Post on 09-Nov-2018
i
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR
Ana Heloneida de Araújo Morais
Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum
(seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta
Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima
Licopeno-β-ciclase
Brasília-DF
Dezembro, 2007
Tese de Doutoramento em Ciências Biológicas-Biologia Molecular apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de doutor pelo Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília. Orientadora: Dra Damares de Castro Monte Co-orientadora: Dra Maria Esther de Noronha Fonseca Boiteux Co-orientadora: Dra Elionor Rita Pereira de Almeida
ii
É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta tese e
emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor
reserva outros direitos de publicação e nenhuma parte desta tese de doutorado pode ser
reproduzida sem a autorização por escrito do autor.
Ana Heloneida de Araújo Morais
Morais, Ana Heloneida de Araújo.
Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase/ Ana Heloneida de Araújo Morais
Brasília, 2007.
106p. : il. Tese de Doutorado. Departamento de Biologia Celular (IB),
Universidade de Brasília, Brasília. 1. Variabilidade, Carotenóides, Tomate, Alimento funcional.
iii
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR
Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum (seção
Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase
Ana Heloneida de Araújo Morais
Tese de Doutorado submetida ao Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Doutor em Ciências Biológicas – Biologia Molecular. Aprovado por: Damares de Castro Monte, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Orientadora) Patrícia Gonçalves Baptista de Carvalho, Doutora (EMBRAPA – Hortaliças) (Examinador Externo) Luiz Joaquim Castelo Branco Carvalho, Doutor-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Externo) Soraya Cristina de Macedo Leal Bertioli, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Externo) Renato de Oliveira Resende, Doutor (Universidade de Brasília) (Examinador Interno) Maria Fátima Grossi de Sá, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Suplente) Brasília-DF, 14 Dezembro 2007
iv
“... A semente da curiosidade e do
desejo de busca já foi semeada...”
(Ana Heloneida de Araújo Morais).
v
DEDICO
A Deus, pela vida;
À minha Mãe Salete, pela minha existência;
Ao meu marido Antonio Carlos, pelo companheirismo e confiança;
À minha filha Ana Clara, por todo amor e com todo amor.
vi
AGRADECIMENTOS
À Universidade de Brasília e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-
Biologia Molecular, pela oportunidade na realização do curso;
Aos professores do programa de Pós-Graduação pelas contribuições em
conhecimentos e experiências;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
de doutorado, concedida durante a realização deste trabalho e pelas contribuições ao curso de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas-Biologia Molecular;
A Empresa Brasileira Agropecuária (EMBRAPA) Recursos Genéticos e Biotecnologia
e EMBRAPA-Hortaliças pela doação de amostras e pela infra-estrutura concedida para o
desenvolvimento desta pesquisa;
À Dra. Maria Esther de Noronha Fonseca Boiteux, pelas contribuições inesgotáveis do
saber na pesquisa científica, pela orientação, pelo incentivo em minha carreira e amizade;
À Dra. Damares de Castro Monte, por transmitir com sua experiência, uma visão
objetiva de conhecimentos tão abstratos e singulares, pela amizade e orientação;
À Dra Elionor Rita Pereira de Almeida, por ter despertado meu interesse pela Biologia
Molecular e pelo carinho sempre;
Ao Dr. Leonardo Silva Boiteux, pelo seu entusiasmo contagiante, que tanto contribuiu
de forma especial, neste trabalho científico;
Aos técnicos e amigos do laboratório de Melhoramento Genético e Análise Genômica
da EMPRAPA- Hortaliças, pela permanente contribuição;
Aos técnicos e amigos do laboratório de nutrigenômica da EMPRAPA- Recursos
Genéticos e Biotecnologia, pelo valoroso auxílio;
Aos funcionários da EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia e Hortaliças pela
eficiência e empenho na realização de suas tarefas;
Aos Amigos de laboratório, especialmente Ana Maria, Anne Gisele, Wesley, Patrícia,
Cristiane, Juliana e Lisângela pelas contribuições diretas e indiretas na realização deste
trabalho;
As amigas Kellen, Liziane e Railene, pelo imprescindível companheirismo nos anos
longe de casa;
Aos colegas e amigos do programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-
Biologia Molecular, pela amizade e convivência;
vii
Aos Dr. Renato de Oliveira Resende e Dr. Robert Neil Gerard Miller, da banca de
qualificação, pelas contribuições e sugestões incorporadas nesta dissertação;
A toda minha família e a do meu marido, nossa família, pelo incentivo sempre;
A todos aqueles que, de uma maneira ou de outra, me estimularam nesta jornada.
viii
Sumário
RESUMO
ABSTRACT
Lista de abreviações e siglas
Lista de símbolos
Lista de ilustrações
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Objetivos específicos
Capítulo 01
Revisão da Literatura
1.0- REVISÃO DA LITERATURA
1.1-Importância da Cultura de Tomate no Brasil.
1.2-Origem e Taxonomia do Gênero Lycopersicon.
1.2.1. Sistemas Taxonômicos do Gênero Lycopersicon.
1.2.2. Sistemática Molecular e a Nova Classificação do Gênero
Lycopersicon.
1.3. Principais Características das Espécies do Gênero Solanum seção
Lycopersicon.
1.4. Carotenóides Mais Comumente Encontrados em Tecidos Vegetais.
1.5. Importância dos Carotenóides na Dieta Humana.
1.6. Importância dos Carotenóides como Elementos Funcionais.
1.7. Biologia dos Carotenóides.
1.8. Identificação e Quantificação de Carotenóides em Tecidos Vegetais.
1.9. A Via Biossintética dos Carotenóides: Enzimas e Genes.
1.10. Genética, Biologia Molecular e Regulação da Biossíntese de
Carotenóides em Tomate.
1.11. Melhoramento de Tomate para Modificar Teores e Tipos de
Carotenóides.
1.12. Genômica e Seleção Assistida por Marcadores Derivados de Genes da
Via Biossintética dos Carotenóides em Tomateiro.
xi
xiii
xv
xix
xx
01
04
04
04
05
05
05
05
06
08
09
10
11
11
16
17
18
20
23
26
27
ix
1.13. Considerações Finais e Objetivos do Trabalho.
Capítulo 02
Análise bioquímica do conteúdo e composição de carotenóides em frutos
maduros de espécies silvestres e cultivadas de Solanum (seção Lycopersicon:
Solanaceae).
2.0- INTRODUÇÃO
2.1-MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
2.1.3. Análise dos Carotenóides.
2.1.2. Extração dos Carotenóides.
2.1.4. Identificação dos Carotenóides.
2.1.5. Obtenção de Padrões Externos.
2.1.6. Determinação do Conteúdo dos Carotenóides.
2.2-RESULDADOS E DISCUSSÕES
2.3-CONCLUSÕES
Capítulo 03
Desenvolvimento de protocolos de PCR específicos para a detecção de genes
codificadores de enzimas da via biossintética de carotenóides em espécies de
Solanum (Seção Lycopersicon).
3.0-INTRODUÇÃO
3.1-MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
3.1.2. Purificação do DNA genômico.
3.1.3. Estimativa da concentração de DNA purificado.
3.1.4. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA.
3.1.4.1. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA
para o gene da enzima licopeno β-ciclase.
3.1.4.2. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA
28
30
30
33
33
35
35
35
36
37
38
47
48
48
51
51
52
52
52
x
para o gene da enzima licopeno ε-ciclase.
3.1.4.3. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA
para o gene da enzima fitoeno sintase.
3.1.4.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).
3.1.4.5. Seqüênciamento direto dos amplicons.
3.1.4.6. Análise das seqüências correspondentes a segmentos
dos genes das enzimas em estudo.
3.2-RESULDADOS E DISCUSSÕES
3.3-CONCLUSÕES
Capítulo 04
Caracterização parcial do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase:
Detecção de polimorfismos e análise filogenética em acessos de diferentes
espécies do gênero Solanum (seção Lycopersicon).
4.0-INTRODUÇÃO
4.1-MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
4.1.2. Purificação de DNA Genômico.
4.1.3. Estimativa da Concentração do DNA Genômico.
4.1.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).
4.1.5. Clonagem dos Amplicons.
4.1.6. Seqüenciamento dos fragmentos obtidos.
4.1.7. Análise das Seqüências Correspondentes a Segmentos dos
Genes Codificadores da Enzima Licopeno-b-ciclase.
4.1.8. Análise do Gene waxy.
4.1.9. Análise e Identificação dos Polimorfismos de Nucleotídeos.
4.1.10. Análise Filogenética.
4.3-RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.4-CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
53
53
53
54
54
56
67
68
68
71
71
71
71
71
72
72
73
73
74
74
75
82
83
ANEXO
xi
RESUMO
MORAIS, A. H. A. Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de
Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução
(CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase. Brasília,
2007. 106p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas - Biologia Molecular) - Departamento
de Biologia Celular, Instituto de Biologia (IB), Universidade de Brasília.
O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) apresenta um papel de destaque na dieta
humana de diferentes etnias e regiões geográficas. Entre as estratégias para aumentar e/ou
permitir um consumo adequado de nutrientes essenciais, destacam-se a introdução de
alimentos ricos em carotenóides na dieta, além do melhoramento genético visando aumentar o
teor pró-vitamínico e de antioxidantes em culturas adaptadas para plantio e com tradição de
consumo nas regiões geográficas onde ocorrem carências nutricionais. Um dos objetivos neste
trabalho foi avaliar os tipos e o conteúdo de carotenóides visando selecionar genótipos com
melhores características nutricionais. Outro objetivo foi, baseado em informações genéticas
para genes que codificam enzimas envolvidas na via biossíntetica de carotenóides, gerar
oligonucleotídeos iniciadores (primers) universais para uso em PCR. Estes primers foram
utilizados para isolar alelos do gene que codifica a enzima licopeno β-ciclase em diferentes
acessos de tomate. Os dados obtidos destas seqüências foram avaliados para estimar as
relações filogenéticas dentro do gênero Solanum (seção Lycopersicon). Esta análise foi
comparada com estudos anteriores utilizando o gene waxy ou GGSSI (Grandule-bound starch
syntase). Esta análise foi informativa e a sua utilização forneceu uma boa resolução na
definição das espécies de tomate. Demonstrou ainda que as espécies com frutos verdes,
amarelos e vermelhos pertencem a um grupo monofilético, além de revelar a proximidade
entre as espécies de tomate com frutos com pigmentação verde. Os resultados aqui
apresentados forneceram ainda o perfil de carotenóides de tomates de coloração verde,
mostrando estas espécies como essenciais fontes de carotenóides luteína e zeaxantina. Um
carotenóide já reconhecido nutricionalmente, mas não encontrado em concentrações
significativas em tomates comerciais, o beta caroteno, foi identificado nas espécies S.
cheesmaniae, S. galapagense e S. pimpinellifolium, que possuem frutos com pigmentação
amarela. Destaca-se ainda o S. pimpinelifolium vermelho como sendo a melhor opção em
cruzamentos visando o melhoramento no conteúdo e na diversidade de carotenóides. A
geração dos oligonucleotídeos iniciadores universais, específicos para o isolamento de alelos
xii
dos genes das enzimas fitoeno sintase, licopeno ε-ciclase e licopeno β-ciclase foi satisfatória,
uma vez que foram específicos para os genes em estudo. À disponibilização do catálogo de
tipos e teores de carotenóides em um subconjunto do germoplasma destas espécies e o
desenvolvimento de ferramentas moleculares com potencial uso em sistemas de seleção
assistida cria perspectivas de aumento da eficiência do melhoramento visando o aumento do
teor e a diversidade de carotenóides em tomate.
Palavras chaves: Variabilidade, Carotenóides, Tomate, Alimento funcional.
xiii
ABSTRACT
MORAIS, A. H. A. Diversity of Antioxidants Carotenoids in Fruits of Solanum (section
Lycopersicon): Characterization Via High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and
Phylogenetic Analysis of The Lycopene-β-cyclase Gene. Brasília, 2007. 106p. Thesis (Doctor
degree in Ciências Biológicas - Biologia Molecular) - Departamento de Biologia Celular,
Instituto de Biologia (IB), Universidade de Brasília.
The cultivated tomato (Solanum lycopersicum L. Mill) plays an important role in the
human diet in distinct ethnic groups and geographical regions, being a major source of
vitamins and antioxidants. One of the most efficient strategies to increase and/or to allow the
satisfactory intake of essential nutrients is to introduce in the daily diet improved food crop
cultivars with higher nutritional/nutraceutical value. Breeding cultivars displaying regional
adaptation for higher pro-vitamin A and antioxidant contents would be an effective way of
minimizing/alleviating nutritional deficiencies in geographic areas with sub-optimum levels
of intake of these compounds. One of the main objectives of the present thesis was to evaluate
the profile and content of carotenoids in a germplasm collection of tomato and in its wild and
semi-domesticated relatives [Solanum (section Lycopersicon)]. This germplasm displayed a
wide range of fruit color varying from greenish to yellow up to deep red. The final aim of this
study is to improve diversity and content of this group of potent antioxidants in the cultivated
tomato via conventional and molecular breeding. A second objective was to isolate a sub-set
of genes coding for structural enzymes of carotenoid biosynthesis in accessions of this
germplasm and to generate a set of “universal” primers derived from the genetic information
of these genes for use in PCR assays. This approach was employed to isolate alleles of the
gene coding for the enzyme lycopene β-cyclase from the distinct accessions and the sequence
data obtained was evaluated to estimate the phylogenetic relationships of the genus Solanum
(section Lycopersicon). This analysis was informative and displayed enough resolution to
discriminate the distinct species within the genus. A monophylletic group was composed by
the green, yellow and red fruit species. A close relationship was also observed among green-
fruited species, which was in agreement with the results reported in the literature using both
classical and molecular tools. Therefore, the sequence of the lycopene β-ciclase gene could
represent an additional tool for phylogenetic analysis in the genus Solanum (section
Lycopersicon) as well as in closely related sections. The results indicated a wide range of
carotenoid types and blends in the accessions of species belonging to the genus Solanum
xiv
(section Lycopersicon). Green-fruited tomatoes accumulated lutein and zeaxanthin, two
carotenoids that are not commonly found in cultivated tomatoes. The carotenoid β-carotene
was identified in accessions of the S. cheesmaniae, S. galapagense and S. pimpinellifolium
(yellow-fruit mutant). Therefore, these species might represent important sources of gene
controlling β-carotene accumulation. However, the most diverse profiles of carotenoids were
found in accessions of S. pimpinelifolium with red fruit phenotype. These would be the
preferential sources for use in breeding programs. PCR primers were developed for universal,
gene-specific isolation of alleles of the following genes: phytoene synthase, lycopene ε-
cyclase and lycopene β-ciclase. The establishment of a catalog of content and types of
carotenoids in representative accessions of species belonging to the genus Solanum (section
Lycopersicon) and the development of molecular tools with potential utility in classical
breeding as well as in marker assisted selection systems. The isolation of new genes/alleles
from wild and semi-domesticated species related to the cultivated tomato has also a potential
scientific and technological impact allowing the identification and cloning of genes of the
carotenoid pathway able to modulate distinct blends of antioxidants carotenoids in fruits of
this important vegetable crop.
Keywords: Variability, Carotenoids, Tomato, Functional Foods.
xv
Lista de Abreviaturas e Siglas
A – adenina
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
2-D – bidimensional
BAC - Bacterial Artificial Chromosomes
B- gene Beta
b ou og- Old-gold-crimson
BLAST - basic local alignment search tool
cm - centímetro
cm2 - centímetro quadrado
A1%1cm - coeficiente de absorvidade
lmáx - comprimentos de onda máximos de absorção
CAPS - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences
cv. - cultivar
crtY ou lyc – licopeno ciclase
crtYB - licopeno β-ciclase
C - citosina
cpDNA – DNA de croloplasto
chr. - cromossomos
chrs - cromossomos
CRTISO - carotenóide isomerase
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
C40 - 40 átomos de carbono
C20 - 20 átomos de carbono
C-3 – Carbono 3
CTAB - brometo de cetiltrimetilamônio
CNPH - Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças
Cenargen - Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia
CLAE-FR - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- fase reversa
Del - Delta
DXP - deoxixilulose 5-fosfato
DXS - deoxixilulose 5-fosfato sintase
xvi
Continua
DNA- ácido desoxiribonucléico
DMAPP - dimetilalil difosfato
EcoR I – enzima de restrição de Escherichia coli
EDTA EthyleneDiamineTetrAcetic acid
EMPRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EST - Expressed Sequence Tag
et al – entre outros
E-value- Expectation value
Fig. - figura
GBSSI - grandule-bound starch syntase I
GGPP - geranilgeranil pirofosfato
GGDS - GGPP sintase
G -guanina
g - grama
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
HCL- Ácido clorídrico
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPP - isopentenil pirofosfato
Kg - Kilograma
LCYB - licopeno β-ciclase
LDL - lipoproteína de baixa densidade
LCYE - licopeno ε-ciclase
µg – micrograma
µg/g-1 – micrograma/grama
mm - micrometro
MVA - ácido mevalônico
MEP - metileritriol 4-fosfato
Mbp – mil pares de base
mm - milímetro
m - metro
mM - milimolar
ml min-1 – mililitro minuto
mcg/dl-1 – micrograma/decilitro
xvii
Continua
mg/kg-1 – miligrama/kilograma
mg - miligrama
mRNA - Ácido ribonucléico mensageiro
min - minutos
mAU - miliunidades de absorbância
nRFLP - nuclear restriction fragment length polymorphisms
NSY - neoxantina sintase
N2 - nitrogênio
NaCl – cloreto de sódio
NCBI - National Center for Biotechnology Information
ng/µl-1 – nanograma/microlitro
nº - número
nm - nanometro
OMS – Organização Mundial de Saúde
pmoles – pico moles
pmoles/mL-1 - pico moles/micro litro
pb – pares de base
pH - potencial hidrogeniônico
PSY - fitoeno sintase
PPPP - fitoeno pirofosfato
PDS - fitoeno dessaturase
PAUP - Phylogenetic Analysis Using Parsymony and Other Methods
PCR - reação em cadeia pela polimerase
PTFE - polytetrafluoroethylene
ppm - parte por milhão
rpm – rotação por minuto
RNA - Ácido ribonucléico
sp - self-pruning
S. - Solanum
SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms
SOL - International Solanaceae Genome Project
Tm - temperaturas de anelamento
TE - Tris-.HCl EDTA
xviii
Continua
t – tonelada
t/ha-1 – tonelada/hectare
t/dia-1 – tonelada/dia
T - tiamina
3-D - tridimensional
UI - unidades internacionais
UNB – Universidade de Brasília
UV - Ultra Violeta
UV-VIS - Ultra Violeta - visível.
UNICEF – Fundo das Nações Unidas para Infância
Var. - variedade
v/v – volume/volume
VDE - violaxantina de-epoxidase
x - vezes
WPTC - World Processing Tomato Council
WHO/NUT - World Health Organization/Nutrition
ZDS - z-caroteno dessaturase
ZEP - zeaxantina epoxidase
xix
Lista de Símbolos
~ - aproximadamente
α - alfa
β – beta
ε - epsilon
δ - delta
°C - graus Celsius
l - lambda
> - maior
< - menor
± - mais ou menos
% - percentual
z - zeta
xx
Lista de Ilustrações
Capítulo 01
FIGURA 1.1. Distribuição geográfica do tomateiro na parte ocidental da América do Sul,
incluindo as Ilhas Galápagos. Fonte: American Journal of Botany 88(10): 1888-1902,
2001....................................................................................................………..............……… 07
FIGURA 1.2. Visão esquemática da via biossintética de carotenóides em plantas. ...............23
Capítulo 02
FIGURA 2.1. Seis diferentes estádios de maturação do fruto de tomateiro. Fonte: (http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/659/1/FERREIRA-2004-DEF.pdfDEF.)...33
FIGURA 2.2. Obtenção da estrutura fina do espectro de carotenóides (BRITTON,
1995).........................................................................................................................................36
FIGURA 2.3. Fórmula de LAMBERT-BEER para cálculo da concentração de
carotenóides..............................................................................................................................37
FIGURA 2.4. Variedade de cores dos frutos maduros das espécies (A) S. peruvianum; (B) S.
pimpinellifolium e (C) S. cheesmaniae. Fonte: Acervo de fotos da Embrapa-Hortaliças........38
FIGURA 2.5. Espectros em 2-D de absorção na região visível na fase móvel
(acetonitrila:metanol:etil acetato - 8:1:1) dos picos característicos identificados nas espécies
de tomate: (A) Luteína (λ dos picos localizados a 425, 449 e 475 nm); (B) Licopeno ( λ dos
picos localizados a 446, 473 e 503 nm); (C) α-caroteno ( λ dos picos localizados a 448 e 480
nm); (D) β-caroteno (λ dos picos localizados a 454 e 480 nm) e (E) Zeaxantina (λ dos picos
localizados a 450 e 477 nm)......................................................................................................39
Capítulo 03
FIGURA 3.1. Amplicons correspondendo a potenciais fragmentos de genes codificadores da
enzima licopeno-β-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro e analisados em gel de
xxi
agarose [1% (p/v) corado com brometo de etídeo]. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo
‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (4) S.
neorickii ‘CNPH 945’; (5) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (6) S. lycopersicum ‘Santa Clara
CNPH 1496’; (7) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (9) S.
chilense ‘CNPH 943’, (10) S. pennellii ‘CNPH 409’, (11) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’,
(12) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (13) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (14) S. chilense ‘CNPH
410’...........................................................................................................................................57
FIGURA 3.2. Amplicons obtidos correspondendo a fragmentos da seqüência do gene
codificador da enzima licopeno-ε-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro (Seção
Lycopersicon) e analisados em gel (agarose 1% corado com brometo de etídeo). (1) Solanum
chmielewskii ‘CNPH 1022’; (2) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (3) S. chilense ‘CNPH 943’;
(4) S. pennellii ‘CNPH 409’; (5) S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (6) S.
galapagense ‘CNPH 432’; (7) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH
1154; (9) S. chilense ‘CNPH 410’; (10) S. neorickii ‘CNPH 945’; (11) S. peruvianum ‘CNPH
944’ e (12) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. .........................................................59
FIGURA 3.3. Resultado da amplificação do fragmento gênico da fitoeno sintase utilizando o
o par de iniciadores PSY-1 tom-1 e PSY-1 tom 1R. Amplicons foram nalisados em gel de
agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH
1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum
‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae
‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH
1022’; (10) S. chmielewskii ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii
‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S.
habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH 201’.................................................61
FIGURA 3.4. Amplicons correspondentes a fragmentos gênicos codificadores da enzima
fitoeno sintase sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-2 e PSY-1 tom-2R.
Amplicons foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1)
Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S.
peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’;
(6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa
Clara CNPH1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’;
xxii
(11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH
796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S.
peruvianum ‘CNPH 201’..........................................................................................................63
FIGURA 3.5. Amplicons correspondendo a fragmentos gênicos codificadores da enzima
fitoeno sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-3 e PSY-1 tom-3R. Amplicons
foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum
pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum
‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii
‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’;
(9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense
‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S.
peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH
201’. ........................................................................................................................................65
Capítulo 04
FIGURA 4.1. Variabilidade das cores de algumas espécies de tomate maduro do gênero
Solanum [Secção Lycopersicon]. Fonte: Enciclopedia.us.es. & acervo Charles Rick
Center........................................................................................................................................68
FIGURA 4.2. Alinhamento das seqüências do fragmento do gene codificador da enzima
licopeno-β-ciclase. O alinhamento foi obtido utilizando o método Clustal W disponível no
pacote do Lasergene com as seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty = 10. Os
polimorfismos de bases estão identificados em
vermelho....................................................................................................................................77
FIGURA 4.3. Filograma de consenso mostrando nos ramos os valores de Bootstrap (após
5000 repetições). Este filograma foi obtido através de análise de parcimônia baseada no
alinhamento realizado com Clustal W do fragmento gênico correspondente ao gene
codificador da enzima licopeno-β-ciclase específica de cromoplasto de espécies de Solanum.
O índice de consistência foi de 0,73.........................................................................................78
xxiii
FIGURA 4.4. Filograma obtido do alinhamento das seqüências do gene de waxy (PERALTA
& SPOONER, 2001). As seqüências do gene waxy foram obtidas no GenBank: (AY875630 =
L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 = L. pennellii,
AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L. peruvianum,
AY875585 = L. parviflorum, AY875588 = L. chmielewskii, AY875582 = S. galapagense = L.
cheesmaniae). Os números nos ramos indicam a porcentagem obtida por análise Bootstrap
com 5000 repetições..................................................................................................................80
Capítulo 02
QUADRO 2.1. Identificação e características de coloração de fruto do germoplasma de
tomate utilizado neste estudo....................................................................................................34
QUADRO 2.3. Média do conteúdo dos carotenóides (em mg/g de peso fresco) verificados nas
espécies do gênero Solanum da seção Lycopersicon.. .............................................................40
Capítulo 03
QUADRO 3.1. Identidade do fragmento de licopeno-β-ciclase amplificado de DNA de
Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ com a seqüência alvo de licopeno-beta-
ciclase. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi submetida ao banco de dados do
GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov)...........................................................................................................58
QUADRO 3.2. Identidade do fragmento de licopeno-ε-ciclase amplificado de DNA de
Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência
objeto foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página
eletrônica do NCBI (Erro! A referência de hiperlink não é válida.
QUADRO 3.3. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).................................................................................................62
xxiv
QUADRO 3.4. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).................................................................................................64
QUADRO 3.5. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)................................................................................................66
Capítulo 04
QUADRO 4.1. Sessenta e três sítios de polimorfismos detectados em múltiplas análises de
alinhamento de um fragmento gênico correspondente ao gene codificador da enzima licopeno
β-ciclase específico de cromoplasto de sete espécies de Solanum (Seção Lycopersicon). Os
números representam os locais de ocorrência dos polimorfismos ao longo da seqüência
amplificada de 1219pb, em um ou mais acessos quando comparado com a seqüência de
referência (S. lycopersicum AF 254793). Os pontos simbolizam inserções e/ou deleções de
nucleotídeos. Os polimorfismos de bases foram identificados com as letras em vermelho, (S)
indica os polimorfismos tipo transição e (V) os polimorfismos tipo transversão. Os
polimorfismos correspondendo a inserções/deleções foram identificados pelo símbolo
ID..............................................................................................................................................79
Ana Heloneida de Araújo Morais
Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de
Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia
Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene
Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase
Brasília-DF
Dezembro 2007
1
INTRODUÇÃO
O tomateiro é originário nas regiões andinas do Peru, Bolívia e Equador na parte
ocidental da América do Sul. Esta hortaliça foi amplamente cultivada e consumida pelos
povos pré-colombianos. O tomate cultivado foi, muito provavelmente, levado da região
ocupada pelos povos Incas até a região do sul do México, onde habitavam os Astecas
(PAZINATO & GALHARDO, 1997). O México, em especial as regiões de Puebla e Vera
Cruz, é considerado o mais provável centro de domesticação do tomate (JENKINS, 1948;
RICK & BUTLER, 1956; MONACO, 1964). Levada para a Europa pelos colonizadores
espanhóis, em poucos anos a tomaticultura espalhou-se pelos diferentes países daquele
continente. Durante um longo tempo, o tomateiro foi considerado apenas como uma planta
medicinal ou simplesmente ornamental, sendo o seu uso difundido na alimentação e na
culinária apenas dois séculos depois de ser levado para a Europa (GARDÊ & GARDÊ, 1993).
Posteriormente, o cultivo do tomate foi introduzido em quase todos os países, em maior ou
menor escala, tendo hoje uma utilização global (FONTES & SILVA, 2002).
A maioria dos botânicos atribui a origem do cultivo e consumo, e mesmo a seleção
genética, do tomate como alimento, à civilização Inca do antigo Peru. Esta origem foi
deduzida pelo fato de que ainda hoje persiste, naquela região, uma grande variedade de
tomates selvagens e algumas espécies domesticadas, de cor verde, que são conhecidas apenas
no Peru. Os tomates selvagens e cultivados se desenvolvem em uma ampla gama de habitats,
com dispersão geográfica variando desde o nível do mar até uma altitude maior que 3.300 m
(RICK, 1973; TAYLOR, 1986). Estes habitats incluem desde a costa árida do Pacífico até as
regiões montanhosas nos Andes, passando por matas ciliares, encostas úmidas (JENKINS,
1948) e as Ilhas Galápagos (RICK, 1967; CAMARGO, 1992). A variedade Solanum
(Lycopersicum) cerasiforme, o mais provável ancestral do tomate cultivado, teria sido levado
do Peru e introduzido pelos povos antigos na América Central, posto que este foi encontrado
amplamente cultivado no México (EMBRAPA, 1993; FONTES & SILVA, 2002).
O tomateiro é uma planta fanerógama, angiosperma e dicotiledônea. Os tomates
podem ser divididos em diversos grupos, de acordo com seu formato e sua finalidade de uso,
como: ‘Santa Cruz’, tradicional na culinária, utilizado em saladas e molhos e de formato
oblongo; ‘Caqui’, utilizado em saladas e lanches, de formato redondo; ‘Saladete’ ou
‘Italiano’, utilizado principalmente para molhos, podendo ainda fazer parte de saladas. Seu
formato é oblongo, tipicamente alongado; e ‘Cereja’, utilizado como aperitivo, ou ainda em
saladas.
2
Nos últimos dez anos, o mercado de tomates no Brasil e no mundo apresentou um
significativo aumento de produção, consumo, produtividade e nos preços pagos pelo
consumidor final. Esse incremento veio atrelado ao desenvolvimento da produtividade e
mudanças no hábito alimentar das pessoas. Esse crescimento da produção e do consumo está
relacionado, entre outros fatores, ao aumento da demanda por alimentos industrializados ou
produtos semi-prontos tais como molhos de tomate, ketchup e congelados. A busca por
alimentos mais saudáveis pela população, associada com a proliferação de restaurantes fast-
food e do tipo self-service também colaboram com o aumento da demanda mundial de frutos
in natura (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).
O tomate é a principal fonte do pigmento vermelho licopeno e contém, em menores
teores, os carotenóides b-caroteno, zeaxantina e luteína. A maioria das investigações tem
sugerido a associação entre dietas ricas em licopeno e a redução dos riscos da ocorrência de
vários tipos de câncer (LUGASI et al., 2003; GIOVANNUCCI, 1999; CLINTON, 1998). O
b-caroteno é um precursor de vitamina A, cuja deficiência é um problema de saúde pública no
Brasil. A luteína e a zeaxantina atuam na prevenção da catarata e degeneração macular
(SOMMERBURG et al., 1999). As cores de fruto nas diversas espécies de tomate variam do
amarelo para o vermelho alaranjado, dependendo da razão licopeno/β-caroteno. O teor e
balanço destes carotenóides também estão associados com a ação da enzima licopeno-β-
ciclase (BOTELLA-PAVÍA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006).
A via dos carotenóides, responsável pela biossíntese dos terpenos, é uma das vias
bioquímicas mais bem caracterizadas em plantas, com vários genes já clonados e
seqüenciados (CUNNINGHAM & GANTT, 1998). Vários estudos têm tentado associar
marcadores moleculares com o acúmulo de licopeno em frutos de tomate (LIU et al., 2003;
KABELKA et al., 2004; ROUSSEAUX et al., 2005). Entretanto, poucos são os exemplos de
esforços para aumentar e/ou modificar a composição nutricional ou nutracêutica de tomates,
explorando a variação de espécies selvagens (LINCOLN & PORTER, 1950; MACKINNEY
et al., 1954, TOMES et al., 1954; STOMMEL & HAYNES, 1994). Por outro lado, existe na
literatura uma vasta quantidade de trabalhos sobre a caracterização genética e molecular dos
fatores que controlam diferentes teores de carotenóides em frutos de tomates cultivados.
Entretanto, comparativamente, poucas informações estão disponíveis sobre a quantidade e
diversidade de carotenóides em frutos de espécies selvagens.
O presente trabalho visou explorar novos aspectos associados com a composição e
conteúdo de carotenóides em espécies selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon:
Solanaceae]. O objetivo final deste trabalho foi gerar ferramentas que auxiliem no processo de
3
seleção de genótipos com melhores características nutricionais. A informação gerada no
presente trabalho poder ser utilizados no estabelecimento de sistemas de seleção assistida e/ou
potenciais estratégias de transformação genética visando obter cultivares de tomate com
melhores combinações e teores de carotenóides nutracêuticos. Foram gerados iniciadores de
síntese e otimizados protocos de PCR (polymerase chain reaction) que foram empregados na
amplificação de fragmentos dos genes que codificam as enzimas licopeno-β-ciclase, licopeno-
ε-ciclase e fitoeno sintase em diferentes espécies de tomate. O fragmento do gene que codifica
a licopeno-β-ciclase foi utilizado para a construção de uma árvore filogenética do gênero
Solanum [Section Lycopersicon: Solanaceae] e o resultado foi comparado com trabalhos de
taxonomia usando marcadores moleculares e morfológicos disponíveis na literatura.
4
OBJETIVOS
Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar diversidade (composição) e teores de
carotenóides em várias espécies do gênero Solanum [seção Lycopersicon] e gerar dados de
sequência e potenciais marcadores moleculares para genes codificadores de algumas das
principais enzimas da via biossintética dos carotenóides.
Objetivos Específicos
Caracterizar diversos materiais genéticos, incluindo linhagens das espécies selvagens
do gênero Solanum seção Lycopersicon Mill, quanto à composição de carotenóides,
visando selecionar genótipos que sejam potenciais fontes de elementos nutracêuticos para
utilização no melhoramento genético do tomateiro.
Gerar oligonucleotídeos iniciadores e definir protocolos de amplificação (PCR)
específicos para isolar alelos dos genes codificadores das enzimas fitoeno sintase,
licopeno-ε-ciclase e licopeno-β-ciclase de cromoplasto.
Caracterizar a diversidade estrutural do gene/alelos codificadore da enzima licopeno-
β-ciclase nas espécies já caracterizadas dentro da seção Lycopersicon Mill.
Conduzir uma análise filogenética das espécies de Solanum seção Lycopersicon Mill
utilizando os dados de sequência do gene que codifica a enzima licopeno-β-ciclase.
5
CAPÍTULO 01
1.0. Revisão da Literatura.
1.1. Importância da Cultura de Tomateiro no Brasil.
O tomateiro (Solanum lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum Mill.) é cultivado
em regiões temperadas, tropicais e subtropicais em todos os cinco continentes. De acordo com
dados da FAO, a produção mundial de tomate gira em torno de 125 milhões de toneladas ao
ano. Entre os maiores produtores destacam-se a China e os Estados Unidos, com cerca de
30% do total mundial (WIEN, 1997; CASQUET, 1998; FONTES & SILVA, 2002;
FAO/ONU, 2004). O Brasil é o nono produtor com 3,3 milhões de toneladas por ano
(CARVALHO & PAGLIUCA, 2007). Os dados coletados em 2004 apontaram um total de 60
milhões de toneladas tomate para o processamento em nível mundial (WORLD
PROCESSING TOMATO COUNCIL – WPTC, 2004). Aproximadamente 62% da produção
brasileira têm como destino o consumo in natura. Em países como Itália, Espanha e Estados
Unidos ocorre uma intensa industrialização e agregação de valor a produtos derivados de
tomate. Por exemplo, apenas vinte e um por cento da produção norte-americana tem sido
destinada para consumo in natura, sendo o restante da produção processada pelas indústrias
de alimentos (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).
Segundo dados da Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação
(FAO/ONU) e as pesquisas de mercado do Centro de Estudos Avançados em Economia
Aplicada – CEPEA (ESALQ/USP) mostram um aumento considerável na produção nacional
de tomate nas últimas duas décadas. Nos últimos dez anos, o mercado de tomates no Brasil e
no mundo apresentou um significativo aumento de produção, consumo, produtividade e nos
preços pagos pelo consumidor final. Esse incremento veio atrelado ao aumento da
produtividade e mudanças no hábito alimentar das pessoas. Para os analistas do CEPEA, esse
crescimento da produção e do consumo está relacionado, entre outros fatores, ao aumento da
demanda por alimentos industrializados ou produtos semi-prontos tais como molhos, ketchup
e congelados. A busca por alimentos mais saudáveis pela população associada com a
proliferação de restaurantes fast-food e do tipo self-service também colaboram com o aumento
da demanda mundial de frutos de tomate in natura (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).
No Brasil, o tomate ocupa o segundo lugar em volume de produção/consumo dentro do
agronegócio de hortaliças, vindo logo atrás da batata, a frente da alface e com volume duas
vezes maior que o da cebola. Segundo dados do AGRIANUAL (2007), a área plantada com
6
tomate no Brasil é superior a 58 mil hectares com produção anual em torno de 3,5 milhões de
toneladas. Os principais Estados produtore são Goiás, São Paulo, Minas Gerais, Rio de
Janeiro e Bahia, que juntos representam 77% do volume comercializado, sendo 65%
destinado ao consumo in natura e 35% para processamento industrial (IBGE, 2004). O Brasil
cultiva anualmente aproximadamente 42,5 mil hectares de tomate para consumo in natura e
produtividade média de 47 t/ha. A região Sudeste é responsável por 55% da produção
nacional do tomate para consumo in natura. Em 2006, a produção de tomate para
processamento foi de 1,16 milhões de toneladas, em área de 14,9 mil hectares (produtividade
de 77,8 t/ha). Os Estados de Goiás e Minas Gerais são responsáveis por aproximadamente
71% da produção nacional de tomate para processamento. Atualmente, a capacidade instalada
de nossas indústrias é de aproximadamente 15.000 t/dia de pasta de tomate e de 1.500 t/dia de
tomate em cubos.
A produção de tomate, tanto para consumo in natura quanto para processamento
industrial, envolve grande utilização de mão-de-obra, gerando empregos diretos e indiretos
em diversas regiões do país. O mercado de sementes de tomate no Brasil é de
aproximadamente US$ 11 milhões, representando cerca de 30% do mercado de sementes de
hortaliças, que é atualmente estimado em US$ 44 milhões. Além de sua importância
econômica e social, o tomate está diariamente presente na mesa de milhares de brasileiros,
sendo uma importante fonte de nutrientes na dieta de diferentes classes sociais. Sob o ponto
de vista social, a cadeia de produção nacional abriga mais de 10.000 produtores, com 60.000
famílias de trabalhadores compostas por um efetivo de mais de 200.000 pessoas (TAVARES,
2003). Como mencionado, o Brasil figura entre os dez maiores produtores mundiais de
tomate. No entanto, ainda existem grandes possibilidades de melhorar os indicadores
tecnológicos da cultura (por exemplo, produtividade e custo de produção) permitindo
estabilizar a oferta do produto ao longo do ano, atender a demanda doméstica por produtos de
melhor qualidade sensorial/nutricional e gerar excedentes para exportação, especialmente de
produtos processados (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).
1.2. Origem e Taxonomia do Gênero Solanum.
O tomateiro é originário na parte ocidental da América do Sul (Figura 1.1.), nas
regiões andinas do Peru, Bolívia e Equador (EMBRAPA, 1993; FONTES & SILVA, 2002).
Os tomateiros selvagens e cultivados se desenvolvem em uma ampla gama de habitats, com
dispersão geográfica variando desde o nível do mar até uma altitude maior que 3.300 m
(RICK, 1973; TAYLOR, 1986). Estes habitats incluem desde a costa árida do Pacífico até as
7
regiões montanhosas nos Andes, encostas úmidas (JENKINS, 1948) e as Ilhas Galápagos
(RICK, 1967; CAMARGO, 1992).
FIGURA 1.1. Distribuição geográfica do tomateiro na parte ocidental da América do Sul,
incluindo as Ilhas Galápagos. Fonte: American Journal of Botany 88(10): 1888-1902, 2001.
O tomate cultivado foi, muito provavelmente, transportado da região ocupada pelos
povos Incas até a região do sul do México, onde habitavam os Astecas (PAZINATO &
GALHARDO, 1997). O México, em especial as regiões de Puebla e Vera Cruz, é considerado
o mais provável centro de domesticação do tomate cultivado (JENKINS, 1948; RICK &
BUTLER, 1956; MONACO, 1964). Levada para a Europa pelos colonizadores espanhóis, em
poucos anos a tomaticultura espalhou-se pelos diferentes países daquele continente. Durante
8
um longo tempo, o tomateiro foi considerado apenas uma planta medicinal ou simplesmente
ornamental, sendo o seu uso difundido na alimentação e na culinária apenas dois séculos
depois de sua introdução na Europa (GARDÊ & GARDÊ, 1993). O cultivo do tomate foi
introduzido em quase todos os países, em maior ou menor escala, tendo hoje uma utilização
global (FONTES & SILVA, 2002).
1.2.1. Sistemas Taxonômicos do Gênero Lycopersicon.
O botânico Milller, em 1754, foi o primeiro a propor a nomenclatura e a classificação
do tomateiro cultivado dentro do gênero Lycopersicon (MINAMI & HAAG, 1989). Embora
Karl Von Linnaeus tenha incialmente classificado o tomateiro dentro do gênero Solanum em
1753, esta espécie permaneceu sendo classificada como uma dicotiledônea, da ordem
Tubiflorae, família Solanaceae, gênero Lycopersicon, subgênero Eulycopersicum e espécie
Lycopersicon esculentum L. (Mill.) Wettst.
As análises morfológicas iniciais do gênero Lycopersicon resultaram em dois
tratamentos taxonômicos distintos. MILLER (1940) considerou Lycopersicon como um
gênero distinto e subdividido em dois subgêneros, de acordo com a presença ou não do
carotenóide licopeno (que confere cor vermelha aos frutos): Eulycopersicon (frutos maduros
vermelhos) composto por duas espécies e Eriopersicon (frutos maduros não vermelhos)
composto por quatro espécies. LUCKWILL (1943) adotou as mesmas categorias supra-
específicas, mas reconheceu um total de sete espécies no subgênero Eriopersicon
(WARNOCK, 1988).
As nove espécies caracterizadas dentro do gênero Lycopersicon, segundo RICK
(1986) podem ser agrupadas em dois “complexos”, de acordo com a ausência/presença de
barreiras de cruzamentos com L. esculentum: (1) “complexo esculentum” e (2) “complexo
peruvianum”. O “complexo esculentum” abrange sete espécies: L. esculentum L. Mill, L.
cheesmaniae L. Riley, L. pimpinellifolium L. Miller; L. chmielewskii Rick; L. parviflorum
Rick; L. hirsutum Dunal e L. pennellii (Corr.) D’Arcy. O “complexo peruvianum” abrange
duas espécies: L. chilense Dunal e L. peruvianum L. Miller (PERALTA & SPOONER, 2000).
CHILD (1990), em um tratamento taxonômico posterior, posicionou o tomate no gênero
Solanum seção Lycopersicon subseção Lycopersicon e dividiu esta subseção em três séries:
Lycopersicon (frutos vermelhos contendo licopeno), Neolycopersicon (frutos sem licopeno) e
Eriopersicon, seguindo o mesmo conceito já descrito acima.
9
1.2.2. Sistemática Molecular e a Nova Classificação do Gênero Lycopersicon.
A sistemática molecular da família Solanácea, incluindo o tomateiro, tem sido baseada
na análise de seqüência de genes de cloroplasto (SPOONER et al., 1993); de genes
mitocondriais (MCLEAN & HANSON, 1986); padrões de isoenzimas (RICK & FOBES,
1975a; RICK & FOBES 1975b; RICK & TANKSLEY, 1981, RICK, 1983; 1986; BRETÓ et
al., 1993) e marcadores moleculares do tipo “restriction fragment length polymorphism” –
RFLP (MILLER & TANKSLEY, 1990). Mais recentemente, PERALTA & SPOONER
(2001) conduziram uma exaustiva análise morfológica e molecular que definiu, de maneira
consistente, que o tomateiro é uma espécie dentro do gênero Solanum na seção Lycopersicon.
No entanto, por questões de ordem prática, muitos dos botânicos e geneticistas ainda
reconhecem o tomate como pertencente ao gênero Lycopersicon Miller (PERALTA &
SPOONER, 2000). A análise de PERALTA & SPOONER (2001) envolveu a comparação de
dados de seqüência do gene GBSSI (“Granule Bound Starch Synthase”). Os resultados
mostraram uma relação estreita entre espécies com frutos maduros verdes, estando de acordo
com as classificações anteriores baseadas exclusivamente em dados morfológicos (PERALTA
& SPOONER, 2001). A partir dos dados obtidos com a seqüência do gene GBSSI combinados
com uma coleção de dados morfológicos (incluindo coloração de fruto), foi proposto o
retorno do gênero Lycopersicon para o gênero Solanum sendo as espécies reclassificadas da
seguinte forma:
S. lycopersicum L. Mill = L. esculentum L. Mill.;
S. cheesmaniae L. Riley = L. cheesmaniae L. Riley;
S. galapagense S. (Darwin) Peralta = L. cheesmaniae L. Riley var. minor;
S. pimpinellifolium L. Miller = L. pimpinellifolium L. Miller;
S. chmielewskii Rick = L. chmielewskii Rick;
S. neorickii Rick = L. parviflorum Rick;
S. habrochaites S. Knapp = L. hirsutum Dunal;
S. pennellii Correl = L. pennellii (Corr.) D’Arcy;
S. chilense Dunal = L. chilense Dunal
O complexo L. peruvianum L. Miller foi desmembrado em quatro taxa (PERALTA &
SPOONER, 2001; PERALTA et al., 2005):
S. corneliomuelleri Macbr, (nova espécie) descrita como L. glandulosum Mull.;
S. arcanum Peralta (nova espécie);
S. huaylasense Peralta (nova espécie);
S. peruvianum L. Miller que corresponde a todos os acessos típicos de L. peruvianum.
10
1.3. Principais Características das Espécies do Gênero Solanum seção Lycopersicon.
A maioria das espécies da seção Lycopersicon é silvestre, apresentando frutos
extremamente pequenos, por vezes pubescentes. Estas espécies têm sido utilizadas com
freqüência em programas de melhoramento do tomateiro visando à introgressão de genes que
conferem resistência a pragas e doenças, melhoria da qualidade dos frutos e aumento da
qualidade nutritiva (GIORDANO et al., 2003).
Solanum peruvianum é a espécie selvagem que apresenta a maior variabilidade
genética e fenotípica. Ela é nativa da região central e norte do Peru, apresenta fatores de
resistência a diversas pragas e doenças e é a fonte mais rica em vitamina C. Alguns acessos
também apresentam tolerância à seca. Esta espécie tem sido utilizada nos programas de
melhoramento como fonte de resistência a um grande número de doenças, tais como as
causadas pelos fungos Cladosporium fulvum e Fusarium oxysporum, várias espécies do
nematóide Meloidogyne e patotipos de Tomato mosaic virus e espécies de Tospovirus
(GIORDANO et al., 2003). Como mencionado, a espécie S. peruvianum L. Miller foi
recentemente dividida em três novas espécies: S. corneliomuelleri Macbr (de ocorrência nas
regiões sul e central do Peru) e duas novas espécies (S. arcanum Peralta e S. huaylasense
Peralta) de ocorrência restrita ao norte do Peru (PERALTA et al., 2005).
A espécie selvagem S. pimpinellifolium é originária do Peru e também denominada de
“tomate-groselha”. No melhoramento genético, esta espécie tem sido fonte de fatores de
resistência a um grande número de patógenos (C. fulvum, F. oxysporum, Phytophthora
infestans, Verticillium dahliae e Pseudomonas tomato) e também de características
relacionadas à qualidade do fruto, tais como: menor acidez, elevado teor de minerais, licopeno
e pró-vitamina A. Esta espécie é adaptada a temperaturas muito altas no que diz respeito ao
pegamento de frutos e ao crescimento vegetativo (GIORDANO et al., 2003).
Solanum cheesmaniae é uma espécie endêmica das Ilhas Galápagos. Ela é resistente à
salinidade (com ocorrência litorânea) e não tem abscisão no pedúnculo floral. Acessos
anteriormente denominados de S. cheesmaniae var. minor foram reclassificados como uma
nova espécie, S. galapagense (PERALTA et al., 2005).
Solanum habrochaites é uma espécie selvagem e rústica de ocorrência em regiões de
elevadas altitudes, no Equador e no Peru. É resistente a numerosos insetos, ácaros e vírus e é
adaptada a temperaturas muito baixas, no que diz respeito à germinação e pegamento de
frutos. O gene B, que controla teores mais elevados de β-caroteno foi introgredido desta
espécie (PERALTA et al., 2005).
11
Solanum neorickii é uma espécie que se encontra nos altos vales dos Andes peruanos.
Esta espécie se caracteriza por frutos com elevados teores de matéria seca (PERALTA et al.,
2005).
Solanum chilense é uma espécie originária das regiões áridas do norte do Chile e do
sul do Peru. Esta espécie é muito resistente à seca. Um dos genes de resistência a geminivírus
(Ty-1) foi introgredido a partir de acessos desta espécie (GIORDANO et al., 2003).
Solanum chmielewskii é uma espécie que se caracteriza por um fruto de cor amarela e
pelo seu alto teor de açúcar, tendo sido utilizada pelos programas de melhoramento genético
visando aumentar o Brix (teor de açúcares solúveis) de tomates para processamento industrial
(PERALTA et al., 2005).
Solanum pennellii é uma espécie selvagem originária do oeste do Peru e que resiste
consideravelmente à seca. Acessos desta espécie apresentam tricomas glandulares que
conferem resistência a diversos insetos e ácaros (GIORDANO et al., 2003).
1.4. Carotenóides Mais Comumente Encontrados em Hortaliças e Frutas.
Os carotenóides mais comumente encontrados nos alimentos de origem vegetal são: o
ß-caroteno e a-caroteno presentes, por exemplo, na cenoura (Daucus carota) e abóboras
(Cucurbita spp), o licopeno presente no tomate, goiaba e melancia e várias xantofilas
(zeaxantina, luteína e outros carotenóides com estruturas oxigenadas) presentes, por exemplo,
no milho (Zea mays); na manga (Mango indica) e no mamão (Carica papaya). A bixina
(corante dérmico e aditivo culinário usado por indígenas amazônicos) é obtida do urucum
(Bixa orellana). Carotenóides como o β-caroteno, licopeno, zeaxantina e luteína exercem
funções antioxidantes em fases lipídicas, bloqueando os radicais livres que danificam as
membranas lipoprotéicas (SIES & STAHL, 1995). O licopeno é o carotenóide predominante
no plasma e nos tecidos humanos, sendo encontrado em um número limitado de alimentos,
como no tomate e seus produtos, na goiaba, na melancia, no mamão e na pitanga (ARAB &
STECK, 2000).
1.5. Importância dos Carotenóides na Dieta Humana.
A hipovitaminose A têm sido observada em algumas regiões brasileiras tais como o
semi-árido nordestino e o Vale do Rio Jequitinhonha (Norte de Minas Gerais). Entre as
estratégias para aumentar e/ou permitir um consumo adequado deste nutriente, destacam-se a
introdução de alimentos ricos em carotenóides em culturas adaptadas para plantio e com
tradição de consumo nas regiões geográficas onde a carência nutricional é manifestada
12
(WHO/UNICEF, 1995). Além disso, BRAMLEY (2000) menciona que muitas tentativas de
controle da deficiência de vitamina A via suplementação (cápsulas) não têm sido eficientes
em países em desenvolvimento. É fundamental também a introdução de alimentos derivados
de plantas com alto teor pró-vitamínico na dieta da população. Neste contexto, o
melhoramento genético, visando desenvolver e disponibilizar cultivares com maiores teores
de pigmentos com ação de pró-vitamina A apresenta um papel de relevo. O tomate, apesar de
não conter teores elevados de carotenóides pró-vitamina A, é uma das mais importantes fontes
deste elemento devido ao alto consumo tanto de produtos in natura quanto de produtos
processados (TAVARES & RODRIGUEZ-AMAYA, 1994). Além disso, o tomate é também
fonte de moléculas antioxidantes com conhecida ação anticâncer (exemplo: licopeno e
luteína) (OLSON, 1999).
O estudo da ação dos antioxidantes bem como da sua relação com os radicais livres e a
prevenção de algumas doenças tornou-se um tema de grande interesse. Os radicais livres são
átomos ou moléculas produzidas durante os processos metabólicos e que atuam como
mediadores da transferência de elétrons em várias reações bioquímicas nas células e tecidos
humanos. As principais fontes de radicais livres são as organelas citoplasmáticas que
metabolizam o oxigênio, o nitrogênio e o cloro (MÉNDEZ FILHO & RODRÍGUEZ, 1997).
A produção excessiva de radicais livres pode conduzir a diversas formas de dano celular e sua
cronicidade está associada com o desenvolvimento de numerosas doenças (SPEISKY &
JIMÉNEZ, 2000). As lesões celulares causadas pelos radicais livres podem ser prevenidas ou
minimizadas por meio da atividade de antioxidantes, sendo estes encontrados em muitos
alimentos de origem vegetal (PAPAS, 1999). Os antioxidantes podem ser definidos como
qualquer substância que, mesmo presente em baixas concentrações, retarda ou inibe de
maneira eficaz a oxidação de um dado substrato celular (AUST et al., 2001). O sistema de
defesa antioxidante (com ação direta na neutralização da ação dos radicais livres) é formado
por fatores enzimáticos e não-enzimáticos. Estes agentes antioxidantes estão presentes tanto
no organismo (nas células ou na circulação sangüínea) como nos alimentos ingeridos
(MONTERO, 1996). No sistema enzimático, os principais agentes antioxidantes são as
proteínas das classes superóxido-dismutases, glutationa-peroxidases e catalases
(HALLIWELL & GUTTERDGE, 1999). Dos componentes não-enzimáticos da defesa
antioxidante destacam-se alguns minerais (ex. cobre, manganês, zinco, selênio e ferro);
vitaminas (ácido ascórbico, vitamina E, vitamina A); carotenóides (β-caroteno, a-caroteno,
13
licopeno e luteína); bioflavonóides (genisteína e quercetina) e taninos (catequinas) (PAPAS,
1999; CARVALHO et al., 2006).
Os carotenóides e as vitaminas são as substâncias mais investigadas como agentes
antioxidantes em sistemas biológicos (POOL-ZOBEL et. al., 1997). Os carotenóides
compreendem uma família de compostos naturais, dos quais mais de 600 variantes estruturais
estão reportadas e caracterizadas em bactérias, algas, fungos e plantas superiores. A produção
mundial de carotenóides naturais é estimada em 100 milhões de toneladas por ano, sendo que
o maior volume individual encontra-se na obtenção da fucoxantina das algas fotossintéticas
marrons. Os mamíferos não estão bioquimicamente capacitados para a síntese de
carotenóides, mas podem acumular e/ou converter precursores que obtêm da dieta (exemplo,
conversão de ß-caroteno em vitamina A) (STAHL & SIES, 1999).
Dos carotenóides acíclicos, o licopeno e o z-caroteno são os mais comuns. O licopeno
é o principal pigmento de algumas hortaliças de coloração vermelha (RODRIGUEZ-
AMAYA, 2001). O carotenóide bicíclico b-caroteno é o mais difundido de todos os
carotenóides, presentes tanto em altas quanto em baixas concentrações, dependendo da
espécie vegetal. Estudos mostram a relação entre o aumento no consumo de alimentos ricos
em carotenóides e a diminuição no risco de várias doenças. Testes in vitro e in vivo sugerem
que os carotenóides são excelentes antioxidantes, seqüestrando e inativando os radicais livres
(ERDMAN, 1999). Segundo OLSON (1999), os carotenóides seqüestram o oxigênio singleto,
removem os radicais peróxidos, modulam o metabolismo carcinogênico, inibem a
proliferação celular, estimulam a comunicação entre células e elevam a resposta imune. Em
decorrência da importância atribuída aos carotenóides, especialmente ao licopeno, vários
estudos vêm sendo realizados para confirmar o efeito benéfico desta classe de pigmentos
vegetais. MICHAUD et al. (2000) relataram que a ingestão de carotenóides reduziu em 32% o
risco de câncer de pulmão em não fumantes. Uma maior ingestão de β-caroteno reduziu em
63% o risco de aparecimento de câncer em não-fumantes. Em fumantes, no entanto, a redução
do risco foi insignificante para os demais antioxidantes, exceto licopeno. Uma significativa
redução no risco de câncer foi observada com o aumento no consumo de licopeno
(MICHAUD et al., 2000), corroborando com uma vasta literatura médica (HEBER, 2000). O
licopeno apresenta maior eficiência na proteção das membranas celulares contra as lesões
causadas pelo radical dióxido de nitrogênio (encontrado no fumo), apresentando, desta forma,
um papel especial na prevenção do câncer de pulmão (BOHM et al., 1995).
14
Apesar das evidências protetoras do licopeno no câncer de próstata (RAO &
AGARWAL, 2000), alguns estudos têm demonstrado resultados inconsistentes sobre este
efeito (SHIRAI et al., 2002). Esta inconsistência pode ser parcialmente explicada por
problemas com a biodisponibilidade do licopeno de diferentes fontes alimentares e questões
fisiológicas próprias de cada indivíduo (TUCKER, 2003). Segundo um estudo realizado no
Canadá por RAO et al. (1998), a média de ingestão de licopeno, verificada por meio de
questionários de freqüência alimentar, foi de 25 mg por dia, com 50% desta ingestão
representada por tomates in natura. RAO & AGARWAL (2000) sugerem que o valor de 35
mg/dia seria uma ingestão média diária apropriada do licopeno. Portanto, é necessário
estimular o consumo de alimentos ricos em licopeno, visando suprir as necessidades diárias
recomendadas. Os tomates consumidos in natura apresentam o licopeno em forma menos
biodisponível que os tomates processados (WILLCOX et al., 2003). Essa diferença de
biodisponibilidade está relacionada com as formas isoméricas apresentadas pelo licopeno,
sugerindo que uma maior ingestão de tomates processados seria a maneira mais eficiente de
suprir este pigmento nas concentrações consideradas adequadas (RAO & AGARWAL, 2000).
Mais recentemente, as propriedades nutracêuticas dos carotenóides fitoeno e fitoflueno
têm sido demonstradas em diferentes estudos. Estes compostos estão também presentes em
frutos do tomateiro e são absorvidos e acumulados em importantes órgãos de diferentes
mamíferos. Três carotenóides do tomate (licopeno, fitoeno e fitoflueno) apresentaram uma
ampla distribuição no organismo de ratos, porém se acumularam mais intensamente na
próstata. O fitoflueno mostrou mais alta concentração no fígado (CAMPBELL, 2007).
As moléculas dos carotenóides apresentam muitas possibilidades de isomeria
geométrica (especialmente induzida por temperatura) e ótica. CLINTON et al. (1996)
demonstraram que 79% a 91% do licopeno presente nos tomates e seus produtos encontram-
se sob a forma do isômero trans (trans-licopeno), em contraste com os níveis de licopeno
sérico e tissulares, que se encontra em mais de 50% na forma de isômero cis-licopeno. O
licopeno ingerido, na sua forma natural (trans-licopeno), é pouco absorvido, mas, como
mencionado, estudos demonstram que o processamento térmico dos tomates e seus produtos
melhoram a sua biodisponibilidade. O processamento térmico rompe a parede celular e
permite uma extração mais eficiente do licopeno dos cromoplastos (WILLCOX et al., 2003).
A importância dos carotenóides β-caroteno e a-caroteno na dieta, como precursores da
vitamina A, tem sido reconhecida por muitas décadas (BRITTON, 1995). No organismo
humano, estes pigmentos atuam na formação de pigmentos visuais, no crescimento celular
normal, no desenvolvimento e manutenção da estrutura epitelial e das mucosas que revestem
15
intestinos, vias respiratórias bem como no desenvolvimento de dentes e ossos. A conversão do
β-caroteno em vitamina A é realizada na parede do intestino delgado, sendo influenciada pela
ingestão de gordura e proteínas da dieta. O â-caroteno só é biologicamente ativo quando
transformado em retinol (vitamina A), sendo seu teor médio no sangue de 300 mcg/dL. A
absorção de β-caroteno é dependente da presença de bile e aproximadamente um terço de β-
caroteno é absorvido no intestino (AMBRÓSIO et al., 2006).
A dificuldade de definir um fator geral de conversão do carotenóide pró-vitamina A
em vitamina A, não é recente. A Organização Mundial de Saúde (OMS) sugeriu, em 1967,
que 6 µg de ß-caroteno trans ou 12 µg de todos os carotenóides do tipo pró-vitamina A trans
nos alimentos é equivalente a 1 µg de retinol trans (FAO/WHO, 1967). Na ausência de uma
informação precisa e devido à complexidade do problema, a maioria dos comitês nacionais e
internacionais adota os mesmos valores. Estes valores foram recentemente duplicados, sendo
proposto que 12 µg de ß-caroteno trans ou 24 µg de carotenóides do tipo pró-vitamina A
trans é equivalente a 1 µg de retinol trans (MONSEN, 2000). O β-caroteno é uma molécula
que pode ser convertida em vitamina A no organismo sempre que necessário. O excesso da
vitamina A pode ser nocivo, enquanto o β-caroteno em si não faz mal algum. Os níveis
máximos de ingestão de vitamina A recomendados são de 10000 unidades internacionais (UI).
Por seu lado, o β-caroteno pode ser tomado em doses diárias que ultrapassam as 300.000 UI
(180 mg), sem que se observem efeitos nefastos (PASSWATER, 1998). O β-caroteno co-
existe como dois isômeros na geometria quadrado planar, o trans e o cis, em proporções
desiguais. Foram realizados vários estudos de absorção dos dois isômeros e verificou-se que
os níveis sanguíneos da forma em trans são superiores ao do isômero cis (STAHL et al.,
1993; 1995; TAMAI et al., 1995; BEN-AMOTZ & LEVY, 1996; JOHNSON et al., 1997).
Alguns destes autores sugerem que este resultado é indicativo de uma maior absorção do
trans-β-caroteno por parte do intestino. Todavia, a maior parte destes estudos não determinou
os níveis de β-caroteno acumulado em tecidos, em especial no fígado, o que implicaria a
realização de biópsias (seres humanos) ou o sacrifício dos animais em estudo. Portanto, são
necessários estudos mais rigorosos de modo a determinar se existe uma absorção preferencial
de um dos isômeros.
A luteína é um carotenóide encontrado em flores, frutos e folhas e, na biologia
humana, tem um importante papel na saúde dos olhos. A luteína tem sido usada como
suplemento, atuando na prevenção do desenvolvimento de catarata e degeneração macular e
prevenindo a diminuição da densidade macular causada por fatores como envelhecimento e
16
tabagismo (HAMMOND et al., 1997; LYLE et al., 1999; SEDDON et al., 1994). A luteína é
sintetizada a partir de α-caroteno. Os seus ésteres, formados pela combinação de uma
molécula de ácido orgânico com uma molécula de álcool, ocorrem naturalmente em muitas
frutas tais como a maçã, a laranja, o mamão papaia, o pêssego, a ameixa seca e a tangerina. A
luteína e a zeaxantina são os dois principais carotenóides encontrados na mácula, o pigmento
da retina responsável pela visão nítida das imagens, e estão associadas a proteínas solúveis
(SOMMERBURG et al., 1999). O excesso no acúmulo desses carotenóides pode causar uma
típica pigmentação amarelada da retina (LYLE et al., 1999).
1.6. Importância dos Carotenóides como Elementos Funcionais.
Dentro de alimentos funcionais e do programa internacional visando utilizar a
biodiversidade vegetal para promover uma alimentação mais saudável, existe a necessidade
de se determinar, com maior precisão, os teores de nutrientes e substâncias bioativas em
alimentos nativos do Brasil. Atualmente já existe um banco de dados sobre composição de
carotenóides em diferentes alimentos brasileiros, incluindo diversas hortaliças
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1996; 1999). Esta informação catalogada minimiza a falta de
exatidão ao utilizar tabelas gerais de composição de alimentos (RODRIGUEZ-AMAYA,
2000), em especial em inquéritos dietéticos que visam avaliar o estado nutricional de
indivíduos e o estabelecimento de eventuais programas de intervenção. Uma recente revisão
sobre as hortaliças como fontes de elementos funcionais foi recentemente publicada
(CARVALHO et al., 2006).
O efeito terapêutico do consumo adequado de hortaliças e frutas inclui alteração na
composição de gorduras corporais, redução na absorção do colesterol, regulação da
coagulação do sangue, influência nas atividades digestivas, entre outras. Contudo, a grande
área emergente é aquela que basicamente combina alimentação com a prevenção de doenças,
buscando os chamados alimentos com propriedades funcionais ou nutracêuticas. Parte
considerável das substâncias de origem vegetal que previnem doenças são pró-vitaminas ou
antioxidantes. Algumas substâncias fazem parte do metabolismo secundário, em especial os
pigmentos carotenóides e os flavonóides (LÁZARO, 2002). A Agência Nacional de
Vigilância Sanitária – ANVISA, visando regulamentar esta nova prática no Brasil, publicou a
portaria nº 398 de 1999, que estabelece as diretrizes básicas para a análise e comprovação de
propriedades funcionais e/ou de saúde alegadas em rotulagem de alimentos. Esta atitude visa
proteger o consumidor e estimular os investimentos em pesquisas científicas. Atualmente
existem alguns alimentos que já tem suas propriedades funcionais comprovadas. Por exemplo:
17
as fibras diminuem o colesterol sangüíneo e a glicemia em pacientes diabéticos e previnem o
câncer de cólon; o tomate possui o licopeno, que atua contra os cânceres de próstata, cólon,
pâncreas e pulmão; o alho e a cebola possuem substâncias de ação antiinflamatória (exemplo,
a alicina). A falta de informação da população acerca das fontes de carotenóides é fato que
deve ser levado em consideração. Programas de educação nutricional da população brasileira
acerca dessas fontes funcionariam como uma importante ferramenta no combate de diversas
carências de pró-vitaminas e antioxidantes. Por exemplo, um programa que proporcionou a
elevação dos níveis séricos de retinol de crianças em uma comunidade rural da África do Sul
envolvia a inclusão na dieta de hortaliças de coloração verde-escura ou amarela combinada
com uma atenção à saúde e educação nutricional (FABER et al. 2002). É importante também
levar em consideração fatores fisiopatológicos dos diferentes grupos etários para garantir uma
maior eficácia destes programas. No caso da vitamina A, de acordo com a NATIONAL
ACADEMY OF SCIENCES USA (2001), a ingestão diária mínima, para garantir um nível
sérico adequado e prevenir sintomas de deficiência em indivíduos adultos é de 500 a 600µg;
em crianças 200 a 300µg; em gestantes 550µg e em lactantes 900µg. Os tomates e seus
derivados aparecem como as maiores fontes de licopeno (DJURIC & POWELL, 2001;
TAKEOKA et al., 2001).
Em relação ao antioxidante licopeno, o tomate in natura apresenta, em média, 30
mg/kg do fruto; o suco de tomate cerca de 150 mg/litro; e o ketchup contém em média 100
mg/kg (STAHL & SIES, 1999). O licopeno presente nos tomates varia conforme o tipo e o
grau de amadurecimento dos mesmos e entre diferentes cultivares (CARVALHO et al., 2005)
Segundo GIOVANNUCCI (1999), o tomate vermelho maduro contém maior quantidade de
licopeno que de β-caroteno, sendo responsável pela cor vermelha predominante. Embora seja
relativamente pobre em pró-vitamina A, o tomate constitui-se na terceira fonte desta
substância na dieta humana devido ao elevado consumo per capita de extratos e produtos
processados derivados do tomate (TIGCHELAAR, 1986).
1.7. Biologia dos Carotenóides.
Os carotenóides são classificados em dois grandes grupos (carotenos e xantofilas). Os
primeiros são hidrocarbonetos simples e os últimos são oxigenados. Os carotenóides são
sintetizados e acumulados nos plastídeos, onde eles se ligam a proteínas hidrofóbicas
específicas. Em todos os organismos fotossintéticos, os carotenóides realizam funções
indispensáveis nos sistemas de captação de luz e nos centros de reações fotossintéticas. Os
carotenóides apresentam a chamada “função de antena”, absorvendo energia solar na região
18
azul-verde do espectro e transferindo esta energia para as clorofilas (GIULIANO et al., 2003).
São também importantes para a conjugação e estabilidade de alguns complexos de pigmentos-
proteínas fotossintéticos (função estrutural). Os carotenóides agem como fotoprotetores,
prevenindo a formação de oxigênio singleto e seqüestrando diretamente estes e outros radicais
livres nocivos à célula vegetal (FOOTE, 1976). Em plantas superiores, estes pigmentos
desempenham papéis adicionais fornecendo as cores amarela, laranja e vermelha a certos
órgãos, como as flores e os frutos, a fim de atrair animais para polinização e para dispersão de
sementes. Nas hortaliças, certos carotenóides que são sintetizados como metabólitos
secundários, se acumulam em altas concentrações e são estocados dentro dos cromoplastos
(RONEN et al., 2000). As cores conferidas por estes pigmentos são de importante valor
agronômico e comercial em várias culturas e plantas ornamentais (CUNNINGHAM &
GANTT, 1998).
1.8. Identificação e Quantificação de Carotenóides em Tecidos Vegetais.
Vários métodos têm sido utilizados para a obtenção de perfis de compostos
metabólicos em tecidos vegetais. A técnica mais recentemente desenvolvida é a
espectrometria de massa, uma ferramenta analítica poderosa que é usada para identificar
compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades
químicas e estruturais das moléculas. A detecção de compostos pode ser conseguida para
quantidades tão pequenas como 10-15 g, para um composto de massa de 1000 Daltons em
misturas quimicamente complexas. A essência da técnica envolve a geração de íons que são
depois detectados. A sofisticação surge nos métodos que são usados para a geração desses
mesmos íons e no modo de analisá-los (CODY et al., 1994). Estudos utilizando
espectrometria de massa acoplada à cromatografia de gás foram capazes de identificar e
quantificar vários metabólicos com propriedades biológicas em folhas e frutos de S.
lycopersicum (SCHAUER et al., 2005; MOCO et al., 2006; TIKUNOV et al., 2005). A
cromatografia gasosa é uma técnica para separação e análise de misturas de substâncias
voláteis, muito utilizada para determinar o perfil de carotenóides. Neste método a amostra é
vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás adequado denominado de fase móvel ou gás
de arraste. Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase
estacionária (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura. As substâncias
separadas saem da coluna dissolvida no gás de arraste e passam por um detector, dispositivo
que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluído. O registro deste sinal
19
em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias aparecem nele como picos
com área proporcional à sua massa, o que possibilita a análise quantitativa (SCOTT &
PERRY, 1995). A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de
separação que passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e
quantitativos nos últimos trinta anos. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua
adaptabilidade para determinações quantitativas; boa sensibilidade e à possibilidade de
separar espécies não voláteis e termicamente instáveis. Segundo BRITTON et al. (1995), um
extrato orgânico (clorofórmio; acetona; etanol) apresentando 0,25 unidades de absorbância
corresponde, aproximadamente, a uma concentração de 1mg de carotenóide/mL em função do
coeficiente de absorvidade A1%1cm= 2500. O limite de sensibilidade na CLAE se situa na
faixa de 5 a 10 mg de carotenóide por litro (BRITTON et al., 1995). Os sistemas de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-Fase Reversa (CLAE-FR), atualmente são muito
utilizados, consistem de uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de
maior polaridade. O sistema de Fase Reversa apresenta várias vantagens, tais como: uso de
fases móveis menos tóxicas e de menor custo (ex. metanol e água); fases estacionárias
estáveis de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel;
facilidade de emprego de eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa
reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à separação de
solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas. A sílica ainda é
o óxido mais utilizado como suporte em CLAE-FR e muitos estudos vêm sendo feitos, para
tentar melhorar a sua estabilidade em pH extremo (TONHIet al., 2002). De um modo geral, as
fases estacionárias monoméricas produzem colunas com maior eficiência. As fases do tipo
poliméricas promovem colunas mais estáveis às condições variadas de fases móveis e com
maior seletividade, pois promovem um melhor recobrimento dos suportes (TONHI et al.,
2002).
A estrutura química mais freqüente dos carotenóides é aquela composta por 40 átomos
de carbonos (C40) ligados por diversas ligações duplas conjugadas. As variantes estruturais
destas moléculas são responsáveis pelas diferentes colorações que elas conferem ao tecido
que as acumula e por muitas de suas funções biológicas. A presença de um grande número de
ligações duplas conjugadas permite a caracterização de diferentes variantes estruturais por
meio da espectrofotometria na faixa de luz visível, com comprimentos de onda máximos de
absorção (l máx) entre 410 a 510 nm (STAHL & SIES, 1999). Uma limitação dos
procedimentos utilizando espectrofotômetro é que eles são utilizados para a determinação de
carotenóides totais e não podendo discriminar os vários tipos de carotenóides. Neste
20
procedimento, os carotenóides são inicialmente extraídos dos frutos utilizando-se solvente
orgânico, com posterior leitura no comprimento de onda variados. Os métodos
espectrofotométricos descritos na literatura são bastante precisos, entretanto muito trabalhosos
e demorados, sendo necessária à utilização de uma quantidade excessiva de reagentes
(CARVALHO et al., 2005).
A colorimetria é uma técnica mais simples e rápida que as anteriores e que, embora de
menor precisão, pode ser empregada em larga escala para a seleção de genótipos com maiores
teores de carotenóides. Além da rapidez, esta técnica evita o dispêndio e os problemas de
descarte dos solventes orgânicos utilizados em outros métodos (CARVALHO et al., 2005).
Em tomateiro esta técnica tem sido amplamente utilizada para identificar e quantificar
licopeno em programas de melhoramento genético. Nesta técnica, a concentração de um
componente específico da amostra é determinada pela comparação da intensidade de cor da
amostra com a de um padrão. A amostra colorida tem características especiais de absorção de
luz que estão relacionados com o conteúdo de licopeno em frutos de tomate (CARVALHO et
al., 2005).
1.9. A Via Biossintética dos Carotenóides: Enzimas e Genes.
A via dos carotenóides, responsável pela biossíntese dos terpenos, um dos grupos do
metabolismo secundário, é uma das vias bioquímicas mais bem caracterizadas em plantas,
com vários genes já clonados e seqüenciados (CUNNINGHAM & GANTT, 1998). No
entanto, com algumas exceções (THORUP et al., 2000), o conhecimento destes genes ainda
não tem sido amplamente utilizado, em termos práticos, no melhoramento genético de
culturas de importância econômica visando aumentar o conteúdo de carotenóides. Esta
informação também ainda é pobremente explorada em estudos sobre a regulação desta
importante via biossintética em plantas (FONSECA & SIMON, 2004).
Uma característica em comum aos vários isoprenóides é a sua biossíntese a partir de
um metabólito central: o composto com cinco carbonos isopentenil pirofosfato (IPP). A
estrutura de 40 átomos de carbono (C40) de pigmentos carotenóides das plantas, por exemplo,
é sintetizada a partir de duas moléculas do composto C20 (geranilgeranil pirofosfato - GGPP),
o precursor imediato dos carotenóides que, por sua vez é sintetizado a partir de quatro
unidades de IPP. O GGPP também serve como precursor para várias outras ramificações da
via dos isoprenóides em plantas, tais como giberelinas, clorofila, tocoferol, filoquinonas e
pastoquinonas, representando o maior ponto de ramificação na formação destes diferentes
21
produtos. A enzima GGPP sintase (GGDS) responsável por este passo já teve, em plantas,
várias das seqüências gênicas que codificam suas isoformas identificadas. Em tomate esta
enzima já foi purificada a partir de cromoplastos e cloroplastos (CUNNINGHAM & GANTT,
1998).
Inicialmente acreditava-se que a biossíntese de IPP em todos os organismos vivos
ocorresse apenas através da via do ácido mevalônico (MVA). Entretanto, recentemente, uma
via alternativa e independente de MVA, conhecida como via metileritriol 4-fosfato (MEP), foi
identificada em bactérias e plastídios. No entanto, existem evidências de que, em plântulas, a
via MVA contribua de fato para a biossíntese de carotenóides (RODRIGUEZ-CONCEPCION
et al., 2004). Já em plantas fotossintéticas, os carotenóides são majoritariamente produzidos
pela via MEP (EISENREICH et al., 2001; LICHTENTHALER, 1999; RODRIGUEZ-
CONCEPCION & BORONAT, 2002).
A reação inicial da via MEP, catalizada pela deoxixilulose 5-fosfato (DXP) sintase
(DXS), envolve a produção de DXP a partir de piruvato e gliceraldeido 3-fosfato (GAP),
seguido por mais quatro passos enzimáticos, ocorrendo assim um rearranjo intramolecular e
por fim uma redução, produzindo finalmente uma mistura de 5:1 de IPP e dimetilalil difosfato
(DMAPP). As enzimas da via MEP são codificadas por genes nucleares, mas localizam-se nos
plastídios (EISENREICH et al., 2001; LICHTENTHALER, 1999; RODRIGUEZ-
CONCEPCION & BORONAT, 2002).
A Figura 1.2. ilustra a via biossintética dos carotenóides. A enzima fitoeno sintase
(PSY) catalisa a etapa de conversão de duas moléculas de GGPP em fitoeno pirofosfato
(PPPP) e então em fitoeno. O fitoeno é um composto incolor que possui a estrutura básica C40
dos carotenóides, e todas as reações subseqüentes na via envolvem transformações químicas
desta. Os genes que codificam PSY têm sido identificados e isolados em diversas plantas. Em
tomate, dois genes para esta enzima foram encontrados, as enzimas foram detalhadamente
caracterizadas bioquimicamente e observou-se a PSY-1 específica de cromoplasto e PSY-2-
específica de cloroplasto (FRASER & BRAMLEY, 2005). O fitoeno sofre uma seqüência de
quatro reações de dessaturação que resulta primeiro no fitoflueno e então no z-caroteno,
neurosporeno e licopeno. Duas enzimas catalisam essa seqüência de quatro reações em
plantas: fitoeno dessaturase (PDS) e z-caroteno dessaturase (ZDS). Em cromoplastos de
tomate é requerida a atividade adicional de uma enzima, a carotenóide isomerase (CRTISO),
para transformar todos os cis-licopeno (pró-licopeno), produzidos pela atividade de PDS e
22
ZDS, em seu isômero trans-licopeno (licopeno) encontrado em plantas (ISAACSON et al.,
2002).
Um ponto importante na ramificação da via de carotenóides é marcado pela ciclização
do licopeno. Em plantas e cianobactérias, a licopeno β-ciclase (LCYB), produto de um único
gene, catalisa a formação da molécula bicíclica β-caroteno a partir da molécula linear
licopeno, criando dois anéis β em suas terminações (FONSECA, 2000). Em outra
ramificação, a licopeno ε-ciclase (LCYE), outra enzima responsável também pela ciclização,
adiciona um anel epsilon no licopeno e produz δ-caroteno. A adição de um anel β na outra
terminação do δ-caroteno, catalisada pela LCYB, leva à produção do α-caroteno
(CUNNINGHAM & GANTT, 2001). Carotenóides com dois anéis epsilon não são
comumente encontrados em plantas. Uma exceção é a lactucaxantina, um ε-carotenóide de
alface. O interessante é que a enzima LCYE de alface demonstra homologia com a proteína
de Arabidopsis e tomate que produz o bicíclico ε-carotenóide mais do que o δ-caroteno a
partir do licopeno (CUNNINGHAM & GANTT, 2001).
Em tomate duas enzimas licopeno β-ciclase foram isoladas, sendo uma delas expressa
especificamente em cromoplasto (RONEN et al., 2000). A hidroxilação na posição C-3 de
cada anel de β-caroteno e α-caroteno produz as xantofilas zeaxantina e lutéina, via β-
criptoxantina e α-criptoxantina respectivamente. Em tomate, duas hidroxilases homólogas as
de Arabidopsis foram encontradas (TIAN et al., 2004). A zeaxantina é convertida em
violaxantina via anteraxantina, pela introdução do grupo 5,6- epoxi na posição 3-hidroxi do
anel β, uma reação catalisada pela enzima zeaxantina epoxidase (ZEP). Sua seqüência gênica
já foi identificada em tomate. Sob excesso de luz a violaxantina de-epoxidase (VDE) catalisa
a reação de de-epoxidação que transforma violaxantina de volta para zeaxantina. Em
condições de pouca luz ocorre a interconversão desta reação, de forma reversível, conhecida
como ciclo da violaxantina (DEMMIG-ADAMS et al., 1996).
O último passo na via de biossíntese de carotenóides é transformar a violaxantina em
neoxantina pela atividade da neoxantina sintase (NSY). Em tomate, a seqüência do gene para
NSY já foi isolado (AL-BABILI et al., 2000). Além disso, a seqüência de aminoácidos
deduzida em tomate para NSY é idêntica a CYCB, levando à especulação dessa enzima ser bi-
funcional sob certas condições. Em tomate, não foi detectada outra atividade de NSY, sendo
esta capaz de sintetizar neoxantina em mutantes com gene CYCB defectivo (RONEN et al.,
2000).
23
FIGURA 1.2. Visão esquemática da via biossintética de carotenóides em plantas.
1.10. Genética, Biologia Molecular e Regulação da Biossíntese de Carotenóides em
Tomate.
Desde 1940, diversas mutações simples que afetam a pigmentação do fruto têm sido
caracterizadas em tomate (LINCOLN & PORTER, 1950). Os frutos do gênero Solanum seção
Lycopersicon possuem uma ampla variedade de cores variando de verde, a amarelo e
vermelho. O processo de amadurecimento em tomates envolve uma complexa e coordenada
série de mudanças na pigmentação e atributos sensoriais resultantes das atividades fisiológica
e bioquímica dos frutos (LURIE et al., 1996). A coloração externa do tomate é o resultado da
pigmentação da polpa e da casca. Visto que a cor é um indicador do estádio de maturação do
tomate, várias cartas de cores e escalas subjetivas têm sido desenvolvidas para classificação
Isopentenil difosfato (IPP) (C )
IPP isomerase
5 IPP (C 5 )
20 GGPP (C )
Geranilgeranil difosfato sintase (GGPP) sintase
) GGPP (C 20
Fitoeno (C 40
)
Fitoeno desaturases
Licopeno
5
d - caroteno
a - caroteno
g - caroteno
b - caroteno
Fitoeno sintase
Licopeno e - ciclase
Giberelina
Tocoferol
Clorofila
Dimetilalil difosfato (DMAPP)
Luteína Zeaxantina
Violaxantina
Neoxantina
Licopeno b - ciclase
Fitoeno
Licopeno Alfa - Caroteno
Beta - Caroteno
OH β-Criptoxantina
β-caroteno hidroxilase
β-Criptoxantina α-Criptoxantina
α-caroteno hidroxilase
Licopeno b - ciclase
24
dos estádios de maturação de tomates (GRIERSON & KADER, 1986). A mudança visível
mais flagrante durante o amadurecimento de tomates é a modificação na sua coloração, ditada
pela degradação de clorofila e síntese de licopeno e β-caroteno (HOBSON & GRIERSON,
1993). Durante o desenvolvimento do fruto, o nível de mRNA dos genes que codificam as
enzimas fitoeno sintase (PSY) e fitoeno dessaturase (PDS) que levam a produção do licopeno
aumentam, enquanto que o nível de mRNA para os genes da licopeno β-ciclase e licopeno ε-
ciclase que converte licopeno para β-caroteno e δ-caroteno, respectivamente, declinam e
desaparecem completamente (RONEN, 1999).
As cores das espécies de tomate diferem do amarelo para o vermelho alaranjado,
dependendo da razão licopeno/β-caroteno da fruta, que também está associada com a presença
da enzima licopeno β-ciclase, a qual participa desta transformação (BOTELLA-PAVÍA &
RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). Em organismos fotossintéticos, a licopeno-β-ciclase é
codificada pelo gene crtL e nos não fotossintéticos pelo, gene crtY ou lyc. Ambas as enzimas
introduzem, seqüêncialmente, dois anéis para formação de β-caroteno. A proteína CrtY tem
massa molecular de 43kDa, enquanto que a CrtL tem de 46-56 kDa e apresentam-se muito
diferentes em relação às suas estruturas primárias, com apenas três pequenas seqüências
conservadas (SIEIRO et al., 2003). VERDOES et al. (1999) descreveram uma nova enzima
para biossíntese de carotenóides codificada pelo gene CrtYB ou B. O gene B, responsável pelo
fenótipo Β (acúmulo de carotenóides) em tomate, foi mapeado no cromossomo 6, próximo ao
locus self-pruning (sp). O fato de o gene CrtL não co-segregar com o lócus B contraria a
possibilidade de uma mutação na licopeno β-ciclase, codificada por CrtL, ser responsável pelo
fenótipo (HIRSCHBERG et al., 2001). Várias evidências indicam que o gene B é responsável
pelo fenótipo tais como: o fato de a seqüência B co-segregar com o fenótipo, assim como a
propriedade de B codificar uma enzima como licopeno β-ciclase, que pode promover a
acumulação de β-caroteno. Além disso, foi observado um elevado nível de mRNA (ácido
ribonucléico mensageiro) do genes B em frutos. Por fim, transgênicos expressando o gene B
em plantas selvagens resultaram em um fenótipo similar ao Β em alguns tecidos do fruto
(RONEN et al., 2000). Duas enzimas licopeno β-ciclase foram isoladas em tomate: uma
codificada pelo gene CrtL, a qual diminui sua atividade com o desenvolvimento do fruto
(PECKER et al., 1996) e uma codificada pelo gene B, sintetizando β-caroteno de novo
durante o desenvolvimento do fruto. Os polipeptídios destas duas enzimas são praticamente
do mesmo tamanho, 500 e 498 aminoácidos respectivamente. Os genes não apresentam
introns e suas seqüências de aminoácidos são 53% idênticas. O gene B é expresso somente em
tecido que contém cromoplasto. (RONEN et al., 2000).
25
A maioria dos carotenóides em tomate cultivado é licopeno (aproximadamente 90%),
com poucas quantidades de β-caroteno (5-10%), lutéina e fitoeno. Nos frutos de old-gold-
crimson (ogc ou b alelo recessivo) falta essencialmente β-caroteno, ao passo que frutos Β (B
alelo dominate) contêm 45% a mais de β-caroteno. Estes dados indicam que a biossíntese de
β-caroteno, específica de cromoplasto, em frutos de tomate é contrariamente modificada pelos
genes og e B (RONEN et al., 2000). A caracterização de bases moleculares em mutantes de
frutos de tomates, com pigmentação alterada como delta (del), Βeta (B) e old-gold-crimson
(ogc), ilustra claramente a importância da regulação transcricional dos genes biossintéticos
para produção de carotenóides em frutos de tomate. No primeiro caso, os frutos ficam com
uma coloração alaranjada, parecida com a da cenoura. No segundo caso, o acúmulo de delta-
caroteno produziu frutos de coloração vermelho alaranjado. No terceiro caso, o mutante no
fruto com total ausência de atividade de β-ciclase, possui mais licopeno do que o tomate
comum (não mutante). Contudo, a quase ausência dessa enzima em frutos como a goiaba e a
melancia, faz com que eles acumulem licopeno e adquira uma coloração vermelha
característica (RONEN et al., 1999; RONEN et al., 2000). Entretanto, o acúmulo de caroteno
pode ser resultado de vários mecanismos regulatórios (CUNNINGHAM & GRANTT, 1998),
no qual além da regulação transcricional, outros mecanismos podem ser importantes, bem
como, o seqüestro destes produtos (CARVALHO et al., 2004).
Nos carotenóides a cadeia de polieno e outras características estruturais influenciam
suas propriedades químicas, a localização e orientação no interior da bicamada lipídica em
ambientes biológicos. Em cromoplastos, a deposição de carotenóides pode levar a alterações
deletérias das propriedades físico-químicos das membranas. Para evitar este efeito, os
cromoplastos apresentam sítios de depósitos de carotenóides no estroma. São os
plastoglóbulos (glóbulos de lipídeos) ligados as membranas e as proteínas fibrilinas
(associadas a corpos carotenóides) que têm por função auxiliar no transporte ou modificação
dos carotenóides e estabilizar as estruturas dos plastídios (cromoplastos) em folhas e frutos. A
formação de cristais de carotenóides, como ocorre no caso do licopeno, é mais uma expressão
celular do seqüestro de carotenóides (CAMARA et al., 1995). Desta forma, fica evidente que
a identificação e o conhecimento de proteínas associadas à cromoplastos poderão contribuir
com o arsenal de tecnologias disponíveis para manipular os produtos da via biossintética dos
carotenóides em pesquisas de trangenes, visando a melhor compreensão da regulação
diferencial do acúmulo destes pigmentos.
26
1.11. Melhoramento de Tomate para Modificar Teores e Tipos de Carotenóides.
O tomateiro cultivado (Solanum lycopersicum L.) apresenta um papel de destaque
quanto ao aspecto de participação na dieta humana. O tomateiro tem sido considerado, no
ponto de vista do melhoramento genético, como uma planta modelo, uma vez que apresenta
diversos mutantes tanto para teor como para tipo de carotenóides (RONEN et al., 1999; 2000;
GIORDANO et al., 2003). Visando disponibilizar aos consumidores cultivares com melhores
propriedades nutritivas, a cultivar ‘San Vito’, utilizando ainda como ferramenta o
melhoramento clássico, foi um dos primeiros resultados destas ações de pesquisa, do
segmento varietal Italiano, totalmente desenvolvido no Brasil. O tomate ‘San Vito’ contém 61
µg g-1 de licopeno, apresentando-se superior no conteúdo de licopeno, quando comparado a
outros tomates cultivados, com média de 30 µg g-1 (GIORDANO et al., 2006). O desafio
agora é incorporar a característica de elevados teores de licopeno em cultivares do tipo longa-
vida.
Recentemente foi anunciado o desenvolvimento do híbrido ‘Doce Vita’ (TORRES et
al., 2007). Este material é um híbrido de porte compacto resultante do cruzamento entre uma
linhagem de entrenós curtos contendo o gene Β e uma linhagem com o fenótipo “anão”. O
gene Β foi introduzido em tomateiro através de cruzamentos interespecíficos com a espécie S.
habrochaites f. glabratum (= L. hirsutum f. glabratum) (LINCOLN & PORTER, 1950).
Acessos que contêm o gene Β possuem frutos com uma coloração alaranjada devido à maior
acumulação do carotenóide β-caroteno (precursor da vitamina A) ao invés de apresentarem
frutos com a típica coloração vermelha, resultantes da acumulação predominante de licopeno.
Apesar da qualidade nutricional das frutas e hortaliças, ricas em vitaminas, sais
minerais, fibras e nutracêuticos, estas ainda não fazem parte da dieta da maioria dos
brasileiros. O estímulo a um consumo mais intenso de frutas e hortaliças, e mais
especificamente do tomate enriquecido com licopeno, não depende apenas dos teores deste
carotenóide. Faz-se necessário que o tomate apresente atributos sensoriais que motivem e
intensifiquem o seu consumo. Desta forma, híbridos que combinem aspectos capazes de
estimular positivamente os principais sentidos humanos envolvidos na degustação do tomate,
incluindo sensações tácteis, gustativas, visuais, aromáticas e com aspectos agronômicos
favoráveis, serão os grandes líderes em um mercado que apresenta crescentes níveis de
exigência (CARVALHO et al., 2006).
27
1.12. Genômica e Seleção Assistida por Marcadores Derivados de Genes da Via
Biossintética dos Carotenóides em Tomateiro.
O genoma nuclear do tomate compreende 12 pares de cromossomos e
aproximadamente 950 Mbp de DNA (59% das seqüências são não-codantes, 11%
transposons, 28% seqüências codantes e 2% seqüências organelares) (WANG et al., 2005).
Aproximadamente 77% do DNA cromossomal está localizado na região heterocromática
centromérica, que é destituída de genes (WANG et al., 2005). Estima-se que o genoma do
tomate expresse aproximadamente 35.000 genes (PETERSON & STACK, 1998; VAN DER
HOEVEN et al., 2002). Atualmente os 12 pares de cromossomos do tomateiro estão sendo
seqüenciados por um consórcio internacional de 10 países, incluindo a China (responsável
pela seqüência do cromossomo 3); França (cromossomo 7); Índia (cromossomo 5); Itália
(cromossomo 12); Japão (cromossomo 8); Coréia (cromossomo 2); Holanda (cromossomo 6);
Espanha (cromossomo 9); Inglaterra (cromossomo 4) e os Estados Unidos (cromossomos 1,
10 e 11). Este esforço é parte de uma grande iniciativa realizada pelo Projeto Genoma
Internacional Solanaceae (International Solanaceae Genome Project – SOL). Concomitante,
outros estudos genômicos estão sendo conduzidos para tomate, incluindo esforços para gerar
dados de “Expressed Sequence Tags” – ESTs (SOL, 2007), e ainda seqüências genômicas de
bibliotecas do tipo “Bacterial Artificial Chromosome” – BACs (SOL, 2007).
Devido à importância dos carotenóides, as enzimas da via biossintética destes
pigmentos tem sido completamente caracterizadas e os genes clonados e seqüenciados em
uma ampla gama de espécies, incluindo o tomate (FRASER & BRAMLEY, 2004).
Marcadores moleculares para vários alelos relacionados a mutações destes genes que resultam
em acúmulo diferencial de carotenóides (GALPAZ et al., 2006; ZHANG & STOMMEL,
2001) e mecanismos de regulação da via biossintética no fruto (SANDMAN et al., 2006) tem
sido descritos e mapeados (LIU et al., 2004). No entanto, não foram encontrados marcadores
moleculares ligados ao acúmulo diferencial de carotenóides tanto em frutos de tomate
cultivado quanto em espécies selvagens.
Na Embrapa Hortaliças, iniciadores de síntese para seqüências gênicas
correspondendo aos genes codificando as enzimas da via biossintética dos carotenóides
fitoeno sintase, fitoeno desaturase, epsilon ciclase e β-ciclase já estão disponíveis e sendo
utilizados na investigação da diversidade alélica em linhagens e híbridos com teores e tipos
contrastantes de carotenóides, visando à identificação de polimorfismos ao nível de DNA
(CARVALHO et al., 2004).
28
A principal classe de marcador resultante deste tipo de prospecção gênica são os
chamados SNPs (“single nucleotide polymorphisms” = polimorfismo de base única). Os SNPs
correspondem à posição onde existe uma modificação das bases nitrogenadas dos
nucleotídeos, A (adenina), T (tiamina), C (citosina) e G (guanina), em uma freqüência alélica
mínima de 1% numa dada população (BROOKES, 1999). Os marcadores moleculares
poderão ser empregados em sistemas de seleção assistida e na identificação de acessos das
espécies semi-domesticadas e selvagens com propriedades nutricionais superiores, que
venham a contribuir em programas de biofortificação nutricional e nutracêutica. Além disso,
estes marcadores SNPs podem ser utilizados para analisar níveis de diversidade genética e
relações filogenéticas inter-específicas e intra-específicas (CARVALHO et al., 2004). As
mutações dos SNPs são de ponto, sendo do tipo transição (substituição de uma purina por
uma purina ou de uma pirimidina por outra pirimidina) ou do tipo transversão (substituição de
uma purina por uma pirimidina e vice-versa) (KWOK & GU, 1999). Em regiões
codificadoras, quando resultam em uma substituição de aminoácidos, são denominados SNPs
não-sinônimos, a substituição podendo ser conservativa e não conservativa, em função das
características dos aminoácidos envolvidos na troca. Nesses casos podem ocorrer
modificações estruturais e funcionais nas proteínas. As modificações que não alteram o
aminoácido são conhecidas como sinônimas, embora possam ocasionar conseqüências
genéticas devido á alteração do mRNA, da tradução e da expressão gênica (KWOK & GU,
1999). Os SNPs podem ser identificados por seqüenciamento. Após a identificação é
necessário validá-los, ou seja, determinar a freqüência de um dado SNP em um grupo de
indivíduos, certificando-se da sua natureza polimórfica (BROOKES, 1999). A grande
vantagem dos SNPs reside na abundância deste tipo polimorfismo em diversos genes
analisados.
1.13. Considerações Finais e Objetivos do Trabalho.
Do ponto de vista do melhoramento genético do tomateiro, a cor vermelha intensa (em
geral diretamente relacionada com a concentração de licopeno) está associada com a melhoria
da percepção visual dos produtos e atributos sensoriais superiores (LEWINSOHN et al.,
2005). Dados recentes indicam que a clivagem dos carotenóides in vivo resulta na formação
de compostos voláteis que conferem sabor e aroma mais acentuados e atrativos (SIMKIN et
al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desta forma, existe uma forte demanda para o aumento
da concentração de licopeno no fruto do tomate tanto para o consumo in natura (ARIAS et
29
al., 2000) como para produtos processados (CARVALHO et al., 2005). Como mencionado,
alguns acessos de tomateiro também acumulam β-caroteno (com função de pró-vitamina A).
No entanto, informações sobre a acumulação de outros carotenóides com propriedades
antioxidantes e/ou com ação de pró-vitamina A em acessos de Solanum (seção Lycopersicon)
ainda são escassas na literatura. A grande variabilidade genética e fenotípica para teor e tipos
de carotenóides existente em espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon tem
possibilitado o desenvolvimento de cultivares para atender as mais diversas demandas do
mercado de tomate para processamento e para consumo in natura. Neste contexto, este
germoplasma pode servir com fontes de genes em programa de melhoramento genético
visando o desenvolvimento de cultivares mais ricas em pigmentos com valor
nutricional/nutracêutico. Um dos focos do programa de melhoramento genético de tomate da
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Hortaliças tem sido diversificar a
disponibilidade destes pigmentos nas novas cultivares e nos novos híbridos. A estratégia é
disponibilizar aos consumidores materiais genéticos que combinem as três características
funcionais dos alimentos, a função primária (organoléptica/sensorial: sabor, textura, cor e
aroma), a função secundária (nutricional: composição química) e a função terciária (alegação
de saúde: nutracêuticos). Para atingir tais objetivos de maneira eficiente, é necessário
estabelecer uma plataforma genética/genômica que auxilie os processos de seleção de
materiais genéticos com atributos nutricionais e/ou nutracêuticos superiores. Esta dissertação
é um componente deste esforço de pesquisa.
30
CAPÍTULO 02
Análise bioquímica do conteúdo e composição de carotenóides em frutos maduros de
espécies silvestres e cultivadas de Solanum (seção Lycopersicon: Solanaceae).
2.0. Introdução.
Os carotenóides são pigmentos lipossolúveis vermelhos, alaranjados e amarelos
encontrados embebidos em membranas de cloroplastos e cromoplastos (BARTLEY &
SCOLNIK, 1995; HIRSCHBERG, 2001). Estes pigmentos têm papel essencial na célula
vegetal permitindo que moléculas de água atuem como redutoras na fotossíntese. Os produtos
da oxidação da água reagem com a molécula da clorofila produzindo oxigênio reativo que
pode causar danos celulares consideráveis (CONN et al., 1991; BARTLEY & SCOLNIK,
1995). Os carotenóides atuam como antioxidantes do oxigênio, clorofila e ânions superóxidos,
permitindo que duas funções essenciais na planta, a absorção de luz durante a fotossíntese e a
conversão de luz em energia química, ocorram sem comprometimento da estrutura celular
(CONN et al., 1991; DEMMIG-ADAMS & ADAMS III, 2002). Os carotenóides
desempenham outros papéis fisiológicos e bioquímicos relevantes, sendo precursores de
alguns hormônios vegetais, clorofila e vitaminas (MILLBORROW, 2001; FESTER et al.,
2002; BOUVIER et al., 2003; GIULIANO et al., 2003). Os diferentes carotenóides também
fornecem as cores necessárias para guiar polinizadores para flores e atrair para os frutos os
agentes de dispersão de sementes (HIRSCHBERG, 2001). Outras funções dos carotenóides
têm sido sugeridas, incluindo a estabilização das membranas dos tilacóides (ex. carotenóide
zeaxantina) e a função estrutural da oligomerização dos complexos de absorção de luz durante
a montagem do complexo fotossintético (ex. luteína) (BRITTON, 1995; POGSON et al.,
1996).
Na nutrição humana, alguns carotenóides como o β-caroteno, α-caroteno e a
criptoxantina são convertidos em vitamina A (retinol) após clivagem enzimática e redução no
trato digestivo. Outros carotenóides (ex. licopeno, luteína e zeaxantina) são poderosos
antioxidantes e têm sido associados com a redução na incidência de certos tipos de câncer,
doenças vasculares e de problemas de visão (SMIDT & BURKE, 2004). Derivados
oxigenados dos carotenóides (coletivamente chamados de xantofilas) tais como luteína,
violaxantina, neoxantina e zeaxantina, quando ingeridos em quantidades suficientes na dieta,
também apresentam efeitos antioxidantes benéficos, amenizando sintomas de uma série de
doenças associadas com o envelhecimento celular (SMIDT & BURKE, 2004). A luteína e a
31
zeaxantina podem atuar combatendo os riscos de degeneração macular, incluindo a catarata
(SEDDON et al., 1994; SMIDT & BURKE, 2004; TRUMBO & ELLWOOD, 2006).
O principal carotenóide presente em frutos maduros do tomate cultivado (Solanum
lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum Mill.) é o pigmento vermelho licopeno (FRASER
et al., 1994). Os frutos e os produtos processados do tomate são as principais fontes de
licopeno na dieta humana (STAHL & SIES, 1992; RAO et al., 1998). As propriedades únicas
da molécula do licopeno (C40H56), que contem sete ligações duplas conjugadas, fazem deste
pigmento um dos mais poderosos antioxidantes na proteção das células contra radicais livres
(RAO, 2002). Desta forma, o licopeno é mais eficiente na eliminação de oxigênio reativo do
que o β-caroteno e outros antioxidantes conhecidos (DI MASCIO et al., 1989). Além disto,
existe um número crescente de dados mostrando que a ingestão de quantidades adequadas de
licopeno está associada com a diminuição do risco de muitos tipos de doenças degenerativas,
cardiovasculares e de câncer em seres humanos (CLINTON, 1998; NGUYEN &
SCHWARTZ, 1999; CRAMER et al., 2001; RAO, 2002; SMIDT & BURKE, 2004). Os
benefícios do licopeno na dieta humana não são condicionados exclusivamente ao seu papel
como antioxidante. Dados recentes mostram que o licopeno também atua na comunicação
intercelular e na modulação hormonal do sistema imune (KUN et al., 2006).
Do ponto de vista do melhoramento genético do tomateiro, a cor vermelha intensa (em
geral diretamente relacionada com a concentração de licopeno) está associada com a melhoria
da percepção visual dos produtos e atributos sensoriais superiores (LEWINSOHN et al.,
2005). Dados recentes indicam que a clivagem dos carotenóides in vivo resulta na formação
de compostos voláteis que conferem sabor e aroma mais acentuados e atrativos (SIMKIN et
al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desta forma, existe uma forte demanda para o aumento
da concentração de licopeno no fruto do tomate tanto para o consumo in natura (ARIAS et
al., 2000) como para produtos processados (CARVALHO et al., 2005). O teor de carotenóides
com função de pró-vitamina A (ex. β-caroteno) em frutos vermelhos de tomate é
relativamente baixa comparada com outras hortaliças (BHASKARACHARY et al., 1995).
Informações sobre a acumulação de α-caroteno em acessos de Solanum (seção Lycopersicon)
ainda são escassas na literatura. No entanto, o intenso consumo de frutos e produtos derivados
de tomate faz desta hortaliça uma das maiores fontes de pró-vitamina A na dieta humana
(SIMON, 1992).
Os tomates [gênero Solanum L. (seção Lycopersicon)] são nativos da parte oeste da
América do Sul e têm sua distribuição geográfica compreendendo da parte central do Equador
até o Peru, norte do Chile e Ilhas Galápagos (RICK, 1979). Os frutos das espécies do gênero
32
Solanum Lycopersicon apresentam uma notável variação de cores, com um espectro de
tonalidades passando pelo verde, amarelo, laranja até o vermelho intenso. No passado, o
sistema taxonômico do gênero Lycopersicon compreendia nove espécies e duas subdivisões
principais (Eulycopersicon e Eriopersicon), definidas pela possibilidade de cruzamentos,
tamanho e cor de frutos maduros (RICK et al., 1986; WARNOCK, 1988). Em um tratamento
taxonômico mais recente, PERALTA & SPOONER (2001) examinaram as relações
filogenéticas de espécies selvagens de tomate e de taxa relacionadas empregando dados
morfológicos, moleculares (comparação de seqüências de DNA do gene estrutural da sintase
de amido – “granule-bound starch synthase” – GBSSI) e também informações sobre ecologia
e localização geográfica. As descrições morfológicas são, em muitas situações, suficientes
para a identificação das espécies examinadas, sendo que a coloração do fruto maduro
(resultante de diferentes combinações de carotenóides) ainda permanece como o principal
caráter analisado nestes estudos (PERALTA & SPOONER, 2001).
O germoplasma de espécies selvagens tem sido amplamente utilizado para o
melhoramento do tomate cultivado, visando resistência a pragas e doenças (NAGAI et al.,
1992). Existem vários estudos envolvendo a genética da intensificação da cor vermelha do
fruto do tomate bem como estudos de caracterização fenotípica, genética e molecular da
composição de frutos do tomate cultivado. Existem na literatura muitos estudos indicando que
macromutações derivadas de espécies selvagens podem modificar de modo intenso a
coloração dos frutos do tomateiro (KABELKA et al., 2004). No entanto, existem poucos
exemplos de tentativas de manipular geneticamente a composição e o balanço de carotenóides
visando aumentar o valor nutricional nos frutos do tomateiro cultivado via genes oriundos de
espécies selvagens (LICOLN & PORTER, 1950; MACKINNEY et al., 1954; TOMES et al.
1954; STOMMEL & HAYNES, 1994).
A maioria das espécies selvagens de tomate possui frutos maduros de cor verde, sendo
que algumas destas apresentam frutos amarelos e vermelhos, indicando a existência de uma
diversidade natural de teores e tipos de carotenóides neste grupo taxonômico. Acessos destes
materiais exóticos podem representar valiosas fontes de genes para o melhoramento, visando
alterar o balanço e/ou aumentar o conteúdo de carotenóides nos frutos do tomateiro cultivado.
Neste capítulo, frutos de espécies selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon:
Solanaceae] mostrando um amplo espectro de cores de fruto maduro foram avaliados via
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com o objetivo de gerar um catálogo
detalhado sobre a composição e o conteúdo dos principais pigmentos carotenóides em acessos
de espécies Solanum (Seção Lycorpesicon).
33
2.1. Materiais e Métodos.
2.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
O presente estudo utilizou frutos de acessos de espécies selvagens com uma diversa
gama de cores variando de verde (S. habrochaites, S. chilense, S. peruvianum, S. neorickii e S.
pennellii), ao amarelo [S. pimpinellifolium (mutante de fruto amarelo), S. galapagense e S.
cheesmaniae] e ao vermelho (S. pimpinellifolium, S. lycopersicum e S. lycopersicum var.
cerasiforme). Os tomates foram cultivados em casa de vegetação na Embrapa Hortaliças, sob
controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando entre 21oC e 30oC e
temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada iluminação complementar.
As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com solo esterilizado. O Quadro
2.1. descreve a coloração característica dos frutos de cada acesso, a nomenclatura clássica das
espécies dentro do gênero Lycopersicon e a atual nomenclatura dentro do gênero Solanum. O
conteúdo de carotenóides nos frutos de tomate varia durante a maturação (Figura 2.1.,
FRASER et al., 1994).
Desta forma, foram coletados somente os frutos completamente maduros (mudança
completa de cor, mas com frutos ainda firmes). No caso dos frutos verdes, os frutos caídos
e/ou próximos de cair da planta (indicando maturação completa) foram os colhidos para a
extração de carotenóides. Logo após a colheita, os frutos utilizados para os estudos de
identificação, composição e conteúdo de carotenóides foram estocados à –20 ºC, protegidos
por papel alumínio e mantidos no escuro. No momento da análise, os frutos foram
descongelados, homogeneizados e pesados.
FIGURA 2.1. Seis diferentes estádios de maturação do fruto de tomateiro. Fonte: (http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/659/1/FERREIRA-2004-DEF.pdf DEF.)
34
QUADRO 2.1. Identificação e características de coloração de fruto do germoplasma de tomate utilizado neste estudo.
Acessos Espécie de Lycopersicon Espécie de Solanum Cor do fruto maduro
CNPH 1037 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium amarelo
CNPH 796 L. pimpinellifolium
S. pimpinellifolium vermelho
CNPH 1025 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
CNPH 1048 L. pimpinellifolium
S. pimpinellifolium
vermelho
LA 1614 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
CNPH 1040 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
LA 2934 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
CNPH 1678 L. pimpinellifolium
S. pimpinellifolium
vermelho
LA 1614 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
LA 2934 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho
CNPH 1304 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1593 L. esculentum var. cerasiforme S. lycopersicum vermelho
CNPH 1026 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1028 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1027 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
LA 1954 L. peruvianum S. peruvianum verde
CNPH 1035 L. peruvianum S. peruvianum verde
CNPH 1277 L. peruvianum S. peruvianum verde
CNPH 201 L. peruvianum S. peruvianum verde
CNPH 402 L. peruvianum S. peruvianum verde
CNPH 945 L. parviflorum S. neorickii verde escuro
CNPH 432 L. cheesmanii f. minor S. galapagense amarelo
CNPH 944 L. cheesmanii S. cheesmaniae amarelo claro
CNPH 410 L. chilense S. chilense verde
CNPH 421 L. hirsutum S. habrochaites verde claro
CNPH 1034 L. hirsutum S. habrochaites verde claro
CNPH 1122 L. hirsutum S. habrochaites verde claro
CNPH 409 L. pennellii S. pennellii verde
Tospodoro L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1588 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1592 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
HEM 54 L. esculentum S. lycopersicum vermelho
CNPH 1502 L. esculentum S. lycopersicum vermelho alaranjado
*No presente estudo não separamos S. peruvianum de Solanum arcanum e S. huaylasense (PERALTA et al., 2005).
35
2.1.2. Extração dos Carotenóides.
Foram utilizados, em média, três frutos de cada acesso/espécie citada, para obtenção
de 2 g de tecido homogeneizado contendo polpa e casca. As sementes foram removidas. O
método de extração foi conduzido de acordo com o procedimento descrito por RODRIGUEZ-
AMAYA (2001). Nestas amostras foram adicionados 40 mL de acetona (repetidas vezes) até
a total extração dos carotenóides da matriz na qual se encontravam (monitorada por meio da
mudança de cor do tecido). Neste passo as amostras foram homogeneizadas com o auxílio de
um extrator (Polytron, Kinematica). Em seguida, procedeu-se à filtragem a vácuo, com o
auxílio de um kitassato envolto com papel alumínio para evitar a foto-oxidação dos
pigmentos. A partição dos carotenóides foi feita usando éter de petróleo. Ao funil de
separação adicionaram-se 45 mL de éter de petróleo e os pigmentos foram transferidos, em
pequenas frações, seguidas de água destilada, para o funil de separação, descartando-se a fase
inferior até a total remoção da acetona. A solução dos pigmentos em éter de petróleo foi
transferida para um balão volumétrico de 100 mL, sendo posteriormente evaporada em um
evaporador rotatório. Os carotenóides foram redissolvidos em 2 mL de acetona grau
HPLC/CLAE. Após filtração em um filtro hidrofóbico (Millex – FH – Millipore, PTFE, 0.45
mm), uma amostra de 20 mL desta solução foi imediatamente injetada no cromatógrafo.
2.1.3. Análise dos Carotenóides.
As análises foram feitas em triplicatas. O método de análise dos carotenóides foi
conduzido de acordo com o procedimento descrito por RODRIGUEZ-AMAYA (2001). O
sistema CLAE consiste de um computador com sistema de dados (Class VP-Shimadzu), um
auto-injetor de amostra e um detector visível/ultravioleta com arranjo de fotodiodo
(Shimadzu). Na análise por CLAE, a separação foi feita de forma isocrática em uma coluna
monomérica C18 (Spherisorb S3 ODS2) de fase reversa 3 mm, 4.6 x 150 mm. A fase móvel
foi composta por acetonitrila:metanol:etil acetato (8:1:1). O fluxo da fase móvel foi de 0.8
mL/min e o tempo total de corrida de 60 min. Trietilamina (0,05%) foi adicionada à fase
móvel, como recomendado por HART & SCOTT (1995) para melhorar a recuperação dos
carotenóides da coluna.
2.1.4. Identificação dos Carotenóides.
Um foto detector do tipo fotodiodo (PDA – “photodiode array detector”) UV-vis
(ultravioleta – visível) foi programado para quantificar e identificar carotenóides a 470 nm.
36
Esta identificação foi baseada no uso combinado do tempo de retenção (tR) e o espectro de
absorção ultravioleta e visível obtido pelo foto detector fotodiodo. Foi também utilizada a
porcentagem da razão III/II, no qual o II é a altura do segundo pico em absorbância, visto no
espectro de identificação do carotenóide, e III é a altura do terceiro pico em absorbância,
tomando o mínimo entre os dois picos como linha de base (Figura 2.2.). Estes dados foram
comparados com os valores disponíveis em literatura para os principais pigmentos observados
(BRITTON, 1995)
350 400 450 500 550 Comprimento de onda (nm)
FIGURA 2.2. Obtenção da estrutura fina do espectro de carotenóides (BRITTON, 1995)
2.1.5. Obtenção de Padrões Externos.
Os padrões de carotenóides foram purificados através de cromatografia em coluna
aberta (CCA), empacotada com MgO:hyflosupercel (1:2), a partir de tomate (licopeno),
rúcula (luteína) e cenoura (β-caroteno e α-caroteno) e previamente quantificados por
espectrometria para o estabelecimento da curva de calibração (RODRIGUEZ-AMAYA,
2001). A concentração dos padrões de carotenóides foi calculada usando-se a fórmula de
Lambert-Beer (Figura 2.3.). A qualidade dos padrões foi determinada pela determinação de
pureza das amostras avaliadas em HPLC. A pureza de todos os padrões obtidos foi acima de
95%.
% III/II=III/II x 100
II III Ab
sorb
ânc
ia
0 0
37
mg/ml = absorbância máxima x volume de solução x 106
102 x A%1cm x volume de solução
FIGURA 2.3. Fórmula de LAMBERT-BEER para cálculo da concentração de carotenóides.
2.1.6. Determinação do Conteúdo dos Carotenóides.
O conteúdo dos carotenóides foi calculado através de curvas de calibração construídas
de cinco pontos com concentrações crescentes de quatro pigmentos (luteína, licopeno, β-
caroteno e α-caroteno). Cada ponto foi obtido da média de três corridas de uma quantidade
pré-determinada de carotenóide analisada. A quantificação foi obtida utilizando o programa
de quantificação do class vp. As áreas dos picos obtidas nos cromatogramas dos padrões e das
amostras dos frutos de tomate foram integradas automaticamente. A fórmula obtida para cada
carotenóide foi:
Luteína (mg) = 2,19275*10-5* Área do pico
b-caroteno (mg) = 2,61523*10-5* Área do pico
a-caroteno (mg) = 59478*10-5* Área do pico
Licopeno (mg) = 2,61645*10-5* Área do pico
Os pontos utilizados tiveram coeficientes de variação menor que 5% e os coeficientes
de correlação entre área e concentração de carotenóide permaneceram muito próximos do
valor 1,0. A quantidade de zeaxantina nas amostras foi estimada indiretamente usando a curva
de luteína. Os valores da área do pico de zeaxantina foram corrigidos através de um fator de
conversão obtido pela razão entre o coeficiente de extinção da luteína (0,2550) e o da
zeaxantina (0,2540), sendo (1,003937).
38
2.2. Resultados e Discussão.
Os frutos do gênero Solanum seção Lycopersicon possuem uma ampla variedade de
cores (Figura 2.4). A Figura 2.5. ilustra o espectro característico dos carotenóides luteína, β-
caroteno, α-caroteno, xantofila e licopeno, os quais compuseram a biblioteca montada no
programa Class Vp, utilizada na identificação dos carotenóides nos acessos estudados. A
identificação dos carotenóides foi baseada na similaridade dos espectros observados nas
amostras com estes espectros, com o tempo de retenção (tR) e com a estrutura fina espectral
(BRITTON, 1995). O Quadro 2.3. apresenta as médias dos conteúdos dos diferentes
carotenóides nos frutos de espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon.
A
FIGURA 2.4. Variedade de cores dos frutos maduros das espécies (A) S.
peruvianum; (B) S. pimpinellifolium e (C) S. cheesmaniae. Fonte: Acervo de fotos
da Embrapa-Hortaliças.
A B C
39
(A) (B)
(C) (D)
(E)
FIGURA 2.5. Espectros em 2-D de absorção na região visível na fase móvel
(acetonitrila:metanol:etil acetato - 8:1:1) dos picos característicos identificados nas espécies
de tomate: (A) Luteína (λ dos picos localizados a 425, 449 e 475 nm); (B) Licopeno ( λ dos
picos localizados a 446, 473 e 503 nm); (C) α-caroteno ( λ dos picos localizados a 448 e 480
nm); (D) β-caroteno (λ dos picos localizados a 454 e 480 nm) e (E) Zeaxantina (λ dos picos
localizados a 450 e 477 nm).
40
QUADRO 2.3. Média do conteúdo dos carotenóides (em mg/g de peso fresco) verificados nas
espécies do gênero Solanum da seção Lycopersicon.
Acessos
Espécies de Solanum
Luteína
Trans β-
caroteno +
fitoflueno
All-trans-
licopeno
Zeaxantina
CNPH 1037 S. pimpinellifolium 1,7 12,5 - -
CNPH 796 S. pimpinellifolium 3,3 12,5 230,00 -
CNPH 1040 S. pimpinellifolium 2,3 2,36 95,01 13,21
LA 2934 S. pimpinellifolium 3,13 12,9 127,56 -
CNPH 1048 S. pimpinellifollium 6,3 14,47 313,32 4,60
CNPH 1025 S. pimpinellifollium 1,13 3,9 102,82 -
LA 1614 S. pimpinellifollium 4,01 13,41 128,14 10,41
CNPH 1678 S. pimpinellifollium 2,73 4,38 143,51 -
LA 2934 S. pimpinellifolium 3,14 12,91 127,56 -
CNPH 1304 S. lycopersicum 1,12 1,0 50,00 -
CNPH 1593 S. lycopersicum 2,3 12,6 90,32 -
CNPH 1026 S. lycopersicum 5,97 23,38 76,41 -
CNPH 1028 S. lycopersicum 4,55 13,36 64,79 -
CNPH 1027 S. lycopersicum 3,38 6,28 60,85 -
LA 1954 S. peruvianum 2,63 2,6 - 0,51
CNPH 1035 S. peruvianum 1,08 - - -
CNPH 1277 S. peruvianum 12,5 3,0 - 3,0
CNPH 201 S. peruvianum 3,3 2,5 - -
CNPH 402 S. peruvianum 3,3 6,5 - 1,0
CNPH 945 S. neorickii 15,2 5,0 - 3,0
CNPH 432 S. galapagense 10,0 25,0 - -
CNPH 944 S. cheesmaniae 3,0 12,0 - -
CNPH 410 S. chilense 13,0 5,0 - 1,0
CNPH 421 S. habrochaites 5,0 2,0 - -
CNPH 1034 S. habrochaites 3,78 3,01 - 0,09
CNPH 1122 S. habrochaites 2,33 2,47 - -
CNPH 409 S. pennellii 15,0 6,0 - 0,6
Tospodoro S. lycopersicum 0,71 3,62 88,73 -
CNPH 1588 S. lycopersicum 1,42 1,03 81,48 -
CNPH 1592 S. lycopersicum 3,63 8,3 89,69 -
HEM 54 S. lycopersicum 1,58 12,92 84,75 -
CNPH 1502 S. lycopersicum 6,58 52,29 - -
41
O licopeno foi o carotenóide predominante nos acessos da espécie S. lycopersicum
utilizados neste estudo (quadro 2.3.). Este resultado é similar ao encontrado por WILBERG
& RODRIGUEZ-AMAYA (1993), após análise de um grupo de variedades de tomate
cultivado. O pico de licopeno foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível
(λ máx a 446, 473 e 503 nm na fase móvel e % III/II = 71) e o tempo de retenção (tR) igual a
18 a 20 minutos. Estes dados foram similares ao padrão de licopeno isolado por CCA. Houve
uma grande variação no conteúdo de licopeno nos acessos de S. lycopersicum (entre 50,0 e
90,3 mg/g), assim como no de luteína (0,7 a 6,9 mg/g) e b-caroteno (1,0 a 23,38 mg/g). A
quantidade típica de β-caroteno em frutos vermelhos de tomates é relativamente baixa, em
média com valores de 2 a 4 mg/g de peso fresco (BHASKARACHARY et al., 1995). No
presente estudo, os conteúdos dos carotenóides β-caroteno e fitoflueno não poderam ser
separados nas condições utilizadas. No entanto, como o fitoflueno ocorre em baixos teores em
tomate (WILBERG & RODRIGUEZ-AMAYA, 1993), presume-se que a maior parte do pico
obtido nesta análise represente β-caroteno. Foi possível observar que os acessos de S.
lycopersicum vermelhos, também revelaram variabilidade no acúmulo de trans β-caroteno,
em conjunto com o fitoflueno. Destacou-se o S. lycopersicum ‘CNPH 1502’, um mutante com
frutos de coloração laranja, apresentando 52,29 mg/g de trans β-caroteno mais fitoflueno. O β-
caroteno apresentou uma % III/II = 25 e o fitoflueno apresentou uma % III/II = 70.
Vários acessos da espécie S. pimpinellifolium destacaram-se por apresentar uma
grande diversidade no perfil de carotenóides. Estes acessos apresentaram, além do trans-
licopeno (0 a 313,0 mg/g), luteína (1,13 a 6,3mg/g), zeaxantina (0 a 13,21 mg/g), fitoeno
(traços), trans β-caroteno e fitoflueno (2,36 a 14,47mg/g), cis-licopeno (traços), z-caroteno
(traços) e neoxantina (traços). O pico de fitoeno foi identificado pelo seu espectro de absorção
na região visível (λ máx a 276, 287 e 297 nm na fase móvel), em acordo com um cromóforo
de 9 duplas ligações conjugadas, todas na cadeia carbônica e tR = 44 minutos. O z-caroteno
apresentou λ máx a 381, 401 e 425 nm, % III/II = 25 e tR = 31 minutos. O pico de neoxantina
foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível (λ máx a 419, 440 e 425 nm,
% III/II =84, de acordo com um cromóforo de nove duplas ligações conjugadas, todas na
cadeia carbônica e tR = 3,5 minutos. É interessante ressaltar a presença de isômeros cis de
licopeno em alguns acessos. Esta variabilidade ainda não havia sido relatada em tomates
cultivados (WILBERG & RODRIGUEZ-AMAYA, 1993). O cis licopeno, um pró-licopeno,
apresentou λ máx a 441, 468 e 498 nm na fase móvel e % III/II = 75. O λ máx 5 nm mais
baixo que o de licopeno e o aparecimento do pico “cis” a 361 nm, comprovaram que se trata
42
de um isômero cis de licopeno.Vários estudos têm sugerido que a combinação de carotenóides
e outros antioxidantes é uma estratégia mais eficiente do que suplementação dietética de um
simples componente (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). A
presença destes pigmentos em espécies próximas da espécie cultivada abre a perspectiva de
um avanço na obtenção de tomates cultivados contendo uma maior variabilidade de
carotenóides. Quanto ao cis-licopeno, os dados sugerem que os cis-isômeros de licopeno são
mais bem absorvidos pelo organismo humano. Esta maior biodisponibilidade é provavelmente
condicionada pela sua melhor solubilidade em micelas e menor poder de agregação.
(CLINTON et al., 1996). O estudo detalhado do controle genético desta acumulação poderá
gerar informações de uso direto em programas de melhoramento visando o enriquecimento do
tomate para cis-licopeno. Além disso, estudos básicos sobre o impacto deste carotenóide na
dieta humana se fazem necessários, uma vez que atualmente apenas o trans-licopeno tem suas
propriedades funcionais em processo de análise.
Os principais carotenóides encontrados em S. neorickii ‘CNPH 945’; S. peruvianum
‘CNPH 1277’; S. pennellii ‘CNPH 409’ e S. chilense ‘CNPH 410’ foram luteína e zeaxantina.
A luteína foi detectada em todos os tomates analisados, apresentando as mais altas
concentrações em S. neorickii (15,2 mg/g) e S. pennellii (15,0 mg/g). O pico de luteína nestes
acessos foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível (λmáx a 424, 446 e
474 nm e λmáx a 423, 447 e 474 nm, respectivamente) e estrutura fina (% III/II = 60) para
ambos. A presença de dois grupos hidroxila na estrutura foi demonstrada pelo comportamento
cromatográfico (tR = 5.5 e 6.5 minutos). Os dados de comprimento de onda de absorbância
máxima da luteína na literatura são de 422 nm, 445 nm e 473 nm e o valor da % III/II é de 60
(RODRIGUEZ-AMAYA, 2001). Os dados obtidos, quando comparados aos publicados,
confirmam a identidade da luteína.
O pico de zeaxantina nestes acessos foi identificado pelo seu espectro de absorção na
região visível apresentando-se todos próximos (λmáx a 430, 453 e 479 nm), de acordo com
um cromóforo de 9 duplas ligações conjugadas, todas na cadeia carbônica. A presença de dois
grupos hidroxila na estrutura foi demonstrada pelo comportamento cromatográfico (tR = 6.5
minutos). Segundo BRITTON (1995), a all-trans-zeaxantina apresenta uma ligação dupla
conjugada a mais na estrutura do que a all-trans-luteína e conseqüentemente um λ max com
maior comprimento de onda (5 nm), resultado este similar aos obtidos em nossas análises.
Existe atualmente bastante interesse médico no uso de luteína e de zeaxantina na saúde
humana como componentes essenciais do pigmento macular do olho (BOTELLA-PAÍVA &
RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). Na alimentação humana, fontes importantes de
43
luteína/zeaxantina são o milho e as hortaliças folhosas de coloração verde escuro
(ALMEIDA-MURADIAN & PENTEADO 1992; RODRIGUEZ-AMAYA, 1999). Os
tomates de coloração verde, como S. chilense, S. neorickii, S. peruvianum e S. pennellii vêm,
portanto aumentar a lista de espécies que apresentam a acumulação destes carotenóides
essenciais. Vale salientar ainda que diversas pesquisas tenham mostrado que a luteína, usada
como suplemento dietético, pode prevenir a degeneração macular causada pelo
envelhecimento. Em um estudo conduzido por PANDE et al. (2001), a zeaxantina mostrou ser
capaz de proteger a retina contra o peroxinitrito, um radical livre formado pela combinação de
radicais de superóxido e de óxido nítrico. Outro estudo demonstrou uma relação entre a
luteína e a zeaxantina, pigmentos maculares, e a densidade do cristalino ocular. O estudo
sugere que o consumo de luteína e/ou zeaxantina pode retardar aumentos na densidade do
cristalino relacionados à idade (HAMMOND et al., 1997).
O pigmento β-caroteno, o mais potente carotenóide com ação de pró-vitamina A, foi
detectado em quase todos os acessos analisados. Elevadas quantidades foram observadas nos
acessos de frutos amarelos, S. cheesmaniae ‘CNPH 944’ (12 mg/g) e S. galapagense ‘CNPH
432’ (25 mg/g). Nestes acessos o β-caroteno apresentou λ máx a 454 e 480 nm e % III/II = 25,
refletindo um cromóforo de 11 duplas conjugadas, porém, com duas duplas em anéis β. O
tempo de retenção (tR = 34 minutos), indicando a ausência de substituintes.
Como fontes de luteína e trans β-caroteno, estas espécies colocam-se como mais uma
alternativa para a manipulação genética do conteúdo de carotenóides não comumente
encontrados nos tomates cultivados. Assim como em S. neorickii ‘CNPH 945’ (5 mg/g); S.
peruvianum ‘CNPH 1277’ (3 mg/g); S. chilense ‘CNPH 410’ (5 mg/g) e S. pennellii ‘CNPH
409’ (6 mg/g) que, mesmo tendo a coloração verde apresentam-se como mais uma fonte de
trans β-caroteno. Variações quantitativas para β-caroteno já haviam sido observadas em
Lycopersicon cheesmanii (STOMMEL & HAYNES, 1994) e em cruzamentos intra-
específicos entre S. lycopersicum e S. pennellii (LIU et al., 2004).
O β-caroteno, assim como todos os carotenóides, co-existe como dois isômeros, o
trans e o cis. A configuração trans é a forma mais estável, e que ocorre na natureza, enquanto
que os cis isômeros podem existir naturalmente, mas em pequenas quantidades. Vários
estudos de absorção dos dois isômeros foram realizados e verificou-se que os níveis
sanguíneos da forma em trans são superiores ao do isômero em cis (STAHL et al., 1993,
1995; TAMAI et al., 1995; BEN-AMOTZ & LEVY, 1996; JOHNSON et al., 1997). Por
conseguinte, alguns dos autores referidos sugerem que este resultado é indicativo de uma
44
maior absorção do trans- β-caroteno por parte do intestino. Todavia são necessários estudos
mais rigorosos de absorção e acumulação dos dois isômeros de β-caroteno, de modo a
determinar se existe, de fato, uma absorção preferencial de um dos isômeros.
Os pigmentos α-caroteno e β-caroteno (pigmentos de cor laranja) são de singular
importância como precursores da vitamina A. Em decorrência do alto custo dos alimentos de
origem animal, as pró-vitaminas vegetais constituem a maior porção das vitaminas dietéticas
(WHO/NUT/95.3). Embora exista no Brasil uma grande disponibilidade de frutas e hortaliças
como potenciais fontes de carotenóides, existe, em contradição, um elevado número de
crianças com hipovitaminose A. O pigmento α-caroteno (com ação de pró-vitamina A) só
esteve presente, e em pequenas quantidades, em frutos amarelos de S. cheesmaniae e S.
galapagense. No restante dos acessos foram observados apenas traços deste carotenóide. A
luteína, sem dúvida, foi o carotenóide mais difundido, apresentando quantidades variadas, em
todas as espécies avaliadas. O resultado combinado da acumulação destes dois pigmentos nos
acessos estudados indica uma aparente ausência de macromutações do gene hidroxilase,
induzindo perda da função e/ou presença de fatores duplicados no anel beta e epsilon, que
controla a conversão enzimática de α-caroteno em luteína (CUNNINGHAM & GANTT,
1998; HIRSCHBERG, 2001).
De acordo com nossos resultados, é inquestionável que o S. pimpinellifolium, um
típico tomate de cor vermelha, é a melhor fonte para melhoramento genético focado no
incremento do conteúdo e na diversidade de carotenóides. Esta espécie apresenta bom nível
de concentração para os isômeros de licopeno, trans β-caroteno, fitoeno, fitoflueno, z-
caroteno, neoxantina e luteína, indicando que a via biossintética de carotenóides parece ser
mais ativa nesta espécie quando comparada com outras espécies selvagens. RAO (2002)
indica que é necessário o consumo, em média, de aproximadamente 35mg licopeno/dia, para
obter os efeitos antioxidantes nas células humanas. Neste contexto, seria necessário, para
atingir o nível recomendado, o consumo diário de aproximadamente 112 g dos frutos do
acesso S. pimpinellifolium (conteúdo de licopeno 313,3 mg/g) em comparação com 194g do
melhor fruto de tomate cultivado (S. lycopersicum ‘Thay Pink’). Ainda é importante
mencionar que compostos intensificadores do aroma do tomate derivam de carotenóides
(SIMKIN et al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desse modo, o melhoramento genético
para intensificar qualidades sensorais mais agradáveis pode requerer um perfil complexo de
acúmulo de carotenóides, o que não é observado, nos nossos dias, em tomates cultivados.
O padrão de acúmulo diferencial, observado no presente estudo, reforça a noção de
que alelos e ou mecanismos de regulação distintos operam na via biossintética de carotenóides
45
em frutos de diferentes acessos de tomates. Em estudos conduzidos por LIU et al. (2004),
foram encontradas muitas regiões contendo componentes quantitativos (“quantitative trait
loci ” – QTLs) associados com à intensidade da cor do fruto. No entanto, estes QTLs não co-
segregaram com genes estruturais da via dos carotenóides em populações derivadas de
cruzamento S. lycopersicum ‘M-82’ x S. pennellii ‘LA 0716’. Esta observação indica que
genes regulatórios adicionais e /ou características morfológicas podem estar associados com
esta característica (ROUSSEAUX et al., 2005). Contudo, seria interessante avaliar se situação
similar pode ocorrer quando empregamos este tipo de busca por gene candidato e QTLs, em
cruzamentos envolvendo acessos da espécie S. pimpinellifolium, que apresentou um perfil de
carotenóides muito mais complexo do que o de S. pennellii ‘LA 0716’
Mais recentemente, extensivos perfis e quantificação de compostos metabólicos em
frutos têm sido conduzidos, via cromatografia de gás e espectrometria de massa, com tomates
cultivados (SCHAUER et al., 2005; 2006; TIKUNOV et al., 2005; MOCO et al., 2006). Estes
estudos foram capazes de identificar e quantificar vários metabólitos de importância
nutricional e funcional, incluindo ácidos orgânicos, açúcares (SCHAUER et al., 2005),
flavonóides (MOCO et al., 2006) e carotenóides cíclicos voláteis (TIKUNOV et al., 2005).
Entretanto, a análise baseada em HPLC/CLAE reportada aqui forneceu o mais amplo estudo
comparativo de níveis relativos e composição de carotenóides em frutos de S. lycopersicum
tipos selvagens e mutantes, bem como em acessos representando variedades botânicas semi-
domesticadas de Solanum L. (seção Lycopersicon [Mill.] Wettst. subseção Lycopersicon).
Dez carotenóides foram detectados, acumulando-se em vários níveis nos acessos
estudados. Alguns destes pigmentos já são reconhecidos como compostos funcionais, tendo
efeito benéfico à saúde humana. Portanto, a ocorrência natural de variações na composição e
conteúdo de carotenóides, em frutos de espécies selvagens, pode ser útil para acrescentar esta
diversidade em tomate por meio de programas de melhoramento, objetivando melhorar o
valor nutricional e funcional do tomate cultivado. Barreiras de cruzamento entre espécies
selvagens e S. lycopersicum são restritas somente para alguns acessos e espécies,
particularmente os do complexo S. peruvianum. Entretanto, vários avanços tecnológicos têm
permitido ultrapassar as barreiras de incompatibilidade (BHATIA et al., 2004). Neste cenário,
a variação de carotenóides observada neste germoplasma exótico de tomate pode representar
uma valiosa fonte de tipos e quantidades de carotenóides para serem incorporados em
variedades elites comerciais, via melhoramento por introgressão (ZAMIR, 2001).
Atualmente novas pesquisas genéticas e genômicas estão em processo de identificar
fatores regulatórios que possam significativamente contribuir para aumentar os níveis de
46
carotenóides e o valor nutricional de alimentos (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-
CONCEPCIÓN, 2006). Os acessos aqui selecionados poderão ser utilizados em estudos de
engenharia metabólica visando aumentar os níveis de carotenóides, relevantes
nutricionalmente.
O enriquecimento da dieta é um requisito fundamental para regiões tropicais, muitas
vezes carentes de fontes baratas de alimentos funcionais. No Brasil existem vários alimentos
fontes de carotenóides, como a abóbora, cenoura, manga, batata-doce, espinafre, mostarda,
couve, entre outros. O desenvolvimento de tomates com maior diversidade de carotenóides se
encaixa perfeitamente dentro de um novo conceito desenvolvido por diversos projetos
internacionais que visam utilizar a biodiversidade para promover uma alimentação mais
saudável, incluindo uma maior disponibilidade de alimentos funcionais ou nutracêuticos. Este
novo conceito é, sem dúvida nenhuma, um incentivo para a identificação e o estudo da
composição de carotenóides considerados importantes para a saúde humana, visando compor
um banco de dados sobre composição de carotenóides no maior número de espécies vegetais
de importância global ou regional (RODRIGUEZ-AMAYA, 1996; 1999).
47
2.3. Conclusões.
A partir dos resultados obtidos podemos concluir que os frutos de diferentes acessos
de espécies cultivadas e selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon apresentam
diversos tipos, conteúdos e balanço de carotenóides. Espécies selvagens com frutos de
coloração verde apresentaram um acúmulo considerável de carotenóides essenciais tais como
luteína e zeaxantina, que não estão disponíveis em quantidades satisfatórias nos acessos de
tomate cultivado. Portanto, estes acessos podem fornecer genes capazes de aumentar o
repertório de carotenóides com características nutricionais diferenciadas. Além deste
acréscimo, diversos carotenóides de reconhecido valor nutricional, mas que não são
comumente encontrados em tomates, tais com o β-caroteno, foram identificados em espécies
como S. galapagense, S. cheesmaniae e em um mutante de S. pimpinellifolium. Estes acessos
com frutos de pigmentação de fruto amarela podem representar fontes alternativas de
carotenóides em tomates. Alguns acessos de S. pimpinellifolium (de coloração tipicamente
vermelha) apresentaram o perfil mais diversificado de carotenóides e, portanto, são
considerados os mais adequados para melhoramento. Acessos desta espécie apresentaram
bons níveis de concentração para distintos carotenóides incluindo: luteína, fitoeno, z-caroteno,
neoxantina, fitoflueno, trans β-caroteno, all-trans-licopeno e cis-licopeno. Estes resultados
indicam que o germoplasma das espécies selvagens apresenta um enorme potencial para
contribuir no melhoramento do tomateiro cultivado visando, especialmente, o
desenvolvimento de variedades com características nutricionais e funcionais superiores. Estes
acessos podem também ser utilizados em estudos básicos de engenharia metabólica, visando
identificar os componentes genético-moleculares associados com maiores níveis e diversidade
de carotenóides de relevância nutricional. Estes estudos serão uma ferramenta fundamental
em projetos de pesquisa, desenvolvimento e inovação visando novos produtos que contribuam
para fornecer fontes baratas de pigmentos com função de pró-vitamina A, bem como de
alimentos funcionais e nutracêuticos. A adoção destas cultivares promoveria o enriquecendo
da dieta humana, especialmente em regiões onde a carência destes pigmentos tem sido
cronicamente observada.
48
CAPÍTULO 03
Desenvolvimento de protocolos de PCR específicos para a detecção de genes
codificadores de enzimas da via biossintética de carotenóides em espécies de Solanum
(Seção Lycopersicon).
3.0. Introdução.
A via biossintética dos carotenóides é uma das mais estudadas em plantas, com vários
genes codificadores de suas enzimas já clonados, seqüenciados e caracterizados
(CUNNINGHAM & GANTT, 1998; ISAACSON et al., 2002). A enzima fitoeno sintase
(PSY) é a primeira dedicada à biossíntese de carotenóides (Figura 1.2.). Esta enzima sintetiza
o fitoeno (uma molécula com 40 carbonos) a partir da condensação de duas moléculas do
composto intermediário geranilgeranil difosfato (uma molécula isoprenóide de 20 carbonos).
Em tomate (Solanaum lycopersicum L.), dois genes que codificam a fitoeno sintase foram
caracterizados. O gene PSY-1 codifica uma enzima que apresenta expressão específica em
frutos e flores (GIULIANO et al., 1993). O gene PSY-2 codifica uma enzima de expressão
específica em tecidos foliares (FRASER & BRAMLEY, 2005).
A etapa de ciclização do licopeno é outra importante bifurcação dentro da via
biossintética dos carotenóides (Figura 1.2.). Duas enzimas do tipo licopeno ciclase [licopeno-
β-ciclase (LCYB) e licopeno-ε-ciclase (LCYE)] estão envolvidas no processo de ciclização do
licopeno. A enzima licopeno-β-ciclase é capaz de adicionar um anel do tipo β a uma molécula
de licopeno. A enzima licopeno-ε-ciclase adiciona um anel do tipo ε. A adição de dois anéis
do tipo β leva à formação do β-caroteno. A adição de um anel do tipo ε e um anel do tipo β
leva à formação de α-caroteno (RONEN et al., 1999).
Dois genes (de cópia única) foram descritos codificando a enzima licopeno-β-ciclase
no tomateiro cultivado: LCYB e CYCB. O gene CYCB codifica uma enzima específica de
tecidos que contêm cromoplastos, tais como frutos e flores (RONEN et al., 2000). A enzima
licopeno-ε-ciclase (LCYE) é codificada pelo gene Crtl-e. Esta enzima apresenta 30% de
identidade de aminoácidos com a LCYB (RONEN et al., 1999). Tanto o conteúdo de mRNA
do gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase quanto o que codifica a licopeno-β-ciclase
diminui durante todos os estádios que levam ao desenvolvimento completo do fruto de
tomate, que culmina com o acúmulo de licopeno (RONEN et al., 1999). Este fato sugere que
um dos pontos da regulação do acúmulo de licopeno poderia ser na produção e/ou degradação
dos mRNAs específicos destas enzimas.
49
A cor amarela e/ou alaranjada observada em frutos de alguns mutantes de tomate
(delta e Beta) é controlada por alterações nos genes codificadores de distintas enzimas
licopeno-ciclases (RONEN et al., 1999; 2000). A mutação Beta resulta em uma acumulação
de mRNA do gene CYCB e um maior teor de β-caroteno em frutos. A mutação delta resulta
na acumulação do mRNA do gene Crtl-e e na acumulação do carotenóide d-caroteno
(RONEN et al., 1999). A mutação “old-gold crimson” (gene ogc) controla o acúmulo de
licopeno em frutos e pétalas devido a uma mutação que altera a seqüência de dois códons no
gene CYCB resultando em uma ciclase não funcional (RONEN et al., 2000).
Embora a genética da síntese de carotenóides seja bem estudada em tomates
cultivados, existem poucas informações disponíveis sobre a diversidade dos genes
relacionados a esta via em espécies selvagens do gênero Solanum Seção Lycopersicon. O
desenvolvimento de protocolos de PCR (reação em cadeia da polimerase) e a síntese de
oligonucleotídeos capazes de permitir amplificação de forma específica de fragmentos e/ou
genes codificadores de enzimas chave da via biossintética dos carotenóides tais como fitoeno
sintase, licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase é fundamental para tais estudos. Para
converter estes amplicons em potenciais marcadores moleculares, é necessário que estes
fragmentos sejam capazes de revelar variações alélicas nos diversos acessos. Estas diferenças
podem ser originadas por diferenças no tamanho do fragmento devido a eventos de inserção
e/ou deleção (INDels) ou mesmo por simples alterações nos nucleotídeos (“single nucleotide
polymorphisms” – SNPs) (BROOKES, 1999).
Os SNPs representam uma das classes mais abundantes de polimorfismos em genomas
de plantas. Os SNPs podem contribuir para explorar a diversidade estrutural de seqüências
gênicas e gerar “marcadores funcionais” (VARSHNEY et al., 2005). Os marcadores
funcionais são derivados da informação obtida da análise de seqüência de “genes candidatos”
(ANDERSEN & LÜBBERSTEDT, 2003). Entre os principais grupos de “genes candidatos”
estão aqueles componentes de famílias gênicas que contêm função conhecida e domínios
estruturais conservados e aqueles que codificam enzimas de vias biossintéticas (ANDERSEN
& LÜBBERSTEDT, 2003). “Marcadores funcionais” do tipo SNPs têm sido amplamente
utilizados para mapear regiões genômicas de interesse bioquímico ou agronômico em
programas de melhoramento genético (RAVEL et al., 2007).
Neste contexto, esta estratégia mostra-se extremamente adequada para os genes
estruturais da via biossintética dos carotenóides, cujos polimorfismos têm sido detectados em
associação com “macromutações” (TANKSLEY, 1993) tais como: coloração e/ou teor de
pigmentos carotenóides em diferentes tecidos vegetais. Vários estudos vêm tentando
50
correlacionar às reações mediadas por estas enzimas a fenótipos apresentados por diversas
espécies de frutos e hortaliças tais como Capsicum (HUH et al., 2002; THORUP et al., 2000),
melancia (BANG et al., 2007), cenoura (JUST et al., 2007) e milho (HARJES et al., 2008) .
Usando a informação disponível no extenso e sempre crescente banco de seqüências
pertencentes a genes codificadores de enzimas da via de síntese de carotenóides é possível
desenhar oligonucleotídeos iniciadores e padronizar protocolos para PCR (reação em cadeia
pela polimerase) para a detecção específica de SNPs ou INDELs dentro dos genes
codificadores de enzimas desta via. Estes SNPs podem ser prontamente convertidos em
marcadores moleculares, auxiliando em programas de melhoramento ou em estratégias
transgênicas (JUST et al., 2007). O objetivo do presente capítulo foi desenhar e avaliar pares
de iniciadores específicos e desenvolver protocolos de PCR capazes de amplificar os genes
codificadores de enzimas envolvidas na biossíntese de carotenóides em espécies do gênero
Solanum (Seção Lycopersicon).
51
3.1. Materiais e Métodos.
3.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
O presente estudo utilizou vários acessos das espécies do genêro Solanum seção
Lycopersicon, compreendendo espécies selvagens com frutos de cor verde (S. chmielewskii, S.
habrochaites, S. chilense, S. peruvianum, S. neorickii e S. pennellii), amarela (S.
pimpinellifolium amarelo, S. galapagense e S. cheesmaniae) e vermelha (S. lycopersicum
'Santa Clara', S. lycopersicum e S. pimpinellifolium). Os tomates foram cultivados em casa de
vegetação, sob controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando entre
21oC e 30oC e temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada iluminação
complementar. As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com solo
esterilizado, no Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira
de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).
3.1.2. Purificação do DNA genômico.
A purificação de DNA de espécies selvagens e cultivadas de tomate, utilizados neste
estudo, foi feita usando o método CTAB seguindo o protocolo padrão de DOYLE & DOYLE
(1990) com algumas adaptações implementadas por BOITEUX et al. (1999). Um grama de pó
fino, obtidos da maceração da folha em N2 (líquido), foi transferido para um microtubo com
600 µL de tampão CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) [2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl
100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)] aquecido a 65º C em banho-
maria por dez minutos, ficando em seguida à temperatura ambiente por cinco minutos. O
CTAB solubiliza as membranas, formando um complexo com o DNA que facilita sua
posterior precipitação (WEISING et al., 1995). Ao microtubo foram acrescentados 600 µL de
clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1 v/v), procedendo-se à agitação num vortex e
centrifugação (12.000 rpm por cinco minutos). O sobrenadante (aproximadamente 550 µL)
foi coletado e o DNA precipitado pela adição de 300 µL de isopropanol gelado e
centrifugação (12.000 rpm por 13 minutos). Após este passo o sobrenadante foi descartado e o
DNA aderido ao fundo do tubo foi lavado com etanol 70% para remoção de restos de
isopropanol e de sais. Os microtubos foram colocados por 10 min em estufa a 37°C. O DNA
foi dissolvido em 100 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e incubado por 24
horas a 4°C.
52
3.1.3. Estimativa da concentração de DNA purificado.
A concentração e a qualidade do DNA purificado foram estimadas em gel de agarose
1% (p/v) através da comparação com um marcador de quantidade contendo DNA do fago l
(lambda) na concentração de 10 ng/mL. Após a quantificação e a verificação que o DNA
estava intacto (sem degradação), todos os materiais foram diluídos para a concentração final
de 20 ng/µL em Tris 0,01M.
3.1.4. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA.
3.1.4.1. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA para o gene da
enzima licopeno β-ciclase.
A seqüência alvo para a síntese dos iniciadores foram duas regiões conservadas
identificadas no gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase. Um banco de dados foi
organizado contendo os genes e/ou segmentos gênicos já descritos para licopeno β-ciclase
específica de cromoplasto de S. lycopersicum (GenBank AF254793 e X86452). Estes genes
foram alinhados utilizando o método Clustal W, disponível no programa Megalign
(Lasergene, Madison, WI), com as condições: gap penalty e gap length penalty = 10. Um
consenso foi construído utilizando o programa SeqMan (Lasergene, Madison, WI). Os
iniciadores de síntese foram desenhados a partir deste consenso utilizando o programa
PrimerSelect (Lasergene, Madison, WI), nas condições ótimas (dímeros de no máximo 2 pb,
distantes 8 bases da região terminal 3´).
O iniciador senso “1” (5’-TAGCACCCACATCAAAGCCAGAGT-3’) hibridiza na
posição 170 a 193 da seqüência AF254793. O iniciador anti-senso “1R” (5’-
CCGAAAAGACACACAAGCTGAGTAAA-3’) hibridiza na posição 1380 a 1403 da
seqüência AF254793. Este par de iniciadores permite amplificar um fragmento de
aproximadamente 1233 pb. Várias temperaturas próximas à temperatura teórica de
anelamento (Tm) foram avaliadas, tendo como objetivo obter fragmentos gênicos
amplificados de tamanho o mais próximo possível do gene codificador da enzima licopeno-β-
ciclase completo, depositado no GenBank.
53
3.1.4.2. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA para o gene da
enzima licopeno ε-ciclase.
Para o gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase, os procedimentos para desenho
e síntese dos iniciadores de síntese foram os mesmos descritos acima, utilizando as
informações do gene licopeno ε-ciclase de S. lycopersicum (GenBank Y14387). Dois
iniciadores foram desenhados: o iniciador senso Tom-1 (5’-ATTTGACCCGAGCCTGATG -
3’) localizado na posição 827 a 845 e o iniciador anti-senso Tom-1R (5’-
GACCGCGATTTCTGTTATGA-3’) localizado na posição 1639 a 1658 do gene da ε-ciclase
(GenBank Y14387). Desta forma, um fragmento gênico de 831pb era o produto previsto da
amplificação utilizando este par de iniciadores.
3.1.4.3. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA para o gene da
enzima fitoeno sintase.
Para o gene da enzima fitoeno sintase, foram desenhados e avaliados três pares de
iniciadores a partir de um consenso obtido do alinhamento das seqüências do gene da fitoeno
sintase PSY-2, isolada de folhas de S. lycopersicum (GenBank L23424, BARTLEY &
SCOLNIK, 1993) e do gene PSY-1, isolado de frutos de S. lycopersicum (GenBank M84744,
BARTLEY et al., 1992).
Os códigos usados para os iniciadores e suas respectivas seqüências são:
PSY-1 tom-1 = (5’- AGTTGGTTTGCCTGTCTGTGG-3’);
PSY-1 tom 1R = (5’- GCTGCCTGCCTCAAAACC-3’);
PSY-1 tom-2 = (5’- TGCCTTGTTATGGGTTGTTTCTC-3’);
PSY-1 tom-2R = (5’- CTGCCTGTGCTAATTCATCTTG-3’);
PSY-1 tom 3 = (5’- AGAGTGGCCATTGTTGAAAGAGA-3’);
PSY-1 tom3R = (5’- TCCTTTCTCTGCCTCATCAAAGA-3’).
Para cada par de iniciadores são previstos três amplicons de 457pb, 914pb e 1311pb,
respectivamente. Os demais procedimentos para desenho e síntese dos iniciadores de síntese
foram os mesmos descritos acima.
3.1.4.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).
A PCR foi realizada nos termocicladores PCR System 9700 (Applied Biosystems Co.)
e Mastercycler gradient (Eppendorf). Os reagentes usados na mistura de 25 µL continham a
solução DNA (20ng/mL), tampão PCR (1x) sem MgCl2, dNTP 0,25mM , MgCl2 2,0 mM,
54
iniciadores de síntese (0,2 mM cada) e 1U Taq DNA Polymerase, todos da Invitrogentm
LifeTechnologies. A amplificação foi realizada em três temperaturas de PCR (temperatura
ideal de anelamento t; t-20C e t+20C) para cada par de iniciadores de síntese utilizando-se de
uma máquina de gradiente de PCR [Mastercycler gradient (Eppendorf)]. As seguintes
condições foram as ideais para o gene codificadores da enzima licopeno-β-ciclase: um ciclo
inicial de desnaturação a 94oC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos repetidos com as
temperaturas de 96oC por 30 segundos, 56oC por 1 minuto e 68oC por 2 minutos, finalizando-
se com um ciclo extra de extensão a 72oC por 10 minutos. Para o gene codificador da enzima
licopeno-ε-ciclase foram adotadas as mesmas condições descritas acima. Para o gene da
enzima fitoeno sintase foram modificadas apenas as temperaturas dos ciclos de anelamento,
que foram reduzidas a 53oC. O produto amplificado pela reação de PCR foi analisado em gel
de agarose 1% (p/v), corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta.
3.1.4.5. Seqüênciamento direto dos amplicons.
O seqüênciamento dos fragmentos foi realizado em um seqüenciador ABI 3100,
utilizando o kit ABI Prism BigDye version 3.0 (Applied Biosystems). Os iniciadores de
síntese senso e anti-senso, para cada gene, foram utilizados individualmente na reação de
seqüênciamento de cada amostra a fim de obter, por meio do consenso, um fragmento de
maior tamanho possível. Para cada reação foram utilizados 40 ng de DNA quantificado em
gel de agarose e 5 pmoles dos oligonucleotídeos iniciadores de síntese.
3.1.4.6. Análise das seqüências correspondentes a segmentos dos genes das
enzimas em estudo.
A qualidade das seqüencias foi avaliada através do programa SeqMan (Lasergene,
Madison,WI) e a seqüências de baixa qualidade foram removidas (ALLEX, 1999). As
seqüências correspondentes ao fragmento gênico de cada uma das espécies estudadas foram
obtidas a partir do consenso dos fragmentos seqüenciados com os iniciadores senso e anti
senso utilizando-se o programa SeqMan (Lasergene)® DNAstar. As seqüências obtidas para os
genes codificadores da enzima licopeno-β-ciclase, licopeno-ε-ciclase e fitoeno sintase foram
submetidas ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
National Center for Biotechnology Information – NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Dentre os
fragmentos seqüenciados, todos apresentaram homologia com o gene da enzima
55
correspondente de S. lycopersicum depositadas no GenBank e que serviram de molde no
desenho dos iniciadores.
56
3.2. Resultados e Discussão.
Os frutos dos acessos de diferentes espécies do gênero Solanum (seção Lycopersicon)
apresentam uma ampla variedade de cores. A caracterização de bases moleculares associadas
com distintos mutantes de frutos de tomates com pigmentação alterada delta, Beta e old-gold-
crimson ilustra claramente a importância da regulação transcricional dos genes que codificam
enzimas da via de biossíntese de carotenóides no teor e tipos destes pigmentos em frutos de
tomate (RONEN et al 1999; 2000). No presente estudo foram obtidos fragmentos
amplificados do gene de algumas enzimas da via de biossíntese dos carotenóides de diversas
espécies selvagens de Solanum (Seção Lycopersicon).
A otimização do PCR permitiu a amplificação de um fragmento de 1219pb do gene
codificador da enzima licopeno β-ciclase (que apresenta um tamanho previsto de 1666 pb) nas
seguintes espécies: S. habrochaites ‘CNPH 421’; S. chilense ‘CNPH 410’, S. peruvianum
‘CNPH 201’, S. peruvianum ‘CNPH 402’, S. neorickii ‘CNPH 945’, S. pennellii ‘CNPH
409’, S. galapagense ‘CNPH 432’, S. cheesmaniae ‘CNPH 944’, S. pimpinellifolium ‘CNPH
796’, S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’, S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’,
S. chmielewskii ‘CNPH 1022’, S. lycopersicum ‘CNPH 1136’, S. chilense ‘CNPH 943’ e S.
lycopersicum ‘CNPH 1154’ (Figura 3.1.). As seqüências dos fragmentos obtidos
apresentaram identidade variando entre 99% a 100% entre os acessos destas espécies e o
depósito original do gene (GenBank AF254793). O quadro 3.1. mostra uma das análises
realizadas na página eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), em que a seqüência de
licopeno-β-ciclase amplificada à partir de DNA de S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’
foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn.
É interessante observar que as seqüências dos genes da neoxantina sintase de tomate e
da capsantina-capsorubina sintase de pimentão aparecem no quadro 3.1 antes mesmo do gene
codificador da segunda enzima licopeno-b-ciclase descrita na literatura (Crtl-B / dados não
apresentados). Esta observação sugere uma maior similaridade com estes dois genes, como já
anteriormente descrito por RONEN et al. (2000). Este dado também sugere que os iniciadores
desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados para a obtenção de dados de seqüência
específicos do gene da enzima licopeno-b-ciclase de cromoplastos (e não do gene Crtl-B), nas
espécies de tomate avaliadas, utilizando as condições de PCR descritas.
57
FIGURA 3.1. Amplicons correspondendo a potenciais fragmentos de genes codificadores da
enzima licopeno-β-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro e analisados em gel de
agarose [1% (p/v) corado com brometo de etídeo]. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo
‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (4) S.
neorickii ‘CNPH 945’; (5) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (6) S. lycopersicum ‘Santa Clara
CNPH 1496’; (7) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (9) S.
chilense ‘CNPH 943’, (10) S. pennellii ‘CNPH 409’, (11) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’,
(12) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (13) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (14) S. chilense ‘CNPH
410’.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1219pb
58
QUADRO 3.1. Identidade do fragmento de licopeno-β-ciclase amplificado de DNA de
Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ com a seqüência alvo de licopeno-beta-
ciclase. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi submetida ao banco de dados do
GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Acesso Descrição da
seqüência alvo
Pontuação
máxima
Pontuação
Total
% de
alinhamento
Valor de
expectativa
(E-value)
Identidade
máxima
AF254793.1 Lycopersicon esculentum chromoplast-specific lycopene beta-cyclase mRNA, complete cds
2302 2302 100% 0.0 100%
Y18297.1 Lycopersicum esculentum mRNA for neoxanthin synthase
2290 2290 100% 0.0 99%
AJ272136.1 Solanum tuberosum mRNA for neoxanthin synthase (nxs gene)
2097 2097 100% 0.0 97%
X76165.1 C. annuum mRNA for capsanthin/capsorubin synthase
1711 1711 99% 0.0 91%
A seqüência parcial do fragmento obtido para o gene codificador da enzima licopeno-
ε-ciclase nas espécies em estudo foi também obtida via PCR utilizando iniciadores
desenhados a partir de seqüências do gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase do
tomateiro cultivado S. lycopersicum (GenBank Y14387), que possui um tamanho aproximado
de 1697 pb (RONEN et al., 1999). Após a otimização do PCR para a amplificação dos genes
codificadores da enzima licopeno-ε-ciclase, foram obtidos amplicons de 831 pb para acessos
das espécies S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; S. chilense
‘CNPH 943’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; S.
galapagense ‘CNPH 432’; S. peruvianum ‘CNPH 1277’; S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; S.
chilense ‘CNPH 410’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. peruvianum ‘CNPH 402’; S. cheesmaniae
‘CNPH 944’ e S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ (Figura 3.2.). Os resultados
também demonstraram a especificidade do par de iniciadores para licopeno-ε-ciclase, uma vez
que nenhum outro produto foi obtido por PCR nas condições experimentais utilizadas e que a
seqüência obtida deste amplicon único foi o de licopeno-ε-ciclase.
As seqüências dos fragmentos amplificados correspondentes ao gene codificador da
enzima licopeno-ε-ciclase apresentaram identidade variando de 91% a 93% entre os acessos
testados e o depósito original do gene que codifica a enzima licopeno ε-ciclase (GenBank
Y14387). O quadro 3.2. mostra uma das análises realizada na página eletrônica do NCBI
59
(www.ncbi.nlm.nih.gov), em que a seqüência objeto de licopeno-ε-ciclase amplificada à partir
de DNA de S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ foi submetida ao banco de dados do
GenBank pelo programa BLASTn e apresentou elevada homologia com o gene da ε-ciclase
(GenBank Y14387). Um dos genes observados com elevada identidade é o de café (Coffea
canephora) (quadro 3.2.). Este dado está de acordo com um estudo comparativo do
repertório gênico de tomate e café que mostrou que o genoma destas duas espécies apresenta
elevada similaridade em vários genes expressos em fruto e na semente (CHENWEI et al.,
2005).
FIGURA 3.2. Amplicons obtidos correspondendo a fragmentos da seqüência do gene
codificador da enzima licopeno-ε-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro (Seção
Lycopersicon) e analisados em gel (agarose 1% corado com brometo de etídeo). (1) Solanum
chmielewskii ‘CNPH 1022’; (2) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (3) S. chilense ‘CNPH 943’;
(4) S. pennellii ‘CNPH 409’; (5) S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (6) S.
galapagense ‘CNPH 432’; (7) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH
1154; (9) S. chilense ‘CNPH 410’; (10) S. neorickii ‘CNPH 945’; (11) S. peruvianum ‘CNPH
944’ e (12) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
831pb
60
QUADRO 3.2. Identidade do fragmento de licopeno-ε-ciclase amplificado de DNA de
Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência
objeto foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página
eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Acesso Descrição da
seqüência alvo
Pontuação
máxima
Pontuação
Total
% de
alinhamento
Valor de
expectativa
(E-value)
Identidade
máxima
Y14387.1 Lycopersicon esculentum mRNA for lycopene epsilon-cyclase
1122 1122 100% 0.0 93%
AF321537.1 Solanum tuberosum lycopene epsilon-cyclase mRNA, partial cds
680 680 64% 0.0 92%
DQ357178.1 Coffea canephora lycopene epsilon cyclase mRNA, partial CDs
287 287 66% 5e-74 77%
Para a obtenção da amplificação do gene da enzima fitoeno sintase foi empregado um
protocolo de PCR utilizando três pares de iniciadores (PSY-1 tom-1; PSY-1 tom-1R // PSY-1
tom-2; PSY-1 tom-2R // PSY-1 tom-3; PSY-1 tom-3R) desenhados a partir de um consenso
obtido do alinhamento das seqüências do gene da fitoeno sintase PSY-2 (expressa em folhas) e
do gene PSY-1 (expresso em frutos de S. lycopersicum). Foram obtidos três amplicons de
tamanho esperado (457pb, 914pb e 1311pb) utilizando estes pares de iniciadores,
respectivamente. Estes três amplicons foram obtidos nos acessos S. pimpinellifolium amarelo
‘CNPH 1037’; S. galapagense ‘CNPH 432’; S. peruvianum ‘CNPH 1277’; S. lycopersicum
‘CNPH 1154’; S. chilense ‘CNPH 410’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. cheesmaniae ‘CNPH
944’; S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; S.
lycopersicum ‘CNPH 1136’; S. chilense ‘CNPH 943’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S.
pimpinellifolium ‘CNPH 796’; S. peruvianum ‘CNPH 402’; S. habrochaites ‘CNPH 421’ e S.
peruvianum ‘CNPH 201’ (Figuras 3.3., 3.4. e 3.5.). As seqüências dos amplicons obtidos do
acesso S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ confirmaram a identidade do fragmento
com o gene depositado no GenBank. Foram observadas identidades de 90% para o amplicom
obtido com PSY-1 Tom-1, 90% para o amplicom obtido com PSY-1 Tom-2 e 95% para o
amplicom obtido com PSY-1 Tom-3 (Quadros 3.3., 3.4. e 3.5., respectivamente).
61
FIGURA 3.3. Resultado da amplificação do fragmento gênico da fitoeno sintase utilizando o
o par de iniciadores PSY-1 tom-1 e PSY-1 tom 1R. Amplicons foram nalisados em gel de
agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH
1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum
‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae
‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH
1022’; (10) S. chmielewskii ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii
‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S.
habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH 201’.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
457pb
62
QUADRO 3.3. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Acesso Descrição da
seqüência alvo
Pontuação
máxima
Pontuação
Total
% de
alinhamento
Valor de
expectativa
(E-value)
Identidade
máxima
EF157836.1 Solanum lycopersicum var. cerasiforme phytoene synthase (Psy1) mRNA, complete cds
558 558 57% 9e-156 90%
EF157835.1 Solanum lycopersicum phytoene synthase (Psy1) gene, complete cds
558 558 57% 9e-156 90%
EF157834.1 Solanum lycopersicum var. cerasiforme phytoene synthase (Psy1) gene, complete cds
558 558 57% 9e-156 90%
63
FIGURA 3.4. Amplicons correspondentes a fragmentos gênicos codificadores da enzima
fitoeno sintase sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-2 e PSY-1 tom-2R.
Amplicons foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1)
Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S.
peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’;
(6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa
Clara CNPH1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’;
(11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH
796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S.
peruvianum ‘CNPH 201’.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
914pb
64
QUADRO 3.4. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Acesso Descrição da
seqüência alvo
Pontuação
máxima
Pontuação
Total
% de
alinhamento
Valor de
expectativa
(E-value)
Identidade
máxima
EF157835.1 Solanum lycopersicum
phytoene synthase (Psy1)
gene, complete cds
348 348 81% 9e-93 90%
EF157834.1 Solanum lycopersicum var.
cerasiforme phytoene
synthase (Psy1) gene,
complete cds
348 348 81% 9e-93 90%
X60441.1 L.esculentum GTom5 gene
for phytoene synthase
316 316 81% 3e-83 88%
65
FIGURA 3.5. Amplicons correspondendo a fragmentos gênicos codificadores da enzima
fitoeno sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-3 e PSY-1 tom-3R. Amplicons
foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum
pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum
‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii
‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’;
(9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense
‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S.
peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH
201’.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1311pb
66
QUADRO 3.5. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum
lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi
submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do
NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Acesso Descrição da
seqüência alvo
Pontuação
máxima
Pontuação
Total
% de
alinhamento
Valor de
expectativa
(E value)
Identidade
máxima
EF157835.1 Solanum lycopersicum
phytoene synthase (Psy1)
gene, complete cds
261 261 71% 8e-67 95%
EF157834.1 Solanum lycopersicum
var. cerasiforme phytoene
synthase (Psy1) gene,
complete cds
261 261 71% 8e-67 95%
X60441.1 L.esculentum GTom5
gene for phytoene
synthase
235 235 71% 5e-59 93%
Desta forma, os iniciadores de PCR desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados
para amplificação e seqüênciamento dos genes que codificam fitoeno sintase, licopeno b-
ciclase e licopeno e-ciclase na maioria dos acessos de Solanum seção Lycopersicon. A
presença de variações genéticas naturais identificadas após a análise da seqüência destes
fragmentos gênicos pode contribuir para explorar a diversidade destes genes em estudos
taxonômicos de tomate. Estas seqüências podem ainda facilitar a obtenção via PCR de
fragmentos maiores (ou mesmo o gene completo) combinando os iniciadores de síntese já
utilizados e outros iniciadores em regiões conservadas ou nos promotores. Os polimorfismos
encontrados poderão ser utilizados para o desenho de marcadores do tipo CAPS (Cleaved
Amplified Polymorphic Sequences) (KONIECZNY & AUSUBEL, 1993) ou dCAPS
(Michaels & Amasino, 1998) para uso em programas de melhoramento de tomate. Os
iniciadores podem ainda ser utilizados em análises que combinem a expressão dos genes da
via biossintética de carotenóides em acessos com diferentes teores e tipos de carotenóides
com o objetivo de encontrar genes candidatos que expliquem a vasta gama de pigmentos
presentes em frutos de tomate cultivado e selvagens.
67
3.3. Conclusões.
A padronização de um protocolo para PCR com oligonucleotídeos iniciadores
específicos para os genes que codificam as enzimas fitoeno sintase, licopeno β-ciclase e
licopeno ε-ciclase foi satisfatória. Estes protocolos permitiram a obtenção de amplicons de
tamanho esperado e com identidade de seqüência com o conjunto de genes correspondentes
aos codificadores destas enzimas da via biossintética de carotenóides depositados no
GenBank. A disponibilidade destes oligonucleotídeos iniciadores possibilita a caracterização,
via seqüenciamento, de polimorfismos do tipo INDELs ou de SNPs em espécies de tomates
cultivados e selvagens [Solanum (Seção Lycopersicon)]. Tais polimorfismos podem ser
convertidos em marcadores moleculares, podendo ser utilizados em sistemas de seleção
assistida visando o melhoramento para maior teor e diversidade de carotenóides em frutos do
tomateiro.
68
Capítulo 04
Caracterização parcial do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase: Detecção de
polimorfismos e análise filogenética em acessos de diferentes espécies do gênero Solanum
(seção Lycopersicon).
4.0. Introdução.
Além de sua importância econômica e nutricional, o tomateiro [Solanum lycopersicum
L. (Seção Lycopersicon)] se destaca como uma espécie modelo para estudos de genética e
genômica da acumulação de carotenóides, apresentando diversos mutantes para teor e tipos
destes pigmentos em diferentes tecidos (RONEN et al., 1999; 2000). Alguns destes mutantes
têm sido caracterizados em acessos de espécies semi-domesticadas e selvagens. Além disso,
as espécies classificadas dentro da seção Lycopersicon apresentam uma grande variabilidade
de cores dos frutos (ex. Figuras 2.3. e 4.1.). Esta diversidade em cores, em combinação com
outros caracteres morfológicos, tem sido utilizada como um dos principais critérios na
taxonomia de Solanum (seção Lycopersicon).
S. pimpinellifolum S. cheesmaniae S. parviflorum
S. peruvianum S. pennellii
FIGURA 4.1. Variabilidade das cores de algumas espécies de tomate maduro do gênero
Solanum [Secção Lycopersicon]. Fonte: Enciclopedia.us.es. & acervo Charles Rick Center.
69
Mais recentemente, novas características taxonômicas têm sido utilizadas em
inferências filogenéticas dentro de espécies de Solanum (seção Lycopersicon), incluindo
marcadores moleculares e dados de seqüências gênicas (PERALTA & SPOONER, 2001).
Este conjunto de dados moleculares permitiu que posicionamentos taxonômicos
aparentemente consolidados dentro de grupo fossem reavaliados (OLMSTEAD & PALMER,
1992; SPOONER et al., 1993; OLMSTEAD & PALMER, 1997; BOHS & OLMSTEAD,
1997; 1999; OLMSTEAD et al., 1999). PERALTA el al. (2001) conduziram um análise
taxonômica de acessos de espécies pertencentes ao antigo gênero Lycopersicon e as
reclassificaram dentro do gênero Solanum L. seção Lycopersicon [Mill.] Wettst. Subseção
Lycopersicon (PERALTA & SPOONER, 2005). Dados de seqüência do gene GBSSI,
utilizados por PERALTA & SPOONER (2001), permitiram esclarecer a relação filogenética
entre cinco das nove espécies. A espécie L. peruvianum, que apresentava a mais ampla
distribuição geográfica e a maior diversidade fenotípica, foi separada em dois grupos de
acordo com marcos geográficos, sendo um grupo do norte do Peru e outro grupo do sul do
Peru. De fato, RICK (1986) já havia reconhecido três grupos de L. peruvianum no norte do
Peru e um quarto grupo na região central-sul do Peru e norte do Chile. Foram também
identificadas barreiras de cruzamento entre os acessos de L. peruvianum do norte e os do sul
do Peru. Estes resultados também foram validados por dados com marcadores moleculares do
tipo nRLFP (MILLER & TANKSLEY, 1990). Mais recentemente, o complexo L. peruvianum
(L.) Miller foi sub-dividido em quatro espécies, sendo mantida a própria L. peruvianum (= S.
peruvianum) e adicionadas três novas espécies: Solanum corneliomuelleri Macbr = L.
glandulosum Mull. (com distribuição geográfica nas regiões sul e central do Peru); Solanum
arcanum Peralta e Solanum huaylasense Peralta (espécies endêmicas do norte do Peru)
(PERALTA & SPOONER 2005).
Genes nucleares de cópia única e/ou poucas cópias são de grande interesse em estudos
moleculares, uma vez que são potencialmente mais informativos para comparações entre
espécies taxonomicamente próximas (FRASER & BRAMLEY, 2004). Um exemplo do
emprego deste tipo de gene em estudos filogenéticos é o gene nuclear estrutural GBSSI ou
waxy que, em algumas espécies, apresenta cópia única e, em outras, poucas cópias (MASON
& KELLOGG, 1996; 1998; MILLER et al., 1999; WHITSON & MANOS, 1999; PERALTA
& SPOONER, 2005). A cor no fruto do tomate cultivado está diretamente relacionada ao
balanço dos pigmentos carotenóides tais como licopeno, luteína e β-caroteno e,
conseqüentemente, relacionado à funcionalidade da enzima licopeno-b-ciclase. Desta forma,
o gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase pode se constituir em uma excelente
70
ferramenta para a análise filogenética deste grupo taxonômico. Duas enzimas licopeno-β-
ciclase foram isoladas em tomate, uma delas tem expressão específica em cromoplastos de
flores e frutos. Os genes que codificam tais enzimas são de cópia única, não apresentam
introns e suas seqüências de aminoácidos são 53% idênticas (PECKER et al., 1996; RONEN
et al., 2000).
Neste contexto, uma hipótese a ser avaliada é que dados da seqüência dos genes
codificadores da enzima licopeno-β-ciclase dentro de Solanum seção Lycopersicon podem
funcionar como ferramentas adicionais em análises filogenéticas. Além disso, esta análise de
sequencia pode permitir a identificação de variações genéticas naturais entre as distintas
espécies. A identificação de variações do tipo SNPs (“single nucleotide polymorphisms”) ou
INDELs em alelos destes genes pode contribuir para gerar potenciais “marcadores funcionais”
associados com a acumulação de diferentes teores e tipos de carotenóides. Esta estratégia tem
sido eficaz especialmente em vias biossintéticas bem caracterizadas com enzimas codificadas
por classes de genes apresentando domínios conservados (ANDERSEN & LÜBBERSTEDT,
2003), como é o caso da via biossintética dos carotenóides.
Em tomate, a via biossintética dos carotenóides apresenta uma coleção já caracterizada
de “macromutantes” fenotípicos (TANKSLEY, 1993) associados a frutos com distintos teores
de pigmentos carotenóides e/ou colorações em diferentes tecidos, incluindo frutos e flores
(RONEN et al., 2000). As enzimas licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase são codificadas por
genes (de cópia única) já clonados e caracterizados (CUNNINGHAM et al., 1994;
HUGUENEY et al., 1995; SCOLNIK & BARTLEY, 1995; PECKER et al., 1996). No
entanto, ainda não está disponível um catálogo com as sequencias dos genes codificadores das
principais enzimas da via nas diferentes espécies, incluindo o gene codificador da enzima
licopeno-β-ciclase. O objetivo do presente capítulo foi avaliar a utilidade da análise de
seqüência do gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase em revelar polimorfismos entre
acessos dentro do gênero Solanum [Seção Lycopersicon] e de seu emprego com um critério
adicional na taxonomia deste grupamento taxonômico.
71
4.1 Materiais e Métodos.
4.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).
Foram utilizados os seguintes acessos das espécies do gênero Solanum seção
Lycopersicon: S. habrochaites ‘CNPH 421’; S. chilense ‘CNPH 410’; S. peruvianum ‘CNPH
1277’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S. galapagense ‘CNPH 432’; S.
cheesmaniae ‘CNPH 944’; S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; S. pimpinellifolium amarelo
‘CNPH 1037’ e S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Os tomates foram cultivados em
casa de vegetação, sob controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando
entre 21oC e 30oC e temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada
iluminação complementar. As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com
solo esterilizado, no Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças (CNPH) da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).
4.1.2. Purificação de DNA Genômico.
A purificação de DNA de folhas de espécies selvagens e cultivadas de tomate foi feita
usando o método CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) seguindo o protocolo padrão de
DOYLE & DOYLE (1990) com algumas adaptações implementadas por BOITEUX et al.
(1999). O protocolo de purificação do DNA é descrito no capítulo 03.
4.1.3. Estimativa da Concentração do DNA Genômico.
A concentração do DNA purificado foi estimada em gel de agarose 1% (p/v) a partir
de uma solução do marcador de quantidade contendo o fago l (lambda) na concentração de
10ng/mL. Todos os materiais foram diluídos para a concentração final de 20 ng/µL em TE
(Tris 0,01M; EDTA 0,001M; pH 7,0).
4.1.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).
A PCR foi realizada nos termocicladores PCR System 9700 (Applied Biosystems Co.)
e Mastercycler gradient (Eppendorf). Os reagentes usados na mistura de 25 µL continham, 4
µL de solução DNA (20ng/ml), 2,5µl do tampão PCR (10x) sem MgCl2, 0,25mM dNTP, 2,0
mM MgCl2, e 1U Taq DNA Polymerase, todos da Invitrogentm Life Technologies. Os
iniciadores de síntese utilizados (0,2 mM cada) foram os gerados, especificamente, para
72
amplificação de um fragmento do gene licopeno-b-ciclase e apresentaram as seguintes
seqüências:
“1” iniciador senso (5’-TAGCACCCACATCAAAGCCAGAGT-3’) e
“1R” iniciador anti-senso (5’-CCGAAAAGACACACAAGCTGAGTAAA-3’)
Os ciclos e as temperaturas da PCR foram definidos de acordo com adaptações
geradas após ensaios de otimização. Estes protocolos permitiram obter amplicons únicos e de
boa qualidade/intensidade. Foram estabelecidas as seguintes condições de reação: um ciclo
inicial de desnaturação a 94o C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos repetidos com as
temperaturas de 96oC por 30 segundos, 56oC por 1 minuto e 68oC por 2 minutos, finalizando-
se com um ciclo extra de extensão a 72oC por 10 minutos. Para análise do resultado da
amplificação, os produtos amplificados pela PCR foram analisados em gel de agarose 1%
(p/v), corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta. Os fragmentos com
aproximadamente 1200pb foram purificadas utilizando o S.N.A.P.™ Gel Purification Kit.
4.1.5. Clonagem dos Amplicons.
Após a purificação, os amplicons correspondendo a fragmentos gênicos das espécies
estudadas foi clonado no vetor pGEMT–Easy (Promega), o qual possui o gene de resistência a
ampicilina. O vetor modificado foi inserido em células de Escherichia coli (linhagem XL-
1BLUE-Clontech) por eletroporação. Foram selecionados oito clones por espécie. O DNA
plasmidial das colônias positivas foi extraído com o QIAprep Spin Miniprep Kit e cortado
com EcoR I a 37°C por 3 horas. Dos clones analisados, três que apresentaram fragmentos de
aproximadamente 1200pb de cada amostra foram seqüenciados.
4.1.6. Seqüenciamento dos fragmentos obtidos.
A purificação do DNA plasmidial dos clones acima citados foi realizada pelo método
de lise alcalina, em placas de PCR de 96 poços com uma etapa final de purificação da solução
de DNA através de passagem em placas contendo filtros de 0,45 micras (Millipore). O
seqüênciamento dos clones foi realizado em um seqüenciador ABI PRIMS 3100, utilizando o
kit ABI Prism BigDye version 3.0 chemistry da Applied Biosystems e os iniciadores de síntese
“1” senso e “1R” anti-senso, utilizados individualmente na amplificação de cada amostra, a
fim de obter, através do consenso, um fragmento de maior tamanho possível. Para cada clone
foi utilizado 400 ng de DNA e 5 pmoles dos oligonucleotídeos iniciadores.
73
4.1.7. Análise das Seqüências Correspondentes a Segmentos dos Genes
Codificadores da Enzima Licopeno-b-ciclase.
A qualidade das seqüências foi avaliada através do programa SeqMan (Lasergene,
Madison,WI) e a seqüencias de baixa qualidade foram removidas (ALLEX, 1999). As
seqüências correspondentes ao fragmento gênico de cada uma das espécies estudadas foram
obtidas a partir do consenso dos fragmentos seqüenciados com os iniciadores senso e anti
senso utilizando-se o programa SeqMan (Lasergene)® DNAstar. As seqüências obtidas para o
gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase foram submetidas ao banco de dados do
GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do National Center for Biotechnology
Information – NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Todos os clones citados acima apresentaram
identidade com o gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase específico de cromoplasto de
S. esculentum (AF254793). O alinhamento das seqüências foi realizado por meio do software
Megalign (Lasergene,Madison, WI), utilizando-se o método Clustal W com as seguintes
condições: gap penalty e gap length penalty = 10. Foi feito um alinhamento comparando as
seqüências de dez acessos de nove espécies citadas acima e outro com o S. lycopersicum (AF
254793) e acessos das seis espécies estudadas (S. neorickii, S. peruvianum, S. pennellii, S.
cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum ‘Santa Clara’).
4.1.8. Análise do Gene waxy.
A análise do gene waxy foi conduzida para confirmar o status taxonômico dos acessos
utilizados no presente estudo. Os resultados apresentados com o gene waxy nos estudos de
filogenética realizados por PERALTA et al. (2001) foram reproduzidos utilizando o seguinte
par de iniciadores:
“136” (5’-GATGGGCTCCAATCAAGAACTAAT-3’)
“1639” (5’-GCCATTCACAATCCCAGTTATGC-3’).
As condições de PCR foram as seguintes: ciclo inicial de 4 min a 94oC, seguido por 5
ciclos de 30’’ a 94oC / 1 min a 50oC / 1,5 min a 72oC e ainda 30 ciclos (30’’a 94oC / 1 min a
55oC /1,5 min a 72oC) e um ciclo de extensão final de 10 min a 72oC. O gene waxy foi
clonado nos materiais genéticos aqui utilizados, a fim de certificar se as espécies de tomates
estudadas eram as mesmas que foram utilizadas nos experimentos com waxy, uma vez que
iriam ser utilizadas as seqüências deste gene, disponíveis no GenBank, em alinhamento e
filograma, para comparação com os resultados obtidos com o gene licopeno-β-ciclase. Os
fragmentos gênicos obtidos do gene waxy nas espécies utilizadas neste trabalho foram
74
comparados com os já depositados no GenBank. As seqüências obtidas do gene waxy foram:
AY875630 = L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 =
L. pennellii, AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L.
peruvianum, AY875585 L. parviflorum, AY875588=L. chmielewskii e AY875582 = S.
galapagense = L. cheesmaniae. O alinhamento das seqüências também foi realizado por meio
do software Megalign (Lasergene,Madison, WI), utilizando o método Clustal W com as
seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty=10. Neste trabalho não foram
separadas S. peruvianum de Solanum arcanum e S. huaylasense (PERALTA et al., 2005), pois
as informações das seqüências não estavam disponíveis. O tamanho da seqüência utilizada no
alinhamento foi de 1500 bases.
4.1.9. Análise e Identificação dos Polimorfismos de Nucleotídeos.
Após a eliminação de seqüências de baixa qualidade através do programna SeqMan
(Lasergene, Madison, Wi) e alinhamento das seqüências por meio do programa Clustal W
(Megalign, Lasergene, Madison, WI), foram anotadas as ocorrências e as posições de cada
modificação de base.
4.1.10. Análise Filogenética.
A análise de parcimônia foi conduzida usando o programa PAUP 4.0 (Phylogenetic
Analysis Using Parsimony version 3.1, SWOFFORD, 1993), através da busca heurística. Foi
utilizado o índice de suporte bootstrap com 5000 repetições. Associações que tiveram valores
de bootstrap menores do que 50% não foram mostradas nas árvores. O grau de homoplasia foi
avaliado pelo índice de consistência. Todos os espaços (“gaps”) gerados no alinhamento
foram considerados na construção das árvores.
75
4.2. Resultados e Discussão.
Os marcadores moleculares tem sido valiosas ferramentas utilizadas para inferências
filogenéticas em diferentes grupamentos taxonômicos vegetais (SYTSMA, 1990). A
taxonomia clássica de Solanum (seção Lycopersicon) tem se baseado predominantemente na
cor do fruto, que é um fenótipo determinado pelo teor e tipo de carotenóides. As enzimas
licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase, que participam em uma etapa essencial na definição
da composição e conteúdo de β-caroteno e licopeno em frutos de tomate, são codificadas por
genes (de cópia única) que já se encontram clonados e caracterizados (CUNNINGHAM et al.,
1994; HUGUENEY et al., 1995; SCOLNIK & BARTLEY, 1995; PECKER et al., 1996). No
presente estudo, foram obtidas as seqüências parciais do gene codificador da enzima licopeno-
β-ciclase de diversas espécies selvagens de Solanum (seção Lycopersicon) com o objetivo de
avaliar possíveis relações entre cor de fruto e mutações neste gene. As seqüências
apresentaram elevados níveis de identidade com o gene original descrito por RONEN et al.
(2000) e depositado no GenBank (AF 254793), indicando que estes genes/alelos não possuem
introns, dentro do limite defindo pelo par de iniciadores empregados. As seqüências obtidas,
para os diferentes acessos de espécies selvagens são todas inéditas e serão depositadas no
GenBank. Foi feito um alinhamento (Figuras 4.2) e este alinhamento foi utilizado para as
análises de filogenia (Figura 4.3).
A análise das seqüências obtidas indicou a ausência de longas deleções/inserções
(INDELs). Foi observado um total de 63 regiões com polimorfismos de bases tomando como
referência para comparação a seqüência de licopeno-b-ciclase de S. lycopersicum depositada
no GenBank (AF 254793) (Quadro 4.1.). Os polimorfismos de bases foram detectados
predominantemente em espécies com frutos verdes (20 em S. neorickii, 21 em S. peruvianum
e 31 em S. pennellii), 3 em frutos amarelos (S. cheesmaniae) e 8 em frutos vermelhos (S.
pimpinellifolium). Nenhum polimorfismo foi observado entre a seqüência AF 254793 e aquela
obtida do acesso S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Destes 63 polimorfismos
identificados 31 foram do tipo transição, sendo 6 (T/C), 5 (C/T), 8(G/A) e 12 (A/G). 18
polimorfismos foram do tipo transversão, sendo 2 (A/C), 3 (A/T), 4 (G/T), 4 (T/A) e 5 (T/G).
Apenas 45 regiões polimórficas em um fragmento de 1500 bases foram encontradas no gene
waxy (dados não apresentados). Estas regiões polimórficas do gene waxy são
predominantemente regiões de introns (PERALTA & SPOONER, 2001), que estão ausentes
na região do gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase caracterizada neste trabalho.
Desta forma, o elevado número de polimorfismos encontrados no fragmento de licopeno-b-
76
ciclase se equipara a aquele observado em sítios não codantes ou “silenciosos”. Uma
possibilidade ainda não explorada é que estes polimorfismos estejam localizados na terceira
posição do códon de tradução da proteína, o que permitiria mutações silenciosas (SMALL e
al., 2004). Outra possibilidade é que o gene caracterizado neste trabalho, que é um gene
específico de cromoplasto, não seja essencial na síntese de carotenóides em frutos verdes, o
que permitiria então a manutenção no genoma de genes não funcionais da enzima nas
espécies com este fenótipo.
77
FIGURA 4.2. Alinhamento das seqüências do fragmento do gene codificador da enzima
licopeno-β-ciclase. O alinhamento foi obtido utilizando o método Clustal W disponível no
pacote do Lasergene com as seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty = 10. Os
polimorfismos de bases estão identificados em vermelho.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 105S. lycopersicum 'Santa Clara' T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G G A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T T G G A G C T G G 137S. peruvianum LA 0444T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. cheesmaniae LA 1036T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C T G G T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. pennellii LA 0716T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G G A T C G G G C T C A A T T C G A T G T G A T C A T T A T T G G A G C T G G 100S. neorickii LA 1716T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. pimpinellifolium LA 1342T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. lycopersicum AF 254793
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 205S. lycopersicum 'Santa Clara' C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A A G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T T T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 237S. peruvianum LA 0444C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. cheesmaniae LA 1036C C C T G C T G G G C T C A G G T T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. pennellii LA 0716C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. neorickii LA 1716C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. pimpinellifolium LA 1342C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. lycopersicum AF 254793
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A A A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 305S. lycopersicum 'Santa Clara' G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A A A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 337S. peruvianum LA 0444G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. cheesmaniae LA 1036G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A G A C T A A G T A T T 300S. pennellii LA 0716G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A G A C C A A G T A T T 300S. neorickii LA 1716G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. pimpinellifolium LA 1342G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A A A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. lycopersicum AF 254793
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 405S. lycopersicum 'Santa Clara' T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A C A G T T G T G T T G A G A A C G G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 437S. peruvianum LA 0444T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. cheesmaniae LA 1036T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A C A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. pennellii LA 0716T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. neorickii LA 1716T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. pimpinellifolium LA 1342T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. lycopersicum AF 254793
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 505S. lycopersicum 'Santa Clara' G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C C T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 537S. peruvianum LA 0444G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. cheesmaniae LA 1036G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. pennellii LA 0716G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. neorickii LA 1716G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. pimpinellifolium LA 1342G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. lycopersicum AF 254793
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 603S. lycopersicum 'Santa Clara' T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G G T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 636S. peruvianum LA 0444T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. cheesmaniae LA 1036T T T A T A G A G T A T G A C A A G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G - - - T T T A G A A G A A G T T G A T A A T C A T C C C T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 596S. pennellii LA 0716T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A - T T G C T C C A T G G G G T T T T A A T T G A A G T T G G A T A A T A T C C A T T T G A T T T G G G A T A A A A T G G T 599S. neorickii LA 1716T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. pimpinellifolium LA 1342T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. lycopersicum AF 254793
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700
G - C T T A T G G A T T G G A G G G - A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 699S. lycopersicum 'Santa Clara' G - C T T A T G G G A T T G G A G G G A T T C T C A T T T - A G G T A A T G A G C C A T A T T - - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 732S. peruvianum LA 0444G - C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 695S. cheesmaniae LA 1036G - - C T A T G G A T T G G A G G G - A T T T T C A T T T - A G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 691S. pennellii LA 0716G G C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T T A G G C A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 698S. neorickii LA 1716G - C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 695S. pimpinellifolium LA 1342G - C T T A T G G A T T G G A G G G - A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 694S. lycopersicum AF 254793
710 720 730 740 750 760 770 780 790 800
T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 795S. lycopersicum 'Santa Clara' T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T G T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 828S. peruvianum LA 0444T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 791S. cheesmaniae LA 1036T A G A A A T T T G G T T T T T C T T G G A A G A G A C T T T C T T T T G G T G A G T C G T C C T G T G T T T T T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 791S. pennellii LA 0716T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T T G G T G A G T C G T C C C T G T G T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 796S. neorickii LA 1716T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C C T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 792S. pimpinellifolium LA 1342T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 790S. lycopersicum AF 254793
810 820 830 840 850 860 870 880 890 900
T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 895S. lycopersicum 'Santa Clara' T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 928S. peruvianum LA 0444T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 891S. cheesmaniae LA 1036T T T G G G G A T C A A A G C G A G A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 891S. pennellii LA 0716T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 896S. neorickii LA 1716T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 892S. pimpinellifolium LA 1342T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 890S. lycopersicum AF 254793
910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000
G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 995S. lycopersicum 'Santa Clara' G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 1028S. peruvianum LA 0444G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 991S. cheesmaniae LA 1036G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C G G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 991S. pennellii LA 0716G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 996S. neorickii LA 1716G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 992S. pimpinellifolium LA 1342G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 990S. lycopersicum AF 254793
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100
C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1095S. lycopersicum 'Santa Clara' C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1128S. peruvianum LA 0444C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1091S. cheesmaniae LA 1036C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1091S. pennellii LA 0716C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1096S. neorickii LA 1716C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1092S. pimpinellifolium LA 1342C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1090S. lycopersicum AF 254793
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200
G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1195S. lycopersicum 'Santa Clara' G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G G 1228S. peruvianum LA 0444G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1191S. cheesmaniae LA 1036G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1191S. pennellii LA 0716G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1196S. neorickii LA 1716G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1192S. pimpinellifolium LA 1342G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1190S. lycopersicum AF 254793
1210 1220 1230 1240
T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1239S. lycopersicum 'Santa Clara' T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1272S. peruvianum LA 0444T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1235S. cheesmaniae LA 1036T G G G C A A T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1235S. pennellii LA 0716T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1240S. neorickii LA 1716T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1236S. pimpinellifolium LA 1342T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1234S. lycopersicum AF 254793
78
FIGURA 4.3. Filograma de consenso mostrando nos ramos os valores de Bootstrap (após
5000 repetições). Este filograma foi obtido através de análise de parcimônia baseada no
alinhamento realizado com Clustal W do fragmento gênico correspondente ao gene
codificador da enzima licopeno-β-ciclase específica de cromoplasto de espécies de Solanum.
O índice de consistência foi de 0,73.
S. lycopersicum AF 254793
S. pimpinellifolium LA 1342
S. cheesmaniae LA 1036
S. pennellii LA 0716
S. neorickii LA 1716
S. peruvianum LA 0444
S. lycopersicum ‘Santa Clara ’
63
64
91
58
79
QUADRO 4.1. Sessenta e três sítios de polimorfismos detectados em múltiplas análises de alinhamento de um fragmento gênico correspondente
ao gene codificador da enzima licopeno β-ciclase específico de cromoplasto de sete espécies de Solanum (Seção Lycopersicon). Os números
representam os locais de ocorrência dos polimorfismos ao longo da seqüência amplificada de 1219pb, em um ou mais acessos quando comparado
com a seqüência de referência (S. lycopersicum AF 254793). Os pontos simbolizam inserções e/ou deleções de nucleotídeos. Os polimorfismos
de bases foram identificados com as letras em vermelho, (S) indica os polimorfismos tipo transição e (V) os polimorfismos tipo transversão. Os
polimorfismos correspondendo a inserções/deleções foram identificados pelo símbolo ID.
Acessos 63 64 65 80 92 117 149 176 221 237 290 293 356 372 428 517 540 547 548 549 552 S. lycopersicum “Santa Clara” G A A C C C G C G A A T T A T G A A T G G S. peruvianum LA 0444 G G A C T C A T A G A T C G C G A A T G G S. cheesmaniae LA 1036 G A A C C C G C G G A T T A T G A A T G G S. pennellii LA 0716 T G G C C T G C G G G T C A T A A A T G . S. neorickii LA 1716 G G A T T C G C G G G C T A T G . A T G G S. pimpinellifolium LA 1342 G A A C C C G C G G A T T A T G A C A T G S. lycopersicum AF 254793 G A A C C C G C G A A T T A T G A A T G G Tipo de Polimorfismo V S S S S S S S S S S S S S S S ID V V V ID
Acessos 553 554 559 560 561 569 570 571 579 590 602 603 604 610 611 613 615 616 619 623 630 S. lycopersicum “Santa Clara” . T G A A A T A A . . C T A T G A G . C . S. peruvianum LA 0444 G T G A A A T A A . . C T G A T G A G C . S. cheesmaniae LA 1036 . T G A A A T A A . . C T A T G A G G C . S. pennellii LA 0716 . , G G A A T A C . . . C A T G A G . T . S. neorickii LA 1716 G T A A T G A T A . . C T A T G A G G C T S. pimpinellifolium LA 1342 . T G A A A T A A G G C T A T G A G G C . S. lycopersicum AF 254793 . T G A A A T A A . . C T A T G A G . C . Tipo de Polimorfismo ID ID S S V S V V V ID ID ID S S V V S S ID S ID
Acessos 631 634 648 705 716 731 736 749 750 751 752 753 756 875 818 930 1200 1202 1204 1207 1208 S. lycopersicum “Santa Clara” G T T G . . . . T G T T A T A A A T T T G S. peruvianum LA 0444 A T . A . . . . T G T G A T A A G T T T G S. cheesmaniae LA 1036 G T T A . . . . T G T T A T A A A T T T G S. pennellii LA 0716 A T T A T T T T G T G T T C G G A G G A A S. neorickii LA 1716 A C T A . . . C T G T G A T A A A T T T G S. pimpinellifolium LA 1342 G T T G . . . C T G T T A T A A A T T T G S. lycopersicum AF 254793 G T T G . . . . T G T T A T A A A T T T G Tipo de Polimorfismo S S ID S ID ID ID ID V V V V V S S S S V V V S
80
A árvore filogenética obtida com o gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase foi
similar a grupamentos obtidos com dados de morfologia (MULLER, 1940; LUCKWILL,
1943) e também empregando ferramentas moleculares, incluindo a diversidade de seqüência
do gene GBSSI (PERALTA et al., 2005). A análise de bootstrap mostrou que a árvore obtida
teve um suporte variando entre 58% (ramo entre S. peruvianum e S. neorickii) e 91% (ramo
entre S. cheesmaniae e as espécies de fruto verde). Solanum lycopersicum ‘Santa Clara’ e
acesso S. lycopersicon (AF 254793) apresentaram-se idênticos, estando separados das demais
espécies com suporte calculado através de bootstrap de 63%. A ramificação que separa S.
cheesmaniae de S. pimpinellifolium obteve um valor de bootstrap de 64%. Estes resultados
foram muito similares aos obtidos com o gene waxy (Figura 4.4).
FIGURA 4.4. Filograma obtido do alinhamento das seqüências do gene de waxy (PERALTA
& SPOONER, 2001). As seqüências do gene waxy foram obtidas no GenBank: (AY875630 =
L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 = L. pennellii,
AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L. peruvianum,
AY875585 = L. parviflorum, AY875588 = L. chmielewskii, AY875582 = S. galapagense = L.
cheesmaniae). Os números nos ramos indicam a porcentagem obtida por análise Bootstrap
com 5000 repetições.
A caracterização e isolamento de mutantes apresentando diferentes perfis de
carotenóides tem sido uma estratégia adequada para identificar mecanismos regulatórios
relacionados ao controle do acúmulo de carotenóides em cromoplastos, bem como em
sistemas não fotossintéticos (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006;
S. chilense
S. habrochaites
S. pennellii
S. pimpinellifolium (vermelho)
S. lycopersicum
S. cheesmaniae
S. neorickii
S. chimielewskii
S. peruvianum
60
65
87
86
81
HARJES et al., 2008). Estudos de identificação, clonagem e diversidade estrutural de genes
envolvidos na via metabólica dos carotenóides são inéditos para muitas destas espécies. Por
sua vez, genes relacionados com a via metabólica dos carotenóides nunca haviam sido
utilizados em análise filogenética da seção Lycopersicon, mesmo com o conhecimento da
importância taxonômica da característica coloração do fruto. Desta forma, os resultados aqui
apresentados podem ainda gerar informações úteis no esclarecimento das relações evolutivas
de tomate e outras espécies relacionadas. Um exemplo ilustrativo da utilidade de estudos
comparativos de seqüências foi descrito por NESBITT & TANKSLEY (2002) em relação ao
impacto da domesticação do tomateiro em regiões genômicas contendo fatores que controlam
tamanho do fruto. No entanto, este tipo de análise ainda necessita ser conduzida para o caráter
cor de fruto.
82
4.3. Conclusões.
A detecção de polimorfismos (de base e INDELs) em acessos de espécies de tomates
cultivados e selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon] foi obtida via comparação do
alinhamento de um fragmento do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase. Foi possível
observar um grande número de polimorfismos entre os acessos. A aplicabilidade da
caracterização desta variação genética deste gene é que esta informação pode ser
filogeneticamente informativa. A presença de bases polimórficas na região codante de um
fragmento do gene codificador da enzima licopeno-â-ciclase das espécies de frutos verdes
abre a perspectiva de avaliar novas hipóteses sobre o papel funcional deste gene, que controla
esta importante característica de qualidade nutricional dos frutos do tomateiro cultivado. Estes
polimorfismos podem permitir o desenvolvimento de marcadores moleculares capazes de
identificar a variação alélica dos genes pesquisados, podendo contribuir para o
estabelecimento de um sistema de seleção assistida.
Foi possível concluir que a utilização de genes relacionados à via metabólica dos
carotenóides na reconstrução filogenética de Solanum [seção Lycopersicon] apresentou-se
satisfatória. Este gene mostrou-se informativo e forneceu uma boa resolução além de clarear a
relação entre espécies. Foi observado um agrupamento de acordo com os relacionamentos
evolucionários, apresentando valor de “bootstrap” de 58%-91%. Além disso, esta análise
reforçou a hipótese de que as espécies S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. esculentum são
derivadas de um grupo monofilético.
83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRIANUAL – Anuário Estatístico da Agricultura Brasileira. São Paulo: FNP Consultoria
& Comércio. 435p. 2007.
AL-BABILI S. P.; HUGUENEY, P.; SCHLEDZA, M.; WELSCHA, R.; FROHNMEYER,
H.; LAULEA, O. & BEYER, P. Identification of a novel gene coding for neoxanthin
synthase from Solanum tuberosum. FEBS Letters, v. 485, p.168–172, 2000.
ALLEX, C. F. Computational Methods for Fast and Accurate DNA Fragment Assembly.
Tese (Doutorado em Ciências da Computação). University of Wisconsin, Madison, 1999.
ALMEIDA, M.L.B.; PENTEADO, M.V.C. Carotenoids and provitamin A value of some
Brazilian sweet potato cultivars (Ipomoea batatas Lam.). Rev. Farm. Bioquim., v. 28,
n.2, p.145-54, 1992.
AMBRÓSIO, C.L.B.; CAMPOS, F.A.C.S.; FARO, Z. P. Carotenóides como alternativa
contra a hipovitaminose A. Rev. Nutr., v.19, n.2, 2006.
ANDERSEN, J.R.; LÜBBERSTEDT, T. Functional markers in plants. Trends Plant Sci.,
v.8, n.11, p. 554-560, 2003.
ANVISA. Resolução nº 449, de 9 de setembro de 1999 (DOU 13/09/1999). Portaria nº 398,
de 30 de abril de 1999 (retificada para Resolução nº 18/99) – Diretrizes Básicas para
Análise e Comprovação de Propriedades Funcionais e ou Saúde Alegadas em Rotulagem
de Alimentos.
ARAB, L.; STECK, S. Lycopene and cardiovascular disease. Am. J. Clin. Nutr., v.71, n.6,
p.1691-5, 2000.
ARIAS, R.; LEE, T.; LOGENDRA, L.; JANES, H. Correlation of lycopene measured by
HPLC with the L*, a*, b* color readings of a hidroponic tomato and the relationship of
84
maturity with color and lycopene content. J. Agric. Food Chem., v. 48, p.1697-1702,
2000.
AUST, O.; SIES, H.; STAHL, W.; POLIDORI, M. C. Analysis of lipophilic antioxidants in
human serum and tissues: tocopherols and carotenoids. J. Chromatogr., v.93, n.6, p.83-
93, 2001.
BANG, H.; KIM, S.; LESKOVAR, D.; KING, S. Development of a codominant CAPS
marker for allelic selection between canary yellow and red watermelon based on SNP in
lycopene β-cyclase (LCYB) gene. Mol. Breed., v. 20, n.1, p. 63-72, 2007.
BARTLEY, G.E.; VIITANEN, P.V.; BACOT, K.O.; SCOLNIK, P.A. A tomato gene
expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosynthesis
pathway. J. Biol. Chem., v. 267, n. 8, p. 5036-5039, 1992.
BARTLEY, G. B.; SCOLNIK, P. A. cDNA cloning, expression during development, genome
mapping of PSY2, a second tomato gene encoding phytoene synthase. J. Biol. Chem., v.
268, p.25718-25721, 1993.
BARTLEY, G. E.; SCOLNIK, P. A. Plant carotenoids: Pigments for photoprotection,
attraction, and human health. Plant Cell., v.7, p. 1027-1038, 1995.
BEN-AMOTZ, A.; LEVY, Y. Bioavailability of a natural isomer mixture compared with
synthetic all trans beta-carotene in human serum. Am. J. Clin. Nutr., v.63, n.5, p.729-
734, 1996.
BHASKARACHARY, K.; RAJENDRAN, A.; THINGNGANING, L. Carotene content of
some common and less familiar foods of plant origin. Food Chem., v. 54, p.189-193,
1995.
BHATIA, P.; ASHWATH, N.; SENARATNA, T.; MIDMORE, D. Tissue culture studies of
tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Cell Tiss. Organ Cult., v. 78, p.1-21, 2004.
85
BOHM, F.; TINKLER, J. H.; TRUSCOTT, T.G. Carotenoids protect against cell membrane
damage by the nitrogen dioxide radical. Nat. Méd., v.1, p.98-99, 1995.
BOHS, L.; OLMSTEAD, R. Solanum phylogeny inferred from chloroplast DNA sequence
data. In: NEE, M.; SYMON, D. E.; LESTER, R. N.; JESSOP, J. P. (Eds.). Solanaceae
IV: advances in biology and utilization. The Royal Botanic Gardens, Kew, Inglaterra,
p. 97-109, 1999.
BOITEUX, L.S.; FONSECA, M.E.N.; SIMON, P.W. Effects of plant tissue and DNA
purification method on randomly amplified polymorphic DNA-based genetic
fingerprinting analysis in carrot. J. Am. Soc. Hort. Sci., v.124, n.1, p.32-38, 1999.
BOTELLA-PAÍVA, P.; RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, M. Carotenoid biotechnology in
plants for nutritionally improved foods, Phys. Plant., v.126, p.369-31, 2006.
BOUVIER, F.; SUIRE, C.; MUTTERER, J.; CAMARA, B. Oxidative remodeling of
chromoplast carotenoids: identification of the carotenoid dioxygenase CsCCD and CsZCD
genes involved in crocus secondary metabolite biogenesis. Plant Cell., v. 15, p.47-62,
2003.
BRAMLEY, P. M. Is lycopene beneficial to human health? Phytochemistry, v.54, n.3, p.233-
6, 2000.
BRETO, M.P.; ASINS, M.J.; CARBONELL, E.A. Genetic variability in Lycopersicon
species and their genetic relationships. Theor. Appl. Genet., v. 86, p.113-120, 1993.
BRITTON, G. Structure and properties of carotenoids in relation to function. FASEB J., v. 9,
p.1551-1558, 1995.
BROOKES, A.J. The essence of SNPs. Gene, v. 234. 177-186. 1999.
86
CAMARGO, L. S. As Hortaliças e seu Cultivo. 3ª edição Campinas: Fundação Cargill, n. 6,
253 p., 1992.
CAMPBELL, J.K.; ENGELMANN, N.J.; LILA, M.A.; ERDMAN JR, J.W. Phytoene,
phytofluene, and lycopene from tomato powder differentially accumulate in tissues of
male Fisher 344 rats. Nutrition Res., v.27, n.12, p. 794-801, 2007.
CARVALHO, L. J. C. B.; AGOSTINI, M. A. V.; CAPDEVILLE, G.; BLOCH JR., C.
Chromoplast associated proteins from color storage root diversity in cassava (Manihot
esculenta Crantz). In: Sixth International Scientific Meet of the Cassava Biotechnology
Network, 2004, Cali. 6th International Scientific Meet of the Cassava Biotechnology
Network. Cali: Centro Internacional de Agricultura Tropical, p. 26, 2004.
CARVALHO, J.L.; PAGLIUCA, L.G. Tomate, um mercado que não pára de crescer
globalmente. Hortifruti Brasil, p.1- 9, 2007.
CARVALHO, P.G.B.; MACHADO, C.M.M.; MORETTI, C.L.; FONSECA, M.E.N.
Hortaliças como alimentos funcionais. Hort. Bras., v.24, n.4, p. 397-404, 2006.
CARVALHO, W; ARAÚJO, A.H.; GIORDANO, L.B.; BOITEUX, L.S.; SALES, M.P.;
FONSECA, M.E.N. Use of genes of the carotenoid biochemical pathway to evaluate
genetic diversity and species relationships in the genus Lycopersicon. In: PROCEEDINGS
OF THE XXXIII BRAZILIAN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY
CONGRESS, 23. Anais...Caxambu: SBBq (CD-ROM), 2004.
CARVALHO, W.; FONSECA, M. E. N.; SILVA, H. R.; BOITEUX, L. S.; GIORDANO, L.
B. Estimativa indireta de teores de licopeno em frutos de genótipos de tomateiro via
análise colorimétrica. Hort. Bras., v.23 n.3, p.819-825, 2005.
CASQUET, E. Principios de Economía Agraria. Zaragoza: Acribia, 368 p., 1998.
87
CHENWEI, L.; MUELLER, L.A.; MC CARTHY, J.; CROUZILLAT, D.; PÉTIARD, V.;
TANKSLEY, S.D. Coffee and tomato share common gene repertoires as revealed by deep
sequencing of seed and cherry transcripts Theor. Appl. Genet., v.112, p.114-130, 2005.
CHILD, A. A synopsis of Solanum subgenus Potatoe (G. Don) D’Arcy [Tuberarium (Dun.)
Bitter (s.l.)]. Feddes Repertorium, v.101, p.209–235, 1990.
CLINTON, S. K.; EMENHISER, C.; SCHWARTZ ,S. J.; BOSTWICK, D. G.; WILLIAMS,
A. W.; MOORE, B. J.; ERDMAN JR, J. W. Cis-trans lycopene isomers, carotenoids and
retinol in the human prostate. Cancer Epidemiol., v.5, p.823-33, 1996.
CLINTON, S.K. Lycopene: Chemistry, biology and implications for human health and
disease. Nutr. Rev., v.56, n.2, p.32-51, 1998.
CODY, R.B.; TAMURA, J.; FINCH, J.W.; MUSSELMAN, B.D. Mass spectrometry. J. Am.
Soc., v.5, p.194, 1994.
CONN, P.F.; SCHALCH, W.; TRUSCOTT, T.G. The singlet oxygen and carotenoid
interaction. J. Photochem. Photobiol., v. 11, p.41-47, 1991.
CRAMER D. W.; KUPER, H.; HARLOW, B.L.; TITUS-ERNSTOFF, L. Carotenoids,
antioxidants and ovarian cancer risk in pre- and postmenopausal women. Inter J. Cancer,
v. 94, p.128-134, 2001.
CUNNINGHAM , F.X.; GANTT, E. Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants.
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.49, p.557-583, 1998.
CUNNINGHAM, F.X.; GANTT, E. One ring or two? Determination of ring number in
carotenoids by lycopene epsilon-cyclases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 98, p.2905-
2910, 2001.
DEMMIG-ADAMS, B.; GILMORE, A.M.; ADAMS, W.W. In vivo functions of carotenoids
in higher plants. FASEB J., v.10, p.403–412, 1996.
88
DEMMIG-ADAMS, B.; ADAMS III, W. W. Antioxidants in photosynthesis and human
nutrition. Science, v. 298, p.2149-2153, 2002.
DI MASCIO, P.; KAISER, S.; SIES, H. Lycopene as the most efficient biological carotenoid
singlet oxygen quencher. Arch. Biochem. Biophys., v. 274, p.532-538, 1989.
DJURIC, Z.; POWELL, L.C. Antioxidant capacity of lycopene-containing foods. Int. J.
Food Sci. Nutr., v.52, p.143-9, 2001.
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v. 12, p. 13-15,
1990.
EISENREICH, W.; ROHDICH, F.; BACHER, A. Deoxyxylulose phosphate pathway to
terpenoids. Trends Plant Sci., v. 6, p.78-84, 2001.
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. A cultura do tomateiro (para a
mesa). Brasília: Embrapa - SPI, 92p. 1993.
ERDMAN JR, J. W. Variable bioavailability of carotenoids from vegetables. Am. J. Clin.
Nutr., v.70, n.2, p.179-80, 1999.
FABER, M. ; PHUNGULA, M. A. S.; VENTER, S. L, DHANSAY, M. A.; BENADÉ, A. J.
S. Home gardens focusing on the production of yellow and dark-green leafy vegetables
increase the serum retinol concentrations of 2-5-y-old children in South Africa. Am. J.
Clin. Nutr., v.76, n.5, p.1048-54, 2002.
FAO/WHO. Requirements of vitamin A, thiamine, riboflavine, and niacin. FAO Nutr Rep Ser
n. 41, WHO Tech Rep Ser n. 360. Geneva: WHO, p.1-86, 1967.
FESTER, T.; HAUSE, B.; SCHMIDT, D.; HALFMANN, K.; SCHMIDT, J.; WRAY, V.;
HAUSE, G.; STRACK, D. Occurrence and localization of apocarotenoids in arbuscular
mycorrhizal plant roots. Plant Cell Phys., v. 43, p. 256-265, 2002.
89
FONSECA, M. E. N. Isolation of cDNA Clones Coding for Enzymes of the Carotenoid
Biosynthetic Pathway in Carrot (Daucus Carota L.): Allelic Diversity and Patterns of
Expression. Tese (Doutorado Plant Breeding and Plant Genetics). University of
Wisconsin, Madison, 2000. 251 p.
FONSECA, M. E. N.; SIMON, P.W. Molecular Breeding of Vegetables for Improved
Provitamin A Carotenoid Content. In: CAKMAK, I.; WELSH, R.M. (Org.).
Encyclopedia of Life Support Systems / Impacts of Agriculture on Human Health and
Nutrition. Paris, France: UNESCO-EOLSS Publishing, p. 1-13, 2004.
FONTES, P. C. R.; SILVA, D. J. H. Produção de Tomate de Mesa. Viçosa: Aprenda Fácil,
2002. 197p.
FOOTE, C. S. Photosensitized Oxidation and Singlet Oxygen: Consequences in
Biological Systems. In: Free Radicals and Biological Systems. PRYER, W.A. (Ed.),
Academic Press, p.85-133, 1976.
FRASER, P.D.; TRUESDALE, M.R.; BIRD, C.R.; SCHUCH, W.; BRAMLEY, P.M.
Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development. Plant Phys., v. 105, p.405-413,
1994.
FRASER, P.D.; BRAMLEY, P.M. The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids. Prog.
Lipid Res., v.43, n.3, p.228-265, 2004.
GARDÊ, A.; GARDÊ, N. Culturas Hortícolas. 6a edição. Lisboa: Clássica, (Coleção Nova
Coleção Técnica Agrária), 1993. 469p.
GALPAZ, N.; RONEN, G.; KHALFA, Z.; ZAMIR, D.; HIRSCHBERG, J. A chromoplast-
specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed by cloning of the tomato white-
flower locus. Plant Cell, v.18, p.1947-1960, 2006.
GAYET, J. P.; BLEINROTH, E. W.; MATALLO, M.; GARCIA, E. E. C.; GARCIA, A. E.;
ARDITO, E.F.G.; BORDIN, M.R. Tomate para Exportação: Procedimentos de
Colheita e Pós-colheita. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma
Agrária, Secretaria do Desenvolvimento Rural, Programa de Apoio à Produção e
90
Exportação de Frutas, Hortaliças, Flores e Plantas Ornamentais – Brasília: EMBRAPA
SPI, Série Publicações Técnicas FRUPEX v.13, p. 34, 1995.
GIORDANO, L.B.; ARAGÃO, F.A.S.; BOITEUX L.S. Melhoramento genético do tomateiro.
Inf. Agrop., v.24, n. 219, p.43-57, 2003.
GIORDANO, L.B.; BOITEUX, L.S.; FONSECA, M. E.N.; MELO, P.C.T.; NASCIMENTO,
W.M . ‘San Vito’: A nova geração de híbridos de tomate ricos em elementos funcionais.
Rev. Campo Neg. HF, v. 1, n.10, p. 8 - 9, 2006.
GIOVANNUCCI, E. Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the
epidemiologic literature. J. Natl. Cancer Inst., v.91, n.4, p.317-31, 1999.
GIULIANO, G.; BARTLEY, G.E., SCOLNIK, P.A. regulation of carotenoid biosynthesis
during tomato development. Plant Cell, v.5, p. 379-387, 1993.
GIULIANO, G.; AL-BABILI, S.; VON LINTIG, J. Carotenoid oxygenases: Cleave it or leave
it. Trends Plant Sci., v. 8, p.145-149, 2003.
GRIERSON, D.; KADER, A.A. Fruit Ripening and Quality. In: ATHERTON, J.G.;
RUDICH, J. (Eds.). The Tomato Crop: A Scientific Basis for Improvement. London:
Chapman and Hall, Cap. 6, p.241-280, 1986.
HALLIWELL, B.; GUTTERDGE, J.M.C. Antioxidant Defenses. In: Free Radicals in
Biology and Medicine. 3rd ed. Oxford: Clarenton Press; p.105-245, 1999.
HAMMOND, B.R.; WOOTEN, B.R.; SNODDERLY, D.M. Density of the human crystalline
lens is related to the macular pigment carotenoids, lutein and zeaxanthin. Vision Sciences
Laboratory, College of Arts & Sciences, Arizona State University, Phoenix, EUA, 1997.
HARJES, C.E.; ROCHEFORD, T.R.; BAI, L.; BRUTNELL, T.P.; BUCKLER, E.S. Natural
genetic variation in Lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification. Science,
v.319, p. 330-333, 2008.
91
HART, D.J.; SCOTT, K.J. Development and evaluation of an HPLC method for the analysis
of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and
fruits commonly consumed in the UK. Food Chem., v. 54, n.1, p. 101-111, 1995.
HEBER, D. Colorful cancer prevention: β-carotene, lycopene, and lung cancer. Am. J. Clin.
Nutr., v.72, n.4, p.901-2, 2000.
HIRSCHBERG , J. Carotenoid biosynthesis in flowering plants. Curr. Op. Plant Biol., v. 4,
p.210-218, 2001.
HOBSON, G.E.; GRIERSON, D. Tomato. In: SEYMOUR, G.B.; TAYLOR, J.E.; TUCKER,
G.A. (Eds.). Biochemistry of Fruit Ripening. Londres: Chapman & Hall, Cap.14, p.405-
442, 1993.
HUGUENEY, P.; BADILLO, A.; CHEN, H.C.; KLEIN, A.; HIRSCHBERG, J.; CAMARA,
B.; KUNTZ, M. Metabolism of cyclic carotenoids: a model for the alteration of this
biosynthetic pathway in Capsicum annuum chromoplats. Plant J., v.8, p.417-424, 1995.
HUH, J. H.; KANG, B. C.; NAHM, S. H.; KIM, S.; HA, K. S.; LEE, M. H.; KIM, B. D. A
candidate gene approach identified phytoene synthase as the locus for mature fruit color in
red pepper (Capsicum spp.), Theor. Appl. Genet., v. 102, n.4, p.524-530, 2001.
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2003) Levantamento sistemático da
produção agrícola. Disponível em: http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/ Acesso em: 03
fev. 2004.
ISAACSON, T.; RONEN, G.; ZAMIR, D. HIRSCHBERG, J. Cloning of tangerine from
tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and
xanthophylls in plants. Plant Cell, v. 14, p.333–342, 2002.
JENKINS, J. A. The origin of the cultivated tomato. Economic Bot., v. 2, p.379-392, 1948.
92
JOHNSON, E. J.; QIN, J.; KRINSKY, N. I.; RUSSELL, R. M. Beta-carotene isomers in
human serum, breast milk and buccal mucosa cells after continuous oral doses of all-trans
and 9-cis beta-carotene. J. Nutr., v.127, p.1993-1999, 1997.
JUST, B. J.; SANTOS, C. A. F.; FONSECA, M. E. N.; BOITEUX, L. S.; OLOIZIA, B. B.;
SIMON, P.W. Carotenoid biosynthesis structural genes in carrot (Daucus carota):
isolation, sequence-characterization, single nucleotide polymorphism (SNP) markers and
genome mapping. Theor. Appl. Genet., v.114, p.693-704, 2007.
KABELKA, E.; YANG, W.; FRANCIS, D. M. Improved tomato fruit color within an inbred
backcross lines derived from Lycopersicon esculentum and L. hirsutum involves the
interaction of loci. J. Amer Soc. Hort. Sci., v. 129, p.250-257, 2004.
KHACHIK, F.; CARVALHO, L.; BERNSTEIN, P. S.; MUIR, G. J.; ZHAO, D.-Y.; KATZ,
N. B. Chemistry, distribuition, and metabolism of tomato carotenoids and their impact on
human health. Exp. Biol. Med., v. 227, n.10, p.845-851, 2002.
KONIECZNY, A., AUSUBEL, F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using
codominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J., v.4, p.403-410, 1993.
KUN, Y.; LULE, U. S.; XIAO-LIN, D. Lycopene: Its properties and relationship to human
health. Foods Rev. Inter., v.22, p.309-333, 2006.
KWOK, P-Y.; GU, Z. Single nucleotide polymorphism libraries: why and how are we
building them? Mol. Med. Today, v. 5, p.538-543, 1999.
LÁZARO, E.P.P. (2002) Metabolismo secundário. Disponível em
http://www.ciagri.usp.br/~lazaropp/FisioVegGradBio/MetSec.pdf. Acesso em: 20 dez.
2003.
LEWINSOHN, E.; SITRIT, Y.; BAR, E.; AZULAY, Y.; MEIR, A.; ZAMIR, D.; TADMOR,
Y. Carotenoid pigmentation affects the volatile composition of tomato and watermelon
93
fruits, as revealed by comparative genetic analyses. J. Agric. Food Chem., v. 53, p.3142-
3148, 2005.
LICHTENTHALER, H. K. The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid
biosynthesis in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.50, p.47-65, 1999.
LINCOLN R.E.; PORTER J.P. Inheritance of β-carotene in tomato. Genetics, v.35, p.206-
211, 1950.
LIU, Y.S.; GUR, A.; RONEN, G.; CAUSSE, M.; DAMIDAUX, R.; BURET, M.;
HIRSCHBERG, J.; ZAMIR, D. There is more to tomato fruit colour than candidate
carotenoid genes. Plant Biotech. J., v. 1, p.195-207, 2004.
LURIE, S.; HANDROS, A.; FALLIK, E.; SHAPIRA, R. Reversible inhibition of tomato fruit
gene expression at high temperature. Effects on tomato fruit ripening. Plant Phys., v.110,
n.4, p.1207-1214, 1996.
LYLE, B.J.; MARES-PERLMAN, J.A.; KLEIN, B.E.K.; KLEIN, R.; GREGER, J.L.
Antioxidant intake and risk of incident age-related nuclear cataracts in the Beaver Dam.
Eye Study, Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison,
Medical School, EUA, 1999.
LUCKWILL, L. C. The genus Lycopersicon: an historical, biological, and taxonomic survey
of the wild and cultivated tomatoes. Aberdeen University Studies, v.120, p. 1-44, 1943.
LUGASI A.; HÓVÁRI J.; BÍRÓ L.; BRANDT S.; HELYES L. Factors influencing lycopene
content of foods, and lycopene of Hungarian population. Nutr. Res., v.23, n.1035, p.44,
2003.
MACKINNEY G.; RICK, C.M.; JENKINS, J.A. Carotenoid differences in Lycopersicon:
Hybrids of an unusual race of L. pimpinellifolium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 40,
p.695-699, 1954.
94
MASON-GAMER, R. J.; KELLOGG, E.A. Potential utility of the nuclear gene waxy for plant
phylogenetic analysis. Am. J. Bot., (supplement), v.83, p.178, 1996.
MASON-GAMER, R. J.; WEIL, C. F.; KELLOGG, E.A. Granule-bound starch synthase:
structure, function, and phylogenetic utility. Mol. Biol. Evol., v.15, p.1658-1673, 1998.
MCCLEAN, P.E.; HANSON, M.R. Mitochondrial DNA sequence divergence among
Lycopersicon and related Solanum species. Genetics, v. 112, p.649–667, 1986.
MÉNDEZ FILHO, J. D., RODRÍGUEZ, H. G. R. Sobre los benefícios de los radicales libres.
Rev. Med. IMSS, v.35, n.4, p.309-13, 1997.
MICHAUD, D.S. ; FESKANICH, D.; RIMM, E.B.; COLDITZ, G.A.; SPEIZER, F.E.;
WILLETT, W. C.; GIOVANNUCCI, E. Intake of specific carotenoids and risk of lung
cancer in 2 prospective US cohorts. Am. J. Clin. Nutr., v.72, n.4, p.990-7, 2000.
MICHAELS, S.D.; AMASINO, R.M. A robust method for detecting single‐nucleotide
changes as polymorphic markers by PCR. Plant J., v.14, n.3, p.381-385, 1998.
MILLER, P. The Gardeners Dictionary, abridged 4th ed. London, UK, 1754.
MILLER, J.C.; TANKSLEY, S.D. RFLP analysis of phylogenetic relationships and genetic
variation in the genus Lycopersicon. Theor. Appl. Genet., v. 80, p.437-448, 1990.
MILLBORROW, B. V. The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plants: A
review of the present state of knowledge of ABA biosynthesis. J. Exp. Bot., v. 52,
p.1145-1164, 2001.
MINAMI K.; HAAG H. P. O Tomateiro. 2a edião. Campinas: Fundação Cargill. 397 p.,
1989.
95
MOCO, S.; BINO, R.J., VORST, O.; VERHOEVEN, H.A.; GROOT, J.; VAN BEEK, T.A.;
VERVOORT, J.; RIC DE VOS, C. H. A liquid chromatography-mass spectrometry-based
metabolome database for tomato. Plant Phys., v.141, p.1205-1218, 2006.
MONACO, L. Melhoramento do tomateiro. Boletim do Campo, n.193, p.79-85, 1964.
MONSEN, E. Dietary reference intakes for the antioxidant nutrients vitamin C, vitamin E,
selenium, and carotenoids. J. Am. Dietetic Ass., v. 100, n. 6, p. 637-640, 2000.
MONTERO, M. Los radicales libres y las defensas antioxidantes: revisión. Ann. Fac. Med.,
v. 57, n.4, p.278-81, 1996.
MULLER, C.H. A revision of the genus Lycopersicon. United States Department of
Agriculture v. 382, p. 1–28, 1940.
NAGAI, H.; SIQUEIRA, W.; LOURENCÃO, A. Tomato breeding for resistance to disease
and pests in Brazil. Acta Hort., v. 301, p. 91-98, 1992.
NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES USA. Dietary Reference intakes for vitamin A,
vitamin K, arsenic, boron, chromium, copper, iodine, iron, manganese, molybdenium,
nickel, silicon, vanadium, and zinc. Washington (DC); 2001.
NESBITT T.C.; TANKSLEY S.D. Comparative sequencing in the genus Lycopersicon:
Implications for the evolution of fruit size in the domestication of cultivated tomatoes
Genetics, v. 162, 365-379, 2002.
NGUYEN, M.L.; SCHWARTZ, S.J. Lycopene: Chemical chemical and biological properties:
Developing nutraceuticals for the new millennium. Food Tech., v. 53, p.38-45, 1999.
OLMSTEAD, R.; PALMER, J.D. A chloroplast DNA phylogeny of the Solanaceae:
subfamilial relationships and character evolution. Ann. Missouri Bot. Garden, v. 79,
n.2, p.346-360, 1992.
OLMSTEAD, R.; PALMER, J.D. Implications for the phylogeny, classification, and
biogeography of Solanum from cpDNA restriction site variation. System. Bot., v. 22, n.1,
p.19-29, 1997.
96
OLMSTEAD, R.; SWEERE, J. A.; SPANGLER, R. E.; BOHS, L.; PALMER, J.D. Phylogeny
and provisional classification of the Solanaceae based on chloroplast DNA. In: NEE, M.;
SYMON, D.E.; LESTER, R.N.; JESSOP, J.P. (Eds.). Solanaceae IV: Advances in
Biology and Utilization. The Royal Botanic Gardens, Kew, p. 111-137, 1999.
OLSON, J.A. Carotenoids. In: SHILS, M.E.; OLSON, J.A.; SHIKE, M.; ROSS, A.C. (Eds).
Modern Nutrition in Health and Disease, 9th edition. Baltimore, MD: Williams &
Wilkins, p. 525-541, 1999.
PALMER, J. D.; ZAMIR, D. Chloroplast DNA evolution and phylogenetic relationships in
Lycopersicon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.79, p.5006-5010, 1982.
PANDE, A.; PANJE, J. ASHERIE, N.; LOMAKIN, A.; OGUN, O.; KING, J.; BENEDEK,
G.B. Crystal cataracts: human genetic cataract caused by protein crystallization. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, v. 98, p. 6116-6120, 2001.
PAPAS, A. M. Diet and antioxidant status. Food Chem. Toxicol., v.37, p.999-1007, 1999.
PASSWATER, R.A. All about Antioxidants. Garden City Park, NY: Avery Publishing
Group, 1998.
PAZINATO, B.C.; GALHARDO, R.C. Processamento Artesanal do Tomate. 2ª impressão.
Campinas: Coordenadoria de Assistência Técnica Integral, 30 p., 1997.
PECKER, I.; GABBAY, R.; CUNNINGHAM, F. X.: HIRSCHBERG, J. Cloning and
characterization of the cDNA for lycopene β-cyclase from tomato reveals decrease in its
expression during fruit ripening. Plant Mol. Biol., v. 30, p.807-819, 1996.
PERALTA, I. E.; SPOONER, D. M. Classification of wild tomatoes: A review. Kurtziana, v.
28, p. 45-54, 2000.
97
PERALTA, I. E.; SPOONER, D.M. GBSSI gene phylogeny of wild tomatoes (Solanum L.
section Lycopersicon [Mill.] Wettst. Subsection Lycopersicon). Amer. J. Bot., v. 88,
p.1888-1902, 2001.
PERALTA, I. E.; KNAPP, S.; SPOONER, D.M. New species of wild tomatoes (Solanum
Section Lycopersicon: Solanaceae) from Northern Peru. System. Bot., v. 30, p.424-434,
2005.
PETERSON, D.G.; PEARSON W.R.; STACK, S. M. Characterization of the tomato
(Lycopersicon esculentum) genome using in vitro and in situ DNA reassociation.
Genome, v. 41, p.346-356, 1998.
POGSON, B.; MCDONALD, K.A.; TRUONG, M.; BRITTON, G.; DELLAPENNA, D.
Arabidopsis carotenoid mutants demonstrate that lutein is not essential for photosynthesis
in higher plants. Plant Cell, v. 8, p.1627-1639, 1996.
POOL-ZOBEL, B.L.; BUB, A.; MULLER, H.; WOLLOWSKII, I.; RECHKEMMER, G.
Consumption of vegetables reduces genetic damage in humans: First results of a human
intervention trial with carotenoid-rich foods. Carcinogenesis, v.18, n.9, p.1847-1850,
1997.
RAO, A.V.; WASEEM, Z.; AGARWAL, S. Lycopene content of tomatoes and tomato
products and their contribution to dietary lycopene. Food Res. Inter., v.31, p.737-741,
1998.
RAO, A. V.; AGARWAL, S. Role of antioxidant lycopene in câncer and heart disease. J.
Am. Coll. Nutr., v.19, n.5, p.563-9, 2000.
RAVEL, C.; PRAUD, S.; CANAGUIER, A.; DUFOUR, P.; GIANCOLA, S.;
BALFOURIER, F.; CHALHOUB, B.; BRUNEL, D.; LINOSSIER, L.; DARDEVET, M.
DNA sequence polymorphisms and their application to bread wheat quality. Euphytica,
v.158, n.3, p.331-336, 2007.
98
RICK, C. M.; BUTLER, L. Cytogenetics of the tomato. Adv. Gen., v. 8, p. 267-382, 1956.
RICK, C.M. Fruit and pedicel characteristics derived from Galapagos tomato. Econ. Bot.,
v.21, p. 171-184, 1967.
RICK, C.M. Potential Genetic Resources in Tomato Species: Clues from Observations in
Native Habitats. In: A. M. Srb (ed.), Genes, Enzymes, and Populations, p. 255-269.
Plenum, New York, USA. Columbia University Press, New York, USA. p.477-495,
1973.
RICK, C. M. Tomato (Lycopersicon). In: Tanksley, S. D.; Orton T. J. (eds.), Isozymes in
Plant Genetics and Breeding Part B, Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands.
p.147-165, 1983.
RICK, C. M.; FOBES, J. F. Allozymes of Galapagos tomatoes: polymorphism, geographic
distribution and affinities. Evolution, v. 29, p.443-457, 1975a.
RICK, C. M.; FOBES, J. F. Allozyme variation in the cultivated tomato and closely related
species. Bull. Torrey Bot. Club, v. 102, p.376-384, 1975b.
RICK, C.M. Biosystematic Studies in Lycopersicon and Closely Related Species of
Solanum. p. 667-677. In: The Biology and Taxonomy of the Solanaceae. Linnean Society
Symposium Series 7. HAWKES, J.G., LESTER, R.N.; SKELDING. A.D. (Eds). New
York: Academic Press, 1979.
RICK, C. M.; TANKSLEY, S. D. Genetic variation in Solanum pennelli: comparison with
two other sympatric tomato species. Plant System. Evol., v. 139, p.11–45, 1981.
RICK, C.M. Reproductive Isolation in the Lycopersicon peruvianum Complex. In:
D’Arcy, W.G. (ed.), Solanaceae, Biology and Systematics, 1986.
RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Assessment of the provitamin A contents of foods: the
Brazilian experience. J. Food Comp. Anal., v. 9, p.196-230, 1996.
99
RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Latin American food sources of carotenoids. Arch. Latinoam.
Nutr., v.49 (3 Suppl 1), p.74S-84S, 1999.
RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Some considerations in generating carotenoid data for food
composition tables. J. Food Comp. Anal., v.13, p.641-47, 2000.
RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. A Guide to Carotenoids Analysis in Food. Washington:
International Life Sciences Institute Press, 64p, 2001.
RODRIGUEZ-CONCEPCION, M.; BORONAT, A. Elucidation of the methylerythritol
phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic
milestone achieved through genomics. Plant Physiol., v. 130, p.1079-1089, 2002.
RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, M.; FORÉS, O.; MARTÍNEZ-GARCÍA, J. F.; GONZÁLEZ,
V.; PHILLIPS, M. A.; FERRER, A.; BORONAT, A. Distinct light-mediated pathways
regulate the biosynthesis and exchange of isoprenoid precursors during Arabidopsis
seedling development. Plant Cell, v. 16, p.144-156, 2004.
RONEN G.; COHEN, M.; ZAMIR, D.; HIRSCHBER, J. Regulation of carotenoid
biosynthesis during tomato fruit development: Expression of the gene for lycopene
epsilon-cyclase is down-regulated during ripening and is elevated in the mutant Delta.
Plant J., v. 17, p.341-351, 1999.
RONEN G.; COHEN, M.; ZAMIR, D.; HIRSCHBER, J. An alternative pathway to beta-
carotene formation in plant chromoplast discovered by map-based cloning of beta and old
gold color mutation in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 97, p.11102-11107, 2000.
ROUSSEAUX M. C.; JONES C. M.; ADAMS D.; CHETELAT R.; BENNETT A.; POWELL
A. QTL analysis of fruit antioxidants in tomato using Lycopersicon pennellii introgression
lines. Theor. Appl. Genet., v. 111, p.1396-1408, 2005.
100
SANDMANN, G.; RÖMER, S.; FRASER, P.D. Understanding carotenoid metabolism as a
necessity for genetic engineering of crop plants. Metabolic Engineering, v.8, p.291-302,
2006.
SCHAUER, N.D.; ZAMIR, D.; FERNIE, A. R. Metabolic profiling of leaves and fruit of wild
species tomato: A survey of the Solanum lycopersicum complex. J. Exp. Bot., v. 56,
p.297-307, 2005.
SCHAUER, N.; SEME Y.; ROESSNE, U.; GUR, A.; BALBO, I.; CARRARI, F.; PLEBAN,
T.; PEREZ-MELIS, A.; BRUEDIGAM, C.; KOPKA, J.; WILLMITZER, L.; ZAMIR, D.;
FERNIE, A.R. Comprehensive metabolic profiling and phenotyping of interspecific
introgression lines for tomato improvement. Nature Biotech., v. 24, p. 447-454, 2006.
SCOLNIK, P.A.; BARTLEY, G.E. Nucleotide sequence of lycopene cyclase (GenBank
L40176) from Arabidopis. Plant Phys., v.108, p.1343, 1995.
SCOTT R. P. W.; PERRY J. A. Introduction to Analytical Gas Chromatography. 2a Ed.,
Marcel Dekker, New York, 1995.
SEDDON J. M.; AJANI, U.A.; SPERDUTO, R.D.; HILLER, R.; BLAIR, N.; BURTON,
T.C.; FARBER, M.D.; GRAGOUDAS, E.S.; HALLER, J.; MILLER, D.T. Dietary
carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration. Eye
disease Case – Control Study Group. Epidemiology Unit, Massachusetts Eye and Ear
Infermary, Boston 02114, EUA, 1994.
SHAMI, N.J. I.; MOREIRA, E. A. M. Licopeno como agente antioxidante. Rev. Nutr., v. 17,
n.2, p.227-36, 2004.
SHIRAI, T.; ASAMOTO, M.; TAKAHASHI, S.; IMAIDA, K. Diet and prostate cancer.
Toxicology, v.181, n.2, p.89-94, 2002.
SIEIRO, C.; POZA, M.; DE MIGUEL, T.; VILLA, T.G. Genetic basis of microbial
carotenogenesis. Int. Microbiol., v. 6, p.11-16, 2003.
101
SIES, H.; STAHL, W. Vitamins E and C, β-carotene, and other carotenoids as antioxidants.
Am. J. Clin. Nutr., v. 62, n.6, p.1315-21, 1995.
SILVA, J.B.C.; GIORDANO, L.B. Tomate para Processamento Industrial. Brasília:
Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia – Embrapa Hortaliças, 2000.
168pp.
SIMKIN, A.J.; SCHWARTZ, S.H.; AULDRIDGE, M.; TAYLOR, M.G.; KLEE, H.J. The
tomato carotenoid cleavage dioxygenase 1 genes contribute to the formation of the flavor
volatiles beta-ionone, pseudoionone, and geranylacetone. Plant J., v. 40, p.882-892, 2004.
SIMON, P.W. Genetic Improvement of Vegetable Carotene Content. p. 291-300. In:
BILLS, D.D.; KUNG, S. (Eds.) Biotechnology and Nutrition. Butterworth-Heinemann,
Boston, Massachusetts, 1992.
SMALL, R.L.; CRONN, R.C. & WENDEL, J.F. Use of nuclear genes for phylogeny
reconstruction in plants. Aust. Syst. Bot. 17: 145-170, 2004.
SMIDT, C.R.; BURKE, D.S. Nutritional significance and measurement of carotenoids. Curr.
Topics Nutraceutical Res., v. 2, p.79-91, 2004.
SOL – International Solanaceae Genome Project – (2007) Projeto genoma internacional
Solanaceae. http://www.sgn.cornell.edu/help/about/tomato_sequencing.pl. Acesso em:
15 maio 2007.
SOMMERBURG, O.G. ; SIEMS, W.G. ; HURST, J.S. ; LEWIS, J.W. ; KLIGER, D.S. ; VAN
KUIJK, F.J. Lutein and zeaxanthin are associated with photoreceptors in the human retina,
University of Texas Medical Branch, Department of Ophtalmology & Visual Sciences
TX, Galveston 77555-1067, EUA, 1999.
SPEISKY, H.C.; JIMÉNEZ, I.T. Radicales libres y antioxidantes en la prevención de
enfermidades III: evidencias clínico epidemiológicas de los riesgos y beneficios asociados
102
al consumo de antioxidantes en la prevención de enfermidades cardiovasculares. Rev Chil
Nutr., v.27, n.3, p.314-25, 2000.
SPOONER, D.; ANDERSON, G.; JANSEN, R. Chloroplast DNA evidence for the
interrelationships of tomatoes, potatoes, and pepinos (Solanaceae). Am. J. Bot., v. 80, n.6,
p.676-688, 1993.
STAHL, W.; SIES, H. Uptake of lycopene and its geometrical isomers is greater from heat-
processed than from unprocessed tomato juice in humans. J. Nutrit., v. 122, p.2161-2166,
1992.
STAHL, W.; SCHWARZ, W.; SIES, H. Human serum concentrations of all-trans beta- and
alpha-carotene but not 9-cis beta-carotene increase upon ingestion of a natural isomer
mixture obtained from Dunaliella salina (Betatene). J. Nutr., v.123, p.847-851, 1993.
STAHL, W.; SCHWARZ, W.: VON LAAR, J.; SIES, H. All-trans beta-carotene
preferentially accumulates in human chylomicrons and very low density lipoproteins
compared with the 9-cis geometrical isomer. J. Nutr., v.125, p.2128-2133, 1995.
STAHL, W.; SIES, H. Carotenoids: Occurrence, Biochemical Activities, and
Bioavailability. In: Packer, L; Hiramatsu, M; Yoshikawa, T. Antioxidant Food
Supplements in Human Health. San Diego: Academic Press; p.183-98, 1999.
STOMMEL, J. R.; HAYNES, K.G. Inheritance of beta-carotene content in wild tomato
species Lycopersicon cheesmanii. J. Hered., v. 85, p.401-404, 1994.
SYTSMA, K. J. DNA and morphology: Inference of plant phylogeny. Trends Ecol. Evol., v.
5, p.104-110, 1990.
SWOFFORD, D.L. PAUP*, Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Related
Methods). Version 4.0. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, EUA, 1999.
103
TAKEOKA, G.R.; DAO, L.; FLESSA, S.; GILLESPIE, D.M.; JEWELL, W.T.; HUEBNER,
B.; BERTOW, D.; EBELER, S.E. Processing effects on lycopene content and antioxidant
activity of tomatoes. J. Agric. Food Chem., v. 49, n.8, p.3713-3717, 2001.
TAMAI, H.; MORINOBU, T.; MURATA, T.; MANAGO, M.; MINO, M. 9-cis β-carotene in
human plasma and blood cells after ingestion of β-carotene. Lipids, v.30, p.493-498,
1995.
TANKSLEY, S.D. Mapping polygenes. Annu. Rev. Genet., v. 27, p.205-233, 1993.
TAVARES, C.A.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Carotenoid composition of Brazilian
tomatoes and tomato products. Lebensm. Wissu. Tech., v. 27, p.219-224, 1994.
TAYLOR, I.B. Biosystematics of the Tomato. In: ATHERTON, J.G.; RUDICH, J. (Eds.).
The Tomato Crop: A Scientific Basis for Improvement, Chapman and Hall, London,
UK. p. 1-34, 1986.
THOMPSON, J.D.; HIGGINS, D.G.; GILSON, T. J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment thought sequence wighting, positions specific
gag penalties and weight matrix choice. Nuc. Acids Res., v. 22, p. 4673-4680, 1994.
THORUP, T.A.; TANYOLAC, B.; LIVINGSTONE, K.D.; POPOVSKY, S.; PARAN, I.;
JAHN, M. Candidate gene analysis of organ pigmentation loci in the Solanaceae. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, v. 97, p.11192-11197, 2000.
TIAN, L.; MUSETTI, V. K. J.; MAGALLANES-LUNDBACK, M.; DELLAPENNA, D. The
Arabidopsis LUT1 locus encodes a member of the cytochrome p450 family that is
required for carotenoid epsilon-ring hydroxylation activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
v. 101, p.402-407, 2004.
TIGCHELAAR, E.C. Tomato Breeding, p. 135-171. In: Breeding Vegetable Crops, Bassett,
M.J. (Ed.) AVI Publishing Co., Westport, Connecticut, 1986.
104
TIKUNOV, Y.; LOMMEN, A.; RIC DE VOS, C.H.; VERHOEVEN, H.A.; BINO, R.J.;
HALL, R.D.; BOVY, A.G. A novel approach for nontargeted data analysis for
metabolomics. Large-scale profiling of tomato fruit volatiles. Plant Phys., v.139, p.1125-
1137, 2005.
TOMES, M. L.; QUACKENBUSH, F.W.; MCQUISTAN, M. Modification and dominance of
the gene governing formation of higher concentrations of beta-carotene in the tomato.
Genetics, v. 39, p.810-817, 1954.
TONHI, E.; COLLINS, K.E.; JARDIM, I. C. S. F.; COLLINS, C.H. Fases estacionárias para
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) baseadas em
superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados Quím. Nova, v.25, n.4, 616-623, 2002.
TORRES, A.C.; BOITEUX, L.S.; FONSECA, M.E.N.; GIORDANO, L.B. Doce Vita: Um
híbrido de tomateiro de porte compacto com frutos alaranjados devido à acumulação de
beta-caroteno. Hort. Bras, v. 25. p. S87, 2007.
TRUMBO, P.R.; ELLWOOD, K.C. Lutein and zeaxanthin intakes and risk of age-related
macular degeneration and cataracts: an evaluation using the Food and Drug
Administration’s evidence-based review system for health claims. Am. J. Clin. Nutr., v.
84, p. 971-974, 2006.
TUCKER, G. Nutritional enhancement of plants. Curr. Opin. Biotechnol., v.14, p.1-5, 2003.
VARSHNEY, R.K.; GRANER, A.; SORRELLS, M.E. Genomics-assisted breeding for crop
improvement. Trends Plant Sci., v. 10, n.12, p. 621-630, 2005.
VAN DER HOEVEN, R.; RONNING, C.; GIOVANNONI, J.; MARTIN, G.; TANKSLEY,
S. D. Deductions about the number, organization, and evolution of genes in the tomato
genome based on analysis of a large expressed sequence tag collection and selective
genomic sequencing. Plant Cell, v.14, p.1441-1456, 2002.
105
VERDOES, J.C.; KRUBASIK, P.; SANDMANN, G.; VAN OOYEN, A.J.J. Isolation and
functional characterization of a novel type of carotenoid biosynthetic gene from
Xanthophyllomyces dendrorhous. Mol. Gen. Genet., v. 262, p.453-461, 1999.
WANG Y.; NIELSEN, R.; MUELLER, L.A.; TANKSLEY, S.D. Characteristics of the
tomato nuclear genome as determined by sequencing unmethylated EcoRI digest
fragment. Theor. Appl. Genet., v. 112, p.72-84, 2005.
WARNOCK, S.J. A review of taxonomy and phylogeny of the genus Lycopersicon.
HortScience, v. 23, p.669-673, 1988.
WEISING K.; NYBOM, H.; WOLFF, K.; MEYER, W. DNA Fingerprinting in Plants and
Fungi. CRC Press, Boca Raton, Flor. 1995.
WHITSON, M. K.; MANOS, P. Phylogenetic utility of sequence data from two regions of
nuclear DNA in clarifying sectional relationships within Physalis. Abstracts, XVI
International Botanical Congress, Saint Louis, Missouri, USA, 1999.
WIEN, H. C. The Physiology of Vegetable Crops. 2nd ed., New York: Labi Publishing,
662p. 1997.
WILBERG, V. C.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Quantificação de beta-caroteno e licopeno
em tomate e em alguns dos seus produtos por CLAE. Ciência Tecnol Alim., v.13, p.132-
141, 1993.
WILLCOX, J. K.; CATIGNANI, G. L.; LAZARUS, S. Tomatoes and cardiovascular health.
Crit. Rev. Food Sci. Nutr., v. 43, n.1, p.1-18, 2003.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Global prevalence of vitamin A deficiency
(WHO/NUT/95.3). Geneva, 1995.
WPTC-WOLD PROCESSING TOMATO COUNCIL (2004). Disponível em:
http://www.wptc.to/. Acesso em: 20 maio 2007.
106
ZAMIR, D. Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Nature Rev. Genet., v. 2,
p. 983-990, 2001.
ZHANG, Y.; STOMMEL, J.R. Development of SCARs and CAPS markers linked to the Beta
gene in tomato. Crop. Sci., v.41, p.1602-1608, 2001.