a talamuszban

AK-os betegek post mortem agymintájában (Yoo és mtsai., 2001). Más kísérletek emelkedett

Vdac1 szintet mutattak az említett humán agyrégiókban, illetve APP transzgenikus egerek

cortexében. Kimutatták továbbá, hogy a Vdac1 közvetlenül kötődik az Aβ és foszforilált tau

fehérjékhez AK-os post mortem agyban, illetve különböző AK egérmodellekben, ami

blokkolja a mitokondriális permeabilitási pórust (MPT), gátolja a mitokondriális

fehérjetranszportot, továbbá oxidatív foszforilációt okozva mitokondriális funkciózavarhoz

vezet az idegsejtekben (Cuadrado-Tejedor és mtsai., 2011; Manczak és Reddy, 2012; Reddy,

2013). A Vdac1 szintén overexpresszálódik a hippocampusban Aβ-overexpresszáló

egérmodellben. A szolubilis Aβ oligomerek továbbá serkentőleg hatnak a Vdac1-re humán

neuroblasztóma sejtvonalban (Cuadrado-Tejedor és mtsai., 2011). A csökkent Vdac1

expresszió előnyös lehet a szinaptikus aktivitás szempontjából, javíthatja a funkcióját továbbá

107

védelmet nyújthat az AK-hoz kötődő gének toxikus hatásával szemben, mint amilyen az APP,

Tau, PS1, PS2 és BACE1 (Manczak és mtsai., 2013). Detergens-rezisztens membrán-

frakcióban a Vdac1 kötődik a γ-szekretázhoz, ami befolyásolja az Aβ termelődést, és ami

alapján felmerül, hogy a hozzájuk kötődő molekulák lehetséges terápiás célpontok lehetnek

AK-ban (Hur és mtsai., 2012). Eredményeink alapján a Vdac1 szintje lecsökken 6 hónapos

APP/PS1 egerek szinaptikus mitokondriumában, ami javíthatja a szinaptikus funkciót, míg 9

hónapos korra ugyanitt megnövekszik a szintje, ami a szinapszisvesztéssel és

memóriahanyatlással korrelál. A nem-szinaptikus mitokondriális Vdac1 szintje a különböző

fehérjefoltokban ellentétes irányú változást mutat.

Munkánk során a mitokondriális funkciót is teszteltük ugyanazokon az állatokon,

melyekből a proteomikai vizsgálatot is végeztük. A mitokondriális oxidatív metabolizmus

ismerten eltolódik a ROS-képződés irányába az öregedéssel és a neurodegeneratív betegségek

során, ezért vizsgáltuk a mitokondrium preparátumokban a H2O2 termelődés mértékét (Rao és

Balachandran, 2002; Emerit és mtsai., 2004; Lin és Beal, 2006; Shibata és Kobayashi, 2008).

Az ETL, mint ahogy a bevezető 1.8.3. alfejezetében is olvashattuk, a legfőbb intracelluláris

ROS legfőbb forrása (Boveris és mtsai., 1972). Az ETL enzim komplexek aktivitása

leszabályozódik AK-os betegek agyában (Kish és mtsai., 1992; Mutisya és mtsai., 1994; Kim

és mtsai., 2001). Az izolált agyi mitokondriumokban a komplex I és III a legfőbb ROS képző

helyek (Votyakova és Reynolds, 2001), de más ETL enzimek és CK dehidrogenázok szintén

hozzájárulnak a H2O2 képződéshez (Adam-Vizi és Tretter, 2013). Az oxidatív

metabolizmusban szerepet játszó fehérjekülönbségek ellenére a mitokondriális H2O2

termelésben nem tapasztaltunk változást a 3 hónapos egerekben (29/A ábra). Ez valószínűleg

a fehérjeváltozások funkcionális kompenzációjának eredménye, ami megnehezíti a

metabolikus diagnózist az AK-nak ebben a korai fázisában. Ezzel szemben, 6 hónapos korban

emelkedett ROS-szintet tapasztaltunk az APP/PS1 egerek sMito-ában (29/B ábra), amikor az

amyloid plakkok már megjelennek a hippocampusban és a cerebrális cortexben (26/F ábra).

Alátámasztva az adatokat (ld. bevezető), miszerint az sMito-ok érzékenyebbek az Aβ toxikus

hatásaival szemben (Du és mtsai., 2010), az nsMito-okban nem tapasztaltunk növekedést a

ROS termelődésben 6 hónapos APP/PS1 egerekben (29/B ábra). Néhány komplex I alegység

fehérjeszintje enyhébb, ellenkező irányú változást mutatott az nsMito-okban az sMito-okhoz

képest, ami magyarázhatja az állandó ROS szintet. Rendkívül kiterjedt amyloid plakk

lerakódás figyelhető meg a 9 hónapos APP/PS1 egerek corticális és hippokampális

agyterületén (26/G ábra), a ROS termelésben azonban nem tapasztaltunk további növekedést

(29/C ábra). Néhány hősokk fehérje szintje (Hspd1 és Hspa9) emelkedett szintet mutatott a 9

108

hónapos állatok mindkét mitokondrium populációjában, ami összefügghet a megnövekedett

ER-stressz, a fokozott mértékű hibás fehérjefeltekeredés és a növekvő mennyiségű sérült

fehérjék eliminációjának folyamatával.

Az AK kutatásának egyik legfőbb célja napjainkban a korai biomarker keresés, ami

alapján a betegségre hajlamos rizikócsoportokat lehet kijelölni egy lehetséges AK kezelés

kidolgozása érdekében. Eredményeink olyan korai mitokondriális fehérjeváltozásokat írnak

le, melyek megelőzik az AK-ra jellemző memóriazavarok megjelenését 3 hónapos APP/PS1

egerekben. Az eredményeink transzlálhatóságát illetően fontos megemlíteni, hogy a 60

különböző mitokondriális fehérjeváltozás közül 46 fehérje ismerten érintett a humán AK

késői fázisában (4. táblázat / humán AK-os minta), továbbá 11 fehérjét már korábban

leírtak, mint humán Aβ oligomer kötőpartnert (4. táblázat / zöld jelölés) (Olah és mtsai.,

2011), ami jelentős szereppel bírhat az Aβ által okozott patológiás elváltozásokban.

Fontos megjegyeznünk, hogy a korai mitokondriális marker fehérjék a humán agyi

biopszia lehetőségének hiányában közvetlenül nem használhatóak, mérésükre nem-invazív

eljárásokat kell kidolgozni. Felmerül a képalkotó eljárásokkal vizsgálható metabolikus

termékeken keresztüli monitorozás, vagyis az FDG-PET további finomítása a citrát-kör

metabolitjainak irányába. Első lépés azonban a fehérjeszintű korai változások részletes

feltérképezése.

109

6. KONKLÚZIÓ

I. A szinaptikus és nem-szinaptikus mitokondriumok proteomikai összehasonlításának

vizsgálatából levonható legfőbb következtetések:

Munkánk során kidolgoztunk egy módosított Percoll gradiens centrifugálási eljárást,

amivel egyazon agymintából metabolikusan aktív sMito és nsMito frakciók állíthatók

elő 90% fölötti tisztasággal, amit elektronmikroszkóppal és FACS-szal is igazoltunk.

Az azonosított -2,28 – 3,70-szeres tartományba eső, 56 különböző fehérjeváltozás közül

22 szignifikánsan magasabb és 34 szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű fehérjét

azonosítottunk az sMito-okban az nsMito-okhoz képest. Mindezek alapján elmondható,

hogy a különböző mitokondrium populációkat specifikus fehérjeösszetétel jellemzi,

továbbá valószínűsíthető, hogy a mitokondriális proteom dinamikája a szinaptikus

funkciókban kulcsfontosságú tényező.

A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a szinaptikus

transzmisszió, valamint a laktát, glutation és nukleotid metabolizmus folyamataiban

résztvevő fehérjék az sMito-okban dúsultak fel. Ezzel szemben a glükóz, alkohol,

aminosav, lipid és ketonmetabolizmus, szignáltranszdukció, morfogenezis,

fehérjeszintézis, fehérje degradáció és transzkripció folyamataiban szerepet játszó

fehérjék nsMito-okra voltak jellemzőek. A további funkcionális csoportok mind sMito,

mind nsMito-ra jellemző fehérjéket tartalmaztak.

A Sod2 és C1qbp oxidatív stresszben szerepet játszó fehérjekülönbségeket, valamint az

Idh3a és Sucla2 citrát-körben szerepet játszó fehérjekülönbséget Western blottal, illetve

utóbbi kettőt immunhisztokémiával is igazoltuk. Eredményeink alapján a szinapszis

energiaellátását szolgáló citrát-kör jelentősen különbözik a kétféle mitokondrium

populációban, továbbá az sMito-ok fokozottabb érzékenységet mutatnak az oxidatív

stresszre.

Az sMito-okban feldúsult, energiametabolizmusban szerepet játszó fehérjék elemzése

alapján a szinaptikus régiót alkotó idegsejtvégződések és az azokhoz szorosan

kapcsolódó gliavégtalpak között kialakuló glutamin-glutamát ciklus alapvető fontosságú

lehet az sMito-ok energiatermelését biztosító szubsztrátok ellátásában.

Az sMito egyedi fehérjeösszetétele az alapkutatáson felül terápiás szempontból is

jelentős lehet, hiszen specifikus jelölésük a bennük nagy mennyiségben megtalálható

fehérjék révén (mint a C1qbp) lehetséges, ami az sMito-okra irányuló célzott

gyógyszerfejlesztésben nagy jelentőséggel bírhat.

110

II. Az Aβ progresszió mitokondriális proteomra és oxidatív metabolizmusra gyakorolt

hatásának vizsgálatából levonható legfőbb eredmények és következtetések:

A proteomikai analízis során 42 különböző, -1,41 – 1,80-szoros tartományba eső

szinaptikus mitokondriális fehérjéváltozást, valamint 43 különböző, -2,29 – 1,52-szeres

tartományba eső nem-szinaptikus mitokondriális fehérjeváltozást azonosítottunk,

melyek az APP túltermelés és Aβ felgyülemlés mitokondriális folyamatokra gyakorolt

hatását tükrözik. Vizsgálataink alapján elmondható, hogy az Aβ felhalmozódás eltérő és

korfüggő hatást gyakorol az sMito-kban és a sejttestekben lokalizált nsMito-kban

APP/PS1 transzgenikus egérmodellben.

Mindkét mitokondrium populációban a viselkedési elváltozások és amyloid plakkok

megjelenése előtti, az eddigi adatokkal összevetve az eddig ismert legkorábbi

fehérjeváltozásokat írtunk le a 3 hónapos APP/PS1 egerekben, amikor a hidrogén-

peroxid képződésben nem tapasztaltunk változást. Ez utóbbi jelenség a

fehérjeváltozások funkcionális kompenzálódásának eredeménye lehet. Ezzel szemben a

6 hónapos APP/PS1 egerekben az sMito-okat fokozottabb mértékben érintő, emelkedett

hidrogén-peroxid termelést detektáltunk, melynek mértéke 9 hónapos korra kevésbé

volt jelentős.

A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a fehérjék

többsége az energiametabolizmus, oxidatív stressz és apoptózis folyamataihoz

kapcsolódik.

A Western blottal is igazolt Htra2 és Ethe1 apoptotikus fehérjék szintje a kor

előrehaladtával jellegzetes dinamikát mutat (↓↑↓) az APP/PS1 egerek sMito-ában,

ugyanez a jelenség figyelhető meg a jelenleg ismeretlen funkciójú ES1 fehérjénél is a

nsMito-okban. Mindezek alapján felmerül, hogy az említett fehérjék alkalmasak

lehetnek az Aβ progresszió okozta mitokondriális fehérjehálózat-változás különböző

fázisainak indexálására.

A bioinformatikai vizsgálatok során végzett közös célpont és regulátor analízis alapján

megállapítottuk, hogy a Tnf-α fontos szereppel bír az Aβ hatására megváltozott szintű

mitokondriális fehérjék szabályozásában. A leírt proteomikai változások és

bioinformatikai elemzések felvetik a Htra2, Ethe1 és Tnf-α korai, non-invazív

vizsgálatának fontosságát humán perifériás mintákban (pl. vérszérum), ami lehetővé

teheti bizonyos korai biomarkerek azonosítását, melyek segíthetnek az AK-ra

hajlamosabb rizikócsoportok kijelölésére.

111

A Tnf-α által indukált külső, valamint az Aβ hatására jelentős változást mutató Htra2,

Ethe1, Pebp1 és Vdac1 által befolyásolt mitokondriális apoptotikus útvonalak

kapcsololatai felvetik az Aβ hatásának jelentőségét az NFκB szignalizáció, illetve a

kaszpáz-kaszkád útvonalakra.

Adataink korábbi, humán AK-os post mortem agyminták vizsgálatából származó

proteomikai eredményeket is alátámasztanak, amellett, hogy korábban le nem írt

fehérjeváltozásokat is tartalmaznak.

Eredményeink tehát egy új kutatási irányt nyitnak az Aβ hatására bekövetkező korai

mitokondriális elváltozások feltárásában, ami az AK tünetmentes, korai fázisának

megértésében jelentős előrelépés lehet. Adataink felvetik a 3 hónaposnál fiatalabb

állatok mitokondriális fehérjeváltozásainak részletesebb kutatásának lehetőségét , és

amelyet különböző állatmodellek összevetésével tervezünk vizsgálni a jövőben.

112

Irodalomjegyzék

Abramov, A. Y., Canevari, L., Duchen, M. R. (2004). "Beta -amyloid peptides induce mitochondrial dysfunction and oxidative stress in astrocytes and death of neurons through activation of NADPH oxidase." J Neurosci 24(2): 565-575.

Adam-Vizi, V., Tretter, L. (2013). "The role of mitochondrial dehydrogenases in the generation of oxidative

stress." Neurochem Int 62(5): 757-763. Addya, S., Anandatheerthavarada, H. K., Biswas, G., Bhagwat, S. V., Mullick, J., Avadhani, N. G. (1997).

"Targeting of NH2-terminal-processed microsomal protein to mitochondria: a novel pathway for the biogenesis of hepatic mitochondrial P450MT2." J Cell Biol 139(3): 589 -599.

Agca, C., Fritz, J. J., Walker, L. C., Levey, A. I., Chan, A. W., Lah, J. J., Agca, Y. (2008). "Development of transgenic rats producing human beta-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically." BMC Neurosci 9: 28.

Agca, C., Seye, C., Kashuba Benson, C. M., Rikka, S., Chan, A. W., Weisman, G. A., Agca, Y. (2009). "Development of a novel transgenic rat overexpressing the P2Y(2) nucleotide receptor using a lentiviral vector." J Vasc Res 46(5): 447-458.

Ahmed, T., Gilani, A. H. (2009). "Inhibitory effect of curcuminoids on acetylcholinesterase activity and

attenuation of scopolamine-induced amnesia may explain medicinal use of turmeric in Alzheimer's disease." Pharmacol Biochem Behav 91(4): 554-559.

Allen, N. J., Karadottir, R., Attwell, D. (2005). "A preferential role for glycolysis in preventing the anoxic

depolarization of rat hippocampal area CA1 pyramidal cells." J Neurosci 25(4): 848 -859. Alley, G. M., Bailey, J. A., Chen, D., Ray, B., Puli, L. K., Tanila, H., Banerjee, P. K., Lahiri, D. K. (2010). "Memantin e

lowers amyloid-beta peptide levels in neuronal cultures and in APP/PS1 transgenic mice." J Neurosci Res 88(1): 143-154.

All inson, T. M., Parkin, E. T., Turner, A. J., Hooper, N. M. (2003). "ADAMs family members as amyloid precursor protein alpha-secretases." J Neurosci Res 74(3): 342-352.

Alzheimer, A., Stelzmann, R. A., Schnitzlein, H. N., Murtagh, F. R. (1995). "An English translation of Alzheimer's 1907 paper, "Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde"." Clin Anat 8(6): 429-431.

Ames, A., 3rd (2000). "CNS energy metabolism as related to function." Brain Res Brain Res Rev 34(1 -2): 42-68. Anandatheerthavarada, H. K., Biswas, G., Robin, M. A., Avadhani, N. G. (2003). "Mitochondrial targeting and a

novel transmembrane arrest of Alzheimer's amyloid precursor protein impairs mitochondrial function

in neuronal cells." J Cell Biol 161(1): 41-54. Anantharaman, M., Tangpong, J., Keller, J. N., Murphy, M. P., Markesbery, W. R., Kiningham, K. K., St Clair, D. K.

(2006). "Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's

disease." Am J Pathol 168(5): 1608-1618. Andersen, P., Bliss, T. V., Skrede, K. K. (1971). "Unit analysis of hippocampal polulation spikes." Exp Brain Res

13(2): 208-221. Anderson, S., Bankier, A. T., Barrell, B. G., de Bruijn, M. H., Coulson, A. R., Drouin, J., Eperon, I. C., Nierlich, D. P.,

Roe, B. A., Sanger, F., Schreier, P. H., Smith, A. J., Staden, R., Young, I. G. (1981). "Sequence and organization of the human mitochondrial genome." Nature 290(5806): 457 -465.

Andreyev, A. Y., Kushnareva, Y. E., Starkov, A. A. (2005). "Mitochondrial metabolism of reactive oxygen

species." Biochemistry (Mosc) 70(2): 200-214. Antequera, D., Bolos, M., Spuch, C., Pascual, C., Ferrer, I., Fernandez-Bachiller, M. I., Rodriguez-Franco, M. I.,

Carro, E. (2012). "Effects of a tacrine-8-hydroxyquinoline hybrid (IQM-622) on Abeta accumulation and cell death: involvement in hippocampal neuronal loss in Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 46(3):

682-691. Area-Gomez, E., Del Carmen Lara Castil lo, M., Tambini, M. D., Guardia -Laguarta, C., de Groof, A. J., Madra, M.,

Ikenouchi, J., Umeda, M., Bird, T. D., Sturley, S. L., Schon, E. A. (2012). "Upregulated function of

mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease." EMBO J 31(21): 4106-4123. Baranello, R. J., Bharani, K. L., Padmaraju, V., Chopra, N., Lahiri, D. K., Greig, N. H., Pappolla, M. A., Sambamurti,

K. (2015). "Amyloid-beta protein clearance and degradation (ABCD) pathways and their role in Alzheimer's disease." Curr Alzheimer Res 12(1): 32-46.

Barbero-Camps, E., Fernandez, A., Martinez, L., Fernandez-Checa, J. C., Colell, A. (2013). "APP/PS1 mice overexpressing SREBP-2 exhibit combined Abeta accumulation and tau pathology underlying Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 22(17): 3460-3476.

113

Barrett, E. F. (2001). "Contrasting contributions of endoplasmic reticulum and mitochondria to Ca(2)+ handling

in neurons." J Gen Physiol 118(1): 79-82. Barros, L. F., Deitmer, J. W. (2010). "Glucose and lactate supply to the synapse." Brain Res Rev 63(1 -2): 149-159. Behbahani, H., Pavlov, P. F., Wiehager, B., Nishimura, T., Winblad, B., Ankarcrona, M. (2010). "Association of

Omi/HtrA2 with gamma-secretase in mitochondria." Neurochem Int 57(6): 668-675. Benn, S. C., Woolf, C. J. (2004). "Adult neuron survival strategies --slamming on the brakes." Nat Rev Neurosci

5(9): 686-700. Bero, A. W., Bauer, A. Q., Stewart, F. R., White, B. R., Cirrito, J. R., Raichle, M. E., Culver, J. P., Holtzman, D. M.

(2012). "Bidirectional relationship between functional connectivity and amyloid -beta deposition in mouse brain." J Neurosci 32(13): 4334-4340.

Bierer, L. M., Haroutunian, V., Gabriel, S., Knott, P. J., Carlin, L. S., Purohit, D. P., Perl, D. P., Schmeidler, J.,

Kanof, P., Davis, K. L. (1995). "Neurochemical correlates of dementia severity in Alzheimer's disease: relative importance of the cholinergic deficits." J Neurochem 64(2): 749-760.

Bil lups, B., Forsythe, I. D. (2002). "Presynaptic mitochondrial calcium sequestration influences transmission at mammalian central synapses." J Neurosci 22(14): 5840-5847.

Biscaro, B., Lindvall, O., Tesco, G., Ekdahl, C. T., Nitsch, R. M. (2012). "Inhibition of microglial activation protects hippocampal neurogenesis and improves cognitive deficits in a transgenic mouse model for Alzheimer's disease." Neurodegener Dis 9(4): 187-198.

Bobba, A., Amadoro, G., Valenti, D., Corsetti, V., Lassandro, R., Atlante, A. (2013). "Mitochondrial respiratory

chain Complexes I and IV are impaired by beta -amyloid via direct interaction and through Complex I -dependent ROS production, respectively." Mitochondrion 13(4): 298 -311.

Bons, N., Mestre, N., Ritchie, K., Petter, A., Podlisny, M., Selkoe, D. (1994). "Identification of amyloid beta

protein in the brain of the small, short-lived lemurian primate Microcebus murinus." Neurobiol Aging 15(2): 215-220.

Borchelt, D. R., Thinakaran, G., Eckman, C. B., Lee, M. K., Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C. M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H. H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A. I., Gandy, S. E., Copeland, N. G.,

Jenkins, N. A., Price, D. L., Younkin, S. G., Sisodia, S. S. (1996). "Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo." Neuron 17(5): 1005-1013.

Boveris, A., Oshino, N., Chance, B. (1972). "The cellular production of hydrogen peroxide." Biochem J 128(3): 617-630.

Braak, H., Braak, E. (1995). "Staging of Alzheimer's disease-related neurofibril lary changes." Neurobiol Aging 16(3): 271-278; discussion 278-284.

Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. (1994). "Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation

of neurofibril lary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat." Neurosci Lett 171(1-2): 1-4.

Brendza, R. P., O'Brien, C., Simmons, K., McKeel, D. W., Bales, K. R., Paul, S. M., Olney, J. W., Sanes, J. R., Holtzman, D. M. (2003). "PDAPP; YFP double transgenic mice: a tool to study amyloid-beta associated

changes in axonal, dendritic, and synaptic structures." J Comp Neurol 456(4): 375 -383. Brown, M. R., Sull ivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. (2004). "Nitrogen

disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria." J Neurosci

Methods 137(2): 299-303. Brown, M. R., Sull ivan, P. G., Geddes, J. W. (2006). "Synaptic mitochondria are more susceptible to

Ca2+overload than nonsynaptic mitochondria." J Biol Chem 281(17): 116 58-11668. Bubber, P., Haroutunian, V., Fisch, G., Blass, J. P., Gibson, G. E. (2005). "Mitochondrial abnormalities in

Alzheimer brain: mechanistic implications." Ann Neurol 57(5): 695 -703. Burte, F., De Girolamo, L. A., Hargreaves, A. J., Bil lett, E. E. (2011). "Alterations in the mitochondrial proteome

of neuroblastoma cells in response to complex 1 inhibition." J Proteome Res 10(4): 1974 -1986. Butterfield, D. A., Gnjec, A., Poon, H. F., Castegna, A., Pierce, W. M., Klein, J. B., Martins, R. N. (2006). "Redox

proteomics identification of oxidatively modified brain proteins in inherited Alzheimer's disease: an initial assessment." J Alzheimers Dis 10(4): 391-397.

Calkins, M. J., Reddy, P. H. (2011). "Amyloid beta impairs mitochondrial anterograde transport a nd degenerates

synapses in Alzheimer's disease neurons." Biochim Biophys Acta 1812(4): 507 -513. Cardoso, S. M., Proenca, M. T., Santos, S., Santana, I., Oliveira, C. R. (2004a). "Cytochrome c oxidase is

decreased in Alzheimer's disease platelets." Neurobiol Aging 25(1): 105-110. Cardoso, S. M., Santana, I., Swerdlow, R. H., Oliveira, C. R. (2004b). "Mitochondria dysfunction of Alzheimer's

disease cybrids enhances Abeta toxicity." J Neurochem 89(6): 1417-1426.

114

Casley, C. S., Canevari, L., Land, J. M., Clark, J. B., Sharpe, M. A. (2002). "Beta-amyloid inhibits integrated

mitochondrial respiration and key enzyme activities." J Neurochem 80(1): 91-100. Caspersen, C., Wang, N., Yao, J., Sosunov, A., Chen, X., Lustbader, J. W., Xu, H. W., Stern, D., McKhann, G., Yan,

S. D. (2005). "Mitochondrial Abeta: a potential focal point for neuronal metabolic dysfunction in

Alzheimer's disease." FASEB J 19(14): 2040-2041. Cassidy-Stone, A., Chipuk, J. E., Ingerman, E., Song, C., Yoo, C., Kuwana, T., Kurth, M. J., Shaw, J. T., Hinshaw, J.

E., Green, D. R., Nunnari, J. (2008). "Chemical inhibition of the mitochondrial division dynamin reveals its role in Bax/Bak-dependent mitochondrial outer membrane permeabilization." Dev Cell 14(2): 193 -

204. Castane, A., Theobald, D. E., Robbi ns, T. W. (2010). "Selective lesions of the dorsomedial striatum impair serial

spatial reversal learning in rats." Behav Brain Res 210(1): 74-83.

Cente, M., Fil ipcik, P., Pevalova, M., Novak, M. (2006). "Expression of a truncated tau protein induces oxidat ive stress in a rodent model of tauopathy." Eur J Neurosci 24(4): 1085-1090.

Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. (2009). "Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms." Cell 138(4): 628-644.

Chan, D. C. (2012). "Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health." Annu Rev Genet 46: 265-287.

Chang, E. H., Savage, M. J., Flood, D. G., Thomas, J. M., Levy, R. B., Mahadomrongkul, V., Shirao, T., Aoki, C., Huerta, P. T. (2006). "AMPA receptor downscaling at the onset of Alzheimer's disease pathology in

double knockin mice." Proc Natl Acad Sci U S A 103(9): 3410-3415. Chandrasekaran, K., Hatanpaa, K., Rapoport, S. I., Brady, D. R. (1997). "Decreased expression of nuclear and

mitochondrial DNA-encoded genes of oxidative phosphorylation in association neocortex in Alzheimer

disease." Brain Res Mol Brain Res 44(1): 99-104. Chavez-Gutierrez, L., Bammens, L., Benilova, I., Vandersteen, A., Benurwar, M., Borgers, M., Lismont, S., Zhou,

L., Van Cleynenbreugel, S., Esselmann, H., Wiltfang, J., Serneels, L., Karran, E., Gijsen, H., Schymkowitz, J., Rousseau, F., Broersen, K., De Strooper, B. (2012). "The mechanism of gamma -Secretase

dysfunction in familial Alzheimer disease." EMBO J 31(10): 2261-2274. Chen, F., Hasegawa, H., Schmitt-Ulms, G., Kawarai, T., Bohm, C., Katayama, T., Gu, Y., Sanjo, N., Glista, M.,

Rogaeva, E., Wakutani, Y., Pardossi -Piquard, R., Ruan, X., Tandon, A., Checler, F., Marambaud, P., Hansen, K., Westaway, D., St George-Hyslop, P., Fraser, P. (2006). "TMP21 is a presenilin complex

component that modulates gamma-secretase but not epsilon-secretase activity." Nature 440(7088): 1208-1212.

Chen, H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. (2007). "Mitochondrial fusion protects against neurod egeneration in the

cerebellum." Cell 130(3): 548-562. Chen, J. X., Yan, S. D. (2007). "Amyloid-beta-induced mitochondrial dysfunction." J Alzheimers Dis 12(2): 177-

184. Choi, J., Ravipati, A., Nimmagadda, V., Schubert, M., Castellani, R. J., Russell, J. W. (2014). "Potential roles of

PINK1 for increased PGC-1alpha-mediated mitochondrial fatty acid oxidation and their associations with Alzheimer disease and diabetes." Mitochondrion 18: 41-48.

Chou, J. L., Shenoy, D. V., Thomas, N., Choudhary, P. K., Laferla, F. M., Goodman, S. R., Breen, G. A. (2011).

"Early dysregulation of the mitochondrial proteome in a mouse model of Alzheimer's disease." J Proteomics 74(4): 466-479.

Choudhry, F., Howlett, D. R., Richardson, J. C., Francis, P. T., Will iams, R. J. (2012). "Pro-oxidant diet enhances beta/gamma secretase-mediated APP processing in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging 33(5):

960-968. Chowdhury, A. R., Ghosh, I., Datta, K. (2008). "Excessive reactive oxygen species induces apoptosis in

fibroblasts: role of mitochondrially accumulated hyaluronic acid binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR)." Exp Cell Res 314(3): 651-667.

Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. (2012). "Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network." Proc Natl Acad Sci U S A 109(30): E2077-2082.

Chyung, A. S., Greenberg, B. D., Cook, D. G., Doms, R. W., Lee, V. M. (1997). "Novel beta -secretase cleavage of beta-amyloid precursor protein in the endoplasmic reticulum/intermediate compartment of NT2N cells." J Cell Biol 138(3): 671-680.

Cohen, R. M., Rezai-Zadeh, K., Weitz, T. M., Rentsendorj, A., Gate, D., Spivak, I., Bholat, Y., Vasilevko, V., Glabe,

C. G., Breunig, J. J., Rakic, P., Davtyan, H., Agadjanyan, M. G., Kepe, V., Barrio, J. R., Bannykh, S., Szekely, C. A., Pechnick, R. N., Town, T. (2013). "A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau

115

pathology, behavioral impairment, oligomeric abeta, and frank neuronal loss." J Neurosci 33(15):

6245-6256. Cole, N. B., Dieuliis, D., Leo, P., Mitchell, D. C., Nussbaum, R. L. (2008). "Mitochondrial translocation of alpha-

synuclein is promoted by intracellular acidification." Exp Cell Res 314(10): 2076 -2089.

Colombini, M. (2004). "VDAC: the channel at the interface between mitochondria and the cytosol." Mol Cell Biochem 256-257(1-2): 107-115.

Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. (2001). "beta -Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFalpha-dependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal

apoptosis." J Neurosci 21(4): 1179-1188. Contestabile, A. (2011). "The history of the cholinergic hypothesis." Behav Brain Res 221(2): 334 -340. Cooper, A. J. (2012). "The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in cerebral ammonia

homeostasis." Neurochem Res 37(11): 2439-2455. Cork, L. C., Powers, R. E., Selkoe, D. J., Davies, P., Geyer, J. J., Price, D. L. (1988). "Neurofibril lary tangles and

senile plaques in aged bears." J Neuropathol Exp Neurol 47(6): 629 -641. Cotman, C. W., Head, E. (2008). "The canine (dog) model of human aging and dis ease: dietary, environmental

and immunotherapy approaches." J Alzheimers Dis 15(4): 685-707. Craft, J. M., Watterson, D. M., Van Eldik, L. J. (2006). "Human amyloid beta -induced neuroinflammation is an

early event in neurodegeneration." Glia 53(5): 484-490. Cuadrado-Tejedor, M., Vilarino, M., Cabodevilla, F., Del Rio, J., Frechilla, D., Perez-Mediavil la, A. (2011).

"Enhanced expression of the voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) in Alzheimer's disease transgenic mice: an insight into the pathogenic effects of amyloid-beta." J Alzheimers Dis 23(2): 195-206.

Cummings, J. L., Back, C. (1998). "The cholinergic hypothesis of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease." Am J Geriatr Psychiatry 6(2 Suppl 1): S64-78.

Cummings, B. J., Head, E., Ruehl, W., Milgram, N. W., Cotman, C. W. (1996). "The canine as an animal model of human aging and dementia." Neurobiol Aging 17(2): 259-268.

Dadsetan, S., Bak, L. K., Sorensen, M., Keiding, S., Vilstrup, H., Ott, P., Leke, R., Schousboe, A., Waagepetersen, H. S. (2011). "Inhibition of glutamine synthesis induces glutamate dehydrogenase-dependent ammonia fixation into alanine in co-cultures of astrocytes and neurons." Neurochem Int 59(4): 482-488.

Davey, G. P., Canevari, L., Clark, J. B. (1997). "Threshold effects in synaptosomal and nonsynaptic mitochondria from hippocampal CA1 and paramedian neocortex brain regions." J Neurochem 69(6): 2564 -2570.

Davies, P., Maloney, A. J. (1976). "Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease." Lancet

2(8000): 1403. de la Torre, J. C. (2010). "The vascular hypothesis of Alzheimer's disease: bench to bedside and beyond."

Neurodegener Dis 7(1-3): 116-121. De Vos, K. J., Chapman, A. L., Tennant, M. E., Manser, C., Tudor, E. L., Lau, K. F., Brownlees, J., Ackerley, S.,

Shaw, P. J., McLoughlin, D. M., Shaw, C. E., Leigh, P. N., Miller, C. C., Grierson, A. J. (2007). "Familial amyotrophic lateral sclerosis -l inked SOD1 mutants perturb fast axonal transport to reduce axonal mitochondria content." Hum Mol Genet 16(22): 2720-2728.

Deacon, R. M., Koros, E., Bornemann, K. D., Rawlins, J. N. (2009). "Aged Tg2576 mice are impaired on social memory and open field habituation tests." Behav Brain Res 197(2): 466 -468.

Delatour, B., Guegan, M., Volk, A., Dhenain, M. (2006). "In vivo MRI and histological evaluation of brain atrophy in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging 27(6): 835-847.

Devi, L., Prabhu, B. M., Galati, D. F., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. (2006). "Accumulation of amyloid precursor protein in the mitochondrial import channels of human Alzheimer's disease brain is associated with mitochondrial dysfunction." J Neurosci 26(35): 9057 -9068.

Ding, Y., Qiao, A., Wang, Z., Goodwin, J. S., Lee, E. S., Block, M. L., Allsbrook, M., McDonald, M. P., Fan, G. H.

(2008). "Retinoic acid attenuates beta-amyloid deposition and rescues memory deficits in an Alzheimer's disease transgenic mouse model." J Neurosci 28(45): 11622 -11634.

Doecke, J. D., Laws, S. M., Faux, N. G., Wilson, W., Burnham, S. C., Lam, C. P., Mondal , A., Bedo, J., Bush, A. I.,

Brown, B., De Ruyck, K., Ell is, K. A., Fowler, C., Gupta, V. B., Head, R., Macaulay, S. L., Pertile, K., Rowe, C. C., Rembach, A., Rodrigues, M., Rumble, R., Szoeke, C., Taddei, K., Taddei, T., Trounson, B., Ames, D., Masters, C. L., Martins, R. N. (2012). "Blood-based protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer disease." Arch Neurol 69(10): 1318-1325.

Dournaud, P., Delaere, P., Hauw, J. J., Epelbaum, J. (1995). "Differential correlation between neurochemical deficits, neuropathology, and cognitive status in Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 16(5): 817 -823.

116

Dragicevic, N., Mamcarz, M., Zhu, Y., Buzzeo, R., Tan, J., Arendash, G. W., Bradshaw, P. C. (2010).

"Mitochondrial amyloid-beta levels are associated with the extent of mitochondrial dysfunction in different brain regions and the degree of cognitive impairment in Alzheimer's transgenic mice." J Alzheimers Dis 20 Suppl 2: S535-550.

Du, H., Guo, L., Fang, F., Chen, D., Sosunov, A. A., McKhann, G. M., Yan, Y., Wang, C., Zhang, H., Molkentin, J. D., Gunn-Moore, F. J., Vonsattel, J. P., Arancio, O., Chen, J. X., Yan, S. D. (2008). "Cyclophilin D deficiency attenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memory in Alzheimer's disease." Nat Med 14(10): 1097-1105.

Du, H., Guo, L., Yan, S., Sosunov, A. A., McKhann, G. M., Yan, S. S. (2010). "Early deficits in synaptic mitochondria in an Alzheimer's disease mouse model." Proc Natl Acad Sci U S A 107(43): 18670 -18675.

Du, H., Guo, L., Zhang, W., Rydzewska, M., Yan, S. (2011). "Cyclophilin D deficiency improves mitochondrial

function and learning/memory in aging Alzheimer disease mouse model." Neurobiol Aging 32(3): 398 -406.

Dumont, M., Ho, D. J., Calingasan, N. Y., Xu, H., Gibson, G., Beal, M. F. (2009). "Mitochondrial dihydrolipoyl succinyltransferase deficiency accelerates amyloid pathology and memory deficit in a transgenic

mouse model of amyloid deposition." Free Radic Biol Med 47(7): 1019 -1027. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Heath, J. W., Kidd, G. J., Rostas, J. A. (1986). "A rapid method for isolation of

synaptosomes on Percoll gradients." Brain Res 372(1): 115-129. Eaton, S. L., Roche, S. L., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K. J., Farquharson, C., Gill ingwater, T. H., Wishart, T. M.

(2013). "Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting." PLoS One 8(8): e72457.

Echeverria, V., Ducatenzeiler, A., Alhonen, L., Janne, J., Grant, S. M., Wandosell, F., Muro, A., Baralle, F., Li, H.,

Duff, K., Szyf, M., Cuello, A. C. (2004). "Rat transgenic models with a phenotype of intracellular Abeta accumulation in hippocampus and cortex." J Alzheimers Dis 6(3): 209-219.

Echeverria, V., Ducatenzeiler, A., Chen, C. H., Cuello, A. C. (2005). "Endogenous beta-amyloid peptide synthesis modulates cAMP response element-regulated gene expression in PC12 cells." Neuroscience 135(4):

1193-1202. Eckert, A., Hauptmann, S., Scherping, I., Rhein, V., Muller-Spahn, F., Gotz, J., Muller, W. E. (2008). "Soluble beta-

amyloid leads to mitochondrial defects in amyloid precursor protein and tau transgenic mice." Neurodegener Dis 5(3-4): 157-159.

Ell is, C. E., Murphy, E. J., Mitchell, D. C., Golovko, M. Y., Scaglia, F., Barcelo-Coblijn, G. C., Nussbaum, R. L. (2005). "Mitochondrial l ipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking alpha-synuclein." Mol Cell Biol 25(22): 10190-10201.

Emerit, J., Edeas, M., Bricaire, F. (2004). "Neurodegenerative diseases and oxidative stress." Biomed Pharmacother 58(1): 39-46.

Enns, G. M., Kinsman, S. L., Perlman, S. L., Spicer, K. M., Abdenur, J. E., Cohen, B. H., Amagata, A., Barnes, A., Kheifets, V., Shrader, W. D., Thoolen, M., Blankenberg, F., Miller, G. (2012). "Initial experience in the

treatment of inherited mitochondrial disease with EPI-743." Mol Genet Metab 105(1): 91-102. Erecinska, M., Cherian, S., Si lver, I. A. (2004). "Energy metabolism in mammalian brain during development."

Prog Neurobiol 73(6): 397-445.

Erickson, C. A., Barnes, C. A. (2003). "The neurobiology of memory changes in normal aging." Exp Gerontol 38(1-2): 61-69.

Falkevall, A., Alikhani, N., Bhushan, S., Pavlov, P. F., Busch, K., Johnson, K. A., Eneqvist, T., Tjernberg, L., Ankarcrona, M., Glaser, E. (2006). "Degradation of the amyloid beta -protein by the novel

mitochondrial peptidasome, PreP." J Biol Chem 281(39): 29096-29104. Feldmann, M., Maini, R. N. (2003). "Lasker Clinical Medical Research Award. TNF defined as a therapeutic target

for rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases." Nat Med 9(10): 1245 -1250. Finder, V. H., Glockshuber, R. (2007). "Amyloid-beta aggregation." Neurodegener Dis 4(1): 13-27.

Fisher, N. J., Rourke, B. P., Bieliauskas, L. A., Giordani, B., Berent, S., Foster, N. L. (1997). "Unmasking the heterogeneity of Alzheimer's disease: case studies of individuals from distinct neuropsychological subgroups." J Clin Exp Neuropsychol 19(5): 713-754.

Fladby, T., Maehlen, J. (1999). "[The amyloid and tau hypothesis in degenerative dementia]." Tidsskr Nor Laegeforen 119(7): 976-979.

Fonseca, M. I., Zhou, J., Botto, M., Tenner, A. J. (2004). "Absence of C1q leads to less neuropathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease." J Neurosci 24(29): 6457 -6465.

117

Fougner, S. L., Bollerslev, J., Latif, F., Hald, J. K., Lund, T., Ramm-Pettersen, J., Berg, J. P. (2008). "Low levels of

raf kinase inhibitory protein in growth hormone-secreting pituitary adenomas correlate with poor response to octreotide treatment." J Clin Endocrinol Metab 93(4): 1211 -1216.

Francis, P. T., Palmer, A. M., Snape, M., Wilcock, G. K. (1999). "The cholinergic hypothesis of Alzheimer's

disease: a review of progress." J Neurol Neurosurg Psychiatry 66(2): 137 -147. Frautschy, S. A., Yang, F., Calderon, L., Cole, G. M. (1996). "Rodent models of Alzheimer's disease: rat A beta

infusion approaches to amyloid deposits." Neurobiol Aging 17(2): 311 -321. Frieden, C. (2007). "Protein aggregation processes: In search of the mechanism." Protein Sci 16(11): 2334-2344.

Friedland, R. P., Koss, E., Haxby, J. V., Grady, C. L., Luxenberg, J., Schapiro, M. B., Kaye, J. (1988). "NIH conference. Alzheimer disease: clinical and biological heterogeneity." Ann Intern Med 109(4): 298 -311.

Games, D., Adams, D., Alessandrini, R., Barbour, R., Berthelette, P., Blackwell, C., Carr, T., Clemens, J.,

Donaldson, T., Gillespie, F., et al. (1995). "Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein." Nature 373(6514): 523-527.

Gan, X., Wu, L., Huang, S., Zhong, C., Shi, H., Li, G., Yu, H., Howard Swerdlow, R., X i Chen, J., Yan, S. S. (2014). "Oxidative stress-mediated activation of extracellular signal -regulated kinase contributes to mild

cognitive impairment-related mitochondrial dysfunction." Free Radic Biol Med 75C: 230-240. Gardiol, A., Racca, C., Tril ler, A. (2001). "RNA transport and local protein synthesis in the dendritic

compartment." Results Probl Cell Differ 34: 105-128. Gatto, L., Vizcaino, J. A., Hermjakob, H., Huber, W., Lil ley, K. S. (2010). "Organelle proteomics experimental

designs and analysis." Proteomics 10(22): 3957-3969. Gearing, M., Tigges, J., Mori, H., Mirra, S. S. (1997). "beta-Amyloid (A beta) deposition in the brains of aged

orangutans." Neurobiol Aging 18(2): 139-146.

George, A. J., Gordon, L., Beissbarth, T., Koukoulas, I., Holsinger, R. M., Perreau, V., Cappai, R., Tan, S. S., Masters, C. L., Scott, H. S., Li, Q. X. (2010). "A serial analysis of gene expression profile of the Alzheimer's disease Tg2576 mouse model." Neurotox Res 17(4): 360-379.

George, A. J., Holsinger, R. M., McLean, C. A., Tan, S. S., Scott, H. S., Cardamone, T., Cappai, R., Masters, C. L., Li,

Q. X. (2006). "Decreased phosphatidylethanolamine binding protein expression correlates with Abeta accumulation in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 27(4): 614 -623.

Ghanbari, H. A., Ghanbari, K., Harris, P. L., Jones, P. K., Kubat, Z., Castellani, R. J., Wolozin, B. L., Smith, M. A., Perry, G. (2004). "Oxidative damage in cultured human olfactory neurons from Alzheimer's disease

patients." Aging Cell 3(1): 41-44. Ghebrehiwet, B., Lim, B. L., Kumar, R., Feng, X., Peerschke, E. I. (2001). "gC1q-R/p33, a member of a new class

of multifunctional and multicompartmental cellular proteins, is involved in inflammation and

infection." Immunol Rev 180: 65-77. Gibson, G. E., Blass, J. P., Beal, M. F., Bunik, V. (2005). "The alpha-ketoglutarate-dehydrogenase complex: a

mediator between mitochondria and oxidative stress in neurodegeneration." Mol Neurobiol 31(1-3): 43-63.

Gibson, G. E., Sheu, K. F., Blass, J. P. (1998). "Abnormalities of mitochondrial enzymes in Alzheimer disease." J Neural Transm 105(8-9): 855-870.

Gillardon, F., Rist, W., Kussmaul, L., Vogel, J., Berg, M., Danzer, K., Kraut, N., Hengerer, B. (2007). "Proteomic

and functional alterations in brain mitochondria from Tg2576 mice occur before amyloid plaque deposition." Proteomics 7(4): 605-616.

Gimbel, D. A., Nygaard, H. B., Coffey, E. E., Gunther, E. C., Lauren, J., Gimbel, Z. A., Strittmatter, S. M. (2010). "Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein." J Neurosci 30(18):

6367-6374. Gioio, A. E., Eyman, M., Zhang, H., Lavina, Z. S., Giuditta, A., Kaplan, B. B. (2001). "Local synthesis of nuclear -

encoded mitochondrial proteins in the presynaptic nerve terminal." J Neurosci Res 64(5): 447-453. Giuditta, A., Kaplan, B. B., van Minnen, J., Alvarez, J., Koenig, E. (2002). "Axonal and presynaptic protein

synthesis: new insights into the biology of the neuron." Trends Neurosci 25(8): 400-404. Glenn, M. J., Nesbitt, C., Mumby, D. G. (2003). "Perirhinal cortex lesions produce variable patterns of

retrograde amnesia in rats." Behav Brain Res 141(2): 183-193.

Glenner, G. G., Wong, C. W. (1984). "Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein." Biochem Biophys Res Commun 120(3): 885 -890.

Gong, Y., Chang, L., Viola, K. L., Lacor, P. N., Lambert, M. P., Finch, C. E., Krafft, G. A., Klein, W. L. (2003). "Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta l igands (ADDLs) suggests a

molecular basis for reversible memory loss." Proc Natl Acad Sci U S A 100(18): 10417-10422.

118

Gong, Y., Meyer, E. M., Meyers, C. A., Klein, R. L., King, M. A., Hughes, J. A. (2006). "Memory-related deficits

following selective hippocampal expression of Swedish mutation amyloid precursor protein in the rat." Exp Neurol 200(2): 371-377.

Gotz, J., Deters, N., Doldissen, A., Bokhari, L., Ke, Y., Wiesner, A., Schonrock, N., Ittner, L. M. (2007). "A decade

of tau transgenic animal models and beyond." Brain Pathol 17(1): 91 -103. Gotz, J., Schild, A., Hoerndli, F., Pennanen, L. (2004). "Amyloid-induced neurofibril lary tangle formation in

Alzheimer's disease: insight from transgenic mouse and tissue-culture models." Int J Dev Neurosci 22(7): 453-465.

Gray, J. A., McNaughton, N. (1983). "Comparison between the behavioural effects of septal and hippocampal lesions: a review." Neurosci Biobehav Rev 7(2): 119-188.

Gray, C. W., Ward, R. V., Karran, E., Turconi, S., Rowles, A., Viglienghi, D., Southan, C., Barton, A., Fantom, K. G.,

West, A., Savopoulos, J., Hassan, N. J., Clinkenbeard, H., Hanning, C., Amegadzie, B., Davis, J. B., Dingwall, C., Livi, G. P., Creasy, C. L. (2000). "Characterization of human HtrA2, a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response." Eur J Biochem 267(18): 5699 -5710.

Gray, E. G., Whittaker, V. P. (1962). "The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of

cell fragments derived by homogenization and centrifugation." J Anat 96: 79 -88. Guix, F. X., Il l -Raga, G., Bravo, R., Nakaya, T., de Fabriti is, G., Coma, M., Mis cione, G. P., Vil la-Freixa, J., Suzuki,

T., Fernandez-Busquets, X., Valverde, M. A., de Strooper, B., Munoz, F. J. (2009). "Amyloid-dependent triosephosphate isomerase nitrotyrosination induces glycation and tau fibril lation." Brain 132(Pt 5):

1335-1345. Gunn-Moore, D. A., McVee, J., Bradshaw, J. M., Pearson, G. R., Head, E., Gunn-Moore, F. J. (2006). "Ageing

changes in cat brains demonstrated by beta -amyloid and AT8-immunoreactive phosphorylated tau

deposits." J Feline Med Surg 8(4): 234-242. Guo, C., Wang, T., Zheng, W., Shan, Z. Y., Teng, W. P., Wang, Z. Y. (2013a). "Intranasal deferoxamine reverses

iron-induced memory deficits and inhibits amyloidogenic APP processing in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 34(2): 562-575.

Guo, L., Du, H., Yan, S., Wu, X., McKhann, G. M., Chen, J. X., Yan, S. S. (2013b). "Cyclophilin D deficiency rescues axonal mitochondrial transport in Alzheimer's neurons." PLoS One 8(1): e54914.

Gupta, S., Singh, R., Datta, P., Zhang, Z., Orr, C., Lu, Z., Dubois, G., Zervos, A. S., Meisler, M. H., Srinivasula, S. M., Fernandes-Alnemri, T., Alnemri, E. S. (2004). "The C-terminal tail of presenilin regulates Omi/HtrA2

protease activity." J Biol Chem 279(44): 45844-45854. Gyorffy, B., Kovacs, Z., Gulyassy, P., Simor, A., Volgyi, K., Orban, G., Baracskay, P., Szabo, Z., Janaky, T., Dobolyi,

A., Juhasz, G., Czurko, A., Kekesi, K. A. (2013). "Brain protein expression changes in WAG/Rij rats, a

genetic rat model of absence epilepsy after peripheral l ipopolysaccharide treatment." Brain Behav Immun.

Hall, C. N., Klein-Flugge, M. C., Howarth, C., Attwell, D. (2012). "Oxidative phosphorylation, not glycolysis, powers presynaptic and postsynaptic mechanisms underlying brain information processing." J

Neurosci 32(26): 8940-8951. Hammerschmidt, T., Kummer, M. P., Terwel, D., Martinez, A., Gorji, A., Pape, H. C., Rommelfanger, K. S.,

Schroeder, J. P., Stoll, M., Schultze, J., Weinshenker, D., Heneka, M. T. (2013). "Selective loss of

noradrenaline exacerbates early cogniti ve dysfunction and synaptic deficits in APP/PS1 mice." Biol Psychiatry 73(5): 454-463.

Hamilton, R. L. (2000). "Lewy bodies in Alzheimer's disease: a neuropathological review of 145 cases using alpha-synuclein immunohistochemistry." Brain Pathol 10(3): 378-384.

Hamilton, A., Holscher, C. (2012). "The effect of ageing on neurogenesis and oxidative stress in the APP(swe)/PS1(deltaE9) mouse model of Alzheimer's disease." Brain Res 1449: 83 -93.

Hansson Petersen, C. A., Alikhani, N., Behbahani, H., Wiehager, B., Pavlov, P. F., Alafuzoff, I., Leinonen, V., Ito, A., Winblad, B., Glaser, E., Ankarcrona, M. (2008). "The amyloid beta -peptide is imported into

mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae." Proc Natl Acad Sci U S A 105(35): 13145-13150.

Hardy, J., Allsop, D. (1991). "Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease."

Trends Pharmacol Sci 12(10): 383-388. Hardy, J., Selkoe, D. J. (2002). "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progr ess and problems on the

road to therapeutics." Science 297(5580): 353-356. Harkany, T., Abraham, I., Timmerman, W., Laskay, G., Toth, B., Sasvari, M., Konya, C., Sebens, J. B., Korf, J.,

Nyakas, C., Zarandi, M., Soos, K., Penke, B., Luiten, P. G. (2000). "beta-amyloid neurotoxicity is

119

mediated by a glutamate-triggered excitotoxic cascade in rat nucleus basalis." Eur J Neurosci 12(8):

2735-2745. Harkany, T., O'Mahony, S., Kelly, J. P., Soos, K., Toro, I., Penke, B., Luiten, P. G., Nyakas, C., Gulya, K., Leon ard, B.

E. (1998). "Beta-amyloid(Phe(SO3H)24)25-35 in rat nucleus basalis induces behavioral dysfunctions,

impairs learning and memory and disrupts cortical cholinergic innervation." Behav Brain Res 90(2): 133-145.

Harrison, P. M., Kumar, A., Lang, N., Snyder, M., Gerstein, M. (2002). "A question of size: the eukaryotic proteome and the problems in defining it." Nucleic Acids Res 30(5): 1083 -1090.

Hassel, B. (2000). "Carboxylation and anaplerosis in neurons and glia." Mol Neurobiol 22(1-3): 21-40. Hattingen, E., Magerkurth, J., Pilatus, U., Mozer, A., Seifried, C., Steinmetz, H., Zanella, F., Hilker, R. (2009).

"Phosphorus and proton magnetic resonance spectroscopy demonstrates mitochondrial dysfunction

in early and advanced Parkinson's disease." Brain 132(Pt 12): 3285-3297. Hauss-Wegrzyniak, B., Lukovic, L., Bigaud, M., Stoeckel, M. E. (1998). "Brain inflammatory response induced by

intracerebroventricular infusion of l ipopolysaccharide: an immunohistochemical study." Brain Res 794(2): 211-224.

Head, E., Moffat, K., Das, P., Sarsoza, F., Poon, W. W., Landsberg, G., Cotman, C. W., Murphy, M. P. (2005). "Beta-amyloid deposition and tau phosphorylation in clinically characterized aged cats." Neurobiol Aging 26(5): 749-763.

Hebb, C. O., Whittaker, V. P. (1958). "Intracellular distributions of acetylcholine and choline acetylase." J Physiol

142(1): 187-196. Hernandez-Zimbron, L. F., Luna-Munoz, J., Mena, R., Vazquez-Ramirez, R., Kubli -Garfias, C., Cribbs, D. H.,

Manoutcharian, K., Gevorkian, G. (2012). "Amyloid-beta peptide binds to cytochrome C oxidase

subunit 1." PLoS One 7(8): e42344. Hertz, L., Kala, G. (2007). "Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia concentrations."

Metab Brain Dis 22(3-4): 199-218. Hetz, C., Mollereau, B. (2014). "Disturbance of endoplasmic reticulum proteostasis in neurodegenerative

diseases." Nat Rev Neurosci 15(4): 233-249. Higashitsuji, H., Masuda, T., Liu, Y., Itoh, K., Fujita, J. (2007). "Enhanced deacetylation of p53 by the anti -

apoptotic protein HSCO in association with histone deacetylase 1." J Biol Chem 282(18): 13716-13725. Higashitsuji, H., Nagao, T., Nonoguchi, K., Fujii , S., Itoh, K., Fujita, J. (2002). "A novel protein overexpressed in

hepatoma accelerates export of NF-kappa B from the nucleus and inhibits p53-dependent apoptosis." Cancer Cell 2(4): 335-346.

Hillefors, M., Gioio, A. E., Mameza, M. G., Kaplan, B. B. (2007). "Axon viability and mitochondrial function are

dependent on local protein synthesis in sympathetic neurons." Cell Mol Neurobiol 27(6): 701 -716. Hirai, K., Aliev, G., Nunomura, A., Fujioka, H., Russell, R. L., Atwood, C. S., Johnson, A. B., Kress, Y., Vinters, H. V.,

Tabaton, M., Shimohama, S., Cash, A. D., Siedlak, S. L., Harris, P. L., Jones, P. K., Petersen, R. B., Perry, G., Smith, M. A. (2001). "Mitochondrial abnormalities in Alzheimer's disease." J Neurosci 21(9): 3017 -

3023. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. (2010). "Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in

brain function, development, and disease." Neuron 68(4): 610-638.

Hollenbeck, P. J. (1996). "The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons." Front Biosci 1: d91 -102.

Hollenbeck, P. J. (2005). "Mitochondria and neurotransmission: evacuating the synapse." Neuron 47(3): 331 -333.

Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. (2005). "The axonal transport of mitochondria." J Cell Sci 118(Pt 23): 5411 -5419.

Hongpaisan, J., Sun, M. K., Alkon, D. L. (2011). "PKC epsilon activation prevents synaptic loss, Abeta elevation, and cognitive deficits in Alzheimer's disease transgenic mice." J Neurosci 31(2): 630-643.

Hooijmans, C. R., Graven, C., Dederen, P. J., Tanila, H., van Groen, T., Kil iaan, A. J. (2007). "Amyloid beta deposition is related to decreased glucose transporter-1 levels and hippocampal atrophy in brains of aged APP/PS1 mice." Brain Res 1181: 93-103.

Hrnkova, M., Zilka, N., Minichova, Z., Koson, P., Novak, M. (2007). "Neurodegeneration caused by expression of human truncated tau leads to progressive neurobehavioural impairment in transgenic rats." Brain Res 1130(1): 206-213.

Hroudova, J., Singh, N., Fisar, Z. (2014). "Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases: relevance

to Alzheimer's disease." Biomed Res Int 2014: 175062.

120

Hsiao, K., Chapman, P., Nilsen, S., Eckman, C., Harigaya, Y., Younkin, S., Yang, F., Cole, G. (1996). "Correlative

memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice." Science 274(5284): 99 -102.

Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. (2003). "Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in

proteomics." Circ Res 92(9): 962-968. Huntley, J. D., Howard, R. J. (2010). "Working memory in early Alzheimer's disease: a neuropsychological

review." Int J Geriatr Psychiatry 25(2): 121-132. Hur, J. Y., Teranishi, Y., Kihara, T., Yamamoto, N. G., Inoue, M., Hosia, W., Hashimoto, M., Winblad, B., Frykman,

S., Tjernberg, L. O. (2012). "Identification of novel gamma -secretase-associated proteins in detergent-resistant membranes from brain." J Biol Chem 287(15): 11991-12005.

Hussain, I., Powell, D., Howlett, D. R., Tew, D. G., Meek, T. D., Chapman, C., Gloger, I. S., Murphy, K. E., Southan,

C. D., Ryan, D. M., Smith, T. S., Simmons, D. L., Walsh, F. S., Dingwall, C., Christie, G. (1999). "Identification of a novel aspartic protease (Asp 2) as beta -secretase." Mol Cell Neurosci 14(6): 419-427.

Irwin, D. J., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. (2013). "Parkinson's disease dementia: convergence of alpha -

synuclein, tau and amyloid-beta pathologies." Nat Rev Neurosci 14(9): 626-636. Ishrat, T., Hoda, M. N., Khan, M. B., Yousuf, S., Ahmad, M., Khan, M. M., Ahmad, A., Islam, F. (2009).

"Amelioration of cognitive deficits and neurodegeneration by curcumin in rat model of sporadic dementia of Alzheimer's type (SDAT)." Eur Neuropsychopharmacol 19(9): 636 -647.

Iwai, A., Masl iah, E., Yoshimoto, M., Ge, N., Flanagan, L., de Silva, H. A., Kittel, A., Saitoh, T. (1995). "The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system." Neuron 14(2): 467-475.

Iwatsubo, T. (2004). "The gamma-secretase complex: machinery for intramembrane proteolysis." Curr Opin Neurobiol 14(3): 379-383.

Jankowsky, J. L., Fadale, D. J., Anderson, J., Xu, G. M., Gonzales, V., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Lee, M. K., Younkin, L. H., Wagner, S. L., Younkin, S. G., Borchelt, D. R. (2004). "Mutant presenilins specifically

elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase." Hum Mol Genet 13(2): 159-170.

Janocko, N. J., Brodersen, K. A., Soto-Ortolaza, A. I., Ross, O. A., Liesinger, A. M., Duara, R., Graff-Radford, N. R., Dickson, D. W., Murray, M. E. (2012). "Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease

differ significantly from neurofibril lary tangle-predominant dementia." Acta Neuropathol 124(5): 681-692.

Jardanhazi-Kurutz, D., Kummer, M. P., Terwel, D., Vogel, K., Thiele, A., Heneka, M. T. (2011). "Distinct

adrenergic system changes and neuroinflammation in response to induced locus ceruleus degeneration in APP/PS1 transgenic mice." Neuroscience 176: 396-407.

Jell inger, K. A., Alafuzoff, I., Attems, J., Beach, T. G., Cairns, N. J., Crary, J. F., Dickson, D. W., Hof, P. R., Hyman, B. T., Jack, C. R., Jr., Jicha, G. A., Knopman, D. S., Kovacs, G. G., Mackenzie, I. R., Masliah, E., Montine, T.

J., Nelson, P. T., Schmitt, F., Schneider, J. A., Serrano-Pozo, A., Thal, D. R., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Troncoso, J. C., Vonsattel, J. P., Wisniewski, T. (2015). "PART, a distinct tauopathy, differen t from classical sporadic Alzheimer disease." Acta Neuropathol.

Jell inger, K. A., Attems, J. (2012). "Neuropathology and general autopsy findings in nondemented aged subjects." Clin Neuropathol 31(2): 87-98.

Johnson, D. T., Harris, R. A., Blair, P. V., Bal aban, R. S. (2007). "Functional consequences of mitochondrial proteome heterogeneity." Am J Physiol Cell Physiol 292(2): C698-707.

Jomova, K., Vondrakova, D., Lawson, M., Valko, M. (2010). "Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders." Mol Cel l Biochem 345(1-2): 91-104.

Kann, O., Kovacs, R. (2007). "Mitochondria and neuronal activity." Am J Physiol Cell Physiol 292(2): C641 -657. Kaplan, B. B., Gioio, A. E., Hil lefors, M., Aschrafi, A. (2009). "Axonal protein synthesis and the regulation of loca l

mitochondrial function." Results Probl Cell Differ 48: 225-242. Kawamoto, Y., Ito, H., Kobayashi, Y., Suzuki, Y., Takahashi, R. (2010). "Localization of HtrA2/Omi

immunoreactivity in brains affected by Alzheimer's disease." Neuroreport 21(17): 1121-1125.

Keil, U., Hauptmann, S., Bonert, A., Scherping, I., Eckert, A., Muller, W. E. (2006). "Mitochondrial dysfunction induced by disease relevant AbetaPP and tau protein mutations." J Alzheimers Dis 9(2): 139 -146.

Keller, J. N., Lauderback, C. M., Butterfield, D. A., Kindy, M. S., Yu, J., Markesbery, W. R. (2000). "Amyloid beta -peptide effects on synaptosomes from apolipoprotein E-deficient mice." Journal of Neurochemistry

74(4): 1579-1586.

121

Kim, I., Xu, W., Reed, J. C. (2008). "Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and

therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 7(12): 1013-1030. Kim, S. H., Fountoulakis, M., Cairns, N. J., Lubec, G. (2002). "Human brain nucleoside diphosphate kinase

activity is decreased in Alzheimer's disease and Down syndrome." Biochem Biophys Res Commun

296(4): 970-975. Kim, S. H., Vlkolinsky, R., Cairns, N., Fountoulakis, M., Lubec, G. (2001). "The reduction of NADH ubiquinone

oxidoreductase 24- and 75-kDa subunits in brains of patients with Down syndrome and Alzheimer's disease." Life Sci 68(24): 2741-2750.

Kim, W. S., Kagedal, K., Halliday, G. M. (2014). "Alpha -synuclein biology in Lewy body diseases." Alzheimers Res Ther 6(5): 73.

Kimura, R., Devi, L., Ohno, M. (2010). "Partial reduction of BACE1 improves synaptic plasticity, recent and

remote memories in Alzheimer's disease transgenic mice." J Neurochem 113(1): 248 -261. King, J. S. (1988). "Chemical synapses in the mammalian central nervous system: an introduction." J Electron

Microsc Tech 10(2): 205-210. Kish, S. J., Bergeron, C., Rajput, A., Dozic, S., Mastrogiacomo, F., Chang, L. J., Wilson, J. M., DiStefano, L. M.,

Nobrega, J. N. (1992). "Brain cytochrome oxidase in Alzheimer's disease." J Neurochem 59(2): 776-779. Kittel, R. J., Hallermann, S., Thomsen, S., Wichmann, C., Sigrist, S. J., Heckmann, M. (2006). "Active zone

assembly and synaptic release." Biochem Soc Trans 34(Pt 5): 939-941. Klegeris, A., Walker, D. G., McGeer, P. L. (1997). "Interaction of Alzheimer beta -amyloid peptide with the

human monocytic cell l ine THP-1 results in a protein kinase C-dependent secretion of tumor necrosis factor-alpha." Brain Res 747(1): 114-121.

Kloskowska, E., Pham, T. M., Nilsson, T., Zhu, S., Oberg, J., Codita, A., Pedersen, L. A., Pedersen, J. T.,

Malkiewicz, K., Winblad, B., Folkesson, R., Benedikz, E. (2010). "Cognitive impairment in the Tg6590 transgenic rat model of Alzheimer's disease." J Cell Mol Med 14(6B): 1816 -1823.

Klyubin, I., Betts, V., Welzel, A. T., Blennow, K., Zetterberg, H., Wallin, A., Lemere, C. A., Cullen, W. K., Peng, Y., Wisniewski, T., Selkoe, D. J., Anwyl, R., Walsh, D. M., Rowan, M. J. (2008). "Amyloid beta protein

dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity: prevention by systemic passive immunization." J Neurosci 28(16): 4231-4237.

Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. (2008). "Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration." Nat Rev Neurosci 9(7): 505-518.

Kooistra, J., Milojevic, J., Melacini, G., Ortega, J. (2009). "A new function of human HtrA2 a s an amyloid-beta oligomerization inhibitor." J Alzheimers Dis 17(2): 281-294.

Koson, P., Zilka, N., Kovac, A., Kovacech, B., Korenova, M., Fil ipcik, P., Novak, M. (2008). "Truncated tau

expression levels determine life span of a rat model of tauopathy without causing neuronal loss or correlating with terminal neurofibril lary tangle load." Eur J Neurosci 28(2): 239 -246.

Kovács, G. (2014). "Current concepts of neurodegenerative disease." EMJ Neurology: 1:78 -86. Krapfenbauer, K., Engidawork, E., Cairns, N., Fountoulakis, M., Lubec, G. (2003). "Aberrant expression of

peroxiredoxin subtypes in neurodegenerative disorders." Brain Res 967(1 -2): 152-160. Kristian, T. (2010). "Isolation of mitochondria from the CNS." Curr Protoc Neurosci Chapter 7: Unit 7 22. Kudin, A. P., Kudina, T. A., Seyfried, J., Vielhaber, S., Beck, H., Elger, C. E., Kunz, W. S. (2002). "Seizure-

dependent modulation of mitochondrial oxidative phosphorylation in rat hippocampus." Eur J Neurosci 15(7): 1105-1114.

Kuninaka, S., Iida, S. I., Hara, T., Nomura, M., Naoe, H., Morisaki, T., Nitta, M., Arima, Y., Mimori, T., Yonehara, S., Saya, H. (2007). "Serine protease Omi/HtrA2 targets WARTS kinase to control cell proliferation."

Oncogene 26(17): 2395-2406. Kurt, M. A., Davies, D. C., Kidd, M., Duff, K., Howlett, D. R. (2003). "Hyperphosphorylated tau and paired helical

fi lament-like structures in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes." Neurobiol Dis 14(1): 89-97.

Kurt, M. A., Davies, D. C., Kidd, M., Duff, K., Rolph, S. C., Jennings, K. H., Howlett, D. R. (2001). "Neurodegenerative changes associated with beta -amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes." Exp Neurol 171(1): 59-71.

Lacor, P. N., Buniel, M. C., Chang, L., Fernandez, S. J., Gong, Y., Viola, K. L., Lambert, M. P., Velasco, P. T., Bigio, E. H., Finch, C. E., Krafft, G. A., Klein, W. L. (2004). "Synaptic targeting by Alzheimer's -related amyloid beta oligomers." J Neurosci 24(45): 10191-10200.

Lacor, P. N., Buniel, M. C., Furlow, P. W., Clemente, A. S., Velasco, P. T., Wood, M., Viola, K. L., Klein, W. L.

(2007). "Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease." J Neurosci 27(4): 796 -807.

122

LaFerla, F. M., Green, K. N., Oddo, S. (2007). "Intracellular amyloid-beta in Alzheimer's disease." Nat Rev

Neurosci 8(7): 499-509. Lagadec, S., Rotureau, L., Hemar, A., Macrez, N., Delcasso, S., Jeantet, Y., Cho, Y. H. (2012). "Early temporal

short-term memory deficits in double transgenic APP/PS1 mice." Neurobiol Aging 33(1): 203 e201 -211.

Lai, A., Sisodia, S. S., Trowbridge, I. S. (1995). "Characterization of sorting signals in the beta-amyloid precursor protein cytoplasmic domain." J Biol Chem 270(8): 3565-3573.

Lam, B., Masellis, M., Freedman, M., Stuss, D. T., Black, S. E. (2013). "Clinical, imaging, and pathological heterogeneity of the Alzheimer's disease syndrome." Alzheimers Res Ther 5(1): 1.

Lammich, S., Kojro, E., Postina, R., Gilbert, S., Pfeiffer, R., Jasionowski, M., Haass, C., Fahrenholz, F. (1999). "Constitutive and regulated alpha-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by a disintegrin metalloprotease." Proc Natl Acad Sci U S A 96(7): 3922-3927.

Larson, M. E., Sherman, M. A., Greimel, S., Kuskowski, M., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Lesne, S. E. (2012). "Soluble alpha-synuclein is a novel modulator of Alzheimer's disease pathophysiology." J Neurosci 32(30): 10253-10266.

Lee, S. H., Kim, K. R., Ryu, S. Y., Son, S., Hong, H. S., Mook-Jung, I., Ho, W. K. (2012). "Impaired short-term

plasticity in mossy fiber synapses caused by mitochondrial dysfunction of dentate granule cells is the earliest synaptic deficit in a mouse model of Alzheimer's disease." J Neurosci 32(17): 5953-5963.

Leenders, K. L., Frackowiak, R. S., Quinn, N., Marsden, C. D. (1986). "Brain energy metabolism and dopaminergic function in Huntington's disease measured in vivo using positron emission tomography."

Mov Disord 1(1): 69-77. Leyssen, M., Ayaz, D., Hebert, S. S., Reeve, S., De Strooper, B., Hassan, B. A. (2005). "Amyloid precursor protein

promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain." EMBO J 24(16): 2944 -

2955. Leon, W. C., Canneva, F., Partridge, V., Allard, S., Ferretti, M. T., DeWilde, A., Vercauteren, F., Atifeh , R.,

Ducatenzeiler, A., Klein, W., Szyf, M., Alhonen, L., Cuello, A. C. (2010). "A novel transgenic rat model with a full Alzheimer's-l ike amyloid pathology displays pre-plaque intracellular amyloid-beta-

associated cognitive impairment." J Alzheimers Dis 20(1): 113-126. Leroy, K., Ando, K., Laporte, V., Dedecker, R., Suain, V., Authelet, M., Heraud, C., Pierrot, N., Yilmaz, Z., Octave,

J. N., Brion, J. P. (2012). "Lack of tau proteins rescues neuronal cell death and decreases amyloidogenic processing of APP in APP/PS1 mice." Am J Pathol 181(6): 1928-1940.

Li, F., Calingasan, N. Y., Yu, F., Mauck, W. M., Toidze, M., Almeida, C. G., Takahashi, R. H., Carlson, G. A., Fl int Beal, M., Lin, M. T., Gouras, G. K. (2004a). "Increased plaque burden in brains of APP mutant MnSOD heterozygous knockout mice." J Neurochem 89(5): 1308-1312.

Li, J. Q., Yu, J. T., Jiang, T., Tan, L. (2015). "Endoplasmic reticulum dysfunction in Alzheimer's disease." Mol Neurobiol 51(1): 383-395.

Li, W. W., Yang, R., Guo, J. C., Ren, H. M., Zha, X. L., Cheng, J. S., Cai, D. F. (2007). "Localization of alpha -synuclein to mitochondria within midbrain of mice." Neuroreport 18(15): 1543 -1546.

Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. (2004b). "The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses." Cell 119(6): 873 -887.

Lin, M. T., Beal, M. F. (2006). "Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases."

Nature 443(7113): 787-795. Liu, H. L., Zhao, G., Cai, K., Zhao, H. H., Shi, L. D. (2011). "Treadmill exercise prevents decline in spatial learning

and memory in APP/PS1 transgenic mice through improvement of hippocampal long-term potentiation." Behav Brain Res 218(2): 308-314.

Liu, L., Orozco, I. J., Planel, E., Wen, Y., Brettevil le, A., Krishnamurthy, P., Wang, L., Herman, M., Figueroa, H., Yu, W. H., Arancio, O., Duff, K. (2008). "A transgenic rat that develops Alzheimer's disease-like amyloid pathology, deficits in synaptic plasticity and cognitive impairment." Neurobiol Dis 31(1): 46-57.

Liu, X., Hajnoczky, G. (2009). "Ca2+-dependent regulation of mitochondrial dynamics by the Miro-Milton

complex." Int J Biochem Cell Biol 41(10): 1972-1976. Lopez, N., Tormo, C., De Blas, I., Ll inares, I., Alom, J. (2013). "Oxidative stress in Alzheimer's disease and mild

cognitive impairment with high sensitivity and specificity." J Alzheimers Dis 33(3): 823 -829.

Lustbader, J. W., Ciri l l i , M., Lin, C., Xu, H. W., Takuma, K., Wang, N., Caspersen, C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M., Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F., Lue, L. F., Walker, D. G., Kuppusamy, P., Zewier, Z. L., Arancio, O., Stern, D., Yan, S. S., Wu, H. (2004). "ABAD directly l inks Abeta to mitochondrial toxicity in Alzheimer's disease." Science 304(5669): 448-452.

Ly, C. V., Verstreken, P. (2006). "Mitochondria at the synapse." Neuroscientist 12(4): 291-299.

123

Ma, Q. L., Chan, P., Yoshii, M., Ueda, K. (2003). "Alpha -synuclein aggregation and neurodegenerative diseases."

J Alzheimers Dis 5(2): 139-148. MacAskill , A. F., Kittler, J. T. (2010). "Control of mitochondrial transport and localization in neurons." Trends

Cell Biol 20(2): 102-112.

Macia, E., Ehrlich, M., Massol, R., Boucrot, E., Brunner, C., Kirchhausen, T. (2006). "Dynasore, a cell -permeable inhibitor of dynamin." Dev Cell 10(6): 839-850.

Magistretti, P. J., Pellerin, L. (1999). "Astrocytes Couple Synaptic Activity to Glucose Util ization in the Brain." News Physiol Sci 14: 177-182.

Magistretti, P. J., Sorg, O., Naichen, Y., Pellerin, L., de Rham, S., Martin, J. L. (1994). "Regulation of astrocyte energy metabolism by neurotransmitters." Ren Physiol Biochem 17(3-4): 168-171.

Maki, M., Matsukawa, N., Yuasa, H., Otsuka, Y., Yamamoto, T., Akatsu, H., Okamoto, T., Ueda, R., Ojika, K.

(2002). "Decreased expression of hippocampal cholinergic neurostimulating peptide precursor protein mRNA in the hippocampus in Alzheimer disease." J Neuropathol Exp Neurol 61(2): 176 -185.

Malm, T. M., Iivonen, H., Goldsteins, G., Keksa-Goldsteine, V., Ahtoniemi, T., Kanninen, K., Salminen, A., Auriola, S., Van Groen, T., Tanila, H., Koistinaho, J. (2007). "Pyrrolidine dithiocarbamate activates Akt and

improves spatial learning in APP/PS1 mice without affecting beta -amyloid burden." J Neurosci 27(14): 3712-3721.

Malviya, M., Kumar, Y. C., Asha, D., Chandra, J. N., Subhash, M. N., Rangappa, K. S. (2008). "Muscarinic receptor 1 agonist activity of novel N-arylthioureas substituted 3-morpholino arecoline derivatives in

Alzheimer's presenile dementia models." Bioorg Med Chem 16(15): 7095-7101. Mancuso, M., Filosto, M., Bosetti, F., Ceravolo, R., Rocchi, A., Tognoni, G., Manca, M. L., Solaini, G., Sicil iano, G.,

Murri, L. (2003). "Decreased platelet cytochrome c oxidase activity is accompanied by increased blood

lactate concentration during exercise in patients with Alzheimer disease." Exp Neurol 182(2): 421-426. Manczak, M., Anekonda, T. S., Henson, E., Park, B. S., Quinn, J., Reddy, P. H. (2006). "Mitochondria are a direct

site of A beta accumulation in Alzheimer's disease neurons: implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression." Hum Mol Genet 15(9): 1437 -1449.

Manczak, M., Calkins, M. J., Reddy, P. H. (2011). "Impaired mitochondrial dynamics and abnormal interaction of amyloid beta with mitochondrial protein Drp1 in neurons from patients with Alzheimer's disease: implications for neuronal damage." Hum Mol Genet 20(13): 2495 -2509.

Manczak, M., Mao, P., Calkins, M. J., Cornea, A., Reddy, A. P., Murphy, M. P., Szeto, H. H., Park, B., Reddy, P. H.

(2010). "Mitochondria-targeted antioxidants protect against amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease neurons." J Alzheimers Dis 20 Suppl 2: S609-631.

Manczak, M., Reddy, P. H. (2012). "Abnormal interacti on of VDAC1 with amyloid beta and phosphorylated tau

causes mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 21(23): 5131-5146. Manczak, M., Sheiko, T., Craigen, W. J., Reddy, P. H. (2013). "Reduced VDAC1 protects against Alzheimer's

disease, mitochondria, and synaptic deficiencies." J Alzheimers Dis 37(4): 679-690. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. (2005). "The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference

gel analysis technology." Anal Bioanal Chem 382(3): 669-678. Marcello, E., Epis, R., Saraceno, C., Di Luca, M. (2012). "Synaptic dysfunction in Alzheimer's disease." Adv Exp

Med Biol 970: 573-601.

Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Kaplowitz, N., Fernandez-Checa, J. C. (2013). "Mitochondrial glutathione: features, regulation and role in disease." Biochim Biophys Acta 1830(5): 3317 -3328.

Martin, E. M., Wilson, R. S., Penn, R. D., Fox, J. H., Clasen, R. A., Savoy, S. M. (1987). "Cortical biopsy results in Alzheimer's disease: correlation with cognitive deficits ." Neurology 37(7): 1201-1204.

Martin, L. J., Pan, Y., Price, A. C., Sterling, W., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Price, D. L., Lee, M. K. (2006). "Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death." J Neurosci 26(1): 41-50.

Martins, L. M., Iaccarino, I., Tenev, T., Gschmeissner, S., Totty, N. F., Lemoine, N. R., Savopoulos, J., Gray, C. W.,

Creasy, C. L., Dingwall, C., Downward, J. (2002). "The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif." J Biol Chem 277(1): 439-444.

Marui, W., Iseki, E., Ueda, K., Kosaka, K. (2000). "Occurrence of human alpha-synuclein immunoreactive

neurons with neurofibril lary tangle formation in the limbic areas of patients with Alzheimer's disease." J Neurol Sci 174(2): 81-84.

Masters, C. L., Simms, G., Weinman, N. A., Multhaup, G., McDonald, B. L., Beyreuther, K. (1985). "Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome." Proc Natl Acad Sci U S A 82(12): 4245 -

4249.

124

Mattiasson, G., Friberg, H., Hansson, M., Elmer, E., Wieloch, T. (2003). "Flow cytometric analysis of

mitochondria from CA1 and CA3 regions of rat hippocampus reveals differences in permeability transition pore activation." J Neurochem 87(2): 532-544.

Mattson, M. P. (2004). "Pathways towards and away from Alzheimer's disease." Nature 430(7000): 631 -639.

Mattson, M. P., Gleichmann, M., Cheng, A. (2008). "Mitochondria in neuroplasticity and neurological disorders." Neuron 60(5): 748-766.

Maurer, I., Zierz, S., Moller, H. J. (2000). "A selective defect of cytochrome c oxidase is present in brain of Alzheimer disease patients." Neurobiol Aging 21(3): 455-462.

McAlpine, F. E., Lee, J. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Blurton-Jones, M., Hong, J., Das, P., Golde, T. E., LaFerla, F. M., Oddo, S., Blesch, A., Tansey, M. G. (2009). "Inhibition of soluble TNF signaling in a mouse model of Alzheimer's disease prevents pre-plaque amyloid-associated neuropathology." Neurobiol Dis 34(1):

163-177. Mager, P. P., Penke, B., Walter, R., Harkany, T., Hartignny, W. (2002). "Pathological peptide folding in

Alzheimer's disease and other conformational disorders." Curr Med Chem 9(19): 1763 -1780. McGee, A. M., Baines, C. P. (2011). "Complement 1q-binding protein inhibits the mitochondrial permeability

transition pore and protects against oxidative stress -induced death." Biochem J 433(1): 119-125. McKenna, M. C., Stevenson, J. H., Huang, X., Hopkins, I. B. (2000). "Differential distribution of the enzymes

glutamate dehydrogenase and aspartate aminotransferase in cortical synaptic mitochondria contributes to metabolic compartmentation in cortical synaptic terminals." Neurochem Int 37(2-3):

229-241. McLachlan, D. R., Smith, W. L., Kruck, T. P. (1993). "Desferrioxamine and Alzheimer's disease: video home

behavior assessment of clinical course and measures of brain aluminum." Ther Drug Monit 15(6): 602 -

607. Mega, M. S., Cummings, J. L., Fiorello, T., Gornbein, J. (1996). "The spectrum of behavioral changes in

Alzheimer's disease." Neurology 46(1): 130-135. Meir, A., Ginsburg, S., Butkevich, A., Kachalsky, S. G., Kaiserman, I., Ahdut, R., Demirgoren, S., Rahamimoff, R.

(1999). "Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release." Physiol Rev 79(3): 1019-1088.

Melanson, J. E., Avery, S. L., Pinto, D. M. (2006). "High-coverage quantitative proteomics using amine-specific isotopic labeling." Proteomics 6(16): 4466-4474.

Melov, S., Doctrow, S. R., Schneider, J. A., Haberson, J., Patel, M., Coskun, P. E., Huffman, K., Wallace, D. C., Malfroy, B. (2001). "Lifespan extension and rescue of spongiform encephalopathy in superoxide dismutase 2 nullizygous mice treated with superoxide dismutase-catalase mimetics." J Neurosci

21(21): 8348-8353. Miao, L., St Clair, D. K. (2009). "Regulation of superoxide dismutase genes: implications in disease." Free Radic

Biol Med 47(4): 344-356. Minkeviciene, R., Banerjee, P., Tanila, H. (2004). "Memantine improves spatial learning in a transgenic mouse

model of Alzheimer's disease." J Pharmacol Exp Ther 311(2): 677-682. Molnar, Z., Soos, K., Lengyel, I., Penke, B., Szegedi, V., Budai, D. (2004). "Enhancement of NMDA responses by

beta-amyloid peptides in the hippocampus in vivo." Neuroreport 15(10): 1649 -1652.

Monteiro-Cardoso, V. F., Ol iveira, M. M., Melo, T., Domingues, M. R., Moreira, P. I., Ferreiro, E., Peixoto, F., Videira, R. A. (2014). "Cardiolipin Profile Changes are Associated to the Early Synaptic Mitochondrial Dysfunction in Alzheimer's Disease." J Alzheimers Dis.

Moreira, P. I., Cardoso, S. M., Santos, M. S., Oliveira, C. R. (2006). "The key role of mitochondria in Alzheimer's

disease." J Alzheimers Dis 9(2): 101-110. Moreira, P. I., Siedlak, S. L., Wang, X., Santos, M. S., Oliveira, C. R., Tabaton, M., Nunomura, A., Szweda, L. I.,

Aliev, G., Smith, M. A., Zhu, X., Perry, G. (2007). "Autophagocytosis of mitochondria is prominent in Alzheimer disease." J Neuropathol Exp Neurol 66(6): 525-532.

Moreira, P. I., Zhu, X., Wang, X., Lee, H. G., Nunomura, A., Petersen, R. B., Perry, G., Smith, M. A. (2010). "Mitochondria: a therapeutic target in neurodegeneration." Biochim Biophys Acta 1802(1): 212 -220.

Mosconi, L., Brys, M., Glodzik-Sobanska, L., De Santi, S., Rusinek, H., de Leon, M. J. (2007). "Early detection of

Alzheimer's disease using neuroimaging." Exp Gerontol 42(1-2): 129-138. Mosconi, L., Tsui, W. H., De Santi, S., Li, J., Rusinek, H., Convit, A., Li, Y., Boppana, M., de Leon, M. J. (2005).

"Reduced hippocampal metabolism in MCI and AD: automated FDG-PET image analysis." Neurology 64(11): 1860-1867.

Mouton, P. R., Chachich, M. E., Quigley, C., Spangler, E., Ingram, D. K. (2009). "Caloric restriction attenuates amyloid deposition in middle-aged dtg APP/PS1 mice." Neurosci Lett 464(3): 184-187.

125

Mucke, L. (2009). "Neuroscience: Al zheimer's disease." Nature 461(7266): 895-897.

Mungarro-Menchaca, X., Ferrera, P., Moran, J., Arias, C. (2002). "beta -Amyloid peptide induces ultrastructural changes in synaptosomes and potentiates mitochondrial dysfunction in the presence of ryanodine." J Neurosci Res 68(1): 89-96.

Mutisya, E. M., Bowling, A. C., Beal, M. F. (1994). "Cortical cytochrome oxidase activity is reduced in Alzheimer's disease." J Neurochem 63(6): 2179-2184.

Nag, S., Yee, B. K., Tang, F. (1999). "Reduction in somatostatin and substance P levels and choline acetyltransferase activity in the cortex and hippocampus of the rat after chronic

intracerebroventricular infusion of beta-amyloid (1-40)." Brain Res Bull 50(4): 251-262. Naga, K. K., Sull ivan, P. G., Geddes, J. W. (2007). "High cyclophilin D content of synaptic mitochondria results in

increased vulnerability to permeability transition." J Neurosci 27(28): 7469 -7475.

Naiki, H., Higuchi, K., Hosokawa, M., Takeda, T. (1989). "Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1." Anal Biochem 177(2): 244-249.

Nakamura, S., Murayama, N., Noshita, T., Annoura, H., Ohno, T. (2001). "Progressive brain dysfunction following intracerebroventricular infusion of beta(1-42)-amyloid peptide." Brain Res 912(2): 128-136.

Nandi, P. K. (1996). "Protein conformation and disease." Vet Res 27(4 -5): 373-382. Nisbet, R. M., Polanco, J. C., Ittner, L. M., Gotz, J. (2015). "Tau aggregation and its interplay with amyloid -beta."

Acta Neuropathol 129(2): 207-220. Oakley, H., Cole, S. L., Logan, S., Maus, E., Shao, P., Craft, J., Guillozet-Bongaarts, A., Ohno, M., Disterhoft, J.,

Van Eldik, L., Berry, R., Vassar, R. (2006). "Intraneuronal beta -amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation." J Neurosci 26(40): 10129-10140.

Oddo, S., Caccamo, A., Kitazawa, M., Tseng, B. P., LaFerla, F. M. (2003). "Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple transgenic model of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 24(8): 1063 -1070.

Ohyagi, Y., Yamada, T., Nishioka, K., Clarke, N. J., Tomlinson, A. J., Naylor, S., Nakabeppu, Y., Kira, J., Younkin, S. G. (2000). "Selective increase in cellular A beta 42 i s related to apoptosis but not necrosis."

Neuroreport 11(1): 167-171. Olah, J., Vincze, O., Virok, D., Simon, D., Bozso, Z., Tokesi, N., Horvath, I., Hlavanda, E., Kovacs, J., Magyar, A.,

Szucs, M., Orosz, F., Penke, B., Ovadi, J. (2011). "Interactions of pathological hallmark proteins: tubulin polymerization promoting protein/p25, beta -amyloid, and alpha-synuclein." J Biol Chem 286(39):

34088-34100. Olariu, A., Yamada, K., Mamiya, T., Hefco, V., Nabeshima, T. (2002). "Memory impairment induced by chronic

intracerebroventricular infusion of beta-amyloid (1-40) involves downregulation of protein kinase C."

Brain Res 957(2): 278-286. O'Neil, J. N., Mouton, P. R., Tizabi, Y., Ottinger, M. A., Lei, D. L., Ingram, D. K., Manaye, K. F. (2007).

"Catecholaminergic neuronal loss in locus coeruleus of aged female dtg APP/PS1 mice." J Chem Neuroanat 34(3-4): 102-107.

Orbán, G., Völgyi, K., Juhász, G., Penke, B., Kékesi, K. A., Kardos, J., Czurkó, A. (2010). "Different electrophysiological actions of 24- and 72-hour aggregated amyloid-beta oligomers on hippocampal field population spike in both anesthetized and awake rats." Brain Res 1354: 227 -235.

Pagani, L., Eckert, A. (2011). "Amyloid-Beta interaction with mitochondria." Int J Alzheimers Dis 2011: 925050. Palay, S. L. (1956). "Synapses in the central nervous system." J Biophys Biochem Cytol 2(4 Suppl): 193 -202. Parachikova, A., Nichol, K. E., Cotman, C. W. (2008). "Short-term exercise in aged Tg2576 mice alters

neuroinflammation and improves cognition." Neurobiol Dis 30(1): 121-129.

Park, H., Kam, T. I., Kim, Y., Choi, H., Gwon, Y., Kim, C., Koh, J. Y., Jung, Y. K. (2012). "Neuropathogenic role of adenylate kinase-1 in Abeta-mediated tau phosphorylation via AMPK and GSK3beta." Hum Mol Genet 21(12): 2725-2737.

Park, H. J., Kim, S. S., Seong, Y. M., Kim, K. H., Goo, H. G., Yoon, E. J., Min do, S., Kang, S., Rhim, H. (2006). "Beta -

amyloid precursor protein is a direct cleavage target of HtrA2 serine protease. Implications for the physiological function of HtrA2 in the mitochondria." J Biol Chem 281(45): 34277-34287.

Park, H. J., Seong, Y. M., Choi, J. Y., Kang, S., Rhim, H. (2004). "Alzheimer's disease-associated amyloid beta

interacts with the human serine protease HtrA2/Omi." Neurosci Lett 357(1): 63 -67. Parker, W. D., Jr., Fi l ley, C. M., Parks, J. K. (1990). "Cytochrome oxidase deficiency in Alzheimer's disease."

Neurology 40(8): 1302-1303. Parker, W. D., Jr., Mahr, N. J., Fi l ley, C. M., Parks, J. K., Hughes, D., Young, D. A., Cullum, C. M. (1994). "Reduced

platelet cytochrome c oxidase activity in Alzheimer's disease." Neurology 44(6): 1086 -1090.

126

Pavlov, P. F., Wiehager, B., Sakai, J., Frykman, S., Behbahani, H., Winblad, B., Ankarcrona, M. (2011).

"Mitochondrial gamma-secretase participates in the metabolism of mitochondria-associated amyloid precursor protein." FASEB J 25(1): 78-88.

Paxinos, A., Watson, C. (1982). "The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates." Academic Press, San Diego.

Perez, R. G., Soriano, S., Hayes, J. D., Ostaszewski, B., Xia, W., Selkoe, D. J., Chen, X., Stokin, G. B., Koo, E. H. (1999). "Mutagenesis identifies new signals for beta -amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42." J Biol Chem 274(27): 18851 -18856.

Perry, E. K., Perry, R. H., Tomlinson, B. E., Blessed, G., Gibson, P. H. (1980). "Coenzyme A-acetylating enzymes in

Alzheimer's disease: possible cholinergic 'compartment' of pyruvate dehydrogenase." Neurosci Lett 18(1): 105-110.

Petit, J. M., Huet, O., Gallet, P. F., Maftah, A., Ratinaud, M. H., Julien, R. (1994). "Direct analysis and significance

of cardiolipin transverse distribution in mitochondrial inner membranes." Eur J Biochem 220(3): 871 -879.

Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. (2011). "Mitochondria: isolation, structure and function." J Physiol 589(Pt 18): 4413-4421.

Picone, P., Nuzzo, D., Caruana, L., Scafidi, V., Di Carlo, M. (2014). "Mitochondrial dysfunction: different routes to Alzheimer's disease therapy." Oxid Med Cell Longev 2014: 780179.

Pigino, G., Morfini, G., Pelsman, A., Mattson, M. P., Brady, S. T., Busciglio, J. (2003). "Alzheimer's presenilin 1 mutations impair kinesin-based axonal transport." J Neurosci 23(11): 4499-4508.

Pil l ing, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. (2006). "Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons." Mol Biol Cell 17(4): 2057 -2068.

Pinho, C. M., Teixeira, P. F., Glaser, E. (2014). "Mitochondrial import and degradation of amyloid -beta peptide."

Biochim Biophys Acta 1837(7): 1069-1074. Placido, A. I., Pereira, C. M., Duarte, A. I., Candeias, E., Correia, S. C., Santos, R. X., Carvalho, C., Cardoso, S.,

Oliveira, C. R., Moreira, P. I. (2014). "The role of endoplasmic reticulum in amyloid precursor pr otein processing and trafficking: Implications for Alzheimer's disease." Biochim Biophys Acta 1842(9): 1444 -

1453. Plun-Favreau, H., Klupsch, K., Moisoi, N., Gandhi, S., Kjaer, S., Frith, D., Harvey, K., Deas, E., Harvey, R. J.,

McDonald, N., Wood, N. W., Martins, L. M., Downward, J. (2007). "The mitochondrial protease HtrA2 is regulated by Parkinson's disease-associated kinase PINK1." Nat Cell Biol 9(11): 1243-1252.

Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Kadish, I., Van Groen, T. (2008). "Subfield and layer -specific depletion in calbindin-D28K, calretinin and parvalbumin immunoreactivity in the dentate gyrus of amyloid precursor protein/presenilin 1 transgenic mice." Neuroscience 155(1): 182 -191.

Power, J. H., Asad, S., Chataway, T. K., Chegini, F., Manavis, J., Temlett, J. A., Jensen, P. H., Blumbergs, P. C., Gai, W. P. (2008). "Peroxiredoxin 6 in human brain: molecular forms, cellular distribution and association with Alzheimer's disease pathology." Acta Neuropathol 115(6): 611-622.

Pratico, D., Uryu, K., Leight, S., Trojanoswki, J. Q., Lee, V. M. (2001). "Increased lipid peroxidation precedes

amyloid plaque formation in an animal model of Alzheimer amyloidosis." J Neurosci 21(12): 4183 -4187.

Preston, G. C., Ward, C., Lines, C. R., Poppleton, P., Haigh, J. R., Tr aub, M. (1989). "Scopolamine and

benzodiazepine models of dementia: cross -reversals by Ro 15-1788 and physostigmine." Psychopharmacology (Berl) 98(4): 487-494.

Pugh, P. L., Richardson, J. C., Bate, S. T., Upton, N., Sunter, D. (2007). "Non-cognitive behaviours in an APP/PS1 transgenic model of Alzheimer's disease." Behav Brain Res 178(1): 18-28.

Puzzo, D., Privitera, L., Leznik, E., Fa, M., Staniszewski, A., Palmeri, A., Arancio, O. (2008). "Picomolar amyloid -beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus." J Neurosci 28(53): 14537-14545.

Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. (2013). "A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial

fission and neurotoxicity." J Cell Sci 126(Pt 3): 789-802. Radde, R., Bolmont, T., Kaeser, S. A., Coomaraswamy, J., Lindau, D., Stoltze, L., Calhoun, M. E., Jaggi, F.,

Wolburg, H., Gengler, S., Haass, C., Ghetti, B., Czech, C., Holscher, C., Mathews, P. M., Jucker, M.

(2006). "Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology." EMBO Rep 7(9): 940-946.

Raichle, M. E. (2010). "The brain's dark energy." Sci Am 302(3): 44-49. Ralay Ranaivo, H., Craft, J. M., Hu, W., Guo, L., Wing, L. K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M. (2006). "Glia as a

therapeutic target: selective suppression of human amyloid-beta-induced upregulation of brain proinflammatory cytokine production attenuates neurodegeneration." J Neurosci 26(2): 662 -670.

127

Rao, A. V., Balachandran, B. (2002). "Role of oxidative stress and antioxidants in neurodegenerative diseases."

Nutr Neurosci 5(5): 291-309. Raukas, M., Rebane, R., Mahlapuu, R., Jefremov, V., Zilmer, K., Karelson, E., Bogdanovic, N., Zilmer, M. (2012).

"Mitochondrial oxidative stress index, activity of redox-sensitive aconitase and effects of endogenous

anti- and pro-oxidants on its activity in control, Alzheimer's disease and Swedish Familial Alzheimer's disease brain." Free Radic Res 46(12): 1490-1495.

Reddy, P. H. (2008). "Mitochondrial medicine for aging and neurodegenerative diseases." Neuromolecular Med 10(4): 291-315.

Reddy, P. H. (2013). "Is the mitochondrial outermembrane protein VDAC1 therapeutic target for Alzheimer's disease?" Biochim Biophys Acta 1832(1): 67-75.

Reddy, P. H., McWeeney, S., Park, B. S., Manczak, M., Gutala, R. V., Partovi, D., Jung, Y., Yau, V., Searles, R.,

Mori, M., Quinn, J. (2004). "Gene expression profiles of transcripts in amyloid precursor protein transgenic mice: up-regulation of mitochondrial metabolism and apoptotic genes is an early cellular change in Alzheimer's disease." Hum Mol Genet 13(12): 1225-1240.

Reddy, P. H., Reddy, T. P. (2011). "Mitochondria as a therapeutic target for aging and neurodegenerative

diseases." Curr Alzheimer Res 8(4): 393-409. Reddy, P. H., Reddy, T. P., Manczak, M., Calki ns, M. J., Shirendeb, U., Mao, P. (2011). "Dynamin-related protein

1 and mitochondrial fragmentation in neurodegenerative diseases." Brain Res Rev 67(1 -2): 103-118. Reed, T., Perluigi, M., Sultana, R., Pierce, W. M., Klein, J. B., Turner, D. M., Coccia, R., Markesbery, W. R.,

Butterfield, D. A. (2008). "Redox proteomic identification of 4 -hydroxy-2-nonenal-modified brain proteins in amnestic mild cognitive impairment: insight into the role of l ipid peroxidation in the progression and pathogenesis of Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 30(1): 107-120.

Reinhard, C., Hebert, S. S., De Strooper, B. (2005). "The amyloid-beta precursor protein: integrating structure with biological function." EMBO J 24(23): 3996-4006.

Rey, N. L., Jardanhazi -Kurutz, D., Terwel, D., Kummer, M. P., Jourdan, F., Didier, A., Heneka, M. T. (2012). "Locus coeruleus degeneration exacerbates olfactory deficits in APP/PS1 transgenic mice." Neurobiol Aging

33(2): 426 e421-411. Ribe, E. M., Perez, M., Puig, B., Gich, I., Lim, F., Cuadrado, M., Sesma, T., Catena, S., Sanchez, B., Nieto, M.,

Gomez-Ramos, P., Moran, M. A., Cabodevilla, F., Samaranch, L., Ortiz, L., Perez, A., Ferrer, I., Avila, J., Gomez-Isla, T. (2005). "Accelerated amyloid deposition, neurofibrillary degeneration and neuronal loss

in double mutant APP/tau transgenic mice." Neurobiol Dis 20(3): 814 -822. Roach, K. E., Tappen, R. M., Kirk-Sanchez, N., Will iams, C. L., Loewenstein, D. (2011). "A randomized controlled

trial of an activity specific exercise program for individuals with Alzheimer disease in long-term care

settings." J Geriatr Phys Ther 34(2): 50-56. Roch, J. M., Masliah, E., Roch-Levecq, A. C., Sundsmo, M. P., Otero, D. A., Veinbergs, I., Saitoh, T. (1994).

"Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid beta/A4 protein precursor." Proc Natl Acad Sci U S A 91(16): 7450 -7454.

Rodrigues, C. M., Sola, S., Brito, M. A., Brondino, C. D., Brites, D., Moura, J. J. (2001). "Amyloid beta -peptide disrupts mitochondrial membrane lipid and protein structure: protective role of tauroursodeoxycholate." Biochem Biophys Res Commun 281(2): 468 -474.

Roertgen, K. E., Parisi, J. E., Clark, H. B., Barnes, D. L., O'Brien, T. D., Johnson, K. H. (1996). "A beta -associated cerebral angiopathy and senile plaques with neurofibril lary tangles and cerebral hemorrhage in an aged wolverine (Gulo gulo)." Neurobiol Aging 17(2): 243-247.

Rofina, J. E., van Ederen, A. M., Toussaint, M. J., Secreve, M., van der Spek, A., van der Meer, I., Van

Eerdenburg, F. J., Gruys, E. (2006). "Cognitive disturbances in old dogs suffering from the canine counterpart of Alzheimer's disease." Brain Res 1069(1): 216-226.

Rosenberg, P. B. (2005). "Clinical aspects of inflammation in Alzheimer's disease." Int Rev Psyc hiatry 17(6): 503-514.

Rostovtseva, T. K., Antonsson, B., Suzuki, M., Youle, R. J., Colombini, M., Bezrukov, S. M. (2004). "Bid, but not Bax, regulates VDAC channels." J Biol Chem 279(14): 13575-13583.

Roussel, B. D., Kruppa, A. J., Miranda, E., Crowther, D. C., Lomas, D. A., Marciniak, S. J. (2013). "Endoplasmic

reticulum dysfunction in neurological disease." Lancet Neurol 12(1): 105 -118. Rowan, M. J., Klyubin, I., Wang, Q., Anwyl, R. (2004). "Mechanisms of the inhibitory effects of amyloid beta -

protein on synaptic plasticity." Exp Gerontol 39(11-12): 1661-1667. Rowan, M. J., Klyubin, I., Wang, Q., Anwyl, R. (2004). "Mechanisms of the inhibitory effects of amyloid beta -

protein on synaptic plasticity." Exp Gerontol 39(11-12): 1661-1667.

128

Rui, Y., Tiwari, P., Xie, Z., Zheng, J. Q. (2006). "Acute impairment of mitochondrial trafficking by beta -amyloid

peptides in hippocampal neurons." J Neurosci 26(41): 10480 -10487. Ruiz-Opazo, N., Kosik, K. S., Lopez, L. V., Bagamasbad, P., Ponce, L. R., Herrera, V. L. (2004). "Attenuated

hippocampus-dependent learning and memory decline in transgenic TgAPPswe Fischer -344 rats." Mol

Med 10(1-6): 36-44. Sambamurti, K., Greig, N. H., Utsuki, T., Barnwell, E. L., Sharma, E., Mazell, C., Bhat, N. R., Kindy, M. S., Lahiri, D.

K., Pappolla, M. A. (2011). "Targets for AD treatment: conflicting messages from gamma -secretase inhibitors." J Neurochem 117(3): 359-374.

Sarasa, M., Pesini, P. (2009). "Natural non-trasgenic animal models for research in Alzheimer's disease." Curr Alzheimer Res 6(2): 171-178.

Schade, S., Mollenhauer, B. (2014). "Biomarkers in biological fluids for dementia with Lewy bodies." Alzheimers

Res Ther 6(5-8): 72. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. (2010). "Mitochondrial protein import: from proteomics to functional

mechanisms." Nat Rev Mol Cell Biol 11(9): 655-667. Schon, E. A., DiMauro, S., Hirano, M. (2012). "Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic

mutations." Nat Rev Genet 13(12): 878-890. Schonberger, S. J., Edgar, P. F., Kydd, R., Faul l, R. L., Cooper, G. J. (2001). "Proteomic analysis of the brain in

Alzheimer's disease: molecular phenotype of a complex disease process." Proteomics 1(12): 1519 -1528.

Schousboe, A., Bak, L. K., Waagepetersen, H. S. (2013). "Astrocytic Control of Biosynthesis and Turnover of the Neurotransmitters Glutamate and GABA." Front Endocrinol (Lausanne) 4: 102.

Scullion, G. A., Kendall, D. A., Marsden, C. A., Sunter, D., Pardon, M. C. (2011). "Chronic treatment with the

alpha2-adrenoceptor antagonist fluparoxan prevents age-related deficits in spatial working memory in APPxPS1 transgenic mice without altering beta -amyloid plaque load or astrocytosis." Neuropharmacology 60(2-3): 223-234.

Selfridge, J. E., E, L., Lu, J., Swerdlow, R. H. (2013). "Role of mitochondrial homeostasis and dynamics in

Alzheimer's disease." Neurobiol Dis 51: 3-12. Selkoe, D. J. (2008). "Soluble oligomers of the amyloid beta -protein impair synaptic plasticity and behavior."

Behav Brain Res 192(1): 106-113. Sengupta, A., Banerjee, B., Tyagi, R. K., Datta, K. (2005). "Golgi localization and dynamics of hyaluronan binding

protein 1 (HABP1/p32/C1QBP) during the cell cycle." Cell Res 15(3): 183 -186. Sergeant, N., Wattez, A., Galvan-valencia, M., Ghestem, A., David, J. P., Lemoine, J., Sautiere, P. E., Dachary, J.,

Mazat, J. P., Michalski, J. C., Velours, J., Mena-Lopez, R., Delacourte, A. (2003). "Association of ATP

synthase alpha-chain with neurofibril lary degeneration in Alzheimer's disease." Neuroscience 117(2): 293-303.

Shank, R. P., Campbell, G. L. (1984). "Alpha-ketoglutarate and malate uptake and metabolism by synaptosomes: further evidence for an astrocyte-to-neuron metabolic shuttle." J Neurochem 42(4): 1153-1161.

Shankar, G. M., Li, S., Mehta, T. H., Garcia-Munoz, A., Shepardson, N. E., Smith, I., Brett, F. M., Farrell, M. A., Rowan, M. J., Lemere, C. A., Regan, C. M., Walsh, D. M., Sabatini, B. L., Selkoe, D. J. (2008). "Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory."

Nat Med 14(8): 837-842. Sheng, Z. H., Cai, Q. (2012). "Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and

neurodegeneration." Nat Rev Neurosci 13(2): 77-93. Shibata, N., Kobayashi, M. (2008). "[The role for oxidative stress in neurodegenerative diseases]." Brain Nerve

60(2): 157-170. Shimizu, S., Ide, T., Yanagida, T., Tsujimoto, Y. (2000). "Electrophysiological study of a novel large pore formed

by Bax and the voltage-dependent anion channel that is permeable to cytochrome c." J Biol Chem 275(16): 12321-12325.

Shin, R. W., Saido, T. C., Maeda, M., Kitamoto, T. (2005). "Novel alpha -secretase cleavage of Alzheimer's amyloid beta precursor protein in the endoplasmic reticulum of COS7 cells." Neurosci Lett 376(1): 14 -19.

Shiozaki, A., Tsuji, T., Kohno, R., Kawamata, J., Uemura, K., Teraoka, H., Shimohama, S. (2004). "Proteome analysis of brain proteins in Alzheimer's disease: subproteomics following sequentially extracted protein preparation." J Alzheimers Dis 6(3): 257-268.

Shirendeb, U., Reddy, A. P., Manczak, M., Calkins, M. J., Mao, P., Tagle, D. A., Reddy, P. H. (2011). "Abnormal

mitochondrial dynamics, mitochondrial loss and mutant huntingtin oligomers in Huntington's disease: implications for selective neuronal damage." Hum Mol Genet 20(7): 1438-1455.

129

Schousboe, A., Bak, L. K., Waagepetersen, H. S. (2013). "Astrocytic Control of Biosynthesis and Turnover of the

Neurotransmitters Glutamate and GABA." Front Endocrinol (Lausanne) 4: 102. Silva, P. N., Furuya, T. K., Braga, I. L., Rasmussen, L. T., Labio, R. W., Bertolucci, P. H., Chen, E. S., Turecki, G.,

Mechawar, N., Payao, S. L., Mill, J., Smith, M. C. (2014). "Analysis of HSPA8 and HSPA9 mRNA

expression and promoter methylation in the brain and blood of Alzheimer's disease patients." J Alzheimers Dis 38(1): 165-170.

Sims, N. R., Anderson, M. F. (2008). "Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation." Nat Protoc 3(7): 1228-1239.

Singh, N. K., Banerjee, B. D., Bala, K., Basu, M., Chhillar, N. (2014). "Polymorphism in Cytochrome P450 2D6, Glutathione S-Transferases Pi 1 Genes, and Organochlorine Pesticides in Alzheimer Disease: A Case-Control Study in North Indian Population." J Geriatr Psychiatry Neurol 27(2): 119-127.

Sinha, S., Anderson, J. P., Barbour, R., Basi, G. S., Caccavello, R., Davis, D., Doan, M., Dovey, H. F., Frigon, N., Hong, J., Jacobson-Croak, K., Jewett, N., Keim, P., Knops, J., Lieberburg, I., Power, M., Tan, H., Tatsuno, G., Tung, J., Schenk, D., Seubert, P., Suomensaari, S. M., Wang, S., Walker, D., Zhao, J., McConlogue, L., John, V. (1999). "Purification and cloning of amyloid precursor protein beta -secretase from human

brain." Nature 402(6761): 537-540. Sipos, E., Kurunczi, A., Kasza, A., Horvath, J., Felszeghy, K., Laroche, S., Toldi, J., Parducz, A., Penke, B., Penke, Z.

(2007). "Beta-amyloid pathology in the entorhinal cortex of rats induces memory deficits: implications for Alzheimer's disease." Neuroscience 147(1): 28-36.

Sloan, H. L., Good, M., Dunnett, S. B. (2006). "Double dissociation between hippocampal and prefrontal lesions on an operant delayed matching task and a water maze reference memory task." Behav Brain Res 171(1): 116-126.

Small, S. A., Duff, K. (2008). "Linking Abeta and tau in late-onset Alzheimer's disease: a dual pathway hypothesis." Neuron 60(4): 534-542.

Sonnewald, U., Muller, T. B., Westergaard, N., Unsgard, G., Petersen, S. B., Schousboe, A. (1994). "NMR spectroscopic study of cell cultures of astrocytes and neurons exposed to hypoxia: compartmentation

of astrocyte metabolism." Neurochem Int 24(5): 473-483. Sorbi, S., Bird, E. D., Blass, J. P. (1983). "Decreased pyruvate dehydrogenase complex activity in Huntington and

Alzheimer brain." Ann Neurol 13(1): 72-78. Stacpoole, P. W. (2012). "The pyruvate dehydrogenase complex as a therapeutic target for age-related

diseases." Aging Cell 11(3): 371-377. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. (2011). "Impaired mitochondrial transport and Parkin-

independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo." Proc Natl Acad

Sci U S A 108(31): 12937-12942. Stine, W. B., Jr., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. (2003). "In vitro characterization of conditions for

amyloid-beta peptide oligomerization and fibril logenesis." J Biol Chem 278(13): 11612-11622. Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z.,

Muller, T., Bornemann, A., Wolburg, H., Downward, J., Riess, O., Schulz, J. B., Kruger, R. (2005). "Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease." Hum Mol Genet 14(15): 2099-2111.

Sturchler-Pierrat, C., Abramowski, D., Duke, M., Wiederhold, K. H., Mistl, C., Rothacher, S., Ledermann, B., Burki, K., Frey, P., Paganetti, P. A., Waridel, C., Calhoun, M. E., Jucker, M., Probst, A., Staufenbiel, M., Sommer, B. (1997). "Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology." Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 13287-13292.

Sultana, R., Poon, H. F., Cai, J., Pierce, W. M., Merchant, M., Klein, J. B., Markesbery, W. R., Butterfield, D. A. (2006). "Identification of nitrated proteins in Alzheimer's disease brain using a redox proteomics approach." Neurobiol Dis 22(1): 76-87.

Sunayama, J., Ando, Y., Itoh, N., Tomiyama, A., Sakurada, K., Sugiyama, A., Kang, D., Tashiro, F., Gotoh, Y.,

Kuchino, Y., Kitanaka, C. (2004). "Physical and functional interaction between BH3 -only protein Hrk and mitochondrial pore-forming protein p32." Cell Death Differ 11(7): 771-781.

Sunderland, T., Tariot, P. N., Weingartner, H., Murphy, D. L., Newhouse, P. A., Mueller, E. A., Cohen, R. M.

(1986). "Pharmacologic modelling of Alzheimer's disease." Prog Neuropsychopharmacol Bio l Psychiatry 10(3-5): 599-610.

Sutton, M. A., Schuman, E. M. (2006). "Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory." Cell 127(1): 49-58.

Swerdlow, R. H. (2011). "Brain aging, Alzheimer's disease, and mitochondria." Biochim Biophys Acta 1812 (12): 1630-1639.

130

Swerdlow, R. H., Khan, S. M. (2004). "A "mitochondrial cascade hypothesis" for sporadic Alzheimer's disease."

Med Hypotheses 63(1): 8-20. Swerdlow, R. H., Khan, S. M. (2009). "The Alzheimer's disease mitochondrial cascade hypothesis: an up date."

Exp Neurol 218(2): 308-315.

Sy, M., Kitazawa, M., Medeiros, R., Whitman, L., Cheng, D., Lane, T. E., Laferla, F. M. (2011). "Inflammation induced by infection potentiates tau pathological features in transgenic mice." Am J Pathol 178(6): 2811-2822.

Szabados, T., Dul, C., Majtenyi, K., Hargitai, J., Penzes, Z., Urbanics, R. (2004). "A chronic Alzheimer's model

evoked by mitochondrial poison sodium azide for pharmacological investigations." Behav Brain Res 154(1): 31-40.

Szego, E. M., Janaky, T., Szabo, Z., Csorba, A., Kompagne, H., Muller, G., Levay, G., Simor, A., Juhasz, G., Kekesi,

K. A. (2010). "A mouse model of anxiety molecularly characterized by altered protein networks in the brain proteome." Eur Neuropsychopharmacol 20(2): 96-111.

Takahashi, H., Brasnjevic, I., Rutten, B. P., Van Der Kolk, N., Perl, D. P., Bouras, C., Steinbusch, H. W., Schmitz, C., Hof, P. R., Dickstein, D. L. (2010). "Hippocampal interneuron loss in an APP/PS1 double mutant mouse

and in Alzheimer's disease." Brain Struct Funct 214(2-3): 145-160. Takahashi, R. H., Nam, E. E., Edgar, M., Gouras, G. K. (2002). "Alzheimer beta -amyloid peptides: normal and

abnormal localization." Histol Histopathol 17(1): 239-246. Takami, M., Nagashima, Y., Sano, Y., Ishihara, S., Morishima -Kawashima, M., Funamoto, S., Ihara, Y. (2009).

"gamma-Secretase: successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of beta-carboxyl terminal fragment." J Neurosci 29(41): 13042-13052.

Tamagno, E., Parola, M., Bardini, P., Piccini, A., Borghi, R., Guglielmotto, M., Santoro, G., Davit, A., Danni, O.,

Smith, M. A., Perry, G., Tabaton, M. (2005). "Beta-site APP cleaving enzyme up-regulation induced by 4-hydroxynonenal is mediated by stress -activated protein kinases pathways." J Neurochem 92(3): 628-636.

Tani, H., Dulla, C. G., Farzampour, Z., Taylor-Weiner, A., Huguenard, J. R., Reimer, R. J. (2014). "A local

glutamate-glutamine cycle sustains synaptic excitatory transmitter release." Neuron 81(4): 888 -900. Tanzi, R. E. (2005). "The synaptic Abeta hypothesis of Alzheimer disease." Nat Neurosci 8(8): 977-979. Tarkowski, E., Lil jeroth, A. M., Minthon, L., Tarkowski, A., Wallin, A., Blennow, K. (2003). "Cerebral pattern of

pro- and anti-inflammatory cytokines in dementias." Brain Res Bull 61(3): 255-260.

Terni, B., Boada, J., Portero-Otin, M., Pamplona, R., Ferrer, I. (2010). "Mitochondrial ATP-synthase in the entorhinal cortex is a target of oxidative stress at stages I/II of Alzheimer's disease pathology." Brain Pathol 20(1): 222-233.

Thal, D. R., Rub, U., Orantes, M., Braak, H. (2002). "Phases of A beta -deposition in the human brain and its relevance for the development of AD." Neurology 58(12): 1791-1800.

Thal, D. R., von Arnim, C. A., Griffin, W. S., Mrak, R. E., Walker, L., Attems, J., Arzber ger, T. (2015). "Frontotemporal lobar degeneration FTLD-tau: preclinical lesions, vascular, and Alzheimer-related co-

pathologies." J Neural Transm. Thinakaran, G., Koo, E. H. (2008). "Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function." J Biol Chem

283(44): 29615-29619.

Thompson, C. A., Spilsbury, K., Hall, J., Birks, Y., Barnes, C., Adamson, J. (2007). "Systematic review of information and support interventions for caregivers of people with dementia." BMC Geriatr 7: 18.

Tiranti, V., Viscomi, C., Hildebrandt, T., Di Meo, I., Mineri, R., Tiveron, C., Levitt, M. D., Prelle, A., Fagiolari, G., Rimoldi, M., Zeviani, M. (2009). "Loss of ETHE1, a mitochondrial dioxygenase, causes fatal sulfide

toxicity in ethylmalonic encephalopathy." Nat Med 15(2): 200-205. Tiwari, V., Ambadipudi, S., Patel, A. B. (2013). "Glutamatergic and GABAergic TCA cycle and neurotransmitter

cycling fluxes in different regions of mouse brain." J Cereb Blood Flow Metab 33(10): 1523 -1531. Tobinick, E. (2009). "Tumour necrosis factor modulation for treatment of Alzheimer's disease: rationale and

current evidence." CNS Drugs 23(9): 713-725. Tobinick, E., Gross, H., Weinberger, A., Cohen, H. (2006). "TNF-alpha modulation for treatment of Alzheimer's

disease: a 6-month pilot study." MedGenMed 8(2): 25.

Toledano, A., Alvarez, M. I. (2004). "Lesions and dysfunctions of the nucleus basalis as Alzheimer's disease models: general and critical overview and analysis of the long-term changes in several excitotoxic models." Curr Alzheimer Res 1(3): 189-214.

Toney, M. D. (2014). "Aspartate aminotransferase: an old dog teaches new tricks." Arch Biochem Biophys 544:

119-127.

131

Torres, L. L., Quaglio, N. B., de Souza, G. T., Garcia, R. T., Dati, L. M., Moreira, W. L., Loureiro, A. P., de Souza -

Talarico, J. N., Smid, J., Porto, C. S., Bottino, C. M., Nitrini, R., Barros, S. B., Camarini, R., Marcourakis, T. (2011). "Peripheral oxidative stress biomarkers in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease." J Alzheimers Dis 26(1): 59-68.

Torres, M., Jimenez, S., Sanchez-Varo, R., Navarro, V., Trujil lo-Estrada, L., Sanchez-Mejias, E., Carmona, I., Davila, J. C., Vizuete, M., Gutierrez, A., Vitorica, J. (2012). "Defective lysosomal proteolysis and axonal transport are early pathogenic events that worsen with age leading to increased APP metabolism and synaptic Abeta in transgenic APP/PS1 hippocampus." Mol Neurodegener 7: 59.

Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2006). "Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers." J Physiol 572(Pt 2): 477-492.

Trinchese, F., Fa, M., Liu, S., Zhang, H., Hidalgo, A., Schmidt, S. D., Yamaguchi, H., Yoshii, N., Mathews, P. M., Nixon, R. A., Arancio, O. (2008). "Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease." J Clin Invest 118(8): 2796-2807.

Trushina, E., Nemutlu, E., Zhang, S., Christensen, T., Camp, J., Mesa, J., Siddiqui, A., Tamura, Y., Sesaki, H.,

Wengenack, T. M., Dzeja, P. P., Poduslo, J. F. (2012). "Defects in mitochondrial dynamics and metabolomic signatures of evolving energetic stress in mouse models of familial Alzheimer's disease." PLoS One 7(2): e32737.

Turner, P. R., O'Connor, K., Tate, W. P., Abraham, W. C. (2003). "Roles of amyloid precursor protein and its

fragments in regulating neural activity, plasticity and memory." Prog Neurobiol 70(1): 1 -32. Tweedie, D., Sambamurti, K., Greig, N. H. (2007). "TNF-alpha inhibition as a treatment strategy for

neurodegenerative disorders: new drug candidates and targets." Curr Alzheimer Res 4(4): 378 -385.

Uchida, K., Yoshino, T., Yamaguchi, R., Tateyama, S., Kimoto, Y., Nakayama, H., Goto, N. (1995). "Senile plaques and other senile changes in the brain of an aged American black bear." Vet Pathol 32(4): 412-414.

Urano, T., Tohda, C. (2010). "Icariin improves memory impairment in Alzheimer's disease model mice (5xFAD) and attenuates amyloid beta-induced neurite atrophy." Phytother Res 24(11): 1658-1663.

Van Dam, D., Vloeberghs, E., Abramowski, D., Staufenbiel, M., De Deyn, P. P. (2005). "APP23 mice as a model of Alzheimer's disease: an example of a transgenic approach to modeling a CNS disorder." CNS Spectr 10(3): 207-222.

Van Der Bliek, A. M., Shen, Q., Kawajiri, S. (2013). "Mechanisms of mitochondrial fission and fusion." Cold

Spring Harb Perspect Biol 5(6). Vangavaragu, J. R., Valasani, K. R., Fang, D., Will iams, T. D., Yan, S. S. (2014). "Determination of Small Molecule

ABAD Inhibitors Crossing Blood-Brain Barrier and Pharmacokinetics." J Alzheimers Dis 42(1): 333-344.

Venditti, P., Di Stefano, L., Di Meo, S. (2013). "Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species." Mitochondrion 13(2): 71-82.

Vercauteren, F. G., Clerens, S., Roy, L., Hamel, N., Arckens, L., Vandesande, F., Alhonen, L., Janne, J., Szyf, M., Cuello, A. C. (2004). "Early dysregulation of hippocampal proteins in transgenic rats with Alzheimer's

disease-linked mutations in amyloid precursor protein and presenilin 1." Brain Res Mol Brain Res 132(2): 241-259.

Verdier, Y., Penke, B. (2004). "Binding sites of amyloid beta -peptide in cell plasma membrane and implications

for Alzheimer's disease." Curr Protein Pept Sci 5(1): 19-31. Vetrivel, K. S., Thinakaran, G. (2010). "Membrane rafts in Alzheimer's disease beta-amyloid production."

Biochim Biophys Acta 1801(8): 860-867. Vickers, J. C., Dickson, T. C., Adlard, P. A., Saunders, H. L., King, C. E., McCormack, G. (2000). "The cause of

neuronal degeneration in Alzheimer's disease." Prog Neurobiol 60(2): 139 -165. Vil lanueva, S., Steward, O. (2001). "Protein synthesis at the synapse: developmental changes, subcellular

localization and regional distribution of polypeptides synthesized in isolated dendritic fragments." Brain Res Mol Brain Res 91(1-2): 148-153.

Vos, M., Lauwers, E., Verstreken, P. (2010). "Synaptic mitochondria in synaptic transmission and organization of vesicle pools in health and disease." Front Synaptic Neurosci 2: 139.

Votyakova, T. V., Reynolds, I. J. (2001). "DeltaPsi(m)-Dependent and -independent production of reactive

oxygen species by rat brain mitochondria." J Neurochem 79(2): 266 -277. Völgyi, K., Gulyássy, P., Háden, K., Kis, V., Badics, K., Kékesi, K. A., Simor, A., Györffy, B., Tóth, E. A., Lubec, G.,

Juhász, G., Dobolyi, A. (2015b). "Synapti c mitochondria: a brain mitochondria cluster with a specific proteome." J Proteomics 120: 142-157.

132

Völgyi, K., Juhász, G., Kovács, Z., Penke, B. (2015a). "Dysfunction of Endoplasmic Reticulum (ER) and

Mitochondria (MT) in Alzheimer's Disease: The Role of the ER-MT Cross-Talk." Current Alzheimer Research 12(7).

Walker, D. G., McGeer, P. L. (1992). "Compl ement gene expression in human brain: comparison between

normal and Alzheimer disease cases." Brain Res Mol Brain Res 14(1-2): 109-116. Walsh, D. M., Klyubin, I., Fadeeva, J. V., Cullen, W. K., Anwyl, R., Wolfe, M. S., Rowan, M. J., Selkoe, D. J. (2002).

"Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo." Nature 416(6880): 535-539.

Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2004). "Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease." Neuron 44(1): 181-193.

Walsh, D. M., Selkoe, D. J. (2007). "A beta oligomers - a decade of discovery." J Neurochem 101(5): 1172-1184.

Wang, J., Tanila, H., Puolivali, J., Kadish, I., van Groen, T. (2003). "Gender differences in the amount and deposition of amyloidbeta in APPswe and PS1 double transgenic mice." Neurobiol Dis 14(3): 318 -327.

Wang, X., Schwarz, T. L. (2009). "Imaging axonal transport of mitochondria." Methods Enzymol 457: 319 -333. Wang, X., Su, B., Lee, H. G., Li, X., Perry, G., Smith, M. A., Zhu, X. (2009). "Impaired balance of mitochondrial

fission and fusion in Alzheimer's disease." J Neurosci 29(28): 9090 -9103. Wang, X., Su, B., Siedlak, S. L., Moreira, P. I., Fujioka, H., Wang, Y., Casadesus, G., Zhu, X. (2008). "Amyloid -beta

overproduction causes abnormal mitochondrial dynamics via differential modulation of mitochondrial fission/fusion proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 105(49): 19318 -19323.

Weldon, D. T., Rogers, S. D., Ghilardi, J. R., Finke, M. P., Cleary, J. P., O'Hare, E., Esler, W. P ., Maggio, J. E., Mantyh, P. W. (1998). "Fibril lar beta-amyloid induces microglial phagocytosis, expression of inducible nitric oxide synthase, and loss of a select population of neurons in the rat CNS in vivo." J Neurosci

18(6): 2161-2173. Wenk, G. L., McGann, K., Hauss-Wegrzyniak, B., Rosi, S. (2003). "The toxicity of tumor necrosis factor-alpha

upon cholinergic neurons within the nucleus basalis and the role of norepinephrine in the regulation of inflammation: implications for Alzheimer's disease." Neuroscience 121(3): 719-729.

Westerlund, M., Behbahani, H., Gellhaar, S., Forsell, C., Belin, A. C., Anvret, A., Zettergren, A., Nissbrandt, H., Lind, C., Sydow, O., Graff, C., Olson, L., Ankarcrona, M., Galter, D. (2011). "Altered enzymatic activity and allele frequency of OMI/HTRA2 in Alzheimer's disease." FASEB J 25(4): 1345-1352.

Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Coyle, J. T., DeLong, M. R. (1981). "Alzheimer disease: evidence for

selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis." Ann Neurol 10(2): 122-126. Wilkins, M. (2009). "Proteomics data mining." Expert Rev Proteomics 6(6): 599 -603. Wirths, O., Weis, J., Szczygielski, J., Multhaup, G., Bayer, T. A. (2006). "Axonopathy in an APP/PS1 transgenic

mouse model of Alzheimer's disease." Acta Neuropathol 111(4): 312-319. Wong, K. K., Ho, M. T., Lin, H. Q., Lau, K. F., Rudd, J. A., Chung, R. C., Fung, K. P., Shaw, P. C., Wan, D. C. (2010).

"Cryptotanshinone, an acetylcholinesterase inhibitor from Salvia miltiorrhiza, ameliorates scopolamine-induced amnesia in Morris water maze task." Planta Med 76(3): 228 -234.

Wu, J., Anwyl, R., Rowan, M. J. (1995). "beta-Amyloid-(1-40) increases long-term potentiation in rat hippocampus in vitro." Eur J Pharmacol 284(3): R1-3.

Wyss, M. T., Jolivet, R., Buck, A., Magistretti, P. J., Weber, B. (2011). "In vivo evidence for lactate as a neuronal

energy source." J Neurosci 31(20): 7477-7485. Xie, A., Gao, J., Xu, L., Meng, D. (2014). "Shared mechanisms of neurodegeneration in Alzhei mer's disease and

Parkinson's disease." Biomed Res Int 2014: 648740. Xu, X. (2009). "Gamma-secretase catalyzes sequential cleavages of the AbetaPP transmembrane domain." J

Alzheimers Dis 16(2): 211-224. Yagi, H., Katoh, S., Akiguchi, I., Takeda, T. (1988). "Age-related deterioration of ability of acquisition in memory

and learning in senescence accelerated mouse: SAM-P/8 as an animal model of disturbances in recent memory." Brain Res 474(1): 86-93.

Yamada, M., Chiba, T., Sasabe, J., Nawa, M., Tajima, H., Ni ikura, T., Terashita, K., Aiso, S., Kita, Y., Matsuoka, M., Nishimoto, I. (2005). "Implanted cannula -mediated repetitive administration of Abeta25-35 into the mouse cerebral ventricle effectively impairs spatial working memory." Behav Brain Res 164(2): 139 -

146. Yan, P., Bero, A. W., Cirrito, J. R., Xiao, Q., Hu, X., Wang, Y., Gonzales, E., Holtzman, D. M., Lee, J. M. (2009).

"Characterizing the appearance and growth of amyloid plaques in APP/PS1 mice." J Neurosci 29(34): 10706-10714.

133

Yan, J., Liu, X. H., Han, M. Z., Wang, Y. M., Sun, X. L., Yu, N., Li, T., Su, B., Chen, Z. Y. (2015). "Blockage of

GSK3beta-mediated Drp1 phosphorylation provides neuroprotection in neuronal and mouse models of Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 36(1): 211-227.

Yao, J., Du, H., Yan, S., Fang, F., Wang, C., Lue, L. F., Guo, L., Chen, D., Stern, D. M., Gunn Moore, F. J., Xi Chen,

J., Arancio, O., Yan, S. S. (2011). "Inhibition of amyloid-beta (Abeta) peptide-binding alcohol dehydrogenase-Abeta interaction reduces Abeta accumulation and improves mitochondrial function in a mouse model of Alzheimer's disease." J Neurosci 31(6): 2313-2320.

Yao, J., Irwin, R. W., Zhao, L., Nilsen, J., Hamilton, R. T., Brinton, R. D. (2009). "Mitochondrial bioenergetic deficit

precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease." Proc Natl Acad Sci U S A 106(34): 14670-14675.

Ye, C., Walsh, D. M., Selkoe, D. J., Hartley, D. M. (2004). "Amyloid beta -protein induced electrophysiological

changes are dependent on aggregation state: N-methyl-D-aspartate (NMDA) versus non-NMDA receptor/channel activation." Neurosci Lett 366(3): 320-325.

Yeung, K. C., Rose, D. W., Dhillon, A. S., Yaros, D., Gustafsson, M., Chatterjee, D., McFerran, B., Wyche, J., Kolch, W., Sedivy, J. M. (2001). "Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-kappaB-inducing kinase and

TAK1 and inhibits NF-kappaB activation." Mol Cell Biol 21(21): 7207-7217. Yoo, B. C., Fountoulakis, M., Cairns, N., Lubec, G. (2001). "Changes of voltage-dependent anion-selective

channel proteins VDAC1 and VDAC2 brain levels in patients with Alzheimer's disease and Down syndrome." Electrophoresis 22(1): 172-179.

Yudkoff, M., Nelson, D., Daikhin, Y., Erecinska, M. (1994). "Tricarboxylic acid cycle in rat brain synaptosomes. Fluxes and interactions with aspartate aminotransferase and malate/aspartate shuttle." J Biol Chem 269(44): 27414-27420.

Zahid, S., Oellerich, M., Asif, A. R., Ahmed, N. (2014). "Differential expression of proteins in brain regions of Alzheimer's disease patients." Neurochem Res 39(1): 208-215.

Zhang, L., Zhang, C., Zhu, Y., Cai, Q., Chan, P., Ueda, K., Yu, S., Yang, H. (2008). "Semi-quantitative analysis of alpha-synuclein in subcellular pools of rat brain neurons: an immunogold electron microscopic study

using a C-terminal specific monoclonal antibody." Brain Res 1244: 40-52. Zhang, Q. L., Jia, L., Jiao, X., Guo, W. L., Ji , J. W., Yang, H. L., Niu, Q. (2012). "APP/PS1 transgenic mice treated

with aluminum: an update of Alzheimer's disease model." Int J Immunopathol Phar macol 25(1): 49-58. Zarandi, M., Soos, K., Fulop, L., Bozso, Z., Datki, Z., Toth, G. K., Penke, B. (2007). "Synthesis of Abeta[1 -42] and

its derivatives with improved efficiency." J Pept Sci 13(2): 94-99. Zheng, H., Koo, E. H. (2006). "The amyloid precursor protein: beyond amyloid." Mol Neurodegener 1: 5. Zhu, X., Perry, G., Moreira, P. I., Aliev, G., Cash, A. D., Hirai, K., Smith, M. A. (2006). "Mitochondrial

abnormalities and oxidative imbalance in Alzheimer disease." J Alzheimers Dis 9(2): 147 -153. Zilka, N., Fi l ipcik, P., Koson, P., Fialova, L., Skrabana, R., Zilkova, M., Rolkova, G., Kontsekova, E., Novak, M.

(2006). "Truncated tau from sporadic Alzheimer's disease suffices to drive neurofibril lary degeneration in vivo." FEBS Lett 580(15): 3582-3588.

Zinsmaier, K. E., Babic, M., Russo, G. J. (2009). "Mitochondrial transport dynamics in axons and dendrites." Results Probl Cell Differ 48: 107-139.

134

Összefoglalás

Az Alzheimer-kór (AK) egy multifaktoriális, szinaptikus funkcióvesztéssel, majd

neuronpusztulással és memóriahanyatlással járó fehérjekonformációs neurodegeneratív

betegség. Az APP, valamint az Aβ és tau fehérjék felgyülemlése az AK legfőbb

neuropatológiai elváltozásai. Az AK korai patomechanizmusának feltárása elengedhetetlen a

korai, diagnosztizálható biomarkerek azonosításához. Az egyik legkorábbi detektálható

klinikai elváltozás az AK-os betegeknél a csökkent agyi metabolizmus, ami mitokondriális

zavarokra vezethető vissza. A szinaptikus mitokondriumok (sMito-ok) a neurodegeneratív és

pszichiátriai betegségekben fokozott érzékenységet mutatnak. Az azonban, hogy a szinaptikus

mitokondriális fehérjék milyen, szinapszisra specifikus funkcióval rendelkeznek, nem ismert.

A sMito-ok proteomikai jellemzéséhez teljes egéragyból izolált sMito és nem-szinaptikus

mitokondrium (nsMito) preparátumokat állítottunk elő, melyek tisztaságát

elektronmikroszkópiával és fluoreszcencia aktivált sejt analízis és szétválogatás módszerekkel

validáltuk. A proteomikai vizsgálatok alapján 22 szignifikánsan magasabb és 34

szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű fehérjét azonosítottunk az sMito-okban a nsMito-

okhoz képest, melyek közül a legjelentősebb fehérjéket Western blottal, illetve

immunhisztokémiával is igazoltuk. Eredményeink alapján elmondható, hogy a szinapszis

energiaellátását szolgáló citrát-kör jelentősen különbözik a kétféle mitokondrium

populációban, továbbá a sMito-ok fokozottabb érzékenységet mutatnak az oxidatív stresszre.

A fehérjék funkcionális csoportosítása alapján megállapítottuk, hogy a sMito-okban és a

nsMito-okban eltérő folyamatokban szerepet játszó fehérjék dúsulnak fel. A különböző

mitokondrium populációk proteomikai jellemzését követően az Aβ progresszió sMito-okra és

nsMito-okra gyakorolt hatását vizsgáltuk 3, 6 illetve 9 hónapos APP/PS1 egerekben. A

proteomikai vizsgálatok mellett a mitokondriumok funkcionális változásait is vizsgáltuk a

hidrogén-peroxid metabolizmus és oxigénfogyasztás szintjén. A proteomikai analízis során 60

különböző fehérjeváltozást azonosítottunk, melyek az APP túltermelés és Aβ felgyülemlés

mitokondriális folyamatokra gyakorolt hatását tükrözik. A legtöbb, Aβ hatására szignifikáns

változást mutató fehérje az elektrontranszport-lánc, citrát-kör, oxidatív stressz és apoptózis

folyamataiban játszik szerepet. A Htra2 és Ethe1 fehérjeváltozásokat Western blottal is

igazoltuk. A bioinformatikai analízisek felvetik a Tnf-α szabályozó szerepét a Aβ hatására

megváltozott mitokondriális fehérjékre. Adataink egy új kutatási megközelítést adnak az Aβ

progresszió hatására bekövetkező korai mitokondriális elváltozások vizsgálatában, ami az AK

korai, tünetmentes fázisának megértésében jelentős előrelépés lehet.

135

Summary

Alzheimer’s disease (AD) is a multifactorial protein misfolding based

neurodegenerative disease correlating with synaptic failure and memory impairment.

Overproduction of APP and accumulation of β-amyloid (Aβ) and tau proteins are important

neuropathological hallmarks of AD. The identification of early pathomechanisms of AD is

critically important for discovery of early diagnosis markers. Decreased brain metabolism is

one of the earliest clinical symptoms of AD that indicate mitochondrial dysfunction in the

brain. Synaptic mitochondria (sMitos) are more vulnerable in several neurodegenerative and

psychiatric disorders. However, the specific synaptic functions of the synaptic mitochondrial

proteins are unknown. To reveal sMito’s molecular characteristics, we isolated whole brain

sMito and non-synaptic mitochondria (nsMito) from mouse brain and sample purity was

validated by electron microscopy and fluorescence activated cell analysis and sorting.

Proteomic analysis revealed 22 proteins with significantly higher and 34 proteins with

significantly lower level in synaptic compared to non-synaptic mitochondria. The most

abundant protein differences were verified by Western blot and immunohistochemistry. The

proteomics data suggest altered tricarboxylic acid metabolism in energy supply of synapse

and high sensitivity of synapses to oxidative stress. Further functional clustering

demonstrated that proteins enriched in sMito or nsMito involved in different biological

processes. After proteomic characterization of the different mitochondrial populations we

performed a comprehensive study integrating synaptic and non-synaptic mitochondrial

proteome analysis in correlation with Aβ progression in APP/PS1 mice (3, 6 and 9 months of

age). In parallel with proteomics studies, functional changes in mitochondria via peroxide

metabolism and oxygen consumption were also recorded. We identified the changes of the

level of 60 different mitochondrial proteins, which reflect the progressive effect of APP

overproduction and Aβ accumulation on mitochondrial processes. Most of the proteins that

were significantly affected by Aβ play role in the mitochondrial electron transport chain,

citric acid cycle, oxidative stress or apoptosis. Altered expression levels of Htra2 and Ethe1

were confirmed also by Western blot analysis. The result of bioinformatical analysis suggests

a possible regulatory role of Tnf-α as a common regulator in Aβ mediated mitochondrial

protein changes. We hope to open a new path of research aiming early mitochondrial

molecular mechanisms of Aβ accumulation as a prodromal stage of human AD.

136

Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Juhász Gábornak, aki lehetővé tette

számomra, hogy már szakdolgozó korom óta a kutatócsoportjában dolgozhassak. Különösen

hálás vagyok azért, hogy mindig támogatott önálló ötleteim megvalósításában, miközben

tanácsaival segítette kutatói munkámat és alakította tudományos szemléletmódomat.

Köszönöm Dr. Erdei Annának és Dr. Sass Miklósnak, hogy tanulmányaimat a

Biológia Doktori Iskola Molekuláris sejt- és neurobiológiai doktori Programjában

végezhettem el.

Szeretném megköszönni Dr. Penke Botondnak az inspiráló szakmai konzultációkat és

az átadott tudást az Alzheimer-kór hátterében álló folyamatok megértésével kapcsolatban.

Köszönettel tartozom Dr. Kékesi Adrienna Katalinnak, Dr. Dobolyi Árpádnak és

Dr. Czurkó Andrásnak a kísérleti munkákban és a kéziratok megírásában nyújtott szakmai

segítségükért és áldozatos munkájukért.

Szeretném megköszönni Gulyássy Péternek, Háden Krisztinának, Badics Katának,

Györffy Balázsnak, Todorov Mihailnak, Dr. Simor Attilának, Dr. Orbán Gergelynek, valamint

a Proteomika Labor összes korábbi és jelenlegi munkatársának és szakdolgozójánák az

éveken át tartó közös munkát, szakmai segítséget és nem utolsó sorban a baráti légkört.

Külön köszönet illeti Kis Viktort a mikroszkópos munkákban nyújtott segítségéért,

lelkes együttműködésére bármikor számíthattam. Szeretnék köszönetet mondani Tóth

Eszternek és Dr. Matkó Jánosnak , akik nélkül a mitokondrium szortolás beállítása nem

valósulhatott volna meg.

Köszönet illeti Dr. Szabó Zoltán, Dr. Janáky Tamás, Dr. Drahos László és Dr. Gert

Lubec együttműködő partnereinket a tömegspektrometriás mérésekért, Dr. Tretter Lászlót a

mitokondriumok funkcionális vizsgálatában valamint Dr. Kardos Józsefet az amyloid oldatok

karakterizálásában nyújtott segítségéért.

Szeretnék köszönetet mondani szüleimnek, Völgyi Lászlóné sz. Komáromi Editnek és

Völgyi Lászlónak, akik gyerekkorom óta bíztattak, támogattak és lehetővé tették

tanulmányaim elvégzését.

Külön köszönet illeti páromat, Dr. Radnai Lászlót, aki végig lelkesített a doktori

tanulmányaim elvégzése során, támogatására és segítségére mindig számíthattam.

137

Publikációs lista

Az értekezéshez kapcsolódó saját közlemények

Völgyi K, Gulyássy P, Háden K, Kis V, Badics K, Kékesi KA, Simor A, Györffy B, Tóth EA, Lubec G, Juhász G, Dobolyi

A. Synaptic mitochondria: A brain mitochondria cluster with a specific proteome. J Proteomics. 2015 Apr 29;120:142-57. doi: 10.1016/j.jprot.2015.03.005. Epub 2015 Mar 14. PMID: 25782751

Völgyi K; Juhász G; Kovács Zs; Penke B Dysfunction of Endoplasmic Reticulum (ER) and Mitochondria (MT) in Alzheimer's Disease: the Role of the ER-

MT cross-talk. Curr Alzheimer Res. 2015 Jul 9. Epub ahead of print PMID: 26159206

Orbán G, Völgyi K, Juhász G, Penke B, Kékesi KA, Kardos J, Czurkó A. Different electrophysiological actions of 24- and 72-hour aggregated amyloid-beta oligomers on hippocampal field population spike in both anesthetized and awake rats. Brain Res. 2010 Oct 1;1354:227-35. doi: 10.1016/j.brainres.2010.07.061. Epub 2010 Jul 24.

PMID: 20659435 Völgyi K; Háden K; Kis V; Gulyássy P; Badics K; Györffy B A; Simor A; Szabó Z; Janáky T; Drahos L; Tretter L;

Dobolyi Á; Penke B; Juhász G; Kékesi AK Mitochondrial proteome and oxidative metabolism changes correlating with amyloid -β accumulation Kézirat elbírálás alatt

Egyéb közlemények

Györffy B, Kovács Z, Gulyássy P, Simor A, Völgyi K, Orbán G, Baracskay P, Szabó Z, Janáky T, Dobolyi A, Juhász G, Czurkó A, Kékesi KA. Brain protein expression changes in WAG/Rij rats, a genetic rat model of absence epilepsy after peripheral

l ipopolysaccharide treatment. Brain Behav Immun. 2014 Jan;35:86-95. doi: 10.1016/j.bbi.2013.09.001. Epub 2013 Sep 8. PMID: 24021561

A β amyloid progresszió hatása a mitokondriális proteomra és...

Documents

Transcript of A β amyloid progresszió hatása a mitokondriális proteomra és...