4 Hasil dan Pembahasan

-Amilase merupakan enzim yang mempunyai peranan penting dalam bioteknologi saat ini.

Aplikasi teknis enzim ini sangat luas, seperti pada proses likuifaksi pati pada proses produksi

sirup fruktosa jagung atau bahan bakar etanol, pada industri tekstil, industri pembuatan kertas,

biomedis, dan industri-industri lain yang berbasiskan pati [Nazmi et al., 2006]. Gen bla yang

mengkode -amilase dari Bacillus licheniformis SITH galur lokal telah diklon ke dalam vektor

ekspresi YEp-Secretex pada penelitian sebelumnya, dan juga telah diekspresikan di dalam ragi

Saccharomyces cerevisiae [Oktaviani, 2006; Natalia et al., 2007]. Pada penelitian ini dilakukan

produksi -amilase rekombinan dalam ragi S. cerevisiae dan penentuan sidat-sifat biokimia

-amilase rekombinan.

4.1 Uji Kualitatif Aktivitas -Amilase Rekombinan dari B. licheniformis pada S. cerevisiae

Penentuan aktivitas -amilase rekombinan secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui

keberadaan ekspresi gen bla pengkode -amilase dari B. licheniformis yang disisipkan pada

plasmid YEp-Secretex dalam ragi S. cerevisiae. Ekspresi gen pada plasmid YEp-Secretex

dikontrol oleh promotor hibrid galactose-phosfodegluceraldehydedekinase (GAL-PGK). Oleh

karena itu, -amilase rekombinan dapat diekspresikan jika ragi ditumbuhkan dalam media YNB

padat yang mengandung galaktosa. -Amilase rekombinan ini disekresikan ke media

pertumbuhan, karena gen BLA telah difusikan pada signal sequence invertase gen SUC pada

plasmid YEp-Secretex. -Amilase rekombinan ini akan mengkatalisis reaksi hidrolisis pati yang

terdapat pada media YNB padat. Ketika ditambahkan larutan KI/I2 akan terlihat daerah bening

dan gelap (Gambar 4.1 A dan B). Gambar 4.1 A menunjukkan kultur ragi S. cerevisiae yang

membawa gen bla pada media YNB padat sebelum ditambahkan larutan KI/I2. Gambar 4.1 B

menunjukkan kultur ragi setelah ditambahkan larutan KI/I2.

A B

Gambar 4.1 Uji kualitatif aktivitas -amilase rekombinan.

Daerah gelap (biru kehitaman) pada Gambar 4.1 B menunjukkan terbentuknya kompleks iodin

dengan pati. Daerah bening menunjukkan adanya aktivitas amilolitik -amilase rekombinan,

karena pada daerah ini tidak terbentuk kompleks iodin dengan pati yang menandakan bahwa pati

di daerah ini telah terhidrolisis oleh enzim.

4.2 Optimasi Kadar Penginduksi untuk Produksi -Amilase Rekombinan

Media pertumbuhan yang digunakan adalah media pertumbuhan 3xYEP. Pada tahap awal

dilakukan penentuan kadar galaktosa untuk mengetahui kondisi optimum produksi -amilase

rekombinan. Konsentrasi galaktosa yang ditambahkan ke media produksi adalah 1%, 2%, 3%,

3,5%, 4%, 4,5%, dan 5% (b/v). Inokulum disiapkan sebanyak 5 mL untuk 50 mL media

produksi, lalu ditumbuhkan hingga nilai OD600 selnya sekitar 0,6. Sel ragi dari inokulum diambil

dengan cara sentrifugasi lalu ditumbuhkan pada media produksi. Setiap 24 jam waktu inkubasi

dilakukan pengambilan sampel enzim untuk diuji aktivitasnya. Uji aktivitas enzim menggunakan

Metode Fuwa [Fuwa, 1954]. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai penurunan absorban

sebesar 10% selama 10 menit waktu reaksi per ml enzim. Aktivitas enzim pada berbagai kadar

galaktosa terhadap waktu inkubasi dapat dilihat pada Gambar 4.2. Dari Gambar 4.2 dapat dilihat

bahwa pada penambahan 1% galaktosa, aktivitas -amilase rekombinan sangat kecil dengan

harga maksimum sekitar 700 U.mL-1 setelah waktu inkubasi 96 jam. Untuk penambahan

galaktosa 2% aktivitas optimum enzim diperoleh setelah waktu inkubasi 72 jam dengan aktivitas

sebesar 1600 U.mL-1. Aktivitas optimum untuk penambahan galaktosa sebanyak 3% dan 4%

diperoleh setelah dilakukan inkubasi selama 48 jam - 72 jam. Penambahan 3,5% galaktosa

menghasilkan aktivitas optimum pada waktu inkubasi 96 jam. Untuk penambahan galaktosa

4,5% dan 5% aktivitas enzim mulai meningkat dengan tajam setelah dilakukan inkubasi selama

21

72 jam. Secara umum pada jam ke-72 hingga 96 jam terjadi peningkatan aktivitas (2%, 3%,

3,5%, 4,5%, dan 5%) dan penurunan aktivitas (4% galaktosa) tidak terlalu signifikan.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 24 48 72 96 120 144

Waktu Inkubasi (jam)

U.m

L-1

1% galaktosa2% galaktosa3% galaktosa3,5% galaktosa4% galaktosa4,5% galaktosa5% galaktosa

Gambar 4.2 Aktivitas -amilase rekombinan dengan variasi kadar galaktosa.

Berdasarkan hasil optimasi penginduksi yang telah dilakukan, untuk produksi -amilase

rekombinan dalam jumlah yang lebih banyak dipilih kadar penginduksi 3% galaktosa dengan

waktu inkubasi 72 jam. Pemilihan kadar penginduksi dan waktu inkubasi ini berdasarkan pada

efisiensi biaya dan efisiensi waktu produksi.

4.3 Produksi -Amilase Rekombinan dan Fraksinasi Ammonium Sulfat

Produksi -amilase dilakukan dengan menyiapkan inokulum sebanyak 25 mL, lalu diambil sel

raginya dengan cara sentrifugasi. Sel ragi ditumbuhkan pada media cair 3 x YEP yang

mengandung 3% galaktosa sebanyak 500 mL. -Amilase rekombinan disekresikan ke media

pertumbuhan (ekstraseluler), oleh karena itu enzim diambil dari kultur supernatan dengan alat

sentrifuga. Supernatan yang mengandung enzim dipekatkan dengan fraksinasi ammonium sulfat.

Endapan enzim dengan garam ammonium sulfat disentrifuga kembali. Garam ammonium sulfat

dan enzim dipisahkan dengan dialisis menggunakan buffer phosfat 5 mM pH 7 di dalam kantong

selofan. Untuk mengetahui enzim telah terbebas dari ammonium sulfat dilakukan uji kualitatif

ammonium sulfat dengan larutan BaCl2. Enzim hasil fraksinasi dan dialisis diperoleh sebanyak

24 mL. Nilai aktivitas total -amilase rekombinan hasil fraksinasi ini adalah sebesar 2,77 x 105

U (pada suhu reaksi 70C).

22

4.4 SDS-PAGE -Amilase Rekombinan

Penentuan massa molekul -amilase rekombinan dilakukan dengan SDS-PAGE. SDS berfungsi

sebagai denaturan enzim membentuk molekul yang lebih linear dan menyebabkan enzim

menjadi bermuatan negatif, sehingga saat dilakukan elektroforesis laju protein hanya

dipengaruhi oleh ukuran protein. SDS-PAGE pada penelitian ini dilakukan dengan memodifikasi

loading buffer tanpa penambahan -merkaptoetanol dan menginkubasi sebagian gel

elektroforesis dengan larutan pati. Marker protein (Rainbow, Amersham Life Science) digunakan

untuk menentukan massa molekul enzim rekombinan. Pita biru marker protein diperoleh dari

hasil visualisasi menggunakan larutan staining Coomassie Brilliant Blue R-250 (Gambar 4.3.B).

Pita -amilase rekombinan (Gambar 4.3.A) diperoleh dengan menginkubasi gel elektroforesis

dalam larutan pati dan ditambahkan larutan KI/I2.

A B

Gambar 4.3 Gel elektroforesis SDS-PAGE -amilase rekombinan.

Daerah gelap pada Gambar 4.3.A menunjukkan terbentuknya kompleks antara pati dengan iodin,

sedangkan daerah terang menunjukkan pita -amilase rekombinan yang telah menghidrolisis

molekul pati, sehingga tidak terbentuk kompleks pati-iodin. Massa molekul enzim rekombinan

ini diperoleh sekitar 68 kDa. Gen bla yang diisolasi dari B. licheniformis galur lokal ini memiliki

ukuran sebesar 1.453 bp [Oktaviani, 2006]. Massa molekul teoritis -amilase ini adalah sebesar

53,27 kDa. Hal ini menunjukkan bahwa -amilase rekombinan yang diekspresikan dalam ragi

23

S. cerevisiae ini memiliki massa molekul yang lebih besar dari massa molekul teoritisnya. Hal

ini dapat disebabkan karena -amilase ini mengalami glikosilasi ketika diekspresikan dalam ragi

S. cerevisiae. -Amilase yang dihasilkan oleh B. licheniformis dari galur yang berbeda memiliki

perbedaan karakteristik karena disebabkan oleh perbedaan jumlah asam aminonya. Untuk

-amilase rekombinan, perbedaan jenis vektor ekspresi yang digunakan akan menghasilkan

karakteristik enzim yang juga berbeda. Misalnya, -Amilase yang diisolasi dari B. licheniformis

44MB82-A memiliki massa molekul yang berbeda yaitu sebesar 58 kDa [Ivanova et al., 1993].

4.5 Penentuan Suhu Optimum -Amilase Rekombinan

Penentuan suhu optimum -amilase rekombinan dengan Metode Fuwa dilakukan untuk

mengetahui suhu optimum yang memiliki aktivitas amilolitik -amilase rekombinan maksimum.

Aktivitas -amilase rekombinan menunjukkan peningkatan dari suhu 30C hingga suhu 70C.

Aktivitasnya optimum pada suhu 70C dengan aktivitas sebesar 11,5 x 103 U.mL-1 (Gambar 4.4).

Pada suhu 80C dan 90C aktivitas enzim mulai menurun hingga akhirnya relatif tidak aktif

pada suhu 100C. -Amilase wild type B. licheniformis 44MB82-A memiliki suhu optimum

sekitar 90C [Ivanova et al., 1993], maka -amilase rekombinan dari B. licheniformis galur lokal

ini memiliki sifat yang berbeda.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

20 40 60 80 100 120

Temperatur (derajat C)

U.m

L-1

Temperatur (C)

Gambar 4.4 Aktivitas -amilase rekombinan terhadap suhu.

24

4.6 Penentuan pH Optimum -Amilase Rekombinan

Aktivitas -amilase rekombinan dipengaruhi oleh pH atau konsentrasi H+ dalam larutan.

Penentuan pH optimum -amilase rekombinan dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada

pH yang berbeda, yaitu dari pH 3 sampai pH 10. Pada pH 3 dan pH 4 enzim tidak memiliki

aktivitas (data tidak ditampilkan). Aktivitas enzim terhadap pH (dari pH 5-10) dapat dilihat p