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FERNANDA VIEIRA PALADINO Vias de transdução de sinal do receptor tipo Toll 4 nas células β pancreáticas e seus efeitos na secreção e produção de insulina São Paulo 2012 Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Alergia e Imunopatologia Orientadora: Profa. Dra. Anna Carla Renata Krepel Goldberg
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FERNANDA VIEIRA PALADINO
Vias de transdução de sinal do receptor tipo Toll 4
nas células β pancreáticas e seus efeitos na secreção
e produção de insulina
São Paulo
2012
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Alergia e Imunopatologia Orientadora: Profa. Dra. Anna Carla Renata Krepel Goldberg
FERNANDA VIEIRA PALADINO
Vias de transdução de sinal do receptor tipo Toll 4
nas células β pancreáticas e seus efeitos na secreção
e produção de insulina
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 5890, de 20 de dezembro de 2010. A versão original está disponível na Biblioteca FMUSP)
São Paulo
2012
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Alergia e Imunopatologia Orientadora: Profa. Dra. Anna Carla Renata Krepel Goldberg
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Paladino, Fernanda Vieira
Vias de transdução de sinal do receptor tipo Toll 4 nas células ß
pancreáticas e seus efeitos na secreção e produção de insulina / Fernanda
Vieira Paladino. -- São Paulo, 2012.
Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
Programa de Alergia e Imunopatologia.
Orientador: Anna Carla Renata Krepel Goldberg.
Descritores: 1.Receptor 4 Toll-like 2.Lipopolissacarídeos 3.Células
secretoras de insulina 4.Insulina 5.Via MyD88-dependente 6.Linhagem
celular MIN6
USP/FM/DBD-186/12
Dedico esse trabalho aos meus
pais, que com muito amor,
esforço e dedicação fizeram o
possível e o impossível para que
esse sonho se tornasse
realidade. Amo vocês!
À minha família! Avós, tios e
minha pequena Rafaella, que
sempre me apoiaram e
torceram pelo meu sucesso!
Ao meu namorado Ricardo, pelo
companheirismo e amor nessa
etapa importante da minha vida!
A Deus, porque sem Ele nada
seria possível! Muito obrigada!
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que de alguma forma fizeram parte dessa
etapa tão importante na minha vida.
À minha orientadora Dra. Anna Carla Goldberg, agradeço pela oportunidade
de ser sua aluna e por acreditar que eu fosse capaz de realizar esse projeto.
Agradeço pela confiança, paciência, incentivo e pelos ensinamentos que levarei por
toda minha vida e que com certeza foram muito importantes para o meu
crescimento profissional.
À Dra. Carla Piccinato, que além de amiga é uma excelente colega de
trabalho, agradeço a dedicação, ajuda e paciência em vários momentos
importantes durante esses 3 anos de mestrado!
À Dra. Anna Coló, agradeço a paciência e ajuda nos experimentos de PCR
em tempo Real.
À Dra. Eliane Antonioli, agradeço pela amizade, pelas conversas e pelo
apoio nos momentos profissionais e pessoais.
À Dra. Andréa Sertie e sua aluna Camila, agradeço por compartilharem seu
conhecimentos com paciência e dedicação!
À Lilian Buzzeto, agradeço pela ajuda nos experimentos de ELISA.
Ao Dr. Luiz Sardinha, agradeço pela atenção, paciência e dedicação na
realização dos experimentos de citometria de fluxo.
Ao Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein, agradeço pela
disponibilidade da estrutura física para a realização deste trabalho.
Às minhas amigas queridas Vanessa Pazzini e Janaina Munuera, que são
pessoas muito especiais e foram fundamentais durante esses anos na convivência
dentro e fora do laboratório! Agradeço pela amizade, companheirismo, carinho e
dedicação!
A todos os amigos do Centro de Pesquisa Experimental do IIEP, em
especial Luciana, Flávia, Renata, Ana Carolina, Andrea, Jaila, Alex, Lis, Marta,
Natália, Érica, Daniela, Eliana e Pedro. Obrigada pela amizade, pela ajuda, pelas
conversas e pelos bons conselhos. Os meus dias no laboratório ficam muito mais
divertidos com a companhia de vocês!
Ao Prof. Dov Zipori e aos alunos do laboratório de Biologia Celular e
Molecular do Instituto Weizmann de Ciência. Agradeço por compartilharem seus
conhecimentos, pela hospitalidade e dedicação durante minha estadia em Israel.
Foi uma experiência única!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
agradeço o auxílio financeiro através do projeto de pesquisa 2009/06547-6 e ao
Instituto UNIEMP.
SUMÁRIO
Lista de figuras
Lista de abreviaturas e sigla
Lista de símbolos
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1
1.1. Receptores tipo Toll (TLRs) e sistema imune ......................................... 1
1.2. Receptor tipo Toll 4 (TLR4) e vias de sinalização ................................... 3
1.3. TLR4 em células não imunes .................................................................... 6
1.4. Ilhotas de Langerhans e células β pancreáticas ..................................... 6
1.5. Diabetes Mellitus ....................................................................................... 8
1.6. Resultados anteriores ............................................................................. 10
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 13
2.1. Objetivo geral ........................................................................................... 13
2.2. Objetivos específicos .............................................................................. 13
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 14
3.1. Cultura Celular ......................................................................................... 14
3.1.1. Células MIN6 (células β de insulinoma de camundongo) ...................... 14
3.1.2. Células J774-A1 (linhagem de macrófagos de camundongo) ................ 14
3.2. Preparação do meio RPMI com concentrações de glicose .................. 15
3.3. Tratamento com LPS ............................................................................... 15
3.4. Caracterização funcional das células MIN6 ........................................... 16
3.4.1. Produção Intracelular de insulina ........................................................... 16
3.4.2. Responsividade à glicose ....................................................................... 17
3.5. Dosagem de insulina ............................................................................... 18
3.6. Extração de RNA total ............................................................................. 18
3.7. Síntese de cDNA ...................................................................................... 19
3.8. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) .......................................... 20
3.8.1. Desenho dos “primers”............................................................................ 20
3.8.2. Análise resultados da PCR em tempo real ............................................. 21
3.9. Padronização e Otimização das reações de PCR em Tempo Real ...... 22
3.10. Ensaio de fosforilação ........................................................................... 23
3.11. Extração de proteínas............................................................................ 23
3.12. Western Blot ........................................................................................... 24
3.13. Citometria de fluxo ................................................................................ 25
3.13.1. Marcação com anti-CD284(TLR4)/MD2 e anti-CD14 ............................ 25
3.13.2. Marcação com anexina V e iodeto de propídeo (PI) ............................. 26
3.14. Análise estatística .................................................................................. 26
4. RESULTADOS ............................................................................................. 27
4.1. Células MIN6 expressam TLR4/MD2 e a molécula adaptadora CD14 .. 27
4.2. Expressão de TLR4 em células MIN6 é induzida por LPS e
hiperglicemia ................................................................................................... 28
4.3. Via MyD88-dependente é ativada por LPS em células MIN6 ................ 30
4.4. Tratamento com LPS causa aumento na secreção de insulina em
células MIN6 .................................................................................................... 32
4.5. LPS não altera a expressão de moléculas de superfície TLR4/MD2 e
CD14 nas células MIN6 ................................................................................... 34
4.6. Tratamento com LPS não induz morte celular nas células MIN6 ........ 35
5. DISCUSSÃO ................................................................................................. 37
6. CONCLUSÕES ............................................................................................. 43
7. ANEXOS ....................................................................................................... 44
8. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 47
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema das vias de transdução de sinal de TLR4. Modificada do site www.invitrogen.com. Data de acesso: 20 de janeiro de 2011 ............................................................................................................ 5 Figura 2 - Expressão de TLR4, CD14 e secreção de insulina induzida por LPS em cultura primária de células β humanas. Resultado de PCR em Tempo-Real, mostrando o aumento dose-dependente da expressão de (A) TLR4 e (B) CD14 em cultura primária de células β humanas tratadas com 0, 5 e 50ng/mL LPS por 48h. (C) Diminuição da expressão do RNA mensageiro de insulina após tratamento com 50ng/mL LPS. ..... 11
Figura 3 - Viabilidade de células β humanas após tratamento com LPS. Resultado de citometria de fluxo, mostrando a diminuição da viabilidade celular em cultura primária de células β humanas tratadas com 50ng/mL LPS por 48h, através da marcação por TMRE .......................... 12 Figura 4 - Produção intracelular de insulina. (A) Foram semeadas 5x105 células sobre lamínulas e fixadas com paraformaldeido 4%. As células foram incubadas por 15 minutos a 37°C com Newport Green 1μM insulina (verde) e DAPI - núcleo (azul). Aumento de 20X. (B) 5x105 células foram coletadas e marcadas com Newport Green por 15 minutos a 37°C e posteriormente passadas no citômetro de fluxo. Células positivas para NG (linha pontilhada) e controle negativo (linha contínua). Experimento realizado em triplicata (n=3). Figura representativa de 3 experimentos ... 16 Figura 5 - Secreção de insulina. Foram semeadas 104 células e cultivadas durante 4 dias em condições de 2,8mM; 5,6mM e 11,2mM glicose. Após esse período o sobrenadante foi coletado para dosagem de insulina, através do método de ELISA. Experimento realizado em triplicata (n=3). Resultados representados por média ± EPM ................................. 17 Figura 6 - Curva Padrão e Curva de Dissociação dos "primers". (A) HPRT e (B) TLR4. Foi utilizado o Software 7500 v2.0.1 - Applied Biosystems. Todos os produtos da PCR tinham o tamanho esperado. ... 23 Figura 7 - Expressão de TLR4/MD2 e CD14 na superfície das células MIN6, cultivadas por 4 dias em meio de cultura hiperglicêmico, analisadas por citometria de fluxo. Foram incubadas 5x105 células por 30 minutos a 4°C no escuro com os anticorpos anti-TLR4/MD2 anti-CD14 e analisadas por citometria de fluxo. (A) Células TLR4/MD2 positivas (linha pontilhada) e controle negativo (linha contínua). (B) Células CD14 positivas (linha pontilhada) e controle negativo (linha contínua). Experimento realizado em triplicata (n=3). Figuras representativas de três
experimentos independentes. Resultados representados por média ± EPM. ......................................................................................................... 27 Figura 8 - Expressão de TLR4, MyD88, IRAK4, IRAK1, TRAF6, INS1 e INS2, após incubação com LPS e diferentes concentrações de glicose nas células MIN6. Foram incubadas 104 células por 4 dias com 2,8mM; 5,6mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h as células foram lisadas, RNA total extraído e foi feito PCR em Tempo Real. Expressão gênica de (A) TLR4, (B) MyD88, (C) IRAK4, (D) IRAK1, (E) TRAF6, (F) INS1 e (G) INS2. Expressão normalizada pelo gene HPRT e expressos como número de vezes em relação ao controle - células não tratadas (fold-change). Resultados representados por média ± EPM. Diferenças estatísticas significantes estão indicadas por (*) p<0,05. ................................................................. 29
Figura 9 - Ativação das proteínas p38, JNK e NF-κB por LPS em células MIN6. As células foram cultivadas por 24h com RPMI (glicose 11,2 mM) suplementado com 0,5% SBF e após esse período foram incubadas com 50 ng/mL de LPS nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60 minutos. (A) p38 e fosfo-p38 (B) NF-κB e β-actina, (C) JNK1 e 2 e fosfo-JNK1 e 2, (D) IRF3 e β-actina e (E) IRF7 e β-actina. Experimento realizado em duplicata (n=2).. ........................................................................................ 31
Figura 10 - Conteúdo intracelular e secreção de insulina em células MIN6 tratadas com LPS. MIN6 foram incubadas por 4 dias com 2,8mM; 5,6mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células foram coletadas. (A) Marcação com NG, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (B) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do Newport Green. (C) No mesmo experimento, o sobrenadante foi coletado e a insulina secretada foi dosada por ELISA. Os dados foram normalizados pelo número de células por amostra. Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM. Diferenças estatísticas significantes estão indicadas por (*) p<0,05. ................................................................................................. 33
Figura 11 - Expressão de TLR4/MD2 e CD14 em células MIN6 tratadas com LPS. MIN6 foram incubadas por 4 dias com 2,8mM; 5,6mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as
mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células foram coletadas. (A) Marcação com anticorpo anti-TLR4/MD2, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (B) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do anticorpo TLR4/MD2. (C) Marcação com anticorpo anti-CD14, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (D) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do anticorpo CD14. Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM. ..................................................................................... 34
Figura 12 - Avaliação de morte celular em celular MIN5 tratadas com LPS. MIN6 foram incubadas por 4 dias com 2,8 mM; 5,6 mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células foram coletadas e marcadas com anexina V e PI. (A) Porcentagem de células positivas para anexina V (apoptose), (B) porcentagem de células positivas para anexina V e PI (apoptose tardia e necrose), (C) porcentagem de células positivas para PI (necrose). Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM ................................. 36
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP-1 Do inglês, activator protein 1
CD14 Do inglês, Cluster of differentiation 14
Ct Do inglês, cycle threshold / Limiar do ciclo
DM1 Diabetes Mellitus tipo 1
DM2 Diabetes Mellitus tipo 2
DMEM Do inglês, Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium
dNTP Desoxinucleotídeos trifosfatados
EPM erro padrão da média
HRP Do inglês, horseradish peroxidase
IFN interferon
IKK Do inglês, IκB kinase
IL interleucina
IRAK1 Do inglês, Interleukin-1 receptor-associated kinase 1
IRAK4 Do inglês, Interleukin-1 receptor-associated kinase 4
IRF3 Do inglês, Interferon regulatory factor 3
IRF7 Do inglês, Interferon regulatory factor 7
IκB Do inglês, inhibitor of κ light chain gene enhancer in B cells
JNK Do inglês, JUN N-terminal kinase
LBP Do inglês, lipopolysaccharide binding protein
LPS Lipopolissacarídeo
MAPK Do inglês, mitogen-activated protein kinase
MD2 Proteína mielóide diferenciadora 2
MIP1 Do inglês, macrophage inflammatory proteins
MyD88 Do inglês, Myeloid differentiation primary response gene 88
NF-κB Do inglês, nuclear factor kappa B
NG Newport Green
Oligo-dT oligo-desoxitimidina
PBS Do inglês, Phosphate Buffered Saline / Tampão fosfato-salino
PI Do inglês, propidium iodide/ Iodeto de propídeo
Primer Oligonucleotídeo iniciador
RNAm RNA mensageiro
SBF Soro bovino fetal
TAB1 Do inglês, TAK1 binding protein 1
TAK1 Do inglês, TGFβ activated kinase 1
TBK1 Do inglês, TANK binding kinase 1
TIR Do inglês, Toll/ Interleukin-1 receptor
TLR Do inglês, Toll-like receptor/ Receptor tipo Toll
TNF Do inglês, tumor necrosis factor/ Fator de necrose tumoral
TRAF3 Do inglês, TNF receptor-associated factor 3
TRAF6 Do inglês, TNF receptor-associated factor 6
TRAM Do inglês, TRIF-related adaptor molecule
TRIF Do inglês, TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β
LISTA DE SÍMBOLOS
°C Grau Celsius
μg Micrograma
μL Microlitro
cm Centímetro
g Força centrífuga relativa (=RCF)
mL Mililitro
mM Milimolar
ng Nanograma
Vieira Paladino F. Vias de transdução de sinal do receptor tipo Toll 4 nas
células beta pancreáticas e seus efeitos na secreção e produção de insulina
[Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2012.
RESUMO
INTRODUÇÃO: O receptor tipo Toll 4 (TLR4) pertencente a uma família de
receptores do sistema imune inato, reconhece o padrão molecular de
lipopolissacarídeos (LPS), expressos por bactérias Gram negativas. Sua
cascata de sinalização, nas células apresentadoras de antígeno, ocorre por
duas vias principais: MyD88-dependente, que resulta na ativação de NF-κB
e na expressão de genes de resposta inflamatória e MyD88-independente,
responsável pela ativação dos fatores IRF3 e IRF7, culminando na síntese
de interferons α e β, envolvidos na resposta anti-viral e anti-bacteriana.
Células não-imunes, de diversos tecidos, também expressam TLR4,
incluindo células β pancreáticas murinas e humanas. Devido ao seu papel
nos processos inflamatórios, os TLR estão implicados em doenças crônicas
como obesidade e diabetes. Estudo anterior do grupo identificou TLR4 como
uma molécula que ativa sinais inflamatórios e provoca alterações na
homeostase das células β. Neste trabalho, investigamos qual via é ativada
por LPS e quais os efeitos da expressão do TLR4 na viabilidade celular e na
produção de insulina em células β murinas. MÉTODOS: Células MIN6
(linhagem celular de insulinoma de camundongo) foram cultivadas em
condições de hipo (2,8mM glicose), normo (5,6mM glicose) e hiperglicemia
(11,2mM glicose), por 4 dias. Após esse período, foi adicionado LPS (50
ng/mL) por 48h e foram feitas análises por PCR em tempo real, Western
Blot, ELISA e citometria de fluxo. RESULTADOS: Os resultados confirmam o
aumento de TLR4 em células β em condições de hiperglicemia e a via de
sinalização ativada por LPS é a via MyD88-dependente, envolvida na
produção de citocinas pró-inflamatórias. A via de indução de intérferons tipo
1 está ausente nestas células. Além disso, TLR4 ativado por LPS aumentou
secreção de insulina em resposta a glicose, mas não induziu a morte celular.
CONCLUSÃO: A expressão de TLR4 em células β pancreáticas murinas é
induzida em resposta ao aumento da glicemia, constituindo um novo elo
entre a agressão à célula β causada por altos níveis de glicose e a alteração
da função celular induzida por LPS.
Descritores: receptor 4 Toll-like; lipopolissacarídeos; células secretoras de
insulina; insulina; via MyD88-dependente; linhagem celular MIN6.
Vieira Paladino F. Toll-like receptor 4 signal transduction pathways in
pancreatic β cells and their effect on insulin secretion and production
[dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo”; 2012.
SUMMARY
INTRODUCTION: Toll-like receptor 4 (TLR4) belongs to a family of innate
immunity receptors and recognizes the molecular pattern present in
lipopolysaccharides (LPS), typical of Gram-negative bacteria. There are two
TLR4 signaling pathways, typically in antigen-presenting cells: one is MyD88-
dependent, activating NF-kB transcription factor and triggering inflammatory
cytokine production and the other is MyD88-independent, leading to
activation of IRF3 and IRF-7 and production of interferons α e β, involved in
antiviral and antibacterial immune responses. Non-immune cells in several
tissues also express TLR4, including human and murine pancreatic β cells.
Due to their role in inflammatory processes, TLRs have been implicated in
chronic diseases like obesity and diabetes. Our previous study identified
TLR4 as a molecule which activates inflammatory signals and induces
changes in β cell homeostasis. In this study, we investigated which of the
TLR4 pathways is activated by LPS and the effects of glucose levels on cell
viability and insulin production in a mouse insulinoma cell line. METHODS:
MIN6 cells were maintained in low (2,8mM), normal (5,6mM) and high
(11,2mM) glucose levels for 4 days, and then incubated with LPS (50 ng/mL)
for 48 hours. Analyses were done by real-time PCR, Western Blot, ELISA
and flow cytometry. RESULTS: Analysis confirmed increase in TLR4 gene
expression in hyperglycemic conditions and showed that the signaling
pathway activated by LPS is MyD88-dependent. The interferon induction
pathway is absent in these cells. Furthermore, upon activation by LPS, TLR4
impacts on insulin secretion in response to glucose, but without triggering cell
death. CONCLUSION: We conclude that TLR4 expression in mouse
pancreatic β cells is induced in response to increased glucose levels,
constituting a new link in the chain of events leading to β cell stress caused
by high glucose levels with concomitant changes in cell function induced by
LPS.
Descriptors: Toll-like receptor 4; lipopolysaccharides; insulin-secreting cells;
insulin; MyD88-dependent pathway; cell line MIN6.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Receptores tipo Toll (TLRs) e sistema imune
Receptores tipo Toll ou TLR (Toll-Like receptor) pertencem a uma
família conservada de receptores do sistema imune inato, que reconhecem
padrões moleculares expressos por diversos patógenos, iniciando uma
sinalização específica que culmina no desencadeamento da resposta imune
adaptativa. Esses receptores desempenham papeis essenciais nas
respostas imunes, resultando na expressão de genes pró-inflamatórios
(Takeda, Kaisho et al. 2003) e moléculas que auxiliam no combate à
infecção.
O primeiro receptor tipo Toll foi inicialmente descrito em Drosophila
melanogaster, associado à embriogênese e a uma forma primitiva do
sistema imune inato (Hashimoto, Hudson et al. 1988). Posteriormente, foram
identificados genes homólogos em mamíferos, que foram então
denominados de Toll-Like Receptors (TLR) ou receptores tipo Toll.
(Medzhitov, Preston-Hurlburt et al. 1997; Rock, Hardiman et al. 1998)
Hoje, são conhecidos 13 membros da família de TLR, em mamíferos,
Estes apresentam diferenças estruturais e funcionais, mas os genes TLR
humanos 1-9 têm homólogos em camundongos e em outros animais
(Iwasaki and Medzhitov 2004; Kawai and Akira 2010).
As moléculas TLR estão localizadas predominantemente nas células
do sistema imune, como macrófagos e/ou células dendríticas. Enquanto
TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e TLR11 (apenas em camundongos) são
expressas na superfície das células, os receptores TLR3, TLR7, TLR8 e
TLR9 estão presentes em compartimentos intracelulares como os
endossomos e o retículo endoplasmático (Ahmad-Nejad, Hacker et al. 2002;
Heil, Ahmad-Nejad et al. 2003).Devido a diferenças de estrutura e de
2
localização, cada TLR é capaz de reconhecer classes diferentes de
moléculas presentes nos diferentes microrganismos, como, por exemplo,
lipopeptídeos originários de parasitas e peptidoglicanos expressos por
bactérias (TLR2 associado a TLR1) (Takeda, Kaisho et al. 2003), RNA de
dupla fita (TLR3) típico de vírus (Dogusan, Garcia et al. 2008),
lipopolissacarídeos (LPS) característicos de bactérias Gram-negativas
(TLR4) (Poltorak, He et al. 1998; Hoshino, Takeuchi et al. 1999), flagelina
(TLR5) (Hayashi, Smith et al. 2001), DNA na forma de sequências CpG
típicas de bactérias (TLR9) (Hemmi, Takeuchi et al. 2000), RNA de fita
simples típico de vírus que infectam macrófagos (TLR7) e profilina (TLR11)
(Lauw, Caffrey et al. 2005). Alguns TLR também reconhecem ligantes
endógenos como ácidos graxos saturados e produtos de células necróticas
(Andrade, Waddell et al. 2005; Shi, Kokoeva et al. 2006; Davis, Gabler et al.
2008). Recentemente foram descobertos novos membros dessa família, os
receptores TLR10, TLR12 e TLR13, porém seus ligantes ainda não foram
identificados (Grieco, Vendrame et al. 2011).
Quando ativados, os TLR desencadeiam a sinalização intracelular
que culmina com a ativação do macrófago, a transcrição de inúmeros genes
envolvidos na resposta imune e inflamatória e a síntese de compostos que
auxiliam na eliminação do patógeno (Takeda, Kaisho et al. 2003).
Todos os TLRs, com exceção do TLR3, efetuam sua sinalização via a
molécula adaptadora MyD88, levando à ativação das vias NF-κB (nuclear
factor kappa B) e MAP quinase (MAPK - mitogen-activated protein). Essas
vias regulam genes da resposta imune, com a produção de citocinas e
quimiocinas, que modulam a imunidade inata e adaptativa (Shi, Kokoeva et
al. 2006).
3
1.2. Receptor tipo Toll 4 e vias de sinalização
A molécula de TLR4 transduz a sinalização intracitoplasmática
induzida por LPS (Chow, Young et al. 1999), que é uma endotoxina,
componente estrutural encontrado na membrana de bactérias Gram-
negativas, conhecida justamente por induzir inflamação sistêmica. É
constituída por 3 partes: o lipídeo A (o principal padrão molecular
reconhecido pelo receptor), oligossacarideos centrais e cadeias laterais (Lu,
Yeh et al. 2008).
O estímulo por LPS em células de mamíferos ocorre através de uma
série de interações entre diversas proteínas, que incluem LPB, a proteína
ligante de LPS (lipopolysaccharide binding protein), a proteína CD14 (cluster
of differentiation 14) que pode estar sobre a forma solúvel na circulação ou
ancorada à membrana celular (sCD14 e mCD14, respectivamente) e ainda a
proteína mielóide diferenciadora 2 (MD2), que também pode ser encontrada
nas duas formas. As proteínas LBP, MD2 e sCD14 atuam como proteínas
auxiliares, sendo responsáveis por transferir LPS para o receptor TLR4 ou
para o complexo formado entre o receptor TLR4 e a proteína MD2 (Shimazu,
Akashi et al. 1999; Akira and Takeda 2004). Esse complexo é considerado
como a principal forma de reconhecimento do LPS.
A cascata de sinalização do receptor TLR4 é complexa, tendo duas
vias principais (Figura 1). O tipo de sinalização depende do uso seletivo de
diferentes combinações de moléculas adaptadoras e transdutoras de sinal.
Mais especificamente, na via conhecida como MyD88-dependente, o
domínio TIR (Toll/ Interleukin-1 receptor) intracelular, comum a quase todos
os TLR, se associa à molécula adaptadora MyD88 (Myeloid differentiation
primary response gene 88) e numa sinalização análoga a do próprio receptor
de IL1, leva à ativação mais precoce denominada de "early phase" (Kawai,
Adachi et al. 1999; Palsson-McDermott and O'Neill 2004). A proteína MyD88
leva a fosforilação de resíduos de serina/treonina da quinase IRAK4
(Interleukin-1 receptor-associated kinase-4). Após sua ativação, IRAK4 é
4
responsável pelo recrutamento, ativação e degradação do IRAK1
(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1). Essa interação entre MyD88 e
IRAK permite a ligação da molécula TRAF6 (TNF receptor-associated factor
6) ao complexo. As proteínas IRAK1, IRAK4 e TRAF6 são importantes
pontos de regulação desta via. A ligação de TRAF6, por sua vez, ativa TAK1
(TGFβ activated kinase 1) que forma um complexo com TAB1 (TAK1 binding
protein 1), ativando as IKK (IκB kinase) e a cascata das MAPK. IKKα, IKKβ e
IKKγ formam um complexo capaz de fosforilar as proteínas IκB (inhibitor of κ
light chain gene enhancer in B cells). Essa fosforilação leva à liberação das
proteínas IκB do complexo proteico e a sua degradação pelo sistema
proteassomal, com a subsequente translocação do fator de transcrição NF-
κB para o núcleo, onde controla a expressão de centenas de genes de
resposta inflamatória. A sinalização na via das MAPK ocorre através da
transcrição e ativação das proteínas heterodiméricas p38 e JNK (JUN N-
terminal kinase), formando o complexo AP-1 (activator protein 1), que
também tem um papel fundamental na indução da expressão de citocinas
pró-inflamatórias. Esses fatores de transcrição, NF-κB e AP-1, controlam e
expressão de uma série de proteínas importantes para a imunidade inata e
adaptativa, levando à ampliação da resposta imune. As principais são as
citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α (Tumor necrosis factor α), IL-6 e IL-
12 e as quimiocinas MIP1 (macrophage inflammatory proteins) α e β, e IL-8
(Yamamoto, Sato et al. 2003).
A via MyD88-independente (ou TRIF-dependente) se vale das
moléculas adaptadoras TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing
interferon-β) e TRAM (TRIF-related adaptor molecule), que compartilham
com as demais moléculas adaptadoras, o domínio Toll/receptor de
Interleucina 1 (TIR). TRIF recruta TRAF3 (TNF receptor-associated factor 3)
que se associa com TBK1 (TANK binding kinase 1) e IKKε, responsáveis
pela dimerização, translocação e ativação dos fatores IRF3 (Interferon
regulatory factor 3) e IRF7 (Interferon regulatory factor 7). Nesta via ocorre
também uma sinalização tardia ("late phase") através da interação entre
TRIF e TRAF6, constituindo um elo de ligação entre as vias dependentes de
5
MyD88 e de TRIF, que também ativa NF-κB. Além do mais, IRF7 e NF-κB,
juntos, levam à síntese dos interferons do tipo I, α e β, que são citocinas
envolvidas na resposta anti-viral e anti-bacteriana. IRF3, por sua vez induz a
expressão de moléculas co-estimuladores envolvidas na resposta imune
celular (Lu, Yeh et al. 2008).
Figura 1. Esquema das vias de transdução de sinal de TLR4. Modificada do site www.invitrogen.com. Data de acesso: 20 de janeiro de 2011.
6
1.3. TLR4 em células não imunes
Já há na literatura estudos que mostram haver expressão de TLR em
células não-imunes de diversos tecidos. Em modelo experimental murino, a
mutação do gene de TLR4 previne a obesidade e a resistência à insulina
induzida por dieta com alto índice de gordura (Tsukumo, Carvalho-Filho et al.
2007). Também já foi demonstrada a expressão de TLR4 em células
endoteliais (Hijiya, Miyake et al. 2002; Erridge, Burdess et al. 2008),
tireócitos (Nicola, Velez et al. 2009), células mesangiais (Wolf, Bohlender et
al. 2006), adipócitos (Vitseva, Tanriverdi et al. 2008) e células endometriais
(Hirata, Osuga et al. 2005). Em todos os casos, a expressão extraordinária
de TLR4 em células não-imunes estava ligada à inflamação e doença.
1.4. Ilhotas de Langerhans e células β pancreáticas
Ilhotas de Langerhans são pequenas estruturas fortemente irrigadas,
responsáveis pela função endócrina do pâncreas. Produzem hormônios que
agem, primordialmente, como importantes reguladores no metabolismo de
glicose. A ilhota é composta de quatro tipos celulares principais: células α,
células β, células δ e células PP.
As células α sintetizam um hormônio que tem efeito antagônico ao da
insulina, o glucagon. Sua função é induzir a liberação de glicose pelo fígado
e de ácidos graxos pelo tecido adiposo. Por sua vez, glicose e ácidos graxos
livres favorecem a liberação de insulina e inibem a liberação de glucagon
(Goodner, Walike et al. 1977; Grupe, Hultgren et al. 1995). Outros tipos
celulares encontrados nas ilhotas, porém em menores quantidades são as
células δ que produzem somatostatina, um forte inibidor de insulina e
glucagon e as células PP que produzem polipeptídeos pancreáticos, cuja
7
função é regular a secreção pancreática após as refeições (Lonovics, Devitt
et al. 1981).
O tipo celular predominante nas ilhotas é o das células β, que
constituem cerca de 60% das ilhotas humanas. As células β têm como papel
principal produzir e secretar insulina, um hormônio que controla os níveis de
glicose no sangue. A insulina é crucial em diversos processos metabólicos:
promove a absorção e o metabolismo de glicose, regula a liberação de
glicose pelo fígado, auxilia na síntese de proteínas e no armazenamento de
lipídios. A destruição ou a incapacidade das células β de produzir
quantidades suficientes de insulina para controlar os níveis de glicose no
sangue são as causas principais, respectivamente, do diabetes mellitus tipo
1 e tipo 2 em estágios mais avançados.
As células β são células especialmente suscetíveis a uma variedade
de estímulos, entre outros motivos, devido à sua função de pronta resposta a
variações da glicemia (Ramiya, Maraist et al. 2000). Há uma vasta literatura
avaliando o comportamento das células β sob estímulos inflamatórios e
imunológicos, que visam uma melhor compreensão dos mecanismos que
levam ao desencadeamento do diabetes (Ling, Van de Casteele et al. 2000;
Gysemans, Pavlovic et al. 2001). Em modelo humano e murino, foi mostrado
que na vigência de um estímulo inflamatório induzido por IL-1β e IFN-γ,
ocorre a inibição da secreção de insulina em resposta a glicose e morte
celular por apoptose (Arnush, Heitmeier et al. 1998; Maedler, Sergeev et al.
2002; Thomas, Darwiche et al. 2002).Também há na literatura evidências da
expressão de TLR4 em células β pancreáticas. Estudo mostrou a expressão
de CD14, MD2, TLR4 e TLR2 em ilhotas pancreáticas e em células β
transformadas, tanto de ratos como de humanos (Vives-Pi, Somoza et al.
2003). Em modelo alogeneico de transplante (Goldberg, Parolini et al. 2007),
onde ilhotas oriundas de camundongos deficientes em TLR4 foram
transplantadas em camundongos normais (modelo de deficiência de TLR4
apenas nas células das ilhotas), os camundongos apresentaram um longo
período de sobrevida do enxerto (>100 dias). Por outro lado, ilhotas normais
foram prontamente rejeitadas após o transplante, indicando haver um papel
8
funcional importante para esse receptor na rejeição do órgão implantado.
No entanto, vários estudos feitos com ilhotas atribuiram suas observações
às células imunes infiltrantes que migram para este tecido em um cenário de
autoimunidade e inflamação locais sem identificar claramente as células que
expressavam TLR4. Assim, foi verificado que, além de TLR4, células β
humanas e de camundongos expressam TLR2, 3 e 9, porém pouco se sabe
como estas moléculas participam na fisiologia do pâncreas e em doenças
como o diabetes (Vives-Pi, Somoza et al. 2003; Wen, Peng et al. 2004).
1.5. Diabetes Mellitus
Diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune que
resulta na destruição das células β causada por células do sistema imune,
levando à hiperglicemia e à dependência de insulina exógena. As primeiras
células a invadirem as ilhotas de Langerhans são as APCs (células
apresentadoras de antígenos), como monócitos e macrófagos, seguidos por
células T, causando insulite. A insulite é caracterizada pelo aumento da
expressão de mediadores inflamatórios, como interleucina (IL)-1β, TNFα e
interferon- (IFN-). No DM1, as citocinas contribuem para a destruição, por
apoptose, das células β através da ativação da via NF-κB (Osterbye, Funda
et al. 2010).
Foi demonstrado que a combinação das três citocinas IL-1β, TNFα e
IFN- induzem a expressão de FAS (receptor de morte por apoptose) na
superfície das células β, independentemente da susceptibilidade ao
diabetes, aumentando sua vulnerabilidade à destruição autoimune (Wachlin,
Augstein et al. 2003). Porém, embora estas citocinas sejam tóxicas para as
células β, estas também são capazes de produzir e secretar IL-1β e IL-6, o
que contribui para a progressão da doença (Campbell, Cutri et al. 1989).
9
Esses dados sugerem que pode haver envolvimento dos TLRs no DM1, já
que essas são citocinas produzidas durante a ativação destes receptores.
Já o Diabetes mellitus do tipo 2 (DM2) é uma doença metabólica e
inflamatória, caracterizada pela tolerância reduzida à glicose, hiperglicemia,
dislipidemia e resistência à insulina, aumento dos níveis de citocinas
inflamatórias, disfunção e perda progressiva da massa das células β. No
DM2, a inflamação em tecido adiposo e a perda progressiva das células β
são componentes da fisiopatologia da doença e poderiam incluir TLR3 e
TLR4 como vias adicionais de estímulo (Hutton, Soukhatcheva et al. 2010).
Conhecidos por mediar doenças inflamatórias crônicas, os TLRs
presentes em células de resposta imune já foram implicados na
etiopatogenia da obesidade e do diabetes. Foi demonstrado o aumento da
expressão de TLR4 por monócitos expostos à hiperglicemia (Dasu, Devaraj
et al. 2008). TLR4 tem sua expressão aumentada no tecido adiposo, em
ambientes com alta concentração de glicose e ácidos graxos livres, e pode
induzir o aumento da sinalização intracelular pró-inflamatória relacionada
com o aumento da resistência periférica à insulina (Davis, Gabler et al.
2008). Vale salientar que camundongos nocauteados para TLR4 ficam
protegidos da obesidade induzida por dieta e do aumento de resistência à
insulina (Shi, Kokoeva et al. 2006). Baseado em dados da literatura, que
indicam que níveis elevados de ácidos graxos livres circulantes levam à
disfunção das células β, um estudo foi feito para testar se as lipoproteínas
são capazes de modular a função e sobrevida das células β. Resultados
deste estudo demonstraram que lipoproteínas de baixa densidade reduziram
os níveis de RNAm da insulina e a proliferação das células β e tiveram
efeitos pró-apoptóticos (Boden 1997).
Há na literatura estudos que demonstram que a hiperglicemia leva as
células β à morte por apoptose. Em modelo animal de DM2 em Psammomys
obesus (rato-de areia ou gerbil), a hiperglicemia induz a morte de células β,
com redução da capacidade de proliferação, o que contribui para deficiência
de insulina e deterioração da homeostase da glicose (Donath, Gross et al.
1999).
10
Em resumo, o TLR4 tem um papel importante na inflamação e na
imunidade, e há expressão desse receptor na maioria dos tecidos do corpo,
incluindo tecidos sensíveis à insulina. Por ser ativado por LPS e ácidos
graxos saturados (Tsukumo, Carvalho-Filho et al. 2007), que são indutores
de resistência à insulina, TLR4 pode ser um candidato em comum na
interação entre sinais inflamatórios e metabólicos.
1.6. Resultados anteriores
Um tratamento promissor para pacientes com DM1 e DM2 em estágio
avançado, é o transplante de ilhotas. Para esse fim, pâncreas de doadores
de órgãos em morte encefálica são selecionados e as ilhotas, que compõem
de 1-2% do total do tecido pancreático, são isoladas e purificadas em salas
biolimpas para posterior infusão na veia porta dos pacientes (Linetsky,
Bottino et al. 1997). Mesmo com a melhora acentuada nas ultimas décadas,
o procedimento completo para obtenção destas ilhotas é longo e nem
sempre fornece ilhotas em número e qualidade suficientes para um implante
de sucesso. Além disso, há dificuldades inerentes ao processo de separação
das ilhotas do tecido acinar que as envolvem, o que contribui
significativamente para a baixa recuperação das ilhotas (Bertuzzi and Ricordi
2007). Neste processo, as ilhotas são submetidas a condições de estresse
que podem levá-las a expressar justamente as moléculas sinalizadoras de
perigo, características dos processos autoimunes, facilmente induzidas pelo
ambiente inflamatório e pela conhecida suscetibilidade das células a esse
tipo de estímulo. Assim, são eventos comuns, nas ilhotas resultantes do
processo de isolamento, certa porcentagem de morte celular e perda do
conteúdo de insulina das células .
Em trabalho recentemente realizado pelo nosso grupo (Garay-
Malpartida, Mourao et al. 2011), foram analisadas ilhotas pancreáticas
11
humanas isoladas a partir de 12 pâncreas obtidos de doadores falecidos. Foi
avaliada a expressão de TLRs e de vários fatores ligados ao estresse por
PCR em tempo real. A expressão (RNA mensageiro) de TLR1, TLR2, TLR3
e TLR4, estava presente em praticamente todas as amostras,
independentemente do número de ilhotas obtidas. Ao incubar as células
humanas, isoladas após tratamento das ilhotas com Accutase®, com LPS,
observou-se aumento dose-dependente do RNA mensageiro de TLR4 e de
CD14, mas diminuição da produção de RNA mensageiro para insulina
(Figura 2), além de queda da viabilidade das células β (Figura 3).
Figura 2. Expressão de TLR4 e CD14 e secreção de insulina induzida por LPS em cultura primária de células β humanas. Resultado de PCR em Tempo-Real, mostrando o aumento dose-dependente da expressão de (A) TLR4 e (B) CD14 em cultura primária de células β humanas tratadas com 0, 5 e 50ng/mL LPS por 48h. (C) Diminuição da expressão do RNA mensageiro de insulina após tratamento com 50ng/mL LPS.
12
Figura 3. Viabilidade de células β humanas após tratamento com LPS.
Resultado de citometria de fluxo, mostrando a diminuição da viabilidade celular em cultura
primária de células β humanas tratadas com 50ng/mL LPS por 48h, através da marcação
por TMRE.
Neste mesmo estudo, devido à dificuldade em se obter ilhotas
humanas, também foram testadas células MIN6 originárias de insulinoma de
camundongo. Verificou-se que a mesma expressão de TLR4 está presente e
que estas células são responsivas à ação do LPS, inibindo a transcrição do
gene de insulina e acarretando queda da viabilidade celular. De fato, já havia
sido demonstrada, anteriormente, a semelhança funcional entre células
humanas e a linhagem murina MIN6 (Ishihara, Asano et al. 1993). Assim,
tornou-se possível estudar, em maior detalhe, as vias de ativação de TLR4 e
suas consequências para a função e viabilidade celular nesta linhagem
murina, usando-a como modelo de estudo da célula β pancreática. Este é o
objeto de estudo desta dissertação de Mestrado.
13
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar a função biológica do TLR4 em células β pancreáticas de
camundongo, verificando quais as vias de sinalização ativadas pelo seu
ligante LPS e a sua relação com a homeostase de insulina e morte celular.
2.2. Objetivos específicos
Analisar as vias de transdução de sinal do TLR4 ativado por LPS,
em células de insulinoma de camundongo MIN6;
Analisar produção intracelular e secreção de insulina;
Avaliar viabilidade celular.
14
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O projeto foi realizado com a aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein e da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (anexos).
3.1. Cultura celular
3.1.1. Células MIN6 (linhagem de células β de insulinoma de camundongo)
As células foram semeadas em placas de cultura contendo meio
RPMI 1640 (Invitrogen, San Diego, CA) com 11,2mM de glicose,
suplementado com 10% de soro bovino fetal - SBF (Invitrogen, San Diego,
CA), 1% de Hepes 1M (Invitrogen, San Diego, CA) e 0,01% de antibiótico e
antimicótico (10.000 unidades de penicilina, 10.000µg de estreptomicina e
25µg de anfotericina B; Invitrogen, San Diego, CA). As culturas foram
mantidas em estufa a 37°C e com 5% CO2 em incubadora umidificada.
3.1.2. Células J774-A1 (linhagem de macrófagos de camundongo)
As células foram semeadas em placas de cultura contendo meio
DMEM (Invitrogen, San Diego, CA), suplementado com 10% de SBF
(Invitrogen, San Diego, CA) e 1% de antibiótico e antimicótico (10.000
unidades de penicilina, 10.000µg de estreptomicina e 25µg anfotericina B;
Invitrogen, San Diego, CA). As culturas foram mantidas em estufa a 37°C e
com 5% CO2 em incubadora umidificada.
15
3.2. Preparação do meio RPMI com diferentes concentrações de
glicose
Para cada 50 mL de meio RPMI 1640 sem glicose (Invitrogen, San
Diego, CA) foram adicionadas as seguintes quantidades de glicose: 25,22
mg de glicose (2,8 mM glicose - correspondente à hipoglicemia,
concentração de 50 mg/ dL), 50,45 mg de glicose (5,6 mM glicose -
correspondente à normoglicemia, concentração de 100 mg/ dL) e 100,9 mg
de glicose (11,2 mM glicose - correspondente à hiperglicemia, concentração
de 200 mg/ dL). Após a adição da glicose, o meio foi filtrado, o pH ajustado
para 7,2 e suplementado com SBF (Invitrogen, San Diego, CA) de acordo
com a necessidade de cada experimento.
3.3. Tratamento com LPS
Foram semeadas 104 células por poço, em placas com 6 poços. Após
48h, as células MIN6 foram incubadas com meio RPMI 1640 com diferentes
concentrações de glicose suplementado com 10% de SBF por 4 dias. Após
esse período, as células foram lavadas com PBS e o meio foi substituído por
RPMI 1640 com as diferentes concentrações de glicose e com 0,5% de SBF,
na ausência ou na presença de LPS (50 ng/mL; InvivoGen, San Diego, CA)
por mais 48 horas. Como controle positivo para todos os experimentos que
envolvem sinalização via TLR4, macrófagos J774-A1 de camundongo foram
utilizados.
16
3.4. Caracterização funcional da linhagem celular MIN6
3.4.1. Produção intracelular de insulina
Para avaliar a produção intracelular de insulina foi utilizada a técnica
de imunofluorescência através da marcação com Newport Green (NG;
Invitrogen, San Diego, CA), um marcador que tem afinidade por zinco e
marca grânulos de insulina. Foram semeadas 5x105 células por poço, em
meio RPMI 1640 (11,2mM glicose) suplementado com 10% SBF sobre
lamínulas. As células foram incubadas e fixadas com paraformaldeido 4%
por 15 minutos, foram lavadas novamente com PBS. Posteriormente, foram
incubadas por 15 minutos a 37°C com Newport Green 1 μM (Invitrogen, San
Diego, CA), após esse período foram lavadas com PBS seguida da solução
de montagem Vectashield (Labvision Corporation, Fremont, CA) contendo o
corante nuclear DAPI e as lamínulas foram transferidas para lâminas para
microscopia (Olympus, Lake Success, NY). Através de citometria de fluxo,
100% das células foram positivas para NG (Figura 4B), ou seja, todas as
células da linhagem MIN6 são células β produtoras de insulina.
Figura 4. Produção intracelular de insulina (A) 5x10
5 células foram semeadas sobre
lamínulas e fixadas com paraformaldeido 4%. As células foram incubadas por 15 minutos a 37°C com Newport Green 1μM insulina (verde) e DAPI - núcleo (azul). Aumento de 20X. (B) 5x10
5 células foram coletadas e marcadas com Newport Green por 15 minutos a 37°C e
17
posteriormente passadas no citômetro de fluxo. Células positivas para NG (linha pontilhada) e controle negativo (linha contínua). Experimento realizado em triplicata (n=3). Figura representativa de 3 experimentos.
3.4.2. Responsividade à glicose
Foram semeadas 104 células e cultivadas durante 4 dias com RPMI
1640, com adição de glicose nas concentrações 2,8 mM, 5,6 mM e 11,2 mM
de glicose. Após esse período o sobrenadante foi coletado e a dosagem de
insulina foi feita pelo método de ELISA (do inglês, Enzyme-Llinked
Immunosorbent Assay). Este resultado indicou que após a incubação com
diferentes níveis de glicose, as células MIN6 são responsivas a esta
variação, secretando menos insulina em condições de hipoglicemia e mais
insulina em condições de hiperglicemia (Figura 5).
Figura 5. Secreção de insulina. 104 células foram semeadas e cultivadas durante 4 dias
em condições de 2,8mM; 5,6mM e 11,2mM glicose. Após esse período o sobrenadante foi coletado para dosagem de insulina, através do método de ELISA. Experimento realizado em triplicata (n=3). Resultados representados por média ± EPM.
18
3.5. Dosagem de insulina
A insulina presente no sobrenadante das culturas de células MIN6 foi
quantificada pela técnica de ELISA (Shibayagi Co., Ltd., Gunma, JP) para
dosagem de insulina de camundongo, seguindo as instruções do fabricante.
A placa revestida com o anticorpo anti-insulina foi lavada 4 vezes com a
solução de lavagem 1X fornecida pelo kit. Em seguida, foram adicionados
100 μL do anticorpo anti-insulina conjugado com biotina e a placa agitada 3
vezes por 10 segundos. Foram adicionados 10 μL de amostra ou de alíquota
de curva padrão por poço, incubados por 2 horas em temperatura ambiente,
no escuro, sob agitação. Foram feitas 4 lavagens utilizando a solução de
lavagem 1X e, em seguida, foram adicionados 100 μL da solução de
estreptavidina conjugada com HRP (horseradish peroxidase) e a placa foi
agitada 3 vezes por 10 segundos e incubada por 30 minutos em temperatura
ambiente, no escuro. Foram adicionados 100 μL da reação de parada e a
leitura da absorbância foi feita utilizando o comprimento de onda de 450 nm.
Os resultados foram normalizados pela quantidade de células em cada poço.
3.6. Extração de RNA total
O RNA total das células MIN6 e J774-A1 foi extraído através do kit
RNAspin (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK), seguindo as instruções do
fabricante. O meio de cultura foi aspirado e posteriormente as células foram
lavadas duas vezes com PBS 1X. Adicionou-se 350 μL de solução de lise e
3,5 μL de β-mercaptoetanol. Agitou-se vigorosamente por 10 segundos no
vórtex, a fim de obter um lisado homogêneo. O lisado foi então centrifugado
a 11000xg por 1 minuto à temperatura ambiente. A fase aquosa foi
cuidadosamente transferida para um novo tubo e então foi adicionado 1x
volume recuperado após a centrifugação de etanol 70%, à temperatura
19
ambiente. Para cada amostra foi montada uma coluna em um tubo coletor.
Em seguida, 700 μL da mistura foram pipetados na coluna e centrifugados
30 segundos à 8000xg. O líquido foi descartado e o procedimento foi
repetido até que toda a mistura lisado/etanol fosse filtrada. Aplicou-se 350
μL de MDB à coluna e centrifugou-se por 1 minuto à 11000xg. Descartou-se
o líquido e as amostras foram incubadas por 15 minutos a temperatura
ambiente com 95 μL de solução preparada com 10 μL DNase 1 e 90 μL de
tampão DNase. Foram adicionados 200 μL de RA2 (solução de lavagem) e a
placa foi centrifugada 1 minuto à 11000xg. O sobrenadante foi descartado e
foram feitas duas lavagens com RA3 (solução de lavagem) de 600 μL e 250
μL e centrifugado 2 minutos à 11000xg. O último passo foi repetido e, após
descartar o líquido, centrifugou-se 1 minuto para remover resíduos líquidos
do filtro. A coluna foi transferida para um novo tubo coletor e a ela foram
adicionados 50 μL de água livre de RNases. Centrifugou-se 1 minuto à
11000xg para recuperar o RNA.
O RNA extraído foi avaliado quanto à sua qualidade e concentração
por leitura no espectrofotômetro NanoVue Spectrophotometer (GE
Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). A pureza das amostras foi determinada
pela razão entre os valores de absorbâncias em 260 nm e 280 nm. Somente
as amostras que apresentaram razões entre 1,7 e 2,0 foram utilizadas. As
amostras de RNA foram, também, submetidas à eletroforese em gel de
agarose, corado com brometo de etídio, para análise da integridade através
da visualização das duas bandas de RNA ribossômico 28S e 18S.
3.7. Síntese de cDNA
O cDNA foi preparado a partir de 1 μg de RNA total com o uso de 200
U da enzima transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen, San Diego,
CA) combinada com 50 μg de Oligo-dT (oligo-desoxitimidina; Invitrogen,
San Diego, CA), 10 mM de dNTP (desoxinucleotideos trifosfato ;Invitrogen,
20
San Diego, CA) em tampão concentrado específico e água, volume final de
20 μL. A síntese foi realizada no termociclador (Eppendorf Mastercycler
Gradient, Hamburg, DE) sob as condições de 5 min a 25°C, 50 minutos a
50°C e 15 min a 70°C.
3.8. PCR quantitativa (qRT-PCR)
Todas as reações de PCR em tempo real foram realizadas em
duplicata. Como matriz, foram utilizados 2 μL do cDNA sintetizado, 2 μL do
conjunto de “primers” específicos para cada gene (Tabela 1) na
concentração final de 400nM cada, 12,5 μL do reagente Syber Green e 8,5
μL de água DEPC (Ambion, Austin, TX), num volume final de 25 μL. As
reações foram realizadas pelo equipamento 7500 Real-Time PCR (Applied
Biosystems, Foster City, USA) nas seguintes condições: 95° C por 10
minutos, 40 ciclos com as seguintes etapas: desnaturação do DNA a 94°C
por 15 segundos, anelamento dos “primers” (temperatura determinada pelo
par de “primers” utilizado na reação) por 30 segundos e extensão a 72°C por
30 segundos, seguido de curva de dissociação. A especificidade do produto
gerado e detecção da presença de eventual contaminação foram
confirmadas por análise da curva de dissociação dos produtos, bem como
por eletroforese em gel de agarose convencional. O controle positivo para
esses experimentos foi o RNA obtido de macrófagos da linhagem J774-A1,
submetidos às mesmas condições experimentais.
3.8.1. Desenho dos “primers”
Sequências dos genes-alvo foram obtidas do Genbank e exportadas
para o programa Primer Express v 3.3 (Applied Biosystems, Foster City,
USA). Os conjuntos de “primers” foram desenhados seguindo os critérios
definidos pelo software.
21
Tabela 1. Sequências 5´ (forward; Fw) e 3´ (reverse; Rv) dos pares de “primers”,
sintetizados pela Life Technologies.
3.8.2. Análise dos resultados da PCR em tempo real
A análise dos resultados da PCR em tempo real foi semiquantitativa,
segundo o modelo matemático do método de ∆∆Ct (Livak and Schmittgen,
2002). O cálculo baseia-se na comparação dos valores de Ct (do inglês,
cycle threshold), expresso em unidades arbitrárias, entre dois grupos de
amostras no momento em que a PCR atinge a fase exponencial de
amplificação. Reações utilizando “primers” para o gene constitutivo HPRT
22
foram utilizadas para normalizar os resultados obtidos. De acordo com este
modelo, utiliza-se a seguinte fórmula:
fold-change = 2-ΔΔCt , sendo que:
ΔCt = Ct do gene-alvo - Ct do gene referência
ΔΔCt = ΔCt1–ΔCt2
ΔCt1 = amostra de interesse
ΔCt2 = amostra do grupo controle
3.9. Padronização e Otimização das reações de PCR em Tempo Real
Primeiramente realizamos testes com controles positivos e negativos
sem limitar a concentração de "primers". Em seguida, fizemos a titulação dos
"primers", buscando a concentração ideal que gerasse menor Ct, sem a
formação de dímeros.
Para avaliação da eficiência dos "primers", utilizamos como controle
positivo, cDNA de macrófagos J774-A1 para os genes da cascata de
sinalização do TLR4 (TLR4, MD2, MyD88, CD14, TRAM, TRIF, TAK1,
IRAK4, IRAK1, TRAF6 e IRF3), cDNA de MIN6 para os genes da insulina
(INS1 e INS2) e como controle endógeno da reação de PCR o gene HPRT
(gene constitutivo envolvido na via de salvamento de purinas, processo
bioquímico de reciclagem das bases nitrogenadas). Através da curva de
diluição (100%, 10%, 1% e 0,1%) das amostras, pudemos observar que os
valores de Slope (inclinação) e R2 (correlação) eram aproximadamente –3,33
e 0,99; respectivamente, demonstrando eficiência de praticamente 100% nas
reações de PCR em tempo real. Análise da curva de dissociação mostrou a
formação de um produto único e específico para todos os "primers",
conforme exemplificado na figura abaixo (Figura 6).
23
Figura 6. Curva Padrão e Curva de Dissociação dos "primers". A) HPRT e B) TLR4. Foi utilizado o Software 7500 v2.0.1 - Applied Biosystems. Todos os produtos da PCR tinham o tamanho esperado.
3.10. Identificação de proteínas fosforiladas
Após atingirem a confluência, as células MIN6 foram lavadas com
PBS e mantidas em RPMI com 0,5% de SBF por 24h. Em seguida, foi
adicionado RPMI contendo 11,2 mM glicose e 50 ng/mL de LPS e as células
foram incubadas nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60 minutos.
3.11. Extração de proteínas
Ao final do procedimento experimental, as placas foram lavadas com
PBS gelado, aspiradas completamente e congeladas por imersão em
nitrogênio líquido. Sobre a placa foi adicionado 250 μL de tampão de lise
celular - RIPA (do inglês, radioimmunoprecipitation assay buffer) com 1% de
coquetel de inibidores de proteases e fosfatases; Sigma-Aldrich, St. Louis,
24
MO) e as células foram então coletadas com auxílio de uma espátula. A
seguir, foram homogenizadas com seringas e agulha 21G. Após
centrifugação a 12.000 rpm / 4ºC por 10 min, o sobrenadante, contendo as
proteínas totais das células, foi separado e quantificado pelo kit BCA Protein
(Bio-Rad, Hercules, CA). Albumina bovina foi utilizada para a diluição da
curva-padrão.
3.12. Western Blot
A mesma quantidade de proteína (30 μg) foi aplicada em cada poço
do gel contendo SDS-poliacrilamida em tampão Tris-glicina (10%). A
primeira etapa da corrida ocorreu a 100V constantes até que as amostras
atingissem o grau de separação desejado. As proteínas do gel foram
eletroforeticamente transferidas para uma membrana de PVDF (poros de
0,45 μm) em tampão gelado de Tris-Glicina contendo 20% de metanol sob
agitação contínua durante 80 minutos a 275 mA constantes. A membrana foi
incubada em solução de bloqueio (tampão TBS contendo 0,05% de Tween-
20 e 3% de leite em pó desnatado) por 40 minutos à temperatura ambiente.
A seguir, a membrana foi incubada com os anticorpos primários: JNK
(1:1000, #9252; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e fosfo-JNK
(1:2000, #9255; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), p38 (1:5000,
MO800, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e fosfo-p38 (1:1000, P1491, Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO), NF-κB (1:1000, # 4882; Cell Signaling Technology,
Danvers, MA), IRF3 (1:1000, #4302; Cell Signaling Technology, Danvers,
MA) e IRF7 (1:1000, PRS3941; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), diluídos na
solução em leite ou BSA (seguindo as instruções do fabricante) por uma
noite a 4°C. Após 4 lavagens com TBST (tampão de solução salina com Tris
e Tween 20), as membranas foram incubadas com anticorpo secundário
conjugado com HRP anti-camundongo ou anti-coelho (1:2000; 7076s e
7074s; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), diluídos em 1% de leite
25
durante 1 hora. Após 4 lavagens com TBST, as membranas foram
incubadas com solução de revelação ECL Plus (GE Healthcare, Chalfont St.
Giles, UK) por 5 min e expostas em filmes de raio-X (GE Healthcare,
Chalfont St. Giles, UK) por variados períodos até que as bandas fossem
detectadas após a revelação.
Para controle da quantidade de proteína utilizada nas amostras, as
membranas foram submetidas ao procedimento de remoção dos anticorpos
ligados usando uma solução de SDS, β-mercaptoetanol e Tris-HCl 1M (pH
6,7) por 30 minutos a 50ºC com agitação ocasional. A seguir, após 2
lavagens com TBST, o protocolo de incubação foi repetido, agora com
anticorpo primário anti-β-actina (1:15.000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
3.13. Citometria de fluxo
3.13.1. Marcação com anti-CD284 (TLR4)/MD2 e anti-CD14
Como descrito no item 3.3, ao final do experimento, as células foram
dissociadas com tripsina e lavadas com PBS. As células (5x105) foram
lavadas duas vezes por 5 minutos com tampão de marcação (PBS 1X+
1%SBF+ 0,05% Azida) e posteriormente incubadas com os anticorpos anti-
CD284/MD2 conjugado com PE (1:100, 558294; BD Biosciences, San Jose,
CA) e anti-CD14 conjugado com PerCP-Cy5 (1:100, 560638; BD Bioscienes,
San Jose, CA) diluídos no tampão de marcação, por 30 minutos a 4°C no
escuro. Os resultados foram analisados pelo software FlowJo (TreeStar, San
Carlos, CA).
26
3.13.2. Marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo (PI)
Como descrito no item 3.3, ao final do experimento, as células foram
dissociadas com tripsina e lavadas com PBS. As células (5x105) foram
lavadas duas vezes por 5 minutos com tampão de marcação do kit (Anexina
V: FITC Kit I Detecção de apoptose, 556547; BD Biosciences, San Jose,
CA). Posteriormente, as células foram incubadas com anexina V e iodeto de
propídeo diluídos no tampão de marcação, por 15 minutos à temperatura
ambiente, no escuro, seguindo as instruções do fabricante. Os resultados
foram analisados pelo software FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA).
3.14. Análise estatística
Os dados de PCR em tempo real, citometria e ELISA foram expressos
como média ± EPM (erro padrão da média) e o teste ANOVA e o teste post-
hoc de Tukey foram aplicados. Cada experimento foi repetido três vezes, em
triplicata. Foi considerada uma diferença estatisticamente significante entre
os grupos avaliados, quando p<0,05. Para as análises foi utilizado o
programa de análise estatística SAS (SAS Institute, 2001).
27
4. RESULTADO
4.1. Células MIN6 expressam TLR4/MD2 e a molécula adaptadora CD14
Avaliamos a expressão de componentes do complexo de
reconhecimento do LPS por citometria de fluxo, utilizando anticorpos que
reconhecem TLR4 acoplado a MD2 e CD14. Confirmamos que as células
MIN6 expressam 50,69±0,98% TLR4/MD2 (Figura 7A) e 14,96±0,89% CD14
(Figura 7B) em condições de cultivo com alta concentração de glicose (RPMI
com 11,2mM glicose + 10%SBF).
Figura 7. Expressão de TLR4/MD2 e CD14 na superfície das células MIN6, cultivadas
por 4 dias em meio de cultura hiperglicêmico, analisadas por citometria de fluxo.
5x105 células foram incubadas por 30 minutos a 4°C no escuro com os anticorpos anti-
TLR4/MD2 anti-CD14 e analisadas por citometria de fluxo. (A) Células TLR4/MD2 positivas
(linha pontilhada) e controle negativo (linha contínua). (B) Células CD14 positivas (linha
pontilhada) e controle negativo (linha contínua). Experimento realizado em triplicata (n=3).
Figuras representativas de três experimentos independentes. Resultados representados por
média ± EPM.
28
4.2. Expressão de TLR4 em células MIN6 é induzida por LPS em
condições de hiperglicemia
Para investigar qual ou quais as vias de transdução de sinal do
receptor TLR4 que são ativadas por LPS e se diferentes condições de
glicemia interferem na expressão de TLR4, avaliamos a expressão de genes
envolvidos nas vias MyD88-dependente e TRIF-dependente em células
MIN6. Foram semeadas 104 células em placas de 6 poços, que foram
cultivadas em 3 concentrações diferentes de glicose (glicose 2,8 mM; 5,6
mM ou 11,2 mM) por 4 dias. Após esse período, as células foram incubadas
por 48h com 50ng/mL de LPS, ainda utilizando meio de cultura com as três
condições de glicose. Como controles foram utilizadas células MIN6 em
meio livre de LPS.
Os resultados mostraram haver apenas expressão de genes
envolvidos na via MyD88-dependente (TLR4, MyD88, IRAK4, IRAK1,
TRAF6) e ausência de expressão de genes da via TRIF-dependente (TRAM,
TRIF, TAK1, IRF3). Não houve também expressão do gene MD2.
Pudemos observar um aumento discreto, porém significativo da
expressão de TLR4 no grupo tratado com LPS, em condições de
hiperglicemia em relação ao controle (sem LPS) do mesmo grupo (Figura
8A). Em condições de hipoglicemia, os genes MyD88 e IRAK4 estavam
aumentados no grupo tratado com LPS (Figuras 8B e 8C). Já os genes
IRAK1 e TRAF6 apresentaram aumento significativo em dois grupos tratados
com LPS, em condições tanto de hipoglicemia como de hiperglicemia
(Figuras 8D e 8E).
Roedores possuem dois genes de insulina estruturalmente
semelhantes, onde INS1 é uma duplicação do gene ancestral INS2
(Roderigo-Milne, Hauge-Evans et al. 2002). Nas mesmas condições, ambos
os genes da insulina, INS1 e INS2, modularam pouco sua expressão, uma
resposta condizente com a origem da linhagem, isto é, a de um insulinoma.
No entanto, a presença de LPS induziu um aumento significativo de INS1 e
29
INS2, em condições de hipoglicemia, indicando um efeito positivo, porém
modesto, do LPS sobre a produção de insulina (Figuras 8F e 8G).
Figura 8. Expressão de TLR4, MyD88, IRAK4, IRAK1, TRAF6, INS1 e INS2, após incubação com LPS e diferentes concentrações de glicose nas células MIN6. Foram incubadas 10
4 células por 4 dias com 2,8mM; 5,6mM e 11,2 mM de glicose. Após esse
período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi
30
adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h as células foram lisadas, RNA total extraído e foi feito PCR em Tempo Real. Expressão gênica de (A) TLR4, (B) MyD88, (C) IRAK4, (D) IRAK1, (E) TRAF6, (F) INS1 e (G) INS2. Expressão normalizada pelo gene HPRT e expressos como número de vezes em relação ao controle - células não tratadas (fold-change). Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM. Diferenças estatísticas significantes estão indicadas por (*) p<0,05.
4.3. Via MyD88-dependente é ativada por LPS em células MIN6
Experimentos para confirmar a ativação da via MyD88-dependente
foram feitos, avaliando a fosforilação de proteínas em pontos-chave das vias
de sinalização MyD88-dependente e TRIF-dependente. As células foram
cultivadas em RPMI (11,2mM de glicose) com 0,5% SBF por 24h. Após esse
período, as células foram incubadas com RPMI sem SBF e LPS (50 ng/mL)
por 0, 5, 15, 30 e 60 minutos e a fosforilação de proteínas das vias foi
analisada por Western Blot.
O tratamento com LPS resultou no aumento da fosforilação da
proteína p38 e JNK nos tempos 5 e 15 minutos (Figuras 9A e 9B), tendo um
pico de fosforilação em 5 minutos. Nas células MIN6 tratadas com LPS
também pudemos observar o aumento da proteína NF-κB em sua forma
ativa (ou seja, desacoplada do seu complexo inibidor), com pico nos tempos
30 e 60 minutos (Figura 9B).
Por outro lado, as proteínas IRF3 e IRF7 não foram detectadas em
Western blot, confirmando os dados obtidos por PCR em Tempo Real. As
proteínas IRF3 e IRF7 estavam presentes apenas no controle positivo, ou
seja, macrófagos tratados com LPS (50 ng/mL) por 5 minutos (Figura 9D e
E).
Em resumo, os dados mostram que apenas a via MyD88-dependente
está ativa em células MIN6 e não há expressão de genes, nem de proteínas
da envolvidas na via TRIF-dependente.
31
Figura 9. Ativação das proteínas p38, JNK e NF-κB por LPS em células MIN6. As
células foram cultivadas por 24h com RPMI (glicose 11,2 mM) suplementado com 0,5% SBF
e após esse período foram incubadas com 50 ng/mL de LPS nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60
minutos. (A) p38 e fosfo-p38 (B) NF-κB e β-actina, (C) JNK1 e 2 e fosfo-JNK1 e 2, (D) IRF3
e β-actina e (E) IRF7 e β-actina. Expressão normalizada pelo controle endógeno β-actina.
Experimento realizado em duplicata (n=2).
32
4.4. Tratamento com LPS causa aumento na secreção de insulina em
células MIN6
Para investigar se a ativação de TLR4 interfere na homeostase de
insulina das células β, avaliamos o conteúdo intracelular e a secreção de
insulina. Foram semeadas 104 células em placas de 6 poços, que foram
cultivadas em 3 concentrações diferentes de glicose (glicose 2,8 mM, 5,6
mM ou 11,2 mM) por 4 dias. Após esse período, as células foram incubadas
por 48h com 50 ng/mL de LPS, ainda utilizando meio de cultura com as três
condições de glicose. Como controles foram utilizados células MIN6 em
meio livre de LPS. Após o tratamento em condições de hipo, normo e
hiperglicemia, na presença de LPS, o sobrenadante foi coletado. As células
foram incubadas com NG por 15 minutos a 37°C, no escuro, e preparadas
para citometria de fluxo. Através da marcação com NG, que marca grânulos
de insulina, verificamos não haver diferença no conteúdo intracelular no
grupo tratado com LPS (Figuras 10A e 10B). Porém, através de dosagem de
insulina no sobrenadante, observamos aumento significativo (p<0,05) da
secreção de insulina nos grupos tratados com LPS em relação aos grupos
controle, independentemente do nível de glicose no meio (Figura 10C).
33
Figura 10. Conteúdo intracelular e secreção de insulina em células MIN6 tratadas com LPS. MIN6 foram incubadas por 4 dias com 2,8mM; 5,6mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células foram coletadas. (A) Marcação com NG, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (B) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do Newport Green. (C) No mesmo experimento, o sobrenadante foi coletado e a insulina secretada foi dosada por ELISA. Os dados foram normalizados pelo número de células por amostra. Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM. Diferenças estatísticas significantes estão indicadas por (*) p<0,05.
34
4.5. LPS não altera a expressão das moléculas de superfície
TLR4/MD2 e CD14 nas células MIN6.
Foram semeadas 104 células em placas de 6 poços, que foram
cultivadas em 3 concentrações diferentes de glicose (glicose 2,8 mM, 5,6
mM ou 11,2 mM) por 4 dias. Após esse período, as células foram incubadas
por 48h com 50 ng/mL de LPS, ainda utilizando meio de cultura com as três
condições de glicose. Como controles foram utilizados células MIN6 em
meio livre de LPS. As células foram incubadas com os anticorpos por 30
minutos a 4°C, no escuro. Observamos que o tratamento com LPS não
modifica a expressão de TLR4/MD2 (Figuras 11A e 11B) e CD14 (Figuras
11C e11D) na superfície da membrana das células MIN6.
35
Figura 11. Expressão de TLR4/MD2 e CD14 em células MIN6 tratadas com LPS. MIN6 foram incubadas por 4 dias com 2,8 mM; 5,6 mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50 ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células foram coletadas. (A) Marcação com anticorpo anti-TLR4/MD2, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (B) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do anticorpo TLR4/MD2. (C) Marcação com anticorpo anti-CD14, controle negativo (linha contínua), células controle sem LPS (linha pontilhada) e células tratadas com LPS (linha tracejada). Figuras representativas de três experimentos independentes. (D) Média de intensidade de fluorescência (MIF) do anticorpo CD14. Experimentos realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM.
4.6. Tratamento com LPS não induz morte celular nas células MIN6
As células são responsivas a citocinas pró-inflamatórias e quando a
via do NF-kB é ativada, há a transcrição de genes que, ao final, acarretam
disfunção das próprias células e sua morte celular (Cardozo, Heimberg et
al. 2001). Por este motivo, fomos investigar se o tratamento com LPS causa
morte em células MIN6. Para avaliar morte celular, foram semeadas 104
células em placas de 6 poços, que foram cultivadas em 3 concentrações
diferentes de glicose (glicose 2,8 mM, 5,6 mM ou 11,2 mM) por 4 dias. Após
esse período, as células foram incubadas por 48h com 50 ng/mL de LPS,
ainda utilizando meio de cultura com as três condições de glicose. Como
controles foram utilizados células MIN6 em meio livre de LPS. As células
foram incubadas com anexina V e iodeto de propídeo (PI) durante 15
minutos a temperatura ambiente. Pudemos observar, através das
36
marcações, que o LPS, na concentração testada, não induziu morte nas
células MIN6 (Figura 12).
Figura 12. Avaliação de morte celular em células MIN6 tratadas com LPS. MIN6 foram
incubadas por 4 dias com 2,8 mM; 5,6 mM e 11,2 mM de glicose. Após esse período, foram
incubadas em meio com as mesmas concentrações de glicose e foi adicionado LPS (50
ng/mL) e para controle as células foram mantidas em meio sem LPS. Após 48h, as células
foram coletadas e marcadas com anexina V e PI. (A) Porcentagem de células positivas para
anexina V (apoptose), (B) porcentagem de células positivas para anexina V e PI (apoptose
tardia e necrose), (C) porcentagem de células positivas para PI (necrose). Experimentos
realizados em triplicada (n=3). Resultados representados por média ± EPM.
37
5. DISCUSSÃO
O presente estudo investiga a relação entre a sinalização via TLR4 e
variações na glicemia e na homeostase de insulina, na linhagem celular
murina MIN6. Avaliamos a expressão de genes e proteínas das vias de
sinalização de TLR4 e suas consequências para a função e viabilidade
celular. Mostramos que o LPS é capaz de induzir o aumento da expressão
do RNAm de TLR4 em células β murinas, ativando apenas a via MyD88-
dependente e causando alterações na secreção de insulina. Além disso,
observamos a ausência da via TRIF-dependente. A identificação da via de
sinalização envolvida na ativação de TLR4 em células β pancreáticas é um
passo importante para a compreensão da ação desse receptor em
condições fisiológicas e patológicas.
Nossos resultados mostram que o LPS foi capaz de induzir a ativação
de TLR4 em células β murinas, inclusive causando o aumento da expressão
de TLR4 e dos genes MyD88, IRAK1, IRAK4 e TRAF6, associados à via
MyD88-dependente. Por outro lado, não houve a expressão de genes
envolvidos na transdução de sinal da via TRIF-dependente, via responsável
pela produção de fatores envolvidos na resposta anti-viral e anti-bacteriana e
na indução de moléculas co-estimulatórias, presentes em células
apresentadoras de antígeno. Esta ausência foi confirmada por Western blot.
Já a ativação da via MyD88-dependente foi confirmada pela detecção de
fosforilação das proteínas p38, JNK e do aumento da forma ativada do fator
de transcrição NF-κB, nos grupos tratados com LPS. Portanto, apenas a via
MyD88-dependente está ativa em células MIN6. No entanto, estes
experimentos deverão ser repetidos utilizando-se células β derivadas de
ilhotas frescas, para verificar se a ausência da via TRIF-dependente
corresponde a células β, em geral. Além disso, cabe ainda verificar se, na
presença de uma infecção viral ou bacteriana, há a expressão de novo da
via de produção de interferons do tipo 1.
38
No mesmo experimento, não houve expressão do RNAm da molécula
acessória MD2, necessária para formação do complexo
TLR4/MD2/CD14/LPS considerado como a principal forma de transdução de
sinal desencadeada pelo LPS. Há na literatura um estudo mostrando que
TLR4 pode ser expresso na membrana celular independentemente de sua
ligação com MD2 (Visintin, Halmen et al. 2006). Porém, a maioria dos
trabalhos, já descritos na literatura, mostra que TLR4 só responde ao LPS
quando o complexo com a proteína MD2 está formado (Shimazu, Akashi et
al. 1999; Akira and Takeda 2004). De fato, utilizamos, na citometria de fluxo,
um anticorpo que detecta TLR4 apenas quando associado a MD2 e, como
obtivemos uma resposta funcional ao LPS, acreditamos que o MD2 esteja
presente em quantidade suficiente para gerar a resposta. Também tivemos
problema com a detecção de CD14. Realizamos vários testes com “primers”
para CD14. Foram desenhados três pares de “primers” em regiões
diferentes do gene que, quando testados no controle positivo (macrófagos
J774) e nas células MIN6, geraram picos duplos e inespecíficos. Buscando
dados da literatura, observamos que não há estudos que fazem análise da
expressão de CD14 por PCR em tempo real, em células murinas. Então,
optamos por avaliar a presença de MD2 e CD14 em nossas amostras através
de citometria de fluxo. Porém, o tempo de 48h utilizado no experimento não
foi suficiente para observarmos o aumento dessas moléculas na superfície
das células β.
Buscando situações comparáveis ao que acontece no ser humano,
realizamos experimentos utilizando diferentes concentrações de glicose.
Pudemos observar que independentemente do nível de glicose no meio, o
tratamento com LPS aumenta a expressão de TLR4, mas esta foi mais
evidente quando as células foram cultivadas em meio hiperglicêmico,
indicando uma ligação entre a ativação de vias induzida por glicose e a
ativação do TLR4. O aumento da expressão de TLR4 frente à hiperglicemia
já foi descrito em monócitos, que constitutivamente expressam altas
quantidades desse receptor (Dasu, Devaraj et al. 2008). Através da análise
da expressão gênica das moléculas envolvidas na via MyD88-dependente
39
observamos, o aumento significativo dos genes MyD88 e IRAK4 apenas no
grupo em condições de hipoglicemia e tratados com LPS. Já os genes
IRAK1 e TRAF6 apresentaram aumento significativo em dois grupos tratados
com LPS, em condições de hipoglicemia e hiperglicemia. Estes resultados
indicam que, em condições anormais de glicemia (hipo ou hiperglicemia),
associadas ao estímulo inflamatório por LPS, ocorre aumento da transcrição
de genes envolvidos na via MyD88-dependente e que, em concentrações
altas de glicose (11,2 mM), há ativação das proteínas p38, JNK e NF-κB
envolvidas na transdução de sinal à jusante do receptor TLR4 .
Estudos recentes têm mostrado o envolvimento de TLR4 na secreção
de insulina. Nossos resultados mostram que não houve diferença no
conteúdo intracelular de insulina no grupo tratado com LPS, indicando que
apesar da ativação de TLR4, nas nossas condições, a síntese de insulina foi
mantida. Em estudo usando a linhagem de células β de rato (BRIN-BD11)
tratada com LPS, também não houve diferença no conteúdo intracelular de
insulina (Kiely, Robinson et al. 2009). Ilhotas de camundongos normais ou
deficientes em TLR4, quando tratadas com LPS, também não mostraram
diferenças no conteúdo intracelular de insulina (Amyot, Semache et al.
2012).
Apesar da manutenção dos níveis intracelulares de insulina,
observamos aumento significativo na secreção de insulina nos grupos
tratados com LPS (50 ng/mL) por 48h, independentemente da glicemia.
Nossos resultados estão de acordo com dados da literatura onde foi
observado aumento na secreção de insulina em células β de ratos (linhagem
BRIN-BD11) incubadas por 24h com diferentes concentrações de LPS e
expostas a variações de glicemia (Kiely, Robinson et al. 2009). Entretanto,
estudo anterior do nosso grupo, mostrou que LPS inibia a secreção de
insulina em ilhotas humanas (Garay-Malpartida, Mourao et al. 2011). Esta
diferença poderia ser explicada pela possível presença de contaminação por
endotoxinas residuais do processo de isolamento, ou ainda no meio de
cultura utilizado para cultivar as ilhotas frescas. Cabe ressaltar que no
40
trabalho anterior, todos os experimentos foram conduzidos em meio
hiperglicêmico, dificultando a comparação.
Para aumentar a controvérsia, em trabalho publicado recentemente,
observou-se, em ilhotas isoladas de camundongos, a diminuição da
secreção de insulina no grupo wild-type tratado com LPS. Entretanto, no
grupo deficiente em TLR4 com o mesmo tratamento, a secreção de insulina
em resposta a glicose foi mantida (Amyot, Semache et al. 2012). Porém,
neste estudo, os autores utilizaram condições experimentais muito diferentes
das utilizadas em nosso trabalho. Nossos experimentos avaliaram a
secreção crônica de insulina, onde a concentração de glicose mais alta
utilizada em nossos experientos foi de 11,2 mM, a incubação foi feita durante
4 dias e o LPS adicionado por mais 48 horas. (Amyot, Semache et al. 2012)
avaliaram secreção aguda de insulina, utilizaram meio com glicose 16,7 mM
(300 mg/dL) por 1 hora e o LPS foi adicionado por apenas 24 horas. Além
disso, a concentração de LPS utilizada nestes experimentos foi de 5 μg/mL,
enquanto em nosso estudo utilizamos apenas 50 ng/mL, ou seja, 100 vezes
menos. De fato, já foi descrito que baixas concentrações de LPS (1-100
ng/mL) aumentam a secreção de insulina (Vives-Pi, Somoza et al. 2003) e
que altas concentrações (5-10 μg/mL) causam efeito citotóxico em ilhotas
(Saitoh, Awaya et al. 2004). Não observamos diferenças nas taxas de
apoptose e necrose entre o grupo tratado com LPS em relação grupo
controle. De fato, nossos dados estão de acordo com dados já publicados na
literatura onde células β de rato BRIN-BD11 foram incubadas com LPS
(10ng/mL a 1000ng/mL) e a viabilidade celular foi mantida (Kiely, Robinson
et al. 2009). Além do mais, em macrófagos, a ativação de NF-kB mediada
por MyD88, via TLR4, promove a sobrevivência celular através da produção
de moléculas anti-apoptóticas da família Bcl-2 (Lombardo, Alvarez-
Barrientos et al. 2007).
Outra possível explicação para a discrepância observada poderia ser
o fato de termos utilizado uma linhagem de células β imortalizadas, já que os
trabalhos mencionados utilizaram células β primárias isoladas de ilhotas
frescas. As células MIN6 são originárias de um insulinoma, situação em que
41
as células perdem total ou parcialmente a capacidade de resposta à glicose,
mantendo uma produção autônoma de insulina. Porém a descrição original
da linhagem MIN6 (Ishihara, Asano et al. 1993) mostrou que esta linhagem
mantinha a resposta à glicose, e por este motivo, foi a linhagem que
escolhemos para desenvolver o trabalho.
Assim, acreditamos que as diferenças observadas nos diversos
trabalhos possam ser explicadas pelo nível de LPS, tempo de incubação e
outros detalhes técnicos. Nossos resultados indicam que o LPS interfere na
homeostase de insulina, independentemente da glicemia, e que ativação de
TLR4 via MyD88 protege as células β da morte celular.
Apesar dos TLRs serem conhecidos como importantes sinalizadores
do sistema imune inato que tem como função principal detectar patógenos
invasores no organismo, nossos dados indicam haver um papel adicional
para TLR4 na regulação da função de células β. Sugerimos que baixas
doses de LPS poderiam ter efeitos benéficos para as células β, aumentando
a secreção de insulina e mantendo a viabilidade celular, ao passo que
estímulos fortes, com altas doses de LPS, poderiam levar as células β a
condições de estresse, causando diminuição da produção e secreção de
insulina, levando à disfunção e à morte celular.
Em modelos animais, foi demonstrado que a inibição da ativação de
TLR4 previne a obesidade e que o aumento de sua expressão estimula a
resistência à insulina (Davis, Gabler et al. 2008). Acreditamos que, como na
obesidade, o TLR4 poderia ter impacto também no DM2, conhecida como
uma síndrome metabólica e inflamatória. O estágio inicial do
desenvolvimento do DM2 é caracterizado pelo aumento da resistência
periférica à insulina, que leva à hiperinsulinemia e hiperglicemia e produção
de citocinas inflamatórias pelo tecido adiposo. Nesse estágio, a baixa
expressão de TLR4, poderia auxiliar na manutenção e equilíbrio da função
das células β, fazendo com que essas aumentem a secreção de insulina
para compensar a hiperglicemia e protegendo-as da morte celular. Em um
estágio mais avançado da doença, poderia ocorrer aumento da expressão
de TLR4, através do aumento de ligantes endógenos circulantes, como por
42
exemplo ácidos graxos saturados, comum em doenças como o DM2
(Tsukumo, Carvalho-Filho et al. 2007). Nesta fase, o TLR4 poderia ter um
papel citotóxico, causando a diminuição da produção de insulina, levando as
células β à morte celular.
43
6. CONCLUSÕES
Células β murinas expressam TLR4;
A via de sinalização ativada por LPS é a via MyD88-dependente e a
via TRIF-dependente está ausente nestas células;
A ativação de TLR4 interfere na homeostase de insulina das células
β, independentemente da glicemia, aumentando a secreção de
insulina;
Apesar da ativação de TLR4 via MyD88 não houve morte celular
detectável.
44
7. ANEXOS
45
46
47
8. REFERÊNCIAS
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