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Análise da expressão de TGFααααα (Transforming GrowthFactor Alpha) nas células germinativas e afrequência de células de sertoli em touros de raçassintéticas com alteração na qualidade seminal

Marilise Mesquita HORN1

José Carlos FerrugemMORAES2

Maria Isabel AlbanoEDELWEISS1

Correspondência para:MARILISE MESQUITA HORNCentro de PesquisasHospital de Clínicas de Porto AlegreRua Ramiro Barcelos, 2350, 1° andarCEP 90035-903 - Porto Alegre - RSmmhorn@uol.com.br

Recebido para publicação: 30/08/2004Aprovado para publicação: 23/08/2005

1 - Laboratório de Patologia Experimental do Centro de Pesquisas doHospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre – RS2 - Embrapa Pecuária Sul, Bagé - RS

Resumo

O fator de crescimento transformante alfa (TGFα) é uma molécula dafamília dos fatores de crescimento transformantes, que tem sidoapontado como provável regulador do desenvolvimento testicular.A hipótese do presente estudo foi de que touros de raças sintéticascom deficiente qualidade seminal apresentam um padrão de expressãode TGFα e uma freqüência média de células de Sertoli, diferentesquando comparados aos touros com adequada qualidade seminal.Foram utilizados para o estudo, testículos de seis touros Braford eoito touros Brangus-Ibagé com e sem problemas na qualidadeseminal. A técnica de imuno-histoquímica foi empregada paradeterminar a expressão de TGFα no epitélio seminífero e tambémpara marcar o núcleo das células de Sertoli, com o uso do anticorpomonoclonal TGFα (Ab-2; Calbiochem) e anticorpo policlonal anti-proteína S100 (DAKO). A média geral de espermatogônias marcadaspelo anticorpo foi diferente para raça: 9.2±0.4 para Braford e 11.0±0.3para Brangus-Ibagé (P<0.05), porém não houve diferençaestatisticamente significativa entre as fases analisadas. A média decélulas de Sertoli foi similar entre as raças de touros. Porém houveuma interação significativa (P<0.05) entre raça e condição reprodutiva,representada por uma menor freqüência de células Sertoli nos tourosBrangus-Ibagé considerados aptos à reprodução. Este achado quepode ser um indicador de que a origem da menor qualidade de sêmennestes animais de raças sintéticas deve estar desvinculada da faseembrionária ou neonatal, já que é nesta fase que o número de célulasde Sertoli é estabelecido para o indivíduo adulto. O entendimentodas interações celulares do epitélio seminífero, envolvendo os fatoresde crescimento no controle parácrino da espermatogênese, requer nãosomente a identificação do local de expressão destes fatores, comotambém o seu significado in vivo.

Palavras-chave:Fatores decrescimento.Degeneraçãotesticular. Qualidadeseminal.Raças sintéticas.Bovinos.

Introdução

A constatação de animais com alteraçõesna qualidade do sêmen, mantidos sob asmesmas condições ambientais e de manejo queoutros com perfeitas condições reprodutivas,motiva a busca de conhecimento sobre aorigem da variabilidade quanto a aptidãoreprodutiva. Exemplos são os estudos sobre

a correlação entre as características e a prediçãoda fertilidade1,2,3,4,5,6. O controle local daespermatogênese inclui interações entre ascélulas de Sertoli, células germinativas e mióidese entre as células de Leydig e macrófagos7,8.Adicionalmente moléculas de sinalizaçãointercelular denominados fatores decrescimento têm sido verificados emtestículos de ratos recém nascidos e

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prepúberes e também participam na regulaçãoda puberdade e desenvolvimento daespermatogênese, estimulando a proliferaçãocelular, por mediação da ação do FSH9. Aexpressão de oito fatores de crescimento, entreeles o TGFα, foi detectada em testículos decervo em diferentes estações do ano10. Aidentificação imuno-histoquímica do TGFα emtestículos de ratos de várias idades já foi descrita11.Em ratos recém nascidos foi observada intensareação imunoistoquímica nas células de Leydig,o mesmo ocorreu com ratos com 21 dias e emratos adultos. Porém, o gene do TGFαpredominou nas fases precoces dodesenvolvimento testicular e regrediu durante apuberdade. A identificação do fator decrescimento TGFα no testículo, foi descrita alémdos ratos7,9,12, em camun-dongos 13, cervos 10 ehumanos14. Embora estes estudos comprovemque o testículo é um local de produção deTGFα, o papel potencial deste fator é aindaincerto, pois ainda são necessárias evidênciasconclusivas in vivo.

A população de células de Sertoli édefinida no final da gestação e logo após onascimento15,16, constituindo uma população fixaem tamanho após a puberdade e diretamenterelacionada à população de células germinativas17.As células de Sertoli produzem fatores essenciaisà maturação das células germinativas in vitrorelacionados à síntese de RNA e DNA18. Ascélulas de Sertoli secretam inúmeros fatores eapresentam imunoreatividade às proteínasvimentina, citoqueratina, hormônio anti-muleriano19 e proteínas S100a e b20. Estaimunoreatividade facilita a identificação destascélulas permitindo sua avaliação quantitativa.

Os objetivos são: verificar a presença doTGFα no epitélio seminífero de bovinosadultos, e, estando presente, investigar suautilidade como um indicador da funçãotesticular em touros de raças sintéticas. Eadicionalmente investigar a população de célulasde Sertoli em touros aptos e inaptos àreprodução.

Materiais e métodos

Foram utilizados testículos de seis touros

Braford e oito Brangus-Ibagé, de dois anos deidade, provenientes de duas propriedadeslocalizadas em Uruguaiana e Dom Pedrito noRio Grande do Sul. Os animais forampreviamente classificados em aptos e inaptosà reprodução de acordo com a qualidadeseminal, nas propriedades de origem,segundo as recomendações da Portaria nº26 de 05/09/1996, www.agricultura.gov.br.Os animais incluídos neste estudo comoaptos à reprodução foram descartados poraspectos zootécnicos e os inaptos àreprodução por má qualidade de sêmen,sendo abatidos em um frigorífico. Logo apóso abate, foram coletadas amostras de umtestículo de cada animal, colocadas emfixador de Bouin por 24 horas, seguido detratamento padrão para confecção deblocos de parafina. Os cortes com aespessura média de 4mm foram colados emlâminas que receberam um tratamentoprévio de água corrente e imersão em umasolução aquosa de 15% de goma de caseína.Foram utilizados dois anticorpos primários,o anticorpo monoclonal anti-TGFα (Ab-2;Calbiochem) e o policlonal anti-proteínaS100 (DAKO), em uma diluição de 1:20 e1:300 respectivamente. Os controle positivosdo TGFa e S100 foram respectivamentepele humana e tecido neuronal. Os controlesnegativos foram o mesmo corte de testículo,porém sem o anticorpo primário. Os cortesforam desparafinizados e rehidratados. Arecuperação antigênica foi realizada atravésde irradiação por forno de microondas emsolução tampão citrato pH 6, em potênciamáxima. O bloqueio da peroxidaseendógena foi realizado através de banhos emsolução de 5% de peróxido de hidrogênio.O bloqueio das reações inespecíficas foirealizado através da imersão das lâminas emleite desnatado a 5% em PBS. Na seqüência,foi colocado o anticorpo primário, que foideixado durante a noite em câmara úmidaescura a 4 °C. Após este período foicolocado o anticorpo secundário por 30minutos em câmara úmida escura, e apóstrês lavagens com PBS, as lâminas foramincubadas com estreptoavidina por mais 30

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minutos (Kit LSAB, DAKO). A revelaçãoda reação foi realizada com soluçãosubstrato de diaminobenzidine (Kit DAB,DAKO). As lâminas foram contracoradascom solução de Hematoxilina de Mayer por20 segundos.

A análise histológica do cicloespermatogênico foi realizada empregando-se uma classificação proposta porHorn,Moraes e Edelweiss, et al6. Nestesistema o estádio I é caracterizado pelasmitoses das espermatogônias em pré-leptoteno e espermatócito leptoteno eespermátides arredondadas ou levementealongadas; o estádio II é caracterizado pelafase meiótica, quando ocorrem as divisõescelulares reducionais e as células passam deespermatócitos para espermátides jovens eo estádio III é representado pela fase damaturação onde ocorre a transformação dasespermátides em espermatozóides.

Foram observados 528 túbulos, paraidentificar e quantificar as célulasimunoreativas ao anticorpo TGFα, e orespectivo estádio de cada túbulo seminífero.Foram observados 440 cortes de túbulos,para quantificar as células de Sertoli queforam marcadas com a utilização doanticorpo S100, e a freqüência em cadaestádio do túbulo seminífero. O diâmetrodos túbulos variou entre 2-9 mm, tendo sidomedido com uma régua milimetrada aomicroscópio. O número de células marcadaspelo TGFα e o número de células de Sertoliidentificados pelo S100 foi submetido àanálise de variância considerando-se os fatoresraça, condição reprodutiva e estádio do cicloespermatogênico, ajustados para o diâmetrodos túbulos (co-variável). As análises foramefetivadas empregando-se o programaestatístico NCSS 6.0.21

Resultado e Discussão

Dentre todos os tipos de célulasgerminativas no epitélio seminífero, apenasas espermatogônias expressaram o fator decrescimento TGFα. Considerando as duasraças, a média geral de espermatogônias

marcadas pelo anticorpo foi diferente(P<0.05). Para a Braford foi de 9,2±0,4 epara a raça Brangus-Ibagé 11,0±0,3. Porém,considerando-se a classificação dos tourosquanto à qualidade seminal, os touros aptose inaptos não apresentaram diferença quantoà expressão de TGFα. Para os Braford amédia dos touros aptos e inaptos foirespectivamente de 9,4±0,7 e 8,9±0,5 e paraos Brangus-Ibagé de 11,1±0,6 e 11±0,4.

A média de espermatogônias queexpressaram TGFα nos diferentes estádiosdo ciclo espermatogênico foi diferente(P<0.05). Os estádios I, II e III apresentarammédias de respectivamente 12,4±0,5; 7,0±0,5e 10,9±0,4. Além disso, foi observada umainteração significativa entre raças e estádiosque está apresentada na figura 1.

A utilização do anticorpo S100 foieficaz para marcar o núcleo das células deSertoli e facilitar a contagem destas célulasnos diferentes túbulos nos touros aptos einaptos, evitando-se equívocos. As médiasentre raças Braford e Brangus-Ibagé foramrespectivamente 15,9±0,3 e 15,6±0,3 e paraos animais aptos e inaptos respectivamente15,6±0,3 e 16±0,2. Tendo sido constatadauma interação significativa (P<0.05) entreraça e condição reprodutiva (figura 2):

A marcação do TGFα, dentro dostúbulos seminíferos, ficou claramentedefinida nas espermatogônias (figura 3). Noentanto, foi observada marcação para TGFαno citoplasma das células de Sertoli,notadamente nos túbulos em degeneração(figura 4). O S100 marcou as células de Sertoli,diferenciando-as das demais células da basedo epitélio do túbulo seminífero (figura 5).

O presente estudo demonstra que oTGFα está presente nos testículos de bovinos,especificamente nas espermatogônias e, aindaque se encontra em freqüência similar nosanimais com qualidade seminal normal oualterada. Os presentes resultados incluem osbovinos no rol das espécies em que aidentificação do fator de crescimento TGFajá foi descrita nos testículos, tais comoratos7,12, camundongos13, cervos10 ehumanos14. A busca de alguma associação

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Figura 1- Número médio de espermatogônias expressando TGFα nos três estádios do ciclo espermatogênico nas duas raças sintéticas

entre a identificação do fator de crescimentoTGF e alterações na qualidade seminal nãotêm sido alvo de estudo em mamíferos. Amaior expressão de TGFα foi observada nosestádios I e III, e a menor expressão no estádioII onde ocorrem as meioses e uma menorfreqüência de espermatogônias está presentena base do epitélio. As espermatogôniasmarcadas pelo TGFα estiveram em maiorfreqüência, portanto, nos estádioproliferativo e de maturação, reiterando asconclusões de Wong et al.22 sobre apopulação celular em proliferação, que seriao alvo potencial para identificação daexpressão de fatores de crescimento.

A diferença significativa observadaentre raças, demonstra que a raça Brafordapresenta menor média de espermatogôniasexpressando o TGFα quando comparadacom a raça Brangus. De acordo com préviosestudos sobre a classificação quanto àqualidade seminal, foi demonstrado que araça Braford apresenta um percentual maiorde descarte por alterações na qualidadeseminal que a raça Brangus4. Uma menorexpressão de fatores de crescimento no

testículo desta raça, pode ser uma explicaçãopara a detecção de alterações qualitativas nosêmen, uma vez que estes fatores sãoproduzidos pela ativação de determinadosgenes, que estimulam a proliferação celular,meiose e diferenciação, além de atuarem nocontrole da puberdade e espermatogênese10,23.A interação observada entre raças e estádiosdemonstrada na figura 1 indica umcomportamento diferencial na expressão doTGFα nos três estádios para cada grupogenético de touros. Os touros Brangusapresentaram maiores médias de expressãodo TGFα no estádio I, e os Braford noestádio III. Estas diferenças indicam que osestádios do ciclo espermático, onde seconcentram as proliferações espermatogoniaiscom expressão de TGFα, foram diferentesentre os genótipos de touros.

A freqüência de células de Sertoli nãofoi diferente nos touros aptos e inaptos àreprodução. No entanto a figura 2demonstra a interação entre raça e condiçãoreprodutiva, sendo a média de células deSertoli semelhante entre os touros Brafordaptos e inaptos, porém superior nos touros

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Figura 2 - Freqüência média das células de Sertoli nas duas raças de touros aptos e inaptos à reprodução

Figura 3 - Espermatogônias expressando TGFα (aumento de 200x) Figura 4 - Expressão de TGFα em corte de túbulo seminífero degenerado (aumento de 200x)

Brangus-Ibagé inaptos. As células de Sertolisão incapazes de multiplicação na fase adulta,e sua fase divisional se dá no período pré-natal ou pós-natal recente, ou seja, antes daprimeira onda espermatogênica. A divisãodestas células está regulada por dois fatores,o FSH e peptídeos opiáceos de origemtesticular24. Orth,Gunsalus e Lamparti17

observaram em ratos, que quando apopulação de células de Sertoli foi reduzidapela aplicação de um fármaco logo após onascimento, o percentual de espermátides

redondas também diminuiu, o que pode serreflexo de uma redução no recrutamento deespermatogônias ou degeneração das célulasgerminativas, em função da populaçãoreduzida de células de Sertoli. Mesmoconsiderando a pequena diferença apenaspara raça Brangus-Ibagé quanto ao númerode células de Sertoli entre os touros aptos einaptos, possivelmente a alteração relacionadaà baixa qualidade seminal em touros inaptos,deve estar desvinculada da fase gestacionalou pós-natal.

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Figura 5 - Expressão da proteína S100 nas células de Sertoli (aumento de 200x)

Quanto aos detalhes dos achadosimuno-histoquímicos, a figura 3 mostra queas únicas células germinativas do epitélioseminífero que expressaram TGFα foramas espermatogônias. As células em fase depré-leptóteno na prófase meiótica nãoexpressaram este fator. A figura 4 demonstraa expressão de TGFα no citoplasma dascélulas de Sertoli, mais fortemente nostúbulos degenerados. Estes achados estão emconcordância com os de Nakazumi et al.14,que encontraram em humanos, maior

expressão de TGFα no citoplasma dascélulas de Sertoli de pacientes com distúrbiosna espermatogênese. Este fato poderia estarrelacionado a um efeito compensatório naexpressão de TGFα, ou inapropriadainibição deste fator, em virtude de umdesajuste local no epitélio seminífero. A figura5 mostra a marcação da proteína S100 nascélulas de Sertoli. Esta marcação torna-seinteressante no estudo das células de Sertoli,uma vez que estas células apresentam umamorfologia muito variada e complexa25.Também as proteínas S100 regulamprocessos intracelulares como o ciclo celular,transcrição e diferenciação e são secretadaspor células que exercem atividadesextracelulares com efeitos parácrinos. Osgenes do S100 foram identificados nocromossomo humano 1q21, ondeanormalidades cromossômicas que resultamem uma alteração na expressão destes genes,estão associadas com neoplasias, incluindoainda cardiomiopatias, desordensneurodegenerativas e câncer26. As proteínasS100 são envolvidas em processos mediadoresde Ca2+ mas o exato papel biológico delasainda não está totalmente esclarecido20.

Analysis of the TGFααααα (transforming growth factor alpha) expression ingerminative cells and the frequency of Sertoli cells in bulls of syntheticbreed with deficient seminal quality

Abstract

The transforming growth factor alpha (TGFα) is a molecule from thefamily of the transforming growth factors and has been pointed outas a probable regulator of testicular development. The hypotheses inthe present study was that bulls from synthetic breeds with deficientseminal quality presented different TGFα expression and averagenumber of Sertoli cells when compared to normal bulls. Testiclesfrom six Braford and eight Brangus-Ibagé bulls with and withoutproblems in semen quality were used. The immunohistochemicaltechnique was employed to determine the TGFα expression inseminiferous epithelium and to mark the nucleus of the Sertoli cellswith the use of respectively of monoclonal antibody anti-TGFα (Ab-2; Calbiochem) and anti-S100 protein polyclonal antibody (DAKO).The general average of spermatogonia marked by the antibody wasdifferent for each breed: 9.2±0.4 for Braford and 11.0±0.3 for Brangus-Ibagé. No difference regarding the expression of TGFα was foundbetween sound and unsound bulls. The average number of Sertoli

Key-words:Growth factors.Testicular degeneration.Semen quality.Synthetic breeds.Bovine

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cells was similar between bull breeds. A smaller Sertoli cell populationwas found in the sound Brangus-Ibagé bulls, which may be anindication that the origin of the low seminal quality in synthetic bullsshould be detached from the embryonic or the early newborn phasewhen the total number of such cells in adults is established. Theunderstanding of cell interaction in the seminiferous epithelium,involving growth related factors, requires not only the identificationof the expression site but also the in vivo meaning to spermiogenesis.The study of the growth factors in the testicle in adult bulls is worthfurther research in order to understand the regulation ofspermiogenesis at the paracrine level in adult animals.

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