UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE BIOLOGIA...

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

Ana Heloneida de Araújo Morais

Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum

(seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta

Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima

Licopeno-β-ciclase

Brasília-DF

Dezembro, 2007

Tese de Doutoramento em Ciências Biológicas-Biologia Molecular apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de doutor pelo Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília. Orientadora: Dra Damares de Castro Monte Co-orientadora: Dra Maria Esther de Noronha Fonseca Boiteux Co-orientadora: Dra Elionor Rita Pereira de Almeida

ii

É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta tese e

emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor

reserva outros direitos de publicação e nenhuma parte desta tese de doutorado pode ser

reproduzida sem a autorização por escrito do autor.


Morais, Ana Heloneida de Araújo.

Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase/ Ana Heloneida de Araújo Morais

Brasília, 2007.

106p. : il. Tese de Doutorado. Departamento de Biologia Celular (IB),

Universidade de Brasília, Brasília. 1. Variabilidade, Carotenóides, Tomate, Alimento funcional.

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de Solanum (seção

Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase


Tese de Doutorado submetida ao Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Doutor em Ciências Biológicas – Biologia Molecular. Aprovado por: Damares de Castro Monte, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Orientadora) Patrícia Gonçalves Baptista de Carvalho, Doutora (EMBRAPA – Hortaliças) (Examinador Externo) Luiz Joaquim Castelo Branco Carvalho, Doutor-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Externo) Soraya Cristina de Macedo Leal Bertioli, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Externo) Renato de Oliveira Resende, Doutor (Universidade de Brasília) (Examinador Interno) Maria Fátima Grossi de Sá, Doutora-PhD (EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia) (Examinador Suplente) Brasília-DF, 14 Dezembro 2007

iv

“... A semente da curiosidade e do

desejo de busca já foi semeada...”

(Ana Heloneida de Araújo Morais).

v

DEDICO

A Deus, pela vida;

À minha Mãe Salete, pela minha existência;

Ao meu marido Antonio Carlos, pelo companheirismo e confiança;

À minha filha Ana Clara, por todo amor e com todo amor.

vi

AGRADECIMENTOS

À Universidade de Brasília e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-

Biologia Molecular, pela oportunidade na realização do curso;

Aos professores do programa de Pós-Graduação pelas contribuições em

conhecimentos e experiências;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa

de doutorado, concedida durante a realização deste trabalho e pelas contribuições ao curso de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas-Biologia Molecular;

A Empresa Brasileira Agropecuária (EMBRAPA) Recursos Genéticos e Biotecnologia

e EMBRAPA-Hortaliças pela doação de amostras e pela infra-estrutura concedida para o

desenvolvimento desta pesquisa;

À Dra. Maria Esther de Noronha Fonseca Boiteux, pelas contribuições inesgotáveis do

saber na pesquisa científica, pela orientação, pelo incentivo em minha carreira e amizade;

À Dra. Damares de Castro Monte, por transmitir com sua experiência, uma visão

objetiva de conhecimentos tão abstratos e singulares, pela amizade e orientação;

À Dra Elionor Rita Pereira de Almeida, por ter despertado meu interesse pela Biologia

Molecular e pelo carinho sempre;

Ao Dr. Leonardo Silva Boiteux, pelo seu entusiasmo contagiante, que tanto contribuiu

de forma especial, neste trabalho científico;

Aos técnicos e amigos do laboratório de Melhoramento Genético e Análise Genômica

da EMPRAPA- Hortaliças, pela permanente contribuição;

Aos técnicos e amigos do laboratório de nutrigenômica da EMPRAPA- Recursos

Genéticos e Biotecnologia, pelo valoroso auxílio;

Aos funcionários da EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia e Hortaliças pela

eficiência e empenho na realização de suas tarefas;

Aos Amigos de laboratório, especialmente Ana Maria, Anne Gisele, Wesley, Patrícia,

Cristiane, Juliana e Lisângela pelas contribuições diretas e indiretas na realização deste

trabalho;

As amigas Kellen, Liziane e Railene, pelo imprescindível companheirismo nos anos

longe de casa;

Aos colegas e amigos do programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-

Biologia Molecular, pela amizade e convivência;

vii

Aos Dr. Renato de Oliveira Resende e Dr. Robert Neil Gerard Miller, da banca de

qualificação, pelas contribuições e sugestões incorporadas nesta dissertação;

A toda minha família e a do meu marido, nossa família, pelo incentivo sempre;

A todos aqueles que, de uma maneira ou de outra, me estimularam nesta jornada.

viii

Sumário

RESUMO

ABSTRACT

Lista de abreviações e siglas

Lista de símbolos

Lista de ilustrações

INTRODUÇÃO

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Objetivos específicos

Capítulo 01

Revisão da Literatura

1.0- REVISÃO DA LITERATURA

1.1-Importância da Cultura de Tomate no Brasil.

1.2-Origem e Taxonomia do Gênero Lycopersicon.

1.2.1. Sistemas Taxonômicos do Gênero Lycopersicon.

1.2.2. Sistemática Molecular e a Nova Classificação do Gênero

Lycopersicon.

1.3. Principais Características das Espécies do Gênero Solanum seção

Lycopersicon.

1.4. Carotenóides Mais Comumente Encontrados em Tecidos Vegetais.

1.5. Importância dos Carotenóides na Dieta Humana.

1.6. Importância dos Carotenóides como Elementos Funcionais.

1.7. Biologia dos Carotenóides.

1.8. Identificação e Quantificação de Carotenóides em Tecidos Vegetais.

1.9. A Via Biossintética dos Carotenóides: Enzimas e Genes.

1.10. Genética, Biologia Molecular e Regulação da Biossíntese de

Carotenóides em Tomate.

1.11. Melhoramento de Tomate para Modificar Teores e Tipos de

Carotenóides.

1.12. Genômica e Seleção Assistida por Marcadores Derivados de Genes da

Via Biossintética dos Carotenóides em Tomateiro.

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1.13. Considerações Finais e Objetivos do Trabalho.

Capítulo 02

Análise bioquímica do conteúdo e composição de carotenóides em frutos

maduros de espécies silvestres e cultivadas de Solanum (seção Lycopersicon:

Solanaceae).

2.0- INTRODUÇÃO

2.1-MATERIAIS E MÉTODOS

2.1.1. Acessos de espécies de Solanum (Seção Lycopersicon).

2.1.3. Análise dos Carotenóides.

2.1.2. Extração dos Carotenóides.

2.1.4. Identificação dos Carotenóides.

2.1.5. Obtenção de Padrões Externos.

2.1.6. Determinação do Conteúdo dos Carotenóides.

2.2-RESULDADOS E DISCUSSÕES

2.3-CONCLUSÕES

Capítulo 03

Desenvolvimento de protocolos de PCR específicos para a detecção de genes

codificadores de enzimas da via biossintética de carotenóides em espécies de

Solanum (Seção Lycopersicon).

3.0-INTRODUÇÃO



3.1.2. Purificação do DNA genômico.

3.1.3. Estimativa da concentração de DNA purificado.

3.1.4. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA.

3.1.4.1. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA

para o gene da enzima licopeno β-ciclase.


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para o gene da enzima licopeno ε-ciclase.


para o gene da enzima fitoeno sintase.

3.1.4.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).

3.1.4.5. Seqüênciamento direto dos amplicons.

3.1.4.6. Análise das seqüências correspondentes a segmentos

dos genes das enzimas em estudo.

3.2-RESULDADOS E DISCUSSÕES

3.3-CONCLUSÕES

Capítulo 04

Caracterização parcial do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase:

Detecção de polimorfismos e análise filogenética em acessos de diferentes

espécies do gênero Solanum (seção Lycopersicon).

4.0-INTRODUÇÃO



4.1.2. Purificação de DNA Genômico.

4.1.3. Estimativa da Concentração do DNA Genômico.

4.1.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).

4.1.5. Clonagem dos Amplicons.

4.1.6. Seqüenciamento dos fragmentos obtidos.

4.1.7. Análise das Seqüências Correspondentes a Segmentos dos

Genes Codificadores da Enzima Licopeno-b-ciclase.

4.1.8. Análise do Gene waxy.

4.1.9. Análise e Identificação dos Polimorfismos de Nucleotídeos.

4.1.10. Análise Filogenética.

4.3-RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.4-CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO

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RESUMO

MORAIS, A. H. A. Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de

Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia Líquida de Alta Resolução

(CLAE) e Análise Filogenética do Gene Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase. Brasília,

2007. 106p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas - Biologia Molecular) - Departamento

de Biologia Celular, Instituto de Biologia (IB), Universidade de Brasília.

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) apresenta um papel de destaque na dieta

humana de diferentes etnias e regiões geográficas. Entre as estratégias para aumentar e/ou

permitir um consumo adequado de nutrientes essenciais, destacam-se a introdução de

alimentos ricos em carotenóides na dieta, além do melhoramento genético visando aumentar o

teor pró-vitamínico e de antioxidantes em culturas adaptadas para plantio e com tradição de

consumo nas regiões geográficas onde ocorrem carências nutricionais. Um dos objetivos neste

trabalho foi avaliar os tipos e o conteúdo de carotenóides visando selecionar genótipos com

melhores características nutricionais. Outro objetivo foi, baseado em informações genéticas

para genes que codificam enzimas envolvidas na via biossíntetica de carotenóides, gerar

oligonucleotídeos iniciadores (primers) universais para uso em PCR. Estes primers foram

utilizados para isolar alelos do gene que codifica a enzima licopeno β-ciclase em diferentes

acessos de tomate. Os dados obtidos destas seqüências foram avaliados para estimar as

relações filogenéticas dentro do gênero Solanum (seção Lycopersicon). Esta análise foi

comparada com estudos anteriores utilizando o gene waxy ou GGSSI (Grandule-bound starch

syntase). Esta análise foi informativa e a sua utilização forneceu uma boa resolução na

definição das espécies de tomate. Demonstrou ainda que as espécies com frutos verdes,

amarelos e vermelhos pertencem a um grupo monofilético, além de revelar a proximidade

entre as espécies de tomate com frutos com pigmentação verde. Os resultados aqui

apresentados forneceram ainda o perfil de carotenóides de tomates de coloração verde,

mostrando estas espécies como essenciais fontes de carotenóides luteína e zeaxantina. Um

carotenóide já reconhecido nutricionalmente, mas não encontrado em concentrações

significativas em tomates comerciais, o beta caroteno, foi identificado nas espécies S.

cheesmaniae, S. galapagense e S. pimpinellifolium, que possuem frutos com pigmentação

amarela. Destaca-se ainda o S. pimpinelifolium vermelho como sendo a melhor opção em

cruzamentos visando o melhoramento no conteúdo e na diversidade de carotenóides. A

geração dos oligonucleotídeos iniciadores universais, específicos para o isolamento de alelos

xii

dos genes das enzimas fitoeno sintase, licopeno ε-ciclase e licopeno β-ciclase foi satisfatória,

uma vez que foram específicos para os genes em estudo. À disponibilização do catálogo de

tipos e teores de carotenóides em um subconjunto do germoplasma destas espécies e o

desenvolvimento de ferramentas moleculares com potencial uso em sistemas de seleção

assistida cria perspectivas de aumento da eficiência do melhoramento visando o aumento do

teor e a diversidade de carotenóides em tomate.

Palavras chaves: Variabilidade, Carotenóides, Tomate, Alimento funcional.

xiii

ABSTRACT

MORAIS, A. H. A. Diversity of Antioxidants Carotenoids in Fruits of Solanum (section

Lycopersicon): Characterization Via High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and

Phylogenetic Analysis of The Lycopene-β-cyclase Gene. Brasília, 2007. 106p. Thesis (Doctor

degree in Ciências Biológicas - Biologia Molecular) - Departamento de Biologia Celular,

Instituto de Biologia (IB), Universidade de Brasília.

The cultivated tomato (Solanum lycopersicum L. Mill) plays an important role in the

human diet in distinct ethnic groups and geographical regions, being a major source of

vitamins and antioxidants. One of the most efficient strategies to increase and/or to allow the

satisfactory intake of essential nutrients is to introduce in the daily diet improved food crop

cultivars with higher nutritional/nutraceutical value. Breeding cultivars displaying regional

adaptation for higher pro-vitamin A and antioxidant contents would be an effective way of

minimizing/alleviating nutritional deficiencies in geographic areas with sub-optimum levels

of intake of these compounds. One of the main objectives of the present thesis was to evaluate

the profile and content of carotenoids in a germplasm collection of tomato and in its wild and

semi-domesticated relatives [Solanum (section Lycopersicon)]. This germplasm displayed a

wide range of fruit color varying from greenish to yellow up to deep red. The final aim of this

study is to improve diversity and content of this group of potent antioxidants in the cultivated

tomato via conventional and molecular breeding. A second objective was to isolate a sub-set

of genes coding for structural enzymes of carotenoid biosynthesis in accessions of this

germplasm and to generate a set of “universal” primers derived from the genetic information

of these genes for use in PCR assays. This approach was employed to isolate alleles of the

gene coding for the enzyme lycopene β-cyclase from the distinct accessions and the sequence

data obtained was evaluated to estimate the phylogenetic relationships of the genus Solanum

(section Lycopersicon). This analysis was informative and displayed enough resolution to

discriminate the distinct species within the genus. A monophylletic group was composed by

the green, yellow and red fruit species. A close relationship was also observed among green-

fruited species, which was in agreement with the results reported in the literature using both

classical and molecular tools. Therefore, the sequence of the lycopene β-ciclase gene could

represent an additional tool for phylogenetic analysis in the genus Solanum (section

Lycopersicon) as well as in closely related sections. The results indicated a wide range of

carotenoid types and blends in the accessions of species belonging to the genus Solanum

xiv

(section Lycopersicon). Green-fruited tomatoes accumulated lutein and zeaxanthin, two

carotenoids that are not commonly found in cultivated tomatoes. The carotenoid β-carotene

was identified in accessions of the S. cheesmaniae, S. galapagense and S. pimpinellifolium

(yellow-fruit mutant). Therefore, these species might represent important sources of gene

controlling β-carotene accumulation. However, the most diverse profiles of carotenoids were

found in accessions of S. pimpinelifolium with red fruit phenotype. These would be the

preferential sources for use in breeding programs. PCR primers were developed for universal,

gene-specific isolation of alleles of the following genes: phytoene synthase, lycopene ε-

cyclase and lycopene β-ciclase. The establishment of a catalog of content and types of

carotenoids in representative accessions of species belonging to the genus Solanum (section

Lycopersicon) and the development of molecular tools with potential utility in classical

breeding as well as in marker assisted selection systems. The isolation of new genes/alleles

from wild and semi-domesticated species related to the cultivated tomato has also a potential

scientific and technological impact allowing the identification and cloning of genes of the

carotenoid pathway able to modulate distinct blends of antioxidants carotenoids in fruits of

this important vegetable crop.

Keywords: Variability, Carotenoids, Tomato, Functional Foods.

xv

Lista de Abreviaturas e Siglas

A – adenina

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

2-D – bidimensional

BAC - Bacterial Artificial Chromosomes

B- gene Beta

b ou og- Old-gold-crimson

BLAST - basic local alignment search tool

cm - centímetro

cm2 - centímetro quadrado

A1%1cm - coeficiente de absorvidade

lmáx - comprimentos de onda máximos de absorção

CAPS - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences

cv. - cultivar

crtY ou lyc – licopeno ciclase

crtYB - licopeno β-ciclase

C - citosina

cpDNA – DNA de croloplasto

chr. - cromossomos

chrs - cromossomos

CRTISO - carotenóide isomerase

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

C40 - 40 átomos de carbono

C20 - 20 átomos de carbono

C-3 – Carbono 3

CTAB - brometo de cetiltrimetilamônio

CNPH - Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças

Cenargen - Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia

CLAE-FR - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- fase reversa

Del - Delta

DXP - deoxixilulose 5-fosfato

DXS - deoxixilulose 5-fosfato sintase

xvi

Continua

DNA- ácido desoxiribonucléico

DMAPP - dimetilalil difosfato

EcoR I – enzima de restrição de Escherichia coli

EDTA EthyleneDiamineTetrAcetic acid

EMPRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EST - Expressed Sequence Tag

et al – entre outros

E-value- Expectation value

Fig. - figura

GBSSI - grandule-bound starch syntase I

GGPP - geranilgeranil pirofosfato

GGDS - GGPP sintase

G -guanina

g - grama

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

HCL- Ácido clorídrico

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IPP - isopentenil pirofosfato

Kg - Kilograma

LCYB - licopeno β-ciclase

LDL - lipoproteína de baixa densidade

LCYE - licopeno ε-ciclase

µg – micrograma

µg/g-1 – micrograma/grama

mm - micrometro

MVA - ácido mevalônico

MEP - metileritriol 4-fosfato

Mbp – mil pares de base

mm - milímetro

m - metro

mM - milimolar

ml min-1 – mililitro minuto

mcg/dl-1 – micrograma/decilitro

xvii

Continua

mg/kg-1 – miligrama/kilograma

mg - miligrama

mRNA - Ácido ribonucléico mensageiro

min - minutos

mAU - miliunidades de absorbância

nRFLP - nuclear restriction fragment length polymorphisms

NSY - neoxantina sintase

N2 - nitrogênio

NaCl – cloreto de sódio

NCBI - National Center for Biotechnology Information

ng/µl-1 – nanograma/microlitro

nº - número

nm - nanometro

OMS – Organização Mundial de Saúde

pmoles – pico moles

pmoles/mL-1 - pico moles/micro litro

pb – pares de base

pH - potencial hidrogeniônico

PSY - fitoeno sintase

PPPP - fitoeno pirofosfato

PDS - fitoeno dessaturase

PAUP - Phylogenetic Analysis Using Parsymony and Other Methods

PCR - reação em cadeia pela polimerase

PTFE - polytetrafluoroethylene

ppm - parte por milhão

rpm – rotação por minuto

RNA - Ácido ribonucléico

sp - self-pruning

S. - Solanum

SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms

SOL - International Solanaceae Genome Project

Tm - temperaturas de anelamento

TE - Tris-.HCl EDTA

xviii

Continua

t – tonelada

t/ha-1 – tonelada/hectare

t/dia-1 – tonelada/dia

T - tiamina

3-D - tridimensional

UI - unidades internacionais

UNB – Universidade de Brasília

UV - Ultra Violeta

UV-VIS - Ultra Violeta - visível.

UNICEF – Fundo das Nações Unidas para Infância

Var. - variedade

v/v – volume/volume

VDE - violaxantina de-epoxidase

x - vezes

WPTC - World Processing Tomato Council

WHO/NUT - World Health Organization/Nutrition

ZDS - z-caroteno dessaturase

ZEP - zeaxantina epoxidase

xix

Lista de Símbolos

~ - aproximadamente

α - alfa

β – beta

ε - epsilon

δ - delta

°C - graus Celsius

l - lambda

> - maior

< - menor

± - mais ou menos

% - percentual

z - zeta

xx

Lista de Ilustrações

Capítulo 01

FIGURA 1.1. Distribuição geográfica do tomateiro na parte ocidental da América do Sul,

incluindo as Ilhas Galápagos. Fonte: American Journal of Botany 88(10): 1888-1902,

2001....................................................................................................………..............……… 07

FIGURA 1.2. Visão esquemática da via biossintética de carotenóides em plantas. ...............23

Capítulo 02

FIGURA 2.1. Seis diferentes estádios de maturação do fruto de tomateiro. Fonte: (http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/659/1/FERREIRA-2004-DEF.pdfDEF.)...33

FIGURA 2.2. Obtenção da estrutura fina do espectro de carotenóides (BRITTON,

1995).........................................................................................................................................36

FIGURA 2.3. Fórmula de LAMBERT-BEER para cálculo da concentração de

carotenóides..............................................................................................................................37

FIGURA 2.4. Variedade de cores dos frutos maduros das espécies (A) S. peruvianum; (B) S.

pimpinellifolium e (C) S. cheesmaniae. Fonte: Acervo de fotos da Embrapa-Hortaliças........38

FIGURA 2.5. Espectros em 2-D de absorção na região visível na fase móvel

(acetonitrila:metanol:etil acetato - 8:1:1) dos picos característicos identificados nas espécies

de tomate: (A) Luteína (λ dos picos localizados a 425, 449 e 475 nm); (B) Licopeno ( λ dos

picos localizados a 446, 473 e 503 nm); (C) α-caroteno ( λ dos picos localizados a 448 e 480

nm); (D) β-caroteno (λ dos picos localizados a 454 e 480 nm) e (E) Zeaxantina (λ dos picos

localizados a 450 e 477 nm)......................................................................................................39

Capítulo 03

FIGURA 3.1. Amplicons correspondendo a potenciais fragmentos de genes codificadores da

enzima licopeno-β-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro e analisados em gel de

xxi

agarose [1% (p/v) corado com brometo de etídeo]. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo

‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (4) S.

neorickii ‘CNPH 945’; (5) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (6) S. lycopersicum ‘Santa Clara

CNPH 1496’; (7) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (9) S.

chilense ‘CNPH 943’, (10) S. pennellii ‘CNPH 409’, (11) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’,

(12) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (13) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (14) S. chilense ‘CNPH

410’...........................................................................................................................................57

FIGURA 3.2. Amplicons obtidos correspondendo a fragmentos da seqüência do gene

codificador da enzima licopeno-ε-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro (Seção

Lycopersicon) e analisados em gel (agarose 1% corado com brometo de etídeo). (1) Solanum

chmielewskii ‘CNPH 1022’; (2) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (3) S. chilense ‘CNPH 943’;

(4) S. pennellii ‘CNPH 409’; (5) S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (6) S.

galapagense ‘CNPH 432’; (7) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH

1154; (9) S. chilense ‘CNPH 410’; (10) S. neorickii ‘CNPH 945’; (11) S. peruvianum ‘CNPH

944’ e (12) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. .........................................................59

FIGURA 3.3. Resultado da amplificação do fragmento gênico da fitoeno sintase utilizando o

o par de iniciadores PSY-1 tom-1 e PSY-1 tom 1R. Amplicons foram nalisados em gel de

agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH

1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum

‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae

‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH

1022’; (10) S. chmielewskii ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii

‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S.

habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH 201’.................................................61

FIGURA 3.4. Amplicons correspondentes a fragmentos gênicos codificadores da enzima

fitoeno sintase sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-2 e PSY-1 tom-2R.

Amplicons foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1)

Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S.

peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’;

(6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa

Clara CNPH1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’;

xxii

(11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH

796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S.

peruvianum ‘CNPH 201’..........................................................................................................63

FIGURA 3.5. Amplicons correspondendo a fragmentos gênicos codificadores da enzima

fitoeno sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-3 e PSY-1 tom-3R. Amplicons

foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum

pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum

‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii

‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’;

(9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense

‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S.

peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH

201’. ........................................................................................................................................65

Capítulo 04

FIGURA 4.1. Variabilidade das cores de algumas espécies de tomate maduro do gênero

Solanum [Secção Lycopersicon]. Fonte: Enciclopedia.us.es. & acervo Charles Rick

Center........................................................................................................................................68

FIGURA 4.2. Alinhamento das seqüências do fragmento do gene codificador da enzima

licopeno-β-ciclase. O alinhamento foi obtido utilizando o método Clustal W disponível no

pacote do Lasergene com as seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty = 10. Os

polimorfismos de bases estão identificados em

vermelho....................................................................................................................................77

FIGURA 4.3. Filograma de consenso mostrando nos ramos os valores de Bootstrap (após

5000 repetições). Este filograma foi obtido através de análise de parcimônia baseada no

alinhamento realizado com Clustal W do fragmento gênico correspondente ao gene

codificador da enzima licopeno-β-ciclase específica de cromoplasto de espécies de Solanum.

O índice de consistência foi de 0,73.........................................................................................78

xxiii

FIGURA 4.4. Filograma obtido do alinhamento das seqüências do gene de waxy (PERALTA

& SPOONER, 2001). As seqüências do gene waxy foram obtidas no GenBank: (AY875630 =

L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 = L. pennellii,

AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L. peruvianum,

AY875585 = L. parviflorum, AY875588 = L. chmielewskii, AY875582 = S. galapagense = L.

cheesmaniae). Os números nos ramos indicam a porcentagem obtida por análise Bootstrap

com 5000 repetições..................................................................................................................80

Capítulo 02

QUADRO 2.1. Identificação e características de coloração de fruto do germoplasma de

tomate utilizado neste estudo....................................................................................................34

QUADRO 2.3. Média do conteúdo dos carotenóides (em mg/g de peso fresco) verificados nas

espécies do gênero Solanum da seção Lycopersicon.. .............................................................40

Capítulo 03

QUADRO 3.1. Identidade do fragmento de licopeno-β-ciclase amplificado de DNA de

Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ com a seqüência alvo de licopeno-beta-

ciclase. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi submetida ao banco de dados do

GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov)...........................................................................................................58

QUADRO 3.2. Identidade do fragmento de licopeno-ε-ciclase amplificado de DNA de

Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência

objeto foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página

eletrônica do NCBI (Erro! A referência de hiperlink não é válida.

QUADRO 3.3. Identidade do fragmento de fitoeno sintase amplificado de DNA de Solanum

lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi

submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do

NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).................................................................................................62

xxiv




NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).................................................................................................64




NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)................................................................................................66

Capítulo 04

QUADRO 4.1. Sessenta e três sítios de polimorfismos detectados em múltiplas análises de

alinhamento de um fragmento gênico correspondente ao gene codificador da enzima licopeno

β-ciclase específico de cromoplasto de sete espécies de Solanum (Seção Lycopersicon). Os

números representam os locais de ocorrência dos polimorfismos ao longo da seqüência

amplificada de 1219pb, em um ou mais acessos quando comparado com a seqüência de

referência (S. lycopersicum AF 254793). Os pontos simbolizam inserções e/ou deleções de

nucleotídeos. Os polimorfismos de bases foram identificados com as letras em vermelho, (S)

indica os polimorfismos tipo transição e (V) os polimorfismos tipo transversão. Os

polimorfismos correspondendo a inserções/deleções foram identificados pelo símbolo

ID..............................................................................................................................................79


Diversidade de Carotenóides Antioxidantes em Frutos de Espécies de

Solanum (seção Lycopersicon): Caracterização Via Cromatografia

Líquida de Alta Resolução (CLAE) e Análise Filogenética do Gene

Codificador da Enzima Licopeno-β-ciclase

Brasília-DF

Dezembro 2007

1

INTRODUÇÃO

O tomateiro é originário nas regiões andinas do Peru, Bolívia e Equador na parte

ocidental da América do Sul. Esta hortaliça foi amplamente cultivada e consumida pelos

povos pré-colombianos. O tomate cultivado foi, muito provavelmente, levado da região

ocupada pelos povos Incas até a região do sul do México, onde habitavam os Astecas

(PAZINATO & GALHARDO, 1997). O México, em especial as regiões de Puebla e Vera

Cruz, é considerado o mais provável centro de domesticação do tomate (JENKINS, 1948;

RICK & BUTLER, 1956; MONACO, 1964). Levada para a Europa pelos colonizadores

espanhóis, em poucos anos a tomaticultura espalhou-se pelos diferentes países daquele

continente. Durante um longo tempo, o tomateiro foi considerado apenas como uma planta

medicinal ou simplesmente ornamental, sendo o seu uso difundido na alimentação e na

culinária apenas dois séculos depois de ser levado para a Europa (GARDÊ & GARDÊ, 1993).

Posteriormente, o cultivo do tomate foi introduzido em quase todos os países, em maior ou

menor escala, tendo hoje uma utilização global (FONTES & SILVA, 2002).

A maioria dos botânicos atribui a origem do cultivo e consumo, e mesmo a seleção

genética, do tomate como alimento, à civilização Inca do antigo Peru. Esta origem foi

deduzida pelo fato de que ainda hoje persiste, naquela região, uma grande variedade de

tomates selvagens e algumas espécies domesticadas, de cor verde, que são conhecidas apenas

no Peru. Os tomates selvagens e cultivados se desenvolvem em uma ampla gama de habitats,

com dispersão geográfica variando desde o nível do mar até uma altitude maior que 3.300 m

(RICK, 1973; TAYLOR, 1986). Estes habitats incluem desde a costa árida do Pacífico até as

regiões montanhosas nos Andes, passando por matas ciliares, encostas úmidas (JENKINS,

1948) e as Ilhas Galápagos (RICK, 1967; CAMARGO, 1992). A variedade Solanum

(Lycopersicum) cerasiforme, o mais provável ancestral do tomate cultivado, teria sido levado

do Peru e introduzido pelos povos antigos na América Central, posto que este foi encontrado

amplamente cultivado no México (EMBRAPA, 1993; FONTES & SILVA, 2002).

O tomateiro é uma planta fanerógama, angiosperma e dicotiledônea. Os tomates

podem ser divididos em diversos grupos, de acordo com seu formato e sua finalidade de uso,

como: ‘Santa Cruz’, tradicional na culinária, utilizado em saladas e molhos e de formato

oblongo; ‘Caqui’, utilizado em saladas e lanches, de formato redondo; ‘Saladete’ ou

‘Italiano’, utilizado principalmente para molhos, podendo ainda fazer parte de saladas. Seu

formato é oblongo, tipicamente alongado; e ‘Cereja’, utilizado como aperitivo, ou ainda em

saladas.

2

Nos últimos dez anos, o mercado de tomates no Brasil e no mundo apresentou um

significativo aumento de produção, consumo, produtividade e nos preços pagos pelo

consumidor final. Esse incremento veio atrelado ao desenvolvimento da produtividade e

mudanças no hábito alimentar das pessoas. Esse crescimento da produção e do consumo está

relacionado, entre outros fatores, ao aumento da demanda por alimentos industrializados ou

produtos semi-prontos tais como molhos de tomate, ketchup e congelados. A busca por

alimentos mais saudáveis pela população, associada com a proliferação de restaurantes fast-

food e do tipo self-service também colaboram com o aumento da demanda mundial de frutos

in natura (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).

O tomate é a principal fonte do pigmento vermelho licopeno e contém, em menores

teores, os carotenóides b-caroteno, zeaxantina e luteína. A maioria das investigações tem

sugerido a associação entre dietas ricas em licopeno e a redução dos riscos da ocorrência de

vários tipos de câncer (LUGASI et al., 2003; GIOVANNUCCI, 1999; CLINTON, 1998). O

b-caroteno é um precursor de vitamina A, cuja deficiência é um problema de saúde pública no

Brasil. A luteína e a zeaxantina atuam na prevenção da catarata e degeneração macular

(SOMMERBURG et al., 1999). As cores de fruto nas diversas espécies de tomate variam do

amarelo para o vermelho alaranjado, dependendo da razão licopeno/β-caroteno. O teor e

balanço destes carotenóides também estão associados com a ação da enzima licopeno-β-

ciclase (BOTELLA-PAVÍA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006).

A via dos carotenóides, responsável pela biossíntese dos terpenos, é uma das vias

bioquímicas mais bem caracterizadas em plantas, com vários genes já clonados e

seqüenciados (CUNNINGHAM & GANTT, 1998). Vários estudos têm tentado associar

marcadores moleculares com o acúmulo de licopeno em frutos de tomate (LIU et al., 2003;

KABELKA et al., 2004; ROUSSEAUX et al., 2005). Entretanto, poucos são os exemplos de

esforços para aumentar e/ou modificar a composição nutricional ou nutracêutica de tomates,

explorando a variação de espécies selvagens (LINCOLN & PORTER, 1950; MACKINNEY

et al., 1954, TOMES et al., 1954; STOMMEL & HAYNES, 1994). Por outro lado, existe na

literatura uma vasta quantidade de trabalhos sobre a caracterização genética e molecular dos

fatores que controlam diferentes teores de carotenóides em frutos de tomates cultivados.

Entretanto, comparativamente, poucas informações estão disponíveis sobre a quantidade e

diversidade de carotenóides em frutos de espécies selvagens.

O presente trabalho visou explorar novos aspectos associados com a composição e

conteúdo de carotenóides em espécies selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon:

Solanaceae]. O objetivo final deste trabalho foi gerar ferramentas que auxiliem no processo de

3

seleção de genótipos com melhores características nutricionais. A informação gerada no

presente trabalho poder ser utilizados no estabelecimento de sistemas de seleção assistida e/ou

potenciais estratégias de transformação genética visando obter cultivares de tomate com

melhores combinações e teores de carotenóides nutracêuticos. Foram gerados iniciadores de

síntese e otimizados protocos de PCR (polymerase chain reaction) que foram empregados na

amplificação de fragmentos dos genes que codificam as enzimas licopeno-β-ciclase, licopeno-

ε-ciclase e fitoeno sintase em diferentes espécies de tomate. O fragmento do gene que codifica

a licopeno-β-ciclase foi utilizado para a construção de uma árvore filogenética do gênero

Solanum [Section Lycopersicon: Solanaceae] e o resultado foi comparado com trabalhos de

taxonomia usando marcadores moleculares e morfológicos disponíveis na literatura.

4

OBJETIVOS

Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar diversidade (composição) e teores de

carotenóides em várias espécies do gênero Solanum [seção Lycopersicon] e gerar dados de

sequência e potenciais marcadores moleculares para genes codificadores de algumas das

principais enzimas da via biossintética dos carotenóides.

Objetivos Específicos

Caracterizar diversos materiais genéticos, incluindo linhagens das espécies selvagens

do gênero Solanum seção Lycopersicon Mill, quanto à composição de carotenóides,

visando selecionar genótipos que sejam potenciais fontes de elementos nutracêuticos para

utilização no melhoramento genético do tomateiro.

Gerar oligonucleotídeos iniciadores e definir protocolos de amplificação (PCR)

específicos para isolar alelos dos genes codificadores das enzimas fitoeno sintase,

licopeno-ε-ciclase e licopeno-β-ciclase de cromoplasto.

Caracterizar a diversidade estrutural do gene/alelos codificadore da enzima licopeno-

β-ciclase nas espécies já caracterizadas dentro da seção Lycopersicon Mill.

Conduzir uma análise filogenética das espécies de Solanum seção Lycopersicon Mill

utilizando os dados de sequência do gene que codifica a enzima licopeno-β-ciclase.

5

CAPÍTULO 01

1.0. Revisão da Literatura.

1.1. Importância da Cultura de Tomateiro no Brasil.

O tomateiro (Solanum lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum Mill.) é cultivado

em regiões temperadas, tropicais e subtropicais em todos os cinco continentes. De acordo com

dados da FAO, a produção mundial de tomate gira em torno de 125 milhões de toneladas ao

ano. Entre os maiores produtores destacam-se a China e os Estados Unidos, com cerca de

30% do total mundial (WIEN, 1997; CASQUET, 1998; FONTES & SILVA, 2002;

FAO/ONU, 2004). O Brasil é o nono produtor com 3,3 milhões de toneladas por ano

(CARVALHO & PAGLIUCA, 2007). Os dados coletados em 2004 apontaram um total de 60

milhões de toneladas tomate para o processamento em nível mundial (WORLD

PROCESSING TOMATO COUNCIL – WPTC, 2004). Aproximadamente 62% da produção

brasileira têm como destino o consumo in natura. Em países como Itália, Espanha e Estados

Unidos ocorre uma intensa industrialização e agregação de valor a produtos derivados de

tomate. Por exemplo, apenas vinte e um por cento da produção norte-americana tem sido

destinada para consumo in natura, sendo o restante da produção processada pelas indústrias

de alimentos (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).

Segundo dados da Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação

(FAO/ONU) e as pesquisas de mercado do Centro de Estudos Avançados em Economia

Aplicada – CEPEA (ESALQ/USP) mostram um aumento considerável na produção nacional

de tomate nas últimas duas décadas. Nos últimos dez anos, o mercado de tomates no Brasil e

no mundo apresentou um significativo aumento de produção, consumo, produtividade e nos

preços pagos pelo consumidor final. Esse incremento veio atrelado ao aumento da

produtividade e mudanças no hábito alimentar das pessoas. Para os analistas do CEPEA, esse

crescimento da produção e do consumo está relacionado, entre outros fatores, ao aumento da

demanda por alimentos industrializados ou produtos semi-prontos tais como molhos, ketchup

e congelados. A busca por alimentos mais saudáveis pela população associada com a

proliferação de restaurantes fast-food e do tipo self-service também colaboram com o aumento

da demanda mundial de frutos de tomate in natura (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).

No Brasil, o tomate ocupa o segundo lugar em volume de produção/consumo dentro do

agronegócio de hortaliças, vindo logo atrás da batata, a frente da alface e com volume duas

vezes maior que o da cebola. Segundo dados do AGRIANUAL (2007), a área plantada com

6

tomate no Brasil é superior a 58 mil hectares com produção anual em torno de 3,5 milhões de

toneladas. Os principais Estados produtore são Goiás, São Paulo, Minas Gerais, Rio de

Janeiro e Bahia, que juntos representam 77% do volume comercializado, sendo 65%

destinado ao consumo in natura e 35% para processamento industrial (IBGE, 2004). O Brasil

cultiva anualmente aproximadamente 42,5 mil hectares de tomate para consumo in natura e

produtividade média de 47 t/ha. A região Sudeste é responsável por 55% da produção

nacional do tomate para consumo in natura. Em 2006, a produção de tomate para

processamento foi de 1,16 milhões de toneladas, em área de 14,9 mil hectares (produtividade

de 77,8 t/ha). Os Estados de Goiás e Minas Gerais são responsáveis por aproximadamente

71% da produção nacional de tomate para processamento. Atualmente, a capacidade instalada

de nossas indústrias é de aproximadamente 15.000 t/dia de pasta de tomate e de 1.500 t/dia de

tomate em cubos.

A produção de tomate, tanto para consumo in natura quanto para processamento

industrial, envolve grande utilização de mão-de-obra, gerando empregos diretos e indiretos

em diversas regiões do país. O mercado de sementes de tomate no Brasil é de

aproximadamente US$ 11 milhões, representando cerca de 30% do mercado de sementes de

hortaliças, que é atualmente estimado em US$ 44 milhões. Além de sua importância

econômica e social, o tomate está diariamente presente na mesa de milhares de brasileiros,

sendo uma importante fonte de nutrientes na dieta de diferentes classes sociais. Sob o ponto

de vista social, a cadeia de produção nacional abriga mais de 10.000 produtores, com 60.000

famílias de trabalhadores compostas por um efetivo de mais de 200.000 pessoas (TAVARES,

2003). Como mencionado, o Brasil figura entre os dez maiores produtores mundiais de

tomate. No entanto, ainda existem grandes possibilidades de melhorar os indicadores

tecnológicos da cultura (por exemplo, produtividade e custo de produção) permitindo

estabilizar a oferta do produto ao longo do ano, atender a demanda doméstica por produtos de

melhor qualidade sensorial/nutricional e gerar excedentes para exportação, especialmente de

produtos processados (CARVALHO & PAGLIUCA, 2007).

1.2. Origem e Taxonomia do Gênero Solanum.

O tomateiro é originário na parte ocidental da América do Sul (Figura 1.1.), nas

regiões andinas do Peru, Bolívia e Equador (EMBRAPA, 1993; FONTES & SILVA, 2002).

Os tomateiros selvagens e cultivados se desenvolvem em uma ampla gama de habitats, com

dispersão geográfica variando desde o nível do mar até uma altitude maior que 3.300 m

(RICK, 1973; TAYLOR, 1986). Estes habitats incluem desde a costa árida do Pacífico até as

7

regiões montanhosas nos Andes, encostas úmidas (JENKINS, 1948) e as Ilhas Galápagos

(RICK, 1967; CAMARGO, 1992).

FIGURA 1.1. Distribuição geográfica do tomateiro na parte ocidental da América do Sul,

incluindo as Ilhas Galápagos. Fonte: American Journal of Botany 88(10): 1888-1902, 2001.

O tomate cultivado foi, muito provavelmente, transportado da região ocupada pelos

povos Incas até a região do sul do México, onde habitavam os Astecas (PAZINATO &

GALHARDO, 1997). O México, em especial as regiões de Puebla e Vera Cruz, é considerado

o mais provável centro de domesticação do tomate cultivado (JENKINS, 1948; RICK &

BUTLER, 1956; MONACO, 1964). Levada para a Europa pelos colonizadores espanhóis, em

poucos anos a tomaticultura espalhou-se pelos diferentes países daquele continente. Durante

8

um longo tempo, o tomateiro foi considerado apenas uma planta medicinal ou simplesmente

ornamental, sendo o seu uso difundido na alimentação e na culinária apenas dois séculos

depois de sua introdução na Europa (GARDÊ & GARDÊ, 1993). O cultivo do tomate foi

introduzido em quase todos os países, em maior ou menor escala, tendo hoje uma utilização

global (FONTES & SILVA, 2002).

1.2.1. Sistemas Taxonômicos do Gênero Lycopersicon.

O botânico Milller, em 1754, foi o primeiro a propor a nomenclatura e a classificação

do tomateiro cultivado dentro do gênero Lycopersicon (MINAMI & HAAG, 1989). Embora

Karl Von Linnaeus tenha incialmente classificado o tomateiro dentro do gênero Solanum em

1753, esta espécie permaneceu sendo classificada como uma dicotiledônea, da ordem

Tubiflorae, família Solanaceae, gênero Lycopersicon, subgênero Eulycopersicum e espécie

Lycopersicon esculentum L. (Mill.) Wettst.

As análises morfológicas iniciais do gênero Lycopersicon resultaram em dois

tratamentos taxonômicos distintos. MILLER (1940) considerou Lycopersicon como um

gênero distinto e subdividido em dois subgêneros, de acordo com a presença ou não do

carotenóide licopeno (que confere cor vermelha aos frutos): Eulycopersicon (frutos maduros

vermelhos) composto por duas espécies e Eriopersicon (frutos maduros não vermelhos)

composto por quatro espécies. LUCKWILL (1943) adotou as mesmas categorias supra-

específicas, mas reconheceu um total de sete espécies no subgênero Eriopersicon

(WARNOCK, 1988).

As nove espécies caracterizadas dentro do gênero Lycopersicon, segundo RICK

(1986) podem ser agrupadas em dois “complexos”, de acordo com a ausência/presença de

barreiras de cruzamentos com L. esculentum: (1) “complexo esculentum” e (2) “complexo

peruvianum”. O “complexo esculentum” abrange sete espécies: L. esculentum L. Mill, L.

cheesmaniae L. Riley, L. pimpinellifolium L. Miller; L. chmielewskii Rick; L. parviflorum

Rick; L. hirsutum Dunal e L. pennellii (Corr.) D’Arcy. O “complexo peruvianum” abrange

duas espécies: L. chilense Dunal e L. peruvianum L. Miller (PERALTA & SPOONER, 2000).

CHILD (1990), em um tratamento taxonômico posterior, posicionou o tomate no gênero

Solanum seção Lycopersicon subseção Lycopersicon e dividiu esta subseção em três séries:

Lycopersicon (frutos vermelhos contendo licopeno), Neolycopersicon (frutos sem licopeno) e

Eriopersicon, seguindo o mesmo conceito já descrito acima.

9

1.2.2. Sistemática Molecular e a Nova Classificação do Gênero Lycopersicon.

A sistemática molecular da família Solanácea, incluindo o tomateiro, tem sido baseada

na análise de seqüência de genes de cloroplasto (SPOONER et al., 1993); de genes

mitocondriais (MCLEAN & HANSON, 1986); padrões de isoenzimas (RICK & FOBES,

1975a; RICK & FOBES 1975b; RICK & TANKSLEY, 1981, RICK, 1983; 1986; BRETÓ et

al., 1993) e marcadores moleculares do tipo “restriction fragment length polymorphism” –

RFLP (MILLER & TANKSLEY, 1990). Mais recentemente, PERALTA & SPOONER

(2001) conduziram uma exaustiva análise morfológica e molecular que definiu, de maneira

consistente, que o tomateiro é uma espécie dentro do gênero Solanum na seção Lycopersicon.

No entanto, por questões de ordem prática, muitos dos botânicos e geneticistas ainda

reconhecem o tomate como pertencente ao gênero Lycopersicon Miller (PERALTA &

SPOONER, 2000). A análise de PERALTA & SPOONER (2001) envolveu a comparação de

dados de seqüência do gene GBSSI (“Granule Bound Starch Synthase”). Os resultados

mostraram uma relação estreita entre espécies com frutos maduros verdes, estando de acordo

com as classificações anteriores baseadas exclusivamente em dados morfológicos (PERALTA

& SPOONER, 2001). A partir dos dados obtidos com a seqüência do gene GBSSI combinados

com uma coleção de dados morfológicos (incluindo coloração de fruto), foi proposto o

retorno do gênero Lycopersicon para o gênero Solanum sendo as espécies reclassificadas da

seguinte forma:

S. lycopersicum L. Mill = L. esculentum L. Mill.;

S. cheesmaniae L. Riley = L. cheesmaniae L. Riley;

S. galapagense S. (Darwin) Peralta = L. cheesmaniae L. Riley var. minor;

S. pimpinellifolium L. Miller = L. pimpinellifolium L. Miller;

S. chmielewskii Rick = L. chmielewskii Rick;

S. neorickii Rick = L. parviflorum Rick;

S. habrochaites S. Knapp = L. hirsutum Dunal;

S. pennellii Correl = L. pennellii (Corr.) D’Arcy;

S. chilense Dunal = L. chilense Dunal

O complexo L. peruvianum L. Miller foi desmembrado em quatro taxa (PERALTA &

SPOONER, 2001; PERALTA et al., 2005):

S. corneliomuelleri Macbr, (nova espécie) descrita como L. glandulosum Mull.;

S. arcanum Peralta (nova espécie);

S. huaylasense Peralta (nova espécie);

S. peruvianum L. Miller que corresponde a todos os acessos típicos de L. peruvianum.

10

1.3. Principais Características das Espécies do Gênero Solanum seção Lycopersicon.

A maioria das espécies da seção Lycopersicon é silvestre, apresentando frutos

extremamente pequenos, por vezes pubescentes. Estas espécies têm sido utilizadas com

freqüência em programas de melhoramento do tomateiro visando à introgressão de genes que

conferem resistência a pragas e doenças, melhoria da qualidade dos frutos e aumento da

qualidade nutritiva (GIORDANO et al., 2003).

Solanum peruvianum é a espécie selvagem que apresenta a maior variabilidade

genética e fenotípica. Ela é nativa da região central e norte do Peru, apresenta fatores de

resistência a diversas pragas e doenças e é a fonte mais rica em vitamina C. Alguns acessos

também apresentam tolerância à seca. Esta espécie tem sido utilizada nos programas de

melhoramento como fonte de resistência a um grande número de doenças, tais como as

causadas pelos fungos Cladosporium fulvum e Fusarium oxysporum, várias espécies do

nematóide Meloidogyne e patotipos de Tomato mosaic virus e espécies de Tospovirus

(GIORDANO et al., 2003). Como mencionado, a espécie S. peruvianum L. Miller foi

recentemente dividida em três novas espécies: S. corneliomuelleri Macbr (de ocorrência nas

regiões sul e central do Peru) e duas novas espécies (S. arcanum Peralta e S. huaylasense

Peralta) de ocorrência restrita ao norte do Peru (PERALTA et al., 2005).

A espécie selvagem S. pimpinellifolium é originária do Peru e também denominada de

“tomate-groselha”. No melhoramento genético, esta espécie tem sido fonte de fatores de

resistência a um grande número de patógenos (C. fulvum, F. oxysporum, Phytophthora

infestans, Verticillium dahliae e Pseudomonas tomato) e também de características

relacionadas à qualidade do fruto, tais como: menor acidez, elevado teor de minerais, licopeno

e pró-vitamina A. Esta espécie é adaptada a temperaturas muito altas no que diz respeito ao

pegamento de frutos e ao crescimento vegetativo (GIORDANO et al., 2003).

Solanum cheesmaniae é uma espécie endêmica das Ilhas Galápagos. Ela é resistente à

salinidade (com ocorrência litorânea) e não tem abscisão no pedúnculo floral. Acessos

anteriormente denominados de S. cheesmaniae var. minor foram reclassificados como uma

nova espécie, S. galapagense (PERALTA et al., 2005).

Solanum habrochaites é uma espécie selvagem e rústica de ocorrência em regiões de

elevadas altitudes, no Equador e no Peru. É resistente a numerosos insetos, ácaros e vírus e é

adaptada a temperaturas muito baixas, no que diz respeito à germinação e pegamento de

frutos. O gene B, que controla teores mais elevados de β-caroteno foi introgredido desta

espécie (PERALTA et al., 2005).

11

Solanum neorickii é uma espécie que se encontra nos altos vales dos Andes peruanos.

Esta espécie se caracteriza por frutos com elevados teores de matéria seca (PERALTA et al.,

2005).

Solanum chilense é uma espécie originária das regiões áridas do norte do Chile e do

sul do Peru. Esta espécie é muito resistente à seca. Um dos genes de resistência a geminivírus

(Ty-1) foi introgredido a partir de acessos desta espécie (GIORDANO et al., 2003).

Solanum chmielewskii é uma espécie que se caracteriza por um fruto de cor amarela e

pelo seu alto teor de açúcar, tendo sido utilizada pelos programas de melhoramento genético

visando aumentar o Brix (teor de açúcares solúveis) de tomates para processamento industrial

(PERALTA et al., 2005).

Solanum pennellii é uma espécie selvagem originária do oeste do Peru e que resiste

consideravelmente à seca. Acessos desta espécie apresentam tricomas glandulares que

conferem resistência a diversos insetos e ácaros (GIORDANO et al., 2003).

1.4. Carotenóides Mais Comumente Encontrados em Hortaliças e Frutas.

Os carotenóides mais comumente encontrados nos alimentos de origem vegetal são: o

ß-caroteno e a-caroteno presentes, por exemplo, na cenoura (Daucus carota) e abóboras

(Cucurbita spp), o licopeno presente no tomate, goiaba e melancia e várias xantofilas

(zeaxantina, luteína e outros carotenóides com estruturas oxigenadas) presentes, por exemplo,

no milho (Zea mays); na manga (Mango indica) e no mamão (Carica papaya). A bixina

(corante dérmico e aditivo culinário usado por indígenas amazônicos) é obtida do urucum

(Bixa orellana). Carotenóides como o β-caroteno, licopeno, zeaxantina e luteína exercem

funções antioxidantes em fases lipídicas, bloqueando os radicais livres que danificam as

membranas lipoprotéicas (SIES & STAHL, 1995). O licopeno é o carotenóide predominante

no plasma e nos tecidos humanos, sendo encontrado em um número limitado de alimentos,

como no tomate e seus produtos, na goiaba, na melancia, no mamão e na pitanga (ARAB &

STECK, 2000).

1.5. Importância dos Carotenóides na Dieta Humana.

A hipovitaminose A têm sido observada em algumas regiões brasileiras tais como o

semi-árido nordestino e o Vale do Rio Jequitinhonha (Norte de Minas Gerais). Entre as

estratégias para aumentar e/ou permitir um consumo adequado deste nutriente, destacam-se a

introdução de alimentos ricos em carotenóides em culturas adaptadas para plantio e com

tradição de consumo nas regiões geográficas onde a carência nutricional é manifestada

12

(WHO/UNICEF, 1995). Além disso, BRAMLEY (2000) menciona que muitas tentativas de

controle da deficiência de vitamina A via suplementação (cápsulas) não têm sido eficientes

em países em desenvolvimento. É fundamental também a introdução de alimentos derivados

de plantas com alto teor pró-vitamínico na dieta da população. Neste contexto, o

melhoramento genético, visando desenvolver e disponibilizar cultivares com maiores teores

de pigmentos com ação de pró-vitamina A apresenta um papel de relevo. O tomate, apesar de

não conter teores elevados de carotenóides pró-vitamina A, é uma das mais importantes fontes

deste elemento devido ao alto consumo tanto de produtos in natura quanto de produtos

processados (TAVARES & RODRIGUEZ-AMAYA, 1994). Além disso, o tomate é também

fonte de moléculas antioxidantes com conhecida ação anticâncer (exemplo: licopeno e

luteína) (OLSON, 1999).

O estudo da ação dos antioxidantes bem como da sua relação com os radicais livres e a

prevenção de algumas doenças tornou-se um tema de grande interesse. Os radicais livres são

átomos ou moléculas produzidas durante os processos metabólicos e que atuam como

mediadores da transferência de elétrons em várias reações bioquímicas nas células e tecidos

humanos. As principais fontes de radicais livres são as organelas citoplasmáticas que

metabolizam o oxigênio, o nitrogênio e o cloro (MÉNDEZ FILHO & RODRÍGUEZ, 1997).

A produção excessiva de radicais livres pode conduzir a diversas formas de dano celular e sua

cronicidade está associada com o desenvolvimento de numerosas doenças (SPEISKY &

JIMÉNEZ, 2000). As lesões celulares causadas pelos radicais livres podem ser prevenidas ou

minimizadas por meio da atividade de antioxidantes, sendo estes encontrados em muitos

alimentos de origem vegetal (PAPAS, 1999). Os antioxidantes podem ser definidos como

qualquer substância que, mesmo presente em baixas concentrações, retarda ou inibe de

maneira eficaz a oxidação de um dado substrato celular (AUST et al., 2001). O sistema de

defesa antioxidante (com ação direta na neutralização da ação dos radicais livres) é formado

por fatores enzimáticos e não-enzimáticos. Estes agentes antioxidantes estão presentes tanto

no organismo (nas células ou na circulação sangüínea) como nos alimentos ingeridos

(MONTERO, 1996). No sistema enzimático, os principais agentes antioxidantes são as

proteínas das classes superóxido-dismutases, glutationa-peroxidases e catalases

(HALLIWELL & GUTTERDGE, 1999). Dos componentes não-enzimáticos da defesa

antioxidante destacam-se alguns minerais (ex. cobre, manganês, zinco, selênio e ferro);

vitaminas (ácido ascórbico, vitamina E, vitamina A); carotenóides (β-caroteno, a-caroteno,

13

licopeno e luteína); bioflavonóides (genisteína e quercetina) e taninos (catequinas) (PAPAS,

1999; CARVALHO et al., 2006).

Os carotenóides e as vitaminas são as substâncias mais investigadas como agentes

antioxidantes em sistemas biológicos (POOL-ZOBEL et. al., 1997). Os carotenóides

compreendem uma família de compostos naturais, dos quais mais de 600 variantes estruturais

estão reportadas e caracterizadas em bactérias, algas, fungos e plantas superiores. A produção

mundial de carotenóides naturais é estimada em 100 milhões de toneladas por ano, sendo que

o maior volume individual encontra-se na obtenção da fucoxantina das algas fotossintéticas

marrons. Os mamíferos não estão bioquimicamente capacitados para a síntese de

carotenóides, mas podem acumular e/ou converter precursores que obtêm da dieta (exemplo,

conversão de ß-caroteno em vitamina A) (STAHL & SIES, 1999).

Dos carotenóides acíclicos, o licopeno e o z-caroteno são os mais comuns. O licopeno

é o principal pigmento de algumas hortaliças de coloração vermelha (RODRIGUEZ-

AMAYA, 2001). O carotenóide bicíclico b-caroteno é o mais difundido de todos os

carotenóides, presentes tanto em altas quanto em baixas concentrações, dependendo da

espécie vegetal. Estudos mostram a relação entre o aumento no consumo de alimentos ricos

em carotenóides e a diminuição no risco de várias doenças. Testes in vitro e in vivo sugerem

que os carotenóides são excelentes antioxidantes, seqüestrando e inativando os radicais livres

(ERDMAN, 1999). Segundo OLSON (1999), os carotenóides seqüestram o oxigênio singleto,

removem os radicais peróxidos, modulam o metabolismo carcinogênico, inibem a

proliferação celular, estimulam a comunicação entre células e elevam a resposta imune. Em

decorrência da importância atribuída aos carotenóides, especialmente ao licopeno, vários

estudos vêm sendo realizados para confirmar o efeito benéfico desta classe de pigmentos

vegetais. MICHAUD et al. (2000) relataram que a ingestão de carotenóides reduziu em 32% o

risco de câncer de pulmão em não fumantes. Uma maior ingestão de β-caroteno reduziu em

63% o risco de aparecimento de câncer em não-fumantes. Em fumantes, no entanto, a redução

do risco foi insignificante para os demais antioxidantes, exceto licopeno. Uma significativa

redução no risco de câncer foi observada com o aumento no consumo de licopeno

(MICHAUD et al., 2000), corroborando com uma vasta literatura médica (HEBER, 2000). O

licopeno apresenta maior eficiência na proteção das membranas celulares contra as lesões

causadas pelo radical dióxido de nitrogênio (encontrado no fumo), apresentando, desta forma,

um papel especial na prevenção do câncer de pulmão (BOHM et al., 1995).

14

Apesar das evidências protetoras do licopeno no câncer de próstata (RAO &

AGARWAL, 2000), alguns estudos têm demonstrado resultados inconsistentes sobre este

efeito (SHIRAI et al., 2002). Esta inconsistência pode ser parcialmente explicada por

problemas com a biodisponibilidade do licopeno de diferentes fontes alimentares e questões

fisiológicas próprias de cada indivíduo (TUCKER, 2003). Segundo um estudo realizado no

Canadá por RAO et al. (1998), a média de ingestão de licopeno, verificada por meio de

questionários de freqüência alimentar, foi de 25 mg por dia, com 50% desta ingestão

representada por tomates in natura. RAO & AGARWAL (2000) sugerem que o valor de 35

mg/dia seria uma ingestão média diária apropriada do licopeno. Portanto, é necessário

estimular o consumo de alimentos ricos em licopeno, visando suprir as necessidades diárias

recomendadas. Os tomates consumidos in natura apresentam o licopeno em forma menos

biodisponível que os tomates processados (WILLCOX et al., 2003). Essa diferença de

biodisponibilidade está relacionada com as formas isoméricas apresentadas pelo licopeno,

sugerindo que uma maior ingestão de tomates processados seria a maneira mais eficiente de

suprir este pigmento nas concentrações consideradas adequadas (RAO & AGARWAL, 2000).

Mais recentemente, as propriedades nutracêuticas dos carotenóides fitoeno e fitoflueno

têm sido demonstradas em diferentes estudos. Estes compostos estão também presentes em

frutos do tomateiro e são absorvidos e acumulados em importantes órgãos de diferentes

mamíferos. Três carotenóides do tomate (licopeno, fitoeno e fitoflueno) apresentaram uma

ampla distribuição no organismo de ratos, porém se acumularam mais intensamente na

próstata. O fitoflueno mostrou mais alta concentração no fígado (CAMPBELL, 2007).

As moléculas dos carotenóides apresentam muitas possibilidades de isomeria

geométrica (especialmente induzida por temperatura) e ótica. CLINTON et al. (1996)

demonstraram que 79% a 91% do licopeno presente nos tomates e seus produtos encontram-

se sob a forma do isômero trans (trans-licopeno), em contraste com os níveis de licopeno

sérico e tissulares, que se encontra em mais de 50% na forma de isômero cis-licopeno. O

licopeno ingerido, na sua forma natural (trans-licopeno), é pouco absorvido, mas, como

mencionado, estudos demonstram que o processamento térmico dos tomates e seus produtos

melhoram a sua biodisponibilidade. O processamento térmico rompe a parede celular e

permite uma extração mais eficiente do licopeno dos cromoplastos (WILLCOX et al., 2003).

A importância dos carotenóides β-caroteno e a-caroteno na dieta, como precursores da

vitamina A, tem sido reconhecida por muitas décadas (BRITTON, 1995). No organismo

humano, estes pigmentos atuam na formação de pigmentos visuais, no crescimento celular

normal, no desenvolvimento e manutenção da estrutura epitelial e das mucosas que revestem

15

intestinos, vias respiratórias bem como no desenvolvimento de dentes e ossos. A conversão do

β-caroteno em vitamina A é realizada na parede do intestino delgado, sendo influenciada pela

ingestão de gordura e proteínas da dieta. O â-caroteno só é biologicamente ativo quando

transformado em retinol (vitamina A), sendo seu teor médio no sangue de 300 mcg/dL. A

absorção de β-caroteno é dependente da presença de bile e aproximadamente um terço de β-

caroteno é absorvido no intestino (AMBRÓSIO et al., 2006).

A dificuldade de definir um fator geral de conversão do carotenóide pró-vitamina A

em vitamina A, não é recente. A Organização Mundial de Saúde (OMS) sugeriu, em 1967,

que 6 µg de ß-caroteno trans ou 12 µg de todos os carotenóides do tipo pró-vitamina A trans

nos alimentos é equivalente a 1 µg de retinol trans (FAO/WHO, 1967). Na ausência de uma

informação precisa e devido à complexidade do problema, a maioria dos comitês nacionais e

internacionais adota os mesmos valores. Estes valores foram recentemente duplicados, sendo

proposto que 12 µg de ß-caroteno trans ou 24 µg de carotenóides do tipo pró-vitamina A

trans é equivalente a 1 µg de retinol trans (MONSEN, 2000). O β-caroteno é uma molécula

que pode ser convertida em vitamina A no organismo sempre que necessário. O excesso da

vitamina A pode ser nocivo, enquanto o β-caroteno em si não faz mal algum. Os níveis

máximos de ingestão de vitamina A recomendados são de 10000 unidades internacionais (UI).

Por seu lado, o β-caroteno pode ser tomado em doses diárias que ultrapassam as 300.000 UI

(180 mg), sem que se observem efeitos nefastos (PASSWATER, 1998). O β-caroteno co-

existe como dois isômeros na geometria quadrado planar, o trans e o cis, em proporções

desiguais. Foram realizados vários estudos de absorção dos dois isômeros e verificou-se que

os níveis sanguíneos da forma em trans são superiores ao do isômero cis (STAHL et al.,

1993; 1995; TAMAI et al., 1995; BEN-AMOTZ & LEVY, 1996; JOHNSON et al., 1997).

Alguns destes autores sugerem que este resultado é indicativo de uma maior absorção do

trans-β-caroteno por parte do intestino. Todavia, a maior parte destes estudos não determinou

os níveis de β-caroteno acumulado em tecidos, em especial no fígado, o que implicaria a

realização de biópsias (seres humanos) ou o sacrifício dos animais em estudo. Portanto, são

necessários estudos mais rigorosos de modo a determinar se existe uma absorção preferencial

de um dos isômeros.

A luteína é um carotenóide encontrado em flores, frutos e folhas e, na biologia

humana, tem um importante papel na saúde dos olhos. A luteína tem sido usada como

suplemento, atuando na prevenção do desenvolvimento de catarata e degeneração macular e

prevenindo a diminuição da densidade macular causada por fatores como envelhecimento e

16

tabagismo (HAMMOND et al., 1997; LYLE et al., 1999; SEDDON et al., 1994). A luteína é

sintetizada a partir de α-caroteno. Os seus ésteres, formados pela combinação de uma

molécula de ácido orgânico com uma molécula de álcool, ocorrem naturalmente em muitas

frutas tais como a maçã, a laranja, o mamão papaia, o pêssego, a ameixa seca e a tangerina. A

luteína e a zeaxantina são os dois principais carotenóides encontrados na mácula, o pigmento

da retina responsável pela visão nítida das imagens, e estão associadas a proteínas solúveis

(SOMMERBURG et al., 1999). O excesso no acúmulo desses carotenóides pode causar uma

típica pigmentação amarelada da retina (LYLE et al., 1999).

1.6. Importância dos Carotenóides como Elementos Funcionais.

Dentro de alimentos funcionais e do programa internacional visando utilizar a

biodiversidade vegetal para promover uma alimentação mais saudável, existe a necessidade

de se determinar, com maior precisão, os teores de nutrientes e substâncias bioativas em

alimentos nativos do Brasil. Atualmente já existe um banco de dados sobre composição de

carotenóides em diferentes alimentos brasileiros, incluindo diversas hortaliças

(RODRIGUEZ-AMAYA, 1996; 1999). Esta informação catalogada minimiza a falta de

exatidão ao utilizar tabelas gerais de composição de alimentos (RODRIGUEZ-AMAYA,

2000), em especial em inquéritos dietéticos que visam avaliar o estado nutricional de

indivíduos e o estabelecimento de eventuais programas de intervenção. Uma recente revisão

sobre as hortaliças como fontes de elementos funcionais foi recentemente publicada

(CARVALHO et al., 2006).

O efeito terapêutico do consumo adequado de hortaliças e frutas inclui alteração na

composição de gorduras corporais, redução na absorção do colesterol, regulação da

coagulação do sangue, influência nas atividades digestivas, entre outras. Contudo, a grande

área emergente é aquela que basicamente combina alimentação com a prevenção de doenças,

buscando os chamados alimentos com propriedades funcionais ou nutracêuticas. Parte

considerável das substâncias de origem vegetal que previnem doenças são pró-vitaminas ou

antioxidantes. Algumas substâncias fazem parte do metabolismo secundário, em especial os

pigmentos carotenóides e os flavonóides (LÁZARO, 2002). A Agência Nacional de

Vigilância Sanitária – ANVISA, visando regulamentar esta nova prática no Brasil, publicou a

portaria nº 398 de 1999, que estabelece as diretrizes básicas para a análise e comprovação de

propriedades funcionais e/ou de saúde alegadas em rotulagem de alimentos. Esta atitude visa

proteger o consumidor e estimular os investimentos em pesquisas científicas. Atualmente

existem alguns alimentos que já tem suas propriedades funcionais comprovadas. Por exemplo:

17

as fibras diminuem o colesterol sangüíneo e a glicemia em pacientes diabéticos e previnem o

câncer de cólon; o tomate possui o licopeno, que atua contra os cânceres de próstata, cólon,

pâncreas e pulmão; o alho e a cebola possuem substâncias de ação antiinflamatória (exemplo,

a alicina). A falta de informação da população acerca das fontes de carotenóides é fato que

deve ser levado em consideração. Programas de educação nutricional da população brasileira

acerca dessas fontes funcionariam como uma importante ferramenta no combate de diversas

carências de pró-vitaminas e antioxidantes. Por exemplo, um programa que proporcionou a

elevação dos níveis séricos de retinol de crianças em uma comunidade rural da África do Sul

envolvia a inclusão na dieta de hortaliças de coloração verde-escura ou amarela combinada

com uma atenção à saúde e educação nutricional (FABER et al. 2002). É importante também

levar em consideração fatores fisiopatológicos dos diferentes grupos etários para garantir uma

maior eficácia destes programas. No caso da vitamina A, de acordo com a NATIONAL

ACADEMY OF SCIENCES USA (2001), a ingestão diária mínima, para garantir um nível

sérico adequado e prevenir sintomas de deficiência em indivíduos adultos é de 500 a 600µg;

em crianças 200 a 300µg; em gestantes 550µg e em lactantes 900µg. Os tomates e seus

derivados aparecem como as maiores fontes de licopeno (DJURIC & POWELL, 2001;

TAKEOKA et al., 2001).

Em relação ao antioxidante licopeno, o tomate in natura apresenta, em média, 30

mg/kg do fruto; o suco de tomate cerca de 150 mg/litro; e o ketchup contém em média 100

mg/kg (STAHL & SIES, 1999). O licopeno presente nos tomates varia conforme o tipo e o

grau de amadurecimento dos mesmos e entre diferentes cultivares (CARVALHO et al., 2005)

Segundo GIOVANNUCCI (1999), o tomate vermelho maduro contém maior quantidade de

licopeno que de β-caroteno, sendo responsável pela cor vermelha predominante. Embora seja

relativamente pobre em pró-vitamina A, o tomate constitui-se na terceira fonte desta

substância na dieta humana devido ao elevado consumo per capita de extratos e produtos

processados derivados do tomate (TIGCHELAAR, 1986).

1.7. Biologia dos Carotenóides.

Os carotenóides são classificados em dois grandes grupos (carotenos e xantofilas). Os

primeiros são hidrocarbonetos simples e os últimos são oxigenados. Os carotenóides são

sintetizados e acumulados nos plastídeos, onde eles se ligam a proteínas hidrofóbicas

específicas. Em todos os organismos fotossintéticos, os carotenóides realizam funções

indispensáveis nos sistemas de captação de luz e nos centros de reações fotossintéticas. Os

carotenóides apresentam a chamada “função de antena”, absorvendo energia solar na região

18

azul-verde do espectro e transferindo esta energia para as clorofilas (GIULIANO et al., 2003).

São também importantes para a conjugação e estabilidade de alguns complexos de pigmentos-

proteínas fotossintéticos (função estrutural). Os carotenóides agem como fotoprotetores,

prevenindo a formação de oxigênio singleto e seqüestrando diretamente estes e outros radicais

livres nocivos à célula vegetal (FOOTE, 1976). Em plantas superiores, estes pigmentos

desempenham papéis adicionais fornecendo as cores amarela, laranja e vermelha a certos

órgãos, como as flores e os frutos, a fim de atrair animais para polinização e para dispersão de

sementes. Nas hortaliças, certos carotenóides que são sintetizados como metabólitos

secundários, se acumulam em altas concentrações e são estocados dentro dos cromoplastos

(RONEN et al., 2000). As cores conferidas por estes pigmentos são de importante valor

agronômico e comercial em várias culturas e plantas ornamentais (CUNNINGHAM &

GANTT, 1998).

1.8. Identificação e Quantificação de Carotenóides em Tecidos Vegetais.

Vários métodos têm sido utilizados para a obtenção de perfis de compostos

metabólicos em tecidos vegetais. A técnica mais recentemente desenvolvida é a

espectrometria de massa, uma ferramenta analítica poderosa que é usada para identificar

compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades

químicas e estruturais das moléculas. A detecção de compostos pode ser conseguida para

quantidades tão pequenas como 10-15 g, para um composto de massa de 1000 Daltons em

misturas quimicamente complexas. A essência da técnica envolve a geração de íons que são

depois detectados. A sofisticação surge nos métodos que são usados para a geração desses

mesmos íons e no modo de analisá-los (CODY et al., 1994). Estudos utilizando

espectrometria de massa acoplada à cromatografia de gás foram capazes de identificar e

quantificar vários metabólicos com propriedades biológicas em folhas e frutos de S.

lycopersicum (SCHAUER et al., 2005; MOCO et al., 2006; TIKUNOV et al., 2005). A

cromatografia gasosa é uma técnica para separação e análise de misturas de substâncias

voláteis, muito utilizada para determinar o perfil de carotenóides. Neste método a amostra é

vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás adequado denominado de fase móvel ou gás

de arraste. Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase

estacionária (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura. As substâncias

separadas saem da coluna dissolvida no gás de arraste e passam por um detector, dispositivo

que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluído. O registro deste sinal

19

em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias aparecem nele como picos

com área proporcional à sua massa, o que possibilita a análise quantitativa (SCOTT &

PERRY, 1995). A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de

separação que passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e

quantitativos nos últimos trinta anos. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua

adaptabilidade para determinações quantitativas; boa sensibilidade e à possibilidade de

separar espécies não voláteis e termicamente instáveis. Segundo BRITTON et al. (1995), um

extrato orgânico (clorofórmio; acetona; etanol) apresentando 0,25 unidades de absorbância

corresponde, aproximadamente, a uma concentração de 1mg de carotenóide/mL em função do

coeficiente de absorvidade A1%1cm= 2500. O limite de sensibilidade na CLAE se situa na

faixa de 5 a 10 mg de carotenóide por litro (BRITTON et al., 1995). Os sistemas de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-Fase Reversa (CLAE-FR), atualmente são muito

utilizados, consistem de uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de

maior polaridade. O sistema de Fase Reversa apresenta várias vantagens, tais como: uso de

fases móveis menos tóxicas e de menor custo (ex. metanol e água); fases estacionárias

estáveis de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel;

facilidade de emprego de eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa

reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à separação de

solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas. A sílica ainda é

o óxido mais utilizado como suporte em CLAE-FR e muitos estudos vêm sendo feitos, para

tentar melhorar a sua estabilidade em pH extremo (TONHIet al., 2002). De um modo geral, as

fases estacionárias monoméricas produzem colunas com maior eficiência. As fases do tipo

poliméricas promovem colunas mais estáveis às condições variadas de fases móveis e com

maior seletividade, pois promovem um melhor recobrimento dos suportes (TONHI et al.,

2002).

A estrutura química mais freqüente dos carotenóides é aquela composta por 40 átomos

de carbonos (C40) ligados por diversas ligações duplas conjugadas. As variantes estruturais

destas moléculas são responsáveis pelas diferentes colorações que elas conferem ao tecido

que as acumula e por muitas de suas funções biológicas. A presença de um grande número de

ligações duplas conjugadas permite a caracterização de diferentes variantes estruturais por

meio da espectrofotometria na faixa de luz visível, com comprimentos de onda máximos de

absorção (l máx) entre 410 a 510 nm (STAHL & SIES, 1999). Uma limitação dos

procedimentos utilizando espectrofotômetro é que eles são utilizados para a determinação de

carotenóides totais e não podendo discriminar os vários tipos de carotenóides. Neste

20

procedimento, os carotenóides são inicialmente extraídos dos frutos utilizando-se solvente

orgânico, com posterior leitura no comprimento de onda variados. Os métodos

espectrofotométricos descritos na literatura são bastante precisos, entretanto muito trabalhosos

e demorados, sendo necessária à utilização de uma quantidade excessiva de reagentes


A colorimetria é uma técnica mais simples e rápida que as anteriores e que, embora de

menor precisão, pode ser empregada em larga escala para a seleção de genótipos com maiores

teores de carotenóides. Além da rapidez, esta técnica evita o dispêndio e os problemas de

descarte dos solventes orgânicos utilizados em outros métodos (CARVALHO et al., 2005).

Em tomateiro esta técnica tem sido amplamente utilizada para identificar e quantificar

licopeno em programas de melhoramento genético. Nesta técnica, a concentração de um

componente específico da amostra é determinada pela comparação da intensidade de cor da

amostra com a de um padrão. A amostra colorida tem características especiais de absorção de

luz que estão relacionados com o conteúdo de licopeno em frutos de tomate (CARVALHO et

al., 2005).

1.9. A Via Biossintética dos Carotenóides: Enzimas e Genes.

A via dos carotenóides, responsável pela biossíntese dos terpenos, um dos grupos do

metabolismo secundário, é uma das vias bioquímicas mais bem caracterizadas em plantas,

com vários genes já clonados e seqüenciados (CUNNINGHAM & GANTT, 1998). No

entanto, com algumas exceções (THORUP et al., 2000), o conhecimento destes genes ainda

não tem sido amplamente utilizado, em termos práticos, no melhoramento genético de

culturas de importância econômica visando aumentar o conteúdo de carotenóides. Esta

informação também ainda é pobremente explorada em estudos sobre a regulação desta

importante via biossintética em plantas (FONSECA & SIMON, 2004).

Uma característica em comum aos vários isoprenóides é a sua biossíntese a partir de

um metabólito central: o composto com cinco carbonos isopentenil pirofosfato (IPP). A

estrutura de 40 átomos de carbono (C40) de pigmentos carotenóides das plantas, por exemplo,

é sintetizada a partir de duas moléculas do composto C20 (geranilgeranil pirofosfato - GGPP),

o precursor imediato dos carotenóides que, por sua vez é sintetizado a partir de quatro

unidades de IPP. O GGPP também serve como precursor para várias outras ramificações da

via dos isoprenóides em plantas, tais como giberelinas, clorofila, tocoferol, filoquinonas e

pastoquinonas, representando o maior ponto de ramificação na formação destes diferentes

21

produtos. A enzima GGPP sintase (GGDS) responsável por este passo já teve, em plantas,

várias das seqüências gênicas que codificam suas isoformas identificadas. Em tomate esta

enzima já foi purificada a partir de cromoplastos e cloroplastos (CUNNINGHAM & GANTT,

1998).

Inicialmente acreditava-se que a biossíntese de IPP em todos os organismos vivos

ocorresse apenas através da via do ácido mevalônico (MVA). Entretanto, recentemente, uma

via alternativa e independente de MVA, conhecida como via metileritriol 4-fosfato (MEP), foi

identificada em bactérias e plastídios. No entanto, existem evidências de que, em plântulas, a

via MVA contribua de fato para a biossíntese de carotenóides (RODRIGUEZ-CONCEPCION

et al., 2004). Já em plantas fotossintéticas, os carotenóides são majoritariamente produzidos

pela via MEP (EISENREICH et al., 2001; LICHTENTHALER, 1999; RODRIGUEZ-

CONCEPCION & BORONAT, 2002).

A reação inicial da via MEP, catalizada pela deoxixilulose 5-fosfato (DXP) sintase

(DXS), envolve a produção de DXP a partir de piruvato e gliceraldeido 3-fosfato (GAP),

seguido por mais quatro passos enzimáticos, ocorrendo assim um rearranjo intramolecular e

por fim uma redução, produzindo finalmente uma mistura de 5:1 de IPP e dimetilalil difosfato

(DMAPP). As enzimas da via MEP são codificadas por genes nucleares, mas localizam-se nos

plastídios (EISENREICH et al., 2001; LICHTENTHALER, 1999; RODRIGUEZ-

CONCEPCION & BORONAT, 2002).

A Figura 1.2. ilustra a via biossintética dos carotenóides. A enzima fitoeno sintase

(PSY) catalisa a etapa de conversão de duas moléculas de GGPP em fitoeno pirofosfato

(PPPP) e então em fitoeno. O fitoeno é um composto incolor que possui a estrutura básica C40

dos carotenóides, e todas as reações subseqüentes na via envolvem transformações químicas

desta. Os genes que codificam PSY têm sido identificados e isolados em diversas plantas. Em

tomate, dois genes para esta enzima foram encontrados, as enzimas foram detalhadamente

caracterizadas bioquimicamente e observou-se a PSY-1 específica de cromoplasto e PSY-2-

específica de cloroplasto (FRASER & BRAMLEY, 2005). O fitoeno sofre uma seqüência de

quatro reações de dessaturação que resulta primeiro no fitoflueno e então no z-caroteno,

neurosporeno e licopeno. Duas enzimas catalisam essa seqüência de quatro reações em

plantas: fitoeno dessaturase (PDS) e z-caroteno dessaturase (ZDS). Em cromoplastos de

tomate é requerida a atividade adicional de uma enzima, a carotenóide isomerase (CRTISO),

para transformar todos os cis-licopeno (pró-licopeno), produzidos pela atividade de PDS e

22

ZDS, em seu isômero trans-licopeno (licopeno) encontrado em plantas (ISAACSON et al.,

2002).

Um ponto importante na ramificação da via de carotenóides é marcado pela ciclização

do licopeno. Em plantas e cianobactérias, a licopeno β-ciclase (LCYB), produto de um único

gene, catalisa a formação da molécula bicíclica β-caroteno a partir da molécula linear

licopeno, criando dois anéis β em suas terminações (FONSECA, 2000). Em outra

ramificação, a licopeno ε-ciclase (LCYE), outra enzima responsável também pela ciclização,

adiciona um anel epsilon no licopeno e produz δ-caroteno. A adição de um anel β na outra

terminação do δ-caroteno, catalisada pela LCYB, leva à produção do α-caroteno

(CUNNINGHAM & GANTT, 2001). Carotenóides com dois anéis epsilon não são

comumente encontrados em plantas. Uma exceção é a lactucaxantina, um ε-carotenóide de

alface. O interessante é que a enzima LCYE de alface demonstra homologia com a proteína

de Arabidopsis e tomate que produz o bicíclico ε-carotenóide mais do que o δ-caroteno a

partir do licopeno (CUNNINGHAM & GANTT, 2001).

Em tomate duas enzimas licopeno β-ciclase foram isoladas, sendo uma delas expressa

especificamente em cromoplasto (RONEN et al., 2000). A hidroxilação na posição C-3 de

cada anel de β-caroteno e α-caroteno produz as xantofilas zeaxantina e lutéina, via β-

criptoxantina e α-criptoxantina respectivamente. Em tomate, duas hidroxilases homólogas as

de Arabidopsis foram encontradas (TIAN et al., 2004). A zeaxantina é convertida em

violaxantina via anteraxantina, pela introdução do grupo 5,6- epoxi na posição 3-hidroxi do

anel β, uma reação catalisada pela enzima zeaxantina epoxidase (ZEP). Sua seqüência gênica

já foi identificada em tomate. Sob excesso de luz a violaxantina de-epoxidase (VDE) catalisa

a reação de de-epoxidação que transforma violaxantina de volta para zeaxantina. Em

condições de pouca luz ocorre a interconversão desta reação, de forma reversível, conhecida

como ciclo da violaxantina (DEMMIG-ADAMS et al., 1996).

O último passo na via de biossíntese de carotenóides é transformar a violaxantina em

neoxantina pela atividade da neoxantina sintase (NSY). Em tomate, a seqüência do gene para

NSY já foi isolado (AL-BABILI et al., 2000). Além disso, a seqüência de aminoácidos

deduzida em tomate para NSY é idêntica a CYCB, levando à especulação dessa enzima ser bi-

funcional sob certas condições. Em tomate, não foi detectada outra atividade de NSY, sendo

esta capaz de sintetizar neoxantina em mutantes com gene CYCB defectivo (RONEN et al.,

2000).

23

FIGURA 1.2. Visão esquemática da via biossintética de carotenóides em plantas.

1.10. Genética, Biologia Molecular e Regulação da Biossíntese de Carotenóides em

Tomate.

Desde 1940, diversas mutações simples que afetam a pigmentação do fruto têm sido

caracterizadas em tomate (LINCOLN & PORTER, 1950). Os frutos do gênero Solanum seção

Lycopersicon possuem uma ampla variedade de cores variando de verde, a amarelo e

vermelho. O processo de amadurecimento em tomates envolve uma complexa e coordenada

série de mudanças na pigmentação e atributos sensoriais resultantes das atividades fisiológica

e bioquímica dos frutos (LURIE et al., 1996). A coloração externa do tomate é o resultado da

pigmentação da polpa e da casca. Visto que a cor é um indicador do estádio de maturação do

tomate, várias cartas de cores e escalas subjetivas têm sido desenvolvidas para classificação

Isopentenil difosfato (IPP) (C )

IPP isomerase

5 IPP (C 5 )

20 GGPP (C )

Geranilgeranil difosfato sintase (GGPP) sintase

) GGPP (C 20

Fitoeno (C 40

)

Fitoeno desaturases

Licopeno

5

d - caroteno

a - caroteno

g - caroteno

b - caroteno

Fitoeno sintase

Licopeno e - ciclase

Giberelina

Tocoferol

Clorofila

Dimetilalil difosfato (DMAPP)

Luteína Zeaxantina

Violaxantina

Neoxantina

Licopeno b - ciclase

Fitoeno

Licopeno Alfa - Caroteno

Beta - Caroteno

OH β-Criptoxantina

β-caroteno hidroxilase

β-Criptoxantina α-Criptoxantina

α-caroteno hidroxilase

Licopeno b - ciclase

24

dos estádios de maturação de tomates (GRIERSON & KADER, 1986). A mudança visível

mais flagrante durante o amadurecimento de tomates é a modificação na sua coloração, ditada

pela degradação de clorofila e síntese de licopeno e β-caroteno (HOBSON & GRIERSON,

1993). Durante o desenvolvimento do fruto, o nível de mRNA dos genes que codificam as

enzimas fitoeno sintase (PSY) e fitoeno dessaturase (PDS) que levam a produção do licopeno

aumentam, enquanto que o nível de mRNA para os genes da licopeno β-ciclase e licopeno ε-

ciclase que converte licopeno para β-caroteno e δ-caroteno, respectivamente, declinam e

desaparecem completamente (RONEN, 1999).

As cores das espécies de tomate diferem do amarelo para o vermelho alaranjado,

dependendo da razão licopeno/β-caroteno da fruta, que também está associada com a presença

da enzima licopeno β-ciclase, a qual participa desta transformação (BOTELLA-PAVÍA &

RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). Em organismos fotossintéticos, a licopeno-β-ciclase é

codificada pelo gene crtL e nos não fotossintéticos pelo, gene crtY ou lyc. Ambas as enzimas

introduzem, seqüêncialmente, dois anéis para formação de β-caroteno. A proteína CrtY tem

massa molecular de 43kDa, enquanto que a CrtL tem de 46-56 kDa e apresentam-se muito

diferentes em relação às suas estruturas primárias, com apenas três pequenas seqüências

conservadas (SIEIRO et al., 2003). VERDOES et al. (1999) descreveram uma nova enzima

para biossíntese de carotenóides codificada pelo gene CrtYB ou B. O gene B, responsável pelo

fenótipo Β (acúmulo de carotenóides) em tomate, foi mapeado no cromossomo 6, próximo ao

locus self-pruning (sp). O fato de o gene CrtL não co-segregar com o lócus B contraria a

possibilidade de uma mutação na licopeno β-ciclase, codificada por CrtL, ser responsável pelo

fenótipo (HIRSCHBERG et al., 2001). Várias evidências indicam que o gene B é responsável

pelo fenótipo tais como: o fato de a seqüência B co-segregar com o fenótipo, assim como a

propriedade de B codificar uma enzima como licopeno β-ciclase, que pode promover a

acumulação de β-caroteno. Além disso, foi observado um elevado nível de mRNA (ácido

ribonucléico mensageiro) do genes B em frutos. Por fim, transgênicos expressando o gene B

em plantas selvagens resultaram em um fenótipo similar ao Β em alguns tecidos do fruto

(RONEN et al., 2000). Duas enzimas licopeno β-ciclase foram isoladas em tomate: uma

codificada pelo gene CrtL, a qual diminui sua atividade com o desenvolvimento do fruto

(PECKER et al., 1996) e uma codificada pelo gene B, sintetizando β-caroteno de novo

durante o desenvolvimento do fruto. Os polipeptídios destas duas enzimas são praticamente

do mesmo tamanho, 500 e 498 aminoácidos respectivamente. Os genes não apresentam

introns e suas seqüências de aminoácidos são 53% idênticas. O gene B é expresso somente em

tecido que contém cromoplasto. (RONEN et al., 2000).

25

A maioria dos carotenóides em tomate cultivado é licopeno (aproximadamente 90%),

com poucas quantidades de β-caroteno (5-10%), lutéina e fitoeno. Nos frutos de old-gold-

crimson (ogc ou b alelo recessivo) falta essencialmente β-caroteno, ao passo que frutos Β (B

alelo dominate) contêm 45% a mais de β-caroteno. Estes dados indicam que a biossíntese de

β-caroteno, específica de cromoplasto, em frutos de tomate é contrariamente modificada pelos

genes og e B (RONEN et al., 2000). A caracterização de bases moleculares em mutantes de

frutos de tomates, com pigmentação alterada como delta (del), Βeta (B) e old-gold-crimson

(ogc), ilustra claramente a importância da regulação transcricional dos genes biossintéticos

para produção de carotenóides em frutos de tomate. No primeiro caso, os frutos ficam com

uma coloração alaranjada, parecida com a da cenoura. No segundo caso, o acúmulo de delta-

caroteno produziu frutos de coloração vermelho alaranjado. No terceiro caso, o mutante no

fruto com total ausência de atividade de β-ciclase, possui mais licopeno do que o tomate

comum (não mutante). Contudo, a quase ausência dessa enzima em frutos como a goiaba e a

melancia, faz com que eles acumulem licopeno e adquira uma coloração vermelha

característica (RONEN et al., 1999; RONEN et al., 2000). Entretanto, o acúmulo de caroteno

pode ser resultado de vários mecanismos regulatórios (CUNNINGHAM & GRANTT, 1998),

no qual além da regulação transcricional, outros mecanismos podem ser importantes, bem

como, o seqüestro destes produtos (CARVALHO et al., 2004).

Nos carotenóides a cadeia de polieno e outras características estruturais influenciam

suas propriedades químicas, a localização e orientação no interior da bicamada lipídica em

ambientes biológicos. Em cromoplastos, a deposição de carotenóides pode levar a alterações

deletérias das propriedades físico-químicos das membranas. Para evitar este efeito, os

cromoplastos apresentam sítios de depósitos de carotenóides no estroma. São os

plastoglóbulos (glóbulos de lipídeos) ligados as membranas e as proteínas fibrilinas

(associadas a corpos carotenóides) que têm por função auxiliar no transporte ou modificação

dos carotenóides e estabilizar as estruturas dos plastídios (cromoplastos) em folhas e frutos. A

formação de cristais de carotenóides, como ocorre no caso do licopeno, é mais uma expressão

celular do seqüestro de carotenóides (CAMARA et al., 1995). Desta forma, fica evidente que

a identificação e o conhecimento de proteínas associadas à cromoplastos poderão contribuir

com o arsenal de tecnologias disponíveis para manipular os produtos da via biossintética dos

carotenóides em pesquisas de trangenes, visando a melhor compreensão da regulação

diferencial do acúmulo destes pigmentos.

26

1.11. Melhoramento de Tomate para Modificar Teores e Tipos de Carotenóides.

O tomateiro cultivado (Solanum lycopersicum L.) apresenta um papel de destaque

quanto ao aspecto de participação na dieta humana. O tomateiro tem sido considerado, no

ponto de vista do melhoramento genético, como uma planta modelo, uma vez que apresenta

diversos mutantes tanto para teor como para tipo de carotenóides (RONEN et al., 1999; 2000;

GIORDANO et al., 2003). Visando disponibilizar aos consumidores cultivares com melhores

propriedades nutritivas, a cultivar ‘San Vito’, utilizando ainda como ferramenta o

melhoramento clássico, foi um dos primeiros resultados destas ações de pesquisa, do

segmento varietal Italiano, totalmente desenvolvido no Brasil. O tomate ‘San Vito’ contém 61

µg g-1 de licopeno, apresentando-se superior no conteúdo de licopeno, quando comparado a

outros tomates cultivados, com média de 30 µg g-1 (GIORDANO et al., 2006). O desafio

agora é incorporar a característica de elevados teores de licopeno em cultivares do tipo longa-

vida.

Recentemente foi anunciado o desenvolvimento do híbrido ‘Doce Vita’ (TORRES et

al., 2007). Este material é um híbrido de porte compacto resultante do cruzamento entre uma

linhagem de entrenós curtos contendo o gene Β e uma linhagem com o fenótipo “anão”. O

gene Β foi introduzido em tomateiro através de cruzamentos interespecíficos com a espécie S.

habrochaites f. glabratum (= L. hirsutum f. glabratum) (LINCOLN & PORTER, 1950).

Acessos que contêm o gene Β possuem frutos com uma coloração alaranjada devido à maior

acumulação do carotenóide β-caroteno (precursor da vitamina A) ao invés de apresentarem

frutos com a típica coloração vermelha, resultantes da acumulação predominante de licopeno.

Apesar da qualidade nutricional das frutas e hortaliças, ricas em vitaminas, sais

minerais, fibras e nutracêuticos, estas ainda não fazem parte da dieta da maioria dos

brasileiros. O estímulo a um consumo mais intenso de frutas e hortaliças, e mais

especificamente do tomate enriquecido com licopeno, não depende apenas dos teores deste

carotenóide. Faz-se necessário que o tomate apresente atributos sensoriais que motivem e

intensifiquem o seu consumo. Desta forma, híbridos que combinem aspectos capazes de

estimular positivamente os principais sentidos humanos envolvidos na degustação do tomate,

incluindo sensações tácteis, gustativas, visuais, aromáticas e com aspectos agronômicos

favoráveis, serão os grandes líderes em um mercado que apresenta crescentes níveis de

exigência (CARVALHO et al., 2006).

27

1.12. Genômica e Seleção Assistida por Marcadores Derivados de Genes da Via

Biossintética dos Carotenóides em Tomateiro.

O genoma nuclear do tomate compreende 12 pares de cromossomos e

aproximadamente 950 Mbp de DNA (59% das seqüências são não-codantes, 11%

transposons, 28% seqüências codantes e 2% seqüências organelares) (WANG et al., 2005).

Aproximadamente 77% do DNA cromossomal está localizado na região heterocromática

centromérica, que é destituída de genes (WANG et al., 2005). Estima-se que o genoma do

tomate expresse aproximadamente 35.000 genes (PETERSON & STACK, 1998; VAN DER

HOEVEN et al., 2002). Atualmente os 12 pares de cromossomos do tomateiro estão sendo

seqüenciados por um consórcio internacional de 10 países, incluindo a China (responsável

pela seqüência do cromossomo 3); França (cromossomo 7); Índia (cromossomo 5); Itália

(cromossomo 12); Japão (cromossomo 8); Coréia (cromossomo 2); Holanda (cromossomo 6);

Espanha (cromossomo 9); Inglaterra (cromossomo 4) e os Estados Unidos (cromossomos 1,

10 e 11). Este esforço é parte de uma grande iniciativa realizada pelo Projeto Genoma

Internacional Solanaceae (International Solanaceae Genome Project – SOL). Concomitante,

outros estudos genômicos estão sendo conduzidos para tomate, incluindo esforços para gerar

dados de “Expressed Sequence Tags” – ESTs (SOL, 2007), e ainda seqüências genômicas de

bibliotecas do tipo “Bacterial Artificial Chromosome” – BACs (SOL, 2007).

Devido à importância dos carotenóides, as enzimas da via biossintética destes

pigmentos tem sido completamente caracterizadas e os genes clonados e seqüenciados em

uma ampla gama de espécies, incluindo o tomate (FRASER & BRAMLEY, 2004).

Marcadores moleculares para vários alelos relacionados a mutações destes genes que resultam

em acúmulo diferencial de carotenóides (GALPAZ et al., 2006; ZHANG & STOMMEL,

2001) e mecanismos de regulação da via biossintética no fruto (SANDMAN et al., 2006) tem

sido descritos e mapeados (LIU et al., 2004). No entanto, não foram encontrados marcadores

moleculares ligados ao acúmulo diferencial de carotenóides tanto em frutos de tomate

cultivado quanto em espécies selvagens.

Na Embrapa Hortaliças, iniciadores de síntese para seqüências gênicas

correspondendo aos genes codificando as enzimas da via biossintética dos carotenóides

fitoeno sintase, fitoeno desaturase, epsilon ciclase e β-ciclase já estão disponíveis e sendo

utilizados na investigação da diversidade alélica em linhagens e híbridos com teores e tipos

contrastantes de carotenóides, visando à identificação de polimorfismos ao nível de DNA


28

A principal classe de marcador resultante deste tipo de prospecção gênica são os

chamados SNPs (“single nucleotide polymorphisms” = polimorfismo de base única). Os SNPs

correspondem à posição onde existe uma modificação das bases nitrogenadas dos

nucleotídeos, A (adenina), T (tiamina), C (citosina) e G (guanina), em uma freqüência alélica

mínima de 1% numa dada população (BROOKES, 1999). Os marcadores moleculares

poderão ser empregados em sistemas de seleção assistida e na identificação de acessos das

espécies semi-domesticadas e selvagens com propriedades nutricionais superiores, que

venham a contribuir em programas de biofortificação nutricional e nutracêutica. Além disso,

estes marcadores SNPs podem ser utilizados para analisar níveis de diversidade genética e

relações filogenéticas inter-específicas e intra-específicas (CARVALHO et al., 2004). As

mutações dos SNPs são de ponto, sendo do tipo transição (substituição de uma purina por

uma purina ou de uma pirimidina por outra pirimidina) ou do tipo transversão (substituição de

uma purina por uma pirimidina e vice-versa) (KWOK & GU, 1999). Em regiões

codificadoras, quando resultam em uma substituição de aminoácidos, são denominados SNPs

não-sinônimos, a substituição podendo ser conservativa e não conservativa, em função das

características dos aminoácidos envolvidos na troca. Nesses casos podem ocorrer

modificações estruturais e funcionais nas proteínas. As modificações que não alteram o

aminoácido são conhecidas como sinônimas, embora possam ocasionar conseqüências

genéticas devido á alteração do mRNA, da tradução e da expressão gênica (KWOK & GU,

1999). Os SNPs podem ser identificados por seqüenciamento. Após a identificação é

necessário validá-los, ou seja, determinar a freqüência de um dado SNP em um grupo de

indivíduos, certificando-se da sua natureza polimórfica (BROOKES, 1999). A grande

vantagem dos SNPs reside na abundância deste tipo polimorfismo em diversos genes

analisados.

1.13. Considerações Finais e Objetivos do Trabalho.

Do ponto de vista do melhoramento genético do tomateiro, a cor vermelha intensa (em

geral diretamente relacionada com a concentração de licopeno) está associada com a melhoria

da percepção visual dos produtos e atributos sensoriais superiores (LEWINSOHN et al.,

2005). Dados recentes indicam que a clivagem dos carotenóides in vivo resulta na formação

de compostos voláteis que conferem sabor e aroma mais acentuados e atrativos (SIMKIN et

al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desta forma, existe uma forte demanda para o aumento

da concentração de licopeno no fruto do tomate tanto para o consumo in natura (ARIAS et

29

al., 2000) como para produtos processados (CARVALHO et al., 2005). Como mencionado,

alguns acessos de tomateiro também acumulam β-caroteno (com função de pró-vitamina A).

No entanto, informações sobre a acumulação de outros carotenóides com propriedades

antioxidantes e/ou com ação de pró-vitamina A em acessos de Solanum (seção Lycopersicon)

ainda são escassas na literatura. A grande variabilidade genética e fenotípica para teor e tipos

de carotenóides existente em espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon tem

possibilitado o desenvolvimento de cultivares para atender as mais diversas demandas do

mercado de tomate para processamento e para consumo in natura. Neste contexto, este

germoplasma pode servir com fontes de genes em programa de melhoramento genético

visando o desenvolvimento de cultivares mais ricas em pigmentos com valor

nutricional/nutracêutico. Um dos focos do programa de melhoramento genético de tomate da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Hortaliças tem sido diversificar a

disponibilidade destes pigmentos nas novas cultivares e nos novos híbridos. A estratégia é

disponibilizar aos consumidores materiais genéticos que combinem as três características

funcionais dos alimentos, a função primária (organoléptica/sensorial: sabor, textura, cor e

aroma), a função secundária (nutricional: composição química) e a função terciária (alegação

de saúde: nutracêuticos). Para atingir tais objetivos de maneira eficiente, é necessário

estabelecer uma plataforma genética/genômica que auxilie os processos de seleção de

materiais genéticos com atributos nutricionais e/ou nutracêuticos superiores. Esta dissertação

é um componente deste esforço de pesquisa.

30

CAPÍTULO 02

Análise bioquímica do conteúdo e composição de carotenóides em frutos maduros de

espécies silvestres e cultivadas de Solanum (seção Lycopersicon: Solanaceae).

2.0. Introdução.

Os carotenóides são pigmentos lipossolúveis vermelhos, alaranjados e amarelos

encontrados embebidos em membranas de cloroplastos e cromoplastos (BARTLEY &

SCOLNIK, 1995; HIRSCHBERG, 2001). Estes pigmentos têm papel essencial na célula

vegetal permitindo que moléculas de água atuem como redutoras na fotossíntese. Os produtos

da oxidação da água reagem com a molécula da clorofila produzindo oxigênio reativo que

pode causar danos celulares consideráveis (CONN et al., 1991; BARTLEY & SCOLNIK,

1995). Os carotenóides atuam como antioxidantes do oxigênio, clorofila e ânions superóxidos,

permitindo que duas funções essenciais na planta, a absorção de luz durante a fotossíntese e a

conversão de luz em energia química, ocorram sem comprometimento da estrutura celular

(CONN et al., 1991; DEMMIG-ADAMS & ADAMS III, 2002). Os carotenóides

desempenham outros papéis fisiológicos e bioquímicos relevantes, sendo precursores de

alguns hormônios vegetais, clorofila e vitaminas (MILLBORROW, 2001; FESTER et al.,

2002; BOUVIER et al., 2003; GIULIANO et al., 2003). Os diferentes carotenóides também

fornecem as cores necessárias para guiar polinizadores para flores e atrair para os frutos os

agentes de dispersão de sementes (HIRSCHBERG, 2001). Outras funções dos carotenóides

têm sido sugeridas, incluindo a estabilização das membranas dos tilacóides (ex. carotenóide

zeaxantina) e a função estrutural da oligomerização dos complexos de absorção de luz durante

a montagem do complexo fotossintético (ex. luteína) (BRITTON, 1995; POGSON et al.,

1996).

Na nutrição humana, alguns carotenóides como o β-caroteno, α-caroteno e a

criptoxantina são convertidos em vitamina A (retinol) após clivagem enzimática e redução no

trato digestivo. Outros carotenóides (ex. licopeno, luteína e zeaxantina) são poderosos

antioxidantes e têm sido associados com a redução na incidência de certos tipos de câncer,

doenças vasculares e de problemas de visão (SMIDT & BURKE, 2004). Derivados

oxigenados dos carotenóides (coletivamente chamados de xantofilas) tais como luteína,

violaxantina, neoxantina e zeaxantina, quando ingeridos em quantidades suficientes na dieta,

também apresentam efeitos antioxidantes benéficos, amenizando sintomas de uma série de

doenças associadas com o envelhecimento celular (SMIDT & BURKE, 2004). A luteína e a

31

zeaxantina podem atuar combatendo os riscos de degeneração macular, incluindo a catarata

(SEDDON et al., 1994; SMIDT & BURKE, 2004; TRUMBO & ELLWOOD, 2006).

O principal carotenóide presente em frutos maduros do tomate cultivado (Solanum

lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum Mill.) é o pigmento vermelho licopeno (FRASER

et al., 1994). Os frutos e os produtos processados do tomate são as principais fontes de

licopeno na dieta humana (STAHL & SIES, 1992; RAO et al., 1998). As propriedades únicas

da molécula do licopeno (C40H56), que contem sete ligações duplas conjugadas, fazem deste

pigmento um dos mais poderosos antioxidantes na proteção das células contra radicais livres

(RAO, 2002). Desta forma, o licopeno é mais eficiente na eliminação de oxigênio reativo do

que o β-caroteno e outros antioxidantes conhecidos (DI MASCIO et al., 1989). Além disto,

existe um número crescente de dados mostrando que a ingestão de quantidades adequadas de

licopeno está associada com a diminuição do risco de muitos tipos de doenças degenerativas,

cardiovasculares e de câncer em seres humanos (CLINTON, 1998; NGUYEN &

SCHWARTZ, 1999; CRAMER et al., 2001; RAO, 2002; SMIDT & BURKE, 2004). Os

benefícios do licopeno na dieta humana não são condicionados exclusivamente ao seu papel

como antioxidante. Dados recentes mostram que o licopeno também atua na comunicação

intercelular e na modulação hormonal do sistema imune (KUN et al., 2006).

Do ponto de vista do melhoramento genético do tomateiro, a cor vermelha intensa (em

geral diretamente relacionada com a concentração de licopeno) está associada com a melhoria

da percepção visual dos produtos e atributos sensoriais superiores (LEWINSOHN et al.,

2005). Dados recentes indicam que a clivagem dos carotenóides in vivo resulta na formação

de compostos voláteis que conferem sabor e aroma mais acentuados e atrativos (SIMKIN et

al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desta forma, existe uma forte demanda para o aumento

da concentração de licopeno no fruto do tomate tanto para o consumo in natura (ARIAS et

al., 2000) como para produtos processados (CARVALHO et al., 2005). O teor de carotenóides

com função de pró-vitamina A (ex. β-caroteno) em frutos vermelhos de tomate é

relativamente baixa comparada com outras hortaliças (BHASKARACHARY et al., 1995).

Informações sobre a acumulação de α-caroteno em acessos de Solanum (seção Lycopersicon)

ainda são escassas na literatura. No entanto, o intenso consumo de frutos e produtos derivados

de tomate faz desta hortaliça uma das maiores fontes de pró-vitamina A na dieta humana

(SIMON, 1992).

Os tomates [gênero Solanum L. (seção Lycopersicon)] são nativos da parte oeste da

América do Sul e têm sua distribuição geográfica compreendendo da parte central do Equador

até o Peru, norte do Chile e Ilhas Galápagos (RICK, 1979). Os frutos das espécies do gênero

32

Solanum Lycopersicon apresentam uma notável variação de cores, com um espectro de

tonalidades passando pelo verde, amarelo, laranja até o vermelho intenso. No passado, o

sistema taxonômico do gênero Lycopersicon compreendia nove espécies e duas subdivisões

principais (Eulycopersicon e Eriopersicon), definidas pela possibilidade de cruzamentos,

tamanho e cor de frutos maduros (RICK et al., 1986; WARNOCK, 1988). Em um tratamento

taxonômico mais recente, PERALTA & SPOONER (2001) examinaram as relações

filogenéticas de espécies selvagens de tomate e de taxa relacionadas empregando dados

morfológicos, moleculares (comparação de seqüências de DNA do gene estrutural da sintase

de amido – “granule-bound starch synthase” – GBSSI) e também informações sobre ecologia

e localização geográfica. As descrições morfológicas são, em muitas situações, suficientes

para a identificação das espécies examinadas, sendo que a coloração do fruto maduro

(resultante de diferentes combinações de carotenóides) ainda permanece como o principal

caráter analisado nestes estudos (PERALTA & SPOONER, 2001).

O germoplasma de espécies selvagens tem sido amplamente utilizado para o

melhoramento do tomate cultivado, visando resistência a pragas e doenças (NAGAI et al.,

1992). Existem vários estudos envolvendo a genética da intensificação da cor vermelha do

fruto do tomate bem como estudos de caracterização fenotípica, genética e molecular da

composição de frutos do tomate cultivado. Existem na literatura muitos estudos indicando que

macromutações derivadas de espécies selvagens podem modificar de modo intenso a

coloração dos frutos do tomateiro (KABELKA et al., 2004). No entanto, existem poucos

exemplos de tentativas de manipular geneticamente a composição e o balanço de carotenóides

visando aumentar o valor nutricional nos frutos do tomateiro cultivado via genes oriundos de

espécies selvagens (LICOLN & PORTER, 1950; MACKINNEY et al., 1954; TOMES et al.

1954; STOMMEL & HAYNES, 1994).

A maioria das espécies selvagens de tomate possui frutos maduros de cor verde, sendo

que algumas destas apresentam frutos amarelos e vermelhos, indicando a existência de uma

diversidade natural de teores e tipos de carotenóides neste grupo taxonômico. Acessos destes

materiais exóticos podem representar valiosas fontes de genes para o melhoramento, visando

alterar o balanço e/ou aumentar o conteúdo de carotenóides nos frutos do tomateiro cultivado.

Neste capítulo, frutos de espécies selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon:

Solanaceae] mostrando um amplo espectro de cores de fruto maduro foram avaliados via

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com o objetivo de gerar um catálogo

detalhado sobre a composição e o conteúdo dos principais pigmentos carotenóides em acessos

de espécies Solanum (Seção Lycorpesicon).

33

2.1. Materiais e Métodos.


O presente estudo utilizou frutos de acessos de espécies selvagens com uma diversa

gama de cores variando de verde (S. habrochaites, S. chilense, S. peruvianum, S. neorickii e S.

pennellii), ao amarelo [S. pimpinellifolium (mutante de fruto amarelo), S. galapagense e S.

cheesmaniae] e ao vermelho (S. pimpinellifolium, S. lycopersicum e S. lycopersicum var.

cerasiforme). Os tomates foram cultivados em casa de vegetação na Embrapa Hortaliças, sob

controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando entre 21oC e 30oC e

temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada iluminação complementar.

As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com solo esterilizado. O Quadro

2.1. descreve a coloração característica dos frutos de cada acesso, a nomenclatura clássica das

espécies dentro do gênero Lycopersicon e a atual nomenclatura dentro do gênero Solanum. O

conteúdo de carotenóides nos frutos de tomate varia durante a maturação (Figura 2.1.,

FRASER et al., 1994).

Desta forma, foram coletados somente os frutos completamente maduros (mudança

completa de cor, mas com frutos ainda firmes). No caso dos frutos verdes, os frutos caídos

e/ou próximos de cair da planta (indicando maturação completa) foram os colhidos para a

extração de carotenóides. Logo após a colheita, os frutos utilizados para os estudos de

identificação, composição e conteúdo de carotenóides foram estocados à –20 ºC, protegidos

por papel alumínio e mantidos no escuro. No momento da análise, os frutos foram

descongelados, homogeneizados e pesados.

FIGURA 2.1. Seis diferentes estádios de maturação do fruto de tomateiro. Fonte: (http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/659/1/FERREIRA-2004-DEF.pdf DEF.)

34

QUADRO 2.1. Identificação e características de coloração de fruto do germoplasma de tomate utilizado neste estudo.

Acessos Espécie de Lycopersicon Espécie de Solanum Cor do fruto maduro

CNPH 1037 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium amarelo

CNPH 796 L. pimpinellifolium

S. pimpinellifolium vermelho

CNPH 1025 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho


S. pimpinellifolium

vermelho

LA 1614 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho

CNPH 1040 L. pimpinellifolium S. pimpinellifolium vermelho



S. pimpinellifolium

vermelho



CNPH 1304 L. esculentum S. lycopersicum vermelho

CNPH 1593 L. esculentum var. cerasiforme S. lycopersicum vermelho




LA 1954 L. peruvianum S. peruvianum verde

CNPH 1035 L. peruvianum S. peruvianum verde




CNPH 945 L. parviflorum S. neorickii verde escuro

CNPH 432 L. cheesmanii f. minor S. galapagense amarelo

CNPH 944 L. cheesmanii S. cheesmaniae amarelo claro

CNPH 410 L. chilense S. chilense verde

CNPH 421 L. hirsutum S. habrochaites verde claro



CNPH 409 L. pennellii S. pennellii verde

Tospodoro L. esculentum S. lycopersicum vermelho



HEM 54 L. esculentum S. lycopersicum vermelho

CNPH 1502 L. esculentum S. lycopersicum vermelho alaranjado

*No presente estudo não separamos S. peruvianum de Solanum arcanum e S. huaylasense (PERALTA et al., 2005).

35

2.1.2. Extração dos Carotenóides.

Foram utilizados, em média, três frutos de cada acesso/espécie citada, para obtenção

de 2 g de tecido homogeneizado contendo polpa e casca. As sementes foram removidas. O

método de extração foi conduzido de acordo com o procedimento descrito por RODRIGUEZ-

AMAYA (2001). Nestas amostras foram adicionados 40 mL de acetona (repetidas vezes) até

a total extração dos carotenóides da matriz na qual se encontravam (monitorada por meio da

mudança de cor do tecido). Neste passo as amostras foram homogeneizadas com o auxílio de

um extrator (Polytron, Kinematica). Em seguida, procedeu-se à filtragem a vácuo, com o

auxílio de um kitassato envolto com papel alumínio para evitar a foto-oxidação dos

pigmentos. A partição dos carotenóides foi feita usando éter de petróleo. Ao funil de

separação adicionaram-se 45 mL de éter de petróleo e os pigmentos foram transferidos, em

pequenas frações, seguidas de água destilada, para o funil de separação, descartando-se a fase

inferior até a total remoção da acetona. A solução dos pigmentos em éter de petróleo foi

transferida para um balão volumétrico de 100 mL, sendo posteriormente evaporada em um

evaporador rotatório. Os carotenóides foram redissolvidos em 2 mL de acetona grau

HPLC/CLAE. Após filtração em um filtro hidrofóbico (Millex – FH – Millipore, PTFE, 0.45

mm), uma amostra de 20 mL desta solução foi imediatamente injetada no cromatógrafo.

2.1.3. Análise dos Carotenóides.

As análises foram feitas em triplicatas. O método de análise dos carotenóides foi

conduzido de acordo com o procedimento descrito por RODRIGUEZ-AMAYA (2001). O

sistema CLAE consiste de um computador com sistema de dados (Class VP-Shimadzu), um

auto-injetor de amostra e um detector visível/ultravioleta com arranjo de fotodiodo

(Shimadzu). Na análise por CLAE, a separação foi feita de forma isocrática em uma coluna

monomérica C18 (Spherisorb S3 ODS2) de fase reversa 3 mm, 4.6 x 150 mm. A fase móvel

foi composta por acetonitrila:metanol:etil acetato (8:1:1). O fluxo da fase móvel foi de 0.8

mL/min e o tempo total de corrida de 60 min. Trietilamina (0,05%) foi adicionada à fase

móvel, como recomendado por HART & SCOTT (1995) para melhorar a recuperação dos

carotenóides da coluna.

2.1.4. Identificação dos Carotenóides.

Um foto detector do tipo fotodiodo (PDA – “photodiode array detector”) UV-vis

(ultravioleta – visível) foi programado para quantificar e identificar carotenóides a 470 nm.

36

Esta identificação foi baseada no uso combinado do tempo de retenção (tR) e o espectro de

absorção ultravioleta e visível obtido pelo foto detector fotodiodo. Foi também utilizada a

porcentagem da razão III/II, no qual o II é a altura do segundo pico em absorbância, visto no

espectro de identificação do carotenóide, e III é a altura do terceiro pico em absorbância,

tomando o mínimo entre os dois picos como linha de base (Figura 2.2.). Estes dados foram

comparados com os valores disponíveis em literatura para os principais pigmentos observados

(BRITTON, 1995)

350 400 450 500 550 Comprimento de onda (nm)

FIGURA 2.2. Obtenção da estrutura fina do espectro de carotenóides (BRITTON, 1995)

2.1.5. Obtenção de Padrões Externos.

Os padrões de carotenóides foram purificados através de cromatografia em coluna

aberta (CCA), empacotada com MgO:hyflosupercel (1:2), a partir de tomate (licopeno),

rúcula (luteína) e cenoura (β-caroteno e α-caroteno) e previamente quantificados por

espectrometria para o estabelecimento da curva de calibração (RODRIGUEZ-AMAYA,

2001). A concentração dos padrões de carotenóides foi calculada usando-se a fórmula de

Lambert-Beer (Figura 2.3.). A qualidade dos padrões foi determinada pela determinação de

pureza das amostras avaliadas em HPLC. A pureza de todos os padrões obtidos foi acima de

95%.

% III/II=III/II x 100

II III Ab

sorb

ânc

ia

0 0

37

mg/ml = absorbância máxima x volume de solução x 106

102 x A%1cm x volume de solução

FIGURA 2.3. Fórmula de LAMBERT-BEER para cálculo da concentração de carotenóides.

2.1.6. Determinação do Conteúdo dos Carotenóides.

O conteúdo dos carotenóides foi calculado através de curvas de calibração construídas

de cinco pontos com concentrações crescentes de quatro pigmentos (luteína, licopeno, β-

caroteno e α-caroteno). Cada ponto foi obtido da média de três corridas de uma quantidade

pré-determinada de carotenóide analisada. A quantificação foi obtida utilizando o programa

de quantificação do class vp. As áreas dos picos obtidas nos cromatogramas dos padrões e das

amostras dos frutos de tomate foram integradas automaticamente. A fórmula obtida para cada

carotenóide foi:

Luteína (mg) = 2,19275*10-5* Área do pico

b-caroteno (mg) = 2,61523*10-5* Área do pico

a-caroteno (mg) = 59478*10-5* Área do pico

Licopeno (mg) = 2,61645*10-5* Área do pico

Os pontos utilizados tiveram coeficientes de variação menor que 5% e os coeficientes

de correlação entre área e concentração de carotenóide permaneceram muito próximos do

valor 1,0. A quantidade de zeaxantina nas amostras foi estimada indiretamente usando a curva

de luteína. Os valores da área do pico de zeaxantina foram corrigidos através de um fator de

conversão obtido pela razão entre o coeficiente de extinção da luteína (0,2550) e o da

zeaxantina (0,2540), sendo (1,003937).

38

2.2. Resultados e Discussão.

Os frutos do gênero Solanum seção Lycopersicon possuem uma ampla variedade de

cores (Figura 2.4). A Figura 2.5. ilustra o espectro característico dos carotenóides luteína, β-

caroteno, α-caroteno, xantofila e licopeno, os quais compuseram a biblioteca montada no

programa Class Vp, utilizada na identificação dos carotenóides nos acessos estudados. A

identificação dos carotenóides foi baseada na similaridade dos espectros observados nas

amostras com estes espectros, com o tempo de retenção (tR) e com a estrutura fina espectral

(BRITTON, 1995). O Quadro 2.3. apresenta as médias dos conteúdos dos diferentes

carotenóides nos frutos de espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon.

A

FIGURA 2.4. Variedade de cores dos frutos maduros das espécies (A) S.

peruvianum; (B) S. pimpinellifolium e (C) S. cheesmaniae. Fonte: Acervo de fotos

da Embrapa-Hortaliças.

A B C

39

(A) (B)

(C) (D)

(E)

FIGURA 2.5. Espectros em 2-D de absorção na região visível na fase móvel

(acetonitrila:metanol:etil acetato - 8:1:1) dos picos característicos identificados nas espécies

de tomate: (A) Luteína (λ dos picos localizados a 425, 449 e 475 nm); (B) Licopeno ( λ dos

picos localizados a 446, 473 e 503 nm); (C) α-caroteno ( λ dos picos localizados a 448 e 480

nm); (D) β-caroteno (λ dos picos localizados a 454 e 480 nm) e (E) Zeaxantina (λ dos picos

localizados a 450 e 477 nm).

40

QUADRO 2.3. Média do conteúdo dos carotenóides (em mg/g de peso fresco) verificados nas

espécies do gênero Solanum da seção Lycopersicon.

Acessos

Espécies de Solanum

Luteína

Trans β-

caroteno +

fitoflueno

All-trans-

licopeno

Zeaxantina

CNPH 1037 S. pimpinellifolium 1,7 12,5 - -

CNPH 796 S. pimpinellifolium 3,3 12,5 230,00 -

CNPH 1040 S. pimpinellifolium 2,3 2,36 95,01 13,21

LA 2934 S. pimpinellifolium 3,13 12,9 127,56 -

CNPH 1048 S. pimpinellifollium 6,3 14,47 313,32 4,60

CNPH 1025 S. pimpinellifollium 1,13 3,9 102,82 -

LA 1614 S. pimpinellifollium 4,01 13,41 128,14 10,41

CNPH 1678 S. pimpinellifollium 2,73 4,38 143,51 -

LA 2934 S. pimpinellifolium 3,14 12,91 127,56 -

CNPH 1304 S. lycopersicum 1,12 1,0 50,00 -





LA 1954 S. peruvianum 2,63 2,6 - 0,51

CNPH 1035 S. peruvianum 1,08 - - -

CNPH 1277 S. peruvianum 12,5 3,0 - 3,0

CNPH 201 S. peruvianum 3,3 2,5 - -

CNPH 402 S. peruvianum 3,3 6,5 - 1,0

CNPH 945 S. neorickii 15,2 5,0 - 3,0

CNPH 432 S. galapagense 10,0 25,0 - -

CNPH 944 S. cheesmaniae 3,0 12,0 - -

CNPH 410 S. chilense 13,0 5,0 - 1,0

CNPH 421 S. habrochaites 5,0 2,0 - -

CNPH 1034 S. habrochaites 3,78 3,01 - 0,09

CNPH 1122 S. habrochaites 2,33 2,47 - -

CNPH 409 S. pennellii 15,0 6,0 - 0,6

Tospodoro S. lycopersicum 0,71 3,62 88,73 -



HEM 54 S. lycopersicum 1,58 12,92 84,75 -

CNPH 1502 S. lycopersicum 6,58 52,29 - -

41

O licopeno foi o carotenóide predominante nos acessos da espécie S. lycopersicum

utilizados neste estudo (quadro 2.3.). Este resultado é similar ao encontrado por WILBERG

& RODRIGUEZ-AMAYA (1993), após análise de um grupo de variedades de tomate

cultivado. O pico de licopeno foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível

(λ máx a 446, 473 e 503 nm na fase móvel e % III/II = 71) e o tempo de retenção (tR) igual a

18 a 20 minutos. Estes dados foram similares ao padrão de licopeno isolado por CCA. Houve

uma grande variação no conteúdo de licopeno nos acessos de S. lycopersicum (entre 50,0 e

90,3 mg/g), assim como no de luteína (0,7 a 6,9 mg/g) e b-caroteno (1,0 a 23,38 mg/g). A

quantidade típica de β-caroteno em frutos vermelhos de tomates é relativamente baixa, em

média com valores de 2 a 4 mg/g de peso fresco (BHASKARACHARY et al., 1995). No

presente estudo, os conteúdos dos carotenóides β-caroteno e fitoflueno não poderam ser

separados nas condições utilizadas. No entanto, como o fitoflueno ocorre em baixos teores em

tomate (WILBERG & RODRIGUEZ-AMAYA, 1993), presume-se que a maior parte do pico

obtido nesta análise represente β-caroteno. Foi possível observar que os acessos de S.

lycopersicum vermelhos, também revelaram variabilidade no acúmulo de trans β-caroteno,

em conjunto com o fitoflueno. Destacou-se o S. lycopersicum ‘CNPH 1502’, um mutante com

frutos de coloração laranja, apresentando 52,29 mg/g de trans β-caroteno mais fitoflueno. O β-

caroteno apresentou uma % III/II = 25 e o fitoflueno apresentou uma % III/II = 70.

Vários acessos da espécie S. pimpinellifolium destacaram-se por apresentar uma

grande diversidade no perfil de carotenóides. Estes acessos apresentaram, além do trans-

licopeno (0 a 313,0 mg/g), luteína (1,13 a 6,3mg/g), zeaxantina (0 a 13,21 mg/g), fitoeno

(traços), trans β-caroteno e fitoflueno (2,36 a 14,47mg/g), cis-licopeno (traços), z-caroteno

(traços) e neoxantina (traços). O pico de fitoeno foi identificado pelo seu espectro de absorção

na região visível (λ máx a 276, 287 e 297 nm na fase móvel), em acordo com um cromóforo

de 9 duplas ligações conjugadas, todas na cadeia carbônica e tR = 44 minutos. O z-caroteno

apresentou λ máx a 381, 401 e 425 nm, % III/II = 25 e tR = 31 minutos. O pico de neoxantina

foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível (λ máx a 419, 440 e 425 nm,

% III/II =84, de acordo com um cromóforo de nove duplas ligações conjugadas, todas na

cadeia carbônica e tR = 3,5 minutos. É interessante ressaltar a presença de isômeros cis de

licopeno em alguns acessos. Esta variabilidade ainda não havia sido relatada em tomates

cultivados (WILBERG & RODRIGUEZ-AMAYA, 1993). O cis licopeno, um pró-licopeno,

apresentou λ máx a 441, 468 e 498 nm na fase móvel e % III/II = 75. O λ máx 5 nm mais

baixo que o de licopeno e o aparecimento do pico “cis” a 361 nm, comprovaram que se trata

42

de um isômero cis de licopeno.Vários estudos têm sugerido que a combinação de carotenóides

e outros antioxidantes é uma estratégia mais eficiente do que suplementação dietética de um

simples componente (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). A

presença destes pigmentos em espécies próximas da espécie cultivada abre a perspectiva de

um avanço na obtenção de tomates cultivados contendo uma maior variabilidade de

carotenóides. Quanto ao cis-licopeno, os dados sugerem que os cis-isômeros de licopeno são

mais bem absorvidos pelo organismo humano. Esta maior biodisponibilidade é provavelmente

condicionada pela sua melhor solubilidade em micelas e menor poder de agregação.

(CLINTON et al., 1996). O estudo detalhado do controle genético desta acumulação poderá

gerar informações de uso direto em programas de melhoramento visando o enriquecimento do

tomate para cis-licopeno. Além disso, estudos básicos sobre o impacto deste carotenóide na

dieta humana se fazem necessários, uma vez que atualmente apenas o trans-licopeno tem suas

propriedades funcionais em processo de análise.

Os principais carotenóides encontrados em S. neorickii ‘CNPH 945’; S. peruvianum

‘CNPH 1277’; S. pennellii ‘CNPH 409’ e S. chilense ‘CNPH 410’ foram luteína e zeaxantina.

A luteína foi detectada em todos os tomates analisados, apresentando as mais altas

concentrações em S. neorickii (15,2 mg/g) e S. pennellii (15,0 mg/g). O pico de luteína nestes

acessos foi identificado pelo seu espectro de absorção na região visível (λmáx a 424, 446 e

474 nm e λmáx a 423, 447 e 474 nm, respectivamente) e estrutura fina (% III/II = 60) para

ambos. A presença de dois grupos hidroxila na estrutura foi demonstrada pelo comportamento

cromatográfico (tR = 5.5 e 6.5 minutos). Os dados de comprimento de onda de absorbância

máxima da luteína na literatura são de 422 nm, 445 nm e 473 nm e o valor da % III/II é de 60

(RODRIGUEZ-AMAYA, 2001). Os dados obtidos, quando comparados aos publicados,

confirmam a identidade da luteína.

O pico de zeaxantina nestes acessos foi identificado pelo seu espectro de absorção na

região visível apresentando-se todos próximos (λmáx a 430, 453 e 479 nm), de acordo com

um cromóforo de 9 duplas ligações conjugadas, todas na cadeia carbônica. A presença de dois

grupos hidroxila na estrutura foi demonstrada pelo comportamento cromatográfico (tR = 6.5

minutos). Segundo BRITTON (1995), a all-trans-zeaxantina apresenta uma ligação dupla

conjugada a mais na estrutura do que a all-trans-luteína e conseqüentemente um λ max com

maior comprimento de onda (5 nm), resultado este similar aos obtidos em nossas análises.

Existe atualmente bastante interesse médico no uso de luteína e de zeaxantina na saúde

humana como componentes essenciais do pigmento macular do olho (BOTELLA-PAÍVA &

RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). Na alimentação humana, fontes importantes de

43

luteína/zeaxantina são o milho e as hortaliças folhosas de coloração verde escuro

(ALMEIDA-MURADIAN & PENTEADO 1992; RODRIGUEZ-AMAYA, 1999). Os

tomates de coloração verde, como S. chilense, S. neorickii, S. peruvianum e S. pennellii vêm,

portanto aumentar a lista de espécies que apresentam a acumulação destes carotenóides

essenciais. Vale salientar ainda que diversas pesquisas tenham mostrado que a luteína, usada

como suplemento dietético, pode prevenir a degeneração macular causada pelo

envelhecimento. Em um estudo conduzido por PANDE et al. (2001), a zeaxantina mostrou ser

capaz de proteger a retina contra o peroxinitrito, um radical livre formado pela combinação de

radicais de superóxido e de óxido nítrico. Outro estudo demonstrou uma relação entre a

luteína e a zeaxantina, pigmentos maculares, e a densidade do cristalino ocular. O estudo

sugere que o consumo de luteína e/ou zeaxantina pode retardar aumentos na densidade do

cristalino relacionados à idade (HAMMOND et al., 1997).

O pigmento β-caroteno, o mais potente carotenóide com ação de pró-vitamina A, foi

detectado em quase todos os acessos analisados. Elevadas quantidades foram observadas nos

acessos de frutos amarelos, S. cheesmaniae ‘CNPH 944’ (12 mg/g) e S. galapagense ‘CNPH

432’ (25 mg/g). Nestes acessos o β-caroteno apresentou λ máx a 454 e 480 nm e % III/II = 25,

refletindo um cromóforo de 11 duplas conjugadas, porém, com duas duplas em anéis β. O

tempo de retenção (tR = 34 minutos), indicando a ausência de substituintes.

Como fontes de luteína e trans β-caroteno, estas espécies colocam-se como mais uma

alternativa para a manipulação genética do conteúdo de carotenóides não comumente

encontrados nos tomates cultivados. Assim como em S. neorickii ‘CNPH 945’ (5 mg/g); S.

peruvianum ‘CNPH 1277’ (3 mg/g); S. chilense ‘CNPH 410’ (5 mg/g) e S. pennellii ‘CNPH

409’ (6 mg/g) que, mesmo tendo a coloração verde apresentam-se como mais uma fonte de

trans β-caroteno. Variações quantitativas para β-caroteno já haviam sido observadas em

Lycopersicon cheesmanii (STOMMEL & HAYNES, 1994) e em cruzamentos intra-

específicos entre S. lycopersicum e S. pennellii (LIU et al., 2004).

O β-caroteno, assim como todos os carotenóides, co-existe como dois isômeros, o

trans e o cis. A configuração trans é a forma mais estável, e que ocorre na natureza, enquanto

que os cis isômeros podem existir naturalmente, mas em pequenas quantidades. Vários

estudos de absorção dos dois isômeros foram realizados e verificou-se que os níveis

sanguíneos da forma em trans são superiores ao do isômero em cis (STAHL et al., 1993,

1995; TAMAI et al., 1995; BEN-AMOTZ & LEVY, 1996; JOHNSON et al., 1997). Por

conseguinte, alguns dos autores referidos sugerem que este resultado é indicativo de uma

44

maior absorção do trans- β-caroteno por parte do intestino. Todavia são necessários estudos

mais rigorosos de absorção e acumulação dos dois isômeros de β-caroteno, de modo a

determinar se existe, de fato, uma absorção preferencial de um dos isômeros.

Os pigmentos α-caroteno e β-caroteno (pigmentos de cor laranja) são de singular

importância como precursores da vitamina A. Em decorrência do alto custo dos alimentos de

origem animal, as pró-vitaminas vegetais constituem a maior porção das vitaminas dietéticas

(WHO/NUT/95.3). Embora exista no Brasil uma grande disponibilidade de frutas e hortaliças

como potenciais fontes de carotenóides, existe, em contradição, um elevado número de

crianças com hipovitaminose A. O pigmento α-caroteno (com ação de pró-vitamina A) só

esteve presente, e em pequenas quantidades, em frutos amarelos de S. cheesmaniae e S.

galapagense. No restante dos acessos foram observados apenas traços deste carotenóide. A

luteína, sem dúvida, foi o carotenóide mais difundido, apresentando quantidades variadas, em

todas as espécies avaliadas. O resultado combinado da acumulação destes dois pigmentos nos

acessos estudados indica uma aparente ausência de macromutações do gene hidroxilase,

induzindo perda da função e/ou presença de fatores duplicados no anel beta e epsilon, que

controla a conversão enzimática de α-caroteno em luteína (CUNNINGHAM & GANTT,

1998; HIRSCHBERG, 2001).

De acordo com nossos resultados, é inquestionável que o S. pimpinellifolium, um

típico tomate de cor vermelha, é a melhor fonte para melhoramento genético focado no

incremento do conteúdo e na diversidade de carotenóides. Esta espécie apresenta bom nível

de concentração para os isômeros de licopeno, trans β-caroteno, fitoeno, fitoflueno, z-

caroteno, neoxantina e luteína, indicando que a via biossintética de carotenóides parece ser

mais ativa nesta espécie quando comparada com outras espécies selvagens. RAO (2002)

indica que é necessário o consumo, em média, de aproximadamente 35mg licopeno/dia, para

obter os efeitos antioxidantes nas células humanas. Neste contexto, seria necessário, para

atingir o nível recomendado, o consumo diário de aproximadamente 112 g dos frutos do

acesso S. pimpinellifolium (conteúdo de licopeno 313,3 mg/g) em comparação com 194g do

melhor fruto de tomate cultivado (S. lycopersicum ‘Thay Pink’). Ainda é importante

mencionar que compostos intensificadores do aroma do tomate derivam de carotenóides

(SIMKIN et al., 2004; LEWINSOHN et al., 2005). Desse modo, o melhoramento genético

para intensificar qualidades sensorais mais agradáveis pode requerer um perfil complexo de

acúmulo de carotenóides, o que não é observado, nos nossos dias, em tomates cultivados.

O padrão de acúmulo diferencial, observado no presente estudo, reforça a noção de

que alelos e ou mecanismos de regulação distintos operam na via biossintética de carotenóides

45

em frutos de diferentes acessos de tomates. Em estudos conduzidos por LIU et al. (2004),

foram encontradas muitas regiões contendo componentes quantitativos (“quantitative trait

loci ” – QTLs) associados com à intensidade da cor do fruto. No entanto, estes QTLs não co-

segregaram com genes estruturais da via dos carotenóides em populações derivadas de

cruzamento S. lycopersicum ‘M-82’ x S. pennellii ‘LA 0716’. Esta observação indica que

genes regulatórios adicionais e /ou características morfológicas podem estar associados com

esta característica (ROUSSEAUX et al., 2005). Contudo, seria interessante avaliar se situação

similar pode ocorrer quando empregamos este tipo de busca por gene candidato e QTLs, em

cruzamentos envolvendo acessos da espécie S. pimpinellifolium, que apresentou um perfil de

carotenóides muito mais complexo do que o de S. pennellii ‘LA 0716’

Mais recentemente, extensivos perfis e quantificação de compostos metabólicos em

frutos têm sido conduzidos, via cromatografia de gás e espectrometria de massa, com tomates

cultivados (SCHAUER et al., 2005; 2006; TIKUNOV et al., 2005; MOCO et al., 2006). Estes

estudos foram capazes de identificar e quantificar vários metabólitos de importância

nutricional e funcional, incluindo ácidos orgânicos, açúcares (SCHAUER et al., 2005),

flavonóides (MOCO et al., 2006) e carotenóides cíclicos voláteis (TIKUNOV et al., 2005).

Entretanto, a análise baseada em HPLC/CLAE reportada aqui forneceu o mais amplo estudo

comparativo de níveis relativos e composição de carotenóides em frutos de S. lycopersicum

tipos selvagens e mutantes, bem como em acessos representando variedades botânicas semi-

domesticadas de Solanum L. (seção Lycopersicon [Mill.] Wettst. subseção Lycopersicon).

Dez carotenóides foram detectados, acumulando-se em vários níveis nos acessos

estudados. Alguns destes pigmentos já são reconhecidos como compostos funcionais, tendo

efeito benéfico à saúde humana. Portanto, a ocorrência natural de variações na composição e

conteúdo de carotenóides, em frutos de espécies selvagens, pode ser útil para acrescentar esta

diversidade em tomate por meio de programas de melhoramento, objetivando melhorar o

valor nutricional e funcional do tomate cultivado. Barreiras de cruzamento entre espécies

selvagens e S. lycopersicum são restritas somente para alguns acessos e espécies,

particularmente os do complexo S. peruvianum. Entretanto, vários avanços tecnológicos têm

permitido ultrapassar as barreiras de incompatibilidade (BHATIA et al., 2004). Neste cenário,

a variação de carotenóides observada neste germoplasma exótico de tomate pode representar

uma valiosa fonte de tipos e quantidades de carotenóides para serem incorporados em

variedades elites comerciais, via melhoramento por introgressão (ZAMIR, 2001).

Atualmente novas pesquisas genéticas e genômicas estão em processo de identificar

fatores regulatórios que possam significativamente contribuir para aumentar os níveis de

46

carotenóides e o valor nutricional de alimentos (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-

CONCEPCIÓN, 2006). Os acessos aqui selecionados poderão ser utilizados em estudos de

engenharia metabólica visando aumentar os níveis de carotenóides, relevantes

nutricionalmente.

O enriquecimento da dieta é um requisito fundamental para regiões tropicais, muitas

vezes carentes de fontes baratas de alimentos funcionais. No Brasil existem vários alimentos

fontes de carotenóides, como a abóbora, cenoura, manga, batata-doce, espinafre, mostarda,

couve, entre outros. O desenvolvimento de tomates com maior diversidade de carotenóides se

encaixa perfeitamente dentro de um novo conceito desenvolvido por diversos projetos

internacionais que visam utilizar a biodiversidade para promover uma alimentação mais

saudável, incluindo uma maior disponibilidade de alimentos funcionais ou nutracêuticos. Este

novo conceito é, sem dúvida nenhuma, um incentivo para a identificação e o estudo da

composição de carotenóides considerados importantes para a saúde humana, visando compor

um banco de dados sobre composição de carotenóides no maior número de espécies vegetais

de importância global ou regional (RODRIGUEZ-AMAYA, 1996; 1999).

47

2.3. Conclusões.

A partir dos resultados obtidos podemos concluir que os frutos de diferentes acessos

de espécies cultivadas e selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon apresentam

diversos tipos, conteúdos e balanço de carotenóides. Espécies selvagens com frutos de

coloração verde apresentaram um acúmulo considerável de carotenóides essenciais tais como

luteína e zeaxantina, que não estão disponíveis em quantidades satisfatórias nos acessos de

tomate cultivado. Portanto, estes acessos podem fornecer genes capazes de aumentar o

repertório de carotenóides com características nutricionais diferenciadas. Além deste

acréscimo, diversos carotenóides de reconhecido valor nutricional, mas que não são

comumente encontrados em tomates, tais com o β-caroteno, foram identificados em espécies

como S. galapagense, S. cheesmaniae e em um mutante de S. pimpinellifolium. Estes acessos

com frutos de pigmentação de fruto amarela podem representar fontes alternativas de

carotenóides em tomates. Alguns acessos de S. pimpinellifolium (de coloração tipicamente

vermelha) apresentaram o perfil mais diversificado de carotenóides e, portanto, são

considerados os mais adequados para melhoramento. Acessos desta espécie apresentaram

bons níveis de concentração para distintos carotenóides incluindo: luteína, fitoeno, z-caroteno,

neoxantina, fitoflueno, trans β-caroteno, all-trans-licopeno e cis-licopeno. Estes resultados

indicam que o germoplasma das espécies selvagens apresenta um enorme potencial para

contribuir no melhoramento do tomateiro cultivado visando, especialmente, o

desenvolvimento de variedades com características nutricionais e funcionais superiores. Estes

acessos podem também ser utilizados em estudos básicos de engenharia metabólica, visando

identificar os componentes genético-moleculares associados com maiores níveis e diversidade

de carotenóides de relevância nutricional. Estes estudos serão uma ferramenta fundamental

em projetos de pesquisa, desenvolvimento e inovação visando novos produtos que contribuam

para fornecer fontes baratas de pigmentos com função de pró-vitamina A, bem como de

alimentos funcionais e nutracêuticos. A adoção destas cultivares promoveria o enriquecendo

da dieta humana, especialmente em regiões onde a carência destes pigmentos tem sido

cronicamente observada.

48

CAPÍTULO 03

Desenvolvimento de protocolos de PCR específicos para a detecção de genes

codificadores de enzimas da via biossintética de carotenóides em espécies de Solanum

(Seção Lycopersicon).

3.0. Introdução.

A via biossintética dos carotenóides é uma das mais estudadas em plantas, com vários

genes codificadores de suas enzimas já clonados, seqüenciados e caracterizados

(CUNNINGHAM & GANTT, 1998; ISAACSON et al., 2002). A enzima fitoeno sintase

(PSY) é a primeira dedicada à biossíntese de carotenóides (Figura 1.2.). Esta enzima sintetiza

o fitoeno (uma molécula com 40 carbonos) a partir da condensação de duas moléculas do

composto intermediário geranilgeranil difosfato (uma molécula isoprenóide de 20 carbonos).

Em tomate (Solanaum lycopersicum L.), dois genes que codificam a fitoeno sintase foram

caracterizados. O gene PSY-1 codifica uma enzima que apresenta expressão específica em

frutos e flores (GIULIANO et al., 1993). O gene PSY-2 codifica uma enzima de expressão

específica em tecidos foliares (FRASER & BRAMLEY, 2005).

A etapa de ciclização do licopeno é outra importante bifurcação dentro da via

biossintética dos carotenóides (Figura 1.2.). Duas enzimas do tipo licopeno ciclase [licopeno-

β-ciclase (LCYB) e licopeno-ε-ciclase (LCYE)] estão envolvidas no processo de ciclização do

licopeno. A enzima licopeno-β-ciclase é capaz de adicionar um anel do tipo β a uma molécula

de licopeno. A enzima licopeno-ε-ciclase adiciona um anel do tipo ε. A adição de dois anéis

do tipo β leva à formação do β-caroteno. A adição de um anel do tipo ε e um anel do tipo β

leva à formação de α-caroteno (RONEN et al., 1999).

Dois genes (de cópia única) foram descritos codificando a enzima licopeno-β-ciclase

no tomateiro cultivado: LCYB e CYCB. O gene CYCB codifica uma enzima específica de

tecidos que contêm cromoplastos, tais como frutos e flores (RONEN et al., 2000). A enzima

licopeno-ε-ciclase (LCYE) é codificada pelo gene Crtl-e. Esta enzima apresenta 30% de

identidade de aminoácidos com a LCYB (RONEN et al., 1999). Tanto o conteúdo de mRNA

do gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase quanto o que codifica a licopeno-β-ciclase

diminui durante todos os estádios que levam ao desenvolvimento completo do fruto de

tomate, que culmina com o acúmulo de licopeno (RONEN et al., 1999). Este fato sugere que

um dos pontos da regulação do acúmulo de licopeno poderia ser na produção e/ou degradação

dos mRNAs específicos destas enzimas.

49

A cor amarela e/ou alaranjada observada em frutos de alguns mutantes de tomate

(delta e Beta) é controlada por alterações nos genes codificadores de distintas enzimas

licopeno-ciclases (RONEN et al., 1999; 2000). A mutação Beta resulta em uma acumulação

de mRNA do gene CYCB e um maior teor de β-caroteno em frutos. A mutação delta resulta

na acumulação do mRNA do gene Crtl-e e na acumulação do carotenóide d-caroteno

(RONEN et al., 1999). A mutação “old-gold crimson” (gene ogc) controla o acúmulo de

licopeno em frutos e pétalas devido a uma mutação que altera a seqüência de dois códons no

gene CYCB resultando em uma ciclase não funcional (RONEN et al., 2000).

Embora a genética da síntese de carotenóides seja bem estudada em tomates

cultivados, existem poucas informações disponíveis sobre a diversidade dos genes

relacionados a esta via em espécies selvagens do gênero Solanum Seção Lycopersicon. O

desenvolvimento de protocolos de PCR (reação em cadeia da polimerase) e a síntese de

oligonucleotídeos capazes de permitir amplificação de forma específica de fragmentos e/ou

genes codificadores de enzimas chave da via biossintética dos carotenóides tais como fitoeno

sintase, licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase é fundamental para tais estudos. Para

converter estes amplicons em potenciais marcadores moleculares, é necessário que estes

fragmentos sejam capazes de revelar variações alélicas nos diversos acessos. Estas diferenças

podem ser originadas por diferenças no tamanho do fragmento devido a eventos de inserção

e/ou deleção (INDels) ou mesmo por simples alterações nos nucleotídeos (“single nucleotide

polymorphisms” – SNPs) (BROOKES, 1999).

Os SNPs representam uma das classes mais abundantes de polimorfismos em genomas

de plantas. Os SNPs podem contribuir para explorar a diversidade estrutural de seqüências

gênicas e gerar “marcadores funcionais” (VARSHNEY et al., 2005). Os marcadores

funcionais são derivados da informação obtida da análise de seqüência de “genes candidatos”

(ANDERSEN & LÜBBERSTEDT, 2003). Entre os principais grupos de “genes candidatos”

estão aqueles componentes de famílias gênicas que contêm função conhecida e domínios

estruturais conservados e aqueles que codificam enzimas de vias biossintéticas (ANDERSEN

& LÜBBERSTEDT, 2003). “Marcadores funcionais” do tipo SNPs têm sido amplamente

utilizados para mapear regiões genômicas de interesse bioquímico ou agronômico em

programas de melhoramento genético (RAVEL et al., 2007).

Neste contexto, esta estratégia mostra-se extremamente adequada para os genes

estruturais da via biossintética dos carotenóides, cujos polimorfismos têm sido detectados em

associação com “macromutações” (TANKSLEY, 1993) tais como: coloração e/ou teor de

pigmentos carotenóides em diferentes tecidos vegetais. Vários estudos vêm tentando

50

correlacionar às reações mediadas por estas enzimas a fenótipos apresentados por diversas

espécies de frutos e hortaliças tais como Capsicum (HUH et al., 2002; THORUP et al., 2000),

melancia (BANG et al., 2007), cenoura (JUST et al., 2007) e milho (HARJES et al., 2008) .

Usando a informação disponível no extenso e sempre crescente banco de seqüências

pertencentes a genes codificadores de enzimas da via de síntese de carotenóides é possível

desenhar oligonucleotídeos iniciadores e padronizar protocolos para PCR (reação em cadeia

pela polimerase) para a detecção específica de SNPs ou INDELs dentro dos genes

codificadores de enzimas desta via. Estes SNPs podem ser prontamente convertidos em

marcadores moleculares, auxiliando em programas de melhoramento ou em estratégias

transgênicas (JUST et al., 2007). O objetivo do presente capítulo foi desenhar e avaliar pares

de iniciadores específicos e desenvolver protocolos de PCR capazes de amplificar os genes

codificadores de enzimas envolvidas na biossíntese de carotenóides em espécies do gênero

Solanum (Seção Lycopersicon).

51

3.1. Materiais e Métodos.


O presente estudo utilizou vários acessos das espécies do genêro Solanum seção

Lycopersicon, compreendendo espécies selvagens com frutos de cor verde (S. chmielewskii, S.

habrochaites, S. chilense, S. peruvianum, S. neorickii e S. pennellii), amarela (S.

pimpinellifolium amarelo, S. galapagense e S. cheesmaniae) e vermelha (S. lycopersicum

'Santa Clara', S. lycopersicum e S. pimpinellifolium). Os tomates foram cultivados em casa de

vegetação, sob controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando entre

21oC e 30oC e temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada iluminação

complementar. As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com solo

esterilizado, no Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira

de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).

3.1.2. Purificação do DNA genômico.

A purificação de DNA de espécies selvagens e cultivadas de tomate, utilizados neste

estudo, foi feita usando o método CTAB seguindo o protocolo padrão de DOYLE & DOYLE

(1990) com algumas adaptações implementadas por BOITEUX et al. (1999). Um grama de pó

fino, obtidos da maceração da folha em N2 (líquido), foi transferido para um microtubo com

600 µL de tampão CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) [2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl

100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)] aquecido a 65º C em banho-

maria por dez minutos, ficando em seguida à temperatura ambiente por cinco minutos. O

CTAB solubiliza as membranas, formando um complexo com o DNA que facilita sua

posterior precipitação (WEISING et al., 1995). Ao microtubo foram acrescentados 600 µL de

clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1 v/v), procedendo-se à agitação num vortex e

centrifugação (12.000 rpm por cinco minutos). O sobrenadante (aproximadamente 550 µL)

foi coletado e o DNA precipitado pela adição de 300 µL de isopropanol gelado e

centrifugação (12.000 rpm por 13 minutos). Após este passo o sobrenadante foi descartado e o

DNA aderido ao fundo do tubo foi lavado com etanol 70% para remoção de restos de

isopropanol e de sais. Os microtubos foram colocados por 10 min em estufa a 37°C. O DNA

foi dissolvido em 100 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e incubado por 24

horas a 4°C.

52

3.1.3. Estimativa da concentração de DNA purificado.

A concentração e a qualidade do DNA purificado foram estimadas em gel de agarose

1% (p/v) através da comparação com um marcador de quantidade contendo DNA do fago l

(lambda) na concentração de 10 ng/mL. Após a quantificação e a verificação que o DNA

estava intacto (sem degradação), todos os materiais foram diluídos para a concentração final

de 20 ng/µL em Tris 0,01M.

3.1.4. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA.

3.1.4.1. Desenho e síntese dos iniciadores de síntese de DNA para o gene da

enzima licopeno β-ciclase.

A seqüência alvo para a síntese dos iniciadores foram duas regiões conservadas

identificadas no gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase. Um banco de dados foi

organizado contendo os genes e/ou segmentos gênicos já descritos para licopeno β-ciclase

específica de cromoplasto de S. lycopersicum (GenBank AF254793 e X86452). Estes genes

foram alinhados utilizando o método Clustal W, disponível no programa Megalign

(Lasergene, Madison, WI), com as condições: gap penalty e gap length penalty = 10. Um

consenso foi construído utilizando o programa SeqMan (Lasergene, Madison, WI). Os

iniciadores de síntese foram desenhados a partir deste consenso utilizando o programa

PrimerSelect (Lasergene, Madison, WI), nas condições ótimas (dímeros de no máximo 2 pb,

distantes 8 bases da região terminal 3´).

O iniciador senso “1” (5’-TAGCACCCACATCAAAGCCAGAGT-3’) hibridiza na

posição 170 a 193 da seqüência AF254793. O iniciador anti-senso “1R” (5’-

CCGAAAAGACACACAAGCTGAGTAAA-3’) hibridiza na posição 1380 a 1403 da

seqüência AF254793. Este par de iniciadores permite amplificar um fragmento de

aproximadamente 1233 pb. Várias temperaturas próximas à temperatura teórica de

anelamento (Tm) foram avaliadas, tendo como objetivo obter fragmentos gênicos

amplificados de tamanho o mais próximo possível do gene codificador da enzima licopeno-β-

ciclase completo, depositado no GenBank.

53


enzima licopeno ε-ciclase.

Para o gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase, os procedimentos para desenho

e síntese dos iniciadores de síntese foram os mesmos descritos acima, utilizando as

informações do gene licopeno ε-ciclase de S. lycopersicum (GenBank Y14387). Dois

iniciadores foram desenhados: o iniciador senso Tom-1 (5’-ATTTGACCCGAGCCTGATG -

3’) localizado na posição 827 a 845 e o iniciador anti-senso Tom-1R (5’-

GACCGCGATTTCTGTTATGA-3’) localizado na posição 1639 a 1658 do gene da ε-ciclase

(GenBank Y14387). Desta forma, um fragmento gênico de 831pb era o produto previsto da

amplificação utilizando este par de iniciadores.


enzima fitoeno sintase.

Para o gene da enzima fitoeno sintase, foram desenhados e avaliados três pares de

iniciadores a partir de um consenso obtido do alinhamento das seqüências do gene da fitoeno

sintase PSY-2, isolada de folhas de S. lycopersicum (GenBank L23424, BARTLEY &

SCOLNIK, 1993) e do gene PSY-1, isolado de frutos de S. lycopersicum (GenBank M84744,

BARTLEY et al., 1992).

Os códigos usados para os iniciadores e suas respectivas seqüências são:

PSY-1 tom-1 = (5’- AGTTGGTTTGCCTGTCTGTGG-3’);

PSY-1 tom 1R = (5’- GCTGCCTGCCTCAAAACC-3’);

PSY-1 tom-2 = (5’- TGCCTTGTTATGGGTTGTTTCTC-3’);

PSY-1 tom-2R = (5’- CTGCCTGTGCTAATTCATCTTG-3’);

PSY-1 tom 3 = (5’- AGAGTGGCCATTGTTGAAAGAGA-3’);

PSY-1 tom3R = (5’- TCCTTTCTCTGCCTCATCAAAGA-3’).

Para cada par de iniciadores são previstos três amplicons de 457pb, 914pb e 1311pb,

respectivamente. Os demais procedimentos para desenho e síntese dos iniciadores de síntese

foram os mesmos descritos acima.

3.1.4.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).

A PCR foi realizada nos termocicladores PCR System 9700 (Applied Biosystems Co.)

e Mastercycler gradient (Eppendorf). Os reagentes usados na mistura de 25 µL continham a

solução DNA (20ng/mL), tampão PCR (1x) sem MgCl2, dNTP 0,25mM , MgCl2 2,0 mM,

54

iniciadores de síntese (0,2 mM cada) e 1U Taq DNA Polymerase, todos da Invitrogentm

LifeTechnologies. A amplificação foi realizada em três temperaturas de PCR (temperatura

ideal de anelamento t; t-20C e t+20C) para cada par de iniciadores de síntese utilizando-se de

uma máquina de gradiente de PCR [Mastercycler gradient (Eppendorf)]. As seguintes

condições foram as ideais para o gene codificadores da enzima licopeno-β-ciclase: um ciclo

inicial de desnaturação a 94oC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos repetidos com as

temperaturas de 96oC por 30 segundos, 56oC por 1 minuto e 68oC por 2 minutos, finalizando-

se com um ciclo extra de extensão a 72oC por 10 minutos. Para o gene codificador da enzima

licopeno-ε-ciclase foram adotadas as mesmas condições descritas acima. Para o gene da

enzima fitoeno sintase foram modificadas apenas as temperaturas dos ciclos de anelamento,

que foram reduzidas a 53oC. O produto amplificado pela reação de PCR foi analisado em gel

de agarose 1% (p/v), corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta.

3.1.4.5. Seqüênciamento direto dos amplicons.

O seqüênciamento dos fragmentos foi realizado em um seqüenciador ABI 3100,

utilizando o kit ABI Prism BigDye version 3.0 (Applied Biosystems). Os iniciadores de

síntese senso e anti-senso, para cada gene, foram utilizados individualmente na reação de

seqüênciamento de cada amostra a fim de obter, por meio do consenso, um fragmento de

maior tamanho possível. Para cada reação foram utilizados 40 ng de DNA quantificado em

gel de agarose e 5 pmoles dos oligonucleotídeos iniciadores de síntese.

3.1.4.6. Análise das seqüências correspondentes a segmentos dos genes das

enzimas em estudo.

A qualidade das seqüencias foi avaliada através do programa SeqMan (Lasergene,

Madison,WI) e a seqüências de baixa qualidade foram removidas (ALLEX, 1999). As

seqüências correspondentes ao fragmento gênico de cada uma das espécies estudadas foram

obtidas a partir do consenso dos fragmentos seqüenciados com os iniciadores senso e anti

senso utilizando-se o programa SeqMan (Lasergene)® DNAstar. As seqüências obtidas para os

genes codificadores da enzima licopeno-β-ciclase, licopeno-ε-ciclase e fitoeno sintase foram

submetidas ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do

National Center for Biotechnology Information – NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Dentre os

fragmentos seqüenciados, todos apresentaram homologia com o gene da enzima

55

correspondente de S. lycopersicum depositadas no GenBank e que serviram de molde no

desenho dos iniciadores.

56


Os frutos dos acessos de diferentes espécies do gênero Solanum (seção Lycopersicon)

apresentam uma ampla variedade de cores. A caracterização de bases moleculares associadas

com distintos mutantes de frutos de tomates com pigmentação alterada delta, Beta e old-gold-

crimson ilustra claramente a importância da regulação transcricional dos genes que codificam

enzimas da via de biossíntese de carotenóides no teor e tipos destes pigmentos em frutos de

tomate (RONEN et al 1999; 2000). No presente estudo foram obtidos fragmentos

amplificados do gene de algumas enzimas da via de biossíntese dos carotenóides de diversas

espécies selvagens de Solanum (Seção Lycopersicon).

A otimização do PCR permitiu a amplificação de um fragmento de 1219pb do gene

codificador da enzima licopeno β-ciclase (que apresenta um tamanho previsto de 1666 pb) nas

seguintes espécies: S. habrochaites ‘CNPH 421’; S. chilense ‘CNPH 410’, S. peruvianum

‘CNPH 201’, S. peruvianum ‘CNPH 402’, S. neorickii ‘CNPH 945’, S. pennellii ‘CNPH

409’, S. galapagense ‘CNPH 432’, S. cheesmaniae ‘CNPH 944’, S. pimpinellifolium ‘CNPH

796’, S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’, S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’,

S. chmielewskii ‘CNPH 1022’, S. lycopersicum ‘CNPH 1136’, S. chilense ‘CNPH 943’ e S.

lycopersicum ‘CNPH 1154’ (Figura 3.1.). As seqüências dos fragmentos obtidos

apresentaram identidade variando entre 99% a 100% entre os acessos destas espécies e o

depósito original do gene (GenBank AF254793). O quadro 3.1. mostra uma das análises

realizadas na página eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), em que a seqüência de

licopeno-β-ciclase amplificada à partir de DNA de S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’

foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn.

É interessante observar que as seqüências dos genes da neoxantina sintase de tomate e

da capsantina-capsorubina sintase de pimentão aparecem no quadro 3.1 antes mesmo do gene

codificador da segunda enzima licopeno-b-ciclase descrita na literatura (Crtl-B / dados não

apresentados). Esta observação sugere uma maior similaridade com estes dois genes, como já

anteriormente descrito por RONEN et al. (2000). Este dado também sugere que os iniciadores

desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados para a obtenção de dados de seqüência

específicos do gene da enzima licopeno-b-ciclase de cromoplastos (e não do gene Crtl-B), nas

espécies de tomate avaliadas, utilizando as condições de PCR descritas.

57

FIGURA 3.1. Amplicons correspondendo a potenciais fragmentos de genes codificadores da

enzima licopeno-β-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro e analisados em gel de

agarose [1% (p/v) corado com brometo de etídeo]. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo

‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (4) S.

neorickii ‘CNPH 945’; (5) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (6) S. lycopersicum ‘Santa Clara

CNPH 1496’; (7) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (9) S.

chilense ‘CNPH 943’, (10) S. pennellii ‘CNPH 409’, (11) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’,

(12) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (13) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (14) S. chilense ‘CNPH

410’.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1219pb

58

QUADRO 3.1. Identidade do fragmento de licopeno-β-ciclase amplificado de DNA de

Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ com a seqüência alvo de licopeno-beta-

ciclase. Para a obtenção da validação a seqüência objeto foi submetida ao banco de dados do

GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Acesso Descrição da

seqüência alvo

Pontuação

máxima

Pontuação

Total

% de

alinhamento

Valor de

expectativa

(E-value)

Identidade

máxima

AF254793.1 Lycopersicon esculentum chromoplast-specific lycopene beta-cyclase mRNA, complete cds

2302 2302 100% 0.0 100%

Y18297.1 Lycopersicum esculentum mRNA for neoxanthin synthase

2290 2290 100% 0.0 99%

AJ272136.1 Solanum tuberosum mRNA for neoxanthin synthase (nxs gene)

2097 2097 100% 0.0 97%

X76165.1 C. annuum mRNA for capsanthin/capsorubin synthase

1711 1711 99% 0.0 91%

A seqüência parcial do fragmento obtido para o gene codificador da enzima licopeno-

ε-ciclase nas espécies em estudo foi também obtida via PCR utilizando iniciadores

desenhados a partir de seqüências do gene codificador da enzima licopeno-ε-ciclase do

tomateiro cultivado S. lycopersicum (GenBank Y14387), que possui um tamanho aproximado

de 1697 pb (RONEN et al., 1999). Após a otimização do PCR para a amplificação dos genes

codificadores da enzima licopeno-ε-ciclase, foram obtidos amplicons de 831 pb para acessos

das espécies S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; S. chilense

‘CNPH 943’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; S.

galapagense ‘CNPH 432’; S. peruvianum ‘CNPH 1277’; S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; S.

chilense ‘CNPH 410’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. peruvianum ‘CNPH 402’; S. cheesmaniae

‘CNPH 944’ e S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ (Figura 3.2.). Os resultados

também demonstraram a especificidade do par de iniciadores para licopeno-ε-ciclase, uma vez

que nenhum outro produto foi obtido por PCR nas condições experimentais utilizadas e que a

seqüência obtida deste amplicon único foi o de licopeno-ε-ciclase.

As seqüências dos fragmentos amplificados correspondentes ao gene codificador da

enzima licopeno-ε-ciclase apresentaram identidade variando de 91% a 93% entre os acessos

testados e o depósito original do gene que codifica a enzima licopeno ε-ciclase (GenBank

Y14387). O quadro 3.2. mostra uma das análises realizada na página eletrônica do NCBI

59

(www.ncbi.nlm.nih.gov), em que a seqüência objeto de licopeno-ε-ciclase amplificada à partir

de DNA de S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ foi submetida ao banco de dados do

GenBank pelo programa BLASTn e apresentou elevada homologia com o gene da ε-ciclase

(GenBank Y14387). Um dos genes observados com elevada identidade é o de café (Coffea

canephora) (quadro 3.2.). Este dado está de acordo com um estudo comparativo do

repertório gênico de tomate e café que mostrou que o genoma destas duas espécies apresenta

elevada similaridade em vários genes expressos em fruto e na semente (CHENWEI et al.,

2005).

FIGURA 3.2. Amplicons obtidos correspondendo a fragmentos da seqüência do gene

codificador da enzima licopeno-ε-ciclase obtidos de diferentes acessos de tomateiro (Seção

Lycopersicon) e analisados em gel (agarose 1% corado com brometo de etídeo). (1) Solanum

chmielewskii ‘CNPH 1022’; (2) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (3) S. chilense ‘CNPH 943’;

(4) S. pennellii ‘CNPH 409’; (5) S. pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (6) S.

galapagense ‘CNPH 432’; (7) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (8) S. lycopersicum ‘CNPH

1154; (9) S. chilense ‘CNPH 410’; (10) S. neorickii ‘CNPH 945’; (11) S. peruvianum ‘CNPH

944’ e (12) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

831pb

60

QUADRO 3.2. Identidade do fragmento de licopeno-ε-ciclase amplificado de DNA de

Solanum lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Para a obtenção da validação a seqüência

objeto foi submetida ao banco de dados do GenBank pelo programa BLASTn, na página

eletrônica do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).


seqüência alvo

Pontuação

máxima

Pontuação

Total

% de

alinhamento

Valor de

expectativa

(E-value)

Identidade

máxima

Y14387.1 Lycopersicon esculentum mRNA for lycopene epsilon-cyclase

1122 1122 100% 0.0 93%

AF321537.1 Solanum tuberosum lycopene epsilon-cyclase mRNA, partial cds

680 680 64% 0.0 92%

DQ357178.1 Coffea canephora lycopene epsilon cyclase mRNA, partial CDs

287 287 66% 5e-74 77%

Para a obtenção da amplificação do gene da enzima fitoeno sintase foi empregado um

protocolo de PCR utilizando três pares de iniciadores (PSY-1 tom-1; PSY-1 tom-1R // PSY-1

tom-2; PSY-1 tom-2R // PSY-1 tom-3; PSY-1 tom-3R) desenhados a partir de um consenso

obtido do alinhamento das seqüências do gene da fitoeno sintase PSY-2 (expressa em folhas) e

do gene PSY-1 (expresso em frutos de S. lycopersicum). Foram obtidos três amplicons de

tamanho esperado (457pb, 914pb e 1311pb) utilizando estes pares de iniciadores,

respectivamente. Estes três amplicons foram obtidos nos acessos S. pimpinellifolium amarelo

‘CNPH 1037’; S. galapagense ‘CNPH 432’; S. peruvianum ‘CNPH 1277’; S. lycopersicum

‘CNPH 1154’; S. chilense ‘CNPH 410’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. cheesmaniae ‘CNPH

944’; S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; S.

lycopersicum ‘CNPH 1136’; S. chilense ‘CNPH 943’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S.

pimpinellifolium ‘CNPH 796’; S. peruvianum ‘CNPH 402’; S. habrochaites ‘CNPH 421’ e S.

peruvianum ‘CNPH 201’ (Figuras 3.3., 3.4. e 3.5.). As seqüências dos amplicons obtidos do

acesso S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’ confirmaram a identidade do fragmento

com o gene depositado no GenBank. Foram observadas identidades de 90% para o amplicom

obtido com PSY-1 Tom-1, 90% para o amplicom obtido com PSY-1 Tom-2 e 95% para o

amplicom obtido com PSY-1 Tom-3 (Quadros 3.3., 3.4. e 3.5., respectivamente).

61

FIGURA 3.3. Resultado da amplificação do fragmento gênico da fitoeno sintase utilizando o

o par de iniciadores PSY-1 tom-1 e PSY-1 tom 1R. Amplicons foram nalisados em gel de

agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH

1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum

‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae

‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH

1022’; (10) S. chmielewskii ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii

‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S.

habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH 201’.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

457pb

62




NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).


seqüência alvo

Pontuação

máxima

Pontuação

Total

% de

alinhamento

Valor de

expectativa

(E-value)

Identidade

máxima

EF157836.1 Solanum lycopersicum var. cerasiforme phytoene synthase (Psy1) mRNA, complete cds

558 558 57% 9e-156 90%

EF157835.1 Solanum lycopersicum phytoene synthase (Psy1) gene, complete cds

558 558 57% 9e-156 90%

EF157834.1 Solanum lycopersicum var. cerasiforme phytoene synthase (Psy1) gene, complete cds

558 558 57% 9e-156 90%

63

FIGURA 3.4. Amplicons correspondentes a fragmentos gênicos codificadores da enzima

fitoeno sintase sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-2 e PSY-1 tom-2R.

Amplicons foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1)

Solanum pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S.

peruvianum ‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’;

(6) S. neorickii ‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa

Clara CNPH1496’; (9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’;

(11) S. chilense ‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH

796’; (14) S. peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S.

peruvianum ‘CNPH 201’.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

914pb

64






seqüência alvo

Pontuação

máxima

Pontuação

Total

% de

alinhamento

Valor de

expectativa

(E-value)

Identidade

máxima

EF157835.1 Solanum lycopersicum

phytoene synthase (Psy1)

gene, complete cds

348 348 81% 9e-93 90%

EF157834.1 Solanum lycopersicum var.

cerasiforme phytoene

synthase (Psy1) gene,

complete cds

348 348 81% 9e-93 90%

X60441.1 L.esculentum GTom5 gene

for phytoene synthase

316 316 81% 3e-83 88%

65

FIGURA 3.5. Amplicons correspondendo a fragmentos gênicos codificadores da enzima

fitoeno sintase utilizando o par de iniciadores PSY-1 tom-3 e PSY-1 tom-3R. Amplicons

foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. (1) Solanum

pimpinellifolium amarelo ‘CNPH 1037’; (2) S. galapagense ‘CNPH 432’; (3) S. peruvianum

‘CNPH 1277’; (4) S. lycopersicum ‘CNPH 1154’; (5) S. chilense ‘CNPH 410’; (6) S. neorickii

‘CNPH 945’; (7) S. cheesmaniae ‘CNPH 944’; (8) S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’;

(9) S. chmielewskii ‘CNPH 1022’; (10) S. lycopersicum ‘CNPH 1136’; (11) S. chilense

‘CNPH 943’; (12) S. pennellii ‘CNPH 409’; (13) S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; (14) S.

peruvianum ‘CNPH 402’; (15) S. habrochaites ‘CNPH 421’ e (16) S. peruvianum ‘CNPH

201’.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1311pb

66






seqüência alvo

Pontuação

máxima

Pontuação

Total

% de

alinhamento

Valor de

expectativa

(E value)

Identidade

máxima


phytoene synthase (Psy1)

gene, complete cds

261 261 71% 8e-67 95%


var. cerasiforme phytoene

synthase (Psy1) gene,

complete cds

261 261 71% 8e-67 95%

X60441.1 L.esculentum GTom5

gene for phytoene

synthase

235 235 71% 5e-59 93%

Desta forma, os iniciadores de PCR desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados

para amplificação e seqüênciamento dos genes que codificam fitoeno sintase, licopeno b-

ciclase e licopeno e-ciclase na maioria dos acessos de Solanum seção Lycopersicon. A

presença de variações genéticas naturais identificadas após a análise da seqüência destes

fragmentos gênicos pode contribuir para explorar a diversidade destes genes em estudos

taxonômicos de tomate. Estas seqüências podem ainda facilitar a obtenção via PCR de

fragmentos maiores (ou mesmo o gene completo) combinando os iniciadores de síntese já

utilizados e outros iniciadores em regiões conservadas ou nos promotores. Os polimorfismos

encontrados poderão ser utilizados para o desenho de marcadores do tipo CAPS (Cleaved

Amplified Polymorphic Sequences) (KONIECZNY & AUSUBEL, 1993) ou dCAPS

(Michaels & Amasino, 1998) para uso em programas de melhoramento de tomate. Os

iniciadores podem ainda ser utilizados em análises que combinem a expressão dos genes da

via biossintética de carotenóides em acessos com diferentes teores e tipos de carotenóides

com o objetivo de encontrar genes candidatos que expliquem a vasta gama de pigmentos

presentes em frutos de tomate cultivado e selvagens.

67

3.3. Conclusões.

A padronização de um protocolo para PCR com oligonucleotídeos iniciadores

específicos para os genes que codificam as enzimas fitoeno sintase, licopeno β-ciclase e

licopeno ε-ciclase foi satisfatória. Estes protocolos permitiram a obtenção de amplicons de

tamanho esperado e com identidade de seqüência com o conjunto de genes correspondentes

aos codificadores destas enzimas da via biossintética de carotenóides depositados no

GenBank. A disponibilidade destes oligonucleotídeos iniciadores possibilita a caracterização,

via seqüenciamento, de polimorfismos do tipo INDELs ou de SNPs em espécies de tomates

cultivados e selvagens [Solanum (Seção Lycopersicon)]. Tais polimorfismos podem ser

convertidos em marcadores moleculares, podendo ser utilizados em sistemas de seleção

assistida visando o melhoramento para maior teor e diversidade de carotenóides em frutos do

tomateiro.

68

Capítulo 04

Caracterização parcial do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase: Detecção de

polimorfismos e análise filogenética em acessos de diferentes espécies do gênero Solanum

(seção Lycopersicon).

4.0. Introdução.

Além de sua importância econômica e nutricional, o tomateiro [Solanum lycopersicum

L. (Seção Lycopersicon)] se destaca como uma espécie modelo para estudos de genética e

genômica da acumulação de carotenóides, apresentando diversos mutantes para teor e tipos

destes pigmentos em diferentes tecidos (RONEN et al., 1999; 2000). Alguns destes mutantes

têm sido caracterizados em acessos de espécies semi-domesticadas e selvagens. Além disso,

as espécies classificadas dentro da seção Lycopersicon apresentam uma grande variabilidade

de cores dos frutos (ex. Figuras 2.3. e 4.1.). Esta diversidade em cores, em combinação com

outros caracteres morfológicos, tem sido utilizada como um dos principais critérios na

taxonomia de Solanum (seção Lycopersicon).

S. pimpinellifolum S. cheesmaniae S. parviflorum

S. peruvianum S. pennellii

FIGURA 4.1. Variabilidade das cores de algumas espécies de tomate maduro do gênero

Solanum [Secção Lycopersicon]. Fonte: Enciclopedia.us.es. & acervo Charles Rick Center.

69

Mais recentemente, novas características taxonômicas têm sido utilizadas em

inferências filogenéticas dentro de espécies de Solanum (seção Lycopersicon), incluindo

marcadores moleculares e dados de seqüências gênicas (PERALTA & SPOONER, 2001).

Este conjunto de dados moleculares permitiu que posicionamentos taxonômicos

aparentemente consolidados dentro de grupo fossem reavaliados (OLMSTEAD & PALMER,

1992; SPOONER et al., 1993; OLMSTEAD & PALMER, 1997; BOHS & OLMSTEAD,

1997; 1999; OLMSTEAD et al., 1999). PERALTA el al. (2001) conduziram um análise

taxonômica de acessos de espécies pertencentes ao antigo gênero Lycopersicon e as

reclassificaram dentro do gênero Solanum L. seção Lycopersicon [Mill.] Wettst. Subseção

Lycopersicon (PERALTA & SPOONER, 2005). Dados de seqüência do gene GBSSI,

utilizados por PERALTA & SPOONER (2001), permitiram esclarecer a relação filogenética

entre cinco das nove espécies. A espécie L. peruvianum, que apresentava a mais ampla

distribuição geográfica e a maior diversidade fenotípica, foi separada em dois grupos de

acordo com marcos geográficos, sendo um grupo do norte do Peru e outro grupo do sul do

Peru. De fato, RICK (1986) já havia reconhecido três grupos de L. peruvianum no norte do

Peru e um quarto grupo na região central-sul do Peru e norte do Chile. Foram também

identificadas barreiras de cruzamento entre os acessos de L. peruvianum do norte e os do sul

do Peru. Estes resultados também foram validados por dados com marcadores moleculares do

tipo nRLFP (MILLER & TANKSLEY, 1990). Mais recentemente, o complexo L. peruvianum

(L.) Miller foi sub-dividido em quatro espécies, sendo mantida a própria L. peruvianum (= S.

peruvianum) e adicionadas três novas espécies: Solanum corneliomuelleri Macbr = L.

glandulosum Mull. (com distribuição geográfica nas regiões sul e central do Peru); Solanum

arcanum Peralta e Solanum huaylasense Peralta (espécies endêmicas do norte do Peru)

(PERALTA & SPOONER 2005).

Genes nucleares de cópia única e/ou poucas cópias são de grande interesse em estudos

moleculares, uma vez que são potencialmente mais informativos para comparações entre

espécies taxonomicamente próximas (FRASER & BRAMLEY, 2004). Um exemplo do

emprego deste tipo de gene em estudos filogenéticos é o gene nuclear estrutural GBSSI ou

waxy que, em algumas espécies, apresenta cópia única e, em outras, poucas cópias (MASON

& KELLOGG, 1996; 1998; MILLER et al., 1999; WHITSON & MANOS, 1999; PERALTA

& SPOONER, 2005). A cor no fruto do tomate cultivado está diretamente relacionada ao

balanço dos pigmentos carotenóides tais como licopeno, luteína e β-caroteno e,

conseqüentemente, relacionado à funcionalidade da enzima licopeno-b-ciclase. Desta forma,

o gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase pode se constituir em uma excelente

70

ferramenta para a análise filogenética deste grupo taxonômico. Duas enzimas licopeno-β-

ciclase foram isoladas em tomate, uma delas tem expressão específica em cromoplastos de

flores e frutos. Os genes que codificam tais enzimas são de cópia única, não apresentam

introns e suas seqüências de aminoácidos são 53% idênticas (PECKER et al., 1996; RONEN

et al., 2000).

Neste contexto, uma hipótese a ser avaliada é que dados da seqüência dos genes

codificadores da enzima licopeno-β-ciclase dentro de Solanum seção Lycopersicon podem

funcionar como ferramentas adicionais em análises filogenéticas. Além disso, esta análise de

sequencia pode permitir a identificação de variações genéticas naturais entre as distintas

espécies. A identificação de variações do tipo SNPs (“single nucleotide polymorphisms”) ou

INDELs em alelos destes genes pode contribuir para gerar potenciais “marcadores funcionais”

associados com a acumulação de diferentes teores e tipos de carotenóides. Esta estratégia tem

sido eficaz especialmente em vias biossintéticas bem caracterizadas com enzimas codificadas

por classes de genes apresentando domínios conservados (ANDERSEN & LÜBBERSTEDT,

2003), como é o caso da via biossintética dos carotenóides.

Em tomate, a via biossintética dos carotenóides apresenta uma coleção já caracterizada

de “macromutantes” fenotípicos (TANKSLEY, 1993) associados a frutos com distintos teores

de pigmentos carotenóides e/ou colorações em diferentes tecidos, incluindo frutos e flores

(RONEN et al., 2000). As enzimas licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase são codificadas por

genes (de cópia única) já clonados e caracterizados (CUNNINGHAM et al., 1994;

HUGUENEY et al., 1995; SCOLNIK & BARTLEY, 1995; PECKER et al., 1996). No

entanto, ainda não está disponível um catálogo com as sequencias dos genes codificadores das

principais enzimas da via nas diferentes espécies, incluindo o gene codificador da enzima

licopeno-β-ciclase. O objetivo do presente capítulo foi avaliar a utilidade da análise de

seqüência do gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase em revelar polimorfismos entre

acessos dentro do gênero Solanum [Seção Lycopersicon] e de seu emprego com um critério

adicional na taxonomia deste grupamento taxonômico.

71

4.1 Materiais e Métodos.


Foram utilizados os seguintes acessos das espécies do gênero Solanum seção

Lycopersicon: S. habrochaites ‘CNPH 421’; S. chilense ‘CNPH 410’; S. peruvianum ‘CNPH

1277’; S. neorickii ‘CNPH 945’; S. pennellii ‘CNPH 409’; S. galapagense ‘CNPH 432’; S.

cheesmaniae ‘CNPH 944’; S. pimpinellifolium ‘CNPH 796’; S. pimpinellifolium amarelo

‘CNPH 1037’ e S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Os tomates foram cultivados em

casa de vegetação, sob controle de umidade (90% - 95%) e com temperatura diurna variando

entre 21oC e 30oC e temperatura noturna oscilando entre 15oC e 19oC. Não foi utilizada

iluminação complementar. As plantas foram conduzidas em vasos de 5L, preenchidos com

solo esterilizado, no Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças (CNPH) da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).

4.1.2. Purificação de DNA Genômico.

A purificação de DNA de folhas de espécies selvagens e cultivadas de tomate foi feita

usando o método CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) seguindo o protocolo padrão de

DOYLE & DOYLE (1990) com algumas adaptações implementadas por BOITEUX et al.

(1999). O protocolo de purificação do DNA é descrito no capítulo 03.

4.1.3. Estimativa da Concentração do DNA Genômico.

A concentração do DNA purificado foi estimada em gel de agarose 1% (p/v) a partir

de uma solução do marcador de quantidade contendo o fago l (lambda) na concentração de

10ng/mL. Todos os materiais foram diluídos para a concentração final de 20 ng/µL em TE

(Tris 0,01M; EDTA 0,001M; pH 7,0).

4.1.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR).

A PCR foi realizada nos termocicladores PCR System 9700 (Applied Biosystems Co.)

e Mastercycler gradient (Eppendorf). Os reagentes usados na mistura de 25 µL continham, 4

µL de solução DNA (20ng/ml), 2,5µl do tampão PCR (10x) sem MgCl2, 0,25mM dNTP, 2,0

mM MgCl2, e 1U Taq DNA Polymerase, todos da Invitrogentm Life Technologies. Os

iniciadores de síntese utilizados (0,2 mM cada) foram os gerados, especificamente, para

72

amplificação de um fragmento do gene licopeno-b-ciclase e apresentaram as seguintes

seqüências:

“1” iniciador senso (5’-TAGCACCCACATCAAAGCCAGAGT-3’) e

“1R” iniciador anti-senso (5’-CCGAAAAGACACACAAGCTGAGTAAA-3’)

Os ciclos e as temperaturas da PCR foram definidos de acordo com adaptações

geradas após ensaios de otimização. Estes protocolos permitiram obter amplicons únicos e de

boa qualidade/intensidade. Foram estabelecidas as seguintes condições de reação: um ciclo

inicial de desnaturação a 94o C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos repetidos com as

temperaturas de 96oC por 30 segundos, 56oC por 1 minuto e 68oC por 2 minutos, finalizando-

se com um ciclo extra de extensão a 72oC por 10 minutos. Para análise do resultado da

amplificação, os produtos amplificados pela PCR foram analisados em gel de agarose 1%

(p/v), corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz ultravioleta. Os fragmentos com

aproximadamente 1200pb foram purificadas utilizando o S.N.A.P.™ Gel Purification Kit.

4.1.5. Clonagem dos Amplicons.

Após a purificação, os amplicons correspondendo a fragmentos gênicos das espécies

estudadas foi clonado no vetor pGEMT–Easy (Promega), o qual possui o gene de resistência a

ampicilina. O vetor modificado foi inserido em células de Escherichia coli (linhagem XL-

1BLUE-Clontech) por eletroporação. Foram selecionados oito clones por espécie. O DNA

plasmidial das colônias positivas foi extraído com o QIAprep Spin Miniprep Kit e cortado

com EcoR I a 37°C por 3 horas. Dos clones analisados, três que apresentaram fragmentos de

aproximadamente 1200pb de cada amostra foram seqüenciados.

4.1.6. Seqüenciamento dos fragmentos obtidos.

A purificação do DNA plasmidial dos clones acima citados foi realizada pelo método

de lise alcalina, em placas de PCR de 96 poços com uma etapa final de purificação da solução

de DNA através de passagem em placas contendo filtros de 0,45 micras (Millipore). O

seqüênciamento dos clones foi realizado em um seqüenciador ABI PRIMS 3100, utilizando o

kit ABI Prism BigDye version 3.0 chemistry da Applied Biosystems e os iniciadores de síntese

“1” senso e “1R” anti-senso, utilizados individualmente na amplificação de cada amostra, a

fim de obter, através do consenso, um fragmento de maior tamanho possível. Para cada clone

foi utilizado 400 ng de DNA e 5 pmoles dos oligonucleotídeos iniciadores.

73

4.1.7. Análise das Seqüências Correspondentes a Segmentos dos Genes

Codificadores da Enzima Licopeno-b-ciclase.

A qualidade das seqüências foi avaliada através do programa SeqMan (Lasergene,

Madison,WI) e a seqüencias de baixa qualidade foram removidas (ALLEX, 1999). As

seqüências correspondentes ao fragmento gênico de cada uma das espécies estudadas foram

obtidas a partir do consenso dos fragmentos seqüenciados com os iniciadores senso e anti

senso utilizando-se o programa SeqMan (Lasergene)® DNAstar. As seqüências obtidas para o

gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase foram submetidas ao banco de dados do

GenBank pelo programa BLASTn, na página eletrônica do National Center for Biotechnology

Information – NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Todos os clones citados acima apresentaram

identidade com o gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase específico de cromoplasto de

S. esculentum (AF254793). O alinhamento das seqüências foi realizado por meio do software

Megalign (Lasergene,Madison, WI), utilizando-se o método Clustal W com as seguintes

condições: gap penalty e gap length penalty = 10. Foi feito um alinhamento comparando as

seqüências de dez acessos de nove espécies citadas acima e outro com o S. lycopersicum (AF

254793) e acessos das seis espécies estudadas (S. neorickii, S. peruvianum, S. pennellii, S.

cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. lycopersicum ‘Santa Clara’).

4.1.8. Análise do Gene waxy.

A análise do gene waxy foi conduzida para confirmar o status taxonômico dos acessos

utilizados no presente estudo. Os resultados apresentados com o gene waxy nos estudos de

filogenética realizados por PERALTA et al. (2001) foram reproduzidos utilizando o seguinte

par de iniciadores:

“136” (5’-GATGGGCTCCAATCAAGAACTAAT-3’)

“1639” (5’-GCCATTCACAATCCCAGTTATGC-3’).

As condições de PCR foram as seguintes: ciclo inicial de 4 min a 94oC, seguido por 5

ciclos de 30’’ a 94oC / 1 min a 50oC / 1,5 min a 72oC e ainda 30 ciclos (30’’a 94oC / 1 min a

55oC /1,5 min a 72oC) e um ciclo de extensão final de 10 min a 72oC. O gene waxy foi

clonado nos materiais genéticos aqui utilizados, a fim de certificar se as espécies de tomates

estudadas eram as mesmas que foram utilizadas nos experimentos com waxy, uma vez que

iriam ser utilizadas as seqüências deste gene, disponíveis no GenBank, em alinhamento e

filograma, para comparação com os resultados obtidos com o gene licopeno-β-ciclase. Os

fragmentos gênicos obtidos do gene waxy nas espécies utilizadas neste trabalho foram

74

comparados com os já depositados no GenBank. As seqüências obtidas do gene waxy foram:

AY875630 = L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 =

L. pennellii, AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L.

peruvianum, AY875585 L. parviflorum, AY875588=L. chmielewskii e AY875582 = S.

galapagense = L. cheesmaniae. O alinhamento das seqüências também foi realizado por meio

do software Megalign (Lasergene,Madison, WI), utilizando o método Clustal W com as

seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty=10. Neste trabalho não foram

separadas S. peruvianum de Solanum arcanum e S. huaylasense (PERALTA et al., 2005), pois

as informações das seqüências não estavam disponíveis. O tamanho da seqüência utilizada no

alinhamento foi de 1500 bases.

4.1.9. Análise e Identificação dos Polimorfismos de Nucleotídeos.

Após a eliminação de seqüências de baixa qualidade através do programna SeqMan

(Lasergene, Madison, Wi) e alinhamento das seqüências por meio do programa Clustal W

(Megalign, Lasergene, Madison, WI), foram anotadas as ocorrências e as posições de cada

modificação de base.

4.1.10. Análise Filogenética.

A análise de parcimônia foi conduzida usando o programa PAUP 4.0 (Phylogenetic

Analysis Using Parsimony version 3.1, SWOFFORD, 1993), através da busca heurística. Foi

utilizado o índice de suporte bootstrap com 5000 repetições. Associações que tiveram valores

de bootstrap menores do que 50% não foram mostradas nas árvores. O grau de homoplasia foi

avaliado pelo índice de consistência. Todos os espaços (“gaps”) gerados no alinhamento

foram considerados na construção das árvores.

75


Os marcadores moleculares tem sido valiosas ferramentas utilizadas para inferências

filogenéticas em diferentes grupamentos taxonômicos vegetais (SYTSMA, 1990). A

taxonomia clássica de Solanum (seção Lycopersicon) tem se baseado predominantemente na

cor do fruto, que é um fenótipo determinado pelo teor e tipo de carotenóides. As enzimas

licopeno-β-ciclase e licopeno-ε-ciclase, que participam em uma etapa essencial na definição

da composição e conteúdo de β-caroteno e licopeno em frutos de tomate, são codificadas por

genes (de cópia única) que já se encontram clonados e caracterizados (CUNNINGHAM et al.,

1994; HUGUENEY et al., 1995; SCOLNIK & BARTLEY, 1995; PECKER et al., 1996). No

presente estudo, foram obtidas as seqüências parciais do gene codificador da enzima licopeno-

β-ciclase de diversas espécies selvagens de Solanum (seção Lycopersicon) com o objetivo de

avaliar possíveis relações entre cor de fruto e mutações neste gene. As seqüências

apresentaram elevados níveis de identidade com o gene original descrito por RONEN et al.

(2000) e depositado no GenBank (AF 254793), indicando que estes genes/alelos não possuem

introns, dentro do limite defindo pelo par de iniciadores empregados. As seqüências obtidas,

para os diferentes acessos de espécies selvagens são todas inéditas e serão depositadas no

GenBank. Foi feito um alinhamento (Figuras 4.2) e este alinhamento foi utilizado para as

análises de filogenia (Figura 4.3).

A análise das seqüências obtidas indicou a ausência de longas deleções/inserções

(INDELs). Foi observado um total de 63 regiões com polimorfismos de bases tomando como

referência para comparação a seqüência de licopeno-b-ciclase de S. lycopersicum depositada

no GenBank (AF 254793) (Quadro 4.1.). Os polimorfismos de bases foram detectados

predominantemente em espécies com frutos verdes (20 em S. neorickii, 21 em S. peruvianum

e 31 em S. pennellii), 3 em frutos amarelos (S. cheesmaniae) e 8 em frutos vermelhos (S.

pimpinellifolium). Nenhum polimorfismo foi observado entre a seqüência AF 254793 e aquela

obtida do acesso S. lycopersicum ‘Santa Clara CNPH 1496’. Destes 63 polimorfismos

identificados 31 foram do tipo transição, sendo 6 (T/C), 5 (C/T), 8(G/A) e 12 (A/G). 18

polimorfismos foram do tipo transversão, sendo 2 (A/C), 3 (A/T), 4 (G/T), 4 (T/A) e 5 (T/G).

Apenas 45 regiões polimórficas em um fragmento de 1500 bases foram encontradas no gene

waxy (dados não apresentados). Estas regiões polimórficas do gene waxy são

predominantemente regiões de introns (PERALTA & SPOONER, 2001), que estão ausentes

na região do gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase caracterizada neste trabalho.

Desta forma, o elevado número de polimorfismos encontrados no fragmento de licopeno-b-

76

ciclase se equipara a aquele observado em sítios não codantes ou “silenciosos”. Uma

possibilidade ainda não explorada é que estes polimorfismos estejam localizados na terceira

posição do códon de tradução da proteína, o que permitiria mutações silenciosas (SMALL e

al., 2004). Outra possibilidade é que o gene caracterizado neste trabalho, que é um gene

específico de cromoplasto, não seja essencial na síntese de carotenóides em frutos verdes, o

que permitiria então a manutenção no genoma de genes não funcionais da enzima nas

espécies com este fenótipo.

77

FIGURA 4.2. Alinhamento das seqüências do fragmento do gene codificador da enzima

licopeno-β-ciclase. O alinhamento foi obtido utilizando o método Clustal W disponível no

pacote do Lasergene com as seguintes condições: Gap penalty e Gap length penalty = 10. Os

polimorfismos de bases estão identificados em vermelho.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 105S. lycopersicum 'Santa Clara' T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G G A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T T G G A G C T G G 137S. peruvianum LA 0444T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. cheesmaniae LA 1036T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C T G G T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. pennellii LA 0716T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G G A T C G G G C T C A A T T C G A T G T G A T C A T T A T T G G A G C T G G 100S. neorickii LA 1716T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. pimpinellifolium LA 1342T A G C A C C C A C A T C A A A G C C A G A G T C T T T A G A T G T T A A C A T C T C A T G G G T T G A T C C T A A T T C G A A T C G G G C T C A A T T C G A C G T G A T C A T T A T C G G A G C T G G 100S. lycopersicum AF 254793

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 205S. lycopersicum 'Santa Clara' C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A A G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T T T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 237S. peruvianum LA 0444C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. cheesmaniae LA 1036C C C T G C T G G G C T C A G G T T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. pennellii LA 0716C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. neorickii LA 1716C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. pimpinellifolium LA 1342C C C T G C T G G G C T C A G G C T A G C T G A A C A A G T T T C T A A A T A T G G T A T T A A G G T A T G T T G T G T T G A C C C T T C A C C A C T C T C C A T G T G G C C A A A T A A T T A T G G T 200S. lycopersicum AF 254793

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A A A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 305S. lycopersicum 'Santa Clara' G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A A A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 337S. peruvianum LA 0444G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. cheesmaniae LA 1036G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A G A C T A A G T A T T 300S. pennellii LA 0716G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A G A C C A A G T A T T 300S. neorickii LA 1716G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A G A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. pimpinellifolium LA 1342G T T T G G G T T G A T G A G T T T G A G A A T T T A G G A C T G G A A A A T T G T T T A G A T C A T A A A T G G C C T A T G A C T T G T G T G C A T A T A A A T G A T A A C A A A A C T A A G T A T T 300S. lycopersicum AF 254793

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 405S. lycopersicum 'Santa Clara' T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A C A G T T G T G T T G A G A A C G G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 437S. peruvianum LA 0444T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. cheesmaniae LA 1036T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A C A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. pennellii LA 0716T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. neorickii LA 1716T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. pimpinellifolium LA 1342T G G G A A G A C C A T A T G G T A G A G T T A G T A G A A A G A A G C T G A A G T T G A A A T T G T T G A A T A G T T G T G T T G A G A A C A G A G T G A A G T T T T A T A A A G C T A A G G T T T G 400S. lycopersicum AF 254793

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 505S. lycopersicum 'Santa Clara' G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C C T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 537S. peruvianum LA 0444G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. cheesmaniae LA 1036G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. pennellii LA 0716G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. neorickii LA 1716G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. pimpinellifolium LA 1342G A A A G T G G A A C A T G A A G A A T T T G A G T C T T C A A T T G T T T G T G A T G A T G G T A A G A A G A T A A G A G G T A G T T T G G T T G T G G A T G C A A G T G G T T T T G C T A G T G A T 500S. lycopersicum AF 254793

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 603S. lycopersicum 'Santa Clara' T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G G T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 636S. peruvianum LA 0444T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. cheesmaniae LA 1036T T T A T A G A G T A T G A C A A G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G - - - T T T A G A A G A A G T T G A T A A T C A T C C C T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 596S. pennellii LA 0716T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A - T T G C T C C A T G G G G T T T T A A T T G A A G T T G G A T A A T A T C C A T T T G A T T T G G G A T A A A A T G G T 599S. neorickii LA 1716T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. pimpinellifolium LA 1342T T T A T A G A G T A T G A C A G G C C A A G A A A C C A T G G T T A T C A A A T T G C T C A T G G G G - T T T T A G T A G A A G T T G A T A A T C A T C C A T T T G A T T T G G - A T A A A A T G G T 598S. lycopersicum AF 254793

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

G - C T T A T G G A T T G G A G G G - A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 699S. lycopersicum 'Santa Clara' G - C T T A T G G G A T T G G A G G G A T T C T C A T T T - A G G T A A T G A G C C A T A T T - - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 732S. peruvianum LA 0444G - C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 695S. cheesmaniae LA 1036G - - C T A T G G A T T G G A G G G - A T T T T C A T T T - A G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 691S. pennellii LA 0716G G C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T T A G G C A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 698S. neorickii LA 1716G - C T T A T G G A T T G G A G G G G A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 695S. pimpinellifolium LA 1342G - C T T A T G G A T T G G A G G G - A T T C T C A T T T - G G G T A A T G A G C C A T A T T T - A A G G G T G A A T A A T G C T A A A G A A C C A A C A T T C T T G T A T G C A A T G C C A T T T G A 694S. lycopersicum AF 254793

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 795S. lycopersicum 'Santa Clara' T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T G T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 828S. peruvianum LA 0444T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 791S. cheesmaniae LA 1036T A G A A A T T T G G T T T T T C T T G G A A G A G A C T T T C T T T T G G T G A G T C G T C C T G T G T T T T T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 791S. pennellii LA 0716T A G A A A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T T G G T G A G T C G T C C C T G T G T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 796S. neorickii LA 1716T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C C T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 792S. pimpinellifolium LA 1342T A G A G A T T T G G T T T T - C T T G G A A G A G A C T T - C T T T - G G T G A G T C G T C C - T G T T T T A T C G T A T A T G G A A G T A A A A A G A A G G A T G G T G G C A A G A T T A A G G C A 790S. lycopersicum AF 254793

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900

T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 895S. lycopersicum 'Santa Clara' T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 928S. peruvianum LA 0444T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 891S. cheesmaniae LA 1036T T T G G G G A T C A A A G C G A G A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 891S. pennellii LA 0716T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 896S. neorickii LA 1716T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 892S. pimpinellifolium LA 1342T T T G G G G A T C A A A G T G A A A A G T G T T A T T G A G G A A G A G A A A T G T G T G A T C C C T A T G G G A G G A C C A C T T C C G C G G A T T C C T C A A A A T G T T A T G G C T A T T G G T 890S. lycopersicum AF 254793

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 995S. lycopersicum 'Santa Clara' G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 1028S. peruvianum LA 0444G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 991S. cheesmaniae LA 1036G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C G G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 991S. pennellii LA 0716G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 996S. neorickii LA 1716G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 992S. pimpinellifolium LA 1342G G G A A T T C A G G G A T A G T T C A T C C A T C A A C A G G G T A C A T G G T G G C T A G G A G C A T G G C T T T A G C A C C A G T A C T A G C T G A A G C C A T C G T C G A G G G G C T T G G C T 990S. lycopersicum AF 254793

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100

C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1095S. lycopersicum 'Santa Clara' C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1128S. peruvianum LA 0444C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1091S. cheesmaniae LA 1036C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1091S. pennellii LA 0716C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1096S. neorickii LA 1716C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1092S. pimpinellifolium LA 1342C A A C A A G A A T G A T A A G A G G G T C T C A A C T T T A C C A T A G A G T T T G G A A T G G T T T G T G G C C T T T G G A T A G A A G A T G T G T T A G A G A A T G T T A T T C A T T T G G G A T 1090S. lycopersicum AF 254793

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200

G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1195S. lycopersicum 'Santa Clara' G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G G 1228S. peruvianum LA 0444G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1191S. cheesmaniae LA 1036G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1191S. pennellii LA 0716G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1196S. neorickii LA 1716G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1192S. pimpinellifolium LA 1342G G A G A C A T T G T T G A A G C T T G A T T T G A A A G G G A C T A G G A G A T T G T T T G A C G C T T T C T T T G A T C T T G A T C C T A A A T A C T G G C A A G G G T T C C T T T C T T C A A G A 1190S. lycopersicum AF 254793

1210 1220 1230 1240

T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1239S. lycopersicum 'Santa Clara' T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1272S. peruvianum LA 0444T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1235S. cheesmaniae LA 1036T G G G C A A T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1235S. pennellii LA 0716T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1240S. neorickii LA 1716T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1236S. pimpinellifolium LA 1342T T G T C T G T C A A A G A A C T T G G T T T A C T C A G C T T G T G T C T T T T C G G 1234S. lycopersicum AF 254793

78

FIGURA 4.3. Filograma de consenso mostrando nos ramos os valores de Bootstrap (após

5000 repetições). Este filograma foi obtido através de análise de parcimônia baseada no

alinhamento realizado com Clustal W do fragmento gênico correspondente ao gene

codificador da enzima licopeno-β-ciclase específica de cromoplasto de espécies de Solanum.

O índice de consistência foi de 0,73.

S. lycopersicum AF 254793

S. pimpinellifolium LA 1342

S. cheesmaniae LA 1036

S. pennellii LA 0716

S. neorickii LA 1716

S. peruvianum LA 0444

S. lycopersicum ‘Santa Clara ’

63

64

91

58

79

QUADRO 4.1. Sessenta e três sítios de polimorfismos detectados em múltiplas análises de alinhamento de um fragmento gênico correspondente

ao gene codificador da enzima licopeno β-ciclase específico de cromoplasto de sete espécies de Solanum (Seção Lycopersicon). Os números

representam os locais de ocorrência dos polimorfismos ao longo da seqüência amplificada de 1219pb, em um ou mais acessos quando comparado

com a seqüência de referência (S. lycopersicum AF 254793). Os pontos simbolizam inserções e/ou deleções de nucleotídeos. Os polimorfismos

de bases foram identificados com as letras em vermelho, (S) indica os polimorfismos tipo transição e (V) os polimorfismos tipo transversão. Os

polimorfismos correspondendo a inserções/deleções foram identificados pelo símbolo ID.

Acessos 63 64 65 80 92 117 149 176 221 237 290 293 356 372 428 517 540 547 548 549 552 S. lycopersicum “Santa Clara” G A A C C C G C G A A T T A T G A A T G G S. peruvianum LA 0444 G G A C T C A T A G A T C G C G A A T G G S. cheesmaniae LA 1036 G A A C C C G C G G A T T A T G A A T G G S. pennellii LA 0716 T G G C C T G C G G G T C A T A A A T G . S. neorickii LA 1716 G G A T T C G C G G G C T A T G . A T G G S. pimpinellifolium LA 1342 G A A C C C G C G G A T T A T G A C A T G S. lycopersicum AF 254793 G A A C C C G C G A A T T A T G A A T G G Tipo de Polimorfismo V S S S S S S S S S S S S S S S ID V V V ID

Acessos 553 554 559 560 561 569 570 571 579 590 602 603 604 610 611 613 615 616 619 623 630 S. lycopersicum “Santa Clara” . T G A A A T A A . . C T A T G A G . C . S. peruvianum LA 0444 G T G A A A T A A . . C T G A T G A G C . S. cheesmaniae LA 1036 . T G A A A T A A . . C T A T G A G G C . S. pennellii LA 0716 . , G G A A T A C . . . C A T G A G . T . S. neorickii LA 1716 G T A A T G A T A . . C T A T G A G G C T S. pimpinellifolium LA 1342 . T G A A A T A A G G C T A T G A G G C . S. lycopersicum AF 254793 . T G A A A T A A . . C T A T G A G . C . Tipo de Polimorfismo ID ID S S V S V V V ID ID ID S S V V S S ID S ID

Acessos 631 634 648 705 716 731 736 749 750 751 752 753 756 875 818 930 1200 1202 1204 1207 1208 S. lycopersicum “Santa Clara” G T T G . . . . T G T T A T A A A T T T G S. peruvianum LA 0444 A T . A . . . . T G T G A T A A G T T T G S. cheesmaniae LA 1036 G T T A . . . . T G T T A T A A A T T T G S. pennellii LA 0716 A T T A T T T T G T G T T C G G A G G A A S. neorickii LA 1716 A C T A . . . C T G T G A T A A A T T T G S. pimpinellifolium LA 1342 G T T G . . . C T G T T A T A A A T T T G S. lycopersicum AF 254793 G T T G . . . . T G T T A T A A A T T T G Tipo de Polimorfismo S S ID S ID ID ID ID V V V V V S S S S V V V S

80

A árvore filogenética obtida com o gene codificador da enzima licopeno-b-ciclase foi

similar a grupamentos obtidos com dados de morfologia (MULLER, 1940; LUCKWILL,

1943) e também empregando ferramentas moleculares, incluindo a diversidade de seqüência

do gene GBSSI (PERALTA et al., 2005). A análise de bootstrap mostrou que a árvore obtida

teve um suporte variando entre 58% (ramo entre S. peruvianum e S. neorickii) e 91% (ramo

entre S. cheesmaniae e as espécies de fruto verde). Solanum lycopersicum ‘Santa Clara’ e

acesso S. lycopersicon (AF 254793) apresentaram-se idênticos, estando separados das demais

espécies com suporte calculado através de bootstrap de 63%. A ramificação que separa S.

cheesmaniae de S. pimpinellifolium obteve um valor de bootstrap de 64%. Estes resultados

foram muito similares aos obtidos com o gene waxy (Figura 4.4).

FIGURA 4.4. Filograma obtido do alinhamento das seqüências do gene de waxy (PERALTA

& SPOONER, 2001). As seqüências do gene waxy foram obtidas no GenBank: (AY875630 =

L. chilense, AY875633 = L. hirsutum (= Solanum habrochaites), AY875636 = L. pennellii,

AY87541 = L. pimpinellifolium, AY875412 = L. esculentum, AY875413 = L. peruvianum,

AY875585 = L. parviflorum, AY875588 = L. chmielewskii, AY875582 = S. galapagense = L.

cheesmaniae). Os números nos ramos indicam a porcentagem obtida por análise Bootstrap

com 5000 repetições.

A caracterização e isolamento de mutantes apresentando diferentes perfis de

carotenóides tem sido uma estratégia adequada para identificar mecanismos regulatórios

relacionados ao controle do acúmulo de carotenóides em cromoplastos, bem como em

sistemas não fotossintéticos (BOTELLA-PAÍVA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006;

S. chilense

S. habrochaites

S. pennellii

S. pimpinellifolium (vermelho)

S. lycopersicum

S. cheesmaniae

S. neorickii

S. chimielewskii

S. peruvianum

60

65

87

86

81

HARJES et al., 2008). Estudos de identificação, clonagem e diversidade estrutural de genes

envolvidos na via metabólica dos carotenóides são inéditos para muitas destas espécies. Por

sua vez, genes relacionados com a via metabólica dos carotenóides nunca haviam sido

utilizados em análise filogenética da seção Lycopersicon, mesmo com o conhecimento da

importância taxonômica da característica coloração do fruto. Desta forma, os resultados aqui

apresentados podem ainda gerar informações úteis no esclarecimento das relações evolutivas

de tomate e outras espécies relacionadas. Um exemplo ilustrativo da utilidade de estudos

comparativos de seqüências foi descrito por NESBITT & TANKSLEY (2002) em relação ao

impacto da domesticação do tomateiro em regiões genômicas contendo fatores que controlam

tamanho do fruto. No entanto, este tipo de análise ainda necessita ser conduzida para o caráter

cor de fruto.

82

4.3. Conclusões.

A detecção de polimorfismos (de base e INDELs) em acessos de espécies de tomates

cultivados e selvagens do gênero Solanum [Seção Lycopersicon] foi obtida via comparação do

alinhamento de um fragmento do gene codificador da enzima licopeno-β-ciclase. Foi possível

observar um grande número de polimorfismos entre os acessos. A aplicabilidade da

caracterização desta variação genética deste gene é que esta informação pode ser

filogeneticamente informativa. A presença de bases polimórficas na região codante de um

fragmento do gene codificador da enzima licopeno-â-ciclase das espécies de frutos verdes

abre a perspectiva de avaliar novas hipóteses sobre o papel funcional deste gene, que controla

esta importante característica de qualidade nutricional dos frutos do tomateiro cultivado. Estes

polimorfismos podem permitir o desenvolvimento de marcadores moleculares capazes de

identificar a variação alélica dos genes pesquisados, podendo contribuir para o

estabelecimento de um sistema de seleção assistida.

Foi possível concluir que a utilização de genes relacionados à via metabólica dos

carotenóides na reconstrução filogenética de Solanum [seção Lycopersicon] apresentou-se

satisfatória. Este gene mostrou-se informativo e forneceu uma boa resolução além de clarear a

relação entre espécies. Foi observado um agrupamento de acordo com os relacionamentos

evolucionários, apresentando valor de “bootstrap” de 58%-91%. Além disso, esta análise

reforçou a hipótese de que as espécies S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium e S. esculentum são

derivadas de um grupo monofilético.

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