8 Αρχαίο DNA και Παλαιογενετική έρευνα εφαρμογές προοπτικές και περιορισμοί

Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου

Σύνοψη

Το παρόν κεφάλαιο αποτελεί μία συλλογή επίκαιρων γνώσεων και πρακτικών που αφορούν τις εφαρμογές του αρχαίου DNA (aDNA) στη σύγχρονη φυσική ανθρωπολογία Η επιτακτική ανάγκη διεπιστημονικών προσεγγίσε-ων στη μελέτη σύγχρονων και παρελθόντων πληθυσμών καθιστά κρίσιμη την ύπαρξη σχετικών εξειδικευμένων γνώσεων των Ελλήνων φυσικών ανθρωπολόγων και βιοαρχαιολόγων στο εν λόγω ερευνητικό πεδίο Παρουσι-άζονται πρωτόκολλα εργασίας μεθοδολογικά προβλήματα και νέες τεχνολογικές τάσεις καθώς και τα πρώτα αποτελέσματα ερευνών του aDNA από τον ελλαδικό χώρο Σκοπός του κεφαλαίου είναι η εξοικείωση των νέων επιστημόνων με τις σύγχρονες τάσεις της παλαιογενετικής έρευνας ενός ταχέως αναπτυσσόμενου και πρωτοπό-ρου επιστημονικού πεδίου

Προαπαιτούμενη γνώση

Για την κατανόηση του κεφαλαίου είναι απαραίτητες βασικές γνώσεις μοριακής βιολογίας και γενετικής

81 ΕισαγωγήΗ εγγενής ανθρώπινη περιέργεια ανέκαθεν αναζητεί απαντήσεις σχετικές με την προέλευση της ανθρωπό-τητας τη δομή των αρχαίων κοινωνιών τις μεταναστεύσεις την εξάπλωση ή εξαφάνιση ανθρώπινων πλη-θυσμών Η διερεύνηση της γενετικής δομής αρχαίων πληθυσμών με την εφαρμογή μεθόδων της μοριακής ανθρωπολογίας προσφέρει απαντήσεις σε κάποια απrsquo αυτά τα άμεσου ανθρωπολογικού ή αρχαιολογικού ενδι-αφέροντος ερωτήματα Ο όρος laquoμοριακή ανθρωπολογίαraquo οριζόμενος ως το πεδίο που ασχολείται με την ανα-σύσταση φυλογενετικών σχέσεων μέσω συγκρίσεων γενετικών δεδομένων εισάγεται για πρώτη φορά το 1962 από τον βιολόγο Zuckerkandal σε συνέδριο που πραγματοποιήθηκε στην Αυστρία με θέμα ldquoClassification and Human Evolutionrsquorsquo (Destro-Bisol et al 2010) Από τότε στον ευρύτερο τομέα της μοριακής βιολογίας έχουν συντελεστεί σημαντικές επιστημονικές καινοτομίες Παράλληλα αναπτύχθηκε ο τομέας της γενετικής ενώ τα τελευταία χρόνια έχουμε περάσει στην εποχή της γονιδιωματικής

Τι είναι όμως η παλαιογενετική και το αρχαίο DNA Ο όρος laquoαρχαίοraquo DNA αναφέρεται στην απομόνωση μικρής συνήθως ποσότητας γενετικού υλικού από νεκρούς οργανισμούς ανθρώπων ζώων και φυτών Σήμε-ρα 32 χρόνια μετά από την πρώτη ανάκτηση μικρής αλληλουχίας (221 ζεύγη βάσεων) μιτοχονδριακού DNA από ένα εξαφανισμένο μέλος της οικογένειας του αλόγου (quagga) (Higuchi et al 1984) η έρευνα στον χώρο του αρχαίου DNA έχει κατακλύσει ένα ευρύ σύνολο επιστημονικών πεδίων Η παλαιογενετική έρευνα αποτε-λεί πλέον ένα σημαντικό μεθοδολογικό όργανο της μοριακής και της εξελικτικής βιολογίας Χρησιμοποιείται από τη ζωολογία και τη βοτανική για να διαφωτίσει τη βιολογία και την εξέλιξη εξαφανισμένων ειδών καθώς και για να ανακατασκευάσει το παλαιοπεριβάλλον σε ολόκληρο τον πλανήτη Παρέχει σημαντικές πληροφο-ρίες για τη γεωγραφική κατανομή της ανθρώπινης γενετικής ποικιλότητας και την ανασύσταση της βιολογικής ιστορίας αρχαίων και σύγχρονων πληθυσμιακών ομάδων ενώ παράλληλα η χαρτογράφηση γονιδίων σε σύγ-χρονους πληθυσμούς και η μελέτη αυτών σε αρχαιολογικούς διαγράφει την εξελικτική τους πορεία Αποτελεί τέλος ένα ισχυρό εργαλείο στη σύγχρονη ιατρική γενετική την ανθρώπινη φυσιολογία και παθολογία καθώς και στην ιατροδικαστική

Η ανακάλυψη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) (Mullis et al 1986) έδωσε την απαιτούμενη ώθηση για την καθιέρωση αυτών των αναλύσεων ενώ τα τελευταία χρόνια οι μέθοδοι νέας γενιάς αλληλούχησης (Next-Generation-Sequencing NGS) έχουν οδηγήσει σε υπερδιπλασια-σμό των γενετικών πληροφοριών και στη δυνατότητα αλληλούχησης ολόκληρων γονιδιωμάτων (Veeramah amp Hammer 2014) περνώντας στην εποχή της παλαιογονιδιωματικής Η νέα τεχνολογία εφαρμόστηκε αμέσως στον χώρο του αρχαίου DNA Ήδη από το 2006 έχουμε τη δημοσίευση τμήματος του πυρηνικού γονιδιώματος των μαμούθ (Poinar et al 2006) και το 2010 έχουμε τη δημοσίευση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεά-ντερταλ (Green et al 2010) και ενός Εσκιμώου ηλικίας 4500 χιλιάδων χρόνων (Rasmussen et al 2010) ενώ μέχρι το τέλος του 2015 δημοσιεύθηκαν πάνω από 100 γονιδιώματα προϊστορικών πληθυσμών Παρακάτω

αναπτύσσονται όλα τα μεθοδολογικά ζητήματα που αφορούν την παλαιογενετική έρευνα από τη δειγματολη-ψία μέχρι την αλληλούχηση και τη στατιστική ανάλυση καθώς και οι εφαρμογές αυτής στην ανθρωπολογική και αρχαιολογική έρευνα

82 DNA το δομικό στοιχείο της ζωής Όλοι οι οργανισμοί σrsquo αυτόν τον πλανήτη έχουν ως βασικό στοιχείο του βιολογικού τους συστήματος DNA ή δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ Στη βασική του δομή το μόριο του DNA είναι μια διπλή έλικα Η έλικα αποτελεί-ται από βάσεις την αδενίνη τη θυμίνη τη γουανίνη και την κυτοσίνη οι οποίες ονομάζονται νουκλεοτίδια και από ομάδες σακχάρου και φωσφόρου (Εικ 81) Οι βάσεις έχουν μια συμπληρωματική σχέση δηλαδή απέναντι από μια αδενίνη βρίσκεται πάντα μια θυμίνη και απέναντι από μια γουανίνη μια κυτοσίνη Σε κάθε κύτταρο το DNA βρίσκεται στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια -τα μικρά οργανίδια που παράγουν ενέργεια (Εικ 82) Διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην οργάνωση και τη λειτουργία σχεδόν όλων όσων συμβαίνουν στο εσωτερικό ενός οργανισμού Στον ανθρώπινο οργανισμό το πυρηνικό DNA αποτελείται από τρία (3) δισεκα-τομμύρια ζεύγη βάσεων ενώ το μιτοχονδριακό από περίπου 16500 ζεύγη βάσεων Τα δισεκατομμύρια των βάσεων χωρούν στον πυρήνα των κυττάρων με τη συμπύκνωση του DNA σε περιελιγμένες μάζες τα χρωμο-σώματα

Εικόνα 81 Σχηματική αναπαράσταση της διπλής έλικας του DNA

Το ανθρώπινο DNA είναι ομαδοποιημένο σε 46 χρωμοσώματα και αντιπροσωπεύεται από 23 ζεύγη Στο κάθε ζεύγος ένα προέρχεται από τον πατέρα και ένα από τη μητέρα Το πυρηνικό DNA κληρονομείται και από τους δύο αντίθετα το μιτοχονδριακό αποκλειστικά από τη μητέρα Όλες οι βασικές λειτουργίες του οργα-νισμού μας καθώς και η δομή και η εμφάνισή μας καθορίζονται από το DNA Τα γονίδια είναι τμήματα του DNA που κωδικοποιούν αυτές τις πληροφορίες Το σύνολο των πληροφοριών στο DNA ενός οργανισμού ονο-μάζεται γονιδίωμα Μέχρι σήμερα έχουν χαρτογραφηθεί περίπου 25000 γονίδια με γνωστές λειτουργίες για τον ανθρώπινο οργανισμό Αυτό αντιστοιχεί σε περίπου 2 του ανθρώπινου γονιδιώματος Μέχρι το 2012 οι επιστήμονες χαρακτήριζαν το υπόλοιπο 98 ως άχρηστο DNA (junk DNA) Ωστόσο σήμερα έχει αποδειχθεί ότι και το υπόλοιπο τμήμα επιτελεί πολύ σημαντικές λειτουργίες (Maurano et al 2015)

Εικόνα 82 Σχηματική αναπαράσταση ενός κυττάρου

83 Συλλογή και ανάλυση του παλαιογενετικού υλικού Σήμερα είναι δυνατή η μελέτη του DNA όχι μόνο από ζωντανούς οργανισμούς αλλά και από νεκρούς οργα-νισμούς ανθρώπων ζώων και φυτών Το υλικό από όπου μπορούμε να συλλέξουμε δείγματα για να απομο-νώσουμε το παλαιογενετικό υλικό μπορεί να είναι τα σκελετικά κατάλοιπα τμήματα του οργανισμού όπως δέρμα τρίχες φτερά κουκούλια καθώς και προϊόντα τους όπως σάλιο αίμα και περιττώματα

Η απόκτηση ενδογενούς αυθεντικού DNA εξαρτάται άμεσα και από την ποιότητα διατήρησής του Μετά τον θάνατο του οργανισμού ακολουθεί η αυτόλυση και η σήψη Το DNA αρχίζει να αποικοδομείται μέσω των ενδογενών νουκλεασών η ποσότητα και η ποιότητά του σταδιακά μειώνεται Κάτω από ορισμένες ταφονο-μικές συνθήκες όπως η ταχύτητα αποξήρανσης η χαμηλή θερμοκρασία το pΗ και η υψηλή συγκέντρωση αλάτων η αποικοδόμηση μπορεί να σταματήσει πριν καταστραφεί πλήρως το ενδογενές DNA (Hofreiter et al 2001a) Ο μέγιστος χρόνος διατήρησης γενετικού υλικού έχει υπολογιστεί στα 100000 χρόνια αν και είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τον σπουδαιότερο ρόλο στην καταστροφή του DNA παίζει το μικροπεριβάλλον και οι ταφονομικές συνθήκες (Smith et al 2001) Ακόμα και αν επιβιώσει το DNA είναι κατακερματισμένο σε μικρά τμήματα (lt500 νουκλεοτιδικές βάσεις) χημικά τροποποιημένο και σε πολύ μικρή ποσότητα συγκρι-τικά με μοντέρνο DNA καθιστώντας το εξαιρετικά επιρρεπές στην εξωγενή μόλυνση Ειδικά το DNA που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δυσκολότερο να διατηρηθεί συγκριτικά με το μιτοχονδριακό DNA που βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα στα μιτοχόνδρια του κυττάρου Αυτός είναι ένας από τους λόγους που οι περισσότερες παλαιογενετικές έρευνες επικεντρώνονται στο μιτοχονδριακό DNA Οι αναλύσεις γονιδίων ταυτοποίησης προσώπων με STRs και αναλύσεις στο Υ-χρωμόσωμα απαιτούν τη διατήρηση του πυρηνικού DNA γιrsquo αυτό και εμφανίζουν μικρότερα ποσοστά επιτυχίας από τις αναλύσεις στο μιτοχονδριακό DNA

Το μεγαλύτερο πρόβλημα στην παλαιογενετική έρευνα είναι η μόλυνση Το αυθεντικό DNA είναι ενδογε-νές προέρχεται δηλαδή από τον πεθαμένο οργανισμό ενδέχεται όμως να είναι εξωγενές να προέρχεται δηλαδή από έναν άλλο οργανισμό που μόλυνε δευτερογενώς το δείγμα Ένα δείγμα μπορεί να μολυνθεί πολύ εύκολα καθrsquo όλη τη διάρκεια της αναλυτικής διαδικασίας ανασκαφή δειγματοληψία εργαστηριακή ανάλυ-ση Η μόλυνση είναι ιδιαιτέρως επικίνδυνη στα ανθρώπινα δείγματα διότι οι ανασκαφείς οι αρχαιολόγοι οι ανθρωπολόγοι οι παλαιογενετιστές καθώς και οι άνθρωποι που παρασκευάζουν τα αντιδραστήρια απο-τελούν δυνητικές εστίες μόλυνσης Στα ζωικά δείγματα ο κίνδυνος περιορίζεται στην επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα στις ζωικές τροφές και σε εργαστηριακά υλικά ζωικής προέλευσης που μπορεί να υπάρχουν στον ανασκαφικό και στον εργαστηριακό χώρο Η ανάλυση και η ταυτοποίηση του γενετικού υλικού των αν-

θρωπολόγων του ανασκαφικού προσωπικού και του ίδιου του παλαιογενετιστή μπορεί να αποκλείσει ότι μια ασυμφωνία στην αλληλούχηση οφείλεται σε μοντέρνα μόλυνση

Για να είμαστε σίγουροι ότι το DNA που εξάγουμε είναι ενδογενές ακολουθούμε αυστηρούς κανόνες τόσο πριν λάβουμε το δείγμα μας όσο και αφού μεταφέρουμε το δείγμα μας στο ειδικό εργαστήριο Παρακάτω παρουσιάζονται συνοπτικά όλα τα στάδια της εργαστηριακής διαδικασίας

831 Συλλογή των δειγμάτων Η μελέτη του αρχαίου DNA ξεκινάει στην ανασκαφή Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις του αρχαίου DNA προέρχονται συνήθως από σκελετικό υλικό που έχει ήδη ανασκαφεί και βρίσκεται σε μου-σειακές και αρχαιολογικές συλλογές Με την έλευση και την εδραίωση της νέας τεχνολογίας οι αρχαιολόγοι ενδιαφέρονται να συλλέξουν το υλικό τους ήδη από την ανασκαφή ακολουθώντας κατάλληλους κανόνες

Κατά τη διάρκεια της συλλογής της μεταφοράς και της δειγματοληψίας του σκελετικού υλικού θα πρέπει να γίνεται χρήση γαντιών και μάσκας προσώπου και οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία να καθαρίζονται Επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα στην επιφάνεια του δέρματος και τα πτύελα από τη στοματική κοιλότητα περιέ-χουν DNA κάθε ερευνητής που έρχεται σε επαφή με σκελετικό ή οδοντικό υλικό μπορεί να μολύνει το δείγμα Οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τη δειγματοληψία θα πρέπει να καθαρίζο-νται ακολουθώντας βασικούς κανόνες αποδόμησης του DNA για να αποφεύγεται ο κίνδυνος μόλυνσης από τον ερευνητή αλλά και η επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα Το πιο διαδεδομένο και εύκολα διαθέσιμο υλικό καθαρισμού των εργαλείων είναι το υποχλωριώδες νάτριο δηλαδή η χλωρίνη (Εικ 83)

Εικόνα 83 Βασικά εργαλεία που χρειάζονται σε μια δειγματοληψία με σκοπό την παλαιογενετική ανάλυση

Τα τμήματα οστών και δοντιών που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή μελλοντικά σε γενετικές ανα-λύσεις δεν θα πρέπει να πλένονται Ο καθαρισμός και ιδιαίτερα το πλύσιμο των οστών μεταφέρει πολύ εύκολα τη μόλυνση από την εξωτερική επιφάνεια στους εσωτερικούς πόρους του οστού ή του δοντιού Ο πιθανός κίνδυνος είναι μεγαλύτερος διότι είναι πιο εύκολο να απομακρυνθεί η μόλυνση μηχανικά και χημικά από το εξωτερικό παρά από το εσωτερικό του δείγματος (Kirsanow amp Burger 2012)Τα δείγματα είναι σημαντικό να τοποθετούνται σε καθαρά δοχεία και να τοποθετούνται σε χώρο με σταθερά χαμηλή θερμοκρασία χωρίς υγρα-σία και άμεση έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία για αποφυγή της περαιτέρω καταστροφής του DNA (Burger amp Bollongino 2010)

Οστά και δόντια σπασμένα και ταφονομικά αλλαγμένα από ρίζες φυτών μικροοργανισμούς υγρασία όξι-νο ταφικό περιβάλλον εμφανίζουν γενικά μικρό ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA Εκτός από τη μακροσκοπική εξέταση υπάρχουν αρκετές μέθοδοι ελέγχου (ακτινολογικές μικροσκοπικές) του βαθμού διατήρησης του σκελετικού και οδοντικού υλικού που μπορούν να χρησιμοποιηθούν προτού προχωρήσει κάποιος στη δειγματοληψία

Σήμερα γνωρίζουμε ότι στη λιθοειδή απόφυση (Εικ 84) ένα τμήμα εσωτερικά του κρανίου που βρίσκε-ται πίσω από τον ακουστικό πόρο (βλ κεφάλαιο 1) διατηρείται το DNA σε άριστη ποσότητα και ποιότητα (Gamba et al 2014) Στην περίπτωση που το συγκεκριμένο τμήμα δεν σώζεται θα πρέπει να προτιμώνται ένα

ή δύο ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές αλλοιώσεις όπως τερηδόνα έντονη αποτριβή ή τμήματα (1-2 εκατο-στά) συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δρά-σης μικροοργανισμών Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται διότι η πορώδης μορφολογία τους ευνοεί περισσότερο την εξωγενή μόλυνση και την καταστροφή του γενετικού υλικού λόγω της δράσης μικροοργανισμών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων (Εικ 85)

Εικόνα 84 Λιθοειδής απόφυση του κροταφικού οστού ενός ανθρώπινου κρανίου

Εικόνα 85 Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμο-ποιούνται στη δειγματοληψία για έρευνα αρχαίου DNA Θα πρέπει να προτιμώνται ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές

αλλοιώσεις ή τμήματα συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη δράσης μικροοργανισμών

Το μέγεθος του δείγματος μπορεί να αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα Αυτό συμβαίνει κυρίως όταν το οστεολογικό υλικό είναι πολύ περιορισμένο και η σημαντικότητα του ευρήματος δεν επιτρέπει εκτεταμένη δειγματοληψία Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA περίπου 400 βάσεων Η κάθε αντίδραση στόχευε στην ανάλυση ενός μικρού τμήματος περίπου 100 βάσεων η οποία έπρεπε να επαναληφθεί αρκετές φορές Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρου του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος με πολύ λίγες αντιδράσεις

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

αναπτύσσονται όλα τα μεθοδολογικά ζητήματα που αφορούν την παλαιογενετική έρευνα από τη δειγματολη-ψία μέχρι την αλληλούχηση και τη στατιστική ανάλυση καθώς και οι εφαρμογές αυτής στην ανθρωπολογική και αρχαιολογική έρευνα

82 DNA το δομικό στοιχείο της ζωής Όλοι οι οργανισμοί σrsquo αυτόν τον πλανήτη έχουν ως βασικό στοιχείο του βιολογικού τους συστήματος DNA ή δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ Στη βασική του δομή το μόριο του DNA είναι μια διπλή έλικα Η έλικα αποτελεί-ται από βάσεις την αδενίνη τη θυμίνη τη γουανίνη και την κυτοσίνη οι οποίες ονομάζονται νουκλεοτίδια και από ομάδες σακχάρου και φωσφόρου (Εικ 81) Οι βάσεις έχουν μια συμπληρωματική σχέση δηλαδή απέναντι από μια αδενίνη βρίσκεται πάντα μια θυμίνη και απέναντι από μια γουανίνη μια κυτοσίνη Σε κάθε κύτταρο το DNA βρίσκεται στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια -τα μικρά οργανίδια που παράγουν ενέργεια (Εικ 82) Διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην οργάνωση και τη λειτουργία σχεδόν όλων όσων συμβαίνουν στο εσωτερικό ενός οργανισμού Στον ανθρώπινο οργανισμό το πυρηνικό DNA αποτελείται από τρία (3) δισεκα-τομμύρια ζεύγη βάσεων ενώ το μιτοχονδριακό από περίπου 16500 ζεύγη βάσεων Τα δισεκατομμύρια των βάσεων χωρούν στον πυρήνα των κυττάρων με τη συμπύκνωση του DNA σε περιελιγμένες μάζες τα χρωμο-σώματα

Εικόνα 81 Σχηματική αναπαράσταση της διπλής έλικας του DNA

Το ανθρώπινο DNA είναι ομαδοποιημένο σε 46 χρωμοσώματα και αντιπροσωπεύεται από 23 ζεύγη Στο κάθε ζεύγος ένα προέρχεται από τον πατέρα και ένα από τη μητέρα Το πυρηνικό DNA κληρονομείται και από τους δύο αντίθετα το μιτοχονδριακό αποκλειστικά από τη μητέρα Όλες οι βασικές λειτουργίες του οργα-νισμού μας καθώς και η δομή και η εμφάνισή μας καθορίζονται από το DNA Τα γονίδια είναι τμήματα του DNA που κωδικοποιούν αυτές τις πληροφορίες Το σύνολο των πληροφοριών στο DNA ενός οργανισμού ονο-μάζεται γονιδίωμα Μέχρι σήμερα έχουν χαρτογραφηθεί περίπου 25000 γονίδια με γνωστές λειτουργίες για τον ανθρώπινο οργανισμό Αυτό αντιστοιχεί σε περίπου 2 του ανθρώπινου γονιδιώματος Μέχρι το 2012 οι επιστήμονες χαρακτήριζαν το υπόλοιπο 98 ως άχρηστο DNA (junk DNA) Ωστόσο σήμερα έχει αποδειχθεί ότι και το υπόλοιπο τμήμα επιτελεί πολύ σημαντικές λειτουργίες (Maurano et al 2015)

Εικόνα 82 Σχηματική αναπαράσταση ενός κυττάρου

83 Συλλογή και ανάλυση του παλαιογενετικού υλικού Σήμερα είναι δυνατή η μελέτη του DNA όχι μόνο από ζωντανούς οργανισμούς αλλά και από νεκρούς οργα-νισμούς ανθρώπων ζώων και φυτών Το υλικό από όπου μπορούμε να συλλέξουμε δείγματα για να απομο-νώσουμε το παλαιογενετικό υλικό μπορεί να είναι τα σκελετικά κατάλοιπα τμήματα του οργανισμού όπως δέρμα τρίχες φτερά κουκούλια καθώς και προϊόντα τους όπως σάλιο αίμα και περιττώματα

Η απόκτηση ενδογενούς αυθεντικού DNA εξαρτάται άμεσα και από την ποιότητα διατήρησής του Μετά τον θάνατο του οργανισμού ακολουθεί η αυτόλυση και η σήψη Το DNA αρχίζει να αποικοδομείται μέσω των ενδογενών νουκλεασών η ποσότητα και η ποιότητά του σταδιακά μειώνεται Κάτω από ορισμένες ταφονο-μικές συνθήκες όπως η ταχύτητα αποξήρανσης η χαμηλή θερμοκρασία το pΗ και η υψηλή συγκέντρωση αλάτων η αποικοδόμηση μπορεί να σταματήσει πριν καταστραφεί πλήρως το ενδογενές DNA (Hofreiter et al 2001a) Ο μέγιστος χρόνος διατήρησης γενετικού υλικού έχει υπολογιστεί στα 100000 χρόνια αν και είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τον σπουδαιότερο ρόλο στην καταστροφή του DNA παίζει το μικροπεριβάλλον και οι ταφονομικές συνθήκες (Smith et al 2001) Ακόμα και αν επιβιώσει το DNA είναι κατακερματισμένο σε μικρά τμήματα (lt500 νουκλεοτιδικές βάσεις) χημικά τροποποιημένο και σε πολύ μικρή ποσότητα συγκρι-τικά με μοντέρνο DNA καθιστώντας το εξαιρετικά επιρρεπές στην εξωγενή μόλυνση Ειδικά το DNA που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δυσκολότερο να διατηρηθεί συγκριτικά με το μιτοχονδριακό DNA που βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα στα μιτοχόνδρια του κυττάρου Αυτός είναι ένας από τους λόγους που οι περισσότερες παλαιογενετικές έρευνες επικεντρώνονται στο μιτοχονδριακό DNA Οι αναλύσεις γονιδίων ταυτοποίησης προσώπων με STRs και αναλύσεις στο Υ-χρωμόσωμα απαιτούν τη διατήρηση του πυρηνικού DNA γιrsquo αυτό και εμφανίζουν μικρότερα ποσοστά επιτυχίας από τις αναλύσεις στο μιτοχονδριακό DNA

Το μεγαλύτερο πρόβλημα στην παλαιογενετική έρευνα είναι η μόλυνση Το αυθεντικό DNA είναι ενδογε-νές προέρχεται δηλαδή από τον πεθαμένο οργανισμό ενδέχεται όμως να είναι εξωγενές να προέρχεται δηλαδή από έναν άλλο οργανισμό που μόλυνε δευτερογενώς το δείγμα Ένα δείγμα μπορεί να μολυνθεί πολύ εύκολα καθrsquo όλη τη διάρκεια της αναλυτικής διαδικασίας ανασκαφή δειγματοληψία εργαστηριακή ανάλυ-ση Η μόλυνση είναι ιδιαιτέρως επικίνδυνη στα ανθρώπινα δείγματα διότι οι ανασκαφείς οι αρχαιολόγοι οι ανθρωπολόγοι οι παλαιογενετιστές καθώς και οι άνθρωποι που παρασκευάζουν τα αντιδραστήρια απο-τελούν δυνητικές εστίες μόλυνσης Στα ζωικά δείγματα ο κίνδυνος περιορίζεται στην επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα στις ζωικές τροφές και σε εργαστηριακά υλικά ζωικής προέλευσης που μπορεί να υπάρχουν στον ανασκαφικό και στον εργαστηριακό χώρο Η ανάλυση και η ταυτοποίηση του γενετικού υλικού των αν-

θρωπολόγων του ανασκαφικού προσωπικού και του ίδιου του παλαιογενετιστή μπορεί να αποκλείσει ότι μια ασυμφωνία στην αλληλούχηση οφείλεται σε μοντέρνα μόλυνση

Για να είμαστε σίγουροι ότι το DNA που εξάγουμε είναι ενδογενές ακολουθούμε αυστηρούς κανόνες τόσο πριν λάβουμε το δείγμα μας όσο και αφού μεταφέρουμε το δείγμα μας στο ειδικό εργαστήριο Παρακάτω παρουσιάζονται συνοπτικά όλα τα στάδια της εργαστηριακής διαδικασίας

831 Συλλογή των δειγμάτων Η μελέτη του αρχαίου DNA ξεκινάει στην ανασκαφή Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις του αρχαίου DNA προέρχονται συνήθως από σκελετικό υλικό που έχει ήδη ανασκαφεί και βρίσκεται σε μου-σειακές και αρχαιολογικές συλλογές Με την έλευση και την εδραίωση της νέας τεχνολογίας οι αρχαιολόγοι ενδιαφέρονται να συλλέξουν το υλικό τους ήδη από την ανασκαφή ακολουθώντας κατάλληλους κανόνες

Κατά τη διάρκεια της συλλογής της μεταφοράς και της δειγματοληψίας του σκελετικού υλικού θα πρέπει να γίνεται χρήση γαντιών και μάσκας προσώπου και οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία να καθαρίζονται Επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα στην επιφάνεια του δέρματος και τα πτύελα από τη στοματική κοιλότητα περιέ-χουν DNA κάθε ερευνητής που έρχεται σε επαφή με σκελετικό ή οδοντικό υλικό μπορεί να μολύνει το δείγμα Οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τη δειγματοληψία θα πρέπει να καθαρίζο-νται ακολουθώντας βασικούς κανόνες αποδόμησης του DNA για να αποφεύγεται ο κίνδυνος μόλυνσης από τον ερευνητή αλλά και η επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα Το πιο διαδεδομένο και εύκολα διαθέσιμο υλικό καθαρισμού των εργαλείων είναι το υποχλωριώδες νάτριο δηλαδή η χλωρίνη (Εικ 83)

Εικόνα 83 Βασικά εργαλεία που χρειάζονται σε μια δειγματοληψία με σκοπό την παλαιογενετική ανάλυση

Τα τμήματα οστών και δοντιών που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή μελλοντικά σε γενετικές ανα-λύσεις δεν θα πρέπει να πλένονται Ο καθαρισμός και ιδιαίτερα το πλύσιμο των οστών μεταφέρει πολύ εύκολα τη μόλυνση από την εξωτερική επιφάνεια στους εσωτερικούς πόρους του οστού ή του δοντιού Ο πιθανός κίνδυνος είναι μεγαλύτερος διότι είναι πιο εύκολο να απομακρυνθεί η μόλυνση μηχανικά και χημικά από το εξωτερικό παρά από το εσωτερικό του δείγματος (Kirsanow amp Burger 2012)Τα δείγματα είναι σημαντικό να τοποθετούνται σε καθαρά δοχεία και να τοποθετούνται σε χώρο με σταθερά χαμηλή θερμοκρασία χωρίς υγρα-σία και άμεση έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία για αποφυγή της περαιτέρω καταστροφής του DNA (Burger amp Bollongino 2010)

Οστά και δόντια σπασμένα και ταφονομικά αλλαγμένα από ρίζες φυτών μικροοργανισμούς υγρασία όξι-νο ταφικό περιβάλλον εμφανίζουν γενικά μικρό ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA Εκτός από τη μακροσκοπική εξέταση υπάρχουν αρκετές μέθοδοι ελέγχου (ακτινολογικές μικροσκοπικές) του βαθμού διατήρησης του σκελετικού και οδοντικού υλικού που μπορούν να χρησιμοποιηθούν προτού προχωρήσει κάποιος στη δειγματοληψία

Σήμερα γνωρίζουμε ότι στη λιθοειδή απόφυση (Εικ 84) ένα τμήμα εσωτερικά του κρανίου που βρίσκε-ται πίσω από τον ακουστικό πόρο (βλ κεφάλαιο 1) διατηρείται το DNA σε άριστη ποσότητα και ποιότητα (Gamba et al 2014) Στην περίπτωση που το συγκεκριμένο τμήμα δεν σώζεται θα πρέπει να προτιμώνται ένα

ή δύο ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές αλλοιώσεις όπως τερηδόνα έντονη αποτριβή ή τμήματα (1-2 εκατο-στά) συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δρά-σης μικροοργανισμών Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται διότι η πορώδης μορφολογία τους ευνοεί περισσότερο την εξωγενή μόλυνση και την καταστροφή του γενετικού υλικού λόγω της δράσης μικροοργανισμών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων (Εικ 85)

Εικόνα 84 Λιθοειδής απόφυση του κροταφικού οστού ενός ανθρώπινου κρανίου

Εικόνα 85 Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμο-ποιούνται στη δειγματοληψία για έρευνα αρχαίου DNA Θα πρέπει να προτιμώνται ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές

αλλοιώσεις ή τμήματα συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη δράσης μικροοργανισμών

Το μέγεθος του δείγματος μπορεί να αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα Αυτό συμβαίνει κυρίως όταν το οστεολογικό υλικό είναι πολύ περιορισμένο και η σημαντικότητα του ευρήματος δεν επιτρέπει εκτεταμένη δειγματοληψία Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA περίπου 400 βάσεων Η κάθε αντίδραση στόχευε στην ανάλυση ενός μικρού τμήματος περίπου 100 βάσεων η οποία έπρεπε να επαναληφθεί αρκετές φορές Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρου του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος με πολύ λίγες αντιδράσεις

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 82 Σχηματική αναπαράσταση ενός κυττάρου

83 Συλλογή και ανάλυση του παλαιογενετικού υλικού Σήμερα είναι δυνατή η μελέτη του DNA όχι μόνο από ζωντανούς οργανισμούς αλλά και από νεκρούς οργα-νισμούς ανθρώπων ζώων και φυτών Το υλικό από όπου μπορούμε να συλλέξουμε δείγματα για να απομο-νώσουμε το παλαιογενετικό υλικό μπορεί να είναι τα σκελετικά κατάλοιπα τμήματα του οργανισμού όπως δέρμα τρίχες φτερά κουκούλια καθώς και προϊόντα τους όπως σάλιο αίμα και περιττώματα

Η απόκτηση ενδογενούς αυθεντικού DNA εξαρτάται άμεσα και από την ποιότητα διατήρησής του Μετά τον θάνατο του οργανισμού ακολουθεί η αυτόλυση και η σήψη Το DNA αρχίζει να αποικοδομείται μέσω των ενδογενών νουκλεασών η ποσότητα και η ποιότητά του σταδιακά μειώνεται Κάτω από ορισμένες ταφονο-μικές συνθήκες όπως η ταχύτητα αποξήρανσης η χαμηλή θερμοκρασία το pΗ και η υψηλή συγκέντρωση αλάτων η αποικοδόμηση μπορεί να σταματήσει πριν καταστραφεί πλήρως το ενδογενές DNA (Hofreiter et al 2001a) Ο μέγιστος χρόνος διατήρησης γενετικού υλικού έχει υπολογιστεί στα 100000 χρόνια αν και είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τον σπουδαιότερο ρόλο στην καταστροφή του DNA παίζει το μικροπεριβάλλον και οι ταφονομικές συνθήκες (Smith et al 2001) Ακόμα και αν επιβιώσει το DNA είναι κατακερματισμένο σε μικρά τμήματα (lt500 νουκλεοτιδικές βάσεις) χημικά τροποποιημένο και σε πολύ μικρή ποσότητα συγκρι-τικά με μοντέρνο DNA καθιστώντας το εξαιρετικά επιρρεπές στην εξωγενή μόλυνση Ειδικά το DNA που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δυσκολότερο να διατηρηθεί συγκριτικά με το μιτοχονδριακό DNA που βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα στα μιτοχόνδρια του κυττάρου Αυτός είναι ένας από τους λόγους που οι περισσότερες παλαιογενετικές έρευνες επικεντρώνονται στο μιτοχονδριακό DNA Οι αναλύσεις γονιδίων ταυτοποίησης προσώπων με STRs και αναλύσεις στο Υ-χρωμόσωμα απαιτούν τη διατήρηση του πυρηνικού DNA γιrsquo αυτό και εμφανίζουν μικρότερα ποσοστά επιτυχίας από τις αναλύσεις στο μιτοχονδριακό DNA

Το μεγαλύτερο πρόβλημα στην παλαιογενετική έρευνα είναι η μόλυνση Το αυθεντικό DNA είναι ενδογε-νές προέρχεται δηλαδή από τον πεθαμένο οργανισμό ενδέχεται όμως να είναι εξωγενές να προέρχεται δηλαδή από έναν άλλο οργανισμό που μόλυνε δευτερογενώς το δείγμα Ένα δείγμα μπορεί να μολυνθεί πολύ εύκολα καθrsquo όλη τη διάρκεια της αναλυτικής διαδικασίας ανασκαφή δειγματοληψία εργαστηριακή ανάλυ-ση Η μόλυνση είναι ιδιαιτέρως επικίνδυνη στα ανθρώπινα δείγματα διότι οι ανασκαφείς οι αρχαιολόγοι οι ανθρωπολόγοι οι παλαιογενετιστές καθώς και οι άνθρωποι που παρασκευάζουν τα αντιδραστήρια απο-τελούν δυνητικές εστίες μόλυνσης Στα ζωικά δείγματα ο κίνδυνος περιορίζεται στην επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα στις ζωικές τροφές και σε εργαστηριακά υλικά ζωικής προέλευσης που μπορεί να υπάρχουν στον ανασκαφικό και στον εργαστηριακό χώρο Η ανάλυση και η ταυτοποίηση του γενετικού υλικού των αν-

θρωπολόγων του ανασκαφικού προσωπικού και του ίδιου του παλαιογενετιστή μπορεί να αποκλείσει ότι μια ασυμφωνία στην αλληλούχηση οφείλεται σε μοντέρνα μόλυνση

Για να είμαστε σίγουροι ότι το DNA που εξάγουμε είναι ενδογενές ακολουθούμε αυστηρούς κανόνες τόσο πριν λάβουμε το δείγμα μας όσο και αφού μεταφέρουμε το δείγμα μας στο ειδικό εργαστήριο Παρακάτω παρουσιάζονται συνοπτικά όλα τα στάδια της εργαστηριακής διαδικασίας

831 Συλλογή των δειγμάτων Η μελέτη του αρχαίου DNA ξεκινάει στην ανασκαφή Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις του αρχαίου DNA προέρχονται συνήθως από σκελετικό υλικό που έχει ήδη ανασκαφεί και βρίσκεται σε μου-σειακές και αρχαιολογικές συλλογές Με την έλευση και την εδραίωση της νέας τεχνολογίας οι αρχαιολόγοι ενδιαφέρονται να συλλέξουν το υλικό τους ήδη από την ανασκαφή ακολουθώντας κατάλληλους κανόνες

Κατά τη διάρκεια της συλλογής της μεταφοράς και της δειγματοληψίας του σκελετικού υλικού θα πρέπει να γίνεται χρήση γαντιών και μάσκας προσώπου και οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία να καθαρίζονται Επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα στην επιφάνεια του δέρματος και τα πτύελα από τη στοματική κοιλότητα περιέ-χουν DNA κάθε ερευνητής που έρχεται σε επαφή με σκελετικό ή οδοντικό υλικό μπορεί να μολύνει το δείγμα Οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τη δειγματοληψία θα πρέπει να καθαρίζο-νται ακολουθώντας βασικούς κανόνες αποδόμησης του DNA για να αποφεύγεται ο κίνδυνος μόλυνσης από τον ερευνητή αλλά και η επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα Το πιο διαδεδομένο και εύκολα διαθέσιμο υλικό καθαρισμού των εργαλείων είναι το υποχλωριώδες νάτριο δηλαδή η χλωρίνη (Εικ 83)

Εικόνα 83 Βασικά εργαλεία που χρειάζονται σε μια δειγματοληψία με σκοπό την παλαιογενετική ανάλυση

Τα τμήματα οστών και δοντιών που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή μελλοντικά σε γενετικές ανα-λύσεις δεν θα πρέπει να πλένονται Ο καθαρισμός και ιδιαίτερα το πλύσιμο των οστών μεταφέρει πολύ εύκολα τη μόλυνση από την εξωτερική επιφάνεια στους εσωτερικούς πόρους του οστού ή του δοντιού Ο πιθανός κίνδυνος είναι μεγαλύτερος διότι είναι πιο εύκολο να απομακρυνθεί η μόλυνση μηχανικά και χημικά από το εξωτερικό παρά από το εσωτερικό του δείγματος (Kirsanow amp Burger 2012)Τα δείγματα είναι σημαντικό να τοποθετούνται σε καθαρά δοχεία και να τοποθετούνται σε χώρο με σταθερά χαμηλή θερμοκρασία χωρίς υγρα-σία και άμεση έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία για αποφυγή της περαιτέρω καταστροφής του DNA (Burger amp Bollongino 2010)

Οστά και δόντια σπασμένα και ταφονομικά αλλαγμένα από ρίζες φυτών μικροοργανισμούς υγρασία όξι-νο ταφικό περιβάλλον εμφανίζουν γενικά μικρό ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA Εκτός από τη μακροσκοπική εξέταση υπάρχουν αρκετές μέθοδοι ελέγχου (ακτινολογικές μικροσκοπικές) του βαθμού διατήρησης του σκελετικού και οδοντικού υλικού που μπορούν να χρησιμοποιηθούν προτού προχωρήσει κάποιος στη δειγματοληψία

Σήμερα γνωρίζουμε ότι στη λιθοειδή απόφυση (Εικ 84) ένα τμήμα εσωτερικά του κρανίου που βρίσκε-ται πίσω από τον ακουστικό πόρο (βλ κεφάλαιο 1) διατηρείται το DNA σε άριστη ποσότητα και ποιότητα (Gamba et al 2014) Στην περίπτωση που το συγκεκριμένο τμήμα δεν σώζεται θα πρέπει να προτιμώνται ένα

ή δύο ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές αλλοιώσεις όπως τερηδόνα έντονη αποτριβή ή τμήματα (1-2 εκατο-στά) συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δρά-σης μικροοργανισμών Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται διότι η πορώδης μορφολογία τους ευνοεί περισσότερο την εξωγενή μόλυνση και την καταστροφή του γενετικού υλικού λόγω της δράσης μικροοργανισμών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων (Εικ 85)

Εικόνα 84 Λιθοειδής απόφυση του κροταφικού οστού ενός ανθρώπινου κρανίου

Εικόνα 85 Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμο-ποιούνται στη δειγματοληψία για έρευνα αρχαίου DNA Θα πρέπει να προτιμώνται ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές

αλλοιώσεις ή τμήματα συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη δράσης μικροοργανισμών

Το μέγεθος του δείγματος μπορεί να αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα Αυτό συμβαίνει κυρίως όταν το οστεολογικό υλικό είναι πολύ περιορισμένο και η σημαντικότητα του ευρήματος δεν επιτρέπει εκτεταμένη δειγματοληψία Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA περίπου 400 βάσεων Η κάθε αντίδραση στόχευε στην ανάλυση ενός μικρού τμήματος περίπου 100 βάσεων η οποία έπρεπε να επαναληφθεί αρκετές φορές Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρου του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος με πολύ λίγες αντιδράσεις

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

θρωπολόγων του ανασκαφικού προσωπικού και του ίδιου του παλαιογενετιστή μπορεί να αποκλείσει ότι μια ασυμφωνία στην αλληλούχηση οφείλεται σε μοντέρνα μόλυνση

Για να είμαστε σίγουροι ότι το DNA που εξάγουμε είναι ενδογενές ακολουθούμε αυστηρούς κανόνες τόσο πριν λάβουμε το δείγμα μας όσο και αφού μεταφέρουμε το δείγμα μας στο ειδικό εργαστήριο Παρακάτω παρουσιάζονται συνοπτικά όλα τα στάδια της εργαστηριακής διαδικασίας

831 Συλλογή των δειγμάτων Η μελέτη του αρχαίου DNA ξεκινάει στην ανασκαφή Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις του αρχαίου DNA προέρχονται συνήθως από σκελετικό υλικό που έχει ήδη ανασκαφεί και βρίσκεται σε μου-σειακές και αρχαιολογικές συλλογές Με την έλευση και την εδραίωση της νέας τεχνολογίας οι αρχαιολόγοι ενδιαφέρονται να συλλέξουν το υλικό τους ήδη από την ανασκαφή ακολουθώντας κατάλληλους κανόνες

Κατά τη διάρκεια της συλλογής της μεταφοράς και της δειγματοληψίας του σκελετικού υλικού θα πρέπει να γίνεται χρήση γαντιών και μάσκας προσώπου και οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία να καθαρίζονται Επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα στην επιφάνεια του δέρματος και τα πτύελα από τη στοματική κοιλότητα περιέ-χουν DNA κάθε ερευνητής που έρχεται σε επαφή με σκελετικό ή οδοντικό υλικό μπορεί να μολύνει το δείγμα Οι επιφάνειες εργασίας και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τη δειγματοληψία θα πρέπει να καθαρίζο-νται ακολουθώντας βασικούς κανόνες αποδόμησης του DNA για να αποφεύγεται ο κίνδυνος μόλυνσης από τον ερευνητή αλλά και η επιμόλυνση ανάμεσα στα δείγματα Το πιο διαδεδομένο και εύκολα διαθέσιμο υλικό καθαρισμού των εργαλείων είναι το υποχλωριώδες νάτριο δηλαδή η χλωρίνη (Εικ 83)

Εικόνα 83 Βασικά εργαλεία που χρειάζονται σε μια δειγματοληψία με σκοπό την παλαιογενετική ανάλυση

Τα τμήματα οστών και δοντιών που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή μελλοντικά σε γενετικές ανα-λύσεις δεν θα πρέπει να πλένονται Ο καθαρισμός και ιδιαίτερα το πλύσιμο των οστών μεταφέρει πολύ εύκολα τη μόλυνση από την εξωτερική επιφάνεια στους εσωτερικούς πόρους του οστού ή του δοντιού Ο πιθανός κίνδυνος είναι μεγαλύτερος διότι είναι πιο εύκολο να απομακρυνθεί η μόλυνση μηχανικά και χημικά από το εξωτερικό παρά από το εσωτερικό του δείγματος (Kirsanow amp Burger 2012)Τα δείγματα είναι σημαντικό να τοποθετούνται σε καθαρά δοχεία και να τοποθετούνται σε χώρο με σταθερά χαμηλή θερμοκρασία χωρίς υγρα-σία και άμεση έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία για αποφυγή της περαιτέρω καταστροφής του DNA (Burger amp Bollongino 2010)

Οστά και δόντια σπασμένα και ταφονομικά αλλαγμένα από ρίζες φυτών μικροοργανισμούς υγρασία όξι-νο ταφικό περιβάλλον εμφανίζουν γενικά μικρό ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA Εκτός από τη μακροσκοπική εξέταση υπάρχουν αρκετές μέθοδοι ελέγχου (ακτινολογικές μικροσκοπικές) του βαθμού διατήρησης του σκελετικού και οδοντικού υλικού που μπορούν να χρησιμοποιηθούν προτού προχωρήσει κάποιος στη δειγματοληψία

Σήμερα γνωρίζουμε ότι στη λιθοειδή απόφυση (Εικ 84) ένα τμήμα εσωτερικά του κρανίου που βρίσκε-ται πίσω από τον ακουστικό πόρο (βλ κεφάλαιο 1) διατηρείται το DNA σε άριστη ποσότητα και ποιότητα (Gamba et al 2014) Στην περίπτωση που το συγκεκριμένο τμήμα δεν σώζεται θα πρέπει να προτιμώνται ένα

ή δύο ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές αλλοιώσεις όπως τερηδόνα έντονη αποτριβή ή τμήματα (1-2 εκατο-στά) συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δρά-σης μικροοργανισμών Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται διότι η πορώδης μορφολογία τους ευνοεί περισσότερο την εξωγενή μόλυνση και την καταστροφή του γενετικού υλικού λόγω της δράσης μικροοργανισμών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων (Εικ 85)

Εικόνα 84 Λιθοειδής απόφυση του κροταφικού οστού ενός ανθρώπινου κρανίου

Εικόνα 85 Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμο-ποιούνται στη δειγματοληψία για έρευνα αρχαίου DNA Θα πρέπει να προτιμώνται ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές

αλλοιώσεις ή τμήματα συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη δράσης μικροοργανισμών

Το μέγεθος του δείγματος μπορεί να αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα Αυτό συμβαίνει κυρίως όταν το οστεολογικό υλικό είναι πολύ περιορισμένο και η σημαντικότητα του ευρήματος δεν επιτρέπει εκτεταμένη δειγματοληψία Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA περίπου 400 βάσεων Η κάθε αντίδραση στόχευε στην ανάλυση ενός μικρού τμήματος περίπου 100 βάσεων η οποία έπρεπε να επαναληφθεί αρκετές φορές Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρου του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος με πολύ λίγες αντιδράσεις

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

ή δύο ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές αλλοιώσεις όπως τερηδόνα έντονη αποτριβή ή τμήματα (1-2 εκατο-στά) συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δρά-σης μικροοργανισμών Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται διότι η πορώδης μορφολογία τους ευνοεί περισσότερο την εξωγενή μόλυνση και την καταστροφή του γενετικού υλικού λόγω της δράσης μικροοργανισμών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων (Εικ 85)

Εικόνα 84 Λιθοειδής απόφυση του κροταφικού οστού ενός ανθρώπινου κρανίου

Εικόνα 85 Σπογγώδες οστό όπως πλευρά τμήματα σπονδύλων ή εύθρυπτα οστά και δόντια δεν θα πρέπει να χρησιμο-ποιούνται στη δειγματοληψία για έρευνα αρχαίου DNA Θα πρέπει να προτιμώνται ακέραια δόντια χωρίς παθολογικές

αλλοιώσεις ή τμήματα συμπαγούς οστού από τις διαφύσεις μηριαίων ή βραχιονίων χωρίς ίχνη δράσης μικροοργανισμών

Το μέγεθος του δείγματος μπορεί να αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα Αυτό συμβαίνει κυρίως όταν το οστεολογικό υλικό είναι πολύ περιορισμένο και η σημαντικότητα του ευρήματος δεν επιτρέπει εκτεταμένη δειγματοληψία Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA περίπου 400 βάσεων Η κάθε αντίδραση στόχευε στην ανάλυση ενός μικρού τμήματος περίπου 100 βάσεων η οποία έπρεπε να επαναληφθεί αρκετές φορές Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρου του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος με πολύ λίγες αντιδράσεις

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

832 Το εργαστήριο παλαιογενετικήςΟι αναλύσεις αρχαίου DNA απαγορεύεται να πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που πραγματοποιούνται πει-ράματα και αναλύσεις μοντέρνου DNA Ακόμη και εκεί που ακολουθούνται αυστηρά πρωτόκολλα μηχανικής (διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και σαπούνι) και χημικής (ακτινοβολία χρήση υποχλωριώδους νατρίου και εμπορικών διαλυμάτων καταστροφής DNA) απομάκρυνσης της μόλυνσης δηλαδή των μορίων που απελευθερώνονται μετά από κάθε εργαστηριακή πράξη μερικά μόρια θα επιβιώσουν θα σπάσουν σε μι-κρότερα κομμάτια και τελικά θα αποικοδομηθούν στο σημείο όπου χημικώς θα μοιάζουν με aDNA Οι ανα-πόφευκτες αναταράξεις του αέρα που προκαλούνται από ανθρώπους που κινούνται στο εργαστήριο μπορούν να μεταφέρουν αυτές τις προσμείξεις σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα Το χειρότερο σενάριο είναι όταν αυτά τα μόρια προέρχονται από αντιδράσεις άλλων δειγμάτων Τις περισσότερες φορές και ανάλογα με την ποσότητα των μορίων που μεταφέρονται η μόλυνση φαίνεται αμέσως στα λεγόμενα κενά δείγματα ελέγ-χου ή εμφανίζεται σποραδικά ως μόλυνση στις αλληλουχίες

Για τους παραπάνω λόγους έχει θεσπιστεί μια σειρά κριτηρίων και μια σειρά κανόνων οργάνωσης του ερ-γαστηρίου και προστασίας των δειγμάτων (Εικ 86) Στη διεθνή ερευνητική κοινότητα έχουν καθιερωθεί ως τα laquoχρυσά κριτήριαraquo (Cooper amp Poinar 2000) και περιλαμβάνουν

bull Eιδικά διαμορφωμένο εργαστήριο αρχαίου DNA με απομόνωση των χώρων εργασίαςbull Συνεχή μηχανικό και χημικό καθαρισμό όλων των εργαστηριακών επιφανειών εργαλείων αντιδρα-

στηρίων bull Χρήση κενών δειγμάτων ελέγχουbull Επαναληψιμότητα πολλαπλές αντιδράσεις απομόνωσης και πολλαπλασιασμού από το ίδιο δείγμαbull Έλεγχο της ποιότητας άλλων ευρημάτων πχ οστά ζώων από την ίδια αρχαιολογική θέσηbull Βιοπληροφορικό έλεγχο των αποτελεσμάτων

Εικόνα 86 Στο παραπάνω σχήμα απεικονίζεται μία πιθανή διάταξη των εργαστηριακών χώρων για την ανάλυση aDNA

8321 Προετοιμασία του δείγματος

Πριν χρησιμοποιηθεί το δείγμα τοποθετείται κάτω από λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας οι οποίες κα-ταστρέφουν το DNA που βρίσκεται στην επιφάνεια του οστού ή του δοντιού Στη συνέχεια ακολουθείται μηχανική απόξεση του δείγματος με σκοπό τη μηχανική απομάκρυνση της μόλυνσης Το τμήμα του οστού ή του δοντιού κονιορτοποιείται μέχρι να αποκτήσει την υφή λεπτής πούδρας (Εικ 87) Οι τρεις διαδικασίες πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς χώρους και καθrsquo όλη τη διάρκεια της διαδικασίας οι επιφάνειες και τα μηχανήματα καθαρίζονται ενώ ο ερευνητής αλλάζει γάντια και στολές

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 87 H προετοιμασία του οδοντικού ή σκελετικού δείγματος για την εξαγωγή αρχαίου DNA περιλαμβάνει αρκετά στάδια τα οποία πραγματοποιούνται υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες σε ειδικά διαμορφωμένους χώ-

ρους με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος Τα αρχικά στάδια περιλαμβάνουν τον χημικό καθαρισμό των οστών που πραγματοποιείται με ακτινοβολία (1) τη μηχανική απόξεση της εξωτερικής επιφάνειας (2-3) και την κονιορτοποίηση του δείγματος (6-7) (φωτογραφία Χριστίνα Παπαγεωργοπούλου οι φωτογραφίες προέρχονται από το Εργαστήριο Παλαι-

ογενετικής του Johannes Gutenberg Πανεπιστημίου Mainz Γερμανία)

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

8322 Απομόνωση του DNA

Το DNA πρέπει να απομονωθεί από τα άλλα συστατικά του κυττάρου Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετεί-ται για αρκετές ώρες σε διάλυμα EDTA 05M προκειμένου να απομακρυνθεί το ασβέστιο και στη συνέχεια επωάζεται στους 370 C με πρωτεάση Κ για να επιτευχθεί η καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγεται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα Καθαρίζεται με αλλεπάλληλες πλύσεις με ειδικά απο-σταγμένο νερό για την απομάκρυνση αλάτων και όξινων συστατικών τα οποία θα επηρεάσουν αρνητικά τον πολλαπλασιασμό του και συμπυκνώνεται δηλαδή μειώνεται ο όγκος νερού στον οποίο είναι διαλυμένο Το απομονωμένο DNA μπορεί να διατηρηθεί για πολλά χρόνια σε συνθήκες ψύξης (Εικ 88-89)

Εικόνα 88 Το κονιορτοποιημένο οστό τοποθετείται για αρκετές ώρες σε διάλυμα προκειμένου να επιτευχθεί η καταστρο-φή των κυτταρικών μεμβρανών Το υπερκείμενο στρώμα το οποίο διαχωρίζεται μετά από φυγοκέντριση υποβάλλεται σε

εκχύλιση με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου οπότε διαχωρίζεται το DNA (1-3) Στη συνέχεια το μόριο του DNA συλλέγε-ται από ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει κυτταρικά θραύσματα (4)

Μια γρήγορη επισκόπηση των μεθόδων που εφαρμόζονται στην ανάλυση του aDNA αποκαλύπτει ότι έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα με στόχο την ανάκτηση τον καθαρισμό και τον πολλαπλασιασμό τμημάτων DNA κανένα όμως δεν μπορεί να θεωρηθεί εκ των προτέρων ως το αποτελεσματικότερο δυνατό Το κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής aDNA προσαρμόζεται κάθε φορά ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηρι-στικά της αρχαιολογικής θέσης και των ευρημάτων

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 89 Εργαστηριακός πάγκος κατά την πραγματοποίηση της απομόνωσης του DNA

8323 Πολλαπλασιασμός του DNA

Επειδή η ποσότητα του απομονωμένου DNA είναι πολύ μικρή και δεν επαρκεί για την πραγματοποίηση όλων των αναλύσεων οι ερευνητές δημιουργούν χιλιάδες πανομοιότυπα αντίγραφα Αυτό επιτυγχάνεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR (polymarase chain reaction) κατά την οποία πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA ονομαζόμενου ως στόχου DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο η διπλή έλικα του DNA ανοίγει σε δύο αλυσίδες οι ελεύθερες βάσεις του μείγματος της αντίδρασης με τη βοήθεια της πολυμεράσης συνδέονται στις μονές αλυσίδες συμπληρωματικά και έτσι έχουμε 2 νέους κλώνους του DNA Με επαναλαμβανόμενους κύκλους αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA (Εικ 810)

Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια1 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)2 Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)3 Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Τα τρία στάδια επιτυγχάνονται με την επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες σε ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλωτές (thermocyclers) Σε μια τυπική αντίδραση το δίκλωνο DNA αποδι-ατάσσεται με θέρμανση στους 95deg C Στη συνέχεια οι εκκινητές προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπλη-ρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με ψύξη του δείγματος στους 50 ndash 60deg C Ακολουθεί επώαση στους 72deg C για την επιμήκυνση των εκκινητών από την πολυμεράση με τη βοήθεια των τεσσάρων νουκλεο-τιδίων (Πιν 101) Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι δρουν ως εκμαγεία για την εκ νέου σύνθεση του DNA Μrsquo αυτόν τον τρόπο μετά από μερικούς κύκλους ο DNA στόχος η αλληλουχία δηλαδή που επιλέξαμε να πολλαπλασιάσουμε βρίσκεται μέσα στο διάλυμά μας σε πολλά αντίγραφα Για τον πολλαπλασιασμό ενός στόχου μιτοχονδριακού DNA απαιτούνται περίπου 30-35 κύκλοι Στην πράξη η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 15-2 ώρες

Η τεχνική της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και μπορεί να πολλαπλασιάσει οποιαδήποτε ελάχιστη πο-σότητα DNA βρεθεί στον εργαστηριακό χώρο η οποία μπορεί να προέρχεται από τον ερευνητή το περιβάλ-λον ή από άλλα δείγματα Γιrsquo αυτόν τον λόγο ο χώρος όπου πραγματοποιείται είναι ο πλέον αποστειρωμένος από όλους Οι κινήσεις που γίνονται είναι αργές και καλά οργανωμένες (Εικ 811-812) Σκοπός είναι να αποφευχθούν οι αναταράξεις του αέρα που μπορούν να μεταφέρουν τη μόλυνση σε έναν σωλήνα αντίδρασης ή σε ένα δείγμα

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 810 Σχηματική αναπαράσταση in vitro πολλαπλασιασμού του DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

1 στόχος DNA (template DNA)2 εκκινητής (primer) 3 τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) 4 DNA πολυμεράση (DNA polymerase) 5 ιόντα μαγνησίου (Mg++) 6 ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer) 7 σταθεροποιητές ενζύμου (bovine serum albumin-BSA)

Στόχος DNA Ο στόχος DNA είναι το τμήμα του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Επειδή το DNA από οστεοαρχαιολογικό υλικό βρίσκεται σε λίγα αντίγραφα χρειάζεται μεγάλη ποσότητα στόχου DNA Γιrsquo αυτό και κατά την απομόνωση συμπυκνώνουμε το διάλυμα μας Επίσης η ποσότητα του στόχου εξαρτάται από την αρχαιολογική θέση και τις περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες επηρεάζουν τη διατήρηση του DNA Γενικά η ποσότητα DNA που απαιτείται για μία αντίδραση κυμαίνεται μεταξύ 10 και 500 ng σε σύγχρονο DNA και gt1000ng στο αρχαίο DNA

Εκκινητές Οι εκκινητές είναι τμήματα της αλληλουχίας του DNA στόχου και είναι απαραίτητοι προκειμένου να οδηγήσουν τα νουκλεοτίδια στο τμήμα της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια το μήκος των οποίων κυμαίνεται ανάλογα με τη χρήση τους (15 έως 30 βάσεις) Οι εκκινητές σχεδιάζονται από τους ερευνητές με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων (software) και πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια πχ οι αλληλουχίες των δύο εκκινητών δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους πρέπει να έχουν παρόμοια περιεκτικότητα σε G και C δεν θα πρέπει να έχουν επαναλήψεις νουκλεοτιδίων

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδιαΤα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dATP dTTP dCTP και dGTP είναι ελεύθερα νουκλεοτίδια τα οποία τοποθε-τούνται στο διάλυμα της PCR σε ίση συγκέντρωση μεταξύ τους και συνθέτουν τη συμπληρωματική αλυσίδα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού

DNA πολυμεράσηΗ πολυμεράση είναι το ένζυμο με το οποίο επιτυγχάνεται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας του στόχου DNA μετά από κάθε αποδιάταξη και υβριδισμό των εκκινητών Η πολυμεράση Taq έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus που ζει σε περιβάλλον με υψηλή θερμοκρασία (θερμοπίδακες) Η ιδανική θερμοκρασία για τη δράση της είναι 55-75οC (pH 82-90) και ο χρόνος ημιζωής της είναι 50 κύκλοι στους 95οC Η πολυμεράση Taq είναι διαθέσιμη στο εμπόριο Σήμερα με την πρόοδο των μεθόδων NGS εκτός της Taq πολυμεράσης έχουν απομονωθεί πολυμεράσες και από άλλα θερμόφιλα βακτήρια οι οποίες έχουν ιδιαίτερες ιδιότητες πχ είναι πιο θερμοσταθερές (975οC) έχουν καλύτερη δραστικότητα σε πιο ευρύ φάσμα συγκέντρωσης ιόντων Mg++ παράγουν τυφλά άκρα

Ιόντα μαγνησίουΤα ιόντα μαγνησίου τοποθετούνται στην αντίδραση διότι επηρεάζουν την ποιότητα της αντίδρασης Συγκεκριμένα επηρεάζουν τον υβριδισμό του εκκινητή τη θερμοκρασία αποδιάταξης του DNA και των PCR προϊόντων τη δημιουργία διμερών από τους εκκινητές την εξειδίκευση των προϊόντων και τη δραστικότητα και πιστότητα της πολυμεράσης Προϊόντα που δεν αντιστοιχούν στην αλληλουχία του στόχου DNA μπορούν να παραχθούν όταν η συγκέντρωση Mg++ είναι υψηλή Τα προϊόντα αυτά προκύπτουν γιατί το Mg++ μπορεί να σταθεροποιεί το δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα να έχουμε τυχαίες προσκολλήσεις εκκινητών σε μη ομόλογα τμήματα του DNA Αντίθετα η χαμηλή συγκέντρωση μειώνει την απόδοση του PCR γιατί το Mg++ ως συνένζυμο της πολυμεράσης είναι απαραί-τητο για τη λειτουργία της

Ισοτονικό διάλυμα της αντίδρασης (buffer)Συνήθως η Taq πολυμεράση συνοδεύεται από ένα διάλυμα το οποίο δημιουργεί ένα ιοντικό περιβάλλον για να διευκολύνει την αναδιάταξη (annealing) του εκκινητή με το στόχο DNA το οποίο παρέχεται από την παρουσία NaCl ή KCl Στο διάλυμα επίσης υπάρχει Tris-HCl για τη ρύθμιση του pH

Στο διάλυμα τοποθετούνται και σταθεροποιητές ενζύμου όπως ζελατίνη (bovine serum albumin-BSA)

Πίνακας 81 Απαραίτητα συστατικά για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 811 Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη διαδικασία και πραγματοποιείται στον πιο αποστειρωμένο χώρο ενός εργαστηρίου παλαιογενετικής Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται είναι πολύ μικρές γιrsquo αυτό

απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην τοποθέτηση και την ανάμειξή τoυς Το διάλυμα συμπληρώνεται με διπλά αποσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι να συμπληρωθεί ο όγκος της αντίδρασης Δεν υπάρχει συγκεκριμένη σειρά με την οποία αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια αν και συνήθως ξεκινάμε από τον μεγαλύτερο στον μικρότερο όγκο δηλαδή τελευταία

τοποθετείται η Taq πολυμεράση και το δείγμα μας δηλαδή ο στόχος DNA

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 812 Εργαστηριακός πάγκος για την πραγματοποίηση της PCR Αριστερά στη φωτογραφία διακρίνεται ο θερ-μοκυκλοποιητής Στο εργαστήριο παλαιογενετικής ο θερμοκυκλοποιητής βρίσκεται στον post-PCR χώρο Η αντίδραση

προετοιμάζεται στο εργαστήριο παλαιογενετικής αλλά ο πολλαπλασιασμός και η μετέπειτα εργαστηριακή ανάλυση πραγ-ματοποιείται σε ξεχωριστό κτίριο

Την τελευταία πενταετία με την πρόοδο της τεχνολογίας και την εφαρμογή της Νέας Γενιάς Αλληλούχη-σης (Next Generation Sequencing-NGS) η διαδικασία στις αναλύσεις αρχαίου DNA έχει εξελιχθεί σημαντικά Σήμερα οι ερευνητές laquoψαρεύουνraquo μέσα από το δείγμα όλα τα μικρά τμήματα του ανθρώπινου DNA που υπάρχουν Στη συνέχεια μπορούν να τα πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα και να τα διατηρήσουν για μελλοντι-κές έρευνες Έτσι κατασκευάζουν βιβλιοθήκες DNA μέθοδος που έφερε επανάσταση στις γενετικές αναλύ-σεις Πριν την εμφάνιση των μεθόδων NGS η μεθοδολογία της PCR απαιτούσε μεγάλο αριθμό αντιδράσεων για να αναλυθεί ένα μικρό τμήμα DNA Με τη νέα τεχνολογία είναι εφικτή η ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμά-των με πολύ λίγες αντιδράσεις και κατrsquo επέκταση με μικρότερη ποσότητα δείγματος

8333 Αλληλούχηση και επεξεργασία δεδομένων

Ακόμη και μετά από όλη αυτήν την επίπονη διαδικασία οι ερευνητές δεν γνωρίζουν εάν μέσα στον δο-κιμαστικό σωλήνα έχουν DNA Γιrsquo αυτό τοποθετούν ειδική ουσία η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το υπάρχον DNA Στη συνέχεια το χρωματισμένο DNA υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση και υπολογίζεται η ποσότητα του

Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που χρησιμοποιεί το ηλεκτρικό πεδίο για να διαπιστώσει την ύπαρξη DNA και να διαχωρίσει τα μόριά του ανάλογα με το μέγεθός τους Κατά την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα με το πολλαπλασιασμένο DNA φορτώνονται σε μια παχύρρευστη ουσία (τζελ) ηλεκτρικά φορτισμένη ώστε τα αρνητικώς φορτισμένα μόρια DNA αναγκάζονται να κινηθούν προς το θετικά φορτισμένο άκρο Όταν σταμα-τήσει η διαδικασία βλέπουμε εάν υπήρχαν τελικά μόρια DNA και διαπιστώνουμε το μέγεθός τους καθώς τα μόρια μεγαλύτερου μήκους κινούνται πιο αργά από τα μόρια μικρότερου μήκους Σήμερα η παραπάνω δια-δικασία γίνεται αυτόματα με τη χρήση ειδικών μηχανημάτων (Bioanalyser) που μπορούν με την τοποθέτηση ελάχιστης ποσότητας του προϊόντος της PCR να ποσοτικοποιήσουν τον αριθμό των θραυσμάτων DNA που πολλαπλασιάστηκαν καθώς και το μήκος αυτών (αφορά τις τεχνικές NGS) (Εικ 813)

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 813 Εικόνα (πάνω) μετά από ηλεκτροφόρηση με χρήση Bioanalyser όπου φαίνεται η ποσότητα των θραυσμάτων DNA που έχουν πολλαπλασιαστεί Στη δεύτερη εικόνα (κάτω) δεν βρέθηκαν πολλαπλασιασμένα θραύσματα DNA (είτε

γιατί δεν βρέθηκε DNA στο οστεοαρχαιολογικό δείγμα είτε γιατί απέτυχε η αντίδραση της PCR)

Αφού οι ερευνητές βεβαιωθούν ότι υπάρχει DNA πρέπει να διαβάσουν την αλληλουχία των βάσεων του (Εικ 814) Αυτό πραγματοποιείται με την αλληλούχηση στην οποία χρησιμοποιούνται αυτόματοι αναλυτές Οι δύο κύριες προσεγγίσεις για την ανάγνωση των αλληλουχιών του γονιδιώματος είναι γνωστές με τα ονόματα των ερευνητών που τις σχεδίασαν ως μέθοδος Maxam- Gilbert και μέθοδος Sanger αντίστοιχα και διαφέρουν ως προς την τεχνολογία ενσωμάτωσης των επιλεγμένων τμημάτων DNA στο υπό ανάλυση δείγμα Και οι δύο μέθοδοι όμως βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό ο οποίος παρέχει τη δυνατότητα εξαιρετικά ευ-κρινούς διαχωρισμού των τμημάτων DNA ακόμη και αν αυτά διαφέρουν κατά μία μόνο βάση Με την πρόοδο του διεθνούς προγράμματος του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project) το οποίο σήμερα έχει ολοκληρωθεί ως προς την πρώτη φάση του οι τεχνολογίες ανάγνωσης των αλληλουχιών του DNA εξελίχθη-καν ραγδαία Σήμερα υπάρχουν στη διάθεση των ερευνητών διάφοροι τύποι αυτόματων αναλυτών DNA τρίτης γενεάς οι οποίοι καθιστούν δυνατή την ανάλυση τεράστιου αριθμού δειγμάτων σε λίγο χρόνο και με ελαττω-μένο κόστος γεγονός που συμπαρασύρει όλα τα επιστημονικά πεδία σε μία κούρσα συσσώρευσης γνώσεων

Η μέθοδος Sanger (Dideoxy sequencing) χρησιμοποιεί μια ενζυματική διαδικασία για να παρασκευάσει αλυσίδες DNA που ποικίλλουν ως προς το μέγεθος καθώς διακόπτεται ο διπλασιασμός του DNA σε άκρα που καταλήγουν σε καθεμιά από τις τέσσερις βάσεις (ATGC) Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα επί μέρους τμήματα του DNA

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Για την αντίδραση ανάγνωσης των αλληλουχιών (sequencing reaction) τοποθετούνται μέσα σε σωλήνα 1 Το προς ανάλυση τμήμα του DNA-πρότυπο (DNA template)2 Μια μικρή αλληλουχία-αφετηρία (DNA primer)3 Μια πολυμεράση του DNA η οποία καταλύει τη σύνθεση της νέας αλυσίδας του από το σημείο

εκκίνησης του διπλασιασμού του που σηματοδοτείται από το DNA primer4 Τέσσερα είδη δεοξυ-νουκλεοτιδίων (deoxynucleotide triphosphates) (dATP dTTP dCTP and dGTP)

για τον διπλασιασμό της αλυσίδας-προτύπου 5 Ένα επισημασμένο (με ραδιενεργά στοιχεία ή φθορίζουσα χρωστική) δεοξυνουκλεοτίδιο και 6 Ένα δι-δεοξυ-νουκλεοτίδιο (dideoxynucleotide triphosphate) το οποίο τερματίζει τον διπλασιασμό

της αλυσίδας του προτύπου όταν ενσωματωθεί Ετοιμάζονται τέσσερις σωλήνες αντίδρασης (ένας για κάθε βάση) με διαφορετικό περιεχόμενο Στον σω-

λήνα A περιέχεται didATP στον σωλήνα C has didCTP στον σωλήνα Τ didTTP και στον σωλήνα G didGTP Στον σωλήνα για την αντίδραση Α για παράδειγμα η σχέση των συγκεντρώσεων των dATP προς didATP ρυθ-μίζεται έτσι ώστε να έχουμε μία συλλογή από διαφορετικού μήκους τμήματα του DNA τα οποία δημιουργού-νται κάθε φορά που ένα μόριο didATP ενσωματώνεται στο πρότυπο στη θέση όπου θα πήγαινε μία αδενίνη Τα τμήματα διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το μέγεθός τους καθώς τα μικρότερα μετακινούνται ταχύτερα μέσα στην πηκτή Στη συνέχεια τα δεδομένα αναλύονται για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς των βάσεων

Σήμερα γίνεται χρήση της αλληλούχησης νέας γενιάς laquoNext-Generationraquo με την οποία είναι εφικτή η ταυτόχρονη αλληλούχηση εκατοντάδων τμημάτων και όχι μόνο ενός στόχου DNA

Εικόνα 814 Εικόνα αλληλουχιών DNA μετά την αλληλούχηση στον αυτόματα αναλυτή

8334 Πιστοποίηση των αποτελεσμάτων

Ο έλεγχος της αυθεντικότητας πραγματοποιείται κυρίως με την επανάληψη της εργαστηριακής διαδικασίας μία με δύο φορές για κάθε δείγμα και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων Στην περίπτωση της NGS ο όγκος των δεδομένων είναι πάρα πολύ μεγάλος και πρέπει να διαβαστούν εκατοντάδες χιλιάδες αλληλουχίες βάσε-ων Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και απαιτεί τη συμβολή και άλλων επιστημών όπως της βιοπληροφορικής Οι αλληλουχίες των βάσεων συγκρίνονται με σταθερές αλληλουχίες αναφοράς και τα αποτελέσματα αναλύο-νται στατιστικά ανάλογα με το ερευνητικό ερώτημα

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Ο παλαιογενετιστής πρέπει να ελέγξει την ποιότητα και την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων με αρ-κετούς τρόπους και σε μοριακό επίπεδο Οι μεταθανάτιες περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν τις αζωτούχες βάσεις και τη φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA προκαλώντας την αποσταθεροποίηση ή και την καταστροφή του (Gilbert et al 2003) Το πιο κοινό φαινόμενο είναι η απαμίνωση μια χημική δηλαδή μεταλλαγή που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας βάσης σε μια άλλη Οι πιο συνήθεις μεταλλαγές είναι οι μεταπτώσεις δηλαδή οι αλλαγές εντός της ομάδας των πουρινών και των πυριμιδίνων (αδενίνηγουανίνη θυμίνηκυτοσίνη και κυτοσίνηθυμίνη γουανίνηαδενίνη) (Hofreiter et al 2001b) Οι αλλαγές αυτές επηρε-άζουν την αλληλούχηση του γενετικού υλικού και μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα Σήμερα υπάρχουν αρκετοί τρόποι για να διαγνωστεί μία ή και περισσότερες απαμινώσεις Τα μέτρα που λαμβάνονται είναι είτε στατιστικά μοντέλα που υπολογίζουν με μαθηματικό τρόπο τον αριθμό των απαμινώσεων κυρίως στα δείγματα που γίνεται αλληλούχηση εκατοντάδων χιλιάδων βάσεων (Ho et al 2007) είτε χημική προετοι-μασία του δείγματος (Βriggs et al 2010) και κυρίως επανάληψη των αναλύσεων από το ίδιο δείγμα εφόσον μία απαμίνωση πολύ σπάνια εμφανίζεται στο ίδιο ακριβώς σημείο της αλληλουχίας του DNA

Σήμερα η τεχνολογία NGS έχει επιτρέψει την αποτελεσματικότερη ανάλυση αρχαίου γενετικού υλικού και υπάρχει σημαντική βελτίωση ακόμη και στο επίπεδο της μόλυνσης Η νέα μεθοδολογία βασίζεται στον ταυ-τόχρονο πολλαπλασιασμό εκατοντάδων μορίων και επιτρέπει τον καλύτερο διαχωρισμό του ενδογενούς DNA από ένα μόριο εξωγενούς DNA που μόλυνε το δείγμα Με τη PCR πολλαπλασιάζεται κάθε φορά μόνο ένα μόριο γεγονός επικίνδυνο στην περίπτωση που το μόριο προέρχεται από εξωγενή μόλυνση Αναμφισβήτητα αυτό μπορεί να λυθεί με την επανάληψη της PCR το οποίο όμως απαιτεί μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος και πιο χρονοβόρα διαδικασία Η νέα μεθοδολογία κινείται σε επίπεδα πολύ μικρότερα απrsquo αυτά του μοντέρ-νου DNA έχει δηλαδή στόχο τον πολλαπλασιασμό μικρών τμημάτων DNA (30-60 νουκλεοτιδικές βάσεις) και επομένως αφήνει έξω μεγάλα τμήματα (lt120 νουκλεοτιδικές βάσεις) που πιθανότατα είναι προϊόντα μόλυνσης Από την άλλη πλευρά ο έλεγχος των εκατομμυρίων βάσεων στα δεδομένα είναι δύσκολος και ο διαχωρισμός της σύγχρονης μόλυνσης και των μεταθανάτιων αλλαγών από τις αυθεντικές αλληλουχίες απο-τελεί μια νέα πρόκληση η οποία γίνεται πλέον με μαθηματικά μοντέλα και ειδικά software Η νέα τεχνολογία NGS εισήγαγε μεγάλο βαθμό βιοπληροφορική πολυπλοκότητα στην ερμηνεία των δεδομένων γεγονός που έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ένα ταχέως αυξανόμενο αριθμό αναλυτικών μεθόδων και βιοπληροφορικών αλγόριθμων η οποία απαιτεί πληθώρα νέων ειδικοτήτων

84 Eφαρμογές στην φυσική ανθρωπολογία και την αρχαιολογία Το αρχαίο DNA αποτέλεσε πόλο έλξης για τους ανθρωπολόγους που μελετούν το μακρινό παρελθόν του είδους μας αλλά και πιο πρόσφατα κομμάτια της ανθρώπινης ιστορίας Οι μεταναστεύσεις το δημογραφικό προφίλ και η δυναμική των πληθυσμών η φυλογεωγραφία δηλαδή η γεωγραφική κατανομή των απλοτύπων και προσφάτως οι φυλογενετικές σχέσεις εξαφανισμένων ως προς τον σύγχρονο άνθρωπο ειδών του γένους Homo μελετώνται με τη συνδρομή των παλαιογενετικών αναλύσεων Στην αρχαιολογία και στην ανθρωπολο-γία αυτό γίνεται μελετώντας κυρίως τον υλικό πολιτισμό και τα μορφολογικά ανθρωπολογικά χαρακτηριστι-κά για τα οποία όμως δεν είναι ακόμη αποδεδειγμένη η σχέση γονότυπου φαινότυπου και περιβάλλοντος Το αρχαίο DNA μάς έδωσε τη δυνατότητα να ξεπεράσουμε τη σχέση συγγένειας που προσδιορίζεται μόνο μέσω του υλικού πολιτισμού και να μελετήσουμε βαθύτερα τη βιολογική ιστορία των προϊστορικών πληθυσμών

Η πρωτοποριακή εργασία του Luca Cavalli-Sforza στη δεκαετία του 1970 και του 1980 ίδρυσε το σύγχρο-νο πεδίο της αρχαιογενετικής (archaeogenetics) (Bowcock et al 1987) η οποία επιχείρησε να ανασυνθέσει τη δημογραφική ιστορία του ανθρώπου από τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας σε σύγχρονους πληθυ-σμούς Κλασικοί γενετικοί δείκτες και το μιτοχονδριακό DNA ήταν οι πρώτες πηγές των γενετικών δεδομέ-νων του πρωτοεμφανιζόμενου αυτού τομέα χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) (Cavalli-Sforza et al 1986) και φυλογεωγραφικών μεθόδων κυρίως για την ανά-λυση της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (Hypervariable Region I HVR Ι) του μιτοχονδριακού DNA (Richards et al 2000) που αντιπροσωπεύει τη μητρική γραμμή καταγωγής

Παράλληλα με τα συμπέρασματα των φυλογεωγραφικών μεθόδων που έχουν κυριαρχήσει στην παλαιο-γενετική τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες στατιστικές προσεγγίσεις στον τομέα της σύγχρονης γενετικής των πληθυσμών Η συμφυής θεωρία για παράδειγμα χρησιμοποιεί μια αναδρομική προβολή των γενεαλογιών προκειμένου να υπολογίσει τις πιθανότητες σύμφωνα με τις οποίες διαφορετικές γενεαλογίες συγκλίνουν σε έναν κοινό πρόγονο κάτω από μια σειρά διαφορετικών δημογραφικών συνθηκών όπως σταθε-ρότητα του πληθυσμού αύξηση μετανάστευση Η πρόκληση της πληθυσμιακής γενετικής είναι η αναγνώριση των ιστορικών σεναρίων τα οποία οδηγούν σε συγκεκριμένα φυλογενετικά δέντρα Η λύση στο πρόβλημα

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

αυτό είναι η διερεύνηση -με προσομοίωση- διαφορετικών ιστορικών σεναρίων και η αναζήτηση των συνθη-κών υπό τις οποίες τα παρατηρούμενα δεδομένα ή κάποια περιγραφή των δεδομένων έχουν την υψηλότερη πιθανότητα να προκύψουν Η πληροφοριακή αξία των δεδομένων μεγιστοποιείται όταν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται συνδέονται άμεσα με τη γεωγραφία και τη χρονολογία του ερωτήματος και δεν είναι προ-ϊόντα επαγωγικού συμπεράσματος βάσει δηλαδή των σύγχρονων κατανομών αλλά πραγματική ανάλυση σε αρχαιολογικό υλικό Σημαντικές εξελίξεις στη βιοστατιστική όπως η χρήση της Approximate Bayesian Computation (ABC) έχουν απλοποιήσει αυτό το έργο (Beaumont et al 2002)

Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της παλαιογενετικής έρευνας είναι η κατανόηση των φυλογενετι-κών σχέσεων των σύγχρονων ανθρώπων και των εξαφανισμένων ειδών του γένους Homo Οι πρώτες θεωρίες διατυπώθηκαν με την αλληλούχηση μικρού τμήματος μιτοχονδριακού DNA Νεάντερταλ και υποστήριζαν ότι πιθανότατα ή δεν υπήρξε γονιδιακή ροή ανάμεσα στους Νεάντερταλ και στους ανατομικά σύγχρονους ανθρώ-πους ή ήταν τόσο μικρή ώστε δεν είναι πλέον διακριτή( Green et al 2008) Η σχεδόν πλήρης αλληλούχηση του πυρηνικού γονιδιώματος των Νεάντερταλ το 2010 έδειξε με βεβαιότητα ότι υπήρξε γονιδιακή πρόσμειξη με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους( Green et al 2010) Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερα κοινά γενετικά γνωρίσματα με τους σύγχρονους Ευρασιάτες παρά με τους σύγχρο-νους Αφρικανούς υποδηλώνοντας εντονότερη γονιδιακή ροή προς τους προγόνους των πληθυσμιακών ομάδων μη-αφρικανικής καταγωγής Πιθανά σενάρια γενετικής πρόσμειξης υποστηρίζουν ότι η γονιδιακή ροή συνέβη μετά τη μετακίνηση των σύγχρονων ανθρώπων από την Αφρική στην Ευρασία αλλά δεν αποκλείουν το ενδε-χόμενο η διαφοροποίηση να οφείλεται σε διαφορετικές ομάδες του γένους Homo που είχαν ήδη διαμορφωθεί στην Αφρική (Green et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού των Νεάντερταλ από τους σύγχρονους ανθρώπους έχει υπολογισθεί στα 500 χιλιάδες χρόνια βάσει του μιτοχονδριακού DNA στα 800000 βάσει του πυρηνικού DNA και στα 270-440 χιλιάδες χρόνια συνυπολογίζοντας και τα δύο (Green et al 2010middot Reich et al 2010) Ο χρόνος διαχωρισμού η συνολική δηλαδή χρονική περίοδος που δύο ή περισσότερες γενεαλογίες διαχωρίστηκαν από τον κοινό τους πρόγονο μπορεί να υπολογιστεί γνωρίζοντας τον ρυθμό μετάλλαξης μιας σειράς νουκλεοτιδίων

Οι Denisovan ή Denisova hominins είναι ένας πληθυσμός του γένους Homo που εντοπίστηκε πρόσφατα στα Όρη Αλτάι στη νοτιοδυτική Σιβηρία και χρονολογείται περίπου στα 50000 χρόνια πΧ (Krause et al 2010) Ενώ μορφολογικά ήταν λίγα αυτά που μπορούσαν να διατυπωθούν (Mednikova 2011) τα γενετικά δεδομένα που μπόρεσαν να αποκτηθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα έδειξαν σε αντίθεση με ότι γνω-ρίζαμε μέχρι σήμερα ότι παράλληλα με τους σύγχρονους ανθρώπους δύο αρχαϊκές ομάδες οι Νεάντερταλ και οι Denisovan έζησαν σε γειτονικές περιοχές στην νοτιοδυτική Σιβηρία (Reich et al 2010) Συγκρίνοντας συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα διαφοροποιείται από το γονιδίωμα των Denisovan κατά 117 και από το γονιδίωμα των Νεάντερταλ (θέση Vindija) κατά 122 (Krause et al 2010) Η απόσταση δηλαδή των σύγχρονων ανθρώπων ανάμεσα στους Denisovan και τους Νεάντερταλ είναι σχεδόν όμοια Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι και οι δύο ομάδες κατάγονται από έναν κοινό προγονικό πληθυσμό που διαχωρίστηκε νωρίτερα από τους προγόνους των σημερινών ανθρώπων Οι Denisovan όπως και οι Νεάντερταλ μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με τους Ευρασιάτες σε σχέση με του πληθυσμούς αφρικανικής καταγωγής και εμφανίζουν ομοιότητες με πληθυσμιακές ομάδες της Μελανησίας υπολογίζοντας ότι περίπου το 5 του γονιδιώματος των Μελανησίων προέρχεται απrsquo αυτούς (Krause et al 2010)

Με τη βοήθεια του αρχαίου DNA έχει αρχίσει η διερεύνηση και άλλων χαρακτηριστικών αυτών των αρχα-ϊκών ομάδων ndashχαρακτηριστικών που τους διαφοροποίησαν από τους σύγχρονους ανθρώπους και που τελικά έδωσαν στους τελευταίους το πλεονέκτημα της επικράτησης Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 111812 σημειακές μεταλλάξεις αντικατάστασης νουκλεοτιδίων (single-nucleotide changes -SNCs) και 9499 ενθέσεις (insertion) και απαλοιφές (deletion) Σrsquo αυτά τα σημεία οι σύγχρονοι άνθρωποι εμφανίζουν το νέο αλληλόμορφο ενώ οι Denisovan τον αρχέγονο αλληλόμορφο δηλαδή αυτό που συναντάμε και στα πρωτεύοντα Ξεκινώντας τη σύγκριση από τους πιο συντηρητικούς γονιδιακούς τόπους αυτούς δηλαδή που διαφοροποιούνται πλήρως ανάμεσα στα πρωτεύοντα και τους ανθρώπους φαίνεται ότι κάποιοι συνδέονται με γονίδια που επηρεάζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος την αύξηση των νευροαξονικών απολή-ξεων και τον μηχανισμό των συναπτικών συνδέσεων Η περιορισμένη γνώση που έχουμε για το πώς τα γονίδια σχετίζονται με φαινότυπους καθιστά αδύνατο να προβλέψουμε τις λειτουργικές συνέπειες αυτών των αλλα-γών Μας πληροφορούν όμως ότι πολλές από τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται στον σύγχρονο άνθρωπο μπορεί να έχουν αλλάξει πολύ πρόσφατα (Meyer et al 2012)

Παράλληλα με την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων προγονικών ως προς τον σύγχρονο άνθρω-πο ειδών το αρχαίο DNA έχει συμβάλει ουσιαστικά και στη μελέτη των γενετικών σχέσεων σύγχρονων και προϊστορικών πληθυσμιακών ομάδων Ένα απο τα πολύ δημοφιλή ερωτήματα που τα τελευταία χρόνια έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών είναι η γενετική βάση του σημερινού ευρωπαϊκού πληθυσμού Ένα τμήμα

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

αυτής της έρευνας είναι και η μελέτη των πρώτων γεωργικών πληθυσμών που εγκαταστάθηκαν ή αυτοχθόνως αναπτύχθηκαν στην Ευρώπη (Pinhasi et al 2012) Αυτό το φαινόμενο που είναι γνωστό με τον όρο laquoνεολιθική ή αγροτική επανάσταση ή νεολιθική δημογραφική μετάβασηraquo έχει επηρεάσει αποφασιστικά την εξέλιξη της ανθρώπινης ιστορίας Περιγράφει τη μετάβαση από τους κυνηγούς-τροφοσυλλέκτες στη μόνιμη εγκατάσταση και τη μακρά σειρά των νεωτερισμών που την συνόδευσαν Οι νεωτερισμοί αυτοί περιλαμβάνουν κυρίως τη γεωργία και την κτηνοτροφία που συνοδεύεται επίσης από παράλληλη έρευνα για την εξημέρωση των ζώων (Larson amp Burger 2013) και των καλλιεργειών (Palmer Smith amp Allaby 2012) και τη σύνθετη κοινωνική οργάνωση Με τη νεολιθική επανάσταση άλλαξε διαπαντός το δημογραφικό αλλά και το πολιτισμικό προφίλ του ανθρώπινου πληθυσμού Βασισμένες σε απόλυτες μεθόδους χρονολόγησης όπως ο άνθρακας 14C και σε αρχαιολογικά ευρήματα ξέρουμε ότι αυτή η διαδικασία ξεκίνησε στη Μέση Ανατολή στις περιοχές της εύφορης ημισελήνου και σταδιακά έφτασε και στα πιο βόρεια κομμάτια της Ευρώπης Τα κύρια ερωτήματα που προκύ-πτουν από την πλευρά της βιολογικής ιστορίας αλλά και της αρχαιολογίας είναι 1) αν η εμφάνιση των νεωτε-ρισμών αυτών συνοδεύεται από μετακινήσεις πληθυσμών από την Ανατολία προς την Ευρώπη 2) αν ναι ακο-λουθώντας ποιες οδούς και αν όχι ποιος ήταν ο ρόλος των τοπικών πληθυσμών στην ύπαρξη μιας αυτόχθονης εξέλιξης Η μελέτη αυτού του φαινομένου γινόταν μέχρι τώρα κυρίως με τη σύνδεση του υλικού πολιτισμού με ορισμένες πληθυσμιακές ομάδες Επειδή διαφορετικά πολιτισμικά στοιχεία μπορεί να προέρχονται από την ίδια γενετική δεξαμενή αλλά και όμοια πολιτισμικά στοιχεία δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα βιολογική συνέχεια οι γενετικές αναλύσεις προσφέρουν καινούριες πληροφορίες στη μελέτη αυτού του σύνθετου φαινομένου

Χρησιμοποιώντας δεδομένα αρχαίου DNA ήδη γνωρίζουμε ότι υπήρξε εν μέρει γενετική ασυνέχεια μεταξύ των τοπικών κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της κεντρικής Ευρώπης (Bramanti et al 2009) καθώς και γενετική συγγένεια ανάμεσα στους γεωργούς της κεντρικής Ευρώπης -συγκεκριμένα των ομάδων με πολιτισμικά στοιχεία γραμμικής ταινιωτής κεραμικής (Linearbandkeramik-LBK)- και τους σύγ-χρονους πληθυσμούς της δυτικής Ευρασίας (Haak et al 2010) Επιπλέον διαπιστώθηκε γενετική ασυνέχεια μεταξύ των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών και των πρώτων γεωργών της Σκανδιναβίας και μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα των γεωργών με σύγχρονους ευρωπαϊκούς πληθυσμούς της Μεσογείου Αντίθετα η γενετική υπο-γραφή των κυνηγών-τροφοσυλλεκτών δείχνει περισσότερη συγγένεια με υπάρχοντες πληθυσμούς της βορείου Ευρώπης (Skoglund et al 2012) Στη δυτική Ευρώπη γενετικές αναλύσεις σε σκελετικό υλικό του τέλους της νεολιθικής εποχής από την Ιβηρική χερσόνησο υποδεικνύουν μεταναστευτικό κύμα αντρικού πληθυσμού κυ-ρίως διαμέσου της μεσογειακής οδού (Lacan et al 2011) και διαφορές με τους πρώτους αγρότες της κεντρικής Ευρώπης (Hervella et al 2012) Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ίσως μεταναστευτικά κύματα από τη νοτιοανατολική Ευρώπη και ακολουθώντας διαφορετικές οδούς συνέβαλαν στην εξάπλωση της γεωρ-γίας και στον απόηχο αυτής της επέκτασης διαμορφώθηκε τελικά το γονιδιακό τοπίο της σύγχρονης Ευρώπης Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτού του τοπίου φαίνεται ότι έπαιξαν και οι πληθυσμοί της νεότερης και τελικής νεολιθικής εποχής (Brandt et al 2013)

Πρόσφατα συνδυασμός γενετικών και ισοτοπικών δεδομένων από τη θέση Blaumltterhoumlhle της κεντρικής Γερμανίας σε οστεολογικό υλικό μεσολιθικής και νεολιθικής εποχής έδειξε ότι οι απόγονοι των μεσολιθικών διατήρησαν για 2000 χρόνια μετά από την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής στην περιοχή τους τον ίδιο τρόπο αναζήτησης τροφής χωρίς να οικειοποιηθούν τους νεολιθικούς νεωτερισμούς Αντίθετα οι γεωργοί που ζούσαν δίπλα στις μεσολιθικές ομάδες και εκμεταλλεύονταν την ίδια γεωγραφική περιοχή ακολουθούσαν μια τυπική διατροφή καταναλώνοντας εξημερωμένα ζώα και φυτά (Bollongino et al 2013) Ενώ γενικά είχε επικρατήσει η αποψη ότι οι κυνηγοί-τροφοσυλλέκτες εξαφανίστηκαν μετά την άφιξη της γεωργίας φάνηκε τελικά ότι ζούσαν παράλληλα με τους αγρότες για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα Αν και αυτό το μοντέλο σίγουρα δεν έχει εφαρμογή σε ολόκληρη την Ευρώπη αποτελεί μια ακόμη ενδιαφέρουσα θεωρία

Για τη μεσολιθική-νεολιθική δημογραφία και γενετική της νοτιοανατολικής Ευρώπης και του Αιγαίου δεν γνωρίζουμε ακόμη πολλά Η νοτιοανατολική Ευρώπη και τα Βαλκάνια ήταν το σταυροδρόμι για διάφορους πολιτισμούς ήδη από την παλαιολιθική εποχή και πολύ πιθανόν ήταν μέρος της οδού που χρησιμοποιήθηκε από τους νεολιθικούς πληθυσμούς για να εισέλθουν στην Ευρώπη Στο πλαίσιο 3 ερευνητικών προγραμμάτων που ξεκίνησαν το 2010 η γενετική ανάλυση οστεολογικού υλικού από 32 συνολικά μεσολιθικές νεολιθικές και εποχής χαλκού αρχαιολογικές θέσεις του ελλαδικού χώρου (Εικ 815) Σκοπός της ανάλυσης αυτής είναι να διερευνηθεί γενετικά ο ρόλος των πληθυσμών της νότιας Βαλκανικής χερσονήσου και συγκεκριμένα της περιοχής του Αιγαίου στην εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου παραγωγήςmiddot εάν δηλαδή πρόκειται για αποτέ-λεσμα ενδημικής διάχυσης ή μετακίνησης πληθυσμιακών στοιχείων από την Ανατολία Επιπλέον επιχειρείται μια ανάλυση του ποσοστού της γενετικής συμμετοχής των προϋπαρχόντων μεσολιθικών πληθυσμών στο γε-νετικό υπόβαθρο των μετέπειτα νεολιθικών πληθυσμών αλλά και των σύγχρονων πληθυσμών της Ευρώπης (Hofmanova et al 2016)

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Εικόνα 815 Χάρτης της Ελλάδος στον οποίο αποτυπώνονται οι αρχαιολογικές θέσεις από όπου έχουν πραγματοποιηθεί δειγματοληψίες για αναλύσεις αρχαίου DNA

Μέχρι σήμερα έχουν αναλυθεί περίπου 60 από τα 110 μεσολιθικά και νεολιθικά δείγματα με το ποσοστό επιτυχίας στην απομόνωση του DNA να ανέρχεται περίπου στο 30 Το ποσοστό αν και χαμηλό βρίσκεται στα αναμενόμενα όρια για περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα όπως η Ελλάδα Οι μέχρι τώρα αναλύσεις εστι-άζονται στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και συγκεκριμένα της υπερμεταβλητής περιοχής I χρησιμοποιώντας την κλασική μέθοδο της PCR και τις τεχνικές εμπλουτισμού και νέας γενιάς αλληλούχησης με σκοπό την απόκτηση μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι μιτοχονδρι-ακές απλοομάδες σε 20 δείγματα από 9 αρχαιολογικές θέσεις (Μεσολιθικά Θεόπετρα Φράγχθι Νεολιθικά Φράγχθι Μαυροπηγή Ξηρολίμνη Ποντοκώμη Κλείτος Τούμπα Κρεμαστή Κοιλάδα Παλιάμπελα Θαρ-ρούνια) Αναλύσεις σε επιλεγμένους δείκτες του πυρηνικού γονιδιώματος και στο Υ χρωμόσωμα πραγματο-ποιούνται στο πλαίσιο που επιτρέπει η διατήρηση του γενετικού υλικού και η ποσότητα του δείγματος Τα συμπεράσματα των ερευνών προβλέπεται να συνδράμουν σημαντικά στη μελέτη της γενετικής ιστορίας της νοτιοανατολικής Βαλκανικής και των διαδικασιών που έλαβαν χώρα στην περιοχή

Παράλληλα με το μιτοχονδριακό DNA έχουν ήδη διερευνηθεί φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηρι-στικά που συνδέονται με την εμφάνιση των νεολιθικών αγροτών όπως η δυσανεξία στη λακτόζη Σε αντίθεση με ότι γνωρίζαμε η δυσανεξία στη λακτόζη δηλαδή η αδυναμία του οργανισμού να πέψει το γάλα μετά τον απογαλακτισμό ήταν ένα αρχέγονο χαρακτηριστικό τυπικό των ανατομικά σύγχρονων ανθρώπων (Itan et al

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

2009) Αυτό φαίνεται ότι διαφοροποιήθηκε με την εισαγωγή του νεολιθικού τρόπου ζωής και τη συστηματική κατανάλωση γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων (Burger et al 2007) Τα άτομα που τυχαία έφεραν τη μετάλλαξη η οποία τους επέτρεπε να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα χωρίς πρόβλημα είχαν ένα σημαντικό πλεονέκτημα Αυτό οδήγησε σε ταχύτατη αύξηση του ποσοστού εμφάνισης της συγκεκριμένης μετάλλαξης Σήμερα υψηλά ποσοστά του ευρωπαϊκού πληθυσμού φέρουν τη μετάλλαξη και μπορούν να καταναλώσουν γάλα καθrsquo όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Itan et al 2009) Αν και δεν είναι ακόμη εύκολη η ταύτιση λειτουργικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους διαφαίνε-ται ότι οι μελλοντικές έρευνες στην παλαιογενετική θα επικεντρωθούν στην ανάλυση παρόμοιων χαρακτηρι-στικών και παθολογιών

Τέλος μια μικρότερης έκτασης εφαρμογή του αρχαίου DNA στην αρχαιολογική και ανθρωπολογική έρευνα είναι η μελέτη των ταφικών πρακτικών και κοινωνικοπολιτισμικών δεδομένων προσδιορίζοντας τις σχέσεις συγγενείας ενός ταφικού συνόλου Αυτό μπορεί να γίνει ως ένα βαθμό μελετώντας το μιτοχονδριακό DNA και το DNA στο Υ χρωμόσωμα δηλαδή τη μητρική και την πατρική γραμμή καταγωγής Αυτού του τύπου οι γε-νετικοί δείκτες δεν μπορούν όμως να χαρακτηρίσουν τον ακριβή βαθμό συγγένειας δύο ή και περισσότερων ατόμων Για τον σκοπό αυτόν απαιτείται η χρήση γενετικών δεικτών του μικροδορυφορικού DNA ή αλλιώς STRs (βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις-Short Tandem Repeats) Αυτοί οι γενετικοί δείκτες βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου και τους χρησιμοποιούμε κυρίως στην ιατροδικαστική στους ελέγχους ταυτοποίησης ατόμων και πατρότητας (Roewer 2013) Όσο πιο πολλούς ενδεδειγμένους δείκτες χρησιμοποιούμε τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα αποτελέσματα τα οποία βασίζονται σε στατιστικές αναλύσεις πιθανοτήτων δύο ή περισ-σότερα άτομα να εμφανίζουν τον ίδιο ακριβώς αριθμό και μέγεθος αλληλομόρφων STRs Για λόγους που θα αναφερθούν αναλυτικότερα παρακάτω οι δείκτες που βρίσκονται στον πυρήνα του κυττάρου είναι δύσκολο να αναλυθούν με επιτυχία ενώ τις περισσότερες φορές ακόμη και από πιο πρόσφατους ιστορικούς σκελε-τούς (Haas et al 2013) τα ποσοστά επιτυχίας είναι χαμηλά Δεδομένης της πολυπλοκότητας της μεθόδου της καταστροφής του δείγματος του χρόνου και κόστους της ανάλυσης τα παραγόμενα αποτελέσματα έχουν πε-ριορισμένη πληροφοριακή αξία γιατί περιγράφουν ένα γεωγραφικά και χρονολογικά περιορισμένο φαινόμενο και δεν συμβάλλουν ουσιαστικά στην ανασύσταση της εξελικτικής μας ιστορίας (Kirsanow amp Burger 2012) Πολλοί παλαιογενετιστές υποστηρίζουν ότι ερωτήματα που αφορούν τις κοινωνικές δομές των προϊστορικών κοινωνιών μπορούν καλύτερα να απαντηθούν με παραμέτρους της πληθυσμιακής γενετικής όπως ο βαθμός ετεροζυγωτίας και ο βαθμός ενδογαμίας παρά από τον προσδιορισμό συγγένειας σε ένα ταφικό σύνολο

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Βιβλιογραφία

Beaumont M Zhang W amp Balding DJ 2002 Approximate Bayesian computation in population genetics Genetics 162 2025-35

Bramanti B Thomas MG Haak W Unterlaender M Jores P Tambets K Antanaitis-Jacobs I Haidle MN Jankauskas R Kind CJ Lueth F Terberger T Hiller J Matsumura S Forster P amp Burger J 2009 Genetic discontinuity between local hunterndashgatherers and central Europersquos first farmers Science 326 137ndash140

Brandt G Haak W Adler CJ Roth C Szeacutecseacutenyi-Nagy A Karimnia S Moumlller-Rieker S Meller H Ganslmeier R Friederich S Dresely V Nicklisch N Pickrell JK Sirocko F Reich D Cooper A Alt KW amp Genographic Consortium 2013 Ancient DNA reveals key stages in the formation of central European mitochondrial genetic diversity Science 342 257-61

Bollongino R Nehlich O Richards MP Orschiedt J Thomas MG Sell C Fajkosovaacute Z Powell A amp Burger J 2013 2000 years of parallel societies in Stone Age Central Europe Science 342 479-81

Bowcock AM Bucci C Hebert JM Kidd JR Kidd KK Friedlaender JS amp Cavalli-Sforza LL 1987 Study of 47 DNA markers in five populations from four continents Gene Geography 1 47-64

Briggs AW Stenzel U Meyer M Krause J Kircher M amp Paumlaumlbo S 2010 Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA Nucleic Acids Research 38 e87

Burger J Kirchner M Bramanti B Haak W amp Thomas MG 2007 Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic European Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104 3736-41

Burger J amp Bollongino R 2010 Richtlinien zur Bergung Entnahme und Archivierung von Skelettproben fuumlr palaeogenetische Analysen Bulletin der Schweizerischen Gesellschaft fuumlr Anthropologie 16 71-78

Cavalli-Sforza LL Kidd JR Kidd KK Bucci C Bowcock AM Hewlett BS amp Freidlaender JS 1986 DNA markers and genetic variation in the human species Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 411-417

Chahal HS Stals K Unterlaumlnder M Balding DJ Thomas MG Kumar AV Besser GM Atkinson AB Morrison PJ Howlett TA Levy MJ Orme SM Akker SA Abel RL Grossman AB Burger J Ellard S amp Korbonits M 2011 AIP mutation in pituitary adenomas in the 18th century and today New England Journal of Medicine 364 43-50

Cooper A amp Poinar HN 2000 Ancient DNA do it right or not at all Science 289 1139Currat M amp Excoffier L 2011 Strong reproductive isolation between humans and Neanderthals inferred

from observed patterns of introgression Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 15129ndash15134

Devault AM Golding GB Waglechner N Enk JM Kuch M Tien JH Shi M Fisman DN Dhody AN Forrest S Bos KI Earn DJ Holmes EC amp Poinar HN 2014 Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849 New England Journal of Medicine 370 334-40

Fu Q Mittnik A Johnson PL Bos K Lari M Bollongino R Sun C Giemsch L Schmitz R Burger J Ronchitelli AM Martini F Cremonesi RG Svoboda J Bauer P Caramelli D Castellano S Reich D Paumlaumlbo S amp Krause J 2013 A revised timescale for human evolution based on ancient mitochondrial genomes Current Biology 23 553-539

Gilbert MT Bandelt HJ Hofreiter M amp Barnes I 2005 Assessing ancient DNA studies Trends in Ecology and Evoution 20 541-4

Gilbert MTP Willerslev E Hansen AJ Barnes I Rudbeck L Lynnerup N amp Cooper A 2003b Distribution patterns of post-mortem damage in human mitochondrial DNA American Journal of Human Genetics 72 32ndash47

Green R E Malaspinas A-S Krause J Briggs A W Johnson P L F Uhler C Meyer M Good J M Maricic T Stenzel U Pruumlfer K Siebauer M Burbano H A Ronan M Rothberg J M Egholm M Rudan P Brajković D Kućan Ž Gušić I Wikstroumlm M Laakkonen L Kelso J Slat kin M amp Paumlaumlbo S 2008 A Complete Neandertal Mitochondrial Genome Sequence Determined by High-Throughput Sequencing Cell 134 416-426

Gerbault P Liebert A Itan Y Powell A Currat M Burger J Swallow DM amp Thomas MG 2011 Evolution of lactase persistence an example of human niche construction Philosophical transactions

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

of the Royal Society of London 366 863-77Green R E Krause J Briggs A W Maricic T Stenzel U Kircher M Patterson N Li H Zhai

W Fritz M H-Y Hansen N F Durand E Y Malaspinas A-S Jensen J D Marques-Bonet T Alkan C Pruumlfer K Meyer M Burbano H A Good J M Schultz R Aximu-Petri A Butthof A Houmlber B Houmlffner B Siegemund M Weihmann A Nusbaum C Lander E S Russ C Novod N Affourtit J Egholm M Verna C Rudan P Brajkovic D Kucan Ž Gušic I Doronichev V B Golovanova L V Lalueza-Fox C de la Rasilla M Fortea J Rosas A Schmitz R Johnson P L F Eichler E E Falush D Birney E Mullikin J C Slatkin M Nielsen R Kelso J Lachmann M Reich D amp Paumlaumlbo S 2010 A Draft Sequence of the Neandertal Genome Science 328 710-722

Haak W Forster P Bramanti B Matsumura S Brandt G Tanzer M Villems R Renfrew C Gronenborn D Alt KW amp Burger J 2005 Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites Science 310 1016ndash1018

Haak W Balanovsky O Sanchez JJ Koshel S Zaporozhchenko V Adler CJ Der Sarkissian CS Brandt G Schwarz C Nicklisch N Dresely V Fritsch B Balanovska E Villems R Meller H Alt KW amp Cooper A Members of the Genographic Consortium 2010 Ancient DNA from European early neolithic farmers reveals their near eastern affinities PLoS Biol 8e1000536

Haas C Shved N Ruumlhli FJ Papageorgopoulou C Purps J Geppert M Willuweit S Roewer L amp Krawczak M 2013 Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Joumlrg Jenatsch (1596-1639) Forensic Science International Genetics 7 610-7

Hervella M Izagirre N Alonso S Fregel R Alonso A Cabrera VM amp de la Ruacutea C 2012 Ancient DNA from hunter-gatherer and farmer groups from Northern Spain supports a random dispersion model for the Neolithic expansion into Europe PLoS One 7 e34417

Higuchi R Bowman B Freiberger M Ryder O amp Wilson A 1984 DNA sequences from the quagga an extinct member of the horse family Nature 312 282-284

Hofmanovaacute Z Kreutzer S Hellenthal G Sell C Diekmann Z Diacuteez del Molino D van Dorp L Loacutepez S Kousathanas A Link V Kirsanow K Cassidy L Martiniano R Strobel M Scheu A Kotsakis K Halstead P Triantaphyllou S Kyparissi-Apostolika N Urem-Kotsou DC Ziota C Adaktylou F Gopalan S Bobo DM Winkelbach L Bloumlcher J Unterlaumlnder M Leuenberger C Ccedililingiroğlu C Horejs B Gerritsen F Shennan S Bradley DB Currat M Veeramah C Wegmann D Thomas MG Papageorgopoulou C Burger C 2015 Early farmers from across Europe directly descended from Neolithic Aegeans bioRxiv doi httpdxdoiorg101101032763

Hofreiter M Serre D Poinar HN Kuch M amp Paumlaumlbo S 2001a Ancient DNA Nature Review Genetics 2 353ndash359

Hofreiter M Jaenicke V Serre D Haeseler AA amp Paumlaumlbo S 2001b DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA Nucleic Acids Research 29 4793ndash4799

Ho SY Kolokotronis SO amp Allaby RG 2007 Elevated substitution rates estimated from ancient DNA sequences Biology Letters 3 702ndash705

Huynen L Millar CD amp Lambert DM 2012 Resurrecting ancient animal genomes the extinct moa and more Bioessays 34 661-669

Itan Y Powell A Beaumont MA Burger J amp Thomas MG 2009 The origins of lactase persistence in Europe PLoS Computational Biology 5 e1000491

Kirsanow K amp Burger J 2012 Ancient human DNA Annals of Anatomy 194 121-32Krause J Fu Q Good JM Viola Β Shunkov MV Derevianko AP amp Paumlaumlbo S 2010 The complete

mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia Nature 464 894ndash897Lacan M Keyser C Ricaut FX Brucato N Duranthon F Guilaine J Crubezy E amp Ludes B 2011

Ancient DNA reveals male diffusion through the Neolithic Mediterranean route Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 108 9788ndash9791

Larson G amp Burger J 2013 A population genetics view of animal domestication Trends in Genetics 29 197-205

Malmstroumlm H Gilbert MT Thomas MG Brandstrom M Stora J Molnar P Andersen PK Bendixen C Holmlund G Goumltherstroumlm A amp Willerslev E 2009 Ancient DNA reveals lack of continuity between neolithic hunterndashgatherers and contemporary Scandinavians Current Biology 19 1758ndash1762

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162

Maurano MT Haugen E Sandstrom R Vierstra J Shafer A Kaul R Stamatoyannopoulos JA 2015 Large-scale identification of sequence variants influencing human transcription factor occupancy in vivo Nat Genet 471393-401

Meyer M Kircher M Gansauge MT Li H Racimo F Mallick S Schraiber JG Jay F Pruumlfer K de Filippo C Sudmant PH Alkan C Fu Q Do R Rohland N Tandon A Siebauer M Green RE Bryc K Brigg AW Stenzel U Dabney J Shendure J Kitzman J Hammer MF Shunkov MV Derevianko AP Patterson N Andreacutes AM Eichler EE Slatkin M Reich D Kelso J amp Paumlaumlbo S 2012 A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual Science 338 222-6

Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G amp Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1 263-73

Palmer SA Smith O amp Allaby RG 2012 The blossoming of plant archaeogenetics Annals of Anaomy 194 146-156

Poinar H N Schwarz C Qi J Shapiro B MacPhee R D E Buigues B Tikhonov A Huson D H Tomsho L P Auch A Rampp M Miller W amp Schuster S C 2006 Metagenomics to Paleogenomics Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA Science 311 392-394

Pinhasi R Thomas MG Hofreiter M Currat M amp Burger J The genetic history of Europeans Trends in Genetics 28 496-505

Rasmussen M Li Y Lindgreen S Pedersen J S Albrechtsen A Moltke I Metspalu M Metspalu E Kivisild T Gupta R Bertalan M Nielsen K Gilbert M T P Wang Y Raghavan M Campos P F Munkholm Kamp H Wilson A S Gledhill A Tridico S Bunce M Lorenzen E D Binladen J Guo X Zhao J Zhang X Zhang H Li Z Chen M Orlando L Kristiansen K Bak M Tommerup N Bendixen C Pierre T L Groslashnnow B Meldgaard M Andreasen C Fedorova S A Osipova L P Higham T F G Bronk Ramsey C v O Hansen T Nielsen F C Crawford M H Brunak S Sicheritz-Ponteacuten T Villems R Nielsen R Krogh A Wang J amp Willerslev E 2010 Ancient human genome sequence of an extinct Palaeo-Eskimo Nature 463 757-762

Reich D Green RE Kircher M Krause J Patterson N Durand EY Viola B Briggs AW Stenzel U Johnson PL Maricic T Good JM Marques-Bonet T Alkan C Fu Q Mallick S Li H Meyer M Eichler EE Stoneking M Richards M Talamo S Shunkov MV Derevianko AP Hublin JJ Kelso J Slatkin M amp Paumlaumlbo S 2010 Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia Nature 468 1053ndash1060

Richards M Macaulay V Hickey E Vega E Sykes B Guida V Rengo C Sellitto D Cruciani F Kivisild T Villems R Thomas M Rychkov S Rychkov O Rychkov Y Goumllge M Dimitrov D Hill E Bradley D Romano V Caligrave F Vona G Demaine A Papiha S Triantaphyllidis C Stefanescu G Hatina J Belledi M Di Rienzo A Novelletto A Oppenheim A Noslashrby S Al-Zaheri N Santachiara-Benerecetti S Scozari R Torroni A amp Bandelt HJ 2000 Tracing European founder lineages in the near eastern mtDNA pool American Journal of Human Genetics 67 1251-1276

Roewer L 2013 DNA fingerprinting in forensics past present future Investigative Genetics 4 22Skoglund P Malmstroumlm H Raghavan M Storaring J Hall P Willerslev E Gilbert MT Goumltherstroumlm

A amp Jakobsson M 2012 Origins and genetic legacy of Neolithic farmers and hunter-gatherers in Europe Science 336 466-9

Smith CI Chamberlain AT Riley MS Cooper A Stringer CB amp Collins MJ 2001 Neanderthal DNA Not just old but old and cold Nature 410 771ndash772

Veeramah KR amp Hammer MF 2014 The impact of whole-genome sequencing on the reconstruction of human population history Nature Review Genetics 15 149-162