Istruzioni per l’Uso

TNF-alpha ELISA

Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Fattore di Necrosi Tumorale-α (TNF-α) nel siero, plasma e

supernatanti di colture cellulari umani.

BE55001

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

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INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE

1. USO PREVISTO 2

2. SOMMARIO 2

3. PRINCIPIO DEL TEST 4

4. REAGENTI FORNITI 5

5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 5

6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 5

7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 6

8. PRECAUZIONI PER L’USO 6

9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 7

10. PROCEDURA DEL TEST 9

11. CALCOLO DEI RISULTATI 11

12. LIMITI DELLA PROCEDURA 13

13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 13

14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 16

15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 16

16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 17

17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 18

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1. Uso Previsto

Il TNF alfa ELISA è un test ELISA per la determinazione quantitativa di TNF alfa umano. Il TNF alfa ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche.

2. Sommario

Il TNF-α è una citochina multifunzionale coinvolta in molti pathway differenti, nell’omeostasi e nella patofisiologia dei mammiferi. Può presentare effetti biologici contrapposti, il che suggerisce meccanismi regolatori complessi. Il TNF-α, conosciuto anche come cachectina, fu rilevato per la prima volta come fattore citotossico che induce la lisi di alcune cellule tumorali. Il gene TNF-α è un membro di tipo 2 della superfamiglia TNF (consistente di almeno 20 membri distinti). Il rilascio di TNF-α è principalmente innescato da infezioni virali, endotossine, lipopolisaccaridi o altre componenti batteriche, lesioni ai tessuti, danni al DNA e da IL-1, PDFG e dallo stesso TNF-α. Si esprime principalmente nei macrofagi, ma anche nei monociti, nei neutrofili, nelle cellule NK, nei mastociti, nelle cellule endoteliali e nei linfociti attivati. L’espressione del TNF-α nelle cellule endoteliali può essere indotta dall’IL-17. L’espressione di altre citochine, chemochine, intermedi reattivi dell’ossigeno, ossido nitrico e prostaglandine è stimolato dal TNF-α. Il TNF-α inizialmente legato ad una membrana è clivato enzimaticamente dal TACE (= ADAM17). I monomeri solubili si aggregano agli omotrimeri e vengono segreti nel sangue e in altri fluidi biologici. La forma legata alla membrana e quella solubile sono biologicamente attive e si legano ai recettori del TNF TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) e TNFR2 ( = TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80). Legandosi al ligando i recettori formano dei trimeri che portano a cambiamenti nella conformazione, dissociazione delle proteine (SODD = domini silenziatori di morte, BAG4, atanogene 4 associato a Bcl-2) ed associazione delle proteine (TRADD = proteina dei domini di morte associata al TNF-R1) e che inducono le seguenti attività biologiche: - trascrizione di fattori anti-apoptotici e proteine coinvolte nella proliferazione delle cellule ed

infiammazione tramite il legame tra TRAF2 (fattore 2 associato a TNF-R) e RIPK1 (serin-treonin chinasi 1 interagenti con TNF-R) ed attivazione del fattore di trascrizione NF-ĸB.

- proliferazione, differenziazione ma anche apoptosi delle cellule tramite legame con TRAF2, attivazione delle chinasi, attivazione di c-Jun ed ATF2 (la via delle JNK-MAPK).

- apoptosi tramite il legame di FADD (proteina con dominio di morte che si associa a FAS) a TRADD ed attivazione di caspasi (inclusa caspasi 8 = FLICE).

- necrosi, una morte cellulare indipendente dalla caspasi, mediata da ossidasi NADPH, che formano un complesso con TRADD e RIPK1 che porta alla generazione di specie dell’ossigeno. Il TNF-R2 non contiene DD (dominio di morte), ma svolge la sua funzione tramite legame diretto con TRAF. Quindi, le molteplici funzioni biologiche di TNF-α comprendono la proliferazione e la differenziazione cellulare, la tumorigenesi, la morte apoptotica o necrotica delle cellule (includendo alcune linee di cellule tumorali), attività immunoregolanti, metabolismo dei lipidi, coagulazione e funzione endoteliale. Promuove un’infiammazione locale o sistemica (il TNF-α è un potente pirogeno) e stimola il responso nella fase acuta. Espressioni molto alte di TNF-α post-infezione possono portare allo shock settico (il TNF-α è altamente citotossico), mentre livelli bassi sostenuti inducono cachessia ed infiammazione.

Un’alterazione del TNF-α è collegata a varie patologie:

Cancro: Sono stati descritti diversi ruoli del TNF-α nel cancro, a seconda del tipo di tumore, del microambiente tumorale e dei livelli generali di espressione del TNF-α e della cinetica di espressione. E’ stato proposto un modello in base al quale livelli singoli molto alti di TNF-α portano alla regressione del tumore e che livelli cronici di basso dosaggio sono associati al progredire del tumore.

Lupus eritematoso sistemico (SLE): Modelli murini di SLE presentano effetti contraddittori del TNF-α: effetto anti-immune a bassi livelli di TNF-α (la somministrazione di TNF-α porta ad un’attenuazione dei sintomi e il blocco del TNF-α alla generazione di sintomi della SLE), effetti pro-infiammatori con livelli alti di TNF-α (il blocco del TNF-α smorzava la patologia).

Infiammazione cronica intestinale (malattia di Crohn (CD), Malattia Infiammatoria Cronica Intestinale (IBD), Colite Ulcerosa (UC)): E’ stato dimostrato che c’è un effetto essenziale dell’attività del TNF-α / TNF-R1 sull’induzione delle infiammazioni intestinali croniche. Nell’IBD è stata descritta l’aumentata espressione di TNF-α nei monociti/macrofagi del tessuto del tratto digerente e intestinale.

Psoriasi: Nei pazienti psoriasici si è dimostrato che il TNF-α è aumentato sistemicamente e nel tessuto cutaneo. L’espressione del TNF-α nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) era molto

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elevata in pazienti nella fase attiva della patologia ed elevata nella psoriasi cronica. In un modello animale si è dimostrato che per lo sviluppo della Psoriasi era essenziale un’attivazione delle cellule T residenti dipendente dal TNF-α. Malattie polmonari (Fibrosi Cistica(CF), Asma): Nella fibrosi cistica sono stati rilevati livelli alti di TNF-α. Nell’asma grave persistente si rileva un’aumentata espressione del TNF-α. Nell’asma allergica, con bassa esposizione agli antigeni, il TNF-α contribuisce ad un rilascio elevato di istamina. In un modello murino per l’asma l’infiammazione delle vie respiratorie è stata causata dall’attivazione di fosfolipasi A2 mediata dal TNF-α.

Artrite reumatoide (RE), Spondilite anchilosante (AS): Il TNF-α ha effetti stimolanti sulle proteasi degradanti la matrice (metalloproteinasi della matrice, MMPs), sul rimodellamento del tessuto e sugli osteoclasti, causando riassorbimento osseo con conseguente erosione delle articolazioni. In un modello murino per RA, si sono riscontrati livelli elevati di TNF-α nel midollo osseo. Si è dimostrato che le citochine, sintetizzate da cellule sinoviali attivate dal TNF-α, inducono RA. In pazienti AS si è dimostrato che la concentrazione di TNF-α era elevata nell’articolazione sacro-iliaca.

Il trapianto (malattia del trapianto contro l’ospite, rigetto di allotrapianto): Nella ricerca sui trapianti la misurazione dei livelli di TNF-α è risultata utile. Nel rigetto di allotrapianto renale si è rilevato che il livello di TNF-α era molto elevato. Nei trapianti di midollo osseo (BMT) è stato provato che si verifica un aumento dei livelli di TNF-α. I pazienti di BMT con complicazioni correlate ai trapianti, come polmonite interstiziale e grave malattia del trapianto contro l’ospite, hanno presentato un notevole aumento dei livelli di TNF-α.

Aterosclerosi, calcificazione dei vasi arteriosi: A livelli di TNF-α circolante sono stati correlati: un maggior rischio d’infarto del miocardio ricorrente, ispessimento aterosclerotico dell'intima media carotidea, disordini dell’omeostasi dei trigliceridi e del glucosio ed aterosclerosi correlata all’età. In animali con diabetes mellitus di tipo 2 i meccanismi indotti dal TNF-α portano ad un aumento dell’accumulo di calcio nell’aorta.

Resistenza all’insulina (IR) ed Obesità: Un’aumentata espressione di TNF-α si è rilevata nel tessuto adiposo di modelli roditori per l’obesità e negli individui adiposi. Nel tessuto adiposo e nell’IRSi è rilevata un’infiammazione cronica di basso grado. Livelli aumentati di TNF-α condizionano la regolazione del pathway dell’insulina.

Patologie neurodegenerative (Sclerosi Multipla (MS), Malattia di Alzheimer, Malattia da Prioni, Parkinson): Il TNF-α è prodotto da cellule microgliali attivate e causa degenerazione neuronale, apoptosi del tessuto neuronale e un aumento delle infiammazioni. La somministrazione di TNF-α ha causato la morte cellulare di oligodendrociti – un sintomo della MS – in co-colture con astrociti e cellule microgliali.

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3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-TNF-α umano.

Figura 1

Il TNF-α umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo TNF-α umano coniugato di biotina, che si lega con la TNF-α umano catturato dal primo anticorpo.

Figura 2

Dopo l’incubazione, gli anticorpi TNF-α umano coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la Streptavidina-HRP che si lega all’anticorpo TNF-α umano coniugato alla biotina.

Figura 3

Dopo l’incubazione, la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all’HRP.

Figura 4

In proporzione alla quantità di TNF-α umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di TNF-α umano e si determina la concentrazione del campione di TNF-α umano.

Figura 5

Substrato

Terza Incubazione

Substrato post -reazione

Streptavidina-HRP -

Seconda Incubazione

Standard o Campione

Coniugato di Biotina

Prima Incubazione

Anticorpo di Rivestimento

Micropozzetto Rivestito

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4. Reagenti Forniti

1 busta d’alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonale anti-TNF-α umano

1 flaconcino (70 µL) con Coniugato di Biotina anticorpo policlonale anti-TNF-α umano

1 flaconcino (150 µL) con Streptavidina-HRP

2 flaconcini con Standard anti-TNF-α umano liofilizzato, 3000 pg/mL previa ricostituzione

1 flaconcino Controllo alto, liofilizzato

1 flaconcino Controllo basso, liofilizzato

1 flaconcino (12 mL) Diluente dei Campioni

1 flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x

(PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA)

1 flaconcini (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x

(PBS con 1 % Tween 20)

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina)

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M)

4 Copripiastra adesivi

5. Istruzioni di Conservazione

Conservare i reagenti del kit a 2-8 °C ecetto gli controlli. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 °C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 °C, gli controlli a -20 °C rispettativamente. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione.

6. Prelievo e conservazione dei Campioni

Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. Prestare attenzione a un possibile "Effeto Gancio" a causa di alti concentrazioni di campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di TNF-α umano bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela.

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7. Materiali necessair ma no forniti

Pipette graduate da 5 mL e 10 mL

Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta

Micropipette adattabili da 50 µL to 300 µL multicanale con punte usa e getta

Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti

Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti

Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico.

Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento 620 nm)

Acqua bidistillata o deionizzata

Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione

8. Precauzioni per l’Uso

- Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò,

l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli.

- I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico.

- Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza.

- Non usare i kit dopo la data di scadenza.

- Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce.

- Non pipettare utilizzando la bocca.

- Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni.

- Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose.

- Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni.

- Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo.

- Evitare schizzi o produzione di aereosol.

- Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso.

- Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato.

- L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato.

- Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti.

- La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo.

- Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a 121.5 °C.

- Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.

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9. Preparazione dei Reagenti

Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli.

9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)

Versare l'intero contenuto (50 mL) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 mL. Portare il volume finale a 1000 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio

Concentrado (20x) (mL) Acqua Distillata (mL)

1 - 6 25 475

1 - 12 50 950

9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)

Versare l'intero contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 mL. Portare il volume finale a 100 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 8°C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio

Concentrado (20x) (mL) Acqua Distillata (mL)

1 - 6 2.5 47.5

1 - 12 5.0 95.0

9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina

Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (mL) Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1 - 6 0.03 2.97

1 - 12 0.06 5.94

9.4. Streptavidina-HRP

La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Streptavidina-HRP (mL) Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1 - 6 0.06 5.94

1 - 12 0.12 11.88

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9.5. Standard TNF-α Umano

Ricostituire lo Standard TNF-α umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 3000 pg/mL). Far ricostituire lo standard per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene.

Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato.

La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c) oppure nei tubi (vedi 9.5.1).

9.5.1. Diluzione Standard Esterna

Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard.

S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 uL di Diluente dei Campioni a tutti tubi.

Pipettare 225 µL di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 3000 pg/mL) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 1500 pg/mL).

Pipettare 225 µL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento.

Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6).

Il Diluente dei Campioni serve come bianco.

Figura 6

9.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 500 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all’etichetta del flaconcino. Conservare il controllo ricostituito aliquotato a -20 °C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

Transferire 225 µL

Standard Ricostituito TNF-α Umano

S1 S2 S3 S4 - S7

Diluente dei Campioni 225 µL

Buttare 225 µL

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10. Procedura del Test

a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strisce micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 °C e perfettamente sigillate.

b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando esattamente 400 µL di Tampone di Lavaggio per

pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti.

c. Diluizione dello standard in micropozetti

(alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi – vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µL standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 3000 pg/mL) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 1500 pg/mL) e trasferire 100 µL, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da 1500 a 23 pg/mL. Buttare 100 µL del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2).

Figura 7

Transferire 100 µL

Standard Ricostituito TNF-α Umano

S1 S2 S3 S4 - S7

Diluente dei Campioni 100 µL

Buttare 100 µL

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In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µL di queste diluizioni standard (S1–S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1.

Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standard e campioni nei pozzetti:

1 2 3 4

A Standard 1

(1500 pg/mL) Standard 1

(1500 pg/mL) Campione 1 Campione 1

B Standard 2 (750 pg/mL)

Standard 2 (750 pg/mL)

Campione 2 Campione 2

C Standard 3 (375 pg/mL)

Standard 3 (375 pg/mL)

Campione 3 Campione 3

D Standard 4 (188 pg/mL)

Standard 4 (188 pg/mL)

Campione 4 Campione 4

E Standard 5 (94 pg/mL)

Standard 5 (94 pg/mL)

Campione 5 Campione 5

F Standard 6 (47 pg/mL)

Standard 6 (47 pg/mL)

Campione 6 Campione 6

G Standard 7 (23 pg/mL)

Standard 7 (23 pg/mL)

Campione 7 Campione 7

H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8

d. Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco.

e. Dispensare 50 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni.

f. Dispensare 50 µL di ogni muestra in duplicato ai pozzetti dei campioni.

g. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere 9.3 la preparazione del Coniugato di Biotina)

h. Dispensare 50 µL di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto.

i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.

j. Preparare la Streptavidina-HRP (vedere 9.4 la Preparazione di Streptavidina-HRP).

k. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.

l. Dispensare 100 µL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco.

m. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.

n. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.

o. Pipettare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti.

p. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense.

È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili.

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La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di 0.9-0.95.

q. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µL di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 °C.

r. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard.

Note: In caso d’incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più

bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.

11. CALCOLO DEI RISULTATI

- Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio.

- Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard

sull’ordinata contro la concentrazione di TNF-α umano sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).

- Per determinare la concentrazione di TNF-α umano circolante per ogni campione, trovare prima il

valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di TNF-α umano.

- Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono

stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).

- Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per

risultato livelli scorretti e bassi di TNF-α umano. Questi campioni richiedono un’ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell’TNF-α umano, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di TNF-α umano.

- Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione

di TNF-α umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi.

- La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per

dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.

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Figura 8

Curva standard rappresentativa per il TNF-α umano ELISA. Il TNF-α umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.

Tavola 2

Dati tipici relativi all’uso dell’TNF-α umano ELISA Lunghezza d’onda: 450 nm Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm

Standard Concentrazione TNF-α umano

(pg/mL)

D.O. (450 nm)

D.O. Media (450 nm)

C.V. (%)

1 1500 2.312 2.278

2.295 0.7

2 750 1.304 1.314

1.309 0.4

3 375 0.768 0.720

0.744 3.3

4 188 0.424 0.417

0.420 0.8

5 94 0.291 0.276

0.284 2.7

6 47 0.190 0.170

0.180 5.5

7 23 0.147 0.145

0.146 1.0

Bianco 0 0.090 0.092

0.091 1.4

I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.

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12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva

standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione

crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro

riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o

falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati.

- L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi

umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione.

13. Caratteristiche di Prestazione

13.1. Sensibilità Il limite di rilevamento dell’TNF-α umano definito come la concentrazione dell’analita, risultante in un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 5.0 pg/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).

13.2. Riproducibilità

13.2.1. Intra-Dosaggio

La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TNF-α umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TNF-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.7 %.

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Tavola 3

La concentrazione media di TNF-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione.

Campione Esperimento Concentrazione Media TNF-α umano (pg/mL)

CV (%)

1 1 2 3

5328 4990 5474

6.6 9.4 3.4

2 1 2 3

4818 4149 4558

6.4 9.9 11.3

3 1 2 3

3523 2967 3478

12.2 5.3 5.7

4 1 2 3

2236 2207 2381

5.1 2.8 5.9

5 1 2 3

1528 1379 1310

6.7 11.6 8.4

6 1 2 3

889 805 827

2.0 9.0 7.4

7 1 2 3

607 492 507

14.9 8.2 7.3

8 1 2 3

216 286 267

6.3 10.7 8.0

13.2.2. Inter-Dosaggio

La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell’ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TNF-α umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TNF-α umano ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 8.1 %. Tavola 4

La concentrazione media di TNF-α umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione

Campione Concentrazione Media TNF-α umano (pg/mL)

CV (%)

1 5264 4.7

2 4508 7.5

3 3323 9.3

4 2275 4.1

5 1405 7.9

6 840 5.2

7 535 11.7

8 256 14.0

13.3. Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di TNF-α umano al siero. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 6 replicati di campioni di siero. In questi esperimenti il siero non addizionato è stato usato come bianco. l recupero rientrava in un range dal 76 % al 115 % con un recupero medio complessivo del 90 %. I recuperi sono stati mostrati a dipendere dal siero utilizzato.

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13.4. Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di TNF-α umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l’uno. Il recupero rientrava in un range dal 97.1 % al 128.6 % con un recupero medio complessivo del 112.7 % (vedi Tavola 5).

Tavola 5

Campione Diluzione

Concentrazione attesa di TNF-α umano (pg/mL)

Concentrazione misurata di TNF-α

umano (pg/mL)

Recupero di concentrazione attesa di TNF-α umano (%)

1 1:2 1:4 1:8 1:16

2469 1498 890

4937 2996 1781 975

121.4 118.9 109.5

2 1:2 1:4 1:8 1:16

2295 1463 791

4590 2925 1582 1017

127.5 108.2 128.6

3 1:2 1:4 1:8 1:16

2993 1721 876

5986 3442 1751 969

115.0 101.8 110.6

4 1:2 1:4 1:8 1:16

2775 1560 757

5550 3119 1514 766

112.4 97.1

101.2

I recuperi sono stati mostrati a dipendere dal siero utilizzato.

13.5. Stabilità dei Campioni

13.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento

Aliquote di campioni di siero e supernatanti di colture cellulari (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 °C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di TNF-α umano. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della TNF-α umano con altri congelamento e lo scongelamento.

13.5.2. Stabilità della Conservazione

Aliquote di campioni di siero (aggiunti o non aggiunti) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 °C e il livello di TNF-α umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20 °C ed a 2-8 °C non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello TNF-α umano. Si è rilevata una perdita leve d’immunoreattività della TNF-α umano durante la conservazione a TA et a 37 °C dopo 24 ore.

13.6. Specificità Il dosaggio rileva il TNF-α umano sia naturale, sia ricombinante. L’interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero positivo di TNF-α umano. Non è stata rilevata alcuna reattività crociata, in particolare non con TNF-R (60 kDa e 80 kDa).

13.7. Valori Attesi Per il TNF-α umano è stato testato Un pannello di 40 campioni di sieri di donatori apparentemente sani (di sesso maschile e femminile). Non si sono trovati livelli rilevabili di TNF-α umano. Livelli elevati di TNF-α umano dipendono dal tipo di malattia immunologica.

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14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI

Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare:

e-mail: IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com

15. Sommario: Preparazione dei Reagenti

15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)

Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.

Numero di strisce

Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 25 475

1-12 50 950

15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.

Numero di strisce

Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 2.5 47.5

1-12 5.0 95.0

15.3. Coniugato di Biotina

Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di strisce

Coniugato de Biotina (mL)

Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.03 2.97

1-12 0.06 5.94

15.4. Streptavidina-HRP Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di strisce

Streptavidina-HRP (mL)

Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.06 5.94

1-12 0.12 11.88

15.5. Standard TNF-α Umano Reconstituire il standard liofilizzato di TNF-α umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)

15.6. Controlli Aggiungere 500 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati.

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16. Sommario di Procedura del Test

1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.

2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.

3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μL di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μL di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μL dagli ultimi pozzetti.

Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 μL di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti.

4. Aggiungere 100 μL di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco.

5. Aggiungere 50 μL di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti di campione.

6. Aggiungere 50 μL di campione in duplicato ai pozzetti di campione.

7. Preparare il Coniugato di Biotina.

8. Aggiungere 50 μL di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti.

9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).

10. Preparare la Streptavidina-HRP.

11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.

12. Aggiungere 100 μL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti.

13. Coprire le strisce e incubare 1 ora a temperatura ambiente (18-25 °C).

14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.

15. Aggiungere 100 μL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.

16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).

17. Aggiungere 100 μL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.

18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.

Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).

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17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO

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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα

Symbols Version 4.5 / 2015-12-07

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:

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LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:

Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

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