PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

AVALIAÇÃO DA MUTAÇÃO CCR5∆32 DO RECEPTOR DA Β-QUIMIOCINA 5

COMO MARCADOR GENÉTICO-HISTÓRICO NA POPULAÇÃO DE TRIUNFO-PE.

CARLOS JOSÉ DE PESSOA SALDANHA

Recife, PE Agosto, 2008

CARLOS JOSÉ DE PESSOA SALDANHA

AVALIAÇÃO DA MUTAÇÃO CCR5∆32 DO RECEPTOR DA Β-QUIMIOCINA 5

COMO MARCADOR GENÉTICO-HISTÓRICO NA POPULAÇÃO DE TRIUNFO-PE.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte dos

requisitos necessários para a obtenção do

grau de Mestre em Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Rosilda dos

Santos Silva, Depto. de Genética, Centro de

Ciências Biológicas, UFPE.

Recife, PE Agosto, 2008

Saldanha, Carlos José de Pessoa. Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor da β – quimiocina como

marcador genético-histórico na população de Triunfo Pernambuco / Carlos José de Pessoa Saldanha. – Recife: O Autor, 2008. 70 folhas: il., fig., tab. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Programa de Pós-Graduação em Genética, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. ccr5. 2. ccr5∆32 3. Mutação. 4. População – Triunfo (PE). I. Título 575.224.2 CDU (2.ed.) UFPE 576.5 CDD (22.ed.) CCB – 2008-195

Aos meus pais, Antonio Carlos

Saldanha (in memorian) e

Camponeza Matos Pessoa, e ao meu

segundo pai e amigo Carlos Mendes.

AGRADECIMENTOS

- Ao professor Dr. Luiz Maurício da Silva, e a professora Dra. Rosilda

dos Santos Silva – que se revezaram em minha orientação – pela

confiança, oportunidade, e pela imensa compreensão a mim sempre

dispensadas principalmente no turbulento final do ano 2007 e início

de 2008. Muito obrigado por tudo.

- À minha amiga de laboratório Adriana Vieira Gomes. Mencionar o

quão sou grato a ela com algumas palavras é, no mínimo, injusto.

- À Glória Raposo pelos valiosos ensinamentos e paciência eterna.

- Aos colegas de mestrado pelos bons momentos vividos juntos e em

especial aos amigos Neto, Esteban, Carolina, Isaac, Cibele, Pollyana,

pelo companheirismo em situações boas e outras nem tanto.

- Ao grande amigo, professor Dr. Valdir Queiroz Balbino, cujo convite,

ainda no Piauí, trouxe-me ao Recife. Quaisquer adjetivos e predicados

são insuficientes.

- Finalmente e não menos importante, à professora Dra. Neide

Santos, cujas palavras há alguns meses foram minha luz no fim do

túnel. Com certeza uma das pessoas mais especiais e agradáveis que

já encontrei na vida.

SUMÁRIO

Lista de figuras ....................................................................... 5 Lista de Tabelas ...................................................................... 6 Resumo .................................................................................. 7 1. Introdução .......................................................................... 8 2. Revisão Bibliográfica ......................................................... 10

2.1 Quimiocinas e seus receptores ................................................... 10

2.2. Receptor da β-quimiocina 5 ...................................................... 12

2.3. O gene ccr5 ............................................................................. 14

2.4. O alelo mutante ccr5∆32 .......................................................... 16

2.4.1. O alelo ccr5∆32 e HIV/AIDS ................................................. 18

2.4.2. Distribuição global do alelo ccr5∆32 ...................................... 21

2.4.3. Origem da mutação ccr5∆32 ................................................ 24

2.4.4. Possível seleção positiva sobre o ccr5∆32 .............................. 26

2.5. Outros Polimorfismos do gene ccr5 ............................................ 28

3. Referências Bibliográficas ................................................ 31 4. Manuscrito de artigo científico .......................................... 41 5. Conclusões ....................................................................... 58 6. Abstract ............................................................................ 60 7. Anexos .............................................................................. 61

7.1. Instruções para autores .......................................................... 61

5

LISTA DE FIGURAS

Revisão Bibliográfica Página Figura 1. Esquema representativo da seqüência de aminoácidos do receptor humano da β-quimiocina 5 (CCR5).

13

Figura 2. Representação esquemática do cromossomo 3 humano.

15

Figura 3. Estrutura do gene ccr5.

16

Figura 4. Representação de parte da seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos mostrando a deleção de 32 pares de bases.

17

Figura 5. Esquema representativo da forma mutante da proteína CCR5.

18

Manuscrito

Figura 1. Mapa do Brasil com o estado de Pernambuco em realce onde se observa a localização das cidades de Recife e Triunfo.

52

6

LISTA DE TABELAS Revisão Bibliográfica Página Tabela 1. Alguns receptores de quimiocinas e seus respectivos ligantes (subfamílias α e β).

10

Tabela 2. Distribuição global do alelo ccr5∆32.

22

Manuscrito Tabela 1. Distribuição das freqüências genotípicas e alélicas considerando o ccr5 e o ccr5∆32.

51

7

RESUMO

O gene ccr5 codifica o receptor β-quimiocina 5 (CCR5), uma proteína

transmembrânica que age como principal co-receptor para os vírus

HIV-1, Variola major e para a bactéria Yersinia pestis, nos

macrófagos e monócitos humanos. Uma deleção de 32 pares de

bases neste gene dá origem ao alelo mutante ccr5∆32 cuja presença,

em homozigose, tem sido relatada em indivíduos resistentes à AIDS.

A mutação ccr5∆32 tem uma origem recente e se deu na Europa, e

atinge suas maiores freqüências nas populações do norte (16% na

Finlândia). Ocorrências isoladas foram descritas no resto do globo,

entretanto resultariam de fluxo gênico recente para essas

populações. Segundo informação verbal popular, Triunfo não se

constitui numa cidade atrativa para imigrações e apresentaria certo

grau de consangüinidade entre os seus 14 mil habitantes, por isso

esta população tornou-se objeto de estudos das freqüências dos

alelos ccr5 e ccr5∆32 para que se pudesse determinar se essas

freqüências divergem ou não das encontradas nos demais Estados

Nordestinos. Foram analisados 345 indivíduos não aparentados desta

população, e após extração por mini salting-out o DNA genômico foi

amplificado por PCR e a partir da eletroforese por PAGE a 5% suas

bandas foram visualizadas por impregnação com AgNO3. As

freqüências genotípicas observadas foram 89,28% (ccr5/ccr5),

10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências alélicas foram

94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32. A população encontra-

se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p= 0,61). A freqüência um

pouco elevada do ccr5∆32 encontrada na população de Triunfo pode

ser resultado da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de

um processo de deriva genética.

Palavras-chave: ccr5, ccr5∆32, mutação, população de Triunfo.

8

1. INTRODUÇÃO

O gene ccr5 está localizado no cromossomo 3 humano na

região p21 e codifica uma proteína transmembrânica, que é um

importante receptor da β-quimiocina (Samson et al., 1996a).

A deleção de 32pb neste gene dá origem ao alelo mutante

ccr5∆32 que com primers apropriados produz um fragmento de

161pb. A presença do alelo mutante em homozigose tem sido

relatada em indivíduos resistentes ao HIV, e em heterozigose foi

observada uma progressão mais lenta à AIDS (Dean et al., 1996; Liu

et al., 1996).

A distribuição global do alelo mutante ccr5∆32 não está

confinada às pessoas de descendência européia, sendo encontrado

com freqüência de 2 a 5% no Oriente Médio e no território Indiano.

Uma freqüência muito baixa foi observada entre Africanos, Japoneses

e ameríndios (Martinson et al., 1997).

Em populações urbanas brasileiras foi encontrada uma

freqüência de 0,035 para o alelo ccr5∆32 e entre os ameríndios

brasileiros examinados no mesmo estudo foi reportada a ausência do

referido alelo. Segundo os autores, a colonização européia explicaria

os valores encontrados (Passos e Picanço, 1998). O mesmo se

poderia dizer com relação às populações nordestinas onde a

freqüência média para o alelo mutante é 0,04 (dados não

publicados).

9

Segundo informação verbal popular, Triunfo não se constitui

numa cidade atrativa para imigrações e apresenta certo grau de

consangüinidade entre os seus 14 mil habitantes. Por isso esta

população tornou-se objeto de estudos das freqüências dos alelos

ccr5 e ccr5∆32 visando-se determinar a freqüência do alelo mutante

ccr5∆32 na população de Triunfo, verificar se as freqüências

observadas dos alelos ccr5 e ccr5∆32 estão de acordo com a

distribuição esperada, comparar os resultados com os encontrados

para os Estados do Nordeste Brasileiro e relatar os resultados

encontrados como representativos para o Sertão Pernambucano até

nova revisão.

10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Quimiocinas e seus receptores

As quimiocinas constituem uma vasta família de proteínas de

baixo peso molecular, geralmente de 6 a 14kDa, que foram

inicialmente caracterizadas pelos seus efeitos quimiotáticos sobre

vários tipos de leucócitos (Ward e Westwick, 1998) e outros tipos de

células (Tabela 1) (Yang, 1999).

Tabela 1. Alguns receptores de quimiocinas e seus respectivos ligantes (subfamílias α e β). Retirado de Rollins, 1997.

Estas proteínas possuem estruturas muito semelhantes entre si

e um grande número de seqüências conservadas de aminoácidos. São

classificadas em subfamílias C, CC, CXC, CXXXC de acordo com o

número e arranjo das cisteínas presentes em posições altamente

conservadas – em todos os casos pontes dissulfeto se formam entre

Receptores Quimiocinas ligantes

CXCR1 IL-8

CXCR2 IL-8, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, NAP-2, ENA-78

CXCR3 IP-10, MIG

CXCR4 SDF-1α

CCR1 MIP-1α, RANTES, MCP-3

CCR2 MCP-1, MCP-3, MCP-5

CCR3 Eoxtaxin, RANTES, MCP-2, MCP-3, ?MCP-4

CCR4 MIP-1α, RANTES, MCP-1, TARC

CCR5 MIP-1α, MIP-1β, RANTES

CCR6 MIP-3α/LARCCCR7 MIP-3β/ELC

11

essas cisteínas (Murphy, 1996; Premack e Schall, 1996; Ward e

Westwick, 1998; Yang et al., 1999).

A subfamília das α-quimiocinas geralmente está envolvida na

atração de neutrófilos, as β-quimiocinas exercem seus efeitos

principalmente nos monócitos, linfócitos, eosinófilos e basófilos. Estas

proteínas, além de atuar em vários eventos inflamatórios in vitro,

exercem respostas em processos de quimiotaxia, liberação de

enzimas, formação de radicais de oxigênio, rearranjos no

citoesqueleto, geração de mediadores intercelulares e recentemente

foi descoberto o seu envolvimento na regulação de células neuronais

e angiogênese (Rollins, 1997; Ward e Westwick, 1998).

As quimiocinas exercem suas funções fisiológicas através da

ligação e ativação de estruturas presentes na superfície celular que

pertencem à família de receptores acoplados à proteína G

transmembrânica (Murphy, 1996; Yang et al., 1999).

As proteínas G são importantes moléculas transmissoras de

sinais. Suas alças extracelulares se ligam às quimiocinas enquanto as

alças da porção intracelular são responsáveis pela sinalização para

que haja a resposta celular (McNicholl et al., 1997; Neves et al.,

2002).

As quimiocinas são um grupo prolífico de proteínas. Entretanto

há um número bem menor de seus receptores, o que ocasiona

ligações não específicas entre essas duas famílias protéicas (Premack

e Schall, 1996). Talvez por isso os receptores sejam estruturalmente

12

bem relacionados, apresentando até 89% de conservação em suas

seqüências de aminoácidos (Baggiolini et al., 1997) e possuam

algumas assinaturas estruturais como a seqüência de aminoácidos –

DRYLAIV – na segunda alça intracelular (Murphy, 1994; Rollins,

1997).

2.2. Receptor da β-quimiocina 5

Os receptores de quimiocinas desempenham outro papel

importante como co-receptores nos processos de infecção de alguns

patógenos, por exemplo, o HIV-1 (Feng et al., 1996).

Vários grupos publicaram em meados de 1996 os resultados de

pesquisas que demonstravam que o receptor β-quimiocina 5 (CCR5)

é o principal co-receptor no processo de invasão dos macrófagos pelo

HIV-1 (m-trópico) (Alkhatib et al. 1996; Choe et al., 1996; Deng et

al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et al., 1996).

O CCR5 é uma proteína com massa molecular de 40,6 kDa com

352 aminoácidos (Samson et al., 1996c). Há quatro cisteínas nas

porções extracelulares que são altamente conservadas nos receptores

de α e β-quimiocinas (Fig. 1). Duas pontes dissulfeto formam-se

entre essas cisteínas: uma entre a região amino-terminal e a terceira

alça, e outra entre as segunda e terceira alças e são responsáveis

pela estrutura tridimensional da molécula (Murphy, 1996).

13

Alguns estudos demonstraram que o CCR5 atua como mediador

para a resposta dos monócitos para três quimiocinas: a proteína

inflamatória de macrófago 1α (MIP-1α), a proteína inflamatória de

macrófago 1β (MIP-1β) e para RANTES (Regulated on Activation,

Normal T Expressed and Secreted) (Combadiere et al., 1996; Raport

et al., 1996; Samson et al., 1996c). O CCR5 foi o primeiro receptor

humano de quimiocina identificado que responde à MIP-1β (Raport et

al., 1996).

Figura 1. Esquema representativo da seqüência de aminoácidos do receptor humano da β-quimiocina 5 (CCR5). A faixa cinza corresponde à membrana celular que separa o meio extracelular (acima da faixa) do intracelular (abaixo). Os aminoácidos que parecem críticos para as funções do CCR5 estão preenchidos em preto. Retirado de Oppermann 2004.

14

2.3. O gene ccr5

A proteína CCR5 é o produto do gene CMKBR5, atualmente

designado ccr5 que possui uma região codificadora de 1056 pares de

bases (Samson et al., 1996c). Este trabalho também demonstrou que

a seqüência de aminoácidos da proteína CCR5 possui grande

similaridade com os demais receptores de β-quimiocinas, chegando a

75% quando comparado ao CCR2.

Os genes CMKBR1, CMKBR2, CMKBR3 e CMKBR5 que codificam

respectivamente os receptores CCR1, CCR2, CCR3 e CCR5, foram

localizados em um cluster no cromossomo humano 3 na região p21.3,

entre os marcadores AFM362WB9 e WI-6983 (Fig 2). Enquanto o

gene CMKBR4 (CCR4) foi encontrado um pouco mais distante na

região p24 do mesmo cromossomo. A proximidade desses genes

sugere que houve eventos recentes de duplicação para a formação

dessa família de receptores (Samson et al., 1996a).

15

B

Figura 2. Representação esquemática do cromossomo 3 humano. As posições dos 5 receptores de quimiocinas estão indicadas. Retirado de Samson et al. (1996a).

Outros grupos também clonaram o gene ccr5 e estabeleceram

uma similaridade de 48-75% na seqüência de aminoácidos da

proteína CCR5 e sua expressão em monócitos, macrófagos, e células

T (Combadiere et al., 1996; Raport et al., 1996).

Segundo Mummidi et al. (1997) o gene ccr5 é organizado em 4

éxons e 2 íntrons. Há um íntron entre os éxons 1 e 2 e outro entre os

éxons 3 e 4. Os éxons 2 e 3 não são separados por íntrons. No éxon

4 encontram-se: onze pares de bases da região 5’ não traduzida (5’-

16

UTR), o quadro aberto de leitura (ORF), e toda a região 3’ não

traduzida (3’-UTR).

A regulação da expressão do ccr5 se mostra complexa e os

transcritos aparentam ser iniciados através de dois promotores

distintos: um promotor denominado PU, localizado à montante do

éxon 1; e o outro denominado PD, provavelmente localizado à

jusante do éxon 1, na região que se estende do íntron 1 ao éxon 3

(Fig.3) (Mummidi et al., 1997).

Figura 3. Estrutura do gene ccr5. Os retângulos em branco são os éxons. As linhas descontínuas os íntrons. Observa-se a suposta posição dos promotores do gene. Retirado de Mummidi et al. (1997).

Embora haja formação de mRNAs com diferentes regiões 5’ não

traduzidas não houve diferenças na seqüência da proteína CCR5

(Mummidi et al., 1997; Guignard et al., 1998).

2.4. O alelo mutante ccr5∆32

Uma deleção de 32 pares de bases dentro da região

codificadora do gene ccr5, correspondente a segunda alça

17

extracelular da proteína CCR5, dá origem a um alelo mutante

denominado ccr5∆32 (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et

al., 1996b).

A deleção resulta numa terminação prematura da tradução

devido a uma mudança na seqüência de leitura dos nucleotídeos

(Samson et al., 1996b) no aminoácido 185 da proteína selvagem

(Fig. 4) (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996).

Figura 4. Representação de parte da seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos mostrando a deleção de 32 pares de bases. Retirado de Liu et al. (1996).

A proteína codificada pelo alelo mutante ccr5∆32 não possui os

últimos três segmentos transmembrânicos do receptor e duas das

três alças extracelulares (Samson et al., 1996b). Ela é constituída por

215 aminoácidos ao invés dos 352 do fenótipo selvagem (Fig. 5)

(Dean et al., 1996; Liu et al., 1996).

O receptor mutante, por sua vez, não apresenta atividade

funcional, pois não possui o terceiro segmento transmembrânico e a

região carboxi-terminal citoplasmática, perdendo os dois domínios

18

envolvidos no processo de acoplamento das proteínas G (Dean et al.,

1996; Liu et al., 1996; Murphy, 1996).

Figura 5. Esquema representativo da forma mutante da proteína CCR5. Observam-se a ausência dos últimos três segmentos transmembrânicos do receptor e duas das três alças extracelulares. Retirado de McNicholl et al. (1997).

2.4.1. O alelo ccr5∆32 e HIV/AIDS

Os primeiros casos de AIDS foram relatados em 1981 pelo CDC

(Centro para Controle de Doenças) nos Estados Unidos (Gottlieb et

al., 1981). E até hoje é um grande problema mundial, talvez a

epidemia mais devastadora das últimas décadas. Segundo a

19

Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2007 havia

aproximadamente 34 milhões de pessoas infectadas, quase 3 milhões

de novos infectados e 2 milhões de mortes causadas pela doença

somente em 2007 (WHO/UNAIDS, 2007).

Em 1984 foi demonstrado que as moléculas CD4 expressas em

macrófagos e linfócitos T são um componente essencial e específico

no processo de invasão das células hospedeiras pelo HIV-1 (Dalgleish

et al., 1984; Klatzmann et al., 1984).

No entanto, observou-se que apenas a presença das proteínas

CD4 na superfície celular não era suficiente para a fusão e entrada

viral na célula, pois células de ratos manipuladas para expressar a

proteína CD4 humana não foram infectadas pelo HIV. Isso sugeria

que haveria outras estruturas atuando como co-receptores na

mediação da infecção (Levy, 1996).

Após a descoberta de que as β-quimiocinas RANTES, MIP-1α e

MIP-1β funcionam como supressores na infecção de macrófagos pelo

HIV-1, in vitro (Cocchi et al., 1995), vários grupos identificaram os

receptores de quimiocinas como os co-receptores na ligação do HIV-1

na célula hospedeira, dentre eles o CXCR4 para cepas de HIV que

invadem os linfócitos T (T-trópico) e o CCR5 tanto na invasão de

macrófagos (m-trópico) quanto de linfócitos T (Alkhatib et al. 1996;

Choe et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et

al., 1996).

20

A descoberta do CCR5 como co-receptor para o HIV-1 deu

novos horizontes para a busca do motivo pelo qual alguns indivíduos

permaneciam não infectados mesmo após várias relações sexuais

com alto risco de contaminação (DeGruttola et al., 1989; Detels et

al., 1994; Paxton et al., 1996).

Uma explicação adequada para este fenômeno surgiu apenas

em 1996 quando três grupos de pesquisa chegaram

independentemente à mesma conclusão: uma deleção de 32 pares de

bases no gene ccr5 poderia conferir proteção contra a infecção pelo

HIV (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et al., 1996b).

Esses estudos reportaram a ausência de homozigotos ccr5∆32 entre

os indivíduos infectados, uma freqüência elevada de homozigotos

entre os indivíduos expostos mas não infectados e evidência de

resistência contra a infecção in vitro.

Entretanto, há de se ter precaução ao assumir que o genótipo

homozigoto para a deleção confere completa resistência ao HIV

(McNicholl et al., 1997), haja vista o fato de que foram identificados

indivíduos ccr5∆32/ccr5∆32 que foram infectados pelo HIV-1. Todavia

deve-se ressaltar que apenas HIVs T-trópicos – que utilizam o CXCR4

como co-receptor - foram isolados nesses indivíduos (Balotta et al.,

1997; Meyer et al., 1997; O’Brien et al., 1997; Michael et al., 1998).

21

2.4.2. Distribuição global do alelo ccr5∆32

O alelo mutante ccr5∆32 não se encontra igualmente

distribuído entre as diferentes populações. Ele possui uma freqüência

aproximada de 10% em caucasianos e é ausente em populações

negras e japonesas (Dean et al., 1996; Liu et al.,1996).

Nos Estados Unidos a freqüência do ccr5∆32 é de

aproximadamente 10% entre caucasianos e 1,7% entre afro-

americanos, sendo a presença da mutação entre os últimos explicada

pela ocorrência de miscigenação (Dean et al., 1996).

A mutação não foi encontrada em populações não-européias.

Entretanto, ela não está confinada apenas às populações européias,

ocorrendo com freqüências de 2 a 5% no Oriente Médio, Ásia e

território indiano. Essas e outras ocorrências isoladas no resto do

globo resultariam de recente fluxo gênico europeu para essas

populações (Martinson et al., 1997).

As maiores freqüências são encontradas no norte da Europa

entre os Judeus Ashkenazi, 25,9% (Lucotte e Smets, 2003), e

decrescem em direção ao sul do continente atingindo 2,38% na

Grécia (Tabela 2) (Martinson et al., 1997).

22

Tabela 2. Distribuição Global do alelo ccr5∆32.

População N %ccr5∆32 Referência

+/∆32 ∆32/∆32

Ashkenazi 29 11 2 25,90 Lucotte e Smets, 2003Mordivinia 86 28 0 16,30 Libert et al. , 1998

Finlândia 98 31 0 15,80 Libert et al. , 1998

Islândia 102 24 3 14,71 Martinson et al. , 1997

Suécia 204 46 6 14,20 Libert et al. , 1998

Rússia 83 21 1 13,90 Libert et al. , 1998

Eslováquia 30 * * 13,30 Stephens et al. , 1998Estônia 158 * * 13,30 Stephens et al. , 1998

Tartária 50 * * 12,00 Stephens et al. , 1998

Lituânia 283 61 2 11,50 Libert et al. , 1998

Hungria 253 * * 11,30 Szalai et al ., 1998

França 620 112 9 11,29 Lucotte, 1997

Noruega 100 21 0 11,00 Dean et al ., 2002Polônia 861 175 7 10,90 Jagodzinski et al ., 2000

Alemanha 208 * * 10,80 Stephens et al. , 1998

Ciganos Húngaros 104 * * 10,10 Szalai et al., 1998

Holanda 364 73 0 10,00 Dean et al ., 2002

Bélgica 704 114 8 9,00 Dean et al ., 2002

Suíça 64 9 1 9,00 Dean et al ., 2002

Espanha - Bascos 29 5 0 8,62 Martinson et al. , 1997Espanha - Catalões 49 8 0 8,16 Martinson et al. , 1997

Áustria 36 6 0 8,00 Dean et al ., 2002

Croácia 303 * * 7,10 Ristic et al ., 2005

Itália 91 10 0 5,49 Martinson et al. , 1997

Portugal 124 13 0 5,20 Lucotte e Mercier, 1998

Geórgia 190 * * 5,00 Kamkamidze et al ., 2005Chipre 84 7 0 4,17 Martinson et al. , 1997

Sardenha 100 13 0 4,00 Libert et al., 1998

Ciganos Búlgaros 47 * * 3,20 Stephens et al., 1998

Paquistão 34 2 0 2,94 Martinson et al. , 1997

Grécia 63 3 0 2,38 Martinson et al. , 1997

Rep. De Tuva 50 * * 2,00 Stephens et al. , 1998

Bornéu 151 0 0 0 Martinson et al. , 1997Fiji 17 0 0 0 Martinson et al., 1997

Filipinas 56 0 0 0 Martinson et al. , 1997

Jamaica 119 0 0 0 Martinson et al., 1997

Hong Kong 50 0 0 0 Martinson et al. , 1997

Líbano 51 0 0 0 Stephens et al., 1998

México (Huicholes) 52 0 0 0 Martinson et al., 1997Mongólia 59 0 0 0 Martinson et al. , 1997

Sri Lanka 37 0 0 0 Martinson et al. , 1997

Sumatra 72 0 0 0 Martinson et al. , 1997Costa do Marfim 87 0 0 0 Martinson et al. , 1997

Genótipos

* = dados não divulgadosN = no de indivíduos investigados

23

Husain et al. (1998) descreveram o primeiro indivíduo portador

do ccr5∆32 da Índia, uma mulher heterozigota. De acordo com os

autores este é um grande achado, pois estudos anteriores

envolvendo populações asiáticas e africanas não revelaram um único

caso de indivíduos heterozigotos ou homozigotos para o referido

alelo.

No sudeste do Brasil, as populações urbanas investigadas por

Passos e Picanço (1998) apresentaram 3,5% como freqüência para o

alelo ccr5∆32, e não foi encontrado nenhum indivíduo homozigoto

para a mutação. Segundo eles esta freqüência pode ser explicada

pela imigração de povos do sul da Europa e de povos mediterrâneos

para o Brasil desde o século XVI. Nenhum ameríndio brasileiro foi

identificado como portador da mutação.

Lebout et al. (1999) reportaram a ausência do alelo ccr5∆32

em 300 indivíduos de quatro tribos indígenas brasileiras da região

amazônica.

Vargas et al. (2006) investigaram 103 indivíduos do município

de Alegrete, no Rio Grande do Sul, classificando-os como brancos,

morenos e negros. As freqüências encontradas para o alelo ccr5∆32

foram 6,8; 6,4; e 3,8%, respectivamente.

24

2.4.3. Origem da mutação ccr5∆32

Algumas evidências indicam que o alelo ccr5∆32 é resultado de

um único evento mutacional, como por exemplo, a alta freqüência

desse alelo em populações caucasianas (Dean et al., 1996; Samson

et al., 1996b; Martinson et al., 1997; Libert et al., 1998), e sua

virtual ausência em populações da Ásia, do Oriente Médio e em

populações africanas e ameríndias (Samson et al., 1996b; Stephens

et al., 1998). Estes fatores indicam que a mutação teria ocorrido uma

única vez após a divergência entre caucasianos e seus ancestrais

africanos (Dean et al., 1996; O’Brien e Dean, 1997; Stephens et al.,

1998).

A possibilidade de mutações recorrentes para o ccr5∆32 é

improvável, pois esse alelo ocorre predominantemente em um

haplótipo, denominado ancestral com freqüência de 90% entre os

estudados, e os demais haplótipos em que o alelo ccr5∆32 se

encontra seriam resultados de mutações desse haplótipo ancestral

(Stephens et al., 1998). Além disso, mutações grandes como a

deleção de 32 pares de bases surgem a uma probabilidade muito

baixa (Galvani e Novembre, 2005).

Para determinar quando ocorreu a mutação no gene ccr5

Stephens et al. (1998) investigaram o desequilíbrio de ligação entre o

ccr5∆32 e alguns microssatélites em 4166 indivíduos de 38

populações. Eles observaram o declínio norte-sul das freqüências do

25

alelo mutante na Europa e sua ausência na África, Oriente Médio e

nas populações ameríndias, e que a mutação teria surgido há

aproximadamente 700 anos – com um intervalo de confiança entre

275 e 1875 anos atrás.

Também em 1998, Libert et al. publicaram um trabalho no qual

inferiram através da análise de taxas de mutação de microssatélites

que a deleção teria ocorrido há 1400 anos – com um alcance de 375

a 3675 anos.

Sabeti et al. (2005) utilizaram a mesma metodologia de

Stephens et al. (1998), adicionando 32 marcadores genéticos e

estimaram uma idade estimada para a mutação de 5075 anos –

variando de 3150 a 7800 anos.

Baseado na observação de que as maiores freqüências do

ccr5∆32 encontram-se nos países nórdicos e vão diminuindo

gradualmente em direção ao sul da Europa, Lucotte (2001) sugeriu

que a mutação provavelmente surgiu em um dos povos escandinavos

e se espalhou pela Europa através da dispersão dos Vikings. Uma vez

eles que conquistaram vastos territórios em todo o continente entre

os séculos VII e X, chegando até mesmo ao extremo leste onde

fundaram o Estado Russo.

Independentemente da provável origem da mutação, as datas

estimadas para seu surgimento mostram que ela é relativamente

recente para que sua freqüência média atingisse seu valor atual

(10%). Stephens et al. (1998) estimaram que assumindo uma

26

pressão seletiva neutra, deriva genética, e 25 anos por cada geração

humana, a idade da deleção ∆32 seria aproximadamente de 127.500

anos.

Essa discrepância entre uma origem recente, há cerca de um

milênio, e uma origem bem antiga, há quase 130 mil anos, sugere

que algum fator deve ter exercido uma pressão seletiva a favor da

deleção para que sua freqüência média tenha se elevado aos níveis

encontrados hoje (Samson et al., 1996b; Carrington et al., 1997;

Libert et al., 1998; Stephens et al., 1998).

2.4.4. Possível seleção positiva sobre o ccr5∆32

Há muita especulação sobre a possível existência da atuação de

seleção a favor do alelo ccr5∆32. A despeito da relação entre o CCR5

e o vírus HIV-1, este não está presente na população humana há

tempo suficiente para ser considerado responsável pela suposta

pressão seletiva (Galvani e Novembre, 2005).

Libert et al. (1998) sugeriram que alguma doença infecciosa

deveria ter exercido seleção sobre o ccr5∆32, pois o receptor CCR5

está envolvido na resposta imune mediada por macrófagos,

monócitos e células T.

Stephens et al. (1998) também especularam que algum

patógeno que utilize o CCR5 como porta de entrada para as células

27

estaria implicado como fator seletivo para o ccr5∆32. A coincidência

entre a origem do alelo (700 anos) e a Peste Negra ocorrida na

Europa entre 1346 e 1352, com múltiplos surtos severos desde

então, faria da peste bubônica (agente etiológico Yersinia pestis) um

candidato óbvio. Outras possibilidades seriam Shigella, Salmonela,

Mycobacterium tuberculosis, sífilis, varíola e influenza.

Galvani e Slatkin (2003) propuseram que a varíola (agente

etiológico Variola major) seria o candidato mais adequado como

pressão seletiva para o alelo mutante. Eles sugeriram que a mutação

surgiu há 1100 anos e como a peste bubônica assolou a Europa por

aproximadamente 400 anos, ela não poderia ter exercido pressão

seletiva suficiente para elevar as freqüências do ccr5∆32 aos valores

atuais. Por outro lado, a varíola teria mais gerações para aumentar as

freqüências, pois ocorreram epidemias durante quase dois mil anos.

Sabeti et al. (2005), após estimar que a origem da mutação se

deu há 5075 anos, sugeriram que os altos valores do ccr5∆32 não

podem ser atribuídos apenas a um forte evento seletivo ocorrido no

último milênio.

Duncan et al. (2005) especularam que uma “febre

hemorrágica” proveniente do Egito, via Constantinopla no ano 542

seria responsável por uma pressão seletiva contínua a favor do alelo

mutante – que segundo os autores tem 2500 anos. Essa febre atingiu

o nordeste europeu e teria se prolongado até 1711 nos países

28

escandinavos e Rússia, o que explicaria a presença das maiores

freqüências do alelo nessa região.

Entretanto, novos achados mostram que a mutação existe há,

pelo menos, 2900 anos com freqüências semelhantes às atuais.

Foram encontradas dezenove ossadas de indivíduos enterrados entre

1750 e 1810 no cemitério de uma igreja na cidade alemã de Goslar;

dezessete ossadas na caverna Lichtestein nas montanhas Harz

datadas de 900 a.C. e outros dezenove esqueletos da vila de Alia, na

Sicília, que morreram por volta de 1837 devido a um surto de cólera.

As freqüências do alelo ccr5∆32 encontradas foram: Goslar – 18,4%,

caverna Lichtestein – 11,8% e vila de Alia – 2,6%. Os resultados

sugeriram que a peste bubônica muito provavelmente não exerceu

maior pressão seletiva sobre a deleção. Os autores do estudo

afirmam que para uma doença exercer essa forte pressão de seleção

resultando na distribuição geográfica específica do ccr5∆32 como a

encontrada nas populações européias modernas, ela teria que ter um

efeito significativo na mortalidade antes da idade reprodutiva por um

longo período de tempo e apóiam a hipótese de que a varíola seria

uma boa candidata (Hummel et al., 2005).

2.5. Outros polimorfismos do gene ccr5

Além da deleção ∆32, outras variantes do gene ccr5 foram

encontradas. Dezesseis novos alelos para o ccr5 foram identificados,

29

sendo uma deleção de três pares de bases na posição 228 (228∆K) e

quinze mutações de ponto – dentre estas, doze causaram alterações

nas seqüências de aminoácidos e três foram sinônimas. As

freqüências observadas das variantes foram baixas entre os

indivíduos analisados e não houve nenhum homozigoto para qualquer

uma delas (Carrington et al., 1997; 1999).

Uma mutação que provocou a substituição de uma timina por

uma adenina na posição 303 (m303) foi encontrada em um indivíduo

heterozigoto para o alelo ccr5∆32. A mutação m303 introduz um stop

códon prematuro na tradução do gene ccr5 e também evita que o

receptor CCR5 se expresse na superfície celular. Testes in vitro

mostraram incapacidade de fusão do HIV-1 com células do indivíduo

que apresentou o genótipo ccr5m303/ccr5∆32 (Quillent et al., 1998).

Uma nova variante do gene ccr5 foi encontrada em uma

população vietnamita. Em uma amostragem de 296 usuários de

drogas intravenosas, havia um portador heterozigoto para uma

mutação na posição 178 do segundo domínio extracelular do CCR5,

onde uma cisteína (TGC) foi trocada por uma arginina (CGC). De

acordo com o estudo o HIV-1 não conseguiu ligar-se à célula,

garantindo proteção parcial contra o mesmo (Magierowska et al.,

1999).

Em 2007, num estudo envolvendo transmissão do HIV entre

mães e seus filhos, foi descrita uma deleção de 24 pares de bases na

região codificadora do ccr5 (hccr5∆24) na população de Kigali, capital

30

da Ruanda. Para os autores a presença de tal mutação é um fato

notável devido à quase inexistência da mutação ccr5∆32 em

populações africanas, e novos estudos são necessários para avaliar

seu papel na infecção pelo HIV (Masquelier et al., 2007).

31

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO

Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor da β-quimiocina 5 como marcador genético-histórico

na população de Triunfo-PE.

Manuscrito a ser encaminhado à revista:

Human Genetics

ISSN: 0340-6717

42

Avaliação da mutação ccr5∆32 do receptor β-quimiocina 5 como marcador genético-histórico na população de Triunfo-PE. Carlos José de Pessoa Saldanha1; Luiz Mauricio da Silva2; Rosilda dos Santos Silva2. 1 Programa de Pós-graduação em Genética, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco. 2 Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco. Endereço para correspondência: Rosilda dos Santos Silva Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética Universidade Federal de Pernambuco Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife-PE, Brasil. CEP: 50-732-970 Email: rosilda@ufpe.br

43

RESUMO

O gene ccr5 codifica o receptor β-quimiocina 5 (CCR5) nos

macrófagos e monócitos humanos. Uma deleção de 32 pares de

bases neste gene dá origem ao alelo mutante ccr5∆32 cuja presença,

em homozigose, tem sido relatada em indivíduos resistentes à

infecção pelo HIV-1. No presente estudo foram analisados um total

de 345 indivíduos não aparentados da população da cidade de Triunfo

do Estado de Pernambuco, no Nordeste do Brasil, para a

determinação da freqüência do alelo mutante ccr5∆32. O alelo foi

identificado por PCR usando primers específicos gerando fragmentos

de 193 pares de bases para o alelo ccr5 selvagem e de 161 para o

alelo mutante. As freqüências genotípicas observadas foram 89,28%

(ccr5/ccr5), 10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências

alélicas foram 94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32. A

população encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg e as

freqüências observadas não foram significativamente diferentes da

distribuição esperada (p= 0,61). A freqüência um pouco elevada do

ccr5∆32 encontrada na população de Triunfo pode ser resultado da

ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um processo de

deriva genética.

Palavras-chave: ccr5, ccr5∆32, mutação, população de Triunfo.

44

INTRODUÇÃO

O receptor β-quimiocina 5 (CCR5) é o principal mediador na

resposta de monócitos às quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e RANTES

(Combadiere et al., 1996; Raport et al., 1996; Samson et al., 1996c)

e para a fusão celular entre o HIV-1 e monócitos e linfócitos T

(Alkhatib et al. 1996; Choe et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz et

al., 1996; Dragic et al., 1996).

O gene que codifica o CCR5 foi localizado na região p21.3 do

cromossomo 3 humano, e está fisicamente próximo aos genes que

têm como produtos os receptores de β-quimiocinas CCR1, CCR2,

CCR3 e CCR4 (Samson et al., 1996a).

A ocorrência de uma deleção de 32 pares de bases no gene dá

origem ao alelo ccr5∆32 que resulta em uma proteína truncada, não-

funcional e não expressa na membrana celular (Dean et al., 1996, Liu

et al., 1996; Samson et al., 1996b).

O alelo mutante possui uma freqüência média de 10% em

populações caucasianas (Dean et al., 1996, Liu et al., 1996; Samson

et al., 1996b). As freqüências deste alelo encontram-se distribuídas

em um gradiente com valor máximo no norte da Europa - 16,3% na

Mordóvia (Libert et al., 1998), e que decrescem rumo ao sul

atingindo 2,38% na Grécia (Martinson et al., 1997). A mutação é

virtualmente inexistente em populações não-européias, mas há

ocorrências isoladas no resto do globo, como no Oriente Médio, Ásia e

45

território indiano, com freqüências que variam de 2 a 5% (Martinson

et al., 1997). No sudeste brasileiro foi reportada uma freqüência de

3,5% (Passos e Picanço, 1998).

Nos Estados Unidos a freqüência do ccr5∆32 é de

aproximadamente 10% entre caucasianos e 1,7% entre afro-

americanos - a presença da mutação entre os últimos resultaria do

processo de miscigenação (Dean et al., 1996).

No presente trabalho, determinou-se a freqüência do alelo

ccr5∆32 na população de Triunfo no Estado de Pernambuco (Fig. 1),

localizado no Nordeste do Brasil (Latitude -07° 50' 17'' e Longitude

38° 06' 06'') – a primeira população do Sertão Nordestino a ser

investigada para o referido alelo, com o objetivo de avaliar se os

valores encontrados divergiriam das demais populações Nordestinas

investigadas.

46

MATERIAIS E MÉTODOS

No presente estudo foram analisados 345 indivíduos não

aparentados da população de Triunfo, Pernambuco, no nordeste do

Brasil.

O DNA utilizado foi extraído de leucócitos através do método de

mini-salting out (Miller et al., 1988) de amostras de sangue periférico

obtido por punção venosa utilizando ACD (ácido cítrico 0,038M;

citrato de sódio tribásico 0,075M; dextrose 0,133M) como

anticoagulante.

O DNA genômico (50-100ng) de cada indivíduo foi amplificado

em um volume de 25µl contendo tampão Tris-HCl 100mM - pH8,8 e

KCl 50mM; MgCl2 50 mM; albumina 0,05%; dNTP 10mM; 25 pmol de

cada primer; 2µl DNA genômico; 1 U/µl Taq polimerase.

Os primers descritos em Martinson et al. (1997) foram

utilizados para a amplificação da região que envolve a deleção ∆32.

Efetuou-se a PCR em um termociclador Perkin-Elmer 2400 como

segue: 94ºC por 5 minutos, 1 ciclo; 94ºC por 30 segundos e 70ºC

por 30 segundos, 30 ciclos, com um acréscimo de 1 segundo na

temperatura de extensão para cada ciclo.

O produto da PCR foi submetido à eletroforese vertical em gel

de poliacrilamida desnaturante à 5% no seqüenciador manual SQ3

Sequencer-Pharmacia por uma hora a 2000 volts. Após a eletroforese

o gel foi revelado com nitrato de prata. Os alelos - o normal com 193

47

pares de bases e o alelo mutante com 161 pares de bases – foram

identificados por comparação com marcadores de peso molecular.

As freqüências dos alelos ccr5 e ccr5∆32, na população de

Triunfo, foram calculadas por contagem direta. Foram examinadas as

condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg através do teste exato de

Fisher usando o programa GDA (Genomic Data Analysis).

48

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 345 indivíduos genotipados, 308 não possuíam a deleção,

37 eram heterozigotos e nenhum homozigoto ccr5∆32/ccr5∆32 foi

encontrado. As freqüências genotípicas observadas foram 89,28%

(ccr5/ccr5), 10,72% (ccr5/∆32) e 0,0% (∆32/∆32). As freqüências

alélicas foram 94,64% para o ccr5 e 5,36% para o ccr5∆32 (Tabela

1).

As freqüências genotípicas observadas não foram

significativamente diferentes da distribuição esperada segundo o

princípio de Hardy-Weinberg (p= 0,61).

O alelo mutante é inexistente em populações ameríndias

brasileiras (Martinson et al., 1997; Leboute et al., 1999; Grimaldi et

al., 2002). Alguns estudos também demonstraram sua ausência em

populações africanas (Martinson et al., 1997; Stephens et al., 1998).

Todavia, entre afro-brasileiros o alelo ccr5∆32 atinge freqüências que

variam de 1,3% (Chies e Hutz, 2003) a 3,8% (Vargas et al., 2006),

não divergindo do valor encontrado entre os afro-americanos dos

Estados Unidos – 1,7% (Dean et al., 1996).

Alguns estudos com populações urbanas do sudeste brasileiro

reportaram a freqüência de 3,5% para a mutação (Passos e Picanço,

1998); e 6,5%, em média, no sul do país onde a contribuição

européia na formação das populações seria maior (Grimaldi et al.,

2002; Vargas et al., 2006).

49

Como a deleção ∆32 no gene ccr5 seria resultado de um único

evento mutacional ocorrido no nordeste europeu (Libert et al., 1998),

o ccr5∆32 é um eficiente marcador étnico e pode ser utilizado como

indicador de contribuição genética européia em populações

miscigenadas de países não localizados no Velho Mundo.

O fato de que as freqüências do alelo mutante encontradas no

Brasil estão abaixo da média européia poderia ser explicado pela

miscigenação entre os ameríndios brasileiros e os vários grupos

étnicos que migraram para o Brasil desde o período colonial. Ou

ainda, pela prevalência migratória de populações européias onde a

freqüência do alelo mutante não é tão elevada, como por exemplo,

portugueses – 6% (Dean et al., 2002).

A freqüência de 5,36% encontrada para o ccr5∆32 na

população de Triunfo é mais baixa que a encontrada como média na

Europa (10%) (Martinson et al., 1997). Entretanto, este foi o maior

valor encontrado dentre as populações nordestinas já investigadas

pelo nosso grupo, inclusive a do próprio Estado de Pernambuco

(dados em processo de publicação). A saber: os dados que possuímos

do estado de Pernambuco não possuem indivíduos nascidos na cidade

de Triunfo, por isso consideramos essa separação entre as amostras.

Aplicou-se, então, o teste estatístico F de Wright, mas não foi

observada significativa divergência genética entre as populações de

Triunfo e Pernambuco (FST=0.0009), e nem entre Triunfo e as

populações dos nove Estados Nordestinos (FST=0.003199).

50

Assim, a freqüência de 5,36% encontrada na população de

Triunfo, em comparação com a de 4,44% de Pernambuco, pode ser

resultado da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um

processo de deriva genética, tendo em vista que até pouco tempo era

uma cidade de difícil acesso e ainda hoje se constitui num local sem

grandes atrativos para que haja fluxos migratórios consideráveis.

51

Tabela 1. Distribuição das freqüências genotípicas e alélicas considerando o ccr5 e o ccr5∆32.

Genótipo Observado Esperadoccr5/ccr5 308 (89,28%) 309 (89,57%)ccr5/ccr5∆32 37 (10,72%) 35 (10,14%)ccr5∆32/ccr5∆32 0 1 (0,29%)Total 345 345Frequências Alélicasccr5

ccr5∆32

Totalp

0,94640,0536

0,611

52

Figura 1. Mapa do Brasil com o estado de Pernambuco em realce onde se observa a localização das cidades de Recife e Triunfo.

Triunfo

Recife

53

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Gasparini P, Kanavakis E, Claustres M, Kambouris M, Ostrer H, Duff

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58

5. CONCLUSÕES

◊ A população estudada encontra-se sob Equilíbrio de Hardy-

Weinberg.

◊ A freqüência para o alelo mutante ccr5∆32 na população de Triunfo

foi o maior valor encontrado em populações estudadas no Nordeste

Brasileiro.

◊ O teste estatístico F de Wright mostrou que a população da citada

cidade não é geneticamente divergente das demais populações

nordestinas estudadas pelo grupo de pesquisa do Laboratório de

Genética Molecular Humana – UFPE.

◊ O suposto endocruzamento existente nesta população, conforme

informação popular, não foi observado, uma vez que um dos efeitos

diretos do endocruzamento é a diminuição da freqüência de

heterozigotos e o aumento do número de homozigotos. Verificamos o

efeito contrário, pois houve um aumento do número de

heterozigotos.

◊ Assim, a freqüência de 5,36% encontrada na população de Triunfo,

em comparação com a de 4,44% de Pernambuco, pode ser resultado

da ocorrência de efeito fundador nessa cidade, ou de um processo de

59

deriva genética, tendo em vista que até pouco tempo era uma cidade

de difícil acesso e ainda hoje se constitui num local sem grandes

atrativos para que haja fluxos migratórios consideráveis.

60

6. ABSTRACT

The CMKBR5 encodes a 7-transmembrane G-protein-coupled

chemokine receptor (CCR5) in macrophages and lymphocytes. A 32

base pair deletion in the coding region of the ccr5 gene has been

reported in individuals, homozygous for this deletion, who seem to be

resistant to HIV-1 infection. This mutation has a single recent origin

in Northeastern Europe, where the higher frequencies are observed

(16% Finland). There are isolated occurrences throughout the globe,

but they result from recent gene flow to those populations. In the

present study a sample of 345 individuals from Triunfo, a city in the

state of Pernambuco, in the Brazilian northeast was investigated for

the ccr5∆32 allele. The ccr5 alleles were amplified into 193 base pair

fragments and the mutant ccr5∆32 alleles were amplified into 161

base pair fragments. We detected 89.28% of ccr5/ccr5, 10.72% of

ccr5/∆32, but no homozygous ∆32/∆32 individuals were found. The

frequency of the mutant allele is 0.0536. The population is under

Hardy-Weinberg equilibrium (p= 0,61). The ccr5∆32 frequency found

in Triunfo may be due to a genetic drift process or may be result of a

founder effect.

Key-words: ccr5, ccr5∆32, mutation, Triunfo population.

61

7. ANEXOS

7.1 INSTRUÇÕES PARA AUTORES

Revista

Human Genetics

Human Genetics

Editors: D.N. Cooper; Th.J. Hudson

ISSN: 0340-6717

62

Instructions for Authors

Human Genetics

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Thomas J. Hudson

Ontario Institute for Cancer Research

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e-mail: humangenetics@oicr.on.ca

Professor David N. Cooper

Institute of Medical Genetics

Cardiff University

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66

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Mutation nomenclature

Mutation nomenclature as recommended by Dunnen JT den,

Antonarakis SE (2001) Nomenclature for the description of human

sequence variations. Hum Genet 109:121–124 must be used.

Gene symbols

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form suitable for reproduction should be submitted separately from

the text. The top of the figure, the author, and the figure number

should be written lightly in soft pencil on the back of each.

Lowercase letters (a, b etc.) should be used to identify figure parts. If

illustrations are supplied with uppercase labeling, lowercase letters

will still be used in the figure legends and citations.

Figures should not exceed 17.6 cm in width and 23.6 cm in height.

Smaller figures should be grouped (with narrow spaces between

them) in blocks that fill the page width as nearly as possible. Single,

small figures should not exceed the column width (8.6 cm).

Photographs

Photographs should be supplied in quadruplicate (originals plus three

photocopies): good, original glossy prints suitable for reproduction

with minimal reduction. The editors reserve the right to trim figures

further and regroup them.

One set of photographs should be inscribed with rub-on template

lettering (no ink). The lettering should be about 2 mm in height after

69

any reduction required. If plates are submitted, the figures must be

mounted on regular bond paper, not on cardboard. Slides should be

supplied in preference to Polaroid photographs.

For line drawings please submit good quality prints. The drawings

should be lettered in a size that will yield a final height of 2 mm after

reduction. For coordinate inscriptions, only the first letter of the first

word should be capitalized. Computer drawings are acceptable

provided they are of comparable quality to line drawings. Computer-

drawn curves and lines must be smooth.

Rejected manuscripts: Rejected manuscripts will not normally be

returned, although an effort will be made to return original

photographs and prints.

Provisionally Accepted Manuscripts

Final versions of manuscripts which have been accepted subject to

revision must be returned to the Editor within six weeks of

notification of provisional acceptance. Except by prior arrangement,

revised manuscripts returned after this time will be treated as new

submissions.

Diskettes: Accepted manuscripts must be submitted to the publisher

in final form on diskette. Authors are requested to follow the technical

instructions for manuscripts and illustrations in electronic form

printed in each issue of the Journal and available at Springer’s

website (springer.com).

Proofs

One set of proofs will be sent to the corresponding author prior to

publication. Printer’s errors should be corrected, but a charge will be

70

made for any other changes introduced after the manuscript has been

typeset.

Electronic Supplementary Material

Electronic supplementary material (ESM) for an article in the journal

will be published in SpringerLink provided the material is:

submitted to the Editor(s) in electronic form together with the

paper and is subject to peer review

accepted by the journals Editor(s)

ESM may consist of

information that cannot be printed: animations, video clips, sound

recordings

information that is more convenient in electronic form: sequences,

spectral data, etc.

large original data that relate to the paper, e.g. additional tables,

illustrations (color and black & white), etc.

After acceptance by the journals Editor(s) ESM will be published as

received from the author in the online version only. Reference will be

given in the printed version.

Offprints

One complimentary copy is supplied. Orders for offprints can be

placed by returning the order form with the corrected proofs.