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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
AVALIAÇÃO DA MUTAÇÃO CCR5∆32 DO RECEPTOR DA Β-QUIMIOCINA 5
COMO MARCADOR GENÉTICO-HISTÓRICO NA POPULAÇÃO DE TRIUNFO-PE.
CARLOS JOSÉ DE PESSOA SALDANHA
Recife, PE Agosto, 2008
CARLOS JOSÉ DE PESSOA SALDANHA
AVALIAÇÃO DA MUTAÇÃO CCR5∆32 DO RECEPTOR DA Β-QUIMIOCINA 5
COMO MARCADOR GENÉTICO-HISTÓRICO NA POPULAÇÃO DE TRIUNFO-PE.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do
grau de Mestre em Genética.
Orientadora: Profa. Dra. Rosilda dos
Santos Silva, Depto. de Genética, Centro de
Ciências Biológicas, UFPE.
Recife, PE Agosto, 2008
Saldanha, Carlos José de Pessoa. Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor da β – quimiocina como
marcador genético-histórico na população de Triunfo Pernambuco / Carlos José de Pessoa Saldanha. – Recife: O Autor, 2008. 70 folhas: il., fig., tab. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Programa de Pós-Graduação em Genética, 2008.
Inclui bibliografia e anexos.
1. ccr5. 2. ccr5∆32 3. Mutação. 4. População – Triunfo (PE). I. Título 575.224.2 CDU (2.ed.) UFPE 576.5 CDD (22.ed.) CCB – 2008-195
Aos meus pais, Antonio Carlos
Saldanha (in memorian) e
Camponeza Matos Pessoa, e ao meu
segundo pai e amigo Carlos Mendes.
AGRADECIMENTOS
- Ao professor Dr. Luiz Maurício da Silva, e a professora Dra. Rosilda
dos Santos Silva – que se revezaram em minha orientação – pela
confiança, oportunidade, e pela imensa compreensão a mim sempre
dispensadas principalmente no turbulento final do ano 2007 e início
de 2008. Muito obrigado por tudo.
- À minha amiga de laboratório Adriana Vieira Gomes. Mencionar o
quão sou grato a ela com algumas palavras é, no mínimo, injusto.
- À Glória Raposo pelos valiosos ensinamentos e paciência eterna.
- Aos colegas de mestrado pelos bons momentos vividos juntos e em
especial aos amigos Neto, Esteban, Carolina, Isaac, Cibele, Pollyana,
pelo companheirismo em situações boas e outras nem tanto.
- Ao grande amigo, professor Dr. Valdir Queiroz Balbino, cujo convite,
ainda no Piauí, trouxe-me ao Recife. Quaisquer adjetivos e predicados
são insuficientes.
- Finalmente e não menos importante, à professora Dra. Neide
Santos, cujas palavras há alguns meses foram minha luz no fim do
túnel. Com certeza uma das pessoas mais especiais e agradáveis que
já encontrei na vida.
SUMÁRIO
Lista de figuras ....................................................................... 5 Lista de Tabelas ...................................................................... 6 Resumo .................................................................................. 7 1. Introdução .......................................................................... 8 2. Revisão Bibliográfica ......................................................... 10
2.1 Quimiocinas e seus receptores ................................................... 10
2.2. Receptor da β-quimiocina 5 ...................................................... 12
2.3. O gene ccr5 ............................................................................. 14
2.4. O alelo mutante ccr5∆32 .......................................................... 16
2.4.1. O alelo ccr5∆32 e HIV/AIDS ................................................. 18
2.4.2. Distribuição global do alelo ccr5∆32 ...................................... 21
2.4.3. Origem da mutação ccr5∆32 ................................................ 24
2.4.4. Possível seleção positiva sobre o ccr5∆32 .............................. 26
2.5. Outros Polimorfismos do gene ccr5 ............................................ 28
3. Referências Bibliográficas ................................................ 31 4. Manuscrito de artigo científico .......................................... 41 5. Conclusões ....................................................................... 58 6. Abstract ............................................................................ 60 7. Anexos .............................................................................. 61
7.1. Instruções para autores .......................................................... 61
5
LISTA DE FIGURAS
Revisão Bibliográfica Página Figura 1. Esquema representativo da seqüência de aminoácidos do receptor humano da β-quimiocina 5 (CCR5).
13
Figura 2. Representação esquemática do cromossomo 3 humano.
15
Figura 3. Estrutura do gene ccr5.
16
Figura 4. Representação de parte da seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos mostrando a deleção de 32 pares de bases.
17
Figura 5. Esquema representativo da forma mutante da proteína CCR5.
18
Manuscrito
Figura 1. Mapa do Brasil com o estado de Pernambuco em realce onde se observa a localização das cidades de Recife e Triunfo.
52
6
LISTA DE TABELAS Revisão Bibliográfica Página Tabela 1. Alguns receptores de quimiocinas e seus respectivos ligantes (subfamílias α e β).
10
Tabela 2. Distribuição global do alelo ccr5∆32.
22
Manuscrito Tabela 1. Distribuição das freqüências genotípicas e alélicas considerando o ccr5 e o ccr5∆32.
51
7
RESUMO
O gene ccr5 codifica o receptor β-quimiocina 5 (CCR5), uma proteína
transmembrânica que age como principal co-receptor para os vírus
HIV-1, Variola major e para a bactéria Yersinia pestis, nos
macrófagos e monócitos humanos. Uma deleção de 32 pares de
bases neste gene dá origem ao alelo mutante ccr5∆32 cuja presença,
em homozigose, tem sido relatada em indivíduos resistentes à AIDS.
A mutação ccr5∆32 tem uma origem recente e se deu na Europa, e
atinge suas maiores freqüências nas populações do norte (16% na
Finlândia). Ocorrências isoladas foram descritas no resto do globo,
entretanto resultariam de fluxo gênico recente para essas
populações. Segundo informação verbal popular, Triunfo não se
constitui numa cidade atrativa para imigrações e apresentaria certo
grau de consangüinidade entre os seus 14 mil habitantes, por isso
esta população tornou-se objeto de estudos das freqüências dos
alelos ccr5 e ccr5∆32 para que se pudesse determinar se essas
freqüências divergem ou não das encontradas nos demais Estados
Nordestinos. Foram analisados 345 indivíduos não aparentados desta
população, e após extração por mini salting-out o DNA genômico foi
amplificado por PCR e a partir da eletroforese por PAGE a 5% suas
bandas foram visualizadas por impregnação com AgNO3. As
freqüências genotípicas observadas foram 89,28% (ccr5/ccr5),
10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências alélicas foram
94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32. A população encontra-
se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p= 0,61). A freqüência um
pouco elevada do ccr5∆32 encontrada na população de Triunfo pode
ser resultado da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de
um processo de deriva genética.
Palavras-chave: ccr5, ccr5∆32, mutação, população de Triunfo.
8
1. INTRODUÇÃO
O gene ccr5 está localizado no cromossomo 3 humano na
região p21 e codifica uma proteína transmembrânica, que é um
importante receptor da β-quimiocina (Samson et al., 1996a).
A deleção de 32pb neste gene dá origem ao alelo mutante
ccr5∆32 que com primers apropriados produz um fragmento de
161pb. A presença do alelo mutante em homozigose tem sido
relatada em indivíduos resistentes ao HIV, e em heterozigose foi
observada uma progressão mais lenta à AIDS (Dean et al., 1996; Liu
et al., 1996).
A distribuição global do alelo mutante ccr5∆32 não está
confinada às pessoas de descendência européia, sendo encontrado
com freqüência de 2 a 5% no Oriente Médio e no território Indiano.
Uma freqüência muito baixa foi observada entre Africanos, Japoneses
e ameríndios (Martinson et al., 1997).
Em populações urbanas brasileiras foi encontrada uma
freqüência de 0,035 para o alelo ccr5∆32 e entre os ameríndios
brasileiros examinados no mesmo estudo foi reportada a ausência do
referido alelo. Segundo os autores, a colonização européia explicaria
os valores encontrados (Passos e Picanço, 1998). O mesmo se
poderia dizer com relação às populações nordestinas onde a
freqüência média para o alelo mutante é 0,04 (dados não
publicados).
9
Segundo informação verbal popular, Triunfo não se constitui
numa cidade atrativa para imigrações e apresenta certo grau de
consangüinidade entre os seus 14 mil habitantes. Por isso esta
população tornou-se objeto de estudos das freqüências dos alelos
ccr5 e ccr5∆32 visando-se determinar a freqüência do alelo mutante
ccr5∆32 na população de Triunfo, verificar se as freqüências
observadas dos alelos ccr5 e ccr5∆32 estão de acordo com a
distribuição esperada, comparar os resultados com os encontrados
para os Estados do Nordeste Brasileiro e relatar os resultados
encontrados como representativos para o Sertão Pernambucano até
nova revisão.
10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Quimiocinas e seus receptores
As quimiocinas constituem uma vasta família de proteínas de
baixo peso molecular, geralmente de 6 a 14kDa, que foram
inicialmente caracterizadas pelos seus efeitos quimiotáticos sobre
vários tipos de leucócitos (Ward e Westwick, 1998) e outros tipos de
células (Tabela 1) (Yang, 1999).
Tabela 1. Alguns receptores de quimiocinas e seus respectivos ligantes (subfamílias α e β). Retirado de Rollins, 1997.
Estas proteínas possuem estruturas muito semelhantes entre si
e um grande número de seqüências conservadas de aminoácidos. São
classificadas em subfamílias C, CC, CXC, CXXXC de acordo com o
número e arranjo das cisteínas presentes em posições altamente
conservadas – em todos os casos pontes dissulfeto se formam entre
Receptores Quimiocinas ligantes
CXCR1 IL-8
CXCR2 IL-8, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, NAP-2, ENA-78
CXCR3 IP-10, MIG
CXCR4 SDF-1α
CCR1 MIP-1α, RANTES, MCP-3
CCR2 MCP-1, MCP-3, MCP-5
CCR3 Eoxtaxin, RANTES, MCP-2, MCP-3, ?MCP-4
CCR4 MIP-1α, RANTES, MCP-1, TARC
CCR5 MIP-1α, MIP-1β, RANTES
CCR6 MIP-3α/LARCCCR7 MIP-3β/ELC
11
essas cisteínas (Murphy, 1996; Premack e Schall, 1996; Ward e
Westwick, 1998; Yang et al., 1999).
A subfamília das α-quimiocinas geralmente está envolvida na
atração de neutrófilos, as β-quimiocinas exercem seus efeitos
principalmente nos monócitos, linfócitos, eosinófilos e basófilos. Estas
proteínas, além de atuar em vários eventos inflamatórios in vitro,
exercem respostas em processos de quimiotaxia, liberação de
enzimas, formação de radicais de oxigênio, rearranjos no
citoesqueleto, geração de mediadores intercelulares e recentemente
foi descoberto o seu envolvimento na regulação de células neuronais
e angiogênese (Rollins, 1997; Ward e Westwick, 1998).
As quimiocinas exercem suas funções fisiológicas através da
ligação e ativação de estruturas presentes na superfície celular que
pertencem à família de receptores acoplados à proteína G
transmembrânica (Murphy, 1996; Yang et al., 1999).
As proteínas G são importantes moléculas transmissoras de
sinais. Suas alças extracelulares se ligam às quimiocinas enquanto as
alças da porção intracelular são responsáveis pela sinalização para
que haja a resposta celular (McNicholl et al., 1997; Neves et al.,
2002).
As quimiocinas são um grupo prolífico de proteínas. Entretanto
há um número bem menor de seus receptores, o que ocasiona
ligações não específicas entre essas duas famílias protéicas (Premack
e Schall, 1996). Talvez por isso os receptores sejam estruturalmente
12
bem relacionados, apresentando até 89% de conservação em suas
seqüências de aminoácidos (Baggiolini et al., 1997) e possuam
algumas assinaturas estruturais como a seqüência de aminoácidos –
DRYLAIV – na segunda alça intracelular (Murphy, 1994; Rollins,
1997).
2.2. Receptor da β-quimiocina 5
Os receptores de quimiocinas desempenham outro papel
importante como co-receptores nos processos de infecção de alguns
patógenos, por exemplo, o HIV-1 (Feng et al., 1996).
Vários grupos publicaram em meados de 1996 os resultados de
pesquisas que demonstravam que o receptor β-quimiocina 5 (CCR5)
é o principal co-receptor no processo de invasão dos macrófagos pelo
HIV-1 (m-trópico) (Alkhatib et al. 1996; Choe et al., 1996; Deng et
al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et al., 1996).
O CCR5 é uma proteína com massa molecular de 40,6 kDa com
352 aminoácidos (Samson et al., 1996c). Há quatro cisteínas nas
porções extracelulares que são altamente conservadas nos receptores
de α e β-quimiocinas (Fig. 1). Duas pontes dissulfeto formam-se
entre essas cisteínas: uma entre a região amino-terminal e a terceira
alça, e outra entre as segunda e terceira alças e são responsáveis
pela estrutura tridimensional da molécula (Murphy, 1996).
13
Alguns estudos demonstraram que o CCR5 atua como mediador
para a resposta dos monócitos para três quimiocinas: a proteína
inflamatória de macrófago 1α (MIP-1α), a proteína inflamatória de
macrófago 1β (MIP-1β) e para RANTES (Regulated on Activation,
Normal T Expressed and Secreted) (Combadiere et al., 1996; Raport
et al., 1996; Samson et al., 1996c). O CCR5 foi o primeiro receptor
humano de quimiocina identificado que responde à MIP-1β (Raport et
al., 1996).
Figura 1. Esquema representativo da seqüência de aminoácidos do receptor humano da β-quimiocina 5 (CCR5). A faixa cinza corresponde à membrana celular que separa o meio extracelular (acima da faixa) do intracelular (abaixo). Os aminoácidos que parecem críticos para as funções do CCR5 estão preenchidos em preto. Retirado de Oppermann 2004.
14
2.3. O gene ccr5
A proteína CCR5 é o produto do gene CMKBR5, atualmente
designado ccr5 que possui uma região codificadora de 1056 pares de
bases (Samson et al., 1996c). Este trabalho também demonstrou que
a seqüência de aminoácidos da proteína CCR5 possui grande
similaridade com os demais receptores de β-quimiocinas, chegando a
75% quando comparado ao CCR2.
Os genes CMKBR1, CMKBR2, CMKBR3 e CMKBR5 que codificam
respectivamente os receptores CCR1, CCR2, CCR3 e CCR5, foram
localizados em um cluster no cromossomo humano 3 na região p21.3,
entre os marcadores AFM362WB9 e WI-6983 (Fig 2). Enquanto o
gene CMKBR4 (CCR4) foi encontrado um pouco mais distante na
região p24 do mesmo cromossomo. A proximidade desses genes
sugere que houve eventos recentes de duplicação para a formação
dessa família de receptores (Samson et al., 1996a).
15
B
Figura 2. Representação esquemática do cromossomo 3 humano. As posições dos 5 receptores de quimiocinas estão indicadas. Retirado de Samson et al. (1996a).
Outros grupos também clonaram o gene ccr5 e estabeleceram
uma similaridade de 48-75% na seqüência de aminoácidos da
proteína CCR5 e sua expressão em monócitos, macrófagos, e células
T (Combadiere et al., 1996; Raport et al., 1996).
Segundo Mummidi et al. (1997) o gene ccr5 é organizado em 4
éxons e 2 íntrons. Há um íntron entre os éxons 1 e 2 e outro entre os
éxons 3 e 4. Os éxons 2 e 3 não são separados por íntrons. No éxon
4 encontram-se: onze pares de bases da região 5’ não traduzida (5’-
16
UTR), o quadro aberto de leitura (ORF), e toda a região 3’ não
traduzida (3’-UTR).
A regulação da expressão do ccr5 se mostra complexa e os
transcritos aparentam ser iniciados através de dois promotores
distintos: um promotor denominado PU, localizado à montante do
éxon 1; e o outro denominado PD, provavelmente localizado à
jusante do éxon 1, na região que se estende do íntron 1 ao éxon 3
(Fig.3) (Mummidi et al., 1997).
Figura 3. Estrutura do gene ccr5. Os retângulos em branco são os éxons. As linhas descontínuas os íntrons. Observa-se a suposta posição dos promotores do gene. Retirado de Mummidi et al. (1997).
Embora haja formação de mRNAs com diferentes regiões 5’ não
traduzidas não houve diferenças na seqüência da proteína CCR5
(Mummidi et al., 1997; Guignard et al., 1998).
2.4. O alelo mutante ccr5∆32
Uma deleção de 32 pares de bases dentro da região
codificadora do gene ccr5, correspondente a segunda alça
17
extracelular da proteína CCR5, dá origem a um alelo mutante
denominado ccr5∆32 (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et
al., 1996b).
A deleção resulta numa terminação prematura da tradução
devido a uma mudança na seqüência de leitura dos nucleotídeos
(Samson et al., 1996b) no aminoácido 185 da proteína selvagem
(Fig. 4) (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996).
Figura 4. Representação de parte da seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos mostrando a deleção de 32 pares de bases. Retirado de Liu et al. (1996).
A proteína codificada pelo alelo mutante ccr5∆32 não possui os
últimos três segmentos transmembrânicos do receptor e duas das
três alças extracelulares (Samson et al., 1996b). Ela é constituída por
215 aminoácidos ao invés dos 352 do fenótipo selvagem (Fig. 5)
(Dean et al., 1996; Liu et al., 1996).
O receptor mutante, por sua vez, não apresenta atividade
funcional, pois não possui o terceiro segmento transmembrânico e a
região carboxi-terminal citoplasmática, perdendo os dois domínios
18
envolvidos no processo de acoplamento das proteínas G (Dean et al.,
1996; Liu et al., 1996; Murphy, 1996).
Figura 5. Esquema representativo da forma mutante da proteína CCR5. Observam-se a ausência dos últimos três segmentos transmembrânicos do receptor e duas das três alças extracelulares. Retirado de McNicholl et al. (1997).
2.4.1. O alelo ccr5∆32 e HIV/AIDS
Os primeiros casos de AIDS foram relatados em 1981 pelo CDC
(Centro para Controle de Doenças) nos Estados Unidos (Gottlieb et
al., 1981). E até hoje é um grande problema mundial, talvez a
epidemia mais devastadora das últimas décadas. Segundo a
19
Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2007 havia
aproximadamente 34 milhões de pessoas infectadas, quase 3 milhões
de novos infectados e 2 milhões de mortes causadas pela doença
somente em 2007 (WHO/UNAIDS, 2007).
Em 1984 foi demonstrado que as moléculas CD4 expressas em
macrófagos e linfócitos T são um componente essencial e específico
no processo de invasão das células hospedeiras pelo HIV-1 (Dalgleish
et al., 1984; Klatzmann et al., 1984).
No entanto, observou-se que apenas a presença das proteínas
CD4 na superfície celular não era suficiente para a fusão e entrada
viral na célula, pois células de ratos manipuladas para expressar a
proteína CD4 humana não foram infectadas pelo HIV. Isso sugeria
que haveria outras estruturas atuando como co-receptores na
mediação da infecção (Levy, 1996).
Após a descoberta de que as β-quimiocinas RANTES, MIP-1α e
MIP-1β funcionam como supressores na infecção de macrófagos pelo
HIV-1, in vitro (Cocchi et al., 1995), vários grupos identificaram os
receptores de quimiocinas como os co-receptores na ligação do HIV-1
na célula hospedeira, dentre eles o CXCR4 para cepas de HIV que
invadem os linfócitos T (T-trópico) e o CCR5 tanto na invasão de
macrófagos (m-trópico) quanto de linfócitos T (Alkhatib et al. 1996;
Choe et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et
al., 1996).
20
A descoberta do CCR5 como co-receptor para o HIV-1 deu
novos horizontes para a busca do motivo pelo qual alguns indivíduos
permaneciam não infectados mesmo após várias relações sexuais
com alto risco de contaminação (DeGruttola et al., 1989; Detels et
al., 1994; Paxton et al., 1996).
Uma explicação adequada para este fenômeno surgiu apenas
em 1996 quando três grupos de pesquisa chegaram
independentemente à mesma conclusão: uma deleção de 32 pares de
bases no gene ccr5 poderia conferir proteção contra a infecção pelo
HIV (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et al., 1996b).
Esses estudos reportaram a ausência de homozigotos ccr5∆32 entre
os indivíduos infectados, uma freqüência elevada de homozigotos
entre os indivíduos expostos mas não infectados e evidência de
resistência contra a infecção in vitro.
Entretanto, há de se ter precaução ao assumir que o genótipo
homozigoto para a deleção confere completa resistência ao HIV
(McNicholl et al., 1997), haja vista o fato de que foram identificados
indivíduos ccr5∆32/ccr5∆32 que foram infectados pelo HIV-1. Todavia
deve-se ressaltar que apenas HIVs T-trópicos – que utilizam o CXCR4
como co-receptor - foram isolados nesses indivíduos (Balotta et al.,
1997; Meyer et al., 1997; O’Brien et al., 1997; Michael et al., 1998).
21
2.4.2. Distribuição global do alelo ccr5∆32
O alelo mutante ccr5∆32 não se encontra igualmente
distribuído entre as diferentes populações. Ele possui uma freqüência
aproximada de 10% em caucasianos e é ausente em populações
negras e japonesas (Dean et al., 1996; Liu et al.,1996).
Nos Estados Unidos a freqüência do ccr5∆32 é de
aproximadamente 10% entre caucasianos e 1,7% entre afro-
americanos, sendo a presença da mutação entre os últimos explicada
pela ocorrência de miscigenação (Dean et al., 1996).
A mutação não foi encontrada em populações não-européias.
Entretanto, ela não está confinada apenas às populações européias,
ocorrendo com freqüências de 2 a 5% no Oriente Médio, Ásia e
território indiano. Essas e outras ocorrências isoladas no resto do
globo resultariam de recente fluxo gênico europeu para essas
populações (Martinson et al., 1997).
As maiores freqüências são encontradas no norte da Europa
entre os Judeus Ashkenazi, 25,9% (Lucotte e Smets, 2003), e
decrescem em direção ao sul do continente atingindo 2,38% na
Grécia (Tabela 2) (Martinson et al., 1997).
22
Tabela 2. Distribuição Global do alelo ccr5∆32.
População N %ccr5∆32 Referência
+/∆32 ∆32/∆32
Ashkenazi 29 11 2 25,90 Lucotte e Smets, 2003Mordivinia 86 28 0 16,30 Libert et al. , 1998
Finlândia 98 31 0 15,80 Libert et al. , 1998
Islândia 102 24 3 14,71 Martinson et al. , 1997
Suécia 204 46 6 14,20 Libert et al. , 1998
Rússia 83 21 1 13,90 Libert et al. , 1998
Eslováquia 30 * * 13,30 Stephens et al. , 1998Estônia 158 * * 13,30 Stephens et al. , 1998
Tartária 50 * * 12,00 Stephens et al. , 1998
Lituânia 283 61 2 11,50 Libert et al. , 1998
Hungria 253 * * 11,30 Szalai et al ., 1998
França 620 112 9 11,29 Lucotte, 1997
Noruega 100 21 0 11,00 Dean et al ., 2002Polônia 861 175 7 10,90 Jagodzinski et al ., 2000
Alemanha 208 * * 10,80 Stephens et al. , 1998
Ciganos Húngaros 104 * * 10,10 Szalai et al., 1998
Holanda 364 73 0 10,00 Dean et al ., 2002
Bélgica 704 114 8 9,00 Dean et al ., 2002
Suíça 64 9 1 9,00 Dean et al ., 2002
Espanha - Bascos 29 5 0 8,62 Martinson et al. , 1997Espanha - Catalões 49 8 0 8,16 Martinson et al. , 1997
Áustria 36 6 0 8,00 Dean et al ., 2002
Croácia 303 * * 7,10 Ristic et al ., 2005
Itália 91 10 0 5,49 Martinson et al. , 1997
Portugal 124 13 0 5,20 Lucotte e Mercier, 1998
Geórgia 190 * * 5,00 Kamkamidze et al ., 2005Chipre 84 7 0 4,17 Martinson et al. , 1997
Sardenha 100 13 0 4,00 Libert et al., 1998
Ciganos Búlgaros 47 * * 3,20 Stephens et al., 1998
Paquistão 34 2 0 2,94 Martinson et al. , 1997
Grécia 63 3 0 2,38 Martinson et al. , 1997
Rep. De Tuva 50 * * 2,00 Stephens et al. , 1998
Bornéu 151 0 0 0 Martinson et al. , 1997Fiji 17 0 0 0 Martinson et al., 1997
Filipinas 56 0 0 0 Martinson et al. , 1997
Jamaica 119 0 0 0 Martinson et al., 1997
Hong Kong 50 0 0 0 Martinson et al. , 1997
Líbano 51 0 0 0 Stephens et al., 1998
México (Huicholes) 52 0 0 0 Martinson et al., 1997Mongólia 59 0 0 0 Martinson et al. , 1997
Sri Lanka 37 0 0 0 Martinson et al. , 1997
Sumatra 72 0 0 0 Martinson et al. , 1997Costa do Marfim 87 0 0 0 Martinson et al. , 1997
Genótipos
* = dados não divulgadosN = no de indivíduos investigados
23
Husain et al. (1998) descreveram o primeiro indivíduo portador
do ccr5∆32 da Índia, uma mulher heterozigota. De acordo com os
autores este é um grande achado, pois estudos anteriores
envolvendo populações asiáticas e africanas não revelaram um único
caso de indivíduos heterozigotos ou homozigotos para o referido
alelo.
No sudeste do Brasil, as populações urbanas investigadas por
Passos e Picanço (1998) apresentaram 3,5% como freqüência para o
alelo ccr5∆32, e não foi encontrado nenhum indivíduo homozigoto
para a mutação. Segundo eles esta freqüência pode ser explicada
pela imigração de povos do sul da Europa e de povos mediterrâneos
para o Brasil desde o século XVI. Nenhum ameríndio brasileiro foi
identificado como portador da mutação.
Lebout et al. (1999) reportaram a ausência do alelo ccr5∆32
em 300 indivíduos de quatro tribos indígenas brasileiras da região
amazônica.
Vargas et al. (2006) investigaram 103 indivíduos do município
de Alegrete, no Rio Grande do Sul, classificando-os como brancos,
morenos e negros. As freqüências encontradas para o alelo ccr5∆32
foram 6,8; 6,4; e 3,8%, respectivamente.
24
2.4.3. Origem da mutação ccr5∆32
Algumas evidências indicam que o alelo ccr5∆32 é resultado de
um único evento mutacional, como por exemplo, a alta freqüência
desse alelo em populações caucasianas (Dean et al., 1996; Samson
et al., 1996b; Martinson et al., 1997; Libert et al., 1998), e sua
virtual ausência em populações da Ásia, do Oriente Médio e em
populações africanas e ameríndias (Samson et al., 1996b; Stephens
et al., 1998). Estes fatores indicam que a mutação teria ocorrido uma
única vez após a divergência entre caucasianos e seus ancestrais
africanos (Dean et al., 1996; O’Brien e Dean, 1997; Stephens et al.,
1998).
A possibilidade de mutações recorrentes para o ccr5∆32 é
improvável, pois esse alelo ocorre predominantemente em um
haplótipo, denominado ancestral com freqüência de 90% entre os
estudados, e os demais haplótipos em que o alelo ccr5∆32 se
encontra seriam resultados de mutações desse haplótipo ancestral
(Stephens et al., 1998). Além disso, mutações grandes como a
deleção de 32 pares de bases surgem a uma probabilidade muito
baixa (Galvani e Novembre, 2005).
Para determinar quando ocorreu a mutação no gene ccr5
Stephens et al. (1998) investigaram o desequilíbrio de ligação entre o
ccr5∆32 e alguns microssatélites em 4166 indivíduos de 38
populações. Eles observaram o declínio norte-sul das freqüências do
25
alelo mutante na Europa e sua ausência na África, Oriente Médio e
nas populações ameríndias, e que a mutação teria surgido há
aproximadamente 700 anos – com um intervalo de confiança entre
275 e 1875 anos atrás.
Também em 1998, Libert et al. publicaram um trabalho no qual
inferiram através da análise de taxas de mutação de microssatélites
que a deleção teria ocorrido há 1400 anos – com um alcance de 375
a 3675 anos.
Sabeti et al. (2005) utilizaram a mesma metodologia de
Stephens et al. (1998), adicionando 32 marcadores genéticos e
estimaram uma idade estimada para a mutação de 5075 anos –
variando de 3150 a 7800 anos.
Baseado na observação de que as maiores freqüências do
ccr5∆32 encontram-se nos países nórdicos e vão diminuindo
gradualmente em direção ao sul da Europa, Lucotte (2001) sugeriu
que a mutação provavelmente surgiu em um dos povos escandinavos
e se espalhou pela Europa através da dispersão dos Vikings. Uma vez
eles que conquistaram vastos territórios em todo o continente entre
os séculos VII e X, chegando até mesmo ao extremo leste onde
fundaram o Estado Russo.
Independentemente da provável origem da mutação, as datas
estimadas para seu surgimento mostram que ela é relativamente
recente para que sua freqüência média atingisse seu valor atual
(10%). Stephens et al. (1998) estimaram que assumindo uma
26
pressão seletiva neutra, deriva genética, e 25 anos por cada geração
humana, a idade da deleção ∆32 seria aproximadamente de 127.500
anos.
Essa discrepância entre uma origem recente, há cerca de um
milênio, e uma origem bem antiga, há quase 130 mil anos, sugere
que algum fator deve ter exercido uma pressão seletiva a favor da
deleção para que sua freqüência média tenha se elevado aos níveis
encontrados hoje (Samson et al., 1996b; Carrington et al., 1997;
Libert et al., 1998; Stephens et al., 1998).
2.4.4. Possível seleção positiva sobre o ccr5∆32
Há muita especulação sobre a possível existência da atuação de
seleção a favor do alelo ccr5∆32. A despeito da relação entre o CCR5
e o vírus HIV-1, este não está presente na população humana há
tempo suficiente para ser considerado responsável pela suposta
pressão seletiva (Galvani e Novembre, 2005).
Libert et al. (1998) sugeriram que alguma doença infecciosa
deveria ter exercido seleção sobre o ccr5∆32, pois o receptor CCR5
está envolvido na resposta imune mediada por macrófagos,
monócitos e células T.
Stephens et al. (1998) também especularam que algum
patógeno que utilize o CCR5 como porta de entrada para as células
27
estaria implicado como fator seletivo para o ccr5∆32. A coincidência
entre a origem do alelo (700 anos) e a Peste Negra ocorrida na
Europa entre 1346 e 1352, com múltiplos surtos severos desde
então, faria da peste bubônica (agente etiológico Yersinia pestis) um
candidato óbvio. Outras possibilidades seriam Shigella, Salmonela,
Mycobacterium tuberculosis, sífilis, varíola e influenza.
Galvani e Slatkin (2003) propuseram que a varíola (agente
etiológico Variola major) seria o candidato mais adequado como
pressão seletiva para o alelo mutante. Eles sugeriram que a mutação
surgiu há 1100 anos e como a peste bubônica assolou a Europa por
aproximadamente 400 anos, ela não poderia ter exercido pressão
seletiva suficiente para elevar as freqüências do ccr5∆32 aos valores
atuais. Por outro lado, a varíola teria mais gerações para aumentar as
freqüências, pois ocorreram epidemias durante quase dois mil anos.
Sabeti et al. (2005), após estimar que a origem da mutação se
deu há 5075 anos, sugeriram que os altos valores do ccr5∆32 não
podem ser atribuídos apenas a um forte evento seletivo ocorrido no
último milênio.
Duncan et al. (2005) especularam que uma “febre
hemorrágica” proveniente do Egito, via Constantinopla no ano 542
seria responsável por uma pressão seletiva contínua a favor do alelo
mutante – que segundo os autores tem 2500 anos. Essa febre atingiu
o nordeste europeu e teria se prolongado até 1711 nos países
28
escandinavos e Rússia, o que explicaria a presença das maiores
freqüências do alelo nessa região.
Entretanto, novos achados mostram que a mutação existe há,
pelo menos, 2900 anos com freqüências semelhantes às atuais.
Foram encontradas dezenove ossadas de indivíduos enterrados entre
1750 e 1810 no cemitério de uma igreja na cidade alemã de Goslar;
dezessete ossadas na caverna Lichtestein nas montanhas Harz
datadas de 900 a.C. e outros dezenove esqueletos da vila de Alia, na
Sicília, que morreram por volta de 1837 devido a um surto de cólera.
As freqüências do alelo ccr5∆32 encontradas foram: Goslar – 18,4%,
caverna Lichtestein – 11,8% e vila de Alia – 2,6%. Os resultados
sugeriram que a peste bubônica muito provavelmente não exerceu
maior pressão seletiva sobre a deleção. Os autores do estudo
afirmam que para uma doença exercer essa forte pressão de seleção
resultando na distribuição geográfica específica do ccr5∆32 como a
encontrada nas populações européias modernas, ela teria que ter um
efeito significativo na mortalidade antes da idade reprodutiva por um
longo período de tempo e apóiam a hipótese de que a varíola seria
uma boa candidata (Hummel et al., 2005).
2.5. Outros polimorfismos do gene ccr5
Além da deleção ∆32, outras variantes do gene ccr5 foram
encontradas. Dezesseis novos alelos para o ccr5 foram identificados,
29
sendo uma deleção de três pares de bases na posição 228 (228∆K) e
quinze mutações de ponto – dentre estas, doze causaram alterações
nas seqüências de aminoácidos e três foram sinônimas. As
freqüências observadas das variantes foram baixas entre os
indivíduos analisados e não houve nenhum homozigoto para qualquer
uma delas (Carrington et al., 1997; 1999).
Uma mutação que provocou a substituição de uma timina por
uma adenina na posição 303 (m303) foi encontrada em um indivíduo
heterozigoto para o alelo ccr5∆32. A mutação m303 introduz um stop
códon prematuro na tradução do gene ccr5 e também evita que o
receptor CCR5 se expresse na superfície celular. Testes in vitro
mostraram incapacidade de fusão do HIV-1 com células do indivíduo
que apresentou o genótipo ccr5m303/ccr5∆32 (Quillent et al., 1998).
Uma nova variante do gene ccr5 foi encontrada em uma
população vietnamita. Em uma amostragem de 296 usuários de
drogas intravenosas, havia um portador heterozigoto para uma
mutação na posição 178 do segundo domínio extracelular do CCR5,
onde uma cisteína (TGC) foi trocada por uma arginina (CGC). De
acordo com o estudo o HIV-1 não conseguiu ligar-se à célula,
garantindo proteção parcial contra o mesmo (Magierowska et al.,
1999).
Em 2007, num estudo envolvendo transmissão do HIV entre
mães e seus filhos, foi descrita uma deleção de 24 pares de bases na
região codificadora do ccr5 (hccr5∆24) na população de Kigali, capital
30
da Ruanda. Para os autores a presença de tal mutação é um fato
notável devido à quase inexistência da mutação ccr5∆32 em
populações africanas, e novos estudos são necessários para avaliar
seu papel na infecção pelo HIV (Masquelier et al., 2007).
31
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor da β-quimiocina 5 como marcador genético-histórico
na população de Triunfo-PE.
Manuscrito a ser encaminhado à revista:
Human Genetics
ISSN: 0340-6717
42
Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor β-quimiocina 5 como marcador genético-histórico na população de Triunfo-PE. Carlos José de Pessoa Saldanha1; Luiz Mauricio da Silva2; Rosilda dos Santos Silva2. 1 Programa de Pós-graduação em Genética, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco. 2 Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco. Endereço para correspondência: Rosilda dos Santos Silva Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética Universidade Federal de Pernambuco Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife-PE, Brasil. CEP: 50-732-970 Email: rosilda@ufpe.br
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RESUMO
O gene ccr5 codifica o receptor β-quimiocina 5 (CCR5) nos
macrófagos e monócitos humanos. Uma deleção de 32 pares de
bases neste gene dá origem ao alelo mutante ccr5∆32 cuja presença,
em homozigose, tem sido relatada em indivíduos resistentes à
infecção pelo HIV-1. No presente estudo foram analisados um total
de 345 indivíduos não aparentados da população da cidade de Triunfo
do Estado de Pernambuco, no Nordeste do Brasil, para a
determinação da freqüência do alelo mutante ccr5∆32. O alelo foi
identificado por PCR usando primers específicos gerando fragmentos
de 193 pares de bases para o alelo ccr5 selvagem e de 161 para o
alelo mutante. As freqüências genotípicas observadas foram 89,28%
(ccr5/ccr5), 10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências
alélicas foram 94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32. A
população encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg e as
freqüências observadas não foram significativamente diferentes da
distribuição esperada (p= 0,61). A freqüência um pouco elevada do
ccr5∆32 encontrada na população de Triunfo pode ser resultado da
ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um processo de
deriva genética.
Palavras-chave: ccr5, ccr5∆32, mutação, população de Triunfo.
44
INTRODUÇÃO
O receptor β-quimiocina 5 (CCR5) é o principal mediador na
resposta de monócitos às quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e RANTES
(Combadiere et al., 1996; Raport et al., 1996; Samson et al., 1996c)
e para a fusão celular entre o HIV-1 e monócitos e linfócitos T
(Alkhatib et al. 1996; Choe et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz et
al., 1996; Dragic et al., 1996).
O gene que codifica o CCR5 foi localizado na região p21.3 do
cromossomo 3 humano, e está fisicamente próximo aos genes que
têm como produtos os receptores de β-quimiocinas CCR1, CCR2,
CCR3 e CCR4 (Samson et al., 1996a).
A ocorrência de uma deleção de 32 pares de bases no gene dá
origem ao alelo ccr5∆32 que resulta em uma proteína truncada, não-
funcional e não expressa na membrana celular (Dean et al., 1996, Liu
et al., 1996; Samson et al., 1996b).
O alelo mutante possui uma freqüência média de 10% em
populações caucasianas (Dean et al., 1996, Liu et al., 1996; Samson
et al., 1996b). As freqüências deste alelo encontram-se distribuídas
em um gradiente com valor máximo no norte da Europa - 16,3% na
Mordóvia (Libert et al., 1998), e que decrescem rumo ao sul
atingindo 2,38% na Grécia (Martinson et al., 1997). A mutação é
virtualmente inexistente em populações não-européias, mas há
ocorrências isoladas no resto do globo, como no Oriente Médio, Ásia e
45
território indiano, com freqüências que variam de 2 a 5% (Martinson
et al., 1997). No sudeste brasileiro foi reportada uma freqüência de
3,5% (Passos e Picanço, 1998).
Nos Estados Unidos a freqüência do ccr5∆32 é de
aproximadamente 10% entre caucasianos e 1,7% entre afro-
americanos - a presença da mutação entre os últimos resultaria do
processo de miscigenação (Dean et al., 1996).
No presente trabalho, determinou-se a freqüência do alelo
ccr5∆32 na população de Triunfo no Estado de Pernambuco (Fig. 1),
localizado no Nordeste do Brasil (Latitude -07° 50' 17'' e Longitude
38° 06' 06'') – a primeira população do Sertão Nordestino a ser
investigada para o referido alelo, com o objetivo de avaliar se os
valores encontrados divergiriam das demais populações Nordestinas
investigadas.
46
MATERIAIS E MÉTODOS
No presente estudo foram analisados 345 indivíduos não
aparentados da população de Triunfo, Pernambuco, no nordeste do
Brasil.
O DNA utilizado foi extraído de leucócitos através do método de
mini-salting out (Miller et al., 1988) de amostras de sangue periférico
obtido por punção venosa utilizando ACD (ácido cítrico 0,038M;
citrato de sódio tribásico 0,075M; dextrose 0,133M) como
anticoagulante.
O DNA genômico (50-100ng) de cada indivíduo foi amplificado
em um volume de 25µl contendo tampão Tris-HCl 100mM - pH8,8 e
KCl 50mM; MgCl2 50 mM; albumina 0,05%; dNTP 10mM; 25 pmol de
cada primer; 2µl DNA genômico; 1 U/µl Taq polimerase.
Os primers descritos em Martinson et al. (1997) foram
utilizados para a amplificação da região que envolve a deleção ∆32.
Efetuou-se a PCR em um termociclador Perkin-Elmer 2400 como
segue: 94ºC por 5 minutos, 1 ciclo; 94ºC por 30 segundos e 70ºC
por 30 segundos, 30 ciclos, com um acréscimo de 1 segundo na
temperatura de extensão para cada ciclo.
O produto da PCR foi submetido à eletroforese vertical em gel
de poliacrilamida desnaturante à 5% no seqüenciador manual SQ3
Sequencer-Pharmacia por uma hora a 2000 volts. Após a eletroforese
o gel foi revelado com nitrato de prata. Os alelos - o normal com 193
47
pares de bases e o alelo mutante com 161 pares de bases – foram
identificados por comparação com marcadores de peso molecular.
As freqüências dos alelos ccr5 e ccr5∆32, na população de
Triunfo, foram calculadas por contagem direta. Foram examinadas as
condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg através do teste exato de
Fisher usando o programa GDA (Genomic Data Analysis).
48
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 345 indivíduos genotipados, 308 não possuíam a deleção,
37 eram heterozigotos e nenhum homozigoto ccr5∆32/ccr5∆32 foi
encontrado. As freqüências genotípicas observadas foram 89,28%
(ccr5/ccr5), 10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências
alélicas foram 94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32 (Tabela
1).
As freqüências genotípicas observadas não foram
significativamente diferentes da distribuição esperada segundo o
princípio de Hardy-Weinberg (p= 0,61).
O alelo mutante é inexistente em populações ameríndias
brasileiras (Martinson et al., 1997; Leboute et al., 1999; Grimaldi et
al., 2002). Alguns estudos também demonstraram sua ausência em
populações africanas (Martinson et al., 1997; Stephens et al., 1998).
Todavia, entre afro-brasileiros o alelo ccr5∆32 atinge freqüências que
variam de 1,3% (Chies e Hutz, 2003) a 3,8% (Vargas et al., 2006),
não divergindo do valor encontrado entre os afro-americanos dos
Estados Unidos – 1,7% (Dean et al., 1996).
Alguns estudos com populações urbanas do sudeste brasileiro
reportaram a freqüência de 3,5% para a mutação (Passos e Picanço,
1998); e 6,5%, em média, no sul do país onde a contribuição
européia na formação das populações seria maior (Grimaldi et al.,
2002; Vargas et al., 2006).
49
Como a deleção ∆32 no gene ccr5 seria resultado de um único
evento mutacional ocorrido no nordeste europeu (Libert et al., 1998),
o ccr5∆32 é um eficiente marcador étnico e pode ser utilizado como
indicador de contribuição genética européia em populações
miscigenadas de países não localizados no Velho Mundo.
O fato de que as freqüências do alelo mutante encontradas no
Brasil estão abaixo da média européia poderia ser explicado pela
miscigenação entre os ameríndios brasileiros e os vários grupos
étnicos que migraram para o Brasil desde o período colonial. Ou
ainda, pela prevalência migratória de populações européias onde a
freqüência do alelo mutante não é tão elevada, como por exemplo,
portugueses – 6% (Dean et al., 2002).
A freqüência de 5,36% encontrada para o ccr5∆32 na
população de Triunfo é mais baixa que a encontrada como média na
Europa (10%) (Martinson et al., 1997). Entretanto, este foi o maior
valor encontrado dentre as populações nordestinas já investigadas
pelo nosso grupo, inclusive a do próprio Estado de Pernambuco
(dados em processo de publicação). A saber: os dados que possuímos
do estado de Pernambuco não possuem indivíduos nascidos na cidade
de Triunfo, por isso consideramos essa separação entre as amostras.
Aplicou-se, então, o teste estatístico F de Wright, mas não foi
observada significativa divergência genética entre as populações de
Triunfo e Pernambuco (FST=0.0009), e nem entre Triunfo e as
populações dos nove Estados Nordestinos (FST=0.003199).
50
Assim, a freqüência de 5,36% encontrada na população de
Triunfo, em comparação com a de 4,44% de Pernambuco, pode ser
resultado da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um
processo de deriva genética, tendo em vista que até pouco tempo era
uma cidade de difícil acesso e ainda hoje se constitui num local sem
grandes atrativos para que haja fluxos migratórios consideráveis.
51
Tabela 1. Distribuição das freqüências genotípicas e alélicas considerando o ccr5 e o ccr5∆32.
Genótipo Observado Esperadoccr5/ccr5 308 (89,28%) 309 (89,57%)ccr5/ccr5∆32 37 (10,72%) 35 (10,14%)ccr5∆32/ccr5∆32 0 1 (0,29%)Total 345 345Frequências Alélicasccr5
ccr5∆32
Totalp
0,94640,0536
0,611
52
Figura 1. Mapa do Brasil com o estado de Pernambuco em realce onde se observa a localização das cidades de Recife e Triunfo.
Triunfo
Recife
53
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58
5. CONCLUSÕES
◊ A população estudada encontra-se sob Equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
◊ A freqüência para o alelo mutante ccr5∆32 na população de Triunfo
foi o maior valor encontrado em populações estudadas no Nordeste
Brasileiro.
◊ O teste estatístico F de Wright mostrou que a população da citada
cidade não é geneticamente divergente das demais populações
nordestinas estudadas pelo grupo de pesquisa do Laboratório de
Genética Molecular Humana – UFPE.
◊ O suposto endocruzamento existente nesta população, conforme
informação popular, não foi observado, uma vez que um dos efeitos
diretos do endocruzamento é a diminuição da freqüência de
heterozigotos e o aumento do número de homozigotos. Verificamos o
efeito contrário, pois houve um aumento do número de
heterozigotos.
◊ Assim, a freqüência de 5,36% encontrada na população de Triunfo,
em comparação com a de 4,44% de Pernambuco, pode ser resultado
da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um processo de
59
deriva genética, tendo em vista que até pouco tempo era uma cidade
de difícil acesso e ainda hoje se constitui num local sem grandes
atrativos para que haja fluxos migratórios consideráveis.
60
6. ABSTRACT
The CMKBR5 encodes a 7-transmembrane G-protein-coupled
chemokine receptor (CCR5) in macrophages and lymphocytes. A 32
base pair deletion in the coding region of the ccr5 gene has been
reported in individuals, homozygous for this deletion, who seem to be
resistant to HIV-1 infection. This mutation has a single recent origin
in Northeastern Europe, where the higher frequencies are observed
(16% Finland). There are isolated occurrences throughout the globe,
but they result from recent gene flow to those populations. In the
present study a sample of 345 individuals from Triunfo, a city in the
state of Pernambuco, in the Brazilian northeast was investigated for
the ccr5∆32 allele. The ccr5 alleles were amplified into 193 base pair
fragments and the mutant ccr5∆32 alleles were amplified into 161
base pair fragments. We detected 89.28% of ccr5/ccr5, 10.72% of
ccr5/∆32, but no homozygous ∆32/∆32 individuals were found. The
frequency of the mutant allele is 0.0536. The population is under
Hardy-Weinberg equilibrium (p= 0,61). The ccr5∆32 frequency found
in Triunfo may be due to a genetic drift process or may be result of a
founder effect.
Key-words: ccr5, ccr5∆32, mutation, Triunfo population.
61
7. ANEXOS
7.1 INSTRUÇÕES PARA AUTORES
Revista
Human Genetics
Human Genetics
Editors: D.N. Cooper; Th.J. Hudson
ISSN: 0340-6717
62
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Mutation nomenclature
Mutation nomenclature as recommended by Dunnen JT den,
Antonarakis SE (2001) Nomenclature for the description of human
sequence variations. Hum Genet 109:121–124 must be used.
Gene symbols
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legend should be provided for each figure; legends are part of the
text and should be appended to it on a separate page. Figures in a
form suitable for reproduction should be submitted separately from
the text. The top of the figure, the author, and the figure number
should be written lightly in soft pencil on the back of each.
Lowercase letters (a, b etc.) should be used to identify figure parts. If
illustrations are supplied with uppercase labeling, lowercase letters
will still be used in the figure legends and citations.
Figures should not exceed 17.6 cm in width and 23.6 cm in height.
Smaller figures should be grouped (with narrow spaces between
them) in blocks that fill the page width as nearly as possible. Single,
small figures should not exceed the column width (8.6 cm).
Photographs
Photographs should be supplied in quadruplicate (originals plus three
photocopies): good, original glossy prints suitable for reproduction
with minimal reduction. The editors reserve the right to trim figures
further and regroup them.
One set of photographs should be inscribed with rub-on template
lettering (no ink). The lettering should be about 2 mm in height after
69
any reduction required. If plates are submitted, the figures must be
mounted on regular bond paper, not on cardboard. Slides should be
supplied in preference to Polaroid photographs.
For line drawings please submit good quality prints. The drawings
should be lettered in a size that will yield a final height of 2 mm after
reduction. For coordinate inscriptions, only the first letter of the first
word should be capitalized. Computer drawings are acceptable
provided they are of comparable quality to line drawings. Computer-
drawn curves and lines must be smooth.
Rejected manuscripts: Rejected manuscripts will not normally be
returned, although an effort will be made to return original
photographs and prints.
Provisionally Accepted Manuscripts
Final versions of manuscripts which have been accepted subject to
revision must be returned to the Editor within six weeks of
notification of provisional acceptance. Except by prior arrangement,
revised manuscripts returned after this time will be treated as new
submissions.
Diskettes: Accepted manuscripts must be submitted to the publisher
in final form on diskette. Authors are requested to follow the technical
instructions for manuscripts and illustrations in electronic form
printed in each issue of the Journal and available at Springer’s
website (springer.com).
Proofs
One set of proofs will be sent to the corresponding author prior to
publication. Printer’s errors should be corrected, but a charge will be
70
made for any other changes introduced after the manuscript has been
typeset.
Electronic Supplementary Material
Electronic supplementary material (ESM) for an article in the journal
will be published in SpringerLink provided the material is:
submitted to the Editor(s) in electronic form together with the
paper and is subject to peer review
accepted by the journals Editor(s)
ESM may consist of
information that cannot be printed: animations, video clips, sound
recordings
information that is more convenient in electronic form: sequences,
spectral data, etc.
large original data that relate to the paper, e.g. additional tables,
illustrations (color and black & white), etc.
After acceptance by the journals Editor(s) ESM will be published as
received from the author in the online version only. Reference will be
given in the printed version.
Offprints
One complimentary copy is supplied. Orders for offprints can be
placed by returning the order form with the corrected proofs.