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Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología Obtención y caracterización de células madre de pulpa dental humanas e interacción con β-fosfato tricálcicoEscrita y presentada por: Dirigida por: José Viña Almunia Doña Consuelo Borrás Blasco Don Miguel Peñarrocha Diago Don José Viña Ribes Valencia, 2013

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Facultad de Medicina y Odontología

Departamento de Estomatología

“Obtención y caracterización de

células madre de pulpa dental

humanas e interacción con β-fosfato

tricálcico”

Escrita y presentada por: Dirigida por:

José Viña Almunia Doña Consuelo Borrás Blasco

Don Miguel Peñarrocha Diago

Don José Viña Ribes

Valencia, 2013

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Facultad de Medicina y Odontología

Departamento de Estomatología

Universidad de Valencia

Dña. Consuelo Borras Blasco, Profesora Titular de Fisiología

de la Facultad de Medicina y Odontología de Universidad de

Valencia.

D. Miguel Peñarrocha Diago, Catedrático de Cirugía Bucal de

la Facultad de Medicina y Odontología de Universidad de Valencia.

D. José Viña Ribes, Catedrático de Fisiología de la Facultad de

Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.

Certificamos que D. José Viña Almunia, ha realizado bajo

nuestra dirección el trabajo titulado “Obtención y caracterización de

células madre de pulpa dental humanas e interacción con β-

fosfato tricálcico”, el cual reúne, a nuestro juicio, las condiciones

exigibles para ser presentado y defendido como Tesis Doctoral.

Y para que conste y en cumplimiento de las disposiciones

vigentes, firmamos la presente en Valencia a………………. de 2013.

Prof. Dra. Consuelo Borras Blasco

Prof. Dr. Miguel Peñarrocha Diago

Prof. Dr. José Viña Ribes

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La realización de esta tesis ha sido posible

gracias a un Proyecto de Investigación

Fundamental Orientada a la Transmisión de

Conocimiento a la Empresa (TRACE).

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Agradecimientos

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A la Profesora Consuelo Borras Blasco, por la dirección de

este trabajo, por enseñarme cómo funciona un laboratorio de

investigación, y por su apoyo desde el primer día.

Al Profesor Miguel Peñarrocha Diago, por la dirección de este

trabajo y por ser, desde hace ya muchos años, mi maestro en el campo

de la cirugía e implantología bucal.

A mi padre, por la dirección de este trabajo, por inculcarme,

con sus consejos y sus actos, tantos valores, y ayudarme siempre a

tomar la decisión correcta.

A Juan Gambini, por su cercanía, amistad y ejemplo, y por

ayudarme en tantísimos aspectos todos estos años.

A Marya El Alamy, por la realización de la parte básica de esta

Tesis. Por su forma de ser tan perfeccionista y meticulosa, que ha

facilitado tanto la ejecución de estos trabajos.

A todos mis compañeros de la Unidad de Cirugía Bucal: Celia,

Bárbara, Sonnica, Minerva, Tony, Teresa, Sandra, Cris, Jose, Cris

Palma, Javi, Pepe, Amparo, Juan, Pablo, Hilario, Javi Romero, David

y Eugenia por su amistad y sobre todo, por tantos buenos momentos

que pasamos juntos. Y especialmente a Laura Maestre, por su amistad,

por todo lo que me aporta y todo lo que he aprendido de ella.

A los profesores del Máster de Cirugía e Implantología Bucal

de la Facultad de Medicina y Odontología de Valencia, especialmente

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a Luis Martorell, Pepe Balaguer y Berta García, por todos los

conocimientos que me han transmitido, y por su ayuda desinteresada

en el desarrollo de la clínica.

A todos los compañeros del Departamento de Fisiología la

Universidad de Valencia, por el trato que siempre han tenido conmigo.

A Charo Velarde, Mª José Barrachina, Carmina Estellés,

Esther Grau e Inma de la Clínica de Cirugía Bucal por ayuda y apoyo.

A Dña. Delfina Gimenez Abad, por su orientación en las tareas

burocráticas.

A todos mis amigos, por lo importante de su amistad,

especialmente a aquellos con los que estudié la carrera, Nacho

Gamarra, Javi Peláez, Jose Riquelme y Carlos Valdivieso, por

compartir profesión y porque desde hace ya mucho tiempo siguen ahí.

A mis padres, Pepe y Pilar, a quienes debo todo; por todo lo

que han hecho por mí. A mis hermanos, Tomás y Aurora, por todo lo

que me aportan.

A mis tíos, Juan, Teresa, Jose Luis y Paloma. A mis primos,

Carlos, Isabel y Jose Luis.

A mis abuelos, Mari, Tomás, Ela y especialmente esta Tesis

está dedicada a Elo, más que a nadie a él le hubiera gustado estar

presente.

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Índices

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III

ÍNDICE DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN .................................................................... 21

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................... 27

2.1 Embriología y características de la pulpa dental ............ 29

2.2 ¿Qué son las células madre? ............................................. 33

2.3 Células madre según su potencialidad ............................. 33

2.4 Células madre según su origen ......................................... 34

2.5 Células madre mesenquimales ......................................... 35

2.6 Localización ........................................................................ 36

2.7 Diferenciación .................................................................... 37

2.8 Células madre mesenquimales de origen dental ............. 37

2.8.1 Células madre de pulpa dental (CMPD) ...................... 37

2.8.2 Células madre de otros tejidos dentales ....................... 41

2.9 Caracterización de CMPD ................................................ 44

2.10 Estudios in vitro sobre células madre y biomateriales de

regeneración ósea ............................................................................. 48

2.11 Estudios in vivo sobre células madre en regeneración ósea

…………………. ................................................................ 50

2.11.1 Regeneración ósea alveolar .......................................... 51

2.11.2 Elevación de seno maxilar ............................................ 53

2.11.3 Regeneración ósea periimplantaria .............................. 55

2.11.4 Distracción alveolar ...................................................... 56

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IV

2.12 ¿Existen otros factores o proteínas útiles para aumentar

la regeneración ósea? ....................................................................... 62

2.12.1 Proteínas morfogenéticas óseas .................................... 62

2.12.2 Plasma rico en plaquetas .............................................. 64

3 JUSTIFICACIÓN ..................................................................... 67

4 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................... 71

4.1 HIPÓTESIS ........................................................................ 73

4.2 OBJETIVOS ...................................................................... 75

5 MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................... 77

5.1 Material .............................................................................. 78

5.1.1 Material clínico ............................................................ 79

5.1.1.1 Anestesia ............................................................... 79

5.1.1.2 Exodoncia simple .................................................. 79

5.1.1.3 Exodoncia quirúrgica ............................................ 79

5.1.1.4 Extracción de la pulpa dental ................................ 79

5.1.2 Aparatos ....................................................................... 80

5.1.2.1 Para cultivo celular ............................................... 80

5.1.2.2 Para caracterización .............................................. 81

5.1.2.3 Para interacción de CMPD y biomateriales .......... 81

5.1.3 Reactivos y medios de cultivo ...................................... 81

5.1.3.1 Enzimas y reactivos .............................................. 82

5.1.3.2 Medios de cultivo .................................................. 82

5.1.4 Biomateriales de regeneración ósea ............................. 82

5.2 Métodos............................................................................... 83

5.2.1 Diseño del estudio ........................................................ 83

5.2.1.1 Criterios de inclusión ............................................ 84

5.2.1.2 Criterios de exclusión ........................................... 84

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V

5.2.1.3 Recogida de datos ................................................. 84

5.2.2 Exodoncia ..................................................................... 85

5.2.2.1 Anestesia ............................................................... 85

5.2.2.2 Exodoncia simple .................................................. 85

5.2.2.3 Exodoncia quirúrgica ............................................ 85

5.2.2.4 Extracción de la pulpa dental ................................ 86

5.2.2.5 Almacenamiento y transporte ............................... 87

5.2.3 Obtención de CMPD por método publicado por Gandía

y cols. (Gandia C y cols. 2008) (Método A) ............................... 88

5.2.3.1 Rendimiento para la obtención de CMPD ............ 88

5.2.3.2 Tiempo mínimo requerido para el aislamiento de

CMPD… .............................................................................. 89

5.2.4 Optimización del método de obtención de CMPD ....... 90

5.2.4.1 Método B: Obtención de CMPD realizando la

disgregación de la pulpa con EDTA .................................... 90

5.2.4.2 Método C: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con EDTA y colagenasa tipo I .......... 91

5.2.4.3 Método D: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 1 mg/ml de colagenasa durante 13

horas……............................................................................. 91

5.2.4.4 Método E: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con EDTA y colagenasa/dispasa ....... 91

5.2.4.5 Método F: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con EDTA y colagenasa/dispasa y

sonicación ............................................................................ 91

5.2.4.6 Método G: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con EDTA, colagenasa/dispasa,

termolisina y sonicación. ..................................................... 92

5.2.4.7 Método H: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con termolisina .................................. 92

5.2.4.8 Método I: Obtención de CMPD realizando

fragmentación mecánica ...................................................... 92

5.2.5 Caracterización de las células madre mesenquimales

mediante la inmunofluorescencia por microscopía confocal ...... 93

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VI

5.2.6 Cultivo de CMPD a distintas presiones de oxígeno y

realización de curva de crecimiento ............................................ 95

5.2.7 Adhesión y crecimiento de CMPD a β- fosfato

tricálcico. ..................................................................................... 96

5.2.7.1 Adhesión de CMPD a β- fosfato tricálcico ........... 96

5.2.7.2 Crecimiento de las CMPD sobre el biomaterial β-

fosfato tricálcico .................................................................. 96

5.2.8 Análisis estadístico de los resultados ........................... 99

5.3 Documentos anexos.......................................................... 100

6 RESULTADOS ....................................................................... 107

6.1 Obtención de CMPD por método publicado por Gandía y

cols. (Gandia C y cols. 2008) (Método A) ..................................... 109

6.1.1 Rendimiento para la obtención de CMPD .................. 109

6.1.2 Tiempo mínimo requerido para el aislamiento de

CMPD…. .................................................................................. 110

6.2 Optimización del método de obtención de CMPD ........ 113

6.2.1 Método B: Obtención de CMPD realizando la

disgregación de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA. ..................... 114

6.2.2 Método C: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA y 2 mg/ml de colagenasa tipo

I……….. ................................................................................... 116

6.2.3 Método D: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 1 mg/ml de colagenasa durante 13 horas ......... 118

6.2.4 Método E: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (2mg/ml)/dispasa

(4mg/ml) ................................................................................... 121

6.2.5 Método F: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (4mg/ml)/dispasa

(4mg/ml) y sonicación .............................................................. 123

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VII

6.2.6 Método G: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA, colagenasa (4mg/ml)/dispasa

(4mg/ml), 13ng/ml de termolisina y sonicación ....................... 125

6.2.7 Método H: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 13ng/ml de termolisina .................................... 127

6.2.8 Método I: Obtención de CMPD realizando

fragmentación mecánica ........................................................... 129

6.3 Caracterización de CMPD .............................................. 132

6.3.1 Caracterización mediante marcador de superficie CD-

133……. .................................................................................... 133

6.3.2 Caracterización mediante marcador de superficie

Oct4…… ................................................................................... 134

6.3.3 Caracterización mediante marcador de superficie

Nestin…. ................................................................................... 135

6.3.4 Caracterización mediante marcador de superficie Stro-

1………. .................................................................................... 136

6.3.5 Caracterización mediante marcador de superficie CD-

34……… ................................................................................... 137

6.3.6 Caracterización mediante marcador de superficie CD-

45……… ................................................................................... 138

6.4 Cultivo de CMPD a distintas presiones de oxígeno ...... 138

6.5 Adhesión y crecimiento de CMPD sobre β-fosfato

tricálcico .......................................................................................... 140

6.5.1 Adhesión de CMPD sobre β-fosfato tricálcico ......... 140

6.5.2 Crecimiento de CMPD sobre β-fosfato tricálcico ...... 141

7 DISCUSIÓN ............................................................................ 145

7.1 Obtención de CMPD ....................................................... 147

7.1.1 Extracción de pulpa dental ......................................... 147

7.1.2 Almacenamiento y transporte ..................................... 148

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VIII

7.1.3 Aislamiento y cultivo de CMPD ................................ 149

7.1.4 Criopreservación ........................................................ 152

7.2 Optimización del método de obtención CMPD ............. 154

7.3 Crecimiento de CMPD a distintas concentraciones de O2 ..

........................................................................................... 156

7.4 Caracterización de CMPD .............................................. 158

7.5 Adhesión y crecimiento de CMPD a β-fosfato

tricálcico…… .................................................................................. 160

7.6 Limitaciones del estudio .................................................. 163

7.7 Proyecciones del estudio .................................................. 165

8 CONCLUSIONES ................................................................... 167

9 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................... 171

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IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Imagen esquemática de la anatomía dental. Las células

madre mesenquimales se encuentran en la zona perivascular. ........... 24

Figura 2.1. Distintas etapas de la odontogénesis. A: Se observa el

estadío de brote. B: casquete, y C: y campana. Existe una interacción

de células mesenquimales (flecha roja) y el ectodermo (flecha verde).

............................................................................................................ 29

Figura 2.2 A: Corte longitudinal de un diente donde se observa la

cavidad pulpar. B: Representación gráfica de la pulpa dental en la

cavidad pulpar. ................................................................................... 30

Figura 2.3. Imagen de pulpa dental donde se pueden diferenciar las 4

zonas celulares. ................................................................................... 32

Figura 2.4. Representación esquemática del origen histológico y la

diferenciación de CMPD. ................................................................... 40

Figura 2.5 A: Pulpa dental de un canino temporal superior derecho.

B: Ligamento periodontal obtenido con una cureta tras la exodoncia.

............................................................................................................ 41

Figura 2.6. A: Imagen de papila apical de un tercer molar en periodo

de desarrollo. B: Este tejido se desprende fácilmente con la ayuda de

una cureta. .......................................................................................... 42

Figura 2.7. Imagen de un tercer molar tras su extracción con su

folículo dental. .................................................................................... 43

Figura 5.1. Campana de cultivo. ....................................................... 78

Figura 5.2. Extracción de la pulpa dental. A: Odontosección a nivel

de la línea amelocementaria con fresa diamantada. B: Una vez

expuesta la cámara pulpar, C: se despegó la pulpa con una sonda, y D:

se extrajo con unas pinzas. E y F: La pulpa se conservó y transportó

en tubos con medio de cultivo Dulbecco´s modified Eagle® con

suplemento bajo de glucosa (1mg/ml) y antibióticos (penicilina

100U/ml y estreptomicina 100 µg/ml). .............................................. 87

Figura 5.3. A y B: Estufa de cultivo celular. Condiciones: 37ºC, 5%

de CO2 y 3% de O2. ........................................................................... 89

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X

Figura 5.4. A y B: Centrifuga para precipitar los fragmentos pulpares

digeridos. ............................................................................................ 90

Figura 6.1. A y B: Imágenes al microscopio electrónico de CMPD

correspondiente a un hombre de 17 años realizando la digestión de la

pulpa con 2mg/mL de colagenasa I durante 90 minutos. ................. 110

Figura 6.2. Obtención de CMPD realizando la digestión con 2mg/mL

de colagenasa durante 90 minutos. Imágenes a microscopía óptica a

400x aumentos de un cultivo de una pulpa correspondiente a un

hombre de 35 años. Las figuras muestran diferentes tiempos de

cultivo: A: Cultivo a los 7 días. Se observan fragmentos pulpares en

suspensión (flecha roja). B: Cultivo a los 14 días. De los fragmentos

pulpares, se desprenden CMPD adheridas a la placa (flecha verde). C:

Cultivo a los 18 días. La placa de cultivo está confluente. .............. 112

Figura 6.3. Imágenes representativas de microscopía óptica a 400x y

200x aumentos respectivamente de CMPD aisladas realizando la

disgregación con 2 mg/ml de EDTA. Estas células corresponden a un

hombre de 35 años. Imágenes correspondientes a distintos momentos

del cultivo: A: Imagen a los 7 días de cultivo. B: A las 3 semanas del

cultivo. .............................................................................................. 116

Figura 6.4. Imagen de cultivo a los 7 días de aislamiento realizando

la digestión con 2 mg/ml de EDTA y 2 mg/ml de colagenasa tipo I.

Microscopía óptica a 100x aumentos. .............................................. 117

Figura 6.5. Imágenes de microscopio óptico de la obtención de

CMPD realizando la digestión con 1 mg/ml de colagenasa durante 13

horas. A: Imagen a 400x aumentos de la pulpa después de la

digestión. B: Imagen a 400x aumentos de CMPD a las 24 horas tras el

aislamiento. C: Imagen a 200x aumentos de CMPD a las 48 horas tras

el aislamiento. D: Imagen a 400x aumento a los 17 días de cultivo. 120

Figura 6.6. Imagen a los 4 días de cultivo de CMPD realizando la

digestión con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (2mg/ml)/dispasa

(4mg/ml). Imagen mediante microscopio óptico a 200x aumentos. 122

Figura 6.7. Imagen a las 13 horas tras el aislamiento al microscopio

óptico a 400x aumentos de CMPD correspondiente a una mujer de 37

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XI

años. La digestión se realizó con 2mg/ml de EDTA y colagenasa

(4mg/ml)/dispasa (4mg/ml) y sonicación. ........................................ 124

Figura 6.8. Imagen al microscopio óptico de un cultivo donde se

realizó la digestión de la pulpa de un hombre de 30 años con 2 mg/ml

de EDTA, colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de

termolisina y sonicación. Imagen a las 40 horas desde el aislamiento.

.......................................................................................................... 127

Figura 6.9. Imagen al sexto día de cultivo de CMPD correspondientes

a una mujer de 19 años, aisladas con el presente método (digestión

con 13ng/ml de termolisina). ............................................................ 129

Figura 6.10. Imagen de microscopía confocal mediante láser de argón

y otro de neón-helio con una longitud de onda de 543 nm de

excitación y 555-621 nm de emisión (color rojo). Imágenes A: 400x

aumentos y B: 600x aumentos del marcador positivo CD-133. ...... 133

Figura 6.11. Imagen de microscopía confocal mediante láser de

argón y otro de neón-helio con una longitud de onda 488 nm de

excitación y de 510-585 nm de emisión (color verde). Imágenes A:

400x aumentos y B: 600x aumentos del marcador positivo Oct4. ... 134

Figura 6.12. Imagen de microscopía confocal con láser argón y otro

de neón-helio (longitud de onda 488 nm de excitación y de 510-585

nm de emisión color verde); (longitud de onda de 543 nm de

excitación y 555-621 nm de emisión: color rojo). Imágenes A: 400x

aumentos y B: 600x aumentos para el marcador positivo Nestin. ... 135

Figura 6.13. Imagen de microscopía confocal mediante láser de

argón y otro de neón-helio con una longitud de onda 488 nm de

excitación y de 510-585 nm de emisión (color verde). Imágenes A:

400x aumentos y B: 600x aumentos del marcador positivo Stro-1. 136

Figura 6.14. Imagen de microscopía confocal mediante láser de

argón y otro de neón-helio con una longitud de onda 488 nm de

excitación y de 510-585 nm de emisión (color verde). Imagen a 400x

aumentos. .......................................................................................... 137

Figura 6.15. Se observa el número de células contadas en cada tiempo

de cultivo. El número de células para cada momento es la media de 4

cultivos distintos. El eje vertical indica el número de células y el eje

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XII

horizontal el tiempo. Los valores de los resultados de la curva de

CMPD al 3 y al 21% de O2 están representados como la media ±

SEM. La significancia estadística se expresa como * p˂0´05;

**p˂0´01; ***p˂0´001. .................................................................... 139

Figura 6.16. Imágenes con microscopía óptica a distintos aumentos

(40-400x) de CMPD (flecha verde) adheridas a β-fosfato tricálcico

(flecha roja). A: A los 7. B: 13. C: 18 y D: 23 días de cultivo. ....... 141

Figura 6.17. Relación entre el número de células y la concentración

de DNA. ........................................................................................... 142

Figura 6.18. Gráfica donde se observa la correspondencia entre la

concentración de DNA (en ng/µL) y el número de células. Las

mediciones de DNA se realizaron los días 7, 13, 18 y 23. Se observó

un incremento en la cantidad de células a lo largo del intervalo de

tiempo. .............................................................................................. 143

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XIII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 2.1. Marcadores de células madre de pulpa dental. ................. 47

Tabla 2.2. Resumen de los resultados sobre la aplicación de células

madre en regeneración ósea en implantología. .................................. 61

Tabla 6.1. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 2mg/mL de colagenasa I durante 90

minutos. ............................................................................................ 109

Tabla 6.2. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó disgregación con 2 mg/ml de EDTA. .................... 115

Tabla 6.3. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 2 mg/ml de EDTA y 2 mg/ml de

colagenasa tipo I. .............................................................................. 117

Tabla 6.4. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 1 mg/ml de colagenasa durante 13

horas. ................................................................................................ 119

Tabla 6.5. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 2mg/ml de EDTA y colagenasa

(2mg/ml)/dispasa (4mg/ml). ............................................................. 122

Tabla 6.6. Datos descriptivos de los pacientes y las pulpas a las cuales

se realizó digestión con 2mg/ml de EDTA y colagenasa

(4mg/ml)/dispasa (4mg/ml) y sonicación. ........................................ 124

Tabla 6.7. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 2 mg/ml de EDTA, colagenasa

(4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de termolisina y sonicación. . 126

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XIV

Tabla 6.8. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y

porcentaje de obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las

cuales se realizó digestión con 13ng/ml de termolisina. .................. 128

Tabla 6.9. Método utilizado, número de pulpas, tiempo de digestión y

obtención y porcentaje de obtención de todas las pulpas cultivadas en

los objetivos 1 (Método A) y 2 (Métodos B-I). Método A: 2mg/ml

colagenasa tipo I, 90 min. Método B: 2mg/mL EDTA, 30 min.

Método C: 2mg/ml EDTA, 10 min + 2mg/ml colagenasa tipo I, 90

min. Método D: 1mg/ml colagenasa tipo I, 13 horas. Método E:

2mg/ml EDTA 10 min + 2mg/ml colagenasa tipo I + 4mg/ml dispasa

tipo II, 90 min. Método F: 2mg/ml EDTA, 10 min + 4mg/ml

colagenasa tipo I + 4mg/ml dispasa tipo II, 40 min + sonicar, 1 min.

Método G: 2mg/ml EDTA, 10 min + 4mg/ml colagenasa tipo I +

4mg/ml dispasa tipo II + 13ng/mL termolisina 40 min + sonicar,

1min. Método H: Termolisina 13ng/ml 40 min. ............................. 131

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XV

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 5.1. Informe del comité de ética de la Universidad de Valencia.

.......................................................................................................... 100

Anexo 5.2. Modelo de hoja de información al paciente. ................. 101

Anexo 5.3. Modelo de consentimiento informado. .......................... 102

Anexo 5.4. Tabla de recogida de datos referentes a la edad y sexo de

los pacientes, método de aislamiento utilizado y tiempo requerido para

la obtención de CMPD. .................................................................... 106

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XVII

Abreviaturas

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XIX

Abreviatura Descripción

CMM Células madre mesenquimales

CMPD Células madre de pulpa dental

hTERT Telomerasa humana

FBN Fibronectina

DNA Ácido desoxirribonucleico

Al2O3 Óxido de aluminio

PRP Plasma rico en plaquetas

HA Hidroxiapatita

BMPs* proteínas morfogenéticas óseas

rhBMP-2* proteínas morfogenéticas óseas

recombinantes humanas

PDGF* Factor de crecimiento derivado de

las plaquetas

PTH Parathormona

EDTA

Etilen diamino tetraacético

(quelante de metales incluyendo

Ca2+

)

DMEM* Medio modificado Eagle de

Dulbecco

PBS* Tampón fosfato sódico

SBF Suero bovino fetal

BSA Albumina de suero Bovino

RNA Ácido ribonucleico

DEPC Dietilpirocarbonato

α-MEM Medio modificado Eagle-α

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1 INTRODUCCIÓN

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Introducción

23

Las células madre son células con capacidad clonogénica y

autorenovadora y que se pueden diferenciar en múltiples linajes

celulares (Weissman IL 2000). Las células madre mesenquimales

(CMM) son aquellas capaces de diferenciarse hacia células de origen

mesodérmico (Caplan AI 1991) (dentina, hueso, ligamento

periodontal, etc.), aunque recientemente se ha observado que se

pueden transdiferenciar, es decir, se les puede inducir

pluripotencialidad (Song L y Tuan RS 2004). Estas células se

identifican por su capacidad de formar colonias morfológicamente

parecidas a fibroblastos, cuando se cultivan en presencia de factores

de crecimiento mitogénico o suero (Friedenstein AJ y cols. 1978).

El mayor reservorio de CMM se encuentra en el estroma de

médula ósea. También existen CMM en la pulpa dental,

concretamente se encuentran en la zona celular, alrededor de la zona

central (Tecles O y cols. 2005) (Figura 1.1). In vitro, se ha

demostrado que en presencia de una cavidad dentinaria profunda,

estas células proliferan y acuden a la zona de la lesión para sustituir

los odontoblastos necrosados (Tecles O y cols. 2005).

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Introducción

24

Figura 1.1. Imagen esquemática de la anatomía dental. Las células madre

mesenquimales se encuentran en la zona perivascular.

Gronthos y cols. (Gronthos S y cols. 2000) fueron en el año

2000, los primeros en aislar células madre de pulpa dental (CMPD).

La metodología que utilizaron fue digerir la pulpa, fragmentada

previamente, con 3 mg/mL de colagenasa tipo I y 4 mg/mL de dispasa

durante 90 minutos a 37°C. Este protocolo ha sido utilizado por

muchos autores (Takeda T y cols. 2008), (Liu H y cols. 2005). Otros

métodos de aislamiento válidos, fueron aislar la pulpa realizando la

digestión con colagenasa tipo I y tipo II con termolisina (una proteasa

termoestable producida por bacterias Gram-positivas) durante 40

minutos (Perry BC y cols. 2008), con 3 mg/mL de colagenasa tipo I

(Zhang W y cols. 2008), o sin realizar digestión de la pulpa

(Pierdomenico L y cols. 2005). En la mayoría de los estudios

encontrados en la literatura (Zhang W y cols. 2008), (Gandia C y cols.

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Introducción

25

2008), (Graziano A y cols. 2008) se obtuvieron pulpas de dientes

extraídos, los cuales fueron seccionados para acceder a la cavidad

pulpar; normalmente estos dientes fueron terceros molares. Huang y

cols. (Huang AH y cols. 2008) cultivaron y caracterizaron CMPD de

un mesiodens. En un estudio reciente (Huang AH y cols. 2009) se

obtuvo la pulpa dental mediante una lima de endodoncia a un diente

no extraído que requería tratamiento de conductos y cuya pulpa no

presentaba inflamación o infección.

No existe un marcador que caracterice exclusivamente las

CMPD. Estas células son positivas para c-kit, STRO- y CD34 (Laino

G y cols. 2006). A su vez, son negativas para CD44, CD45 y CD14

(Papaccio G y cols. 2006). Kerkis y cols. (Kerkis I y cols. 2006),

cultivaron células madre de dientes deciduos positivas para

marcadores de células madre embrionarias como OCT-4, Nanog,

SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, implicando la pluripotencialidad de

estas células.

Existen indicios de que una población heterogénea de CMPD

reside en la pulpa dental (Gronthos S y cols. 2000), (Shi S y Gronthos

S 2003). Recientemente Waddington y cols. (Waddington RJ y cols.

2009) aislaron 2 estirpes diferentes de CMPD de ratas. Cultivaron

células madre, derivadas de cresta neural y positivas para STRO 1,

CD31, LANGFR, CD105 y Notch 2. Por otra parte, cultivaron solo

positivas para STRO 1 y CD31 y fibronectina. Por tanto, parece que se

pueden diferenciar dos tipos de células madre en la pulpa dental.

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Introducción

26

Las CMM expresan genes como la proteína morfogenética

ósea y el factor de transformación de crecimiento-β (Aonuma H y

cols. 2012). Durante la regeneración ósea, existe una migración de

células madre al lugar de la lesión, que posteriormente se diferencian

hacia osteoblastos (Lock J y cols. 2012).

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2 REVISIÓN

BIBLIOGRÁFICA

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Revisión bibliográfica

29

2.1 Embriología y características de la pulpa

dental

Los dientes tienen su origen en dos de las tres capas

blastodérmicas primitivas, el ectodermo y el mesodermo, donde

desarrolla un importante papel el ectomesénquima, o mesénquima

migrado a la mandíbula o maxilar desde las crestas neurales (Lumsden

AG 1988). En los primeros estadíos de la odontogénesis se produce

una interacción entre las células epiteliales del ectodermo y las células

mesenquimales (Lumsden AG 1988), (Ruch JV 1985), (Thesleff I y

Sharpe P 1997). La porción ectodérmica dará lugar al esmalte,

mientras que las células mesenquimales darán lugar a los tejidos

mesodérmicos: dentina, pulpa y cemento (Bergenholtz G y cols.

1985). En la Figura 2.1 (obtenida de un estudio de Li y cols. (Li L y

cols. 2011) sobre la odontogénesis en ratas) se observa los distintos

pasos de la odontogénesis y la interacción del mesodermo y el

ectodermo.

Figura 2.1. Distintas etapas de la odontogénesis. A: Se observa el estadío de brote.

B: casquete, y C: y campana. Existe una interacción de células mesenquimales

(flecha roja) y el ectodermo (flecha verde).

A B C

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30

En el inicio de la odontogénesis aparecen unos brotes de la

lámina dental (estadio de brote) (Figura 2.1A). Cuando el brote

prolifera determina una concavidad que adquiere el aspecto de

casquete (Figura 2.1B). Su cavidad central encierra una serie de

células ectomesenquimales; la futura papila dentaria, que dará lugar al

complejo dentinopulpar. En el estadio de campana (Figura 2.1C), las

células de la periferia de la papila darán lugar a los odontoblastos, y

las del centro de la papila a la pulpa dental (Bergenholtz G y cols.

1985).

La pulpa es un tejido conjuntivo laxo compuesto de células,

fibras colágenas y reticulares, sustancia fundamental, vasos

sanguíneos y nervios (Figura 2.2). Es la forma madura de la papila

dentaria y el único tejido blando del diente (Bergenholtz G y cols.

1985).

Figura 2.2 A: Corte longitudinal de un diente donde se observa la cavidad pulpar.

B: Representación gráfica de la pulpa dental en la cavidad pulpar.

A B

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Revisión bibliográfica

31

Mientras que las células periféricas se diferencian hacia

odontoblastos, el resto se diferencian hacia fibroblastos, lo que supone

un grado de diferenciación mucho menor. Muchas de las células

mesenquimales permanecen indiferenciadas una vez finalizada la

odontogénesis, conservando su potencial de diferenciación

(Bergenholtz G y cols. 1985).

Se pueden diferenciar 4 zonas en la pulpa dental (Figura 2.3):

Zona odontoblástica en la periferia. Justo debajo de los

odontoblastos se encuentras las células de Höhl, que son

preodontoblastos (Sinanan AC y cols. 2004).

Zona acelular o zona de Weil por debajo de los

odontoblastos. Esta zona es pobre en células y rica en

colágeno.

Zona muy rica en células adyacente a la capa anterior.

Zona central, donde están presentes los nervios y vasos

(Bergenholtz G y cols. 1985).

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Revisión bibliográfica

32

Figura 2.3. Imagen de pulpa dental donde se pueden diferenciar las 4 zonas

celulares.

Después de la erupción dental, la dentina reparativa se forma

por odontoblastos en respuesta a erosión mecánica o a degradación

causada por bacterias (Kitamura C y cols. 1999; Smith AJ y Lesot H

2001). Estos odontoblastos surgen de la proliferación y diferenciación

de células precursoras que residen concretamente en la zona celular de

la pulpa dental, alrededor de la zona perivascular (Ruch JV 1998;

Tecles O y cols. 2005).

Zona central

Zona celular

Zona acelular o de Weil

Zona odontoblástica

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33

2.2 ¿Qué son las células madre?

Las células madre poseen capacidad clonogénica y

autorenovadora y pueden diferenciarse en múltiples linajes celulares

(Weissman IL 2000). Las propiedades clonogénica y autorenovadora

denotan la capacidad de reproducirse siendo las células hijas una

réplica exacta precisa de las anteriores. Estas células pueden replicarse

muchas generaciones sin perder sus características originales (Caplan

AI 1991). Las células madre mantienen la integridad estructural y

funcional de los tejidos reemplazando las células dañadas (Tirino V y

cols. 2011).

Las células madre se pueden clasificar según su potencialidad

y según su origen.

2.3 Células madre según su potencialidad

Totipotentes: capaces de formar células de todos los linajes

del organismo. En los mamíferos solamente son el cigoto y las

obtenidas a partir de los primeros blastómeros.

Pluripotentes: aquellas de las que pueden derivar células de

todos los linajes del cuerpo, pero no de los tejidos necesarios

para el desarrollo del trofoblasto. Son las del embrión de más

de 16 células hasta las de la masa granulosa del blastocisto

(Evans MJ y Kaufman MH 1981). A estas células, se les

denomina células madre embrionarias.

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34

Multipotentes: son aquellas capaces de generar células de

distintos tipos de un mismo tejido (Pittenger MF y cols. 1999),

como especialmente son las hematopoyéticas.

Unipotentes: son las células madre adultas que producen

células de un solo linaje, como las espermatogonias (Jaenisch

R y Young R 2008).

2.4 Células madre según su origen

Por otro lado, según su origen, pueden ser células madre

embrionarias o adultas. La fuente de células madre embrionarias son

los embriones. Estos se pueden obtener a partir de los sobrantes de

fecundación in vitro o generados por transferencia nuclear somática.

Las células madre adultas se pueden obtener de diferentes tejidos

adultos, del cordón umbilical, de la placenta, de teratocarcinomas o

carcinomas, especialmente los testiculares.

Las células madre embrionarias derivan del blastocisto

(Thomson JA y cols. 1998) y son pluripotentes, ya que pueden dar

lugar a todos los linajes celulares del cuerpo (endodermo, mesodermo

y ectodermo) (Korbling M y Estrov Z 2003). Sin embargo, dados los

problemas éticos y legales que plantean la utilización de este tipo de

células, nos centramos en las células madre adultas, que son

multipotentes, y por tanto capaces de diferenciarse en al menos dos

tipos de células diferentes de un mismo tejido (Korbling M y Estrov Z

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Revisión bibliográfica

35

2003). Dentro de las células madre adultas encontramos las células

madre mesenquimales (CMM).

2.5 Células madre mesenquimales

Las CMM son aquellas capaces de dar origen a células de

origen mesodérmico (Caplan AI 1991) (dentina, hueso, ligamento

periodontal, etc.). Friedenstein y cols. (Friedenstein AJ y cols. 1978)

en 1978, fueron los primeros en aislar con éxito CMM y fueron

llamadas células fibroblásticas formadoras de colonias. Los grupos de

Caplan (Caplan AI 1991) y Pittenger

(Pittenger MF y cols. 1999) por

su parte, demostraron en la década de los noventa, que las CMM

tenían propiedades osteogénicas, condrogénicas y adipogénicas. Las

células de una línea celular inmortal se pueden replicar muchas

generaciones pero no pueden diferenciarse hacia distintos linajes

celulares. Con lo cual, las líneas celulares no son células madre. Por

ejemplo, los preosteoblastos se pueden diferenciar hacia osteoblastos,

pero son incapaces de diferenciarse hacia otra línea mesenquimal

como condrocitos o adipocitos (Tirino V y cols. 2011). Las CMM

están presentes en todos los tejidos maduros del cuerpo humano y

residen en áreas específicas de dichos tejidos, donde permanecen

inactivas sin dividirse, hasta que se activan por enfermedad o lesión

tisular (Tirino V y cols. 2011).

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36

2.6 Localización

En la actualidad se sabe que el mayor reservorio de CMM se

encuentra en el estroma de médula ósea. Estas células se identifican

por su capacidad de formar colonias, morfológicamente parecidas a

fibroblastos cuando se cultivan en presencia de factores de

crecimiento mitogénico o suero (Friedenstein AJ y cols. 1978).

También se pueden aislar de: pulpa dental (Gronthos S y cols. 2000),

ligamento periodontal, (Gronthos S y cols. 2000) dientes deciduos

(Miura M y cols. 2003), periostio (Nakahara H y cols. 1991),

membrana sinovial (De Bari C y cols. 2001), músculo (Bosch P y

cols. 2000), grasa (Zuk PA y cols. 2002), dermis (Young HE y cols.

2001), y hueso trabecular (Tuli R y cols. 2003). Estas células se

pueden caracterizar mediante marcadores moleculares de superficie

como SH2 (CD105), SH3, SH4 (Haynesworth SE y cols. 1992), CD44

(Conget PA y Minguell JJ 1999) y Stro-1 (Gronthos S y Simmons PJ

1995); aunque ninguno de estos marcadores es específico de CMM, ya

que también han sido detectados en células mesenquimales

diferenciadas, endoteliales y epiteliales. Hasta la fecha no se ha

identificado un único marcador que caracterice definitivamente este

tipo de células (Shanti RM y cols. 2007).

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37

2.7 Diferenciación

Las CMM son capaces de dar lugar a células de origen

mesodérmico como condrocitos (Pittenger MF y cols. 1999),

osteoblastos (Pittenger MF y cols. 1999), (Rodriguez-Lozano FJ y

cols. 2012), adipocitos (Pittenger MF y cols. 1999), mioblastos

(Wakitani S y cols. 1995), células de tendón (Altman GH y cols.

2002), odontoblastos (Gronthos S y cols. 2000), (Miura M y cols.

2003) y cementoblastos (Kemoun P y cols. 2007). Se pensaba que las

células madre adultas se podían diferenciar hacia un linaje celular en

concreto, pero se ha observado que se pueden transdiferenciar, es

decir, se les puede inducir pluripotencialidad (Song L y Tuan RS

2004). De esta manera, CMM pueden dar lugar a células con

propiedades biológicas y morfológicas de células ectodérmicas

derivadas de tejido neuronal (Azizi SA y cols. 1998), (Kopen GC y

cols. 1999) o células ameloblásticas (Hu B y cols. 2006).

2.8 Células madre mesenquimales de origen

dental

2.8.1 Células madre de pulpa dental (CMPD)

El primer tipo de células madre dentales fueron aisladas de la

pulpa por Gronthos y cols. (Gronthos S y cols. 2000) en el año 2000.

Fueron extraídas de terceros molares humanos y además de demostrar

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38

capacidad clonogénica, fueron capaces de diferenciarlas hacia

odontoblastos, y de formar el complejo dentinopulpar cuando fueron

implantadas subcutáneamente en ratas inmunocomprometidas. Se

observó que estas células presentaban un mayor porcentaje de

proliferación que las células madre mesenquimales de médula ósea

(Shi S y cols. 2001). También se han aislado células madre de pulpa

dental (CMPD) de ratones (Mina M y Braut A 2004), ratas (Zhang W

y cols. 2005) o perros (Iohara K y cols. 2004). Las CMPD no solo se

pueden obtener de dientes sanos, sino también de dientes con pulpitis

irreversible (Wang Z y cols. 2010). Estas CMPD de pulpas con

patología muestran menor formación de colonias y proliferación, pero

similar expresión del marcador STRO-1 e inducción odontogénica ex

vivo. Los autores concluyeron que las pulpas dentales clínicamente

comprometidas deben contener células putativas con propiedades de

células madre. Alongi y cols. (Alongi DJ y cols. 2010) también

estudiaron células madre procedentes de pulpas inflamadas. Éstas

expresaron mayores niveles de los marcadores STRO-1, CD-90, CD-

105 y CD-146 que las células de pulpas normales. Las células de

ambos tipos de pulpas fueron positivas para CD-146, antígeno

específico embrionario fase 4 (SSEA-4) y CD-166. La capacidad de

duplicación y la capacidad osteo/dentinogénica fueron mayores en las

células de las pulpas normales. Sin embargo las células de ambos tipos

de pulpa fueron capaces de formar el complejo dentino-pulpar de

forma similar in vivo.

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39

Murray y cols. (Murray PE y cols. 2002) en 2002 publicaron un

estudio para evaluar los cambios en la densidad de las células pulpares

(odontoblastos y subodontoblastos) en lo que denominaron la zona

inmadura de la pulpa (apical) respecto a la madura (coronal). Encontraron

menor densidad de odontoblastos y subodontoblastos en ambas regiones

en las ratas más viejas. Esta reducción de los odontoblastos fue mayor en

la zona inmadura.

Las CMPD, además de hacia odontoblastos (Gronthos S y cols.

2000; Zhang W y cols. 2006), se han podido diferenciar hacia adipocitos

(Zhang W y cols. 2006), (Gronthos S y cols. 2002), neuronas (Zhang W y

cols. 2006), (Gronthos S y cols. 2002), hueso (Laino G y cols. 2006),

(Zhang W y cols. 2006), músculo (Laino G y cols. 2006), (Papaccio G y

cols. 2006), (Zhang W y cols. 2006) o condrocitos (Zhang W y cols.

2006). Yu y cols. (Yu J y cols. 2010) observaron que las CMPD STRO-1

positivas se diferenciaron hacia odontoblastos, osteoblastos y adipocitos,

pero las mismas células después de 9 pases solo pudieron hacerlo hacia

osteoblastos. Recientemente se ha demostrado que la presencia de

osteoblastos, diferencia las CMPD hacia linaje osteogénico. Además, las

CMPD cultivadas con osteoblastos, presentaban una proliferación mayor

que las cultivadas en ausencia de estos (Wang Y y cols. 2012).

En la Figura 2.4 se representa esquemáticamente el origen y la

diferenciación de CMPD.

También se han realizado estudios para evaluar la influencia de

la presión de O2 en la proliferación del cultivo de CMPD. Sakdee y

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Revisión bibliográfica

40

cols. (Sakdee JB y cols. 2009) compararon la proliferación de células

pulpares a distintas presiones de O2. Demostraron que las células

proliferaban más al 3% que al 20%. El marcador CD133 decrecía al

3% de O2 mientras que el STRO-1 aumentaba.

Li y cols. (Li L y cols. 2011) evaluaron la viabilidad y la

capacidad de las células pulpares de formar tejido mineralizado.

Observaron mejores resultados al 5% que al 21%. Wang y cols.

(Wang J y cols. 2010) observaron que las CMPD proliferaban menos

en condiciones de isquemia (2% de O2) a las 24 y 48 horas.

Figura 2.4. Representación esquemática del origen histológico y la diferenciación

de CMPD.

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41

2.8.2 Células madre de otros tejidos dentales

Además de las CMPD, se han aislado células madre de otros

tejidos dentales humanos como el ligamento periodontal (Gronthos S

y cols. 2000) (Figura 2.5A), o CMM obtenidas a partir de dientes

deciduos (Miura M y cols. 2003) (Figura 2.5B).

Figura 2.5 A: Pulpa dental de un canino temporal superior derecho. B: Ligamento

periodontal obtenido con una cureta tras la exodoncia.

Estas células madre de dientes deciduos son capaces de formar

dentina in vivo al ser trasplantadas subcutáneamente en ratas

(Cordeiro MM y cols. 2008). Recientemente se ha demostrado la

presencia de CMM en la papila apical (Sonoyama W y cols. 2008),

tejido derivado del ectomesénquima, que inducido por la lámina

dental, tiene como función el desarrollo de las raíces durante la

odontogénesis (Figura 2.6).

A B

A B

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Revisión bibliográfica

42

Figura 2.6. A: Imagen de papila apical de un tercer molar en periodo de desarrollo.

B: Este tejido se desprende fácilmente con la ayuda de una cureta.

Estas CMM de la papila apical también han demostrado

potencial dentinogénico, adipogénico, y neurogénico cuando son

tratadas con los respectivos estímulos (Sonoyama W y cols. 2006). Al

comparar las propiedades de las células madre de la papila apical con

CMPD, se observó que las células madre de la papila apical, obtenidas

del mismo diente y cultivadas con las mismas condiciones, mostraron

mayor tasa de proliferación, mayor capacidad de regeneración tisular

y mayor número de células STRO-1 positivas, es decir, mayor

capacidad clonogénica. Además, las células madre de la papila apical

expresan un nivel más alto de supervivencia, pues tienen una tasa de

apoptosis menor y son positivas para telomerasa (hTERT), lo cual

significa que tienen una tasa de duplicación mayor. Sin embargo, las

CMM no presentan estas características (Sonoyama W y cols. 2008).

En 2005, Morsczeck y cols. (Morsczeck C y cols. 2005) aislaron

células madre del folículo dental (Figura 2.7). Estas células tienen un

potencial alto de proliferación, y se diferencian hacía odontoblastos y

cementoblastos.

A B

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43

Figura 2.7. Imagen de un tercer molar tras su extracción con su folículo dental.

Recientemente se han aislado CMM de tejido inflamatorio

periapical procedente de infecciones odontógenas. Estas células

fueron positivas para los marcadores de CMM STRO-1, CD90 y

CD146. Tras el segundo pase, las células mostraron niveles bajos de

STRO-1 y CD146 y moderados de CD90, CD73 y CD105. Además,

mostraron capacidad osteogénica pero no adipogénica. In vivo, estás

células formaron tejido mineralizado en ratas inmunocomprometidas

(Liao J y cols. 2011).

Se ha conseguido reprogramar CMM obtenidas a partir de

pulpa dental, dientes deciduos y papila apical. Así, estas células

adquieren pluripotencialidad y son capaces de dar lugar a cuerpos de

naturaleza embrionaria y teratomas in vivo con las 3 capas

embrionarias (Yan X y cols. 2009).

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44

2.9 Caracterización de CMPD

No existe un marcador que caracterice exclusivamente las

CMPD. Estas células son positivas para c-kit (receptor de membrana

tirosina-kinasa que interacciona con el factor de célula madre. Se

expresa en células derivadas de cresta neural), STRO-1 (marcador de

célula madre de estroma, que reconoce el antígeno de células

perivasculares, y que en la médula ósea contiene precursores

osteogénicos) y CD34 (marcador de célula madre pluripotente tanto

de estroma como hematopoyético) (Laino G y cols. 2006). A su vez

son negativas para CD44 (detecta células de origen mesenquimal

diferenciadas adheridas), CD45 (células hematopoyéticas) y CD14

(marcador monocítico) (Papaccio G y cols. 2006). Kerkis y cols.

(Kerkis I y cols. 2006) cultivaron células madre de dientes deciduos

positivas para marcadores de células madre embrionarias como OCT-

4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, implicando la

pluripotencialidad de estas células. Atari y cols. (Atari M y cols. 2011;

Atari M y cols. 2012) también demostraron la pluripotencialidad de

las CMPD al observar que estas células eran positivas para

marcadores de células madre embrionarias: SSEA-4, Oct4, Nanog,

FLK-1, HNF3beta, Nestin, Sox2, Lin28, c-Myc, CD-13, CD-105, CD

90 (bajo), CD-29, CD-73 (bajo), STRO-1 (bajo); y negativas para:

CD-3, CD-45 y CD-146.

Existen indicios de que una población heterogénea de CMPD

reside en la pulpa dental (Gronthos S y cols. 2000; Shi S y Gronthos S

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45

2003). Recientemente Waddington y cols. (Waddington RJ y cols.

2009) aislaron 2 estirpes diferentes de CMPD de ratas mediante

distintos protocolos de cultivo. Cultivaron células madre, derivadas de

cresta neural y positivas para STRO 1, CD31 (células madre adultas),

LANGFR (células derivadas de cresta neural), CD105 y Notch 2

(marcadores de superficie de células endoteliales). Por otra parte,

cultivaron células madre derivadas de médula ósea, y solo positivas

para STRO 1 y CD31, FBN (fibronectina). Por tanto parece que se

pueden diferenciar dos tipos de células madre en la pulpa dental.

Las CMPD al diferenciarse a osteoblastos siguen siendo

positivas para STRO 1, pero negativas para CD34 y c-kit. También

son positivas para ALP, calcein, osteonectina, CD54 CD44 y RUNX-

2 (Papaccio G y cols. 2006). Además se demostró que las CMPD

también reconocen estos marcadores tras dos años de criopreservación

(Papaccio G y cols. 2006). En la Tabla 2.1 se resume estos

marcadores y sus características.

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46

Marcador

Origen

de las

células

Caracterización Características

c-kit

CMPD

de

humanos

+ (Laino G y

cols. 2006)

Receptor de membrana tirosina-

kinasa. Interacciona con factor de

célula madre. Se expresa en

células de cresta neural

STRO-1

CMPD

de

humanos

+ (Laino G y

cols. 2006)

Marcador de célula madre de

estroma, que reconoce el antígeno

de células perivasculares, y que en

la médula ósea contiene

precursores osteogénicos

CD34

CMPD

de

humanos

+ (Laino G y

cols. 2006)

Marcador de célula madre

pluripotente tanto de estroma

como hematopoyético

CD44

CMPD

de

humanos

- (Papaccio G y

cols. 2006)

Detecta células de origen

mesenquimal diferenciadas

adheridas

CD45

CMPD

de

humanos

- (Papaccio G y

cols. 2006)

Marcador de células

hematopoyéticas

CD14

CMPD

de

humanos

- (Papaccio G y

cols. 2006) Marcador monocítico

OCT-4

Nanog

CMDD

de

humanos

+ (Kerkis I y

cols. 2006)

Marcadores de células madre

embrionarias

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47

SSEA-3

SSEA-4

TRA-1-

60

TRA-1-

81

LANGFR CMPD

de ratas

+ (Waddington

RJ y cols.

2009)

Células derivadas de cresta neural

NESTIN

CMPD

de

humanos

+ (Atari M y

cols. 2011)

Proteína de función desconocida

que se expresa en

CM neuroectodérmicas

CD31 CMPD

de ratas

+ (Waddington

RJ y cols.

2009)

Células madre adultas

CD 105

Notch 2

CMPD

de ratas

y

humanos

+ (Waddington

RJ y cols.

2009)

Marcadores de superficie de

células endoteliales que se

expresan en CMM

Tabla 2.1. Marcadores de células madre de pulpa dental.

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48

2.10 Estudios in vitro sobre células madre y

biomateriales de regeneración ósea

Distintos estudios in vitro han evaluado la interacción de CMM de

médula ósea sobre biomateriales de regeneración ósea, como titanio o

membranas de regeneración tisular. Herten y cols. (Herten M y cols. 2009)

estudiaron la viabilidad de CMM de médula ósea sobre distintos

biomateriales de regeneración ósea a las 2 horas, y a los 3, 6, 10, y 14 días.

Observaron crecimiento celular sobre los siguientes biomateriales:

hidroxiapatita con colágeno residual (Tutodent®), β-fosfato tricálcico

(Cerasorb®) y hidroxiapatita enriquecida con péptido p-15 (PepGen P-

15®). La viabilidad fue menor sobre α-fosfato tricálcico (BioBase®) y no

se observó viabilidad sobre hueso bovino desproteinizado (Bio-Oss®) e

hidroxiapatita nanocristalina (Ostim®). Lock y cols. (Lock J y cols. 2012)

observaron que CMM se adherían sobre hidroxiapatita láctido co-glicolido

y se produjo una diferenciación osteogénica de estas células tanto en

presencia como en ausencia de factores osteogénicos en el medio de

cultivo. Mrozik y cols. (Mrozik KM y cols. 2011) cultivaron células madre

de médula ósea sobre hidroxiapatita y una proteína de matriz de esmalte.

No encontraron una gran evidencia de formación ósea ectópica al

implantar subcutáneamente en una rata el biomaterial con las células

madre. Liu y cols. (Liu Q y cols. 2011) cultivaron células madre de

médula ósea sobre membranas de colágeno. Observaron a los 4 días, mejor

proliferación sobre las membranas que sobre placa de cultivo. A los 7 días

de cultivo mediante microscopía electrónica, observaron una gran

proliferación celular sobre las membranas. Catledge y cols. (Catledge SA

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49

y cols. 2004) cultivaron CMM de médula ósea sobre películas de

partículas depositadas de cerámica metálica nanoestructurada y discos de

titanio de plasma nitrados cubiertos en medio sin suero durante una hora

(grupo estudio) y sin cubrir previamente con suero bovino fetal (grupo

control). Observaron que en el grupo estudio, las células madre se

extendieron sobre ambos biomateriales.

Se han utilizado distintas metodologías para evaluar la interacción

de estas células sobre biomateriales. Roldán y cols. (Roldan JC y cols.

2010) evaluaron la polarización y migración de CMM sobre xenoinjerto,

fosfato tricálcico y fosfato cálcico mediante microscopía confocal.

Observaron que las células polarizadas migraban hacia el biomaterial.

También se ha observado la proliferación celular contando el DNA

(Oliveira JM y cols. 2006). Hasegawa y cols. (Hasegawa T y cols. 2010)

cultivaron CMM de médula ósea sobre β-fosfato tricálcico; evaluaron la

proliferación celular mediante 4 formas distintas de cultivo: mojando el

biomaterial, a baja presión, pipeteando o con sistema de jeringas.

Observaron que el mayor número de células contenidas sobre el

biomaterial se obtuvo con jeringas. Además, mediante este sistema,

después de 2 semanas, se observó el mayor potencial de osteoinducción in

vitro, y a las 8 semanas, también in vivo.

También se ha estudiado la proliferación de células madre

procedentes de otros tejidos sobre biomateriales. De Girolamo y cols. (De

Girolamo L y cols. 2008) observaron que células madre de tejido adiposo

se adherían a hidroxiapatita, fragmentos óseos humanos hueso bovino

desproteinizado y titanio. Heo y cols. (Heo YY y cols. 2010) cultivaron

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50

células madre de ligamento periodontal sobre discos de titanio liso

maquinado, chorreado con partículas de Al2O3. Observaron mayor

proliferación y expresión de osteoclacina sobre titanio con superficie

rugosa. Tete y cols. (Tete S y cols. 2007) estudiaron, mediante

microscopía electrónica, la interacción de células madre de folículo dental

sobre hueso bovino desproteinizado (Bio-Oss®) a la semana y a las 3-6

semanas (una vez diferenciadas a osteoblastos). Observaron que las células

del cultivo primario tenían una morfología similar a CMM de médula

ósea. Además, una vez diferenciadas presentaron un fenotipo típico de

osteoblastos y una organización tridimensional y deposición de matriz

extracelular en contacto con el biomaterial.

2.11 Estudios in vivo sobre células madre en

regeneración ósea

La ingeniería tisular es un campo emergente interdisciplinar, que

aplica los principios de las ciencias biológicas y de ingeniería para el

desarrollo de sustitutos biológicos que restauren, mantengan y mejoren la

función de tejidos dañados y/o perdidos (Langer R y Vacanti JP 1993). En

ingeniería de tisular, las matrices son necesarias para dar soporte a células

u otras estructuras. Las matrices están hechas de material biodegradable,

que es un producto biocompatible que es reabsorbido gradualmente una

vez implantado en el cuerpo, generalmente debido a degradación

enzimática (Fuchs JR y cols. 2005). En los siguientes apartados se revisan

los estudios más relevantes en animales y humanos sobre regeneración

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51

ósea y CMM. Todos los estudios mencionados aplican los principios de

ingeniería tisular con células madre. Con lo cual, se usan distintas matrices

como xenoinjertos (Jafarian M y cols. 2008), fluorhidroxiapatita (Pieri F y

cols. 2009) o fibrina (Ito K y cols. 2006). En diferentes estudios (Yamada

Y y cols. 2004b), (Yamada Y y cols. 2004a), el PRP se utiliza a modo de

matriz como vehículo para las células madre, pero también, como material

de injerto para evaluar su potencial de regeneración.

2.11.1 Regeneración ósea alveolar

Estudios en animales

Diferentes estudios han comparado la regeneración ósea utilizando

CMM y PRP. Yamada y cols. (Yamada Y y cols. 2004b) en defectos

mandibulares de 10 mm, 8 semanas después de injertar, mostraron que las

CMM y PRP fueron tan eficaces como el hueso particulado autólogo (67%

y 61% de hueso regenerado respectivamente); el PRP produjo un 29% de

formación ósea y los casos no regenerados un 18%.

Sobre crestas

edéntulas en minicerdos, Pieri y cols. (Pieri F y cols. 2009) observaron

mayor formación ósea con hueso autógeno (47%) o CMM, PRP y

fluorhidroxiapatita (45%) que con el PRP y fluorhidroxiapatita (38%).

Yoshimi y cols. (Yoshimi R y cols. 2009) demostraron efectos similares en

perros. Además, Yamada y cols. (Yamada Y y cols. 2010) evaluaron la

regeneración ósea en defectos mandibulares con CMM de médula, CMPD,

y células madre de dientes deciduos de sus cachorros; observaron

formación de hueso con los 3 grupos en comparación con los controles

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52

(vacío o PRP). Concluyeron que las CMM de dientes deciduos pueden

tener el potencial de generar un injerto entre padres e hijos.

Mylonas y cols.

(Mylonas D y cols. 2007) aplicaron CMM en

defectos de 5 mm con una morfología de 3 paredes y realizaron el análisis

histomorfométrico en dos momentos diferentes. Cuatro semanas después

del injerto, la regeneración ósea fue mayor en el grupo de CMM (58%)

que en los controles (43%). Después de 3 semanas más, los resultados

histomorfométricos fueron similares en ambos grupos (63% y 60%

respectivamente). Estos resultados mostraron que, aunque la regeneración

ósea se produce cuando las condiciones necesarias estuvieron presentes,

las CMM aceleran el proceso.

Otros estudios revelaron que las CMM también pueden acelerar la

formación ósea en alveolos (De Kok IJ y cols. 2005), (Marei MK y cols.

2005), defectos mandibulares de 10 mm (Jafarian M y cols. 2008), o

defectos mayores (2x2 cm) (Abukawa H y cols. 2004).

Estudios clínicos humanos

Meijer y cols. (Meijer GJ y cols. 2008) implantaron CMM para

regenerar defectos de hueso alveolar en 6 pacientes. Cuatro meses

después, se observó regeneración ósea en 3 de ellos. Los autores

especificaron que sólo en un caso, la regeneración se llevó a cabo por las

CMM, ya que la formación de hueso se produjo a más de 7 mm separado

de las paredes óseas. Fracasó un implante de los 11 colocados en 5

pacientes. d'Aquino y cols. (d'Aquino R y cols. 2009) realizaron un ensayo

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53

clínico para evaluar la regeneración ósea de CMPD en alvéolos

postextracción de terceros molares impactados. Colocaron una esponja de

colágeno con CMPD y compararon la regeneración con aquellos alveolos

no injertados. El análisis radiográfico y la profundidad de sondaje

mostraron mejores resultados en el grupo estudio. Tres meses después de

la cirugía, el análisis histológico mostró hueso bien vascularizado con

arquitectura laminar en el grupo estudio, mientras que los alveolos control

estaban inmaduros, con hueso fibroso.

2.11.2 Elevación de seno maxilar

Estudios en animales

Se han realizado estudios controlados en animales usando CMM

para aumentar la regeneración ósea en elevaciones de seno maxilar. Pieri y

cols. (Pieri F y cols. 2008) en un estudio a boca

partida, realizaron 16 elevaciones de seno maxilar en 8 minicerdos.

Colocaron CMM, PRP y fluorhidroxiapatita en un lado, y

fluorhidroxiapatita en el otro. Doce semanas más tarde, observaron un

42% de hueso regenerado en los injertos con CMM y un 19% en los

controles. Sauebier y cols. (Sauerbier S y cols. 2010) en un estudio en

ovejas demostraron que las CMM aceleran la regeneración ósea en

comparación con xenoinjerto solo. En otros estudios (Ohya M y cols.

2005), (Gutwald R y cols. 2009), 8 semanas después de la intervención, la

regeneración ósea fue similar injertando CMM o autoinjerto particulado.

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54

Estudios clínicos en humanos

Se han realizado estudios de series de casos utilizando CMM con

diferentes biomateriales. Shayesteh y cols. (Shayesteh YS y cols. 2008)

realizaron un estudio clínico 6 pacientes, donde utilizaron CMM y beta-

fosfato tricálcico e hidroxiapatita como material de injerto en elevaciones

de seno maxilar con menos de 3 mm de hueso residual. Tres meses

después, el estudio histomorfométrico mostró un 41% de hueso

regenerado. Se colocaron en 30 implantes en las áreas injertadas de los

cuales 2 fracasaron.

Otros autores (Smiler D y cols. 2007), realizaron elevación de seno

maxilar e injertos onlay con CMM y xenoinjerto o aloinjerto en 5

pacientes. Observaron regeneración ósea en las zonas injertadas mediante

el análisis histológico y histomorfométrico. McAllister y cols. (McAllister

BS y cols. 2009) realizaron elevaciones de seno directas a 5 pacientes con

CMM y aloinjerto y vieron un 33% de hueso vital a los 4 meses. No se

detalló la supervivencia de los implantes.

Gonshor y cols. (Gonshor A y cols. 2011) en un estudio controlado,

compararon la regeneración ósea injertando aloinjerto y CMM o aloinjerto

solo; observaron 3,7 meses después, un 32,5% de hueso vital en el grupo

celular en comparación con el 18,3% del control.

Recientemente, se llevó a cabo el único ensayo clínico en el que se

evaluó el potencial de las CMM en elevación de seno maxilar. Rickert y

cols. (Rickert D y cols. 2010) diseñaron un estudio a boca partida en 12

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55

pacientes, en los cuales injertaron aleatoriamente un seno maxilar con

xenoinjerto y CMM y otro con xenoinjerto (70%) y hueso autólogo (30%).

Quince semanas después, el análisis hitomorfométrico mostró

significativamente más formación ósea en el grupo de CMM (18%) que en

el control (12%).

2.11.3 Regeneración ósea periimplantaria

Estudios en animales

Estudios en animales han evaluado las CMM combinadas con PRP

con el fin de mejorar la regeneración ósea periimplantaria. Yamada y cols.

(Yamada Y y cols. 2004a) regeneraron dehiscencias óseas creadas

artificialmente con CMM y PRP, solo PRP, autoinjerto o controles no

regenerados. Dos meses después, los implantes se colocaron en las zonas

regeneradas, y después de 2 meses más, se realizó el estudio

histomorfométrico. En los casos regenerados con CMM y PRP o con

autoinjerto, la altura ósea se mantuvo constante. Sin embargo, en los casos

regenerados con PRP solo o no regenerados (controles), se produjo la

exposición de las espiras del implante. Ito y cols. (Ito K y cols. 2006)

realizaron un estudio similar en el que colocaron los implantes en hueso

con defectos regenerados con los siguientes materiales de injerto: CMM

con PRP y fibrina, CMM con fibrina, fibrina o no regenerado. La mejor

regeneración ósea periimplantaria y el mayor contacto hueso-implante se

produjo cuando se utilizó CMM con PRP y fibrina.

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56

Diferentes estudios han evaluado el potencial de regeneración de

CMM obtenidas de diferentes tejidos. Ito y cols. (Ito K y cols. 2011)

compararon la osteointegración de implantes en hueso regenerado

mediante CMPD, CMM de médula ósea y células de periostio. Crearon

defectos mandibulares que fueron rellenados con células de una de estos

tres tejidos utilizando PRP como matriz. Ocho semanas después, se

colocaron los implantes, y tras otras 8 semanas, se evaluó el porcentaje de

unión hueso-implante. Los resultados mostraron un 67%, 62% and 39 %

de contacto hueso-implante para las CMPD, CMM de médula ósea y

células de periostio respectivamente. En los grupos de células madre

observaron hueso vital mientras que en el de células del periostio y el

grupo no regenerado encontraron tejido fibroso. Kim y cols. (Kim SH y

cols. 2009) observaron mayor regeneración ósea periimplantaria al injertar

los defectos con CMM de médula ósea que con CMM de ligamento

periodontal (35 y 32% de hueso regenerado respectivamente).

2.11.4 Distracción alveolar

Estudios en animales

Qi y cols. (Qi M y cols. 2006) analizaron el efecto las CMM en la

regeneración ósea en 40 ratas; una vez finalizada la distracción, el hueco

se infiltró con CMM o con solución salina fisiológica. En ambos grupos se

observó formación ósea, pero, a los 27 y 55 días tras el inicio de la

distracción, se observó mayor radiodensidad y formación ósea en el grupo

de CMM. Kinoshita y cols. (Kinoshita K y cols. 2008) estudiaron el efecto

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57

de las CMM y PRP sobre la formación ósea en distracciones alveolares

realizadas a 12 conejos. El estudio radiológico y morfométrico se realizó

2, 3 y 4 semanas tras la distracción. Se obtuvieron mejores resultados

cuando el hueco se infiltró con CMM y PRP que con solución salina

fisiológica o PRP sólo.

En la Tabla 2.2 se detallan los resultados de los estudios.

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58

Tipo

de cirugía

Tipo de

estudio

Autores y año de

publicación

Estudio histológico/

porcentaje de hueso regenerado

Comentarios

Regeneración

ósea alveolar

Estudios

controlados

en animales

(Yamada Y y cols.

2004b)

CMM y PRP: 67%;

Autógeno: 61%; PRP: 29%

No regenerado: 18%

Defectos 10 mm. Diferencias significativas

entre CMM/PRP, autoinjerto y controles

(Pieri F y cols. 2009) CMM+PRP+fluorohidroxiapatita(FHA):

45%;

Autógeno: 47%; PRP + FHA: 38%; FHA: 36%

Defectos de 3.5x8 mm. Resultados

similares injertando CMM que

autoinjerto.

(Yoshimi R y cols. 2009) PuraMatrix+CMM+PRP: 58%

PuraMatrix+CMM: 50%

PuraMatrix+PRP: 28% PuraMatrix: 25%

No regenerado: 12% (8 semanas)

Los grupos con CMM obtuvieron mejores

resultados que control, PuraMatrix®, o

PuraMatrix + PRP

(Yamada Y y cols. 2010)

Control: 19.0%; PRP: 19.7%;

CMM+PRP: 52.8%

CMPD+PRP: 61.6%;

CMM dientes deciduos

cachorros+PRP: 54.7%

CMM de dientes deciduos tienen el potencial de

crear un injerto entre padre e hijos.

(Mylonas D y cols. 2007) Control: 43% (4 semanas) 60% (7 semanas)

Estudio: 58% (4 semanas) 63% (7 semanas)

Defectos de 5mm con morfología de 3 paredes.

Las CMM aceleran el proceso de regeneración ósea.

(De Kok IJ y cols. 2005) HA/fosfato tricálcico+CMM: 34%;

HA/fosfato tricálcico:25%;

Controles: 35%

La implantación de CMM no produjo inflamación.

(Marei MK y cols. 2005) Estudio histomorfométrico a los 4 meses Regeneración y preservación del alveolo

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59

(Jafarian M y cols. 2008) Kasios® + MSC: 65%; Kasios®: 44%

Bio-Oss®+ MSC: 50%;

Bio-Oss®:36% (6 semanas)

Defectos mandibulares de 10 mm. Los biomateriales

óseos tienen efecto en la regeneración ósea con

CMM.

(Abukawa H y cols. 2004) Matriz sola: Formación ósea periférica

No regenerado: Fino puente óseo

Matriz y células madre: defecto

completamente regenerado

Defectos de 2x2 cm.

Serie de

casos en

humanos

(Meijer GJ y cols. 2008) Seis pacientes. 4 meses después de la

cirugía: Hueso regenerado por CMM

en un caso

Se cultivaron y expandieron CMM sobre un

biomaterial óseo durante 7 días.

Estudio

prospectivo

controlado en

humanos

(d'Aquino R y cols. 2009) Grupo estudio: hueso vascularizado con

arquitectura laminar

Grupo control: inmaduros, con hueso

fibroso.

CMPD en alveolos postextracción de terceros molares

Elevación

de seno

maxilar

Estudios

controlados

en animales

(Pieri F y cols. 2008) CMM+PRP+fluorohidroxiapatita: 42% (12

semanas)

Fluorohidroxiapatita: 19% (12 semanas)

Estudio a boca partida (16 elevaciones de seno a 8

minicerdos)

(Sauerbier S y cols. 2010) Formación ósea significativamente

(p = 0,027) más rápida en el grupo estudio

Estudio histológico a las 8 y 16 semasnas.

La terapia con CMM permitió la colocación más

temprana de implantes.

(Ohya M y cols. 2005) CMM+PRP: 29, 24 y 21%

(2, 4 and 8 semanas)

Estudio a boca partida en 18 conejos japoneses

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60

Autoinjerto+PRP: 35, 28 and 21%

(2, 4 y 8 semanas)

(Gutwald R y cols. 2009) CMM: 19% (8 semanas), 29% (16 semanas)

Autoinjerto: 20% (8 semanas),

16% (16 semanas)

CMM combinadas con xenoinjerto tienen la

capacidad de formar hueso

Serie de

casos en

humanos

(Shayesteh YS y cols.

2008)

41% de hueso regenerado (3 meses) Menos de 3 mm de hueso residual. Seis pacientes.

(Smiler D y cols. 2007) CMM con xenoinjerto o injerto aloplástico 5 pacientes. Medula ósea aspirada de cresta iliaca.

(McAllister BS y cols.

2009)

CMM con aloinjerto: 33% (4 meses) 5 pacientes.

Estudio

prospectivo

controlado en

humanos

(Gonshor A y cols. 2011) CMM con aloinjerto: 32.5%;

Aloinjerto solo: 18.3%

Colocación más temprana de implantes cuando se

utiliza injerto celular

Ensayo clínico (Rickert D y cols. 2010) Xenoinjerto con CMM: 18% (15 semanas)

Xenoinnjerto con autoinjerto: 12% (15

semanas)

Estudio a boca partida en 12 pacientes.

Regeneración

ósea

periimplantaria

Estudios

controlados

(Yamada Y y cols. 2004a) CMM+ PRP: 79%; Autoinjerto: 70%

PRP: 68%; No regenerado: 63%

Defectos artificiales regenerados previo a la

colocación de implantes

(Ito K y cols. 2006) Formación ósea mayor a las 2, 4 y

8 semanas cuando se utilizaron CMM

Mejor porcentaje contacto hueso-implante con

CMM+PRP+fibrina

(comparado con controles)

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Revisión bibliográfica

61

Tabla 2.2. Resumen de los resultados sobre la aplicación de células madre en regeneración ósea en implantología.

en animales (Ito K y cols.) 2011 CMPD+PRP y autoinjerto+CMM+PRP:

Hueso Células periostales+PRP:

Tejido fibroso

Hueso formado con CMPD mostró mayor

contacto hueso-implante que

hueso formado con CMM de médula ósea

(Kim SH y cols. 2009) CMM de medula ósea: 35%

CMM de ligamento periodontal: 32%

CMM de ligamento periodontal y de médula ósea.

Distracción

alveolar

Estudios

controlados

en animales

(Qi M y cols. 2006) Mayor regeneración con CMM que con

suero fisiológico en hueco de distracción

Las CMM aceleran la formación ósea comparado con

controles

(Kinoshita K y cols. 2008) Mayor regeneración con CMM que con

suero fisiológico en hueco de distracción

Las CMM con PRP aceleran la formación

ósea comparado con controles

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Revisión bibliográfica

62

2.12 ¿Existen otros factores o proteínas útiles

para aumentar la regeneración ósea?

Una serie de sustancias se han utilizado con el objetivo de

aumentar la regeneración ósea, como la hormona del crecimiento (Gomez-

Moreno G y cols. 2009), la hormona paratiroidea (Valderrama P y cols.

2010), o la melatonina (Calvo-Guirado JL y cols. 2010), pero hay dos en

particular, las proteínas morfogenéticas óseas (cuyas siglas en inglés son

BMP) y el PRP, que requieren atención debido a la cantidad de los

estudios que se han realizado.

2.12.1 Proteínas morfogenéticas óseas

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), una subfamilia del

factor de crecimiento transformante-beta, fueron descubiertas basándose

en su actividad inductiva en la matriz ósea (Urist MR 1965). Un estudio en

ratas demostró que esta proteína es indispensable para la iniciación de la

cicatrización ósea tras una fractura (Tsuji K y cols. 2006). Una de estas

proteínas, la BMP-2 (rhBMP2) ha demostrado ser segura en humanos

(Boyne PJ y cols. 1997), (Howell TH y cols. 1997) e inducir la formación

ósea en el esqueleto (Friedlaender GE y cols. 2001).

Una revisión sistemática reciente sobre los factores de crecimiento

para el aumento alveolar mostró que rhBMP2 es más efectiva que la

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Revisión bibliográfica

63

BMP7, PDGF y PTH para promover la regeneración ósea (Jung RE y cols.

2008).

Estudios controlados en animales han validado los beneficios de la

ingeniería ósea con BMP2 para la regeneración ósea periimplantaria. Se ha

demostrado que la BMP2 estimula la formación de hueso supra-alveolar en

defectos verticales alrededor de implantes (Sigurdsson TJ y cols. 1997), en

la regeneración de las lesiones preiimplantarias (Hanisch O y cols. 1997b)

y en la osteointegración del implante en hueso injertado (Hanisch O y cols.

1997a; Hanisch O y cols. 1997c). Un estudio reciente en perros (Wikesjo

UM y cols. 2008) demostró que los implantes recubiertos con BMP2

inducían la formación de hueso en defectos peri-implantarios supra-

alveolares de 5 mm, sin el uso de biomateriales óseos.

También hay estudios en humanos evaluando las ventajas de la

BMP2 para la regeneración ósea. Existe una clara evidencia científica,

incluyendo estudios controlados (Boyne PJ y cols. 2005), (Boyne PJ y

cols. 1997) de las ventajas del BMP2 en la elevación de seno maxilar. El

hueso inducido con BMP2 tiene propiedades ultraestructurales muy

similares a la de autoinjertos óseos. Numerosos estudios (Howell TH y

cols. 1997), (Fiorellini JP y cols. 2005), (Jung RE y cols. 2003) se han

realizado en humanos con BMP2 para la preservación de cresta. Se ha

demostrado que la BMP2 puede estimular la formación de un tipo de hueso

muy similar al nativo.

Muchos estudios se han llevado a cabo utilizando diferentes

matrices para promover la regeneración ósea. Entre las más destacadas

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Revisión bibliográfica

64

están las xenogénicas (Jung RE y cols. 2009), (Jung RE y cols. 2003),

alogénicas (Sigurdsson TJ y cols. 2001), fosfato de calcio (Wikesjo UM y

cols. 2002), matriz de glicol de polietileno que contienen

hidroxiapatita/fosfato tricálcico (Wikesjo UM y cols. 2002) y la matriz

cerámica de colágeno (Yamashita M y cols. 2010). A pesar de todos estos

estudios, los investigadores no han llegado a una conclusión clara sobre

cual es la mejor matriz y por lo tanto más investigación es necesaria en

este campo. Una cuestión fundamental que hay que responder es si los

biomateriales de reabsorción lenta o no-reabsorción comprometen la

regeneración ósea (Huang YH y cols. 2008).

2.12.2 Plasma rico en plaquetas

El PRP también es un agente muy estudiado en el campo de la

regeneración ósea. Se define como una concentración autóloga de

plaquetas en un pequeño volumen de plasma. En la actualidad, hay una

falta de evidencia científica en la literatura a favor o en contra del uso

clínico del PRP para la regeneración ósea. Una revisión sistemática

publicada en 2008 (Plachokova AS y cols. 2008) concluyó que hay

evidencia de efectos beneficiosos del PRP en el tratamiento de defectos

periodontales, pero los beneficios para la elevación de seno parecen ser

débiles. Esta revisión confirmó que no se pueden sacar conclusiones sobre

otras aplicaciones del PRP en odontología. Los autores también señalaron

que muchos estudios sobre este tema no se ajustan a las recomendaciones

actuales sobre la calidad de estudio basado en los elementos de evaluación

de Montenegro y cols. (Montenegro R y cols. 2002). Boyapati y Wang

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Revisión bibliográfica

65

(Boyapati L y Wang HL 2006) están de acuerdo en que no hay pruebas

suficientes para apoyar el uso de PRP para la elevación de seno y que la

mayoría de los estudios realizados tienen diseños inadecuados. Distintos

estudios han evaluado la influencia del PRP en la regeneración ósea;

mientras que algunos (Yamada Y y cols. 2004b), (Dallari D y cols. 2006),

(Aghaloo TL y cols. 2005) no han encontrado mejoras en la formación

ósea, otros (Anitua E 1999), (Sammartino G y cols. 2005) mostraron

resultados favorables. Un estudio reciente realizado en conejos mostró que

el PRP no dio lugar a la remodelación ósea superior que el coágulo

durante la cicatrización temprana. Por el contrario, el hueso autógeno solo,

demostró, a las 2 semanas, que aceleró la remodelación ósea (Broggini N y

cols. 2010).

Cuando se combinan PRP con autoinjerto, algunos autores como

Raghoebar y cols. (Raghoebar GM y cols. 2005) no encontraron beneficios

al añadir PRP, mientras que otros como Thor y cols. (Thor A y cols. 2005)

encontraron grandes beneficios. Consolo y cols. (Consolo U y cols. 2007)

no encontraron diferencias estadísticamente significativas. Aimetti y cols.

(Aimetti M y cols. 2008) observaron mayor contacto hueso-implante en el

autoinjerto con PRP que en el autoinjerto solo. Al combinarlo con

xenoinjerto, Froum y cols. (Froum SJ y cols. 2002) no encontraron

beneficios. Torres y cols. (Torres J y cols. 2009) observaron mayor

formación de hueso. Estas discrepancias en los resultados confirman la

ausencia de consenso sobre el uso de PRP para la regeneración ósea.

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3 JUSTIFICACIÓN

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Justificación

69

La finalidad principal de las técnicas de regeneración ósea es

conseguir regeneración predecible del defecto para proveer función y

estética a largo plazo con riesgo bajo de complicaciones. Otras

finalidades secundarias son realizar el mínimo número posible de

cirugías con baja morbilidad para el paciente, con el mínimo tiempo

de curación. El potencial de regeneración ósea de las CMM ha sido

evaluado en defectos óseos en animales (Yamada Y y cols. 2004b; Liu

HW y cols. 2007; Lee LT y cols. 2008). Los resultados

histomorfométricos de estos estudios mostraron mayor regeneración

ósea utilizando CMM sobre matrices que con la matriz sola (Yamada

Y y cols. 2004b), (Liu HW y cols. 2007), y resultados similares que

con injertos óseos autógenos (Lee LT y cols. 2008). Además, se ha

demostrado que las CMM obtenidas de pulpa dental, desde el punto de

vista de la regeneración ósea, tienen propiedades similares a las de

médula ósea (Yamada Y y cols. 2010). Se han estudiado otras

aplicaciones clínicas de las CMPD fuera del ámbito odontológico; se

ha conseguido, por ejemplo, regenerar el miocardio tras un infarto con

CMPD en animales (Gandia C y cols. 2008).

Dadas las posibles aplicaciones de las CMM en el campo de la

regeneración ósea en cirugía bucal, y el fácil acceso de las CMPD,

queda justificada la optimización del método de obtención y la

caracterización de CMPD. Hasta el momento, su aplicación está algo

lejos de la realidad, puesto que para obtener un número apropiado de

células, el cultivo debe mantenerse durante semanas. La mejora del

protocolo de obtención (fundamentalmente en cuanto al tiempo

Page 80: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Justificación

70

requerido para obtener suficiente número de células), facilitaría su

empleo en la práctica quirúrgica diaria, puesto que el paciente podría

en una misma intervención recibir un tratamiento que incluyese la

utilización de CMPD. Esto es de relevante importancia, ya que existen

impedimentos legales para extraer un tejido del organismo, tratarlo en

un laboratorio e implantarlo en un acto quirúrgico distinto. De hecho,

Tirino y cols. (Tirino V y cols. 2011) en una revisión reciente sobre

estrategias y perspectivas con CMPD, enfatizan en buscar métodos

que acorten el tiempo de obtención de estas células. A su vez, queda

justificado el estudio de la interacción de estas células con

biomateriales de regeneración ósea, ya que éstos son necesarios para

actuar como matriz para la correcta aplicación clínica de las células.

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4 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

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Hipótesis y objetivos

73

4.1 HIPÓTESIS

Mediante la digestión enzimática de la pulpa dental se pueden

aislar células madre de este tejido (Gronthos S y cols. 2000). Estas

células son positivas para distintos marcadores de membrana de

células mesenquimales y negativas para otros marcadores de células

madre hematopoyéticas (Papaccio G y cols. 2006). Estudios

histomorfométricos in vivo han demostrado que las células madre en

combinación con biomateriales de regeneración ósea aumentan la

formación de hueso (Rickert D y cols. 2010).

Numerosos laboratorios utilizan la misma técnica para el

aislamiento de CMPD: obtención del tejido, digestión enzimática con

colagenasa/dispasa, detección y selección mediante marcadores

selectivos (Tirino V y cols. 2011).

Nos planteamos como hipótesis de trabajo: “Mediante distintos

tratamientos enzimáticos o disgregantes de la pulpa dental se puede

optimizar el tiempo de obtención de células madre de este tejido.

Además, su proliferación debe ser mayor a niveles tisulares de O2 que

a niveles ambientales. Las CMPD deben ser positivas para marcadores

de superficie de células madre mesenquimales y negativas para

marcadores de células madre hematopoyéticas. Por último, estas

células deben ser capaces de adherirse y proliferar sobre biomateriales

de regeneración ósea.”

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Hipótesis y objetivos

75

4.2 OBJETIVOS

Objetivo general:

Obtener células madre de pulpa dental, optimizar el método de

obtención y de cultivo de estas células, y estudiar su interacción con el

biomaterial β-fosfato tricálcico.

Objetivos específicos:

1- Obtener células madre de pulpa dental. 2- Optimizar el método de obtención de células madre de pulpa dental. 3- Caracterizar células madre de pulpa dental usando microscopía

confocal.

4- Estudiar el crecimiento de células madre de pulpa dental a distintas

presiones de O2 para optimizar su cultivo.

5- Estudiar la adhesión y el crecimiento de células madre de pulpa

dental sobre el biomaterial β-fosfato tricálcico.

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5 MATERIAL Y MÉTODOS

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Material y métodos

78

5.1 Material

Todos los procedimientos de aislamiento, cultivo,

caracterización e interacción de células madre con β-fosfato tricálcico

se realizaron en condiciones de esterilidad, realizando todas las

operaciones en una campana de cultivo TEISTAR® de flujo laminar

vertical (Figura 5.1).

Figura 5.1. Campana de cultivo.

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Material y métodos

79

5.1.1 Material clínico

5.1.1.1 Anestesia

Jeringa, agujas, carpules de anestesia de articaína/epinefrina

(1/100000), lidocaína/epinefrina (1/100000), mepivacaína. Ultracain.

Normon®.

5.1.1.2 Exodoncia simple

Botador recto, botador “en T” (Winter, Pot), fórceps. Martin

Solinguen®.

5.1.1.3 Exodoncia quirúrgica

Lo descrito en exodoncia simple y: mango bisturí, hoja bisturí

nº 15, periostotomo de Freer, separador de Minnesota, fresa de

carburo de tungsteno redonda para pieza de mano, pinzas mosquito

curvas, sutura de seda trenzada 3/0 (Lorca Marin®), portaagujas tipo

Mayo, pinzas Adson. Martin Solinguen®.

5.1.1.4 Extracción de la pulpa dental

Turbina Kavo Supertorque 660C®. Fresa cilíndrica diamantada

para turbina Comet®. Sonda de exploración Carl Martin Solingen®.

Pinzas Martin Solingen®.

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Material y métodos

80

5.1.2 Aparatos

5.1.2.1 Para cultivo celular

Balanzas

- Balanza de precisión SARTORIUS®, modelo TECATOR

6110 Aculab, con una sensibilidad de 0.0001 g.

Centrífugas

- Centrífuga refrigerada marca SORVALL HERAEUS®,

modelo MULTIFUGE 3SR+, Thermoscientific o

HERMLE Z216MK®.

Sistema de purificación de agua

- Marca MILLIPORE®, modelos Milli-Q y Milli-RO.

- Marca Elga®, purelab flex.

pHmetro

- Marca CRISON®, modelo Microph 2001, con un electrodo

incorporado INGLOD.

Autoclave Selecta®, modelo Autester-G.

Agitador magnético Stuart®, Hotplate stirrer, SB 162-3.

Estufa termostatizada de cultivos

- Thermoscientific HERAcell 150i CO2 Incubator®.

- BINDER CB150 5 % CO2, 3% O2 Incubator®.

Microscopios

- Microscopio óptico NIKON SE®. x10 x20 x40.

- Microscopio óptico invertido ZEISS® Modelo ID03.

Baño ultrasonidos PSELECTA ULTRASONS®.

Baño seco Stuart, Block heater, SBH 130 D®.

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Material y métodos

81

Congeladores

- Tanque de nitrógeno ARPEGE 140® Air Liquide -160ºC.

- -80ºC marca Revco®, modelo ultima II.

- -80ºC marca Platinum 500®.

- -20ºC marca Liebherr®, modelo Comfort Nofrost.

- -2ºC Nevera Lynx®.

Baño caliente PSELECTA PRECISTERM®.

5.1.2.2 Para caracterización

Microscopio confocal Leica TCS-SP2 (Leica SA,

Mannheim®) con longitud de onda de 543 nm de excitación y

555-621 nm de emisión (color rojo); longitud de onda 488 nm

de excitación y de 510-585 nm de emisión (color verde).

Se utilizó un espectrofotómetro de la marca KONTRON®

modelo Uvikon 810 termostatizado.

Anticuerpos: CD-133, Oct4, Nestin, Stro-1, CD-34, CD-45

5.1.2.3 Para interacción de CMPD y biomateriales

Cuantificación de DNA Thermoscientific NanoDrop 2000®.

5.1.3 Reactivos y medios de cultivo

Determinación de proteínas: “Protein ASSAY Kit” de Sigma-

Aldrich Química®, que contiene el reactivo de Lowry y el reactivo de

Folin.

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Material y métodos

82

5.1.3.1 Enzimas y reactivos

Colagenasa tipo I SIGMA®.

Dispasa tipo II SIGMA®.

Termolisina (Vitacyte ,Indianapolis, IN).

Tripsina (Invitrogen®).

EDTA al 0,02% (tampón de Krebs sin Ca2+

ni Mg2+

)

5.1.3.2 Medios de cultivo

Dulbecco´s modified Eagle® (DMEM), GIBCO, con

suplemento bajo de glucosa (1mg/mL), Invitrogen®.

Suero bovino fetal (SBF), GIBCO, Invitrogen®.

Tampón fosfato (PBS), GIBCO, Invitrogen®.

Antibióticos: Penicilina/Estreptomicina, GIBCO, Invitrogen®.

5.1.4 Biomateriales de regeneración ósea

β-fosfato tricálcico. Keraos®. Keramat. Santiago de

Compostela. España.

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Material y métodos

83

5.2 Métodos

5.2.1 Diseño del estudio

Se realizó un estudio prospectivo, in vitro, no controlado. Los

dientes fueron extraídos por odontólogos de la Unidad de Cirugía de

la Clínica Odontológica de la Facultad de Medicina y Odontología de

la Universidad de Valencia, entre Mayo de 2008 y Marzo de 2012.

Todos los pacientes fueron informados de las características del

estudio, y aceptaron libremente colaborar con el mismo, aportando el

diente extraído, el cual fue siempre exodonciado por motivos ajenos a

este estudio. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la

Universidad de Valencia (Anexo 1). Así pues, los pacientes fueron

informados verbalmente del estudio, leyeron una hoja de información

al paciente (Anexo 2) y firmaron el consentimiento informado (Anexo

3). De la historia clínica del paciente se registró la edad y el sexo.

Durante todo el estudio se mantuvo el anonimato del paciente y la

protección de datos del mismo.

El cultivo de las CMPD y todo lo referente a la parte básica del

estudio, se realizó en el Departamento de Fisiología de la Facultad de

Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia durante las

fechas citadas previamente.

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Material y métodos

84

De todas las pulpas recogidas se seleccionaron los siguientes

datos: Diente extraído, edad y sexo del paciente, fecha de la exodoncia

y del cultivo, y método de cultivo realizado.

5.2.1.1 Criterios de inclusión

Se incluyeron para el cultivo de CMPD, aquellas pulpas de

dientes que no presentasen clínica y/o radiológicamente ningún signo

o síntoma de inflamación y/o infección.

5.2.1.2 Criterios de exclusión

Se excluyeron todas aquellas pulpas de dientes que clínica y/o

radiológicamente presentasen alguno de los siguientes cuadros

clínicos: Pulpitis, periodontitis apical, enfermedad periodontal,

fracturas que afectaran a la pulpa dental y aquellos dientes en los que

durante la exodoncia se produjera una fractura del diente o se realizara

la odontosección del mismo.

5.2.1.3 Recogida de datos

Durante la realización del estudio se recogieron los siguientes

datos:

Sexo y edad del paciente.

Fecha de la exodoncia y de la extracción de la pulpa.

Presencia o ausencia de células tras el cultivo.

Tiempo necesario para la obtención de células. En el Anexo

5.4 se detallan estos datos recogidos.

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Material y métodos

85

Número de células cultivadas al 3 y 21% de O2.

Resultados correspondientes a la caracterización de CMPD con

distintos marcadores.

Cantidad de DNA en cada una de las mediciones sobre β-

fosfato tricálcico.

5.2.2 Exodoncia

5.2.2.1 Anestesia

Se realizó bloqueo nervioso troncular para la extracción de

dientes mandibulares y técnica infiltrativa para exodoncias maxilares

con solución anestésica (articaína, lidocaína) y vasoconstrictor

(epinefrina) en una relación de 1/80.000 o 1/100.000 o con

mepivacaína sin vasoconstrictor.

5.2.2.2 Exodoncia simple

Se realizó la luxación con botadores y la extracción con

fórceps. Una vez realizada la exodoncia se legró el alveolo y se colocó

una gasa estéril.

5.2.2.3 Exodoncia quirúrgica

Fue realizada en casos de terceros molares quirúrgicos. Se

realizó incisión en bayoneta. Se levantó un colgajo de espesor

completo y mínima ostectomía necesaria para poder extraer el cordal.

Una vez legrado el alveolo, se suturó con puntos simples. Los puntos

se retiraron a la semana. Los pacientes a los cuales se les realizó

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Material y métodos

86

exodoncia quirúrgica siguieron una pauta antibiótica profiláctica

(amoxicilina 500 mg. cada 8 horas durante 1 semana o clindamicina

300 mg. cada 8 horas durante 1 semana), antiinflamatoria (ibuprofeno

600 mg. cada 8 horas durante los días que notara dolor y/o

inflamación) y enjuagues con clorhexidina al 0,12% 2 veces al día

durante un minuto 10 días.

A todos los pacientes se les explicaron medidas

postoperatorias, que se les entregó por escrito.

5.2.2.4 Extracción de la pulpa dental

Se realizó la extracción de la pulpa dental cortando el diente a

nivel de la línea amelocementaria con una turbina y una fresa

diamantada a 200.000 revoluciones por minuto. A continuación se

despegó la pulpa de la cámara pulpar y de los conductos radiculares

con una sonda. Una vez despegada, se extrajo la pulpa con unas pinzas

(Figura 5.2).

Entre la exodoncia y la extracción de la pulpa dental hubo un

rango de tiempo de entre una hora y cuatro días. Durante este tiempo

el diente se guardó en un tubo con medio de cultivo y antibióticos a

4ºC.

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Material y métodos

87

Figura 5.2. Extracción de la pulpa dental. A: Odontosección a nivel de la línea

amelocementaria con fresa diamantada. B: Una vez expuesta la cámara pulpar, C: se

despegó la pulpa con una sonda, y D: se extrajo con unas pinzas. E y F: La pulpa se

conservó y transportó en tubos con medio de cultivo Dulbecco´s modified Eagle®

con suplemento bajo de glucosa (1mg/ml) y antibióticos (penicilina 100U/ml y

estreptomicina 100 µg/ml).

5.2.2.5 Almacenamiento y transporte

Una vez extraída la pulpa dental, se almacenó en tubos de 15

mL estériles con medio de cultivo Dulbecco´s modified Eagle® con

suplemento bajo de glucosa (1mg/mL) y antibióticos (Penicilina

100U/ml y Estreptomicina 100 µg/ml). La pulpa se transportó a

temperatura ambiente en un tubo desde la Clínica Odontológica hasta

el Departamento de Fisiología. Entre la extracción de la pulpa y su

cultivo hubo un rango de tiempo de entre una y veinticuatro horas.

Durante este tiempo se guardó a 4ºC.

A

D

b

b

b

E

c

b

b

b

F

c

b

a

a

B C

Page 98: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

88

5.2.3 Obtención de CMPD por método publicado por

Gandía y cols. (Gandia C y cols. 2008) (Método A)

1- Se seccionó la pulpa dental mecánicamente con una hoja de

bisturí nº10.

2- Se recogieron los fragmentos y se realizó la digestión de estos

con 2 mg/mL de colagenasa tipo I durante 90 minutos (Método

A) en condiciones de 37°C, 5% CO2 y 3% O2 (Figura 5.3).

3- Se centrifugó a 1000 g durante 2 minutos (Figura 5.4), y se

recogió el precipitado y cultivó en medio de cultivo completo a

37°C, 5% CO2 y 3% O2. La composición del medio de cultivo

es la siguiente:

- DMEM con suplemento bajo de glucosa (1mg/mL)............90% (v/v)

- Suero bovino fetal……………………..........……..……...10% (v/v)

5.2.3.1 Rendimiento para la obtención de CMPD

Se consideró que existían células aisladas cuando de un

fragmento pulpar adherido a la placa se desprendían células con

morfología de fibroblasto, tal y como Friedstein y cols. (Friedenstein

AJ y cols. 1978) describieron las CMM en 1960. Se calculó el

porcentaje de obtención de CMPD de aquellas pulpas a las que se le

realizo la digestión de estos con 2 mg/mL de colagenasa tipo I durante

90 minutos (Método A). Se observó la morfología de un cultivo

mediante microscopía electrónica de barrido.

Page 99: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

89

5.2.3.2 Tiempo mínimo requerido para el aislamiento de CMPD

Se calculó el tiempo mínimo requerido para el aislamiento de

CMPD observando mediante microscopio óptico el cultivo celular. Se

consideró que existían células aisladas cuando de un fragmento pulpar

adherido a la placa se desprendían células. Éstas tuvieron una

morfología de fibroblasto tal y como Friedstein (Friedenstein AJ y

cols. 1978) describieron. Se consideró “tiempo 0” una vez finalizada

la disgregación y/o digestión de la pulpa. Se observó desde entonces el

cultivo todos los días y se anotó el tiempo exacto de aislamiento de

CMPD.

Figura 5.3. A y B: Estufa de cultivo celular. Condiciones: 37ºC, 5% de CO2 y 3%

de O2.

A B

Page 100: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

90

Figura 5.4. A y B: Centrifuga para precipitar los fragmentos pulpares digeridos.

5.2.4 Optimización del método de obtención de CMPD

Se efectuaron todos los pasos de la manera descrita en el

apartado anterior pero el tejido pulpar se trató utilizando distintos

agentes digestivos (colagenasa, dispasa, termolisina), disgregantes

(EDTA) o mecánicos (fragmentación mecánica, sonicación) de forma

aislada o combinando los unos con los otros.

5.2.4.1 Método B: Obtención de CMPD realizando la

disgregación de la pulpa con EDTA

Se realizó la disgregación de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA al

0,02% (tampón de Krebs sin Ca2+

ni Mg2+

) durante 30 minutos. A

continuación se centrifugó y cultivó de la forma descrita en el

apartado correspondiente a “obtención de CMPD”.

A B

c

b

b

b

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Material y métodos

91

5.2.4.2 Método C: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con EDTA y colagenasa tipo I

Se realizó la digestión de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA

durante 10 minutos y 2 mg/ml de colagenasa tipo I durante 90

minutos.

5.2.4.3 Método D: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con 1 mg/ml de colagenasa durante 13 horas

Se realizó la digestión de la pulpa con 1 mg/ml de colagenasa

tipo I durante 13 horas.

5.2.4.4 Método E: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con EDTA y colagenasa/dispasa

Se realizó la digestión de la pulpa con 2mg/ml EDTA durante

10 minutos y 2mg/ml de colagenasa tipo I y 4mg/ml de dispasa tipo II

durante 40 minutos.

5.2.4.5 Método F: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con EDTA y colagenasa/dispasa y sonicación

Se realizó la digestión de la pulpa con 2mg/ml EDTA durante

10 minutos, 4mg/ml de colagenasa tipo I y 4mg/ml de dispasa tipo II

durante 40 minutos. Una vez realizada la digestión de la pulpa se

procedió a realizar la sonicación del cultivo durante un minuto.

Page 102: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

92

5.2.4.6 Método G: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con EDTA, colagenasa/dispasa, termolisina y

sonicación.

Se realizó la digestión de la pulpa con 2mg/ml EDTA durante

10 minutos, 4mg/ml de colagenasa tipo I, 4mg/ml de dispasa tipo II

durante 40 minutos y 13ng/ml de termolisina durante 40 minutos. Una

vez realizada la digestión de la pulpa se procedió a realizar la

sonicación del cultivo durante un minuto.

5.2.4.7 Método H: Obtención de CMPD realizando la digestión

de la pulpa con termolisina

Se realizó la digestión de la pulpa con 13ng/ml de termolisina

durante 40 minutos.

5.2.4.8 Método I: Obtención de CMPD realizando fragmentación

mecánica

Se fragmentó la pulpa con una hoja de bisturí del número 10

sobre una placa con medio de cultivo. No se realizó digestión de la

pulpa.

Las CMPD se consideraron aisladas cuando se observaron

mediante el microscopio óptico células adheridas a la placa de cultivo,

con forma de fibroblastos. El medio de cultivo fue cambiado a los 7

días. Cuando el cultivo primario alcanzó confluencia, es decir, cuando

la placa estaba llena de células, se realizó el pase a otra placa más

grande.

Page 103: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

93

5.2.5 Caracterización de las células madre

mesenquimales mediante la inmunofluorescencia

por microscopía confocal

El estudio de microscopía confocal se realizó con una unidad de

barrido láser confocal Leica TCS-SP2 (Leica SA, Mannheim®) con

un láser de argón y otro de neón-helio unido a un microscopio

invertido Leica DM1RB®. Se utilizaron placas Lab-Tek de la empresa

Nalge Nunk International, previamente tratadas con poli-L-lisina

(Sigma Aldrich Química). Se colocó la poli-L-lisina 24 horas antes

manteniendo las placas en estufa a 37ºC. Posteriormente se realizó dos

lavados con PBS y uno con DMEM previo a la siembra de las células.

Se colocaron 200.000 células por pocillo que se incubaron en

1mL de medio. Los anticuerpos primarios usados para caracterizar las

células fueron:

CD133 (Prominin-1) (Sigma)

Oct4 (Sigma)

Nestin (Sigma)

Stro-1 (MILLIPORE)

CD34 (Cell Signaling)

CD45 (Cell Signaling)

Los fluorocromos usados fueron:

Anti-Rabbit IgG TRITC conjugado (Sigma®)

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Material y métodos

94

Anti-Mouse IgG FITC conjugado (Sigma®)

Reactivos:

PBS pH 7.4, (Invitrogen®)

Formaldehido al 3.7% (Panreac®)

Glicina 50 mM (Sigma®)

Triton X-100 al 0.25% (FLUKA Biochemika®)

Albumina de suero Bovino (BSA) al 3% (Roche®)

Igepal 0.1% (Sigma®)

Preparación de las muestras:

Todo el proceso se realizó a temperatura ambiente excepto las

incubaciones con los anticuerpos.

1- Se lavaron las células con PBS (atemperado a 37ºC).

2- Se fijaron las células con 3,7% Formaldehido en PBS durante

10 minutos.

3- Se lavó durante 10 minutos con PBS, neutralizó 10 minutos

con 50mM de Glicina en PBS y permeabilizó con 0.25%

Triton X-100 en PBS 10 minutos.

4- Se bloqueó con 3% BSA en PBS 10 minutos.

5- Se incubó con anticuerpo primario diluido en 3% BSA disuelto

en PBS durante 3 horas a 37ºC.

6- Se lavó con 0.1% Igepal en PBS 3 veces (10 minutos cada

lavado).

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Material y métodos

95

7- Se incubó con anticuerpo segundario diluido en 3% BSA en

PBS durante 1 hora a 37ºC en cámara húmeda y en oscuridad.

8- Se lavó con PBS 3 veces (10 minutos cada lavado).

5.2.6 Cultivo de CMPD a distintas presiones de oxígeno

y realización de curva de crecimiento

Se cultivaron CMPD al 3% y al 21% de O2. Se contaron las

células en cada frasco y se determinó la viabilidad celular a las: 6

horas, 1, 2, 3, 5, 7 y 8 días de cultivo. En el momento inicial, se

colocaron 250.000 células en la placa de cultivo.

Para contar las células, se procedió de la manera siguiente:

1- Se lavó la placa 2 veces con PBS pH 7.4 previamente

atemperado a 37ºC.

2- Se añadió tripsina (aproximadamente 1mL) a la placa de

25cm2 para levantar las células.

3- Se detuvo el efecto de la tripsina con medio de cultivo

completo y se recogieron las células levantadas.

4- Se centrifugó a 1500g durante 3 minutos a temperatura

ambiente y se resuspendió el precipitado en medio de cultivo

completo DMEM para contar las células usando la cámara de

Neubauer.

Se utilizaron 4 cultivos distintos para cada uno de los

momentos en los que se realizó el cómputo (6 horas, 1, 2, 3, 5, 7 y 8

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Material y métodos

96

días), con lo que se utilizaron 28 cultivos en total. Para realizar la

curva de crecimiento se hizo una media del cómputo de los 4 cultivos

para cada momento medido.

5.2.7 Adhesión y crecimiento de CMPD a β- fosfato

tricálcico

5.2.7.1 Adhesión de CMPD a β- fosfato tricálcico

Para comprobar la posible interacción de las CMPD con el

biomaterial β-fosfato tricálcico, se procedió de la manera siguiente:

1- Se usaron CMPD de una línea celular de la pulpa dental con 4

pases realizados.

2- Se sembraron 200.000 células sobre el biomaterial β- fosfato

tricálcico. Para ello se usó un tubo de 15 mL, donde se colocó

el biomaterial sobre el cual se sembraron las CMPD en

presencia de medio de cultivo completo DMEM con

suplemento bajo de glucosa (1g/L) y SBF al 10 %.

3- A los 7, 13, 18 y 23 días de cultivo a 37ºC; 5% CO2; 3% O2, se

comprobó la adhesión de las CMPD sobre el biomaterial

usando el microscopio óptico.

5.2.7.2 Crecimiento de las CMPD sobre el biomaterial β- fosfato

tricálcico

Para estudiar la proliferación de CMPD sobre el biomaterial, se

siguió el mismo protocolo del apartado anterior usando 4 discos sobre

los cuales se sembró la misma cantidad de células (200.000/por disco),

Page 107: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

97

y se congelaron a -80ºC sucesivamente los días 7, 13, 18 y 23 de

cultivo.

Para evaluar el crecimiento de las CMPD sobre el biomaterial,

se cuantificó el DNA extraído en cada momento (7, 13, 18 y 23 días

de cultivo). Al saber la cantidad de DNA, se estimó el número de

células que había en cada momento. Para hacer la correspondencia, se

realizó previamente una curva patrón contando el DNA que había en

distintas cantidades concretas de células.

Aislamiento de DNA

El aislamiento de DNA se llevó a cabo utilizando un producto

registrado llamado Trizol®, de la casa comercial ROCHE. El método

se basa en utilizar las propiedades de solubilidad del DNA en

solventes acuosos orgánicos y alcoholes. De este modo podremos

separar las proteínas y el RNA, del DNA

Reactivos:

Tampón de extracción: Trizol®, Invitrogen.

Cloroformo (Sigma®).

Isopropanol (Sigma®).

Etanol 70 % (CARLO ERBA Reagents®).

Agua con dietilpirocarbonato (DEPC) (Sigma®).

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Material y métodos

98

Procedimiento:

Según las instrucciones proporcionadas por el laboratorio que

comercializa el Trizol®, seguimos los siguientes pasos, para cada una

de las muestras:

1- Se añadió 1mL de Trizol® por cada 4 millones de células.

2- Después se incubaron las células con Trizol® durante 2-3

minutos se añadieron 200 µL de cloroformo por cada mililitro

de Trizol® empleado.

4- Se mezclaron durante 15 segundos agitando con la mano y se

dejaron incubar durante 2-3 minutos.

5- Se centrifugaron las muestras a menos de 1200g durante 10

minutos. En este punto se obtuvo el DNA en la fase orgánica.

6- Se recogió el sobrenadante, correspondiente a la fase orgánica

en un nuevo tubo y se añadió 300 µL de etanol al 100%,

mezclándolo y dejándolo incubar 3 minutos a temperatura

ambiente.

7- Se centrifugó a 2000g durante 5 minutos a 4ºC.

8- Se eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado de DNA 2

veces con 0.1 M citrato sódico en etanol al 10% (30 minutos

cada lavado a temperatura ambiente).

9- Se centrifugó a 2000g 5 minutos a 4ºC.

10- Se resuspendió el precipitado en 1mL etanol al 75%, se dejó

reposar 20 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 2000g

a 4ºC.

Page 109: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

99

11- Se secó el precipitado del DNA de 5 a 15 minutos y se

resuspendió en 300µL NaOH 8mM.

12- Se cuantificó el DNA con el Thermoscientific NanoDrop

2000.

5.2.8 Análisis estadístico de los resultados

Para el análisis estadístico de los resultados, primero se realizó

un análisis de la varianza. La hipótesis nula fue aceptada para todos

los valores de aquellos grupos en los cuales F no fue significativa para

un valor p ≤ 0.05. Luego, el grupo de datos para los que F fue

significativa fue analizado por el test de la t de Student. La simbología

empleada en la presente tesis es la siguiente: * p < 0.05; ** p < 0.01;

***p<0.001.

Page 110: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Material y métodos

100

5.3 Documentos anexos

Anexo 5.1. Informe del comité de ética de la Universidad de Valencia.

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Material y métodos

101

Clínica Odontológica, Unidad de Cirugía

Facultad de Medicina y Odontología

Universidad de Valencia

HOJA DE INFORMACIÓN AL PACIENTE

Le invitamos a participar en el presente estudio sobre la obtención de

células madre de pulpa dental que se está llevando a cabo en la Universidad de

Valencia. Podrá hablar con el investigador para aclarar sus dudas y si decide no

participar en el estudio, esto no afectará de ninguna manera a la calidad de su

tratamiento odontológico.

Objetivos del estudio:

- Obtener células madre de pulpa dental.

- Mejorar el método de obtención de estas células.

- Estudiar la interacción de las células con biomateriales de regeneración

ósea.

Tratamiento del estudio: Durante el estudio, se registraran datos referentes a su

historia médica (edad, sexo), así como a las características clínicas del diente a

extraer.

Posibles riesgos: No existen riesgos para el paciente asociados a este estudio.

Participación voluntaria: Puede retirarse del estudio en cualquier momento sin

tener que ofrecer explicación alguna sobre sus razones. El abandono del estudio no

condicionara en absoluto los tratamientos odontológicos en el futuro.

Confidencialidad: Todos los datos referentes a su participación en el estudio se

almacenarán y analizarán en una base de datos electrónica, sin mención expresa de

su nombre.

Anexo 5.2. Modelo de hoja de información al paciente.

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Material y métodos

102

Clínica Odontológica, Unidad de Cirugía

Facultad de Medicina y Odontología

Universidad de Valencia

CONSENTIMIENTO INFORMADO

Nombre y Apellidos………………………………………………………………….

Edad………………………………………………………………………………….

Sexo…………………………………………………………………………………..

He sido informado/a y acepto libremente entregar mi diente, extraído por

motivos ajenos a este estudio, para el cultivo y análisis de las células de la pulpa

dental.

Fecha:

Firma:

Anexo 5.3. Modelo de consentimiento informado.

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Material y métodos

103

Método de disgregación Pulpas Fecha de

cultivo

Aparición

de CMPD

Edad

(años)

Sexo

Colagenasa 2mg/mL

90 min

T1 8-05-08 NO 22 Mujer

T2 19-05-08 NO 15 Mujer

T3 9-05-08 14 25 Mujer

T4 19-05-08 14 27 Mujer

T5 20-05-08 13 21 Mujer

T6 27-05-08 10 23 Mujer

T7 28-05-08 11 42 Mujer

T8 28-05-08 12 48 Mujer

1 29-05-08 11 54 Mujer

2 29-05-08 14 25 Mujer

3 3-06-08 14 24 Mujer

4 05-06-08 14 19 Mujer

5 05-06-08 13 42 Mujer

6 05-06-08 13 33 Mujer

7 09-06-08 11 29 Hombre

8 09-06-08 8 27 Hombre

9 09-06-08 10 33 Mujer

10 17-06-08 11 30 Hombre

11 23-06-08 9 37 Mujer

12 25-06-08 11 22 Hombre

13 25-06-08 NO 32 Mujer

14 4-02-09 7 21 Mujer

15 7-05-09 9 21 Mujer

16 20/10/2009 NO 30 Hombre

17 20/10/2009 NO 38 Mujer

18 20/10/2009 14 días 14 Mujer

19a 23/10/2009 14 días 24 Mujer

20 26/10/2009 14 días 31 Mujer

22 30/10/2009 14 días 30 Mujer

23 02/11/2009 NO 22 Mujer

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Material y métodos

104

24 05/11/2009 NO 32 Mujer

25 05/11/2009 10 días 22 Mujer

26 12/11/2009 7 días 30 Mujer

SI2 20/11/2009 NO 42 Hombre

Cortadas

mecánicamente

28 13/11/2009 NO 26 Hombre

29ª 13/11/2009 NO 24 Mujer

29b 13/11/2009 NO 24 Mujer

*1 3-12-2009 NO 12 Mujer

*2 12-12-2009 NO 21 Mujer

*3 15-12-2009 NO 20 Hombre

EDTA 2mg/mL 30

min

EDTA 1 15-5-2009 7 días 27 Hombre

EDTA 2 1-6-2009 7 días 35 Hombre

EDTA 3 9-6-2009 NO 35 Mujer

EDTA 4 12-6-2009 NO 43 Mujer

Colagenasa 1mg/mL

13h

41 26/01/2010 NO 23 Mujer

42 26/01/2010 NO 34 Hombre

44ª 02/02/2010 SI 5 días 20 Mujer

45ª 02/02/2010 SI 5 días 24 Mujer

43 02/02/2010 SI 10 días 24 Hombre

44b 02/02/2010 SI 10 días 20 Mujer

45b 02/02/2010 SI 10 días 24 Mujer

64b 31/05/2010 SI 36 h 30 Mujer

65ª 31/05/2010 SI 36 h 25 Mujer

67ª 08/06/2010 SI 48h 17 Mujer

67b 08/06/2010 SI 48h 17 Mujer

68 08/06/2010 SI 48h 25 Mujer

Ns 08/06/2010 SI 24h 28 Hombre

EDTA

2mg/mL+colagenasa

2mg/mL 90 min

31 20/11/2009 SI 5 días 16 Hombre

SI1 20/11/2009 SI 5 días 18 Mujer

SI3 20/11/2009 SI 5 días 20 Mujer

30 20/11/2009 SI 7 días 26 Hombre

SI4 20/11/2009 SI en 7

días 21 Hombre

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Material y métodos

105

33a 27/11/2009 SI 5 días 24 Mujer

33b 27/11/2009 SI 5 días 19 Mujer

EDTA 2mg/mL

10min+

Colagenasa 2mg/mL+

Dispasa 4mg/mL

40min

46a 24/02/2010 NO 38 Mujer

46b 24/02/2010 NO 38 Mujer

47 24/02/2010 NO 18 Hombre

60 19/05/2010 SI 7 días 17 Hombre

61 25/05/2010 SI 5 días 25 Mujer

62 25/05/2010 SI 6 días 32 Mujer

63 25/05/2010 SI 3 días 29 Hombre

71a 14/07/2010 SI 2 días 26 Hombre

71b 14/07/2010 SI 2 días 30 Hombre

72 14/07/2010 SI 2 días 23 Mujer

73 14/07/2010 SI 2 días 17 Hombre

74 14/07/2010 SI 2 días 27 Mujer

75 14/07/2010 SI 2 días 25 Mujer

EDTA 2mg/mL

10min+

Colagenasa 2mg/mL+

Dispasa 4mg/mL+

Sonicar 1 min 37ºC

76a 08/09/2010 SI 24h 22 Mujer

76b 08/09/2010 SI 24h 22 Mujer

77 27/09/2010 SI 36h 32 Hombre

78 28/09/2010 SI 24h 48 Mujer

79 30/09/2010 SI 17 h 19 Hombre

80 30/09/2010 SI 17 h 29 Mujer

81 01/10/2010 SI 3 días 30 Mujer

83 04/10/2010 SI 3 días 18 Mujer

84 04/10/2010 SI 20h 29 Mujer

85 05/10/2010 SI 2 días 40 Hombre

86 05/10/2010 SI 3 días 38 Mujer

87a 13/10/2010 SI 36 h 25 Mujer

87b 13/10/2010 SI 7 días 25 Mujer

88a 14/10/2010 SI 13 h 17 Mujer

88b 14/10/2010 SI 13 h 17 Mujer

89 19/10/2010 SI 2 días 24 Hombre

90 26/10/2010 SI 2 días 32 Hombre

91a 26/10/2010 SI 2 días 19 Mujer

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Material y métodos

106

Anexo 5.4. Tabla de recogida de datos referentes a la edad y sexo de los pacientes,

método de aislamiento utilizado y tiempo requerido para la obtención de CMPD.

91b 26/10/2010 SI 2 días 19 Mujer

92a 27/10/2010 SI 2 días 19 Mujer

92b 27/10/2010 SI 5 días 19 Mujer

93a 28/10/2010 SI 4 días 35 Mujer

93b 28/10/2010 SI 4 días 37 Hombre

94 08/10/2010 SI 14h 18 Hombre

EDTA 2mg/mL 10

min +

Colagenasa 4mg/mL +

Dispasa 4mg/mL 40

min+

Termolisina 30 µL

Sonicar 1min baño

37ºC

95a 10/11/2010 SI 14h 29 Mujer

95b 10/11/2010 SI 14h

Mujer

99 23/11/2010 SI 14h 19 Mujer

100 24/11/2010 SI 15h 23 Mujer

101 24/11/2010 SI 15h 21 Mujer

102 24/11/2010 SI 23h 21 Mujer

103 29/11/2010 SI 17h 38 Mujer

104 30/11/2010 SI 10h 37 Hombre

105 30/11/2010 SI 10h 53 Mujer

106 30/11/2010 SI 10h 21 Mujer

107 30/11/2010 SI 10h 54 Mujer

108 01/12/2010 SI 12h 24 Hombre

109 15/12/2010 SI 8h 24 Mujer

110 15/12/2010 SI 8h 32 Hombre

111 20/12/2010 SI 11h 41 Hombre

112 20/12/2010 SI 15h 67 Hombre

Termolisina 30 µL

96 22/11/2010 NO 24 Mujer

97 22/11/2010 NO 22 Hombre

98 22/11/2010 SI 20h 19 Mujer

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6 RESULTADOS

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Resultados

109

6.1 Obtención de CMPD por método publicado

por Gandía y cols. (Gandia C y cols. 2008)

(Método A)

El primer objetivo fue obtener células madre de pulpa dental.

Para ello se siguió una metodología ya descrita en la literatura (Gandia

C y cols. 2008) que consistió en realizar la digestión de la pulpa con

2mg/mL de colagenasa I durante 90 minutos (Método A).

6.1.1 Rendimiento para la obtención de CMPD

Se emplearon 34 pulpas, correspondientes a 34 pacientes, 6

hombres y 28 mujeres de 14 a 54 años. Se aislaron las células con esta

metodología y se observó crecimiento en 26 casos. En 7 casos no se

observó crecimiento, y en uno se infectó el cultivo (Tabla 6.1). El

porcentaje de eficacia de obtención de CMPD fue del 76,4 %.

Sexo (de las

pulpas)

Edad (años) Tiempo

aislamiento

Porcentaje de

obtención

6 hombres 14 a 54 7 a 14 días 76.4 %

28 mujeres

Tabla 6.1. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 2mg/mL de colagenasa I durante 90 minutos.

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Resultados

110

La Figura 6.1 muestra una fotografía de un cultivo de CMPD,

hecha con microscopio electrónico a los 12 días de cultivo. Viendo la

densidad de células podemos observar un crecimiento óptimo (Figura

6.1A). En la Figura 6.1B vemos la forma característica de fibroblasto

que adquieren las CMM.

Figura 6.1. A y B: Imágenes al microscopio electrónico de CMPD correspondiente

a un hombre de 17 años realizando la digestión de la pulpa con 2mg/mL de

colagenasa I durante 90 minutos.

6.1.2 Tiempo mínimo requerido para el aislamiento de

CMPD

En los 26 casos donde se obtuvieron CMPD, éstas se

observaron en la placa de cultivo entre el séptimo y el decimocuarto

día de cultivo (Tabla 6.1). La Figura 6.2 muestra, mediante

microscopía óptica, la evolución de un cultivo correspondiente a una

pulpa dental a la cual se le realizó la digestión con 2mg/mL de

colagenasa I durante 90 minutos. Se pudo observar:

A B

B

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Resultados

111

Una imagen de microscopio óptico donde existen fragmentos

pulpares en suspensión (flecha roja). La imagen corresponde a

el séptimo día de cultivo (Figura 6.2A). No se observan

células adheridas a la placa.

En la imagen a los 14 días de cultivo (Figura 6.2B), existen

fragmentos pulpares adheridos a la placa (flecha roja), de los

cuales se desprenden células con morfología de fibroblasto

correspondientes a CMPD (flecha verde). Friedenstein y cols.

(Friedenstein AJ y cols. 1978) describieron hace décadas esta

morfología característica de las CMM.

A los 18 días se observa la placa confluente de CMPD. Se

puede observar como las células están en contacto entre sí

(Figura 6.2C). Llegado este momento se realizó en todos los

cultivos un pase de las células a una placa mayor.

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Resultados

112

Figura 6.2. Obtención de CMPD realizando la digestión con 2mg/mL de colagenasa

durante 90 minutos. Imágenes a microscopía óptica a 400x aumentos de un cultivo

de una pulpa correspondiente a un hombre de 35 años. Las figuras muestran

diferentes tiempos de cultivo: A: Cultivo a los 7 días. Se observan fragmentos

pulpares en suspensión (flecha roja). B: Cultivo a los 14 días. De los fragmentos

pulpares, se desprenden CMPD adheridas a la placa (flecha verde). C: Cultivo a los

18 días. La placa de cultivo está confluente.

A

B

C

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Resultados

113

6.2 Optimización del método de obtención de

CMPD

Para la aplicación clínica de células madre, lo ideal es aislar y

autoinjertar las células durante el mismo acto, evitando el aislamiento

y la expansión de las células en el laboratorio. Con lo cual, el tiempo

de obtención de las células es un factor de gran importancia. Una de

las claves para acortar este tiempo, es aumentar el grado de

disgregación sin dañar las células. Por ello, el segundo objetivo de la

presente tesis fue optimizar el método de obtención, es decir, acortar

al máximo el tiempo necesario para obtener las CMPD. Se realizaron

para tal fin, una combinación de metodologías originales y otras

descritas en la literatura.

En total, en este segundo objetivo, se cultivaron 86 pulpas de 73

pacientes. Veintinueve de esas pulpas correspondieron a hombres y 57

pulpas a mujeres con edades comprendidas entre 14 y 67 años.

Ya que el método utilizado en primer lugar para obtener CMPD

(primer objetivo) fue denominado Método A, se comienza ahora

describiendo los resultados con el Método B.

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Resultados

114

6.2.1 Método B: Obtención de CMPD realizando la

disgregación de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA.

El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un quelante de

cationes divalentes en tampón fosfato que se emplea para aumentar la

disociación celular. El EDTA se ha utilizado para aislar otras células

como hepatocitos (Vina J y cols. 1978), pero no para aislar CMPD. La

literatura científica utiliza agentes digestivos (colagenasa, dispasa,

etc.) para aislar CMPD, pero no existe ningún artículo que utilice el

EDTA. Este dato es importante desde el punto de vista de que el

EDTA es un quelante del Ca que rompe los desmosomas que unen las

células, y no un agente digestivo que digiere la red de proteínas

intercelulares.

Se cultivaron 4 pulpas correspondientes a 2 hombres de 27 y

35 años y 2 mujeres de 35 y 43 años, realizando la digestión con 2

mg/ml de EDTA al 0,02% (tampón de Krebs sin Ca2+

ni Mg2+

). Se

aislaron CMPD en 2 casos a los 7 días. En los otros 2 cultivos no se

observó crecimiento. El porcentaje de obtención de CMPD fue del

50% (Tabla 6.2).

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Resultados

115

Sexo (de los

donantes de

pulpas)

Edad (años) Tiempo aislamiento Porcentaje de

obtención

2 hombres

23 a 47

No

crecimiento

2

pulpas

50 %

2 mujeres 7 días 2

pulpas

Tabla 6.2. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó

disgregación con 2 mg/ml de EDTA.

En la Figura 6.3 se muestra un cultivo donde se observó

presencia de CMPD y crecimiento de las mismas:

A los 7 días, se observa un fragmento pulpar (flecha roja) del

cual aparecen, adheridas a la placa, CMPD con la morfología

típica de fibroblasto (flecha verde) (Figura 6.3A).

A las 3 semanas, la placa de cultivo comienza a estar

confluente (Figura 6.3B).

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Resultados

116

Figura 6.3. Imágenes representativas de microscopía óptica a 400x y 200x

aumentos respectivamente de CMPD aisladas realizando la disgregación con 2

mg/ml de EDTA. Estas células corresponden a un hombre de 35 años. Imágenes

correspondientes a distintos momentos del cultivo: A: Imagen a los 7 días de

cultivo. B: A las 3 semanas del cultivo.

Aunque la muestra fue muy pequeña, se demostró que con este

método en el cual se utiliza un agente quelante y no un agente

digestivo, se obtuvieron CMPD. No se consiguió acortar el tiempo de

obtención respecto al Método A.

6.2.2 Método C: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA y 2

mg/ml de colagenasa tipo I

Mediante los 2 métodos anteriores se obtuvieron CMPD. Con

la finalidad de acortar el tiempo de aislamiento de las CMPD, se

decidió combinar los dos tratamientos anteriores.

Se emplearon 7 pulpas cultivadas de 6 pacientes de edades

comprendidas entre 16 y 26 años. Se obtuvieron CMPD en todos los

A B

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Resultados

117

casos entre el quinto y el séptimo día. El porcentaje de obtención de

CMPD fue del 100 % (Tabla 6.3).

Sexo (de las

pulpas)

Edad (años) Tiempo

aislamiento

Porcentaje de

obtención

3 hombres

16 a 26

5 días 5

pulpas

100 % 4 mujeres 7 días 2

pulpas

Tabla 6.3. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 2 mg/ml de EDTA y 2 mg/ml de colagenasa tipo I.

En la Figura 6.4 se observa un cultivo en el cual se realizó la

digestión de la pulpa con este método a los 7 días de aislamiento.

Figura 6.4. Imagen de cultivo a los 7 días de aislamiento realizando la digestión

con 2 mg/ml de EDTA y 2 mg/ml de colagenasa tipo I. Microscopía óptica a 100x

aumentos.

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Resultados

118

Combinando 2 métodos (disgregación con EDTA y digestión

con colagenasa) se consiguió acortar ligeramente el tiempo de

obtención y el rendimiento se optimizó alcanzando el 100%.

6.2.3 Método D: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 1 mg/ml de colagenasa

durante 13 horas

Se cultivaron 13 pulpas de 10 pacientes con edades

comprendidas entre 17 y 34 años. Este método está descrito en la

literatura para el aislamiento de células de córnea (Li W y cols. 2007).

En este método se pretendió estudiar si aumentando el tiempo de

digestión de la pulpa, las células no morían y se obtenían CMPD en

menor tiempo. Con este método se observó crecimiento de CMPD en

11 casos (Tabla 6.4). El porcentaje de obtención de CMPD fue del

84,6 %. Las primeras células se observaron entre 24 horas y 10 días de

cultivo.

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Resultados

119

Sexo (de

pulpas)

Edad

(años)

Tiempo aislamiento Porcentaje de

obtención

3 hombres

17 a 34

No

crecimiento 2 pulpas

84,6 %

24 h. 1 pulpa

10 mujeres

48 h. 3 pulpas

36 h. 2 pulpas

5 días 2 pulpas

10 días 3 pulpas

Tabla 6.4. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 1 mg/ml de colagenasa durante 13 horas.

En la Figura 6.5 se describe mediante imágenes, la evolución

de un cultivo en el cual se obtuvieron las primeras células a las 24

horas tras el aislamiento. Se observó:

Inmediatamente tras las 13 horas de digestión, la pulpa está

más disgregada (flechas rojas) que con las otras metodologías

ya descritas (Figura 6.5A).

A las 24 horas de cultivo, ya se observan CMPD (flecha verde)

adheridas a la placa (Figura 6.5B).

A las 48 horas el número de CMPD es abundante en algunas

zonas del cultivo (flecha verde) (Figura 6.5C).

A los 17 días la placa está confluente (Figura 6.5D).

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Resultados

120

Figura 6.5. Imágenes de microscopio óptico de la obtención de CMPD realizando la

digestión con 1 mg/ml de colagenasa durante 13 horas. A: Imagen a 400x aumentos

de la pulpa después de la digestión. B: Imagen a 400x aumentos de CMPD a las 24

horas tras el aislamiento. C: Imagen a 200x aumentos de CMPD a las 48 horas tras

el aislamiento. D: Imagen a 400x aumento a los 17 días de cultivo.

Con este método se obtuvieron CMPD y, aunque el tiempo de

aislamiento aumenta considerablemente, se consiguió acortar mucho

el tiempo de obtención. Mientras que con los otros 2 métodos

descritos anteriormente se obtuvieron las células a los 7 días, con este

se redujo el tiempo de obtención a 24 horas.

A B

C D

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Resultados

121

6.2.4 Método E: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 2mg/ml de EDTA y

colagenasa (2mg/ml)/dispasa (4mg/ml)

La dispasa es una metaloproteinasa neutra derivada del

Bacillus polymyxa que requiere Ca2+

para su actividad. Esta enzima

digiere la fibronectina y el colágeno IV que son componentes de la

lámina densa y las fibrillas de anclaje de la membrana basal, degrada

en menor extensión, pero no el colágeno I, no parte el colágeno V o la

laminina.

Trece pulpas de 11 pacientes de 17 a 38 años fueron cultivadas

con este método de obtención. Se observó crecimiento en 10 casos

entre el segundo y el séptimo día, con lo que el porcentaje de

obtención de CMPD fue del 76 % (Tabla 6.5).

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Resultados

122

Sexo (de las

pulpas) Edad (años)

Tiempo aislamiento

días

Porcentaje de

obtención

6 hombres

17 a 38

No

crecimiento 3 pulpas

76 %

2 días 6 pulpas

7 mujeres

3 días 1 pulpa

5 días 1 pulpa

6 días 1 pulpa

7 días 1 pulpa

Tabla 6.5. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (2mg/ml)/dispasa (4mg/ml).

En la Figura 6.6 se observa un cultivo de CMPD a los 4 días tras el

aislamiento.

Figura 6.6. Imagen a los 4 días de cultivo de CMPD realizando la digestión con

2mg/ml de EDTA y colagenasa (2mg/ml)/dispasa (4mg/ml). Imagen mediante

microscopio óptico a 200x aumentos.

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Resultados

123

Así pues, añadiendo dispasa al método anterior se acorta

mucho el tiempo de obtención de las células. Aun así el rango es

bastante amplio (2 a 7 días), lo que hace que no se puedan extraer

conclusiones definitivas.

6.2.5 Método F: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 2mg/ml de EDTA y

colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml) y

sonicación

En este método, tras la digestión de la pulpa, se sonicó el

cultivo para observar si la agitación mecánica acelera el proceso de

obtención de CMPD.

Se cultivaron 24 pulpas de 18 pacientes de 17 a 48 años, y se

observó crecimiento de CMPD en todos los casos entre las 13 horas y

el séptimo día. El porcentaje de obtención de CMPD fue del 100%

(Tabla 6.6).

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Resultados

124

Sexo (de las

pulpas) Edad (años)

Tiempo

aislamiento

Porcentaje de

obtención

7 hombres

17 a 48

13 h. 3 pulpas

100 %

17 h. 2 pulpas

20 h. 1 pulpa

24 h. 3 pulpas

36 h. 2 pulpas

17 mujeres

2 días 6 pulpas

3 días 3 pulpas

4 días 2 pulpas

5 días 1 pulpa

7 días 1 pulpa

Tabla 6.6. Datos descriptivos de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó

digestión con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml) y

sonicación.

La Figura 6.7 muestra una célula adherida a la placa (flecha

verde). La imagen corresponde a las 13 horas de aislamiento.

Figura 6.7. Imagen a las 13 horas tras el aislamiento al microscopio óptico a 400x

aumentos de CMPD correspondiente a una mujer de 37 años. La digestión se realizó

con 2mg/ml de EDTA y colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml) y sonicación.

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Resultados

125

Con este método en el cual se sonica, se acorta mucho el

tiempo de obtención comparado con el método D, en el cual se realiza

el mismo tipo de digestión pero sin sonicar. Con una muestra

relativamente amplia (24 pulpas), se demuestra que el rango de tiempo

sigue siendo amplio (13 horas a 7 días).

6.2.6 Método G: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA,

colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de

termolisina y sonicación

Para observar si se acorta más el tiempo de aislamiento, se

realizó la digestión con todos los reactivos de los métodos anteriores y

se añadió termolisina. Este reactivo es una metaloproteínasa

extracelular, de peso molecular 34600 Da, aislada de la bacteria gram-

positiva Bacillus thermoproteolyticus.

Contiene un ion de zinc

esencial para la actividad catalítica y cuatro iones de calcio necesario

para la estabilidad térmica. No existen estudios en los que se utilice la

termolisina para aislar CMPD.

Se cultivaron, con este método, 16 pulpas de 15 pacientes de

edades comprendidas entre 19 y 67 años. El porcentaje de obtención

de CMPD fue del 100 %. La Tabla 6.7 recoge la información

referente a este método.

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Resultados

126

Sexo (de las

pulpas) Edad (años)

Tiempo

aislamiento

Porcentaje de

obtención

5 hombres

19 a 67

8 h. 2 pulpas

100 %

10 h. 4 pulpas

11 h. 1 pulpa

12 h. 1 pulpa

11 mujeres

14 h. 3 pulpas

15 h. 3 pulpas

17 h. 1 pulpa

23 h. 1 pulpa

Tabla 6.7. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 2 mg/ml de EDTA, colagenasa (4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de

termolisina y sonicación.

Se observó crecimiento de CMPD entre las 8 y las 23 horas

(Figura 6.8).

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Resultados

127

Figura 6.8. Imagen al microscopio óptico de un cultivo donde se realizó la digestión

de la pulpa de un hombre de 30 años con 2 mg/ml de EDTA, colagenasa

(4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de termolisina y sonicación. Imagen a las 40

horas desde el aislamiento.

Este método demostró, con una muestra amplia, el menor

tiempo de obtención de CMPD. Además, el rango, aunque también

fue amplio (8 a 23 horas), fue menor que con otros métodos.

6.2.7 Método H: Obtención de CMPD realizando la

digestión de la pulpa con 13ng/ml de termolisina

Se realizó este método para observar la capacidad de la

termolisina por sí sola (agente no descrito en la literatura para obtener

CMPD) para digerir la pulpa dental y obtener así células madre de este

tejido.

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Resultados

128

Tres pulpas, correspondientes a un hombre de 22 años y 2

mujeres de 19 y 24, se cultivaron y se observaron CMPD en 1 caso a

las 20 horas. El porcentaje de obtención de CMPD fue del 33%

(Tabla 6.8).

Sexo (de

pulpas)

Edad (años) Tiempo aislamiento Porcentaje de

obtención

1 hombre

19 a 24

No

crecimiento

2

pulpas

33 % 2 mujeres 20 horas Una

pulpa

Tabla 6.8. Datos descriptivos (sexo, edad, tiempo de aislamiento y porcentaje de

obtención de CMPD) de los pacientes y las pulpas a las cuales se realizó digestión

con 13ng/ml de termolisina.

En la Figura 6.9 se observa un cultivo donde se observaron

CMPD adheridas a los 4 días. La imagen corresponde al 6º día de

aislamiento.

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Resultados

129

Figura 6.9. Imagen al sexto día de cultivo de CMPD correspondientes a una mujer

de 19 años, aisladas con el presente método (digestión con 13ng/ml de termolisina).

Por tanto, el método H, en el cual se utiliza únicamente la

termolisina como agente digestivo, demostró la capacidad de aislar

CMPD. Este agente por sí solo no es capaz de mejorar el tiempo de

obtención de CMPD comparado con los métodos donde se combinan

distintos agentes.

6.2.8 Método I: Obtención de CMPD realizando

fragmentación mecánica

Se realizó este método para observar si se podían aislar CMPD

sin realizar la digestión enzimática o disgregación de la pulpa. Se

cultivaron 6 pulpas (de 2 hombres y 4 mujeres de entre 12 y 36 años)

realizando la fragmentación mecánica de éstas. Los cultivos se

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Resultados

130

revisaron cada 3 días durante 3 semanas. En ningún caso se observó

crecimiento de células madre.

Con lo cual, la disgregación mecánica sin más, no es suficiente

para obtener CMPD.

Los resultados del presente objetivo confirmaron que el tiempo

de aislamiento de CMPD difiere en función del tipo de tratamiento al

que se someta el tejido pulpar. No se encontraron, al microscopio

óptico, diferencias morfológicas en función de los distintos métodos

de obtención utilizados.

Se describe a continuación, el número de pulpas cultivadas,

tiempo de acción del agente disgregante/digestivo, el tiempo requerido

para la obtención y el porcentaje de obtención de CMPD con cada

método (Tabla 6.9).

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Resultados

131

Método Nº de

pulpas

Tiempo de

digestión de

la pulpa

(minutos)

Tiempo de obtención

de CMPD

Porcentaje

de

obtención

de CMPD

A 34 90 7-14 días 76%

B 4 30 7 días

50%

C 7 100 5-7 días 100%

D 13 780 1-10 días 84%

E 13 100 2-7 días 76%

F 24 50 0,5 días (13h) - 7 días 100%

G 16 50 0,3-0,9 días (8-23h) 100%

H 3 40 0,8 días (20h) 33%

I 6 - - 0%

Tabla 6.9. Método utilizado, número de pulpas, tiempo de digestión y obtención y

porcentaje de obtención de todas las pulpas cultivadas en los objetivos 1 (Método

A) y 2 (Métodos B-I). Método A: 2mg/ml colagenasa tipo I, 90 min. Método B:

2mg/mL EDTA, 30 min. Método C: 2mg/ml EDTA, 10 min + 2mg/ml colagenasa

tipo I, 90 min. Método D: 1mg/ml colagenasa tipo I, 13 horas. Método E: 2mg/ml

EDTA 10 min + 2mg/ml colagenasa tipo I + 4mg/ml dispasa tipo II, 90 min.

Método F: 2mg/ml EDTA, 10 min + 4mg/ml colagenasa tipo I + 4mg/ml dispasa

tipo II, 40 min + sonicar, 1 min. Método G: 2mg/ml EDTA, 10 min + 4mg/ml

colagenasa tipo I + 4mg/ml dispasa tipo II + 13ng/mL termolisina 40 min +

sonicar, 1min. Método H: Termolisina 13ng/ml 40 min.

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Resultados

132

6.3 Caracterización de CMPD

Una vez aisladas las células de la pulpa dental debemos de

asegurarnos que efectivamente corresponden a CMM. Por ello, se

realizó la caracterización de CMPD correspondientes a 2 cultivos de 2

pulpas distintas escogidas de forma aleatoria. Para dicha

caracterización se utilizaron marcadores de proteínas de membrana.

Además es importante determinar la presencia de varios marcadores

positivos y alguno negativo con el fin de asegurarnos que realmente

corresponde a CMM.

A continuación se describen los resultados obtenidos de los

marcadores CD-133 (proteína glicosilada que se ha detectado en

células repobladoras, progenitoras inmaduras y progenitoras de

monocitos/granulocitos), Oct4 (marcador de células madre

embrionarias), Nestin (proteína de función desconocida que se expresa

en CM neuroectodérmicas), Stro-1 (marcador de célula madre de

estroma, que reconoce el antígeno de células perivasculares, y que en

la médula ósea contiene precursores osteogénicos), CD34 (marcador

de célula madre pluripotente tanto de estroma como hematopoyético)

y CD45 (marcador de células hematopoyéticas). Cada marcador se

utilizó para caracterizar 2 pulpas distintas. Las células de la pulpa 1 se

obtuvieron realizando la digestión con 2mg/ml de colagenasa durante

90 minutos (Método A) y la pulpa 2 con 1mg/ml de colagenasa

durante 13 horas (Método C).

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Resultados

133

6.3.1 Caracterización mediante marcador de superficie

CD-133

Las células de ambas pulpas fueron positivas para el marcador

CD-133 tal y como se observa en la Figura 6.11 A y B.

Figura 6.10. Imagen de microscopía confocal mediante láser de argón y otro de

neón-helio con una longitud de onda de 543 nm de excitación y 555-621 nm de

emisión (color rojo). Imágenes A: 400x aumentos y B: 600x aumentos del marcador

positivo CD-133.

A

c

b

a

a

B

c

b

a

a

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Resultados

134

6.3.2 Caracterización mediante marcador de superficie

Oct4

Utilizando el marcador Oct4, las células obtenidas de las 2

pulpas fueron positivas como se observa en la Figura 6.12 A y B.

Figura 6.11. Imagen de microscopía confocal mediante láser de argón y otro de

neón-helio con una longitud de onda 488 nm de excitación y de 510-585 nm de

emisión (color verde). Imágenes A: 400x aumentos y B: 600x aumentos del

marcador positivo Oct4.

A

c

b

a

a

B

c

b

a

a

Page 145: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

135

6.3.3 Caracterización mediante marcador de superficie

Nestin

Los resultados de la caracterización con el marcador Nestin

fueron positivos (Figura 6.13 A y B).

Figura 6.12. Imagen de microscopía confocal con láser argón y otro de neón-helio

(longitud de onda 488 nm de excitación y de 510-585 nm de emisión color verde);

(longitud de onda de 543 nm de excitación y 555-621 nm de emisión: color rojo).

Imágenes A: 400x aumentos y B: 600x aumentos para el marcador positivo Nestin.

A

c

b

a

a

B

c

b

a

a

Page 146: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

136

6.3.4 Caracterización mediante marcador de superficie

Stro-1

Las células de ambas pulpas también fueron positivas para el

marcador Stro-1 tal y como se observa en la Figura 6.14 A y B.

Figura 6.13. Imagen de microscopía confocal mediante láser de argón y otro de

neón-helio con una longitud de onda 488 nm de excitación y de 510-585 nm de

emisión (color verde). Imágenes A: 400x aumentos y B: 600x aumentos del

marcador positivo Stro-1.

A

c

b

a

a

B

c

b

a

a

Page 147: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

137

6.3.5 Caracterización mediante marcador de superficie

CD-34

Las células de la pulpa 1 fueron positivas, tal y como muestra

la Figura 6.15, para el marcador CD-34, que es un marcador de célula

madre pluripotente tanto de estroma como hematopoyético. En

cambio las células de la pulpa 2 fueron negativas para este marcador.

Figura 6.14. Imagen de microscopía confocal mediante láser de argón y otro de

neón-helio con una longitud de onda 488 nm de excitación y de 510-585 nm de

emisión (color verde). Imagen a 400x aumentos.

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Resultados

138

6.3.6 Caracterización mediante marcador de superficie

CD-45

Las células de ambas pulpas fueron negativas para el marcador

CD-45, que es un marcador de células madre hematopoyéticas.

Los resultados de la caracterización confirmaron que las células

obtenidas de la pulpa dental correspondían a CMM. Estas células

fueron positivas para marcadores de células madre adultas (CD-133,

Nestin, Stro-1) y embrionarias (Oct4). Al ser células mesenquimales,

fueron negativas para células madre hematopoyéticas (CD-45). Una

línea fue positiva para CD-34 y la otra negativa.

6.4 Cultivo de CMPD a distintas presiones de

oxígeno

Mediante las distintas metodologías utilizadas en el segundo

objetivo (optimización del método de obtención de CMPD), se

consiguió acortar el tiempo de aislamiento y obtención de estas

células. Cultivando las CMPD a distintas concentraciones de O2, se

pretendió mejorar el rendimiento del crecimiento.

Se realizaron cultivos en unas condiciones de 3% y de 21% de

O2 y se cuantificó el número de células a las 6 horas, un, 2, 3, 5, 7 y 8

días. Se observó una mayor proliferación celular cultivando las células

al 3% que al 21% de O2 en todos los momentos en los que se realizó el

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Resultados

139

cómputo. En la Figura 6.10 se observa la cantidad de células contadas

en cada tiempo de cultivo. El número de células es la media de 4

cultivos distintos. Se observa cómo al 3% de O2, hay mayor

proliferación celular en todos los tiempos, y que los cultivos proliferan

hasta el 5º día, saturándose en ese momento. En los cultivos al 3% de

O2, el cómputo celular a los 2 días fue alrededor de 0,5.106 células, a

los 3 días, alrededor de 1.106 células y a los 5 días de cerca de 2.10

6

células. En todos los momentos descritos, el número de células de los

cultivos al 21% de O2 fue inferior. Las diferencias fueron

estadísticamente significativas.

Figura 6.15. Se observa el número de células contadas en cada tiempo de cultivo. El

número de células para cada momento es la media de 4 cultivos distintos. El eje

vertical indica el número de células y el eje horizontal el tiempo. Los valores de los

resultados de la curva de CMPD al 3 y al 21% de O2 están representados como la

media ± SEM. La significancia estadística se expresa como * p˂0´05; **p˂0´01;

***p˂0´001.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

6h 1 2 3 5 7 8

mer

o t

ora

l d

e cé

lula

s x

10

6

Días

3% O2 21% O2

**

*

***

***

**

*

Page 150: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

140

6.5 Adhesión y crecimiento de CMPD sobre β-

fosfato tricálcico

Para el uso clínico de células madre, y concretamente en el

campo de la regeneración ósea, estas células han de ser aplicadas

mediante matrices, y no de forma aislada. Por ello se estudió la

interacción de estas células con el biomaterial de regeneración ósea β-

fosfato tricálcico.

6.5.1 Adhesión de CMPD sobre β-fosfato tricálcico

La adhesión de las células al β-fosfato tricálcico se determinó

mediante microscopía óptica. En la Figura 6.16 a-d se puede

observar, la adhesión y crecimiento de las CMPD sobre β-fosfato

tricálcico en los correspondientes días:

Día 7: Se observa el biomaterial en color oscuro (flecha roja) y

CMPD adheridas a éste (flecha verde) (Figura 6.16a).

Día 13: La imagen es similar a la primera. Siguen

observándose células adheridas al biomaterial (Figura 6.16b).

Día 18: Existe un gran incremento de CMPD desde el día 13.

Las CMPD (flecha verde) ocupan todos los huecos formados

entre las partículas de biomaterial (flecha roja) (Figura 6.16c).

Día 23: Las células siguen ocupando los espacios formados

entre las distintas partículas de β-fosfato tricálcico (Figura

6.16d).

23 días

18 días

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Resultados

141

Figura 6.16. Imágenes con microscopía óptica a distintos aumentos (40-400x) de

CMPD (flecha verde) adheridas a β-fosfato tricálcico (flecha roja). A: A los 7. B:

13. C: 18 y D: 23 días de cultivo.

6.5.2 Crecimiento de CMPD sobre β-fosfato tricálcico

El número de CMPD se determinó realizando la

correspondencia con la cantidad de DNA desde el séptimo hasta el

vigesimotercer día. En primer lugar se realizó una correspondencia

entre un número concreto de células y la cantidad de DNA en esas

211

c

c

b

a

a

Page 152: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

142

células. De esta manera se pudo saber cuántas células había en

relación a la cantidad de DNA extraído a dichas células. Se

observaron los siguientes resultados: con 250000, 500000, un millón

y 2 millones de células, se observó una concentración de DNA de

12.8, 18.8, 30 y 64.7 respectivamente (datos expresados en ng/µL).

Estos datos vienen reflejados en la Figura 6.17.

Figura 6.17. Relación entre el número de células y la concentración de DNA.

Una vez realizada la curva patrón, se midió la cantidad de

DNA sobre el biomaterial a los 7, 13, 18 y 23 días respectivamente. Se

realizó posteriormente la correspondencia entre la cantidad de DNA

medida y el número de células. Los resultados fueron: 24500, 411000,

1,42 millones y 12,4 millones de células en cada uno de los citados

días respectivamente. En la Figura 6.18 se observa la correspondencia

Page 153: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Resultados

143

entre la concentración de DNA (en ng/µL) y el número de células

desde el inicio del cultivo hasta los 23 días.

Figura 6.18. Gráfica donde se observa la correspondencia entre la concentración de

DNA (en ng/µL) y el número de células. Las mediciones de DNA se realizaron los

días 7, 13, 18 y 23. Se observó un incremento en la cantidad de células a lo largo del

intervalo de tiempo.

Por lo tanto podemos decir que las CMPD se adhieren al

biomaterial y son capaces de crecer sobre el mismo.

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7 DISCUSIÓN

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Discusión

147

7.1 Obtención de CMPD

7.1.1 Extracción de pulpa dental

En la mayoría de los estudios encontrados en la literatura

(Zhang W y cols. 2008), (Gandia C y cols. 2008), (Graziano A y cols.

2008) se obtuvieron pulpas de dientes extraídos, los cuales fueron

seccionados para acceder a la cavidad pulpar; normalmente estos

dientes fueron terceros molares. Huang y cols. (Huang AH y cols.

2008) cultivaron y caracterizaron CMPD de un mesiodens. En un

estudio reciente (Huang AH y cols. 2009) se obtuvo la pulpa dental

mediante una lima de endodoncia a un diente no extraído que requería

tratamiento de conductos y cuya pulpa no presentaba inflamación o

infección. Pereira y cols. (Pereira LO y cols. 2012) compararon las

células madre de pulpas normales y de pulpas que presentaban

inflamación. No encontraron diferencias morfológicas ni de

proliferación de las células de ambos tipos de pulpas antes y después

de la separación de las células STRO-1 positivas. Los autores

concluyeron que el proceso inflamatorio no afectó a las propiedades

de las células madre. En la presente tesis se obtuvieron las pulpas de

dientes sin signos de inflamación y/o infección, extraídos y

seccionados para la obtención del tejido pulpar.

Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008) lavaron los dientes con

PBS estéril, a continuación lo sumergieron en una solución de

Page 158: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

148

povidoneiodina al 1% durante 2 minutos y en tampón fosfato al 1%

durante 1 minuto más para finalizar. En la presente tesis, el diente se

sumergió en medio de cultivo tras la exodoncia. De todas las muestras

cultivadas, se produjo contaminación bacteriana en un cultivo y

ninguna contaminación fúngica, mientras que en el estudio de Perry y

cols. (Perry BC y cols. 2008) se contaminaron por hongos 7 de 40

cultivos. Según estos datos, la contaminación del cultivo no está

relacionada con el lavado del diente extraído.

7.1.2 Almacenamiento y transporte

Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008) estudiaron el crecimiento

en función del tiempo entre la exodoncia y el cultivo en 54 pulpas.

Según este estudio, se pueden obtener CMPD hasta 120 horas tras la

exodoncia. Observaron menor crecimiento de células tras 72 horas

entre exodoncia y cultivo. También estudiaron el crecimiento en

función de la solución en la cual se transportó el diente al laboratorio.

Observaron mayor crecimiento celular cuando el diente fue

transportado con suero bovino fetal (Sigma Chemical, St. Louis, MO),

en los casos en que el cultivo se realizó a la hora o 120 horas tras la

exodoncia. Cuando el cultivo se realizó a las 24, 48 ó 72 horas el

mayor crecimiento celular se observó cuando los dientes se

transportaron en HypoThermosol (HTS; BioLife Solutions, Bothell,

WA). En todos los casos se observó menor crecimiento celular al

transportar los dientes con medio de cultivo Mesen Cult® (StemCell

Technologies, Vancouver, BC, Canadá). La muestra siempre la

Page 159: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

149

transportaron en hielo. En el presente estudio hubo un intervalo de

tiempo entre 1 hora y 4 días entre la exodoncia y el aislamiento.

Durante este tiempo el diente se conservó a 4ºC en medio de cultivo.

Aunque este dato no se registró específicamente en cada una de las

muestras, se obtuvieron CMPD realizando la digestión hasta 4 días

después de la extracción del diente. Respecto a la solución en la cual

se transportó la pulpa, siempre fue medio de cultivo Dulbecco´s

modified Eagle® con suplemento bajo de glucosa (1mg/ml),

antibióticos (penicilina y estreptomicina), y a temperatura ambiente.

7.1.3 Aislamiento y cultivo de CMPD

Gronthos y cols. (Gronthos S y cols. 2000) fueron, en el año

2000, los primeros en aislar CMM de pulpa dental en humanos. Para

aislar las células, realizaron la digestión de la pulpa con una solución

de 3 mg/ml colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa durante 90 minutos

a 37°C. Muchos autores (Takeda T y cols. 2008), (Liu H y cols. 2005),

(Graziano A y cols. 2008), (Papaccio G y cols. 2006; Sonoyama W y

cols. 2008), (Scheller EL y cols. 2008), (Lindroos B y cols. 2008)

utilizaron este protocolo para aislar CMPD. Otros autores (Huang AH

y cols. 2008), (Huang AH y cols. 2009), (Koyama N y cols. 2009)

también utilizaron estos reactivos pero reduciendo el tiempo de

digestión a una hora. Waddington y cols. (Waddington RJ y cols.

2009) utilizaron 4 mg/ml de colagenasa/dispasa durante 1 hora. Otro

método de aislamiento válido, es aislar la pulpa realizando la digestión

con colagenasa tipo I y tipo II y con termolisina proteasa durante 40

Page 160: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

150

minutos a 37 Cº (Perry BC y cols. 2008). Zang y cols. (Zhang W y

cols. 2008) efectuaron la digestión con 3 mg/ml de colagenasa tipo I.

Sasaki y cols. (Sasaki R y cols. 2008) cultivaron CMPD de ratas,

realizando la digestión con tripsina/EDTA al 0.25 % durante 15

minutos.

Uno de los protocolos realizados en el presente estudio fue

digerir la pulpa con 2 mg/ml de colagenasa tipo I durante 90 minutos a

37ºC, método utilizado previamente en otros estudios (Gandia C y

cols. 2008). También hemos conseguido cultivar CMPD realizando la

disgregación de la pulpa con EDTA, metodología que no está descrita

en la literatura, o con 1mg/ml de colagenasa durante 13 horas,

metodología ya descrita para el aislamiento de células de córnea (Li

W y cols. 2007). Los mejores resultados fueron obtenidos al realizar la

digestión de la pulpa con 2 mg/ml de EDTA, colagenasa

(4mg/ml)/dispasa (4mg/ml), 13ng/ml de termolisina y sonicación, ya

que se empezaron a observar las primeras CMPD a las 8 horas del

cultivo. Sin embargo, al realizar la disgregación mecánica de la pulpa,

no conseguimos cultivar CMPD. Este resultado contrasta con los de

otros estudios (Pierdomenico L y cols. 2005), (Karamzadeh R y cols.

2012) donde obtuvieron CMPD fragmentando la pulpa sin ningún tipo

de digestión. Karamzadeh y cols. (Karamzadeh R y cols. 2012)

estudiaron la obtención de CMPD realizando la digestión de la pulpa o

mediante fragmentación mecánica. Obtuvieron células mediante las 2

metodologías; realizando la digestión, aislaron las CMPD a los 3-5

días y fragmentando al 5º día. Las células fueron iguales

Page 161: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

151

morfológicamente con ambos métodos concluyendo los autores que el

protocolo utilizado para aislar las células no afecta al tipo celular.

Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008) cultivaron 40 pulpas

realizando la digestión con colagenasa tipo I y tipo II y con

termolisina proteasa durante 40 minutos a 37 Cº. De éstas, observaron

crecimiento en 31, contaminación por hongos en 7 y no observaron

crecimiento en 2 casos. En esta tesis, se cultivaron 23 pulpas

realizando la digestión con 2 mg/ml de colagenasa tipo I durante 90

minutos. Se observó crecimiento de CMPD en 20 casos, en 2 casos no

se observó crecimiento, y en 1 caso se observó contaminación

bacteriana. No hubo contaminación por hongos en ningún caso, y al

contrario que en estudio de Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008) el

medio que se utilizó en nuestro trabajo no contenía antifúngicos.

Según estos datos, la presencia o ausencia de antifúngicos en el medio

de cultivo, no influye en la contaminación de éste. Perry y cols. (Perry

BC y cols. 2008) atribuyen la contaminación fúngica más a causas

endógenas del huésped que a una contaminación postexodoncia.

Recientemente, Kanafi y cols. (Kanafi MM y cols. 2013)

compararon la proliferación de CMPD utilizando 3 medios de cultivo

distintos. Observaron mayor proliferación al cultivar las células con

Dulbecco's modified Eagle's médium que con α-MEM o DMEM/F12.

Los autores opinan que hay que mejorar las condiciones de cultivo de

las CMPD y establecer protocolos para aplicar clínicamente las

técnicas que mediante ingeniería tisular se han descrito durante los

últimos años. En un estudio reciente se comparó la proliferación de

Page 162: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

152

CMPD utilizando 4 tipos distintos de medio de cultivo sin suero. Las

células proliferaron más en DMEM con 1% de insulina, transferrina,

selenio y 100 mg/mL de factor embriotrófico. Suchanek y cols.

(Suchanek J y cols. 2009) cultivaron CMPD en medio de cultivo con 2

ó 10% de suero bovino fetal o con 2% de suero bovino fetal con ITS

(medio de suplementos con insulina, transferrina y selenio)

Observaron que al añadir ITS en el medio de cultivo, la proliferación

celular aumentaba claramente. Además observaron que el diámetro de

las células no se alteró en función del medio de cultivo utilizado.

Ferro y cols. (Ferro F y cols. 2012) cultivaron CMPD con 1,25% de

suero humano en vez de 10% de suero bovino fetal (que es lo que

clásicamente se utiliza). Se encontró alta uniformidad y proliferación

en el cultivo y propiedades celulares similares (en cuanto a

caracterización y diferenciación) a las células cultivadas con 10% de

suero bovino fetal. En esta tesis se utilizó siempre el mismo medio de

cultivo, Dulbecco´s modified Eagle® (DMEM), con suplemento de

glucosa (1mg/mL) y suero bovino fetal.

7.1.4 Criopreservación

Aunque no fue uno de los objetivos de esta tesis, se

criopreservaron distintos cultivos con el fin de tener CMPD

disponibles para realizar distintos experimentos. No se recogieron los

datos con protocolos establecidos, pero dado el interés de la literatura

científica en este campo, se realizan a continuación algunos

comentarios al respecto. Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008)

Page 163: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

153

cultivaron CMPD de 31 casos después de criopreservar las pulpas.

Observaron crecimiento en todos los casos. En cambio, al

criopreservar los dientes y extraer las pulpas después de

descongelarlos, observaron crecimiento de CMPD en 7 de 10 pulpas.

No encontraron diferencias en el crecimiento del cultivo,

caracterización y diferenciación de CMPD antes y después de

criopreservarlas. Papaccio y cols. (Papaccio G y cols. 2006)

observaron que las CMPD, las cuales habían sido criopreservadas

durante 2 años, eran capaces de diferenciarse hacia osteoblastos sin

alteraciones morfológicas, y además expresaban sus respectivos

antígenos de superficie. En otro estudio, otros autores (Zhang W y

cols. 2006) observaron que CMPD expresan Stro-1 después de ser

criopreservadas. Los autores no especifican el tiempo de

criopreservación. Lee y cols. (Lee SY y cols. 2010) compararon la

viabilidad, morfología y expresión de marcadores de CMPD obtenidas

de dientes congelados magnéticamente durante 7 días y de CMPD de

dientes no congelados. El porcentaje de obtención de células fue del

73% en dientes congelados y del 100% en el grupo control. Ambos

grupos fueron positivos para los marcadores CD-44 y Stro-1 y

negativos para CD-34 y la morfología celular no varió entre grupos.

En esta tesis, se criopreservaron 19 cultivos de CMPD a los

cuales se les había realizado al menos un pase. Al descongelar uno

(mujer de 25 años), se observó que la viabilidad de las CMPD era

elevada tras la criopreservación puesto que a la semana de

descongelarlas y cultivarlas, la placa estaba subconfluente. En cambio,

Page 164: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

154

en los casos en los cuales el intervalo de tiempo entre la

criopreservación y el descongelamiento de las CMPD era superior a

los 2 meses, no se encontraba viabilidad celular.

7.2 Optimización del método de obtención

CMPD

Como se ha señalado antes, Gronthos y cols. (Gronthos S y

cols. 2000) fueron los primeros en aislar CMPD realizando la

digestión de la pulpa con una solución de 3 mg/ml colagenasa tipo I y

4 mg/ml de dispasa durante 90 minutos a 37°C. Existen estudios

(Takeda T y cols. 2008), (Liu H y cols. 2005), (Graziano A y cols.

2008), (Papaccio G y cols. 2006), (Sonoyama W y cols. 2008),

(Lindroos B y cols. 2008; Scheller EL y cols. 2008) en los cuales se ha

utilizado esta metodología y otros (Waddington RJ y cols. 2009),

(Perry BC y cols. 2008), (Zhang W y cols. 2008) donde se han

utilizado otros reactivos.

Uno de los protocolos realizados en el presente estudio fue

digerir la pulpa con 2 mg/ml colagenasa tipo I durante 90 minutos a

37ºC, método utilizado previamente en otro estudio (Gandia C y cols.

2008). También se cultivó CMPD realizando la disgregación de la

pulpa con agentes que no han sido utilizados según la literatura como

EDTA o sonicando el cultivo tras su digestión. Se debe resaltar el

hecho de haber aislado CMPD únicamente realizando la disgregación

Page 165: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

155

de la pulpa con EDTA, que es un agente quelante del Ca que rompe

los desmosomas que unen las células, y no un agente digestivo (como

la colagenasa, dispasa, termolisina, etc.) que digiere la red de

proteínas intercelulares. El EDTA se ha utilizado para aislar otras

células como hepatocitos (Viña J. y cols. 1978), pero no hemos

encontrado ningún estudio en la literatura en el que se aíslen CMPD

únicamente con EDTA. Los estudios siempre usan agentes digestivos

o fragmentación mecánica sin digestión ni disgregación.

Además, se observó que los mejores resultados se obtuvieron

al combinar distintos agentes, tanto disgregantes (EDTA), digestivos

(colagenasa, dispasa…), como mecánicos (sonicación). El tiempo

mínimo para obtener CMPD fue utilizando 2mg/ml EDTA durante 10

minutos, 4mg/ml de colagenasa tipo I, 4mg/ml de dispasa tipo II

durante 40 minutos y 13ng/ml de termolisina durante 40 minutos y

sonicando un minuto. Con este método se observaron las primeras

CMPD a las 8 horas. El tiempo de aislamiento de este método difiere

mucho de los encontrados en la literatura. Al realizar la disgregación

mecánica de la pulpa, no conseguimos cultivar CMPD. Este resultado

contrasta con los de otro estudio, (Pierdomenico L y cols. 2005) en el

cual observaron CMPD con este método.

No existen muchos estudios en la literatura que realicen series

largas de cultivos de CMPD. En la mayoría de los trabajos no se

detalla el tiempo de aislamiento de estas células, o el método de

cultivo realizado. Sólo algunos trabajos como los de Laino y cols.

(Laino G y cols. 2006) o Takeda y cols. (Takeda T y cols. 2008)

Page 166: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

156

detallan que obtienen CMPD a los 5 días de aislamiento utilizando el

protocolo original descrito por Gronthos y cols. (Gronthos S y cols.

2000) (3 mg/ml colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa durante 60

minutos). Perry y cols. (Perry BC y cols. 2008) obtuvieron CMPD a

las 24 horas de aislamiento. La metodología utilizada por estos autores

fue realizar la digestión de la pulpa con colagenasa tipo I y II y

termolisina durante 40 minutos. Ellos cultivaron 40 pulpas. De éstas,

observaron crecimiento en 31, contaminación por hongos en 7 y no

observaron crecimiento en 2 casos. En la presente tesis, se obtuvo un

porcentaje total de obtención del 80,8%. No hubo contaminación por

hongos en ningún caso, y al contrario que en estudio de Perry y cols.

(Perry BC y cols. 2008) el medio que se utilizó en nuestro estudio no

contenía antifúngicos.

Asimismo tampoco se observaron diferencias importantes en la

tasa de crecimiento de las células según la edad del paciente, no

obstante es muy probable que las haya, pero las perdiéramos por los

diferentes métodos de obtención empleados.

7.3 Crecimiento de CMPD a distintas

concentraciones de O2

Los resultados del segundo objetivo (optimización del método

de obtención de CMPD) demostraron que es posible acortar el tiempo

necesario para conseguir CMPD (tiempo necesario para que aparezcan

Page 167: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

157

células adheridas a la placa a partir de un fragmento pulpar). Otro de

los objetivos planteados fue evaluar el crecimiento de las CMPD a

distintas concentraciones de O2. El aire ambiental tiene una

concentración de O2 del 21%, en cambio, a nivel celular, la

concentración de O2 es del 3% (Chow DC y cols. 2001). Los cultivos

celulares se han realizado clásicamente con concentraciones de O2

ambientales. La hipótesis de este objetivo fue que las CMPD debían

proliferar más a niveles tisulares de O2 (3%) que a niveles ambientales

(21%). De esta manera se intentó mejorar las condiciones de cultivo

para incrementar la proliferación de las CMPD y así acortar el tiempo

en el que se obtiene un gran número de células.

Existen muy pocos estudios publicados sobre la concentración

ideal de O2 para el cultivo de CMPD. Sakdee y cols. (Sakdee JB y

cols. 2009) observaron que las células proliferaban más al 3% que al

20% y que el marcador CD133 (marcador de células madre

hematopoyéticas, endoteliales y neuronales) decrecía al 3% de O2

mientras que el Stro-1 aumentaba. Li y cols. (Li L y cols. 2011)

evaluaron la viabilidad celular y la capacidad de las células pulpares

de formar tejido mineralizado. Observaron mejores resultados al 5%

que al 21%. Wang y cols. (Wang J y cols. 2010) compararon la

proliferación celular utilizando 3 grupos: un grupo control con

condiciones de 21% de O2, y 2 grupos estudio, uno en el cual el cultivo

permanecía 24 horas en condiciones de isquemia (2% de O2) y otro

que permanecía 48 horas en esas condiciones. Observaron, entre el

quinto y séptimo día de cultivo, que las CMPD que habían

Page 168: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

158

permanecido en isquemia proliferaban menos que las del grupo

control.

En el presente estudio se comparó la proliferación con

condiciones tisulares de O2 (3%) y presión ambiental (21% de O2). Se

observó mayor proliferación al 3% que al 21% de O2 en los distintos

tiempos en los cuales se realizaron las mediciones (6 horas, un, 2, 3, 5,

7 y 8 días). Además, las diferencias fueron estadísticamente

significativas en todos los momentos medidos. Es decir, se demostró,

en la misma línea que los estudios mencionados previamente, que la

presión tisulares de O2 mejora las condiciones de cultivo. Ello es

importante si valoramos el posible uso de CMPD en las distintas

aplicaciones clínicas, puesto para ello, se requiere un gran número de

células en el menor tiempo posible.

7.4 Caracterización de CMPD

En el presente estudio se realizó la caracterización de 2 pulpas

distintas. Los resultados fueron positivos para los marcadores de

superficie CD-133, Oct4, Nestin, Stro-1. Una pulpa fue positiva para

el marcador CD-34, que es un marcador de célula madre pluripotente

tanto de estroma como hematopoyético; en cambio, la otra pulpa fue

negativa para este mismo marcador. Para el antígeno CD-45,

marcador de células madre hematopoyéticas, las células de ambas

pulpas fueron negativas. Estos resultados concuerdan con los

publicados en la literatura, ya que el marcador de superficie CD-45, al

Page 169: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

159

ser un marcador de células hematopoyéticas, debe ser negativo para

células madre de pulpa dental, que corresponde a células madre de

origen mesenquimal. La literatura ha estudiado la caracterización de

las CMPD con distintos marcadores como el CD44 (marcador

mesodérmico y mesenquimal) (Pittenger MF y cols. 1999), anti-nestin

(marcador ectodérmico) (Guerette D y cols. 2007), o anticytokerantin

(marcador endodérmico) (Michel M y cols. 1996). Las CMPD de

pulpa dental son positivas para estos marcadores (Hirata TM y cols.

2010). Además, debido a su origen embrionario son también positivas

para el marcador de CD117 que interacciona con el factor de células

madre y el precursor de cresta neural (Suchanek J y cols. 2009).

Aunque las células madre de pulpa son multipotentes (células madre

adultas), se ha demostrado que se les puede inducir pluripotencialidad

(Hu B y cols. 2006). Las células madre embrionarias son

pluripotentes, y es quizá por esto que obtuvimos resultados positivos

para los marcadores de células madre pluripotentes como el Oct-4 y

CD-34. Concretamente, para el marcador CD-34, obtuvimos

resultados positivos para una pulpa y negativos en la otra. Este

resultado se puede llegar a explicar estudiando la literatura científica,

ya que para este marcador, existen publicados resultados tanto

positivos (Laino G y cols. 2006) como negativos (Suchanek J y cols.

2009; Lee SY y cols. 2010).

Page 170: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

160

7.5 Adhesión y crecimiento de CMPD a β-fosfato

tricálcico.

El β-fosfato tricálcico es un biomaterial ampliamente utilizado

para la regeneración ósea. La adhesión y el crecimiento de CMPD fue

evaluada mediante microscopía óptica y cómputo de DNA. Existen

distintos estudios donde se ha estudiado la interacción de CMM sobre

distintos biomateriales. Utilizando CMM procedentes de pulpa dental

sobre β-fosfato tricálcico únicamente hemos encontrado un trabajo

realizado por Khanna- Jain y cols. (Khanna-Jain R y cols. 2013),

quienes observaron proliferación celular sobre el biomaterial.

Compararon además, la diferenciación osteogénica utilizando

dexometasona y vitamina D3; observando con este último más

expresión osteogénica.

Se ha evaluado la interacción de CMM de origen dental no

pulpares sobre distintos biomateriales; Heo y cols. (Heo YY y cols.

2010) cultivaron células madre de ligamento periodontal sobre discos

de titanio liso maquinado chorreado con partículas de Al2O3. Tete y

cols. (Tete S y cols. 2007) estudiaron, mediante microscopía

electrónica, la interacción de células madre de folículo dental sobre

hueso bovino desproteinizado (Bio-Oss®). Observaron que las células

tenían la morfología típica de CMM y que eran positivas para los

marcadores mesenquimales CD29, CD90, CD146 and CD166.

Asimismo, tras la inducción osteogénica, las células adquirieron la

morfología de osteoblasto y fueron capaces de depositar matriz

Page 171: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

161

extracelular en contacto con el biomaterial. Soria y cols. (Soria JM y

cols.) cultivaron CMPD sobre un polímero. Observaron que en

presencia de células de cresta neural, existía una secreción de factores

neurotróficos por parte de las células pulpares.

Además, se ha observado crecimiento de CMM de médula ósea

sobre distintos materiales de regeneración ósea, membranas o

superficies. Así, podemos encontrar estudios con hidroxiapatita

(Herten M y cols. 2009; Lock J y cols. 2012), hidroxiapatita con

colágeno residual (Tutodent®), β-fosfato tricálcico (Cerasorb®)

(Oliveira JM y cols. 2006), hidroxiapatita enriquecida con péptido p-

15 (PepGen P-15®), α-fosfato tricálcico (BioBase®) (Herten M y

cols. 2009), xenoinjerto, fosfato tricálcico y fosfato cálcico (Catledge

SA y cols. 2004), membranas de colágeno (Mrozik KM y cols. 2011),

películas de partículas depositadas de cerámica metálica

nanoestructurada y discos de titanio de plasma nitrados (Liu Q y cols.

2011). En la presente tesis se estudió, mediante microscopía óptica y

cómputo de DNA, la adhesión y crecimiento celular sobre β-fosfato

tricálcico. Se observó, a partir del séptimo día de cultivo, un

crecimiento de CMPD progresivo hasta el vigesimotercer día.

Se han utilizado distintas metodologías para evaluar la

interacción de estas células sobre biomateriales. Roldán y cols.

(Roldan JC y cols. 2010) evaluaron la polarización y migración de

CMM sobre xenoinjerto, fosfato tricálcico y fosfato cálcico mediante

microscopía confocal. Hasegawa y cols. (Hasegawa T y cols. 2010)

cultivaron CMM de médula ósea sobre β-fosfato tricálcico; evaluaron

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Discusión

162

la proliferación celular mediante 4 formas distintas de cultivo:

mojando el biomaterial, a baja presión, pipeteando o con sistema de

jeringas. Observaron que el mayor número de células contenidas sobre

el biomaterial se obtuvo utilizando jeringas. Además, mediante este

sistema, después de 2 semanas, se observó el mayor potencial de

osteoinducción in vitro, y a las 8 semanas, también in vivo. El esta

tesis, se evaluó la cantidad de células sobre el biomaterial

cuantificando el DNA. Al determinar la cantidad de DNA, se estimó

el número de células que había en cada momento. Para poder hacer la

correspondencia, se realizó previamente una curva patrón

cuantificando el DNA que había en distintas cantidades concretas de

células. De esta manera se pudo cuantificar el número de CMPD sobre

β-fosfato tricálcico en cada momento. Esta metodología ha sido

utilizada por autores como Oliveira y cols. (Oliveira JM y cols. 2006).

Hay que concretar que para contar el DNA se despegaron las células

del biomaterial y posteriormente se extrajo el DNA de éstas. Khanna-

Jain y cols. utilizaron un reactivo que permite medir el DNA cuando

las células están en contacto con biomaterial, evitando así, los

problemas que se derivan del aislamiento del DNA que se adhiere al

biomaterial por interacciones electroestáticas (DNA tiene carga

negativa mientras que el biomaterial positiva) (Khanna-Jain R y cols.

2013).

Page 173: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

163

7.6 Limitaciones del estudio

No se pudo relacionar el porcentaje de obtención y el tiempo

de aislamiento de CMPD con la edad y el sexo de los pacientes. Es

probable que existan diferencias pero quizá por la cantidad de

métodos utilizados y por la heterogeneidad de la muestra (más

mujeres que hombres y más jóvenes que viejos) no nos ha sido posible

establecer una relación.

De hecho, la edad del donante parece ser importante, aquellos más

jóvenes tienden a proporcionar un mayor rendimiento de las células

madre en aspirados de médula (D'Ippolito G y cols. 1999; Stolzing A

y cols. 2008). Por otra parte, las células de donantes mayores

proliferan menos que las de los jóvenes (Stenderup K y cols. 2003).

Recientemente se ha visto que CMPD tienen la habilidad de proliferar

independientemente de la edad del donante, pero en cultivo con varios

pases (8 pases) solo las células de donantes jóvenes (hasta 35 años)

proliferaban (Bressan E y cols. 2012). Atari y cols. (Atari M y cols.

2012) observaron en CMPD, que el porcentaje de células

SSEA4+ aumentaba con la edad, mientras que el número de células

OCT3/4+ y CD13

+ disminuía. Además, los mismos autores vieron que

los marcadores embrionarios seguían estando expresados en CMPD de

pacientes de 58 años.

Se obtuvieron CMPD de pulpas de distintos dientes extraídos

que cumplieron los criterios de inclusión para el estudio. No se

Page 174: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

164

compararon los resultados de la obtención en función del diente. La

mayoría fueron terceros molares y premolares extraídos por motivos

ortodóncicos. Por motivos anatómicos, las pulpas de los molares

fueron más voluminosas. En algunos dientes, la pulpa se encontraba

atrofiada y no se pudo obtener ningún tejido. Esto fue más frecuente

en dientes uniradiculares y de pacientes mayores.

Uno de los objetivos fue comparar la proliferación celular a

distintas concentraciones de O2. Se utilizaron estufas de cultivo con

unas presiones de 3 y 21% de O2. En este objetivo encontramos el

problema de que durante el tiempo que se procesaba el tejido pulpar

en la campana de cultivo (fragmentar la pulpa, centrifugarla…), las

condiciones de presión de O2 fueron las del ambiente, es decir 21%.

Aunque este tiempo es reducido, hubo momentos en los cuales, pulpas

cultivadas a 3% de O2 se encontraron en condiciones de 21% de O2.

Una de las dificultades de la presente tesis fue evaluar la

interacción de las CMPD sobre el biomaterial β-fosfato tricálcico.

Comercialmente el biomaterial se presenta en forma granulada, pero

para el estudio se utilizó un agregado del biomaterial que conformaba

un disco. La adhesión de las CMPD se pudo evaluar mediante el

microscopio óptico. La proliferación celular se evaluó cuantificando el

DNA extraído es los distintos momentos. Uno de las dificultades fue

extraer el DNA, que es ácido, del biomaterial, que es básico. La

literatura científica no aclara muy bien este problema en la

metodología de las publicaciones. Muy recientemente, Khanna- Jain y

cols. (Khanna-Jain R y cols. 2013) utilizaron un reactivo que permite

Page 175: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

165

medir el DNA cuando está en contacto con el propio biomaterial, de

manera que no es necesario extraer el DNA de las células que están

sobre el biomaterial. El inconveniente que encontramos a este método

es que, al ser el biomaterial poroso, las células se introducen en estos

poros y no se puede computar el DNA que no está en la superficie

externa del biomaterial.

Se intentó además, en esta tesis, estudiar la interacción de

CMPD sobre otros biomateriales de regeneración ósea (hidroxiapatita,

hueso mineral bovino desproteinizado). Con estos biomateriales se

utilizó la forma comercial granulada. Encontramos el problema que

las células se adherían a la placa de cultivo y no al biomaterial dado la

gran afinidad de las células a adherirse al plástico.

7.7 Proyecciones del estudio

La ingeniería tisular combina células y matrices para regenerar o

reparar los tejidos. Esta tesis estudia distintos métodos para acortar el

tiempo de aislamiento y de obtención de CMPD. Además también se

estudia la presión de O2 idónea para aumentar la proliferación del

cultivo celular. Se estudia también la interacción de la CMPD con β-

fosfato tricálcico. Enfocamos de esta manera esta tesis hacia el campo

de la regeneración ósea con células madre. Todos estos factores están

encaminados a facilitar la aplicación clínica de estas células. La

continuación de este estudio consistiría en realizar una

experimentación animal para evaluar si se puede extraer las células de

Page 176: “Obtención y caracterización de células madre de pulpa ... · Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Estomatología “Obtención y caracterización de células

Discusión

166

la pulpa dental, e injertarlas en un mismo acto quirúrgico. Dado que la

legislación en Europa no permite extraer un tejido, expandir las

células, e injertarlas en un acto quirúrgico distinto, hace que la posible

aplicación de CMPD sea complicada. Por esta razón los estudios en

humanos realizados en Europa donde se han aplicado células madre en

el campo de la cirugía bucal (Gonshor A y cols. 2011) se han llevado

a cabo con células madre de médula ósea mediante punción

aspiración. De esta manera se obtiene gran cantidad de células y no es

necesario expandirlas en cultivo. El inconveniente es que se necesita

de un campo extraoral para obtener las células. Las CMPD tienen la

ventaja de que el acceso y la obtención son sencillas. Además existen

estudios donde se han aislado las células de dientes no extraídos

(Huang AH y cols. 2009) o con pulpitis irreversible (Li W y cols.

2007). Otro aspecto que la literatura no ha investigado a fondo es la

optimización del número de células para acelerar la regeneración ósea.

Sería interesante comparar la formación ósea con un solo biomaterial

y distinto número de células. Estas líneas de investigación facilitaran

la aplicación de estas terapias de ingeniería tisular en humanos, las

cuales permiten ser menos invasivo y acortar los tiempos de

tratamiento.

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8 CONCLUSIONES

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Conclusiones

169

1- En nuestro grupo hemos obtenido células madre de pulpa

dental, permitiéndonos así, determinar las condiciones óptimas

para su aislamiento y cultivo.

2- De todos los métodos empleados para su obtención, la

digestión de la pulpa con EDTA, colagenasa/dispasa,

termolisina y sonicación, fue el que demostró mayor velocidad

de aislamiento de las células.

3- Las células obtenidas de la pulpa dental fueron positivas para

los marcadores CD-133, Oct4, Nestin, Stro-1, demostrando sus

características de células madre mesenquimales. Además

fueron negativas para el marcador de células madre

hematopoyéticas CD-45. El marcador CD-34 fue positivo en

un caso y negativo en otro.

4- Las células madre de pulpa dental mostraron una tasa de

proliferación mayor al ser cultivadas bajo condiciones

fisiológicas de O2 (3%) que bajo condiciones ambientales

(21% O2).

5- Las células madre de pulpa dental tienen la capacidad de

adherirse y proliferar sobre el biomaterial de regeneración ósea

β-fosfato tricálcico.

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9 BIBLIOGRAFÍA

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