CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO … · encontradas em todos os tipos de organismos ......

GABRIELA DESIREÉ TORMET GONZÁLEZ

CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO TIPO α,β E

LEH DE ACTINOBACTÉRIAS DO GÊNERO Streptomyces

CAMPINAS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

GABRIELA DESIREÉ TORMET GONZÁLEZ

CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO TIPO α,β E

LEH DE ACTINOBACTÉRIAS DO GÊNERO Streptomyces

ORIENTADORA: PROFA. DRA. LUCIANA GONZAGA DE OLIVEIRA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA

NA ÁREA DE ORGÂNICA

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

POR GABRIELA DESIREÉ TORMET GONZÁLEZ, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA.

LUCIANA GONZAGA DE OLIVEIRA.

_______________________

Assinatura da Orientadora

CAMPINAS

Dedico esta dissertação a mami, papi e ao meu bro.

Whether you think that you can, or that you can't, you are usually right.

Henry Ford

Agradecimentos

À Deus por me conduzir pelos melhores caminhos ainda atuando de formas

misteriosas.

À papi, mami, Sinkler, meus bebés, Rafa e panda por ser minha fortaleza

nos momentos difíceis e a fonte constante de humor e alegria.

À Profa. Dra. Luciana, minha orientadora, pela paciência, motivação e

dedicação em cada etapa deste trabalho e pelas coisas gostosas que me

fizeram ganhar peso.

À Profa. Wanda por ser tão amorosa e atenciosa, por ser como minha mãe

no Brasil, por me tratar como uma estudante mais de seu grupo, pelas

companhias os sábados e domingos e por sempre me fazer rir.

À minha querida UCV, minha Alma mater, por me formar não só como uma

profissional da química como também por criar em mim uma visão critica na

defesa dos direitos fundamentais do ser humano, por me fazer entender

que o conhecimento e a esperança são as únicas coisas que as ditaduras

não podem roubar.

Aos meus amigos do IQ e do IB Daniela Cipriany, Re Parruca, Ana, Renzo,

Gih, Marcos, Fábio, Lucídio, Bruna, André, Juliano e Marcelo, Tati, Lucas,

Dayanne, Renata S, Erick, João Guilherme, Letícia e Gaby Salazar.

Aos Prof. Moran, Prof. José Augusto, Profa. Anita, Profa. Annete, Prof.

Marcio, Prof. Pilli e a Profa. Ljubica por suas respectivas contribuições.

À Bel, Rinaldo, Ricardo, Priscila, Leandro e Claudia pela ajuda.

Ao Instituto de Química UNICAMP, Capes, Faepex, Fapesp e UNICAMP.

Curriculum vitae

Informações pessoais

Nome: Gabriela Desireé Tormet González.

Lugar de nascimento: La Guaira, Venezuela.

Email: gabrielatormet@gmail.com.

Formação Acadêmica

2013 – 2015 Mestrado em Química (Universidade Estadual de Campinas),

Campinas, Brasil.

2004 – 2010 Graduação em Química (Universidade Central da Venezuela),

Caracas, Venezuela.

Trabalhos publicados

de Oliveira, L. G., Tormet, G. D., Marcom, J., Samborsky, M., Araujo, W. L. and de

Azevedo, J.L., Sequence of Streptomyces wadaymensis A23 strain, an endophytic

actinobacteria from Citrus reticulata, 2014. DDBJ/EMBL/Gen Bank under the

accession JHDU00000000.

de Oliveira, L. G., Tormet Gonzalez, G. D., Samborsky, M., Marcon, J., Araujo, W.

L. and de Azevedo, J. L. Genome sequence of Streptomyces wadayamensis A23

strain, an endophytic actinobacteria from Citrus reticulate. Genome Announc.

2014, 2. doi: 10.1128/genomeA.00625-14

Trabalhos publicados em congressos e eventos

de Jesus, H. C. R., Tormet González, G. D., Balbuena, T. S., de Oliveira, L. G.,

Gozzo, F. Prediction of tertiary structure of SalbIII protein using chemical cross-

linking/mass spectrometry. 2nd Meeting of the Brazilian Proteomics Society jointly

with the 2nd Pan American HUPO Meeting, December 2014. Búzios. RJ-Brasil.

Gonzalez, G.D.T., de Oliveira, L.G., Enzimas B relacionadas à limoneno epóxido-

hidrolase apresentam elevada aceitação por substratos. 37 Reunião Anual da

SBQ, Maio 2014, Natal, RN-Brasil.

Gabriela D. Tomet, Dayane C. C. M. Coqueiro, Luciana G. de Oliveira. Expressão e atividade de duas epóxido-hidrolases putativas

de Streptomyces sp., 37 Reunião Anual da SBQ, Maio 2014, Natal, RN-Brasil.

Gabriela D. T. Gonzalez, Marcio Dias, Fanglu Huang, Pater F. Leadlay, Luciana G.

de Oliveira., Ionophore poliether hydrolases-cyclases shows high activity and wide-

ranging substrate acceptance as epoxide-hydrolases., VII Workshop on

biocatalysis and biotransformations., Setembro, 2014. Búzios, RJ-Brazil.

Gabriela D. Tormet G. Five three per year will make you happier. Reunião annual

dos jovens embaixadores ambientais da farmacêutica Bayer e do Programa das

Nações Unidas para o Medioambiente. Novembro, 2007. Leverkusen, Alemanha.

Premiações

Embaixadora ambiental jovem do programa BYEE da farmacêutica Bayer e o

Programa das Nações Unidas para o Medioambiente (UNEP) na Região Andina.

Período 2007-2008.

Estágios docentes

Programa de estágio docente disciplina QO-620 e QO-422. 1° e 2° semestre 2014.

Unicamp. Campinas, Brasil.

Estágio docente na disciplina Química Analítica Instrumental. Março 2010-Janeiro

2011. Universidad Central da Venezuela. Caracas, Venezuela.

Resumo

CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO TIPO α,β

E LEH DE ACTINOBACTÉRIAS DO GÊNERO Streptomyces

Epóxido-hidrolases pertencem a um amplo grupo de enzimas hidrolíticas

encontradas em todos os tipos de organismos vivos, incluindo insetos, plantas e

micro-organismos. Agem sobre uma variedade de epóxidos convertendo-os aos

respectivos dióis. As epóxido-hidrolases são de grande interesse para aplicação

em biotecnologia uma vez que podem levar à obtenção de epóxidos e dióis

enantiomericamente puros como uma alternativa à aplicação dos catalisadores

químicos. Neste estudo foram produzidas e caracterizadas funcional e

estruturalmente epóxido-hidrolases de dois tipos: uma α,β-hidrolase (B1EPH2)

anotada do genoma de Streptomyces sp B1 e várias hidrolases-ciclases análogas

à limoneno epóxido hidrolase (LEH) denominadas enzimas B. As enzimas B são

encontradas nos agrupamentos de genes que participam da biossíntese de

poliéteres como lasalocida, nigericina, nanchangmicina, tetronasina, tetronomicina

e salinomicina. As enzimas B atuam no mecanismo de ciclização oxidativa que

origina os anéis do tipo pirano e furano presentes nesses compostos. Todos os

genes foram clonados e expressos com sucesso em E. coli BL21(DE3). As

enzimas foram purificadas via cromatografia por afinidade. A atividade das

enzimas como epóxido-hidrolases foi avaliada utilizando-se o teste de adrenalina.

Observou-se que todas as enzimas apresentaram ampla atividade catalítica na

hidrólise de epóxidos com diferentes características estruturais; ao contrário da

LEH, as enzimas B apresentaram alta capacidade de aceitação por substratos. As

estruturas secundárias e terciárias destas enzimas foram previstas por análise in

silico e por medições do espectro de dicroísmo circular. As estruturas

tridimensionais de algumas enzimas B, assim como a previsão dos resíduos que

compõem o sítio ativo, foram obtidas através de estudos de difração de raios-X,

evidenciando a similaridade estrutural das enzimas B à LEH.

Abstract

CHARACTERIZATION OF α,β AND LEH EPOXIDE

HYDROLASES FROM ACTINOMYCETES OF THE GENUS

Streptomyces

Epoxide hydrolases are hydrolytic enzymes found in all living organisms, including

insects, plants and microorganisms. Such enzymes act promoting the conversion

of a variety of epoxides to the corresponding diols. Epoxide hydrolases are of great

interest in biotechnological applications as an alternative to chemical catalysts

since it can lead to enantiomerically pure epoxides and diols. This study details the

production and structural and functional characterization of one α,β-hydrolase

(B1EPH2) annotated from genome of Streptomyces sp B1 and several hydrolases-

cyclases similar to limonene epoxide hydrolase (LEH) named B enzymes. B

enzymes are found in biosynthetic gene clusters of polyether antibiotic as

lasalocid, nigericin, nanchangmycin, tetronasin, tetronomycin and salinomycin.

They are known to participate in the oxidative cyclization process leading to the

formation of the pyran and furan rings present in these compounds. All genes were

successfully cloned and expressed into E. coli BL21(DE3). The enzymes were

purified by affinity chromatography and the activity as epoxide hydrolase was

evaluated using the adrenaline fingerprint test. All enzymes showed wide catalytic

activity towards the hydrolysis of epoxides with diverse structural features; unlike

LEH, B enzymes have high range substrate acceptance. Secondary and tertiary

structures of these enzymes were predicted by in silico analyses and circular

dichroism spectrum measurements. Three-dimensional structures of some of the B

enzymes as well as the prediction of the active site residues were obtained

throughout X-ray diffractometry endorsing structural similarities of B enzymes and

Sumário

Lista de abreviaturas .............................................................................................. xv

Lista de tabelas ..................................................................................................... xvi

Lista de esquemas ............................................................................................... xvii

Lista de figuras .................................................................................................... xviii

1. Introdução ......................................................................................................... 1

1.1. Epóxido-hidrolases microbianas ................................................................ 4

1.2. Estrutura das epóxido-hidrolases e mecanismos de atuação .................... 6

1.3. Enzimas B análogas à limoneno epóxido hidrolase ................................. 11

2. Objetivos ......................................................................................................... 15

3. Materiais e métodos........................................................................................ 16

3.1. Analise in sílico das enzimas ................................................................... 16

3.2. Reagentes químicos................................................................................. 16

3.3. Reagentes biológicos ............................................................................... 16

3.4. Micro-organismos ..................................................................................... 17

3.5. Vetores ..................................................................................................... 18

3.6. Soluções utilizadas................................................................................... 18

3.6.1. Soluções utilizadas para o preparo de células quimio e

eletrocompetentes .......................................................................................... 18

3.6.2. Soluções utilizadas na purificação das proteínas .............................. 18

3.6.3. Soluções utilizadas para preparo do gel SDS-PAGE ........................ 20

3.6.4. Soluções utilizadas nas medições dos parâmetros cinéticos e

enantiosseletividade das enzimas .................................................................. 23

3.7. Métodos ................................................................................................... 23

3.7.1. Extração de DNA plasmidial ............................................................. 23

3.7.2. Manutenção microbiológica ............................................................... 23

3.7.3. Preparação de células quimicamente competentes .......................... 24

3.7.4. Preparação de células eletrocompetentes ......................................... 25

3.7.5. Transformação química ..................................................................... 26

3.7.6. Eletrotransformação/Eletroporação ................................................... 26

3.7.7. Expressão de proteínas ..................................................................... 27

3.7.8. Eletroforese de proteínas .................................................................. 27

3.7.9. Purificação de proteínas .................................................................... 28

3.7.10. Quantificação pelo método de Bradford ......................................... 30

3.7.11. Teste de adrenalina para epóxido-hidrolases ................................. 31

3.7.12. Medições da influencia do pH e temperatura na atividade das

enzimas ....................................................................................................... 32

3.7.13. Medições do espectro de dicroísmo circular .................................. 32

4. Resultados e Discussão ................................................................................. 34

4.1. Enzima tipo α,β-hidrolase ........................................................................ 34

4.1.1. Análise in sílico .................................................................................. 34

4.1.2. Expressão e purificação de proteínas ................................................ 40

4.1.3. Caracterização de enzimas: espectro de dicroísmo circular (DC) ..... 41

4.1.4. Determinação da atividade enzimática pelo teste de adrenalina ....... 44

4.1.5. Medida da influência do pH e temperatura na atividade enzimática .. 47

4.2. Enzimas B ................................................................................................ 51

4.2.1. Analises in sílico ................................................................................ 51

4.2.2. Expressão e purificação das enzimas B ............................................ 59

4.2.3. Espectro de dicroísmo circular (DC) .................................................. 63

4.2.4. Determinação da atividade enzimática pelo teste de adrenalina ....... 65

4.2.5. Estruturas tridimensionais das enzimas B ......................................... 69

5. Conclusões ..................................................................................................... 75

6. Anexos ............................................................................................................ 77

Lista de abreviaturas

A600nm Absorbância medida a 600 nm

ACN Acetonitrila

APS Persulfato de amônio

BSA Albúmina de soro bovino

Da Dalton

DC Dicroísmo circular

DMSO Dimetilsulfóxido

E Razão Enantiomérica

ee Excesso Enantiomérico

EH Epóxido-Hidrolase

IPTG isopropil-ß-D-1-tiogalactopiranosídeo

LEH Limoneno epóxido-hidrolase

PDB Banco de Dados de Proteínas

rpm Rotações por Minuto

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de

sódio

TEMED N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina

Lista de tabelas

Tabela 1. Reagentes biológicos utilizados ............................................................ 17

Tabela 2. Composição em imidazol dos tampões fosfato de sódio 20 mM cloreto

de sódio 500 mM e imidazol 20-500 mM ............................................................... 19

Tabela 3. Quantidade de reagentes utilizados no preparo dos tampões fosfato de

sódio 50 mM cloreto de sódio 150 mM a diferentes pH ........................................ 20

Tabela 4. Substratos usados no teste de adrenalina ............................................ 22

Tabela 5. Proteínas análogas a B1EPH2 depositadas no PDB ............................ 35

Tabela 6. Contribuições participantes na estrutura secundária da enzima B1EPH2

.............................................................................................................................. 43

Tabela 7. Comparação dos dados da estrutura secundária de B1EPH2 gerados

com o programa CDNN para as medições de dicroísmo circular e a estrutura

prevista pelo servidor I-TASSER ........................................................................... 43

Tabela 8. Parâmetros de ponto isoelétrico (pI), coeficiente de instabilidade e

massa molecular das enzimas B calculadas com a ferramenta ProtParam do

ExPASy ................................................................................................................. 52

Tabela 9. Previsão das proteínas análogas a TmnB (I-TASSER) ........................ 56

Tabela 10. Contribuições participantes nas estruturas secundárias das enzimas

NigBI e LasB* ........................................................................................................ 64

Tabela 11. Comparação da estrutura secundária gerada com medições do

espectro DC e a estrutura prevista pelo servidor I-TASSER ................................. 65

Lista de esquemas

Esquema 1. Reação de hidrólise de epóxido resultando no respectivo 1,2-diol

catalisada pela enzima epóxido-hidrolase. .............................................................. 3

Esquema 2. A degradação de aromáticos pode prosseguir através de uma reação

de epoxidação catalisada por mono-oxigenase seguida pela conversão dos

epóxidos a dióis catalisada por epóxido-hidrolases. ............................................... 3

Esquema 3. Reação de abertura enantiosseletiva de epóxidos promovida pelo

extrato enzimático de Rhodococcus sp SP409.25 ................................................... 5

Esquema 4. Representação da reação de conversão do N-fenilcarbamato geraniol

para o correspondente (S)-epóxido catalisada pela EH de Asperigillus niger.31 ..... 6

Esquema 5. Mecanismo proposto para hidrólise de epóxidos promovida pela EH

de Agrobacterium radiobacter.33 ............................................................................. 8

Esquema 6. Representação das possíveis vias pelas quais a hidrólise de epóxidos

pode proceder. ........................................................................................................ 8

Esquema 7. Reação de hidrólise enantioconvergente do limoneno óxido levando a

formação do limoneno-1,2-diol mediada pela LEH de Rhodococcus erythropolis... 9

Esquema 8. Representação do mecanismo push-pull de hidrólise em uma etapa

para a enzima LEH de Rhodococcus erythropolis.23,39 .......................................... 10

Esquema 9. Estrutura dos antibióticos poliéteres lasalocida e monensina de

Streptomyces lasaliensis e Streptomyces cinnamonensis respectivamente. ........ 12

Esquema 10. Modelo CCW representando a biossíntese de poliéteres ionóforos

via epoxidação estereosseletiva seguida de abertura e ciclização. ...................... 13

Esquema 11. Teste de adrenalina para epóxido hidrolases (esquema adaptado da

referência 71). ....................................................................................................... 44

Esquema 12. O processo de ciclização exo-tet leva a formação do anel do tipo

furano nos compostos tetronasina (A) e tetronomicina (B). Desconsiderando o anel

tetronato, todos os centros estereogênicos nos produtos naturais são

enantioméricos. ..................................................................................................... 74

Lista de figuras

Figura 1. Resíduos do sítio ativo responsáveis pela catálise da enzima limoneno

epóxido-hidrolase de Rhodococcus erythropolis (adotado da Ref.40). ................. 11

Figura 2. Modelos tridimensionais obtidos para a enzima B1EPH2 pelo servidor I-

TASSER. ............................................................................................................... 36

Figura 3. Detalhe do modelo tridimensional da enzima B1EPH2 destacando os

resíduos D114 (em azul), D281 (em verde) e H312 (em rosa) que compõem a

tríade catalítica junto aos resíduos de Y163 e Y251 (em vermelho) que ativam o

anel oxirano. .......................................................................................................... 37

Figura 4. Modelagem da interação entre o substrato glicidil fenil éter e a enzima

B1EPH2................................................................................................................. 39

Figura 5. Modelagem da interação entre o substrato 1,2-epóxioctano e a enzima

B1EPH2................................................................................................................. 39

Figura 6. Gel SDS-PAGE apresentando as bandas correspondentes às frações

eluídas a distintas concentrações de imidazol no processo de purificação da

enzima B1EPH2 através da coluna de afinidade de níquel (coluna 1 (lisado);

colunas 2-13 4 (diferentes frações eluídas com o gradiente de tampões fosfato de

sódio pH 7,4 contendo 20-500 mmol L-1 imidazol); coluna 15 marcador

ColorBurst™ Electrophoresis Marker). .................................................................. 41

Figura 7. Medições do espectro DC da enzima B1EPH2. Dados corrigidos de

elipticidade molar θ (graus. cm2 dmol-1) em função do cumprimento de onda para

uma concentração de 125 µg ml-1. ........................................................................ 42

Figura 8. Foto da placa com o teste de adrenalina para a enzima B1EPH2

(superior) e escala de cinza correspondente (inferior). ......................................... 46

Figura 9. Atividade relativa (%) da enzima B1EPH2 em função da variação de pH

e de temperatura em DMSO. ................................................................................ 47

e temperatura em ACN. ........................................................................................ 48

Figura 11. Comparação das atividades relativas (%) da enzima B1EPH2 em ACN

e DMSO................................................................................................................. 49

Figura 12. Atividade relativa (%) da enzima B1EPH2 em DMSO nas diferentes

temperaturas testadas. .......................................................................................... 50

Figura 13. Modelos tridimensionais com maior C-score obtidos para as enzimas a)

NigBI, b) TsnB e c) TmnB pelo I-TASSER. ........................................................... 53

Figura 14. Modelos tridimensionais com maior C-score obtidos para a) LasB e b)

NanI destacando as α-hélices (em azul), as folhas β (em vermelho) e a estrutura

randômica (em roxo). ............................................................................................ 54

SalBI, b) SalBII e c) SalBIII pelo I-TASSER. ......................................................... 55

Figura 16. Alinhamento das enzimas B que mostram vários resíduos conservados

que podem contribuir para a atividade enzimática. ............................................... 57

Figura 17. Superposição gerada no programa PyMol dos modelos das enzimas

NigBI (rosa) e LEH 1NWW (verde) gerados pelo servidor I-TASSER. .................. 58

NigBI (rosa) e LasB (azul) gerados pelo servidor I-TASSER. ............................... 58

NigBI (rosa) e NanI (verde) gerados pelo servidor I-TASSER............................... 59

enzima NigBI (tamanho 15,8 kDa) por coluna de afinidade de níquel (coluna 1

(lisado); colunas 2-8 (frações eluídas com tampão 20 mmol L-1 fosfato de sódio, e

gradiente de 20-500 mmol L-1 imidazol, pH 7,4); colunas 9-14 (frações

concentradas e dessalinizadas com tampão 50 mmol L-1 fosfato de sódio, 150 mM

cloreto de sódio, pH 7); coluna 15 marcador Precision Plus Protein™ Dual Color

Standards (BIO-RAD). ........................................................................................... 60

Figura 21. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a NanI

(colunas 1, 2 e 3; tamanho 34,4 kDa). NigBI (colunas 4, 5 e 6; tamanho 15,8 kDa;

marcador Precision Plus Protein™ Dual Color Standards da BIO-RAD (coluna 7).

B1EPH2 (colunas 8, 9, 10 e 11; tamanho 37,0 kDa); TsnB (colunas 12, 13 e 14;

tamanho 14,8 kDa). Todas as enzimas foram purificada parcialmente por coluna

de afinidade e concentradas com coluna de dessalinização. ............................... 61

Figura 22. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a TmnB

(Colunas 1 e 2: lisado, Colunas 4, 5, 6, 7 e 8 purificação parcial por coluna de

afinidade e Colunas 9, 10, 11, 12 e 13 frações eluídas no processo de

concentração da proteína com coluna de dessalinização). Marcador Precision Plus

Protein™ Dual Color Standards (BIO-RAD). ......................................................... 61

Figura 23. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a SalBI

(colunas 1 e 2: lisado, colunas 3 e 4 proteína purificada coluna de afinidade),

SalBIII (coluna 5: purificação parcial por coluna de afinidade) e SBalII (coluna 6:

lisado, colunas 7, 8 e 9: purificação parcial por coluna de afinidade) e B1EPH2

(colunas 10, 11, 12, 13 e 14 frações eluídas a diferentes concentrações de

imidazol pela coluna de afinidade). Marcador Novex® Sharp Pre-Stained Protein

Standard (Invitrogen). ............................................................................................ 62

Figura 24. Medições do espectro DC para a enzima NigBI. Dados corrigidos de

elipticidade molar θ (graus. cm2. dmol-1) em função do cumprimento de onda (200

a 260 nm) para uma concentração de 300 µg ml-1. ............................................... 63

Figura 25. Medições do espectro DC para a enzima LasB. Dados corrigidos de

a 260 nm) para uma concentração de 250 µg ml-1 da enzima. ............................. 64

Figura 26. Escalas de cinza correspondente as enzimas TsnB, TmnB, LasB, NanI,

NigBI e SalBIII. ...................................................................................................... 68

Figura 27. Estrutura tridimensional obtida por difração de raios-X da enzima LasB.

A projeção indica os resíduos previstos em fazer parte do sítio ativo. Imagem

cedida pelo Prof. Marcio Dias. ............................................................................... 70

Figura 28. Estrutura tridimensional da enzima NanI obtida por difração de raios-X,

mostrando a cavidade prevista em conter o sítio ativo nos domínios da enzima

(domínio N-terminal em verde e domínio C-terminal em rosa). Imagem cedida pelo

Prof. Marcio Dias. .................................................................................................. 71

Figura 29. As enzimas LasB (esquerda) e NanI (direita) apresentam uma possível

permutação estrutural entre seus domínios. Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias.

.............................................................................................................................. 72

Figura 30. Estruturas das enzimas TsnB (A) e TmnB (B). Apesar da elevada

similaridade estrutural dessas enzimas, as cavidades de sítio ativo apontam para

direções opostas. Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias. .................................... 73

Figura 31. Sobreposição dos resíduos polares do sítio ativo de TsnB e TmnB.

Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias. ................................................................. 73

1. Introdução

Epóxidos e dióis vicinais são elementos estruturais presentes em um

grande número de moléculas simples e complexas. Especificamente os epóxidos

destacam-se por sua ampla capacidade para sofrer reações de abertura régio-,

estéreo- e enantiosseletiva devido à alta reatividade do anel oxirano presente na

molécula.1,2 A versatilidade e reatividade dos epóxidos permitem categorizá-los

como materiais de partida e intermediários versáteis na síntese e biossíntese de

compostos dotados de relevantes atividades biológicas e farmacológicas.3

Nas últimas décadas muitos esforços foram dedicados ao desenvolvimento

de estratégias inovadoras para a preparação de epóxidos e outros compostos

enantiomericamente puros para serem empregados como intermediários na

preparação de drogas quirais como enantiômeros únicos para cumprir com as

exigências dos órgãos reguladores como a FDA (Food and Drug Administration)

dos Estados Unidos.4 Neste contexto têm sido desenvolvidas diversas

metodologias para o preparo de epóxidos enantiomericamente puros, entretanto

nenhuma destas alternativas é de aplicação geral pelas restrições próprias de

cada metodologia. Dentre estes procedimentos destacam-se a epoxidação de

Sharpless, conhecida como a primeira reação de epoxidação assimétrica e que

utiliza um catalisador de titânio. Esta reação apresenta como desvantagem um

uso limitado a álcoois alílicos.5 De maneira a estender a reação de epoxidação de

Sharpless a outros tipos de compostos foi desenvolvida a epoxidação de

Jacobsen-Katsuki, que emprega um catalisador de manganês e tem como

vantagem alta enantiosseletividade para cis-alcenos, porém os resultados são

menos satisfatórios para os isômeros trans. 6,7,8

1 Schurig, V. and Betschinger, F. Chem. Rev. 1992, 92, 873-888.

2 Kolb, H., Van Nieuenhze, M. and Sharpless, K. Chem. Rev. 1994, 94, 2483-2547.

3 Belshaw, P. J., Meyes, D. and Johnson, D. D. Synlett 1994, 6, 381-392.

4 Barreiro, E. J., Ferreira, V. F. and Costa, P. R. R. Quim. Nova 1997, 20, 647-656.

5 Finn, M. G. and Sharpless, K. B.: On the Mechanism of Asymmetric Epoxidation with Titanium-

Tartrate Catalysts, ”Asymmetric Synthesis,” Academic Press, Inc.: New York, 1985. 6 Hosoya, N., Hatayama, A., Irie, R., Sasaki, H. and Katsuki, T. Tetrahedron 1994, 50, 4311-4322.

7 Linker, T. Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 2060-2062.

Visando alcançar melhores rendimentos na obtenção de epóxidos

enantiopuros desenvolveram-se vários processos biocatalíticos, entre os que

destacam o uso de mono-oxigenases bacterianas do citocromo P-450 e de outros

tipos para a epoxidação estereoespecífica de alcenos, resultando em excessos

enantioméricos frequentemente altos, porém os rendimentos químicos são

baixos.9,10,11,12 Outros limitantes na aplicação dessas enzimas na síntese orgânica

incluem o uso de cofatores e a alta especificidade que restringe o número de

substratos aceitos pela enzima.

Alternativamente, para a obtenção de epóxidos e dióis enantiomericamente

puros são utilizadas enzimas epóxido-hidrolases (EH), que catalisam a adição de

moléculas de água a epóxidos levando à formação do diol vicinal correspondente

(Esquema 1). A reação ocorre via mecanismo SN2 e a abertura específica de

epóxidos 1,2-substituídos leva à formação de 1,2-dióis com configuração trans. As

principais vantagens da utilização destas enzimas em processos biocatalíticos são

que não requerem cofatores para atuar e estão presentes em uma grande

variedade de seres vivos como mamíferos,13 plantas,14 insetos,15 leveduras,16

fungos filamentosos17,18 e bactérias.19,20

8 Katsuki, T. and Martin, V. S. Org. React. 1996, 48, 1-299.

9 Pedragosa-Moreau, S., Archelas, A. and Furtoss, R. Bull. Soc. Chim. Fr. 1995, 132, 769-800.

10 de Bont, J. A. M. Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1331-1340.

11 Onumonu, A. N., Colocoussi, N., Matthews, C., Woodland, M. and Leak, D. Biocatalysis 1994,

10, 211-218. 12

Besse, P. and Veschambre, H. Tetrahedron 1994, 50, 8885-8927. 13

Bellucci, G., Chiappe, C., Marioni, F. and Benetti, M. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1991, 1, 361-363. 14

Blée, E. and Schuber, F. Eur. J. Biochem 1995, 230, 229-234. 15

Linderman, R. J., Walker, E. A., Haney, C. and Roe, R. M. Tetrahedron 1995, 51, 10845-10856. 16

Weijers, C. A. G. M. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 639-647. 17

Grogan, G., Roberts, S. M. and Willetts, A. J. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 141, 239-243. 18

Pedragosa-Moreau, S., Archelas, A. and Furstoss, R. Tetrahedron 1996, 52, 4593-4606. 19

Mischitz, M., Faber, K. and Willetts, A. Biotechnol. Lett. 1995, 17, 893-898. 20

Osprian, I., Kroutil, W., Mischitz, M. and Faber, K. Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 65-71.

Esquema 1. Reação de hidrólise de epóxido resultando no respectivo 1,2-diol

catalisada pela enzima epóxido-hidrolase.

Na natureza as EH fazem parte do grupo enzimático responsável pela

desintoxicação de xenobióticos de organismos procariotos e eucariotos,

promovendo a hidrólise dos epóxidos formados previamente a partir de compostos

olefínicos ou aromáticos pela ação de mono-oxigenases do tipo citocromo P-450.

Os trans-1,2-dióis resultantes da hidrólise são posteriormente metabolizados ou

excretados de forma mais fácil pelas células pela maior solubilidade em água

(Esquema 2). Uma atividade deficiente das EH no organismo origina, portanto, um

acúmulo de moléculas de epóxido, que devido ao caráter eletrofílico do anel

oxirano podem reagir facilmente até a formação de compostos tóxicos,

carcinogênicos e teratogênicos.21,22,23

Esquema 2. A degradação de aromáticos pode prosseguir através de uma reação

de epoxidação catalisada por mono-oxigenase seguida pela conversão dos

epóxidos a dióis catalisada por epóxido-hidrolases.

Seidegard, J. and De Pierre, J. W. Biochim. Biophys. Acta 1983, 695, 251-270. 22

Armstrong, R. N. CRC Crit. Rev. Biochem. 1987, 22, 39-88. 23

Faber, K.: Biotransformations in Organic Chemistry; 6th ed.; Springer, 2011. pp. 124-149.

1.1. Epóxido-hidrolases microbianas

Embora a aplicação de epóxido-hidrolases microbianas em biocatálise

começou de forma mais estendida na década dos 90 com as pesquisas do Prof. K.

Faber na Áustria e o Prof. R. Furtoss na França, desde há vários anos atrás se

conhecia da existência desta classe enzimática em células de micro-organismos.

Allen et al já tinham relatado em 1969 a catálise na síntese de ácido L- e meso-

tartárico a partir de um precursor epóxido por parte de uma EH isolada da

linhagem Pseudomonas putida.24

No ano 1994, o grupo de Prof. Faber verificou que no preparo enzimático

SP409 produzido a partir de Rhodococcus sp produzido pela Novozymes e

destinado à hidrólises de nitrilas, era capaz também de hidrolisar uma grande

variedade de epóxidos mono- e 2,2-di-substituído com uma enantiosseletividade

de baixa a moderada (Esquema 3).25 Estes resultados abriram uma nova etapa no

estudo das EH microbianas como alternativa para a produção de epóxidos e dióis

enantiopuros uma vez que foi demonstrado que uma ampla variedade de micro-

organismos produzem EH e essas podem exibir excelente enantiosseletividade na

conversão de epóxidos a dióis. 26

Allen, R. H. and Jakoby, W. B. J. Biol. Chem. 1969, 244, 2078-2084. 25

Mischitz, M. and Faber, K. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 81-84. 26

Bornscheuer, U. and Kazlauskas, R. J.: Hydrolases in Organic Synthesis: Regio- and Stereoselective Biotransformations; 2nd ed., 2006. pp. 220-222.

Esquema 3. Reação de abertura enantiosseletiva de epóxidos promovida

pelo extrato enzimático de Rhodococcus sp SP409.25

Os estudos citados anteriormente e outros permitiram o acúmulo de

conhecimento sobre EH microbianas de variadas fontes como bactérias, fungos

filamentosos e leveduras e levou à visualização das preferências na atividade de

EH frente a padrão de substituição de diferentes tipos de epóxidos.27,28,29,30,31 Por

exemplo, EH de fungos (ex. Aspergillus e Beauveria sp) em geral são mais ativas

frente a substratos do tipo óxido de estireno enquanto EH bacterianas em

particular as derivadas de actinobactérias como Rhodococcus e Nocardia sp são

catalisadores preferenciais para epóxidos 2,2- e 2,3- dissubstituídos.23

A primeira hidrólise em escala preparativa produzida por EH foi relatada

pelo grupo do Prof. Furstoss. Eles observaram que o fungo Aspergillus niger

promove a conversão enantiosseletiva do N-fenilcarbamatogeraniol produzindo o

(S)-epóxido em alta pureza óptica (Esquema 4), o qual foi posteriormente

convertido para o composto de Bower.31 Os avanços surgido nas décadas dos

noventa e princípios do 2000 nas técnicas de biologia permitiram que um número

significativo de enzimas EH de outras classes foram clonadas em organismos

heterólogos e posteriormente caracterizadas e melhoradas a partir da identificação

Saving, J. and de Bont, J. A. M. Enzyme Microb. Technol. 1998, 22, 19-26. 28

Archer, I. V. J. Tetrahedron 1997, 53, 15617-15662. 29

Weijers, C. A. G. M. and de Bont, J. A. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, 6, 199-214. 30

Orru, R. V. A., Archelas, A., Furstoss, R. and Faber, K. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1998, 63, 145-167. 31

Zhang, X. M., Archelas, A. and Furstoss, R. J. Org. Chem. 1991, 56, 3814-3817.

dos genes correspondentes, possibilitando a obtenção de quantidades aceitáveis

de enzima para biotransformações em escala preparativa assim como um

aumento na enantiosseletividade comparadas às enzimas selvagens. Aplicando-

se estas metodologias de evolução in vitro por exemplo, a EH de A. niger teve

sua enantiosseletividade amplificada de E = 4,6 para 10,8 frente ao substrato

glicidil fenil éter. 32

Esquema 4. Representação da reação de conversão do N-fenilcarbamato geraniol

para o correspondente (S)-epóxido catalisada pela EH de Asperigillus niger.31

1.2. Estrutura das epóxido-hidrolases e mecanismos de atuação

A maioria das EH pertencem à família das α,β-hidrolases. Estas enzimas

apresentam o numero de classificação enzimática de 3.3.2.10 que corresponde a

enzimas solúveis que catalisam a hidrólise de ligações de éter. As quatro

Reetz, M. T., Torre, C., Eipper, A., Lohmer, R., Hermes, M., Brunner, B., Maichele, A., Bocola, M., Arand, M., Cronin, A., Genzel, Y., Archelas, A. and Furstoss, R. Org. Lett. 2004, 6, 177-180.

estruturas de EH mais representativas desta família são a EH de Agrobacterium

radiobacter,33 a EH solúvel dos mamíferos Mus musculus34,35 e Homo sapiens,36 e

a EH do fungo Asperigillus niger.37 O modelo básico para a estrutura das EH do

tipo α,β-hidrolases é constituído por uma região central com oito conformações de

tipo folhas-β flanqueadas por α-hélices, em meio a estas estruturas encontram-se

os três resíduos que formam a tríade catalítica. Outra região principalmente

formada por estruturas helicoidais constituem uma cobertura (lid) do núcleo que

contém as duas tirosinas que auxiliam na catálise.

O mecanismo proposto para a hidrólise de epóxidos pelas enzimas EH foi

elucidado em 1999 a partir da resolução por difração de raios-X da estrutura da

EH de Agrobacterium radiobacter AD133 em conjunto com estudos de mutação.

Esses estudos permitiram concluir que a conversão de epóxido a diol ocorre em

duas etapas. Em uma primeira etapa dois resíduos de tirosina (Tyr152 e Tyr215)

ativam o anel oxirano presente no substrato para o ataque do resíduo de Asp107.

Os resíduos de tirosina também são responsáveis pela estabilização do estado de

transição.38 Já na segunda etapa, a molécula de água requerida para a catálise é

ativada pelo par histidina-aspartato, promovendo a hidrólise do intermediário

covalente e resultando na formação do diol correspondente (Esquema 4). Estudos

de outras EH como a do fungo Aspergillus niger revelaram que esta enzima tem

uma estrutura e mecanismo de atuação similar. 37

Nardini, M., Ridder, I. S., Rozeboom, H. J., Kalk, K. H., Rink, R., Janssen, D. B. and Dijkstra, B. W. J. Biol. Chem. 1999, 274, 14579-14586. 34

Argiriadi, M. A., Morisseau, C., Hammock, B. D. and Christianson, D. W. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 10637-10642. 35

Argiriadi, M. A., Morisseau, C., Goodrow, M. H., Dowdy, D. L., Hammock, B. D. and Christianson, D. W. J. Biol. Chem. 2000, 275, 15265-15270. 36

Gomez, G. A., Morisseau, C., Hammock, B. D. and Christianson, D. W. Biochemistry 2004, 43, 4716-4723. 37

Zou, J., Hallberg, B. M., Bergfors, T., Oesch, F., Arand, M., Mowbray, S. L. and Jones, T. A. Structure Fold Des. 2000, 8, 111-122. 38

Rink, R., Spelberg, J. H. L., Pieters, R. J., Kingma, J., Nardini, M., Kellogg, R. M., Dijkstra, B. W. and Janssen, D. B. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7417-7418.

Esquema 5. Mecanismo proposto para hidrólise de epóxidos promovida pela EH

de Agrobacterium radiobacter.33

O mecanismo proposto evidencia que a hidrólise enzimática de epóxidos

terminais pode ocorrer com o ataque do aspartato sobre o carbono menos

impedido do anel oxirano, levando neste caso à retenção da configuração (rota

mais comum) ou no centro esterogênico resultando em inversão da configuração

(Esquema 6).23

Esquema 6. Representação das possíveis vias pelas quais a hidrólise de epóxidos

pode proceder.

Algumas EH podem seguir um mecanismo de atuação diferente, onde a

molécula de água ataca diretamente ao epóxido por um mecanismo de apenas

uma etapa. A enzima limoneno-1,2-epóxido hidrolase (LEH) de Rhodococcus

erythropolis apresenta uma estrutura com pouca semelhança quando comparada

a EHs do tipo α,β-hidrolase e um tamanho de apenas 17 kDa (enquanto as

convencionais já mencionadas possuem tamanhos de mais de 30 kDa). A

caracterização estrutural completa e identificação dos resíduos no sítio ativo

responsáveis pela catálise foi relatada por Arand et al., em 2003.39 Os dados de

difração de raios-X foram depositados no banco de dados de proteínas (PDB) com

código de identificação 1NWW. A bactéria Rhodococcus erythropolis consegue

crescer aproveitando limoneno e outros terpenos como fonte de carbono, além de

catalisar a reação de hidrólise do limoneno óxido levando a formação do limoneno-

1,2-diol (Esquema 7) em uma reação enantioconvergente, de grande interesse

para utilização em síntese industrial.

Esquema 7. Reação de hidrólise enantioconvergente do limoneno óxido levando a

formação do limoneno-1,2-diol mediada pela LEH de Rhodococcus erythropolis.

Arand, M., Hallberg, B. M., Zou, J., Bergfors, T., Oesch, F., van der Werf, M. J., de Bont, J. A., Jones, T. A. and Mowbray, S. L. EMBO J. 2003, 22, 2583-2592.

A enzima LEH não apresenta similaridades ao sítio ativo encontrado na

maioria das EH. Possui uma cavidade hidrofóbica moldada por 6 folhas-β

rodeadas por 4 α-hélices. A cavidade possui na posição mais profunda um

conjunto de grupos polares, incluindo uma tríade Asp-Arg-Asp. Os experimentos

voltados para elucidar a atividade catalítica sugeriram um mecanismo do tipo

push-pull que ocorre em apenas uma etapa e envolve a protonação do epóxido

pelo resíduo Asp101 concomitante ao ataque nucleofílico por uma molécula de

água sobre um dos átomos de carbono do anel oxirano.39 A molécula de água é

ativada por ligações de hidrogênio aos resíduos Asp132, Tyr53 e Asn55. As

argininas próximas ao sítio ativo também interagem facilitando o posicionamento

dos resíduos de aspartato (Esquema 8; Figura 1).

Esquema 8. Representação do mecanismo push-pull de hidrólise em uma etapa

para a enzima LEH de Rhodococcus erythropolis.23,39

Figura 1. Resíduos do sítio ativo responsáveis pela catálise da enzima limoneno

epóxido-hidrolase de Rhodococcus erythropolis (adotado da Ref.40).

1.3. Enzimas B análogas à limoneno epóxido hidrolase

Os poliéteres ionóforos representam um grande grupo de substâncias

naturais biossintetizadas principalmente por bactérias do gênero Streptomyces.

Apresentam uma extensa gama de atividades biológicas e uma estrutura

característica composta por múltiplos anéis de tipo furano e pirano (Esquema 9).40

A diversidade estrutural dos poliéteres ionóforos tem sua origem no número de

anéis do tipo pirano e furano originados vias reações de ciclização. Vários

antibióticos poliéteres como monensina (Coban, Rumensin, Coxidin), lasalocida

(Avatec, Bovatec), salinomicina (Bio-cox, Sacox), narasina (Monteban, Maxiban),

maduramicina (Cygro), laidlomicina (Cattlyst) e semduramicina (Aviax) têm

aplicação comercial como agentes anticoccidianos e como aditivos em alimentos

para ruminantes, sendo comercializados com essa finalidade.41

Dutton, C. J., Banks, B. J. and Cooper, C. B. Nat. Prod. Rep. 1995, 12, 165-181. 41

Rutkowski, J. and Brzezinski, B. Biomed. Res. Int. 2013, 2013, 1-32.; Huczyński, A. Bioorg. Med.

Chem. Lett. 2012, 22, 7002-7010.

Esquema 9. Estrutura dos antibióticos poliéteres lasalocida e monensina de

Streptomyces lasaliensis e Streptomyces cinnamonensis respectivamente.

As estruturas e as atividades biológicas dos poliéteres ionóforos atraíram

estudos extensivos das rotas biossintéticas que os originam ao longo dos últimos

40 anos.42 Um modelo biossintético unificado para a biossíntese dos poliéteres

ionóforos foi proposto por Cane, Celmer e Westley com base em dados empíricos.

Este modelo, denominado modelo CCW, envolve a participação de um

intermediário policetídico insaturado linear, o qual sofre epoxidação

estereosseletiva seguida de abertura dos anéis do tipo epóxido e ciclização em

cascata, levando a formação dos sistemas espirocetálicos e dos diversos anéis do

tipo furano e pirano (Esquema 10). Esta estratégia simples, mas versátil para a

construção de antibióticos poliéteres, pode ser estendida para todos os poliéteres

naturais.43

As enzimas “B” são hidrolases-ciclases encontradas como participantes da

biossíntese dos poliéteres ionóforos. Estas enzimas atuam promovendo a abertura

e ciclização dos epóxidos ao longo da biossíntese originando os éteres cíclicos. As

enzimas B de Streptomyces foram inicialmente descritas no cluster de genes que

codifica a biossíntese do antibiótico monensina, produzido por Streptomyces

Minami, A., Ose, T., Sato, K., Oikawa, A., Kuroki, K., Maenaka, K., Oguri, H. and Oikawa, H. ACS Chem. Biol. 2014, 9, 562-569. 43

Cane, D., Celmer, W. and Westley, J. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3594−3600.

cinnamonensis.44,45 Posteriormente, enzimas desempenhando atividades similares

foram identificadas nos clusters de outros antibióticos poliéteres como

lasalocida,46,47 nigericina,48 nanchangmicina,49 tetronasina e tetronomicina 50 e

salinomicina. 51

Esquema 10. Modelo CCW representando a biossíntese de poliéteres ionóforos

via epoxidação estereosseletiva seguida de abertura e ciclização.

Leadlay, P. F., Staunton, J., Oliynyk, M., Bisang, C., Cortes, J., Frost, E., Hughes-Thomas, Z. A., Jones, M. A., Kendrew, S. G., Lester, J. B., Long, P. F., McArthur, H. A., McCormick, E. L., Oliynyk, Z., Stark, C. B. and Wilkinson, C. J. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2001, 27, 360-367. 45

Oliynyk, M., Stark, C. B. W., Bhatt, A., Jones, M. A., Hughes-Thomas, Z. A., Wilkinson, C., Oliynyk, Z., Demydchuk, Y., Staunton, J. and Leadlay, P. F. Mol. Microbiol. 2003, 49, 1179-1190. 46

Migita, A., Watanabe, M., Hirose, Y., Watanabe, K., Tokiwano, T., Kinashi, H. and Oikawa, H. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009, 73, 169-176. 47

Smith, L., Hong, H., Spencer, J. B. and Leadlay, P. F. ChemBioChem. 2008, 9, 2967-2975. 48

Harvey, B. M., Mironenko, T., Sun, Y., Hong, H., Deng, Z., Leadlay, P. F., Weissman, K. J. and Haydock, S. F. Chem. Biol. 2007, 14, 703-714. 49

Sun, Y., Zhou, X., Dong, H., Tu, G., Wang, M., Wang, B. and Deng, Z. Chem. Biol. 2003, 10, 431-441. 50

Bhatt, A., Stark, C. B., Harvey, B. M., Gallimore, A. R., Demydchuk, Y. A., Spencer, J. B., Staunton, J. and Leadlay, P. F. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005, 44, 7075-7078. 51

Yurkovich, M. E., Tyrakis, P. A., Hong, H., Sun, Y., Samborskyy, M., Kamiya, K. and Leadlay, P. F. ChemBioChem. 2012, 13, 66-71.

A análise da sequência do cluster de genes envolvido na biossíntese da

monensina sugeriu inicialmente que duas enzimas, identificadas como MonBI e

MonBII, poderiam ser responsáveis pela isomerização cis-trans das duplas

ligações do intermediário policetídeo linear pré-monensina, agindo em conjunto a

outra enzima identificada como MonCII. MonCII desempenharia atividade de

epóxido-hidrolase além de catalisar a ciclização em cascata do intermediário

poliepóxido.52 Experimentos de deleção de genes MonCII descartaram qualquer

papel para MonBI ou BII na isomerização das ligações duplas do policetídeo

enquanto estudos paralelos estabeleceram que MonCII era uma tioesterase

responsável pela liberação do produto poliéter da proteína carreadora de acila.48

Estes resultados forneceram uma nova perspectiva sobre os papéis de MonBI e

MonBII como candidatas a EH. A comparação de MonBI e MonBII no Banco de

Dados de Proteínas (PDB) forneceu um número de hits dentre os quais o modelo

estrutural mais próximo foi a limoneno 1,2-epóxido-hidrolase de Rhodococcus

erythropolis.52 Com base no alinhamento prévio do modelo 3D de MonBI com a

estrutura da LEH, os resíduos E38 e E65 de MonBI foram identificados como

possíveis resíduos do sítio ativo que auxiliam na catálise. A participação desses

aminoácidos na catálise enzimática foi confirmada posteriormente com a

resolução das estruturas de MonBI e MonBII por difração de raios-X e

experimentos de mutação sítio dirigida.42

Liu, T., Cane, D. E. and Deng, Z. Methods Enzymol. 2009, 459, 187-214.

2. Objetivos

O objetivo geral deste trabalho é a caracterização de um grupo de epóxido-

hidrolases anotadas do genoma de linhagens de actinobactérias do gênero

Streptomyces. Foram eleitas uma hidrolase do tipo α,β e várias hidrolases-ciclases

análogas à limoneno epóxido hidrolase (identificadas nos clusters de genes que

codificam para antibióticos poliéteres produzido por diversas linhagens de

Streptomyces). A caracterização funcional e estrutural dessas enzimas representa

um primeiro passo para a aplicação em síntese industrial. Como objetivos

específicos são propostos:

Expressão das epóxido-hidrolases de actinobactérias do gênero

Streptomyces;

Caracterização da atividade enzimática das enzimas purificadas.

3. Materiais e métodos

3.1. Analise in sílico das enzimas

As estruturas das enzimas estudadas foram modeladas pelo servidor I-

TASSER.53,54,55 Para o docking ligante-enzima utilizou-se o programa Vina56 e

foram selecionadas as estruturas das proteínas com maior pontuação ou C-score

gerada pelo I-TASSER. A visualização das diferentes moléculas foi realizada

através do PyMOL.57 Os alinhamentos das sequencias de aminoácidos foram

desenhados com auxílio do ClustalW.58 Os parâmetros como o ponto isoelétrico

(pI), coeficiente de estabilidade e massa das proteínas a foram obtidos com a

ferramenta ProtParam do ExPASy.59

3.2. Reagentes químicos

Foram utilizados solventes grau PA ou HPLC de acordo com o

procedimento seguido. As soluções foram preparadas com água ultrapura obtida

com o sistema Milli-Q produzido pela Millipore®. Reagentes químicos foram

adquiridos da empresa Sigma Aldrich.

3.3. Reagentes biológicos

Os antibióticos utilizados foram adquiridos da Sigma Aldrich e o isopropil-ß-

D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) da Uniscience. As concentrações das soluções

estoque e de trabalho utilizadas estão descritas na Tabela 1. As soluções estoque

foram preparadas com Água Milli-Q ou solvente grau PA e esterilizadas através da

passagem por membrana filtrante 0,22 µm e armazenadas a -20 ºC.

Roy, A., Kucukural, A. and Zhang, Y. Nat. Protoc. 2010, 5, 725-738. 54

Roy, A., Yang, J. and Zhang, Y. Nucleic. Acids. Res. 2012, 40, W471-477. 55

Zhang, Y. BMC. Bioinformatics 2008, 9, 40. 56

Trott, O. and Olson, A. J. J. Comput. Chem. 2010, 31, 455-461. 57

The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schrödinger, LLC. 58

Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J. and Higgins, D. G. Bioinformatics 2007, 23, 2947-2948. 59

Gasteiger E., H. C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In The Proteomics Protocols Handbook. 2005. 52. 571-607.

Tabela 1. Reagentes biológicos utilizados

Reagente Biológico Solvente Concentração

Estoque

Concentração

de trabalho

Canamicina Água 50 mg ml-1 50 µg ml-1

Ampicilina Água 50 mg ml-1 50 µg ml-1

Cloranfenicol Etanol 34 mg ml-1 34 µg ml-1

IPTG Água 1 mol L-1 400 µmol L-1

Meio de cultivo LB: Meio utilizado para reativação e crescimento de E. coli em

geral.

Triptona 10 g

Extrato de levedura 5 g

NaCl 10 g

Água MilliQ 1 L

Para meio sólido adicionou-se 20 g L-1 de ágar. Esterilizou-se em autoclave

a 120 °C durante 20 minutos.

3.4. Micro-organismos

As cepas de Escherichia coli utilizadas no estudo foram BL21(DE3),

BL21(DE3)pLysS, DH10B, Rosetta 2 e Rosetta (DE3).60,61

http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes. Acessada em 12/2014 61

pET System Manual EMD Chemicals Inc. 2011

3.5. Vetores

Os vetores do sistemas pET foram utilizados nas etapas de clonagem,

transformação e expressão. Estes plasmídeos tem resistência a diversos

antibióticos e a expressão é controlada pelo promotor T7lac. A proteína heteróloga

foi expressa com uma cauda de histinas no C-terminal ou no N-terminal para

facilitar a etapa de purificação. Todas as construções contendo os plasmídeos

utilizados neste estudo foram realizadas pela Prof. Dra. Luciana Gonzaga de

Oliveira e pela Dra. Fanglu Huang do Departamento de Bioquímica da

Universidade de Cambridge, Reino Unido.

3.6. Soluções utilizadas

3.6.1. Soluções utilizadas para o preparo de células quimio e

eletrocompetentes

Tampão A 50 mM cloreto de cálcio, 10 mM acetato de potássio, pH 6,2:

Dissolveu-se 0,2778 g de cloreto de cálcio e 0,0496 g de acetato de potássio em

50 mL de água MilliQ. Ajustou-se o pH para 6,2 adicionando HCl 1 M ou NaOH 1

M. Filtrou-se a solução e reservou-se na geladeira até o uso.

Tampão B 50 mM cloreto de cálcio, 10 mM acetato de potássio, 20% de

glicerol, pH 6,2: Dissolveram-se 0,2778 g de cloreto de cálcio e 0,0496 g de

acetato de potássio em 25 mL de água MilliQ. Adicionou-se 10 mL de glicerol e

completou-se o volume para 50 mL com água. Ajustou-se o pH para 6,2

adicionando HCl 1 M ou NaOH 1 M. Filtrou-se a solução e reservou-se na

geladeira até o uso.

Glicerol 10%: Misturou-se 100 mL de glicerol com 900 mL de água Milli-Q.

Esterilizou-se por filtração.

3.6.2. Soluções utilizadas na purificação das proteínas

Tampões 20 mM fosfato de sódio, 500 mM cloreto de sódio e 20-500 mM

imidazol: Dissolveram-se 1,340 g de fosfato dissódico hepta-hidratado, 0,690 g de

fosfato monossódico mono-hidratado, 14, 61 g de cloreto de sódio e imidazol em

quantidade apropriada com a concentração da solução (Tabela 2) em 450 mL de

água Milli-Q. Ajustou-se o pH com HCl 1M e completou-se o volume para 500 mL

com água Milli-Q. Filtrou-se a solução.

Tabela 2. Composição em imidazol dos tampões fosfato de sódio 20 mM cloreto

de sódio 500 mM e imidazol 20-500 mM

Tampão Concentração de imidazol

no tampão (m mol-1)

Quantidade de fosfato de

imidazol (g)

1 10 0,34

2 20 0,68

3 30 1,00

4 40 1,35

5 50 1,70

6 60 2,05

7 70 2,40

8 80 2,70

9 90 3,05

10 100 3,40

11 200 6,80

12 300 10,20

13 500 17,68

Tampão C de dessalinização 50 mM de fosfato de sódio e 0,15 M de cloreto

de sódio, a diferentes pH: Dissolveu-se quantidades necessárias de fosfato

monossódico mono-hidratado e fosfato dissódico hepta-hidratado (Tabela 3) e

4,383 g de cloreto de sódio em 400 mL de água. Ajustou-se o pH adicionando HCl

1 M ou NaOH 1 M. Completou-se o volume para 500 mL com água. Filtrou-se a

solução.

Tabela 3. Quantidade de reagentes utilizados no preparo dos tampões fosfato de

sódio 50 mM cloreto de sódio 150 mM a diferentes pH

pH Quantidade de fosfato de

monossódico mono-hidratado (g)

Quantidade de fosfato de

dissódico hepta-hidratado (g)

5,0 3,4035 0,0900

6,0 3,0360 0,8045

7,0 1,4590 3,8665

7,2 1,0910 4,5815

7,4 0,7790 5,1870

8,0 0,2355 6,2425

Solução de albumina de soro bovino-BSA 2 mg mL-1 (ThermoScientific):

utilizou-se este padrão na quantificação da proteína total presente após a

purificação das enzimas estudadas.

Padrões de BSA: Diluiu-se uma solução de BSA 2 mg mL-1 até as

concentrações 1,250, 1,000, 0,750, 0,500, 0,250, 0,125 mg mL-1. Essas soluções

foram preparadas na realização da curva de calibração para a quantificação de

proteínas pelo método de Bradford.

3.6.3. Soluções utilizadas para preparo do gel SDS-PAGE

Tampão 1,5 mol L-1 Tris/HCl pH 8,8: Dissolveram-se 90,885 g de base

ultrapura Tris em 400 mL de água MilliQ. Ajustou-se pH a 8,8. Completou-se o

volume para 500 mL com água Milli-Q.

Tampão 0,5 mol L-1 Tris/HCl pH 6,8: Dissolveram-se 30,285 g de base

ultrapura Tris em 400 mL de água MilliQ. Ajustou-se o pH a 6,8. Completou-se o

volume para 500 mL com água Milli-Q.

Solução 20% dodecil sulfato de sódio (SDS): Dissolveram-se 10 g de SDS

em 50 mL de água Milli-Q levemente aquecida.

Solução 10% persulfato de amônio (APS): Dissolveram-se 0,2 g de APS em

água Milli-Q. Reservou-se em tubos de 1,5 mL cobertos com papel alumínio. As

soluções foram mantidas em geladeira.

Gel de corrida 12% de acrilamida/bis-acrilamida: Misturou-se 2,40 mL de

água Milli-Q, 1,82 mL de tampão 1,5 mol L-1 Tris/HCl pH 8,8, 75 µL de solução

10% SDS, 3,00 mL de solução 30% acrilamida/bis- acrilamida, 75 µL APS 10% e

7,5 µL de N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina (TEMED).

Gel de concentração 4% acrilamia/bis-acrilamida: Misturou-se 2,98 mL de

água Milli-Q, 1,25 mL de tampão 0,5 mol L-1 Tris/HCl pH 6,8, 50 µL de solução

10% SDS, 0,67 mL de solução 30% acrilamida/bis-acrilamida, 50 µL solução 10%

APS e 5 µL de N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina (TEMED).

Tampão de desnaturação das amostras LDS 5x: Dissolvou-se 1 g de SDS

em 3 mL de glicerol, 5 mL de solução tampão 0,5 mol L-1 Tris/HCl pH 6,8, 0,5 mL

de β-mercaptoetanol. Adicionaram-se alguns miligramas de azul de bromofenol

até alcançar uma coloração azul escura.

Tampão de corrida do gel: Dissolveram-se 3,0275 g de base ultrapura Tris,

14,40 g de glicina, 5 mL de solução 20% SDS em 1 L de água Milli-Q.

Soluções utilizadas na caracterização da atividade enzimática pelo teste de

adrenalina.

Solução periodato de sódio: Dissolveram-se 21,4 mg de periodato de sódio

(NaIO4) em 10 mL de água MilliQ. A solução foi preparada imediatamente antes

do uso.

Solução estoque de epóxido ou diol 100 mM: Dissolveram-se 0,5 mmol do

substrato ou diol desejado em 5 mL de acetonitrila (Tabela 4).

Tabela 4. Substratos usados no teste de adrenalina

Epóxido Estrutura Epóxido Estrutura

Butil glicidil éter

trans-2,3-

epoxibutano

(+)-trans-limoneno-

1,2-epóxido

cis-2,3-epoxibutano

Óxido de ciclopenteno

1,4-ciclo-

hexanodimetanol

éter diglicidílico

Óxido de cicloexeno

1,2-epoxioctano

Glicidil fenil éter

terc-butilglicidiléter

Óxido de estireno

Sal dissódico da

fosfomicina

exo-2,3-

epoxinorbornano

(+)-trans-1,2-

cicloexanodiol

Solução aquosa de sal de adrenalina 10 mmol L-1: Em um balão volumétrico

de 10 mL, adicionou-se 18 mg de L-adrenalina em 7 mL de água e 98 µL de HCl

37%. Após a dissolução do sal, completou-se o volume para 10 mL com água.

Solução estoque da enzima 1 mg ml-1: Dissolveram-se 2 mg da enzima

purificada em 2 mL do tampão C (50 mM de fosfato de sódio e 0,15 mol L-1 de

cloreto de sódio pH 7,0).

3.6.4. Soluções utilizadas nas medições dos parâmetros cinéticos e

enantiosseletividade das enzimas

Solução estoque 200 mmol L-1 de glicidil fenil éter em DMSO: Dissolveram-

se 2 mmol do glicidil fenil éter em 10 mL de DMSO.

Solução 0,05 mg mL-1 de benzofenona em acetato de etila: Dissolveram-se

0,5 mg de benzofenona em 100 mL de acetato de etila.

Soluções estoque 20 mmol L-1 de glicidil fenil éter, 0,05 mg mL-1 de

benzofenona em acetato de etila: Dissolveram-se 0,2 mmol de glicidil fenil éter em

10 mL da solução anterior. Diluições a concentrações 2, 4, 6, 8, 10, 15 e 20

mmmol L-1 de glicidil fenil éter foram preparadas a partir desta solução estoque.

3.7. Métodos

3.7.1. Extração de DNA plasmidial

A extração do DNA62 plasmidial foi efetuada com o kit QIAprep Spin

Miniprep (QIAGEN).

3.7.2. Manutenção microbiológica

Todas as linhagens de E.coli utilizadas foram incubadas a 37 ºC, durante 16

horas. Os cultivos em meio líquido foram realizados em erlenmeyers estéreis com

capacidade para 5 vezes o volume total do cultivo. No caso de linhagens ou

QIAprep Miniprep Handbook 2003.

vetores com resistência, foi adicionado o antibiótico correspondente na

concentração de trabalho.

As linhagens foram conservadas em placas de Petri contendo meio sólido

adicionado de antibiótico e seladas com parafilme a 4 ºC e em soluções estoque

de glicerol 20% a -80 ºC.

Todos os procedimentos foram realizados em fluxo unidimensional CFLV 12

(Grupo VECO).

3.7.3. Preparação de células quimicamente competentes

1. Preparou-se um pré-inoculo com 5 mL de meio LB adicionado com

antibiótico quando requerido e deixou-se em crescimento por 16 horas

a 37 °C sob agitação de 200 rpm.

2. Inoculou-se 1 mL do pré-inoculo em 50 mL de meio LB adicionado de

antibiótico quando requerido.

3. Cresceram-se as células a 37 °C e sob agitação de 150 rpm até A600nm

de 0,5 a 0,7.

4. Resfriaram-se as células no gelo. Nas próximas etapas, as células

foram mantidas o mais próximo possível de 0 °C e resfriaram-se todos

os recipientes aonde as células vieram a ser adicionadas. Transferiram-

se as células para um tubo de centrífuga resfriado e centrifugou-se a

1744 x g por 20 min a 4 °C.

5. Descartou-se completamente o sobrenadante.

6. As células foram ressupensas, gentilmente, em 50 mL do tampão A e

deixada em incubação por 1 h em gelo. Centrifugou-se a 2300 x g por

20 min a 4°C. Descartou-se completamente o sobrenadante.

7. As células foram ressuspensas em 3 mL de tampão B gelado.

8. Alíquotas de 100 µL da suspensão foram colocadas em tubos de 1,5

mL previamente esterilizados e armazenada à -80 °C.

3.7.4. Preparação de células eletrocompetentes

1. Preparou-se um pré inoculo com 5 mL de meio LB adicionado com

antibiótico quando requerido e deixou-se em crescimento por 16 horas

a 37 °C sob agitação de 200 rpm.

2. Inoculou-se 1 mL do pré inoculo em 50 mL de meio LB adicionado de

antibiótico quando requerido.

3. Cresceram-se as células a 37 °C e sob agitação de 150 rpm até A600nm

de 0,5 a 0,7.

4. Resfriaram-se as células no gelo por 20 min. Nas próximas etapas, as

células foram mantidas o mais próximo possível de 0 °C e resfriaram-se

todos os recipientes aonde as células vieram a ser adicionadas.

Transferiram-se as células para um tubo de centrífuga resfriado e

centrifugou-se a 2300 x g por 20 min a 4 °C.

5. Descartou-se completamente o sobrenadante.

6. Ressuspendeu-se o “pellet”, gentilmente, em 50 mL de glicerol 10%

gelado. Centrifugou-se a 2300 x g por 20 min a 4 ºC. Descartou-se

completamente o sobrenadante.

7. Ressuspendeu-se o “pellet” em 50 mL de glicerol 10% gelado.

Centrifugou-se nas mesmas condições que anteriormente. Descartou-

se completamente o sobrenadante.

8. Ressuspendeu-se o “pellet” em 20 mL de glicerol 10% gelado.

Centrifugou-se novamente e descartou-se completamente o

sobrenadante.

9. Ressuspendeu-se o pellet em um volume de 1 mL de glicerol 10%

gelado.

10. Esta suspensão foi alíquotada em tubos de 1,5 mL previamente

esterilizados e armazenada à -80 ºC.

3.7.5. Transformação química

1. Descongelou-se 1 vial contendo 100 µL de células quimicamente

competentes em gelo e adicionou-se 1 µ L do plasmídeo. Misturou-se

gentilmente e resfriou-se em gelo por 30 minutos.

2. Levou-se o tubo que contém as células a 42 °C por 55 segundos e

colocou-se novamente em gelo por 2 minutos.

3. Adicionou-se 500 µL de meio LB no tubo contendo às células e

incubou-se a 37 ºC por 1 h sob agitação.

4. Plaquearam-se alíquotas de 150 µL em meio LB sólido contendo o

antibiótico apropriado.

5. Incubaram-se as placas a 37 ºC por 16 h.

3.7.6. Eletrotransformação/Eletroporação

1. Descongelaram-se 40 µL de células electrocompetentes em gelo.

Adicionou-se 1 µ L do plasmideo às células e misturou-se gentilmente.

2. Transferiu-se para uma cubeta de eletroporação previamente

esterilizada e resfriada em gelo.

3. Secou-se a parte externa da cubeta e colocou-se no suporte do

electroporador.

4. Aplicou-se 1800 V.

5. Rapidamente, adicionou-se 500 µL de meio LB às células, transferiu-se

para um tubo 1,5 mL estéril e incubou-se por 1 h a 37 °C sob agitação.

6. Adicionaram-se alíquotas de 100 µL em placas de meio LB sólido

contendo o antibiótico apropriado.

7. Incubaram-se as placas a 37 ºC por 16 h.

3.7.7. Expressão de proteínas

1. Preparou-se um pré-inóculo com 25 mL do meio correspondente

adicionado com o antibiótico apropriado e deixou-se em crescimento

por 16 horas a 37 °C sob agitação de 200 rpm.

2. Inoculou-se 25 mL do pré-inóculo em 475 mL de meio LB adicionado

de antibiótico a 37 ° C e sob agitação a 120 rpm.

3. Cresceram-se as células até A600nm 0,7.

4. Adicionou-se a quantidade necessária de IPTG e incubou-se a por

16 horas.

5. Transferiu-se o inóculo a copos plásticos de centrífuga de 500 mL e

centrifugou-se a 3220 x g por 25 minutos.

6. Descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o “pellet” em 40 mL

de meio LB.

7. Transferiu-se a tubos de 50 mL e centrifugou-se a 3100 x g x 25 min.

Descartou-se o sobrenadante e o “pellet” foi armazenado a -80 ºC.

3.7.8. Eletroforese de proteínas

As análises da expressão e pureza das proteínas estudadas foram

realizados com o preparo de géis SDS-PAGE. Os géis foram preparados em

cassetes de plástico e corridos no sistema XCell SureLock, ambos da Invitrogen.

1. Misturaram-se em um tubo de centrífuga de 15 mL os reagentes

necessários para o preparo de gel de corrida e transferiu-se esta

mistura a um cassete de plástico. Deixou-se polimerizar por 20 minutos.

2. Misturaram-se os reagentes do preparo do gel de focalização,

transferiu-se a solução para o cassete e colocou-se um molde marcador

de poços. Aguardou-se 20 minutos até a polimerização da solução.

3. Adicionou-se 40 µL de cada amostra e 10 µL de 5x LDS tampão de

desnaturação em tubos de 0,5 mL. Deixou-se a 80ºC por 10 minutos.

4. O tampão de corrida e o cassete com o gel foram acondicionados na

cuba de eletroforese.

5. As amostras (12 µL) foram dispensadas nos poços do gel. Aplicou-se

uma voltagem de 200 V por 45 minutos.

6. Retirou-se o gel do cassete e lavou-se com água Milli-Q 3 vezes.

Descartou-se completamente a água Milli-Q.

7. Adicionou-se 20 mL de corante SimplyBlue Gel Staining Reagent e o

gel foi deixado corar sob agitação por 1 hora em plataforma agitadora.

8. Descartou-se o corante e lavou-se o gel com água Milli-Q deixando-se

em agitação por 4 horas.

3.7.9. Purificação de proteínas

A purificação das enzimas foi realizada com colunas de afinidade de Níquel

HisTrap FF crude 1 mL da GE HealthCare.

1. Descongelou-se o “pellet” resultante dos experimentos de expressão de

proteínas e resupendeu-se em 40 mL de tampão 1 de imidazol.

2. Sonicou-se a solução 7 vezes com potencia de 6 watts, em banho de

gelo por 30 segundos e intervalos de repouso de 1,5 minutos entre

cada pulso. A sonicação foi realizada no Sonic Dismembrator Model

100 da Fisher Scientific.

3. Centrifugou-se a solução a 3100 x g, 4 ºC por 20 minutos.

4. Transferiu-se o sobrenadante para um tubo de centrífuga.

5. Equilibrou-se a coluna de afinidade com 10 mL de tampão 2 de

imidazol. Imediatamente depois, passou-se 40 mL do lisado bacteriano

pela coluna. Reservou-se o sobrenadante não retido pela coluna para

análises posteriores.

6. Passaram-se 5 volumes de coluna dos tampões 2, 3, 4, 5, 12 e 13

através de coluna e recolheram-se as frações eluídas em tubos de 1,5

7. Realizou-se um gel SDS-PAGE com as frações recolhidas na etapa

anterior.

8. Juntaram-se as frações que apresentaram a banda da proteína alvo e

utilizou-se um tubo com filtro Amicon (Millipore) para a concentração e

dessalinização da proteína alvo. Centrifugou-se a 3200 x g, a 22 ºC por

20 minutos. Descartou-se o filtrado.

9. Adicionou-se 3,5 mL de tampão C ao tubo Amicon e centrifugou-se a

3200 x g, 22 ºC por 20 minutos. Descartou-se o filtrado.

10. Transferiu-se a solução retida pelo tubo de concentração a um tubo

de 1,5 mL.

11. Realizou-se um gel SDS-PAGE para verificar a presença da proteína

3.7.10. Quantificação pelo método de Bradford63

Utilizou-se reagente de Bradford da Sigma Aldrich na quantificação das

proteínas purificadas. A concentração das proteínas também foi estimada com

medições no espectrofotômetro Biomate 3 da Thermo Scientific, utilizando cubetas

de quartzo.

1. Prepararam-se padrões com concentrações 125-1250 µg mL-1 de BSA.

2. Adicionou-se 5 µL das soluções padrão em uma microplaca de 96

poços de polipropileno. Para a medição do branco foram adicionados 5

µL de tampão C no poço G. As medições foram feitas em triplicata.

3. Prepararam-se diluições da amostra de proteína com o tampão C, com

concentrações aproximadas à dos padrões de BSA.

4. Adicionou-se 5 µL das amostras diluídas da proteínas em diferentes

poços da placa.

5. Adicionou-se 250 µL do reagente Bradford a cada poço onde foram

adicionadas diluições dos padrões ou das amostras.

6. Agitou-se a placa por 30 segundos na leitora marca Anthos Zenyth 200

rt (Biochrom) e incubou-se por 15 minutos a temperatura ambiente.

7. Após a incubação a absorbância foi medida a λ=595 nm.

8. Construiu-se uma curva padrão de absorbância vs concentração de

9. Determinou-se a concentração das amostras de proteínas por

comparação a curva de calibração.

Bradford, M. M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254.

3.7.11. Teste de adrenalina para epóxido-hidrolases

1. Preparou-se uma solução com 6,3 ml de tampão C e 900 µl da solução

de periodato de sódio. Adicionou-se 80 µl desta solução em cada poço

de uma microplaca de propileno (A) de 96 cavidades.

2. Adicionaram-se 10 µl da enzima a ser testada em cada poço. Para o

controle da hidrólise espontânea adicionou-se 10 µL do tampão no lugar

da enzima.

3. Adicionaram-se 10 µl do substrato correspondente nos poços da placa.

Como controle positivo foi adicionado 10 µL do diol 1,2-cicloexanodiol

no lugar do substrato.

4. Cobriu-se a microplaca A com uma película adesiva para vedação

térmica e deixou-se em incubação por 30 minutos.

5. Adicionaram-se 15 µl da solução de L-adrenalina em uma segunda

placa (B).

6. Transferiram-se 85 µl da solução que foi deixada em incubação na

microplaca A à placa B.

7. Levou-se a placa B imediatamente depois da transferência da solução

da placa A até a leitora de microplacas e mediu-se a absorbância a λ =

490 nm.

8. Cada enzima foi testada nas concentrações 1, 2,5, 5, 10, 15 e 20 µg

Tratamento dos dados obtidos

1. Substraiu-se a leitura da hidrólise espontânea de cada substrato das

leituras correspondentes à atividade de cada enzima com o substrato

correspondente.

2. Calculou-se a média de cada par de replicatas de leitura de atividade

para uma mesma concentração de enzima e substrato.

3. Converteram-se os valores obtidos a uma escala de intensidades de

cores, onde o menor valor é representado com a cor branca (valor do

controle negativo; reação de periodato de sódio e adrenalina) e o maior

valor correspondente à máxima atividade (controle positivo; reação do

1,2-cicloexano diol, periodato de sódio e adrenalina) é representado

com a cor preta.

3.7.12. Medições da influencia do pH e temperatura na atividade

das enzimas

Os efeitos da variação do pH e a temperatura na atividade EH foram

determinados utilizando o teste de adrenalina descrito acima através da variação

do pH de 5 a 9 (tampões fosfato de sódio 50 mmol L-1 a diferentes pH) e

temperatura de 25 para 60 ° C.

3.7.13. Medições do espectro de dicroísmo circular

As medições do espectro de dicroísmo circular foram feitas no equipamento

Jasco J-720 (Jasco ORD 306) dos Laboratórios Institucionais do Instituto de

Químcia. Utilizou-se uma cubeta de quartzo de 1 cm x 1 cm. As medições foram

realizadas em cumprimento de ondas entre 260 nm e 195 nm.

1. Adicionou-se 500 µL de tampão fosfato de sódio (20 mmol L-1, pH 7) e

realizou-se a medição do branco.

2. Descartou-se o tampão fosfato da cubeta e adicionou-se 500 µL de

solução 1 mg ml-1 das enzimas e realizou-se a medição.

3. Realizaram-se diluições das soluções das enzimas até conseguir uma

concentração de trabalho na qual a sinal obtido no equipamento não

estivesse saturado. Esta concentração de trabalho foi entre 100 e 500

µg ml-1.

4. Para a deconvolução dos dados utilizou-se o programa CDNN,64 que

gera as porcentagens de cada tipo de conformação na estrutura

secundária total.

Böhm, G., Muhr, R. and Jaenicke, R. Protein Eng., Des. Sel. 1992, 5, 191-195.

4. Resultados e Discussão

Micro-organismos do gênero Streptomyces estão entre os mais importantes

produtores de metabólitos com ampla aplicação farmacológica. Seus metabólitos

ditos “secundários” apresentam atividades antimicrobianas, antifúngica,

antiparasitária, antitumoral e agroquímica entre outras. O potencial enzimático em

Streptomyces é de grande interesse e vários autores têm empregado estes micro-

organismos em reações de biotransformação para a obtenção de compostos

provenientes da ação de mono-oxigenases,65 desidrogenases,66 entre outras.

Dentre o maquinário enzimático produzido por Streptomyces sp, as

epóxido-hidrolases se destacam por sua aplicação em biocatálise para a obtenção

de epóxidos e dióis enantiomericamente puros, que são compostos usados

extensivamente como intermediários para a síntese de compostos bioativos.26

Nesse capítulo serão apresentados os resultados de avaliação in vitro da atividade

enzimática de um grupo de epóxido-hidrolases anotadas dos genomas de várias

linhagens do gênero Streptomyces.

4.1. Enzima tipo α,β-hidrolase

4.1.1. Análise in sílico

A enzima B1EPH2 corresponde a uma α,β-epóxido hidrolase anotada do

genoma de Streptomyces sp. A modelagem da enzima pelo I-TASSER possibilitou

a previsão das estruturas secundárias e terciárias, os resíduos que formam o sítio

ativo, além da similaridade da enzima estudada com outras proteínas depositadas

no Banco de Dados de Proteínas (PDB).67

A enzima B1EPH2 tem uma massa molecular de 36,092 kDa. O ponto

isoelétrico (pI) é 5,10 e o índice de instabilidade é 34,13 o que indica que a

Molnar, I., Hill, D. S., Zirkle, R., Hammer, P. E., Gross, F., Buckel, T. G., Jungmann, V., Pachlatko, J. P. and Ligon, J. M. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 6977-6985. 66

Kasanah, N., Rao, K., Yousaf, M., Wedge, D. and Hamann, M. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 1291-1293. 67

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do. Acessada em janeiro 2015.

proteína, de acordo com o algoritmo utilizado pela ferramenta ProtParam e que

considera valores menores a 40 como enzimas estáveis, é teoricamente estável

em um teste hipotético em tubo de ensaio.59

Simulações computacionais realizadas pelo servidor I-TASSER geraram

cinco possíveis estruturas tridimensionais (Figura 2). Os modelos obtidos possuem

um C-score ou pontuação que varia de -5 a 2, sendo que uma maior pontuação

indica uma melhor previsão estrutural. A estrutura secundária prevista para

B1EPH2 é formada por aproximadamente, 40% α-hélices, 9,3% folhas β e 44,6%

de estrutura randômica.

Nos modelos obtidos pelo I-TASSER observou-se a tríade catalítica

formada pelos resíduos de aspartato D114 e D281 e histidina H312. Segundo o

mecanismo proposto para enzimas α,β-EH, os resíduos de tirosina Y163 e Y251

próximos ao sítio catalítico ativam o anel oxirano para que ocorra o ataque

nucleofílico por parte dos resíduos de ácido aspártico (Figura 3). Os cinco modelos

estruturais mais próximos a B1EPH2 correspondem a epóxido hidrolases isoladas

de diferentes organismos, sendo a EH I de Solanum tuberosum 2CJP a que

apresenta maior homologia estrutural. A Tabela 5 apresenta a previsão das cinco

enzimas com maior similaridade estrutural com B1EPH2 e o número de

classificação enzimático (E.C.) para todas elas.

Tabela 5. Proteínas análogas a B1EPH2 depositadas no PDB

Enzimas análogas a B1EPH2 Número PDB Número E.C

EH I de Solanum tuberosum 2CJP 3.3.2.3

EH de Mus musculus 1CQZ 3.3.2.3

EH solúvel de Homo sapiens 1ZD3 3.3.2.10

EH de Mycobacterium tuberculosis 2ZJF 3.3.2.3

EH solúvel de Homo sapiens 1VJ5 3.3.2.10

Modelo 1= 1,22

Modelo 2= -3,86 Modelo 3: -4,59

Modelo 4= -5,00 Modelo 5= -5,00

Figura 2. Modelos tridimensionais obtidos para a enzima B1EPH2 pelo servidor I-

TASSER.

Figura 3. Detalhe do modelo tridimensional da enzima B1EPH2 destacando os

resíduos D114 (em azul), D281 (em verde) e H312 (em rosa) que compõem a

tríade catalítica junto aos resíduos de Y163 e Y251 (em vermelho) que ativam o

anel oxirano.

Apesar de B1EPH2 ser uma enzima de micro-organismo a previsão é que

esta seja análoga à EH de plantas (2CPJ de batata) e de mamíferos (1CQZ de

rato e 1ZD3 de humanos). Esta semelhança é muito interessante e pode resultar

em características na aceitação dos substratos para B1EPH2.

Estudos comparando as estruturas de epóxido hidrolases de micro-

organismo (Aspergillus niger), plantas (Solanarum tuberosum) e mamíferos (Mus

musculus e Homo sapiens sapiens) demonstraram que existe uma correlação

entre o tamanho de dois loops presentes nestas enzimas e a especificidade por

substratos. Nos casos da EH de S. tuberosum estes loops são formados por mais

de 24 resíduos de aminoácidos e contêm uma α-hélice que é determinante na

Y163 Y251

H312 D114

flexibilidade da cavidade do sítio ativo o que é concordante com a preferência

desta enzima por substratos volumosos como os epóxidos de ácidos graxos. Nas

EH de mamíferos pode ser verificado um comportamento similar com dois loops

formados por 23 e 35 resíduos. A ausência destes loops nas estruturas das EH de

micro-organismos como Aspergillus niger estaria de acordo com a maior atividade

destas enzimas frente a epóxidos monosubstituidos.68,69

De acordo com as informações descritas anteriormente, é possível prever

uma flexibilidade na cavidade catalítica de B1EPH2 que daria a esta enzima a

capacidade de aceitar ligantes de grande volume embora seja uma EH bacteriana.

Os epóxidos glicidil fenil éter e 1,2-epoxioctano foram selecionados como

ligantes para realizar modelagens in sílico de interação substrato-enzima. O

modelo tridimensional com o maior C-score obtido pelo I-TASSER para a enzima

B1EPH2 foi utilizado para realizar o docking dos ligantes através do programa

Vina.56 Para o glicidil fenil éter a previsão do distanciamento entre as tirosinas e o

oxigênio do anel oxirano é 1,9 e 3,2 Å para as tirosinas Y163 e Y251

respectivamente (Figura 4). Já o distanciamento entre o resíduo de aspartato

D114, previsto em realizar o ataque nucleofílico, é de 3,2 e 4,7 Å para o carbono

menos e mais substituído do anel oxirano do substrato. Distanciamentos similares

são observados no modelo de interação da enzima com o substrato 1,2-

epoxioctano (Figura 5). Como a distância mais curta para o ataque nucleofílico

sobre o epóxido é com relação ao carbono menos substituído nos dois casos,

possivelmente na reação de hidrólise ocorrerá à formação diol com retenção da

configuração.

Mowbray, S. L., Elfstrom, L. T., Ahlgren, K. M., Andersson, C. E. and Widersten, M. Protein. Sci. 2006, 15, 1628-1637. 69

Barth, S., Fischer, M., Schmid, R. D. and Pleiss, J. Proteins 2004, 55, 846-855.

Figura 4. Modelagem da interação entre o substrato glicidil fenil éter e a enzima

B1EPH2.

Figura 5. Modelagem da interação entre o substrato 1,2-epóxioctano e a enzima

B1EPH2.

Ligante

Y163 Y251

D114 D281

4.1.2. Expressão e purificação de proteínas

Para a expressão dos genes que codificam para as enzimas estudadas foi

realizado um monitoramento de diferentes condições visando a obtenção de cada

uma em quantidade adequada para acessar a atividade. Testaram-se diferentes

temperaturas, velocidade de agitação, tempo de finalização do processo,

quantidade de IPTG adicionado e tipo de frasco Erlenmeyer usado no

procedimento de expressão. Optou-se pela adoção de um mesmo protocolo de

expressão para todas as enzimas estudadas: crescimento a 37 ºC, indução com

IPTG e agitação por 16 horas.

Para a purificação das proteínas, aproveitou-se vantagem da presença da

cauda de histidina na clonagem do gene. Utilizou-se a técnica de cromatografia

por afinidade com coluna contendo uma fase estacionaria constituída de uma

matriz de agarose com uma baixa concentração de íons Ni2+. A cauda de histidina

aumenta a afinidade da proteína pelo Ni2+ fazendo com que aquelas que

possuem a marca de histidina se liguem mais fortemente que as outras proteínas

presentes no lisado. Um aumento gradual na concentração de imidazol de 10 mM

até 500 mM promove a eluição das outras proteínas presentes no lisado que são

pouco retidas na coluna e finalmente da proteína alvo.

A etapa seguinte envolveu a concentração e dessalinização através de

colunas de troca de tampão ou filtros de centrifugas. Na Figura 6 apresenta-se um

gel SDS-PAGE com as frações eluídas utilizando-se tampões com diferentes

concentrações de imidazol na purificação por coluna de afinidade da enzima

B1EPH2.

enzima B1EPH2 através da coluna de afinidade de níquel (coluna 1 (lisado);

colunas 2-13 4 (diferentes frações eluídas com o gradiente de tampões fosfato de

sódio pH 7,4 contendo 20-500 mmol L-1 imidazol); coluna 15 marcador

ColorBurst™ Electrophoresis Marker).

4.1.3. Caracterização de enzimas: espectro de dicroísmo circular

As medições do espectro de dicroísmo circular são de grande importância

para a caracterização de proteínas, uma vez que as informações obtidas permitem

prever suas estruturas secundárias.70 As medições de dicroísmo circular foram

realizadas em cumprimento de ondas entre 260 nm e 195 nm. Realizaram-se

diluições das soluções das enzimas até conseguir uma concentração de trabalho

na qual o sinal obtido no equipamento não estivesse saturado. O programa

CDNN64 gerou as porcentagens de cada tipo de conformação na estrutura

secundária total. O programa CDNN faz a diferenciação entre α-hélice, o tipo de

Kelly, S. M., Jess, T. J. and Price, N. C. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1751, 119-139.

100 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

folhas β (paralelas e antiparalelas) e as estruturas do tipo randômicas dobras β e

estruturas randômicas.

As medições para a enzima B1EPH2 foram realizadas empregando uma

concentração de 125 µg ml-1. A curva da figura 7 apresenta os dados corrigidos de

elipticidade molar θ (graus. cm2 dmol-1) em função do cumprimento de onda para a

concentração indicada de enzima. A correção foi feita subtraindo-se o valor das

medições da solução tampão sem enzima.

190 200 210 220 230 240 250 260

Comprimento de onda (nm)

Figura 7. Medições do espectro DC da enzima B1EPH2. Dados corrigidos de

elipticidade molar θ (graus. cm2 dmol-1) em função do cumprimento de onda para

uma concentração de 125 µg ml-1.

Várias medições do espectro de dicroísmo circular foram realizadas com o

tampão utilizado nos ensaios enzimáticos (50 mM de fosfato de sódio e 150 mM

de cloreto de sódio), entretanto observou-se que as voltagens geradas eram muito

altas, levando a saturação do sinal e podendo resultar em danos ao

fotomultiplicador do equipamento. Novos testes com tampão fosfato de sódio com

concentrações entre 20 e 50 mmol L-1 e com e sem adição de cloreto de sódio

permitiu abranger a faixa do espectro entre 195-260 nm. As medições foram então

realizadas em tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 sem adição de cloreto de

sódio.

Tabela 6. Contribuições participantes na estrutura secundária da enzima B1EPH2

Estrutura secundária B1EPH2

α-hélices 41,0 %

Folhas β paralelas 6,3 %

Folhas β antiparalelas 7,1 %

Dobras β 15,4 %

Randômica 28,7 %

Uma comparação dos dados gerados após deconvolução das medições do

espectro de dicroísmo circular da enzima B1EPH2 e aqueles previstos pelo

servidor I-TASSER evidencia que as diferenças entre as duas previsões não é

maior que 5% para nenhum tipo de conformação da estrutura secundária, sendo

que a maior discrepância é visualizada para folhas β enquanto as α-hélices e

conformações randômicas apresentam valores similares (Tabela 7).

Tabela 7. Comparação dos dados da estrutura secundária de B1EPH2 gerados

com o programa CDNN para as medições de dicroísmo circular e a estrutura

prevista pelo servidor I-TASSER

Tipo de estrutura B1EPH2 medições

B1EPH2 previsão

I-TASSER

α-hélices 41,0 % 40,0 %

Folhas β 13,4 % 9,3 %

Randômica 44,1 % 44,6 %

4.1.4. Determinação da atividade enzimática pelo teste de

adrenalina

Após obtenção da proteína purificada, escolheu-se como método de

caracterização funcional da atividade como epóxido-hidrolase o teste de

adrenalina. O teste de adrenalina para enzimas é um ensaio colorimétrico

baseado na quantificação de produtos da reação que sejam sensíveis ao

periodato, tais como 1,2-dióis. O periodato remanescente é retro-titulado com L-

adrenalina, originando um adrenocromo de cor vermelha facilmente detectável a

490 nm.71 Caso ocorra a hidrólise enzimática, os dióis vicinais resultantes

consomem o periodato. Nesse caso a formação do adrenocromo (adrenalina +

periodato) não é possível, ficando a solução incolor. No caso oposto, quando o

resultado do teste é negativo, ocorre a reação completa entre o periodato e a L-

adrenalina, formando o adrenocromo de coloração vermelha.

Esquema 11. Teste de adrenalina para epóxido hidrolases (esquema adaptado da

referência 71).

Fluxa, V. S., Wahler, D. and Reymond, J. L. Nat. Protoc. 2008, 3, 1270-1277.

O estudo foi realizado para um grupo de 12 substratos de forma a verificar

se B1EPH2 apresenta atividade de EH. Adotando-se epóxidos com diferentes

características estruturais é também possível verificar a abrangência dos

substratos hidrolisados pela enzima. No ensaio utilizou-se como controle positivo o

trans-1,2-ciclohexanodiol. O controle negativo corresponde à reação do periodato

de sódio com L-adrenalina na ausência de enzima e substrato. A hidrólise

espontânea do substrato também foi medida como parte do teste e subtraída dos

dados da hidrólise promovida pela enzima. Para a B1EPH2 foram ensaiadas as

concentrações 1, 2,5, 5, 10, 15 e 20 µg ml-1 de enzima frente aos 12 substratos

selecionados, totalizando 228 medições da atividade enzimática, quantidade de

ensaios que foi possível alcançar devido à realização em formato miniaturizado,

utilizando microplacas de 96 poços. Os dados obtidos foram convertidos para

escala de cinzas com o auxílio de uma ferramenta computacional, com o branco

atribuído a 0% de atividade e preto a 100% de atividade. A escala de cinzas

representa o percentual de redução nos valores de absorbância a 490 nm.

A enzima B1EPH2 apresentou atividade de EH a partir da concentração 2,5

µg ml-1. Na escala de cinzas foi observado que um aumento na concentração da

enzima promove o aumento diretamente proporcional na atividade frente a todos

os substratos ensaiados (Figura 8).

Figura 8. Foto da placa com o teste de adrenalina para a enzima B1EPH2

(superior) e escala de cinza correspondente (inferior).

Os resultados obtidos após a realização do teste de adrenalina mostram

que a enzima B1EPH2 promove a hidrólise de todos os substratos que foram

testados. Porém, apresenta maior aceitação por substratos específicos. A enzima

apresenta maior aceitação pelos butil glicidil éter e glicidil fenil éter onde a

hidrólise é promovida de forma mais eficiente. A preferência da enzima B1EPH2

pode ser explicada em função do impedimento estéreo dos epóxidos para os quais

apresenta menor aceitação, o que possivelmente dificulta um posicionamento

efetivo na cavidade do sítio ativo. Este fato estaria de acordo também com a

preferência prevista da enzima a epóxidos terminais para os quais a interação com

os resíduos catalíticos aparentemente é mais eficiente.

Controle positivo Enzima conc. 5 µg ml-¹ Enzima conc. 2,5 µg ml-¹ Hidrólise espontânea Controle negativo

4.1.5. Medida da influência do pH e temperatura na atividade

enzimática

A influência do pH na atividade enzimática para a enzima B1EPH2 foi

avaliada pelo teste de adrenalina usando como substrato o epóxido glicidil fenil

éter. O pH das soluções tampão variaram entre 5,0 e 9,0 e as temperaturas entre

25 e 60 °C. Os valores foram expressos em função da porcentagem da atividade

relativa. As curvas representando a atividade relativa da enzima a diferentes pH

em função da temperatura estão apresentadas nas Figuras 9 e 10. Estas curvas

foram realizadas seguindo o protocolo de Fluxa et al71 introduzindo-se uma

variável adicional: utilizou-se acetonitrila (ACN) e também dimetilsulfóxido (DMSO)

no preparo das soluções de epóxido para efeito de comparação da influência do

solvente.

e de temperatura em DMSO.

5 6 7 8 9

Atividade Relativa de B1EPH2 em DMSO

25 °C

30 °C

37 °C

45 °C

50 °C

55 °C

60 °C

e temperatura em ACN.

Quando usado DMSO como solvente (Figura 9), o melhor desempenho

catalítico para B1EPH2 foi alcançado a uma temperatura de 45 °C e pH 6,0. Em

todas as temperaturas testadas a atividade relativa de B1EPH2 é maior em pH 6,0

sendo que para as temperaturas de 25 a 45 °C neste pH a atividade é superior a

70%. Para pH superiores a 6 observa-se uma diminuição da atividade até valores

próximos a 30%. Uma análise análoga para os dados das atividades relativas

quando ACN foi utilizada como solvente (Figura 10) permite observar uma

tendência muito similar de atividade em todas as temperaturas e pH testados.

Pode-se verificar uma maior atividade a pH 5 que mantém-se sem muita variação

até pH 9,0, onde é visualizado novamente um leve aumento. A maior atividade

para a enzima em ACN foi observada à temperatura de 25 °C não sendo possível

atribuir uma preferência por algum pH devido à pouca mudança nas porcentagens

de atividade enzimática.

5 6 7 8 9

Atividade Relativa de B1EPH2 em ACN

25 °C

30 °C

37 °C

45 °C

50 °C

55 °C

60 °C

Uma comparação entre a atividade enzimática a 30 °C quando usados os

solventes ACN e DMSO pode ser visualizada na Figura 11. Na curva é evidente

que a enzima promove de forma mais efetiva a hidrólise quando utiliza-se DMSO

como solvente, alcançando um desempenho relativo entre o 70-100% para os pHs

5, 6 e 7. Já quando ACN é utilizada como solvente observa-se uma atividade

modesta alcançando um máximo de 30% no pH 9. Estes dados com poucas

variações para as medições realizadas em ACN sugerem que os efeitos do pH e a

temperatura nesse solvente estão em segundo plano e o fator dominante na perda

da atividade enzimática seria o uso de ACN como solvente inibindo a catálise

promovida por B1EPH2.

Figura 11. Comparação das atividades relativas (%) da enzima B1EPH2 em ACN

e DMSO.

Uma curva apresentando as variações da atividade relativa para B1EPH2 a

diferentes temperaturas (Figura 12) permite visualizar que a enzima apresenta um

5 6 7 8 9

Atividade Relativa de B1EPH2 em ACN e DMSO a 30 °C

ótimo de atividade a 45 °C. Em temperaturas superiores a 50 °C a atividade da

enzima diminui gradualmente, atingindo 50% de atividade relativa nessa

temperatura até valores próximos a 0% a temperaturas de 55 e 60 °C. Não foi

possível testar temperaturas superiores devido às limitantes próprias do protocolo

utilizado, que incluíam entre outros fatores a impossibilidade de incubar de forma

adequada, pelos 30 minutos requeridos para o teste, as placas em temperaturas

superiores a 60 °C.

A termoestabilidade é uma medida da atividade residual da enzima quando

submetida a temperaturas elevadas. T50 corresponde à temperatura requerida

para reduzir em 50% a atividade enzimática inicial em um determinado período de

tempo, sendo este valor próximo à temperatura de desnaturação da enzima.72

Pelo gráfico é possível determinar que o é 50 °C.

Figura 12. Atividade relativa (%) da enzima B1EPH2 em DMSO nas diferentes

temperaturas testadas.

Reetz, M. T., Carballeira, J. D. and Vogel, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 7745-7751.

25 30 35 40 45 50 55 60

temperatura (°C)

Termoestabilidade de B1EPH2

4.2. Enzimas B

4.2.1. Analises in sílico

As enzimas B NanI, TsnB, TmnB, LasB, SalBI, SalBII, SalBIII e NigBI

anotadas dos clusters de genes que codificam para a biossíntese dos poliéteres

ionóforos nanchangmicina, tetronasina, tetronomicina, lasalocida, salinomicina e

nigericina de Streptomyces foram modeladas in sílico utilizando-se as mesmas

ferramentas empregadas para a análise de B1EPH2, pelo servidor I-TASSER

obtive-se a previsão das estruturas secundárias e terciárias, os resíduos que

formam o sítio ativo e as enzimas análogas depositadas no Banco de Dados de

Proteínas (PDB). A ferramenta ProtParam foi utilizada para o calculo dos

parâmetros ponto isoelétrico e massa das proteínas, uma compilação destes

dados obtidos pode ser observada na Tabela 8. Nas Figuras 13, 14 e 15 são

apresentadas as estruturas tridimensionais com maior C-score para cada uma das

enzimas estudadas obtidas pelo I-TASSER.

Tabela 8. Parâmetros de ponto isoelétrico (pI), coeficiente de instabilidade e

massa molecular das enzimas B calculadas com a ferramenta ProtParam do

ExPASy

Enzima pI Massa da proteína

(kDa) Índice de estabilidade

NigBI 4,82 15,793 44,49

Instável

TmnB 6,05 15,348 29,52

Estável

TsnB 5,15 14,816 27,58

Estável

LasB 5,53 30,249 39,07

Estável

NanI 5,15 34,405 36,15

Estável

SalBI 5,75 16,641 22,62

Estável

SalBII 4,93 16,126 25,18

Estável

SalBIII 4,66 14,205 25,69

Estável

NigBI, b) TsnB e c) TmnB pelo I-TASSER.

Figura 14. Modelos tridimensionais com maior C-score obtidos para a) LasB e b)

NanI destacando as α-hélices (em azul), as folhas β (em vermelho) e a estrutura

randômica (em roxo).

SalBI, b) SalBII e c) SalBIII pelo I-TASSER.

Apesar do servidor I-TASSER classificar várias das enzimas B como

análogas a delta cetoesteróide isomerases (Tabela 9), é sabido de estudos

realizados anteriormente que estas enzimas apresentam alta correlação estrutural

á LEH.52 Esta previsão é apresentada na lista do I-TASSER, que indica homologia

de TmnB à LEH de Mycobacterium tuberculosis.

Tabela 9. Previsão das proteínas análogas a TmnB (I-TASSER)

A partir do alinhamento das enzimas B com a utilização do programa

ClustalW é possível identificar vários resíduos de aminoácidos em posições

conservadas que podem fazer parte do sítio ativo (Figura 16). Entre estes resíduos

destacam-se o D38 e E65 já descritos na literatura.48 Como participantes na

atividade catalítica de outras enzimas B como a MonBI e MonBII participantes da

biossíntese da monensina.

Enzimas análogas a TmnB Número

PDB Número E.C

Delta cetoesteróide isomerase de

Pseudomonas testosteroni 8CHO 5.3.3.1

Comamonas testosteroni 1BUQ 5.3.3.1

Pseudomonas putida 1E3V 5.3.3.1

Proteína quinase dependente de

calcio/calmodulin de Homo sapiens 1FWX 2.7.11.17

Epóxido-hidrolase análoga a LEH de

Mycobacterium tuberculosis 2BNG 3.3.2.8

Figura 16. Alinhamento das enzimas B que mostram vários resíduos conservados

que podem contribuir para a atividade enzimática.

As enzimas de tipo LEH possuem tamanho aproximado de 17 kDa. Ao

realizar uma superposição das enzimas NigBI e LEH de Rhodococcus erytropolis

observa-se que estas apresentam grande semelhança estrutural (Figura 17). No

entanto, a enzima LasB e NanI, ainda sendo identificadas como análogas a LEH

tem o tamanho de aproximadamente 30 kDa. Nas estruturas tridimensionais

destas duas enzimas observa-se que as mesmas parecem heterodímeros

formados pela união de duas subunidades de tamanhos menores. Uma

superposição dos modelos das estruturas terciárias das enzimas NanI e LasB à

enzima NigBI como apresentado na Figura 18 e 19, permite observar como a

enzima NigBI de 15 kDa (em rosa) se sobrepõe a metade da estrutura da enzima

LasB e NanI de 30 kDa (em azul e verde respectivamente). LasB e Nan I

apresentam uma estrutura possivelmente formada por duas unidades de enzimas

B análogas a LEH.

NigBI (rosa) e LEH 1NWW (verde) gerados pelo servidor I-TASSER.

NigBI (rosa) e LasB (azul) gerados pelo servidor I-TASSER.

NigBI (rosa) e NanI (verde) gerados pelo servidor I-TASSER.

4.2.2. Expressão e purificação das enzimas B

Os genes que codificam para as enzimas B foram clonados e os

plasmídeos resultantes transformados em E. coli para expressão. As clonagens

incorporam marcadores hexa-His-Tag no C- ou N-terminal. Para as enzimas B foi

necessário otimizar os procedimentos nas etapas de expressão e purificação das

enzimas, testando diversas condições como temperaturas, velocidade de

agitação, tempo de finalização do processo, quantidade de IPTG adicionado e tipo

de frasco Erlenmeyer usado no procedimento de expressão. Finalmente, adotou-

se o mesmo protocolo de expressão e purificação seguido para a enzima

B1EPH2: crescimento a 37 ºC, indução com IPTG e agitação por 16 horas. Para a

purificação das proteínas, utilizaram-se colunas contendo uma fase estacionaria

com uma baixa concentração de íons Ni2+ e soluções com diferente concentração

de imidazol para promover a eluição das proteínas alvo, seguida da concentração

e dessalinização usando colunas de troca de tampão ou filtros de centrifugas. As

Figuras 20, 21, 22 e 23 correspondem aos géis SDS-PAGE realizados nas

diferentes etapas de purificação dessas enzimas.

enzima NigBI (tamanho 15,8 kDa) por coluna de afinidade de níquel (coluna 1

(lisado); colunas 2-8 (frações eluídas com tampão 20 mmol L-1 fosfato de sódio, e

gradiente de 20-500 mmol L-1 imidazol, pH 7,4); colunas 9-14 (frações

concentradas e dessalinizadas com tampão 50 mmol L-1 fosfato de sódio, 150 mM

cloreto de sódio, pH 7); coluna 15 marcador Precision Plus Protein™ Dual Color

Standards (BIO-RAD).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Figura 21. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a NanI

(colunas 1, 2 e 3; tamanho 34,4 kDa). NigBI (colunas 4, 5 e 6; tamanho 15,8 kDa;

marcador Precision Plus Protein™ Dual Color Standards da BIO-RAD (coluna 7).

B1EPH2 (colunas 8, 9, 10 e 11; tamanho 37,0 kDa); TsnB (colunas 12, 13 e 14;

tamanho 14,8 kDa). Todas as enzimas foram purificada parcialmente por coluna

de afinidade e concentradas com coluna de dessalinização.

Figura 22. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a TmnB

(Colunas 1 e 2: lisado, Colunas 4, 5, 6, 7 e 8 purificação parcial por coluna de

afinidade e Colunas 9, 10, 11, 12 e 13 frações eluídas no processo de

concentração da proteína com coluna de dessalinização). Marcador Precision Plus

Protein™ Dual Color Standards (BIO-RAD).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 23. Gel SDS-PAGE mostrando as bandas correspondentes a SalBI

(colunas 1 e 2: lisado, colunas 3 e 4 proteína purificada coluna de afinidade),

SalBIII (coluna 5: purificação parcial por coluna de afinidade) e SalBII (coluna 6:

lisado, colunas 7, 8 e 9: purificação parcial por coluna de afinidade) e B1EPH2

(colunas 10, 11, 12, 13 e 14 frações eluídas a diferentes concentrações de

imidazol pela coluna de afinidade). Marcador Novex® Sharp Pre-Stained Protein

Standard (Invitrogen).

As enzimas SalBI e SalBII foram previstas como estáveis pelos dados de

análise “in silico”. Entretanto, apesar de ser possível afirmar a expressão dessas

enzimas pelo gel de SDS-PAGE, observou-se a degradação de ambas as enzimas

48 horas após a purificação. De acordo com as simulações estruturais feitas pelo

servidor I-TASSER, supõe-se que estas duas enzimas possam fazer parte de um

heterodímero não ligado, similar a LasB, o que conferiria estabilidade a ambas

estruturas. Devido à instabilidade de SalBI e SalBII não foi possível dar

continuidade às etapas de caracterização funcional dessas enzimas como epóxido

hidrolases. A etapas posteriores do estudo envolvendo experimentos de

caracterização da atividade como EH das enzimas B foram conduzidas para as

enzimas SalBIII, NigBI, TsnB, TmnB, LasB e NanI.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

4.2.3. Espectro de dicroísmo circular (DC)

Realizaram-se medições de dicroísmo circular para as enzimas NigBI e

LasB. Foram seguidas as mesmas condições e soluções de trabalho

anteriormente descritas para as medições do DC da enzima B1EPH2. Mediu-se a

enzima NigBI em uma concentração de 300 µg ml-1 entre as faixas 200 nm a 260

nm e LasB a 250 µg ml-1 na faixa 195 nm a 260 nm. Nas Figuras 24 e 25

observam-se as curvas que relacionam a elipticidade molar θ (graus. cm2. dmol-1)

ao cumprimento de onda, obtidas com os dados adquiridos. Na Tabela 10 estão

apresentadas as composições da estrutura secundária para cada enzima,

calculadas com o programa CDNN.

190 200 210 220 230 240 250 260

-25000

-20000

-15000

-10000

Figura 24. Medições do espectro DC para a enzima NigBI. Dados corrigidos de

a 260 nm) para uma concentração de 300 µg ml-1.

190 200 210 220 230 240 250 260

Figura 25. Medições do espectro DC para a enzima LasB. Dados corrigidos de

a 260 nm) para uma concentração de 250 µg ml-1 da enzima.

Tabela 10. Contribuições participantes nas estruturas secundárias das enzimas

NigBI e LasB*

*Dados gerados após a deconvolução das medições do espectro de DC.

Os dados para comparação entre as contribuições participantes da

estrutura secundária obtidos por DC com aqueles gerados pelo I-TASSER

apresentam-se na Tabela 11. Para as duas enzimas observa-se precisão entre as

NigBI LasB

α hélices 31,0 % 25,4 %

Folhas β paralelas 8,9 % 9,9 %

Folhas β antiparalelas 9,3 % 11,8 %

Dobras β 17,3 % 18,1 %

Randômica 34,7 % 39,9 %

percentagens de α-hélices, enquanto para as folhas β e estruturas randômicas

tem-se uma diferenciação maior na comparação destes valores. Em geral, é

recomendado que as aquisições de DC para previsão da estrutura secundária de

enzimas sejam realizadas entre os 180 nm e 260 nm.73 As estruturas do tipo α-

hélices podem ser reconhecidas usando como limite inferior de medição qualquer

cumprimento de onda entre 180 e 210 nm. Já as folhas β, precisam de

cumprimentos de ondas menores que 190 ou 185 nm para serem determinadas

com exatidão. Este fator pode explicar as diferenças observadas nos dados

comparativos das folhas β das estruturas secundárias obtidas pelo CDNN e a

previsão das mesmas pelo servidor I-TASSER.

Essa limitação também origina outro erro perceptível na deconvolução dos

dados de medições feitas em cumprimentos de ondas acima de 185 nm: nesse

caso observa-se uma somatória superior a 100% para as percentagens de cada

tipo de estrutura. 73

Tabela 11. Comparação da estrutura secundária gerada com medições do

espectro DC e a estrutura prevista pelo servidor I-TASSER

Tipo de

estrutura

medições

previsão

I-TASSER

medições

previsão

I-TASSER

α-hélices 32,9 % 30,3 % 25,4 % 28,0 %,

Folhas β 17,1 % 28,3 % 21,7 % 30,1 %

Randômica 50,3 % 41,4 % 58,0 % 41,8 %

4.2.4. Determinação da atividade enzimática pelo teste de

adrenalina

O ensaio de adrenalina foi realizado para as enzimas B seguindo o mesmo

protocolo e tratamento de dados já apresentados para a enzima B1EPH2. Foi

http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn.

calculada a média das duplicatas dos dados de absorbância e subtraído o valor da

hidrólise espontânea para cada epóxido testado. Com auxílio de uma ferramenta

computacional74 gerou-se as escalas de cinzas.

Este teste foi realizado em formato miniaturizado e para cada enzima

estudada foram ensaiadas as concentrações 1, 2,5, 5, 10, 15 e 20 µg ml-1 para os

12 substratos selecionados, totalizando 228 medições por enzima e 1824 ensaios

para o conjunto das enzimas B.

Pode-se observar que todas as enzimas testadas possuem atividade de

EH, promovendo a hidrólise dos substratos aos respectivos dióis vicinais. As

enzimas LasB, TsnB e NigBI apresentaram atividade a partir de uma concentração

de 2,5 µg ml-1 enquanto a enzima TmnB e NanI apresentam atividade a partir de

concentrações de 5,0 µg ml-1.

http://matplotlib.org/

Controle positivo

Enzima conc. 5 µg ml-¹

Enzima conc. 2,5 µg ml-¹

Hidrólise espontânea

Controle negativo

Controle positivo

Controle negativo

Controle positivo

Controle negativo

Controle positivo

Controle negativo

SalBIII

Figura 26. Escalas de cinza correspondente as enzimas TsnB, TmnB, LasB, NanI,

NigBI e SalBIII.

As enzimas ensaiadas promovem a hidrólise de todos os epóxidos de

acordo com os resultados do teste de adrenalina. LasB apresenta uma preferência

maior pelo cis-2,3-epoxibutano e pelo (+)-trans-1,2-limoneno epóxido. NanI e

NigBI apresentam preferências pelo 1,2-epoxioctano. Porém, a tendência geral de

preferências dos substratos das enzimas não pode ser determinada só com os

dados obtidos neste ensaio uma vez que não observamos um comportamento

constante em diferentes leituras.

Controle positivo

Controle negativo

Controle positivo

Controle negativo

O teste de adrenalina para SalBIII foi negativo para todos os substratos em

diferentes concentrações de enzimas, mostrando que apesar da similaridade

estrutural as outras enzimas B, SalBIII deve apresentar atividade enzimática

distinta das EH. O mecanismo de interação da enzima SalBIII com o substrato

natural (intermediário da biossíntese da salinomicina) e análogo deve ser

estudado com mais detalhes com o objetivo de classificar o tipo de atividade

enzimática que esta apresenta.

Para as outras enzimas B os resultados observados mostram que estas

possuem elevada aceitação por substratos, incluindo o limoneno-1,2-epóxido,

substrato natural da enzima LEH de R. erythropolis. Esse comportamento suporta

ainda mais a analogia entre as estruturas e a função enzimática. A baixa

especificidade pelos epóxidos aceitos pelas enzimas B é um fator interessante

para aplicações futuras destas enzimas já que supõe-se uma vantagem com

relação à enzima 1NWW, a qual apresenta um mecanismo enantioconvergente,

mas uma limitada aceitação por substratos.

4.2.5. Estruturas tridimensionais das enzimas B

Em colaboração com o Prof. Marcio Dias (ICB-USP) foi possível a obtenção

de dados estruturais por difração de raios-X de várias das enzimas B avaliadas

com relação à função enzimática.

Para as enzimas LasB e NanI é possível observar um par de domínios

homólogos, mas não idênticos. Pode-se observar que as enzimas possuem o

dobro do tamanho da maioria das enzimas B conhecidas. Essas estruturas são

monoméricas e esses resultados são consistentes com a hipótese de que elas

representam uma fusão de dois monômeros de enzimas análogas a LEH. É

possível observar que essas enzimas adotam uma estrutura do tipo barril formado

por seis folhas beta, as quais se dobram em direção a um trio de α-hélices

formando uma cavidade hidrofóbica prevista em conter o sítio ativo. NanI é

homóloga a LasB, entretanto observa-se pelos testes funcionais que é uma

enzima menos ativa. Especula-se que um dos domínios de NanI seja inativo.

Na Figura 27 e 28 estão representadas as estruturas tridimensionais para

LasB e NanI. No domínio N-terminal de LasB é possível identificar vários resíduos

polares como D38, Y14 e outros resíduos adjacentes como E65, R54 e W121, os

quais podem estar envolvidos na catálise. No domínio C-terminal foram também

identificados vários resíduos polares (D170, H186, H146, E195, Y251 e W270) na

cavidade hidrofóbica.

Figura 27. Estrutura tridimensional obtida por difração de raios-X da enzima LasB.

A projeção indica os resíduos previstos em fazer parte do sítio ativo. Imagem

cedida pelo Prof. Marcio Dias.

Figura 28. Estrutura tridimensional da enzima NanI obtida por difração de raios-X,

mostrando a cavidade prevista em conter o sítio ativo nos domínios da enzima

(domínio N-terminal em verde e domínio C-terminal em rosa). Imagem cedida pelo

Prof. Marcio Dias.

Outra característica interessante é a alta homologia entre o domínio N-

terminal da LasB com o domínio C-terminal de NanI e o domínio C-terminal de

LasB com o domínio N-terminal de NanI que evidencia uma permuta estrutural dos

domínios C- e N-terminais entre as duas enzimas (Figura 29).

Figura 29. As enzimas LasB (esquerda) e NanI (direita) apresentam uma possível

permutação estrutural entre seus domínios. Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias.

As enzimas TsnB e TmnB são homodiméricas e idênticas estruturalmente.

Apesar da elevada similaridade estrutural é possível observar que a cavidade do

sítio ativo dessas enzimas possuem orientações opostas (Figura 30). Na cavidade

do sítio ativo é possível observar a sobreposição dos resíduos correspondentes a

Asp38, His54, Phe30, Tyr14 e Glu65. Estes resíduos incluem o duo D38/E65

também presente em um dos sítios ativos de LasB e identificada como participante

da atividade catalítica das enzimas MonBI e MonBII (Figura 31). A diferença no

posicionamento das cavidades que direcionam para o sítio ativo das duas ciclases

constitui um fator estrutural bastante interessante que pode ajudar a explicar a

estereoquímica complementar observada nos éteres cíclicos das estruturas da

tetronacina e tetronomicina (Esquema12).

Figura 30. Estruturas das enzimas TsnB (A) e TmnB (B). Apesar da elevada

similaridade estrutural dessas enzimas, as cavidades de sítio ativo apontam para

direções opostas. Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias.

Figura 31. Sobreposição dos resíduos polares do sítio ativo de TsnB e TmnB.

Imagem cedida pelo Prof. Marcio Dias.

A BA B

Esquema 12. O processo de ciclização exo-tet leva a formação do anel do tipo

furano nos compostos tetronasina (A) e tetronomicina (B). Desconsiderando o anel

tetronato, todos os centros estereogênicos nos produtos naturais são

enantioméricos.

5. Conclusões

As análises in sílico facilitadas pelo servidor I-TASSER permitiram a

obtenção de modelos para a estrutura secundária e terciária de B1EPH2 em

comparação a enzimas análogas depositadas no PDB. Observou-se que apesar

de ser uma EH microbiana, a mesma foi classificada como análoga às EH solúveis

de mamíferos, característica que facilita justificar a aceitação por substratos

volumosos por esta enzima.

As enzimas B também tiveram as suas estruturas modeladas pelo I-

TASSER. O alinhamento das sequencias de aminoácidos das enzimas B com a

LEH 1NWW permitiu determinar que existem regiões altamente conservadas

nestas estruturas, destacando-se alguns resíduos de aminoácidos como D38 e

E65 identificados na cavidade catalítica de outras enzimas B como MonBI e

MonBII.

A expressão dos genes que codificam para as proteínas B1EPH2 o tipo EH

α,β-hidrolase e NigBI, TsnB, TmnB, NanI, LasB, SalBI, SalBII e SalBIII do tipo LEH

foi otimizada testando diferentes condições de crescimento e/ou indução e

finalmente adotado um protocolo para expressão que permitiu obter todas as

enzimas com sucesso em diferentes linhagens de E.coli.

O processo de purificação foi realizado efetivamente para todas as enzimas

com a técnica de cromatografia de afinidade, usando uma coluna de afinidade

com níquel e tampões de fosfato de sódio/cloreto de sódio com concentrações

variáveis de imidazol; este processo foi acompanhado com géis SDS-PAGE que

permitiram observar a presença das proteínas alvo dos tamanhos esperados. As

enzimas SalBI e SalBII ainda sendo observadas nos géis SDS-PAGE degradaram

após poucas horas não sendo possível realizar a caracterização da atividade

enzimática.

Foi realizado o teste de adrenalina para medir a atividade como EH das

enzimas a diferentes concentrações e com um grupo de 12 substratos. A enzima

B1EPH2 foi capaz de hidrolizar todos os substratos testados e apresentou uma

leve preferência pelos epóxidos terminais, possivelmente devido à interação

substrato-ligante mais efetiva em função da diminuição do impedimento estéreo na

cavidade do sítio ativo.

Medições da estabilidade de B1EPH2 em função do pH e a temperatura

revelaram que o máximo de atividade catalítica para esta enzima é alcançado a

pH 6 e temperatura de 45 °C, sendo que para temperaturas entre 25 e 37 °C a

atividade observada é similar. A partir 50 °C a atividade catalítica diminui. A

determinada foi 50 °C. Não foi possível realizar medições a temperaturas mais

altas devido a limitações no processo de incubação das placas utilizadas na

realização do teste

As enzimas LasB, NigBI, NanI, TsnB e TmnB apresentaram atividade de EH

promovendo a hidrólise dos substratos ao respectivos dióis vicinais. Enquanto

LEH tem uma preferência por substratos bastante limitada, as enzimas B

mostraram uma ampla aceitação substratos. A enzima SalBIII não apresentou

atividade como EH em nenhuma concentração, levando a considerar que o

mecanismo de atuação para esta enzima deve ser diferente, mesmo sendo

inicialmente identificada como uma hidrolase-ciclase.

As medições de espectro de dicroísmo circular para LasB, NigBI e B1EPH2

permitiram estimar a estrutura secundária das enzimas estudadas. Para as

estruturas α-hélices obtiveram-se valores semelhantes aos das análises in silico.

No caso das estruturas de tipo folhas β e randômicas a previsão e as

porcentagens calculadas diferem. Provavelmente essa diferença seja uma

consequência direta da limitação experimental para realizar medições em

cumprimentos de onda abaixo de 195 nm.

6. Anexos

CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO … · encontradas em todos os tipos de organismos ......

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Transcript of CARACTERIZAÇÃO DE EPÓXIDO HIDROLASES DO … · encontradas em todos os tipos de organismos ......

Ric-8B, um provável GEF para Gaolf, promove expressão funcional ...

INFLUÊNCIA DA OBESIDADE SOBRE A EXPRESSÃO …portais4.ufes.br/posgrad/teses/tese_7855_Disserta%E7%E3o%20Artur... · anormalidades cardíacas, entre elas, alterações hemodinâmicas,

Sistemas de Comunicações Móveis - fenix.tecnico.ulisboa.pt · hR = 1.8, 3.0 m, e hE = 50, 100, 200 m. Comente a aplicação desta expressão para o Comente a aplicação desta

UNIVERSIDADE PAULISTA EXPRESSÃO ASTROCITÁRIA ... - … · Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista – UNIP, para a obtenção do título

DANIELA MORAES DE OLIVEIRA - teses.usp.br · DANIELA MORAES DE OLIVEIRA Análise de expressão da distrofina, miostatina, tgf-β e nf-kappa β, durante a fase embrionária e fetal

Controle da Expressão Gênica - uenf.bruenf.br/Uenf/Downloads/LBT_1828_1191948774.pdf · ovo não fertilizado Figure 7-2 part 1 of 3. núcleo injetado dentro do ovo destruição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE … · 2007-02-14 · universidade de sÃo paulo faculdade de medicina de ribeirÃo preto departamento de patologia expressÃo

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE COX-2, EMMPRIN, HIF-1α …€¦ · No tecido conjuntivo, EMMPRIN e HIF-1α foram intensamente positivos para maioria dos casos analisados enquanto

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2. Germinação e Dormência de Sementes · entanto, parece que as giberelinas são menos importantes (não para outras espécies fotoblásticas positivas). O principal sinal de expressão

PRODUCCION DE LA PENICILINA A NIVEL INDUSTRIALs47a2284b2bbc58b0.jimcontent.com/.../name/...a-nivel-industrial.pdf · Los organismos fúngicos sintetizan una amplia gama de metabolitos

RAFAELA RODRIGUES MARTINS · 2019. 6. 29. · mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (A e B - Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de ki-67