EXPRESSÃO DO INTERFERON-γ EM BIÓPSIAS GENGIVAIS … · O grupo teste foi composto por 22...

13

Braz J Periodontol - June 2015 - volume 25 - issue 02

An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393

EXPRESSÃO DO INTERFERON-γ EM BIÓPSIAS GENGIVAIS DE PACIENTES COM PERIODONTITE CRÔNICA SEVERAExpression of interferon-γ in gingival biopsies from patients with severe chronic periodontitis

Tatiane Flôr Coelho de Souza Breves Beiler1, Ricardo Guimarães Fischer2, Fábio Ramôa Pires3, Karina Schittine Bezerra Lomba4, Carlos Marcelo da Silva Figueredo5

1 Mestre em Periodontia, Faculdade de Odontologia, UERJ2 Professor titular de Periodontia, Faculdade de Odontologia, UERJ3 Professor adjunto de Patologia Bucal, Faculdade de Odontologia, UERJ4 Doutora em Periodontia, Faculdade de Odontologia, UERJ5 Professor associado de Periodontia, Faculdade de Odontologia, UERJ

Recebimento: 20/02/15 - Correção: 07/04/15 - Aceite: 10/05/15

RESUMO

O objetivo desse estudo foi analisar a expressão do interferon gama (INF-γ) em biópsias gengivais de sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa, e correlacionar a expressão do INF-γ no fluido gengival. Foram coletadas biópsias de 22 sítios profundos, 18 sítios rasos e 14 sítios controles. O fluido gengival foi coletado de 12 sítios profundos e 8 sítios rasos. Profundidade de bolsa à sondagem (PB); nível de inserção clínica (NIC); índice de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival (ISG) foram avaliados. As análises morfológica e imuno-histoquímica dos tecidos removidos foram realizadas. A intensidade da marcação do INF-γ nos tecidos foi avaliada semiquantitativamente. Houve uma tendência a um padrão de marcação similar nos sítios rasos e profundos, com predomínio de marcação fraca nos sítios profundos. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os três grupos. Não houve correlação significante (Spearman) com a expressão do INF-γ nos tecidos epiteliais e conjuntivos com os dados clínicos e o fluido gengival. Concluímos que não foi possível observar diferenças na expressão do INF-γ em biópsias gengivais nos sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite quando comparados à indivíduos saudáveis, o que pode ser atribuído ao caráter bifásico do INF-γ.

UNITERMOS: Interferon gama, Periodontite, Líquido do Sulco Gengival, Imuno-Histoquímica, Biópsia. R Periodontia 2015; 25: 13-21.

INTRODUÇÃO

A doença periodontal é o resultado de uma resposta inflamatória crônica ao biofilme bacteriano dentário e sua progressão está associada a uma combinação de fatores, como a presença de bactérias patogênicas, aspectos relacionados à resposta imunológica do hospedeiro e fatores ambientais (Page et al., 1997). Os processos inflamatórios e imunológicos são desencadeados frente à presença, invasão e disseminação de microrganismos e seus produtos. Em alguns casos, essas reações de defesa do hospedeiro podem ser nocivas, já que são passíveis de danificar as células e estruturas vizinhas do tecido conjuntivo. Esse mecanismo imune, portanto, mostra-se paradoxal, já que ao mesmo tempo em que luta contra a invasão de patógenos, desencadeia dano tecidual ao hospedeiro (Teng, 2003).

Estas respostas envolvem a geração de alguns mediadores inflamatórios como: citocinas e prostaglandinas; fatores de crescimento; elaboração de enzimas líticas; recrutamento de células inflamatórias e ativação de osteoclastos, causando a destruição periodontal (Assuma et al., 1998). Dentre as citocinas pró-inflamatórias envolvidas nesse processo, destaca-se o interferon (INF), sintetizado por linfócitos T, macrófagos, fibroblastos e outros tipos de células, após estimulação com vírus, antígenos, mitógenos, ácido desoxirribonucléico (DNA) de dupla fita ou lectinas. O INF foi inicialmente conhecido por sua capacidade de inibir a replicação viral (Isaacs & Lindenmann, 1957) e, posteriormente, as investigações mais aprofundadas sobre essa citocina mostraram que o INF é capaz de aumentar a capacidade dos macrófagos para destruir células tumorais, vírus e bactérias, estando envolvido na regulação do

Revista Perio Junho 2015 - 3ª REV - 26-06-15.indd 13 26/06/2015 13:33:26

Braz J Periodontol - June 2015 - volume 25 - issue 02 - 25(2):13-21

14 An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393

crescimento celular e no efeito imunomodulatório (Goodbourn et al., 2000; Hervas-Stubbs et al., 2011).

Apesar de ser essencialmente pró-inflamatório por natureza, estudos demonstram que o interferon gama (INF-γ) é uma citocina imunomodulatória bidirecional por inibir diretamente a osteoclastogênese mediada pelo ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL), in vitro e em estudos com animais, possivelmente através de um transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) (De Klerck et al., 2004). Tal fato nos revela um papel bifásico de destruição e proteção dessa citocina no que se refere ao metabolismo ósseo, demonstrando a controvérsia na sua função regulatória na doença periodontal (Gao et al., 2007).

Diversos estudos com biópsias gengivais em pacientes com periodontite e pacientes saudáveis vêm mostrando maior expressão de mediadores inflamatórios específicos nos sítios com periodontite. O INF-γ foi considerado com expressão aumentada em sítios comprometidos (Fujihashi et al., 1996), sendo também observado aumento desses marcadores no fluido gengival de sítios doentes (Dutzan et al., 2009; Zhang et al., 2010). No entanto, outros estudos mostram níveis mais baixos de INF-γ em sítios com periodontite (Rescala et al., 2010; Rosalem et al., 2011; de Lima Oliveira et al., 2012), tornando plausível a possibilidade de haver diferenças entre as expressões de desses marcadores no tecido e no meio externo, determinando possíveis diferenças nos seus mecanismos de ação. Assim, torna-se importante a avaliação da presença dessa citocina no tecido gengival. O objetivo desse estudo foi analisar a expressão do INF-γ em biópsias gengivais de sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa. O objetivo secundário foi correlacionar a expressão do INF-γ no fluido gengival com os sítios onde foram coletadas as biópsias gengivais.

MATERIAIS E MÉTODOS

Caracterização da amostraA amostra foi composta por 54 espécimes de tecidos

gengivais coletados de 36 pacientes, adolescentes e adultos. O grupo teste foi composto por 22 pacientes portadores de periodontite crônica severa (18 pacientes com periodontite crônica severa generalizada e 04 pacientes com periodontite crônica severa localizada) de acordo com a American Academy of Periodontology (AAP,1999 ) e o grupo controle foi composto por 14 pacientes saudáveis. Os pacientes foram atendidos na clínica de pós-graduação da Faculdade de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) e na clínica de especialização de Periodontia da Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-RJ). Dessa amostra, foram

coletadas 22 biópsias gengivais de sítios profundos em pacientes com periodontite crônica severa (PB ≥ 6 mm e NIC ≥ 5 mm), 18 biópsias de sítios rasos nos pacientes com periodontite crônica severa (PB ≤ 3 mm e NIC ≤ 1 mm) e 14 biópsias de gengivas clinicamente saudáveis que constituíram o grupo controle (PB ≤ 3 mm e NIC ≤ 1 mm). Os sítios rasos e profundos foram coletados do mesmo paciente, sendo que 04 biópsias coletadas dos sítios rasos foram perdidas. As amostras do fluido gengival foram coletadas de alguns dos mesmos sítios de onde foram realizadas as biópsias, sendo 12 sítios profundos e 8 sítios rasos, totalizando 20 amostras.

Foram considerados como critérios de inclusão: adolescentes e adultos de ambos os sexos entre 18 e 65 anos com no mínimo 20 dentes naturais; portadores de periodontite crônica severa generalizada (mais de 30% dos sítios acometidos) e localizada (menos de 30% dos sítios acometidos); pacientes do grupo teste que fossem classificados quanto à severidade da doença como severos, independentemente da extensão da periodontite (NIC ≥ 5 mm e PB ≥ 6 mm em pelo menos 2 ou mais sítios); portadores de gengivas clinicamente saudáveis que apresentassem necessidade de cirurgia periodontal, seja pré-protética, estética ou terapêutica, onde haveria a necessidade de remoção de parte do tecido gengival como etapa do processo cirúrgico. Foram considerados como critérios de exclusão: gestantes ou lactantes; pacientes submetidos a prévio tratamento periodontal nos últimos seis meses; pacientes que tivessem recebido terapia antibiótica/anti-inflamatória nos seis meses anteriores e usuários de medicamentos como anti-histamínicos, cortisona, hormônios, nifedipina e ciclosporina; pacientes diabéticos e fumantes. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UERJ. Todos os pacientes assinaram um Termo de Consentimento antes de serem examinados.

Todos os dentes presentes, com exceção dos terceiros molares, foram examinados. Os parâmetros clínicos avaliados foram: índice de placa visível (IPV) (Ainamo & Bay, 1975): avaliação dicotômica da presença ou não de placa bacteriana visível a olho nu; índice de sangramento gengival (ISG) (Ainamo & Bay, 1975): avaliação dicotômica de sangramento marginal após posicionar uma sonda periodontal milimetrada no sulco gengival, percorrendo o espaço do sulco de uma proximal a outra; profundidade de bolsa à sondagem (PB): distância entre a margem gengival e o fundo do sulco ou bolsa periodontal; nível de inserção clínica (NIC): distância entre a junção cemento-esmalte e o fundo do sulco ou bolsa periodontal. As mensurações foram realizadas em 6 sítios por dente (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual e disto-lingual) para PB e NIC e em 4 sítios por dente (superfícies



15An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393

vestibular, mesial, distal e lingual) para IPV e ISG.A sonda utilizada para realização de todas as medidas

foi uma sonda periodontal milimetrada (PCR 15, Hu-Friedy®, Chicago, IL, EUA). O exame clínico foi realizado por duas examinadoras calibradas, com concordância de 94,5% dentro de ± 1 milímetro para as medições entre as examinadoras.

Fluido gengivalForam analisadas 20 amostras, sendo 12 sítios profundos,

8 sítios rasos. Antes da coleta, a placa supragengival foi removida suavemente, os dentes secos com jatos de ar e isolados parcialmente com roletes de algodão. Uma tira de papel absorvente padrão (PerioPaper®, ProFlow, Inc, Amityville, NY, USA) foi introduzida no sulco ou bolsa periodontal, até certa resistência ser sentida e foi deixada em posição por 30 segundos. Para cada indivíduo, as tiras de cada categoria de sítio foram agrupados em Eppendorfs contendo 500μl de solução salina tamponada (PBS). Após eluição por 40 minutos em temperatura ambiente, as tiras de papel foram removidas, as amostras centrifugadas a 8000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante coletado e imediatamente congelado a -70° C até o momento da análise. A análise dos dados foi realizada no laboratório do departamento de Periodontia da UERJ. A análise com o LUMINEX® (Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA) foi utilizada para mensuração de INF-γ. Cinquenta μL de fluido gengival e 50μL de soro foram analisados utilizando um kit comercial Lincoplex® (Millipore, Missouri, USA), de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados foram calculados pelo programa Bio-Plex Manager Software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Os níveis do INF-γ foram expressos como quantidade total por sítio (pg/sítio).

Biópsias gengivaisAs amostras de tecido gengival foram obtidas de áreas

previamente selecionadas, posteriormente a coleta do fluido gengival, onde o procedimento cirúrgico e/ou a raspagem subgengival sob anestesia local constituíam parte do plano de tratamento odontológico. A região selecionada para ser realizada a biópsia gengival era anestesiada e a altura da crista óssea aferida com sonda periodontal, sendo estabelecida externamente seu ponto correspondente. O tecido foi removido com punch de 1,5 mm de diâmetro, na área demarcada durante o ato cirúrgico (no grupo controle) ou na consulta para raspagem subgengival com ou sem acesso cirúrgico (no grupo teste). Os sítios rasos e profundos de periodontite eram removidos do mesmo quadrante quando anestesiado. Imediatamente após a coleta, todas as amostras foram armazenadas em eppendorffs com 1 ml de solução de formaldeído a 10% para fixação e seguiram para o laboratório

de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia UERJ, onde foram incluídas em parafina para posterior análise morfológica pela técnica de rotina da Hematoxilina / Eosina (HE) e imuno-histoquímica através do método da Estreptavidina-Biotina (LSAB, do inglês labeled streptoavidin-biotin), utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-INF-γ humano (H-145, SC-8308, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA). A Figura 1 ilustra as etapas da coleta de uma biópsia gengival.

As lâminas foram observadas em microscópio óptico

24

FIGURAS

Figura 1 - Etapas da coleta de uma biópsia gengival

Legenda: A - incisão com punch de 2mm; B - ferida cirúrgica imediatamente após a

excisão do tecido; C - tecido gengival biopsiado; D - pós-operátorio (7 dias).

A BA

DA

C

Nikon® (Eclipse E200) com objetiva de 10x e 40x. A avaliação do padrão de marcação do INF-γ foi realizada através de análise da distribuição do anticorpo no tecido biopsiado, onde foram avaliadas as células epiteliais, as células inflamatórias (plasmócitos e macrófagos), fibroblastos e células endoteliais. Esta análise foi desenvolvida por um único examinador previamente calibrado. A calibração foi realizada pela análise de 10 lâminas, duas vezes em tempos diferentes, com percentual de concordância de 90%.

Foram consideradas imunorreativas as células que exibiram a presença de coloração acastanhada nos tipos celulares quer seja no núcleo e/ou no citoplasma, independente da intensidade da marcação. A intensidade da marcação foi avaliada semiquantitativamente, considerando-se marcação forte (++), marcação fraca (+) ou ausência de marcação (-), considerando-se para efeito de análise estatística escores 2, 1 e 0, respectivamente, tanto no tecido epitelial quanto no tecido conjuntivo gengival.

Análise estatísticaValores distribuídos normalmente, como a idade,

foram apresentados através de média e desvio-padrão,

Figura 1 - Etapas da coleta de uma biópsia gengival

Legenda: A - incisão com punch de 1,5mm; B - ferida cirúrgica imediatamente após a excisão do tecido; C - tecido gengival biopsiado; D - pós-operátorio (7 dias).




enquanto que valores não distribuídos normalmente, como os parâmetros clínicos periodontais e fluido gengival, foram apresentados como mediana e intervalo interquartil (IQ).

Os dados categóricos (sexo, raça e marcação imuno-histoquímica) foram apresentados como frequência absoluta e relativa.

Para a análise dos parâmetros supracitados entre os grupos, optou-se pelos testes: Mann-Whitney U-test, teste Qui-quadrado e teste Exato de Fisher, quando indicados.

O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar a expressão do INF-γ nos tecidos epitelial e conjuntivo, entre os três grupos (sítios profundos e rasos da periodontite e sítios controle). A correlação de Spearman foi utilizada na análise da correlação entre a expressão do INF-γ nos tecidos epitelial e conjuntivo e os parâmetros periodontais (PB e NIC) e fluido gengival. Foram consideradas correlações fortes se o coeficiente de correlação de Spearman (r) fosse ≥ 0,6 e sua

significância estatística (p) ≤ 0,01. Para todos os demais testes estatísticos utilizados, o nível de significância estabelecido foi de 5% (p≤0,05). As análises foram realizadas no programa SPSS, versão 18.0, 2009.

RESULTADOS

Parâmetros clínicosAs características clínicas estão apresentadas na Tabela 1.

O sexo masculino representou 63,88% da amostra total e a média de idade dos pacientes foi de 43,11 (± 12,57) anos, sendo a maioria da raça branca (38,88%). Na Tabela 2, observam-se valores de IPV e ISG significativamente maiores no grupo periodontite quando comparados ao grupo controle (p = 0,000). Como esperado, o grupo controle apresentou resultados de PB raso e NIC leve significativamente maiores quando comparados ao grupo periodontite (p = 0,000).

Tabela 1 - caracteríSticaS geraiS doS grupoS controLe e periodontite (n = 36)

Variável Categoria Controle Periodontite p

Sexo [n (%)]Feminino 7(50%) 6(27,3%)

0,165‡

Masculino 7(50%) 16(72,7%)

Raça [n (%)]

Branca 4(28,6%) 10(45,4%)

0,264#Parda 4(28,6%) 8(36,4%)

Negra 6(42,8%) 4(18,2%)

Idade [média (desvio-padrão)] 39,35(±16,5) 45,5 (±8,9) 0,119*

Legenda: ‡ Teste Qui-quadrado; # Teste Exato de Fisher; *Teste Mann-Whitney.

Tabela 2 - porcentagem mediana (intervaLo inter-quartiL) doS parâmetroS periodontaiS noS grupoS controLe e periodontite (n=36)

Variável Controle (n = 14) Periodontite (n = 22) p*

IPV (%) 13,25(9,55) 57,51(27,09) 0,000

ISG (%) 12,15(3,35) 54,50(39,96) 0,000

PB (%)

Raso (≤ 3 mm) 100(100) 58,99(18,76) 0,000

Moderado (4-5 mm) - 25,48(12,31)

Profundo (≥ 6 mm) - 15,53(13,96)

NIC (%)

Leve (0-1 mm) 100(100) 49,07(16,93) 0,000

Moderado (2-4 mm) - 24,47(9,0)

Severo (≥ 5 mm) - 22,91(17,48)

Legenda: * Teste Mann-Whitney.




Resultados do INF-γ no fluido gengivalSeis amostras de sítios profundos (n = 12) tiveram

marcação de valor igual a zero. Já nos sítios rasos (n = 8), cinco amostras apresentaram marcação de valor igual a zero (62,5%). As medianas (IQ) dos sítios profundos e rasos foram 0,25 (4,87) e 0,0 (3,75), respectivamente.

Expressão imuno-histoquímica do INF-γNa Figura 2, observa-se uma marcação do INF-γ mais

evidente nas camadas basais e suprabasais do tecido epitelial em comparação ao tecido conjuntivo, assim como as marcações nos fibroblastos, macrófagos/plasmócitos e células endoteliais.

Figura 2 - Análise da marcação imuno-histoquímica para INF-γ, evidenciando a marcação epitelial nas células basais, em fibroblastos, em macrófagos e em células endoteliais

Legenda: A - marcação epitelial nas células basais (Setas) (Imunoperoxidase, 100x); B - fibroblastos marcados em um sítio profundo de periodontite (Setas) (Imunoperoxidase, 100x); C - macrófagos e outras células inflamatórias no tecido conjuntivo (Seta) (Imunoperoxidase, 40x); D - marcação em células endoteliais (Setas) (Imunoperoxidase, 100x)

Análises descritiva, comparativa e de correlaçãoA análise da expressão imuno-histoquímica do INF-γ

no epitélio, fibroblastos e em macrófagos, demonstrou predomínio de biópsias com marcação fraca nos três grupos analisados. Foi demonstrada uma marcação forte do INF-γ em plasmócitos em 14,3% dos sítios profundos em comparação com 7,1% nos sítios controle. Houve ausência de marcação forte do INF-γ nas células endoteliais no grupo controle.

Na anál ise comparativa, não houve diferença estatisticamente significante para sítios profundos, rasos e controle na expressão do INF-γ no epitélio (p = 0,301), nos fibroblastos (p = 0,582), macrófagos (p = 0,686), plasmócitos (p = 0,476) e em células endoteliais (p = 0,628) (Teste de Kruskall-Wallis). Embora não tenha havido diferenças estatisticamente significativas entre a expressão do INF-γ nos tecidos epitelial e conjuntivo nos grupos analisados, os dados descritivos já expostos demonstram um padrão de marcação fraca predominante nos sítios profundos. Podemos observar uma tendência a um padrão de marcação similar nos sítios rasos e profundos, enquanto que nos sítios controle a marcação do epitélio pareceu ser predominante.

A análise da correlação de Spearman revelou uma forte correlação entre a expressão imuno-histoquímica do INF-γ no epitélio com macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (Tabela 3). A expressão do INF-γ nos tecidos demostrou não ter correlação significante com os dados clínicos apresentados. Da mesma maneira, a quantidade total de INF-γ no fluido gengival não apresentou correlação significante com a expressão de INF-γ nos tecidos epitelial e conjuntivo.

DISCUSSÃO

Neste estudo transversal, observamos a marcação do INF-γ em todos os grupos avaliados, porém não foi possível demonstrar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos analisados. Estudos prévios que realizaram as análises das biópsias gengivais por diferentes métodos, revelaram resultados distintos. Quando utilizada a técnica da imuno-histoquímica para análise das biópsias gengivais, foi verificada uma forte expressão do INF-γ na periodontite crônica (Fujihashi et al., 1996), enquanto que outros estudos demonstraram uma expressão mais fraca do INF-γ nas




biópsias de periodontite crônica quando comparadas aos níveis de outras citocinas, demonstrando prevalência da resposta Th2 em lesões de periodontite crônica moderada e severa (Lappin et al., 2001). Já os trabalhos que realizaram as análises das biópsias gengivais por PCR, mostraram diferença significantemente maior nos níveis do INF-γ na periodontite apenas quando comparados aos tecidos gengivais saudáveis. Dutzan et al. (2009) observaram níveis mais elevados do INF-γ utilizando o PCR, nos sítios ativos de periodontite quando comparados aos inativos, demonstrando a associação da presença da citocina com a destruição tecidual e relacionando-a com a severidade da doença. Embora a diferença encontrada por esse autor tenha sido estatisticamente significante, pode-se questionar o critério de classificação para os sítios ativos e inativos empregados no estudo. As diferentes técnicas utilizadas para as análises das biópsias podem influenciar o resultado. Na técnica de PCR é verificada a expressão gênica, através da análise do RNA responsável pela síntese de proteínas. Dessa forma, é analisada apenas a via de sinalização, o que não se traduz

em uma expressão da citocina. Já na técnica da imuno-histoquímica é possível avaliar a via final da expressão da citocina no tecido.

A forte expressão do INF-γ em todos os tecidos biopsiados, conflita não somente com os nossos resultados como também com resultados encontrados em trabalhos do nosso grupo que utilizaram o fluido gengival para detectar os níveis do INF-γ na periodontite, os quais encontraram baixos valores para essa citocina (Rescala et al., 2010; Rosalem et al., 2011; de Lima Oliveira et al., 2012). Tal fato pode sugerir que o fluido gengival não seja o método de eleição para a detecção do INF-γ, pelos possíveis motivos: eficiência na adesão do INF-γ ao meio; não ser detectado por estar neutralizado por algum receptor solúvel; ser destruído no fluido ou realmente se apresentar em poucas quantidades para serem expressas.

A forte correlação encontrada entre a maior parte das células do tecido conjuntivo e o epitélio, sugere uma estimulação uniforme do tecido analisado. A correlação positiva entre as células epiteliais, macrógafos, fibroblastos, plasmócitos e células endoteliais, nos leva a pensar que um

Tabela 3 - coeficiente de correLação de Spearman (r) e Sua Significância eStatíStica entre a expreSSão imuno-hiStoquímica do inf-γ noS tecidoS epiteLiaL e conjuntivo e aS variáveiS independenteS (parâmetroS cLínicoS periodontaiS e fLuido gengivaL)

INF-γ epitélioINF-γ

fibroblastosINF-γ

macrófagoINF-γ

plasmócitoINF-γ

cel.end

INF-γepitélio

r - 0,59 0,55 0,42 0,56

p - 0,000* 0,000* 0,004 0,000*

INF-γ fibroblastosr - - 0,97 0,80 0,72

p - - 0,000* 0,000* 0,000*

INF-γ macrófagosr - - - 0,82 0,68

p - - - 0,000* 0,000*

INF-γ plasmócitosr - - - - 0,76

p - - - - 0,000*

PBr 0,2 - 0,1 - 0,1 0,0 0,1

p 0,271 0,618 0,635 0,941 0,653

NICr 0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,0 0,0

p 0,464 0,415 0,456 0,958 0,857

INF-γ fluido gengival r 0,25 0,24 0,27 0,02 -0,13

p 0,293 0,302 0,282 0,924 0,670

Legenda: profundidade de bolsa à sondagem (PB); nível de inserção clínica (NIC). *Correlação estatisticamente significante.




estímulo local pode ter ativado sequencialmente as células. Já a ausência de correlação entre as células e PB e NIC dos sítios coletados, demostram a fraca relação entre os dados clínicos e a expressão tecidual da citocina. Como a doença periodontal se caracteriza por episódios de atividade intercalados por longos períodos de quiescência, os episódios de perda de inserção clínica podem estar associados a variações na população celular supracrestal, com números significantes de mastócitos, macrófagos e plasmócitos nos sítios em atividade (Zappa et al., 1991). O fato da quantidade total de INF-γ no fluido gengival não ter apresentado correlação com a expressão de INF-γ nos tecidos epitelial e conjuntivo, pode ser atribuído ao tamanho reduzido da nossa amostra ou realmente possa não existir essa correlação.

A marcação do INF-γ no grupo controle nesse estudo, contrasta com o fato do INF-γ ser uma citocina associada com o aumento da perda óssea alveolar durante as infecções periodontais (Valverde et al., 2004), e com a severidade da doença periodontal (Górska et al., 2003). Tal marcação do INF-γ no grupo controle pode ser atribuída pela presença de uma inflamação subclínica que ocorre na lesão inicial de Page & Schroeder (1976). Nesse estágio, o infiltrado inflamatório ocupa de 5 a 10% do tecido conjuntivo gengival abaixo do epitélio, há perda focal de colágeno e presença de leucócitos polimorfonucleares. Os neutrófilos ativados podem produzir uma série de citocinas que levarão a resposta Th1 e consequentemente a produção do INF-γ. Nesse caso, a inflamação subclínica parece ser suficiente para produção do INF-γ na imunidade inata. Recentemente, foi realizado um estudo que demonstrou a presença do INF-γ e outros marcadores das vias clássica e alternativa de ativação dos macrófagos, tanto em biópsias de pacientes saudáveis como em biópsias de pacientes com periodontite, pelos métodos de Western Blot e imuno-histoquímica (Navarrete et al., 2013). Embora a marcação do INF-γ tenha sido mais intensa na doença, o INF-γ foi detectado em todas as amostras de tecido gengival desse estudo. Esses dados nos permitem supor que ambas as vias de ativação estão presentes nos estados de saúde e doença, sendo a última responsável por um maior padrão de resposta.

O padrão de marcação similar do INF-γ nos sítios rasos e profundos de periodontite nas amostras analisadas, pode ser parcialmente explicado pelo fato da coleta desses sítios ter sido realizada em um único paciente. Embora os mecanismos que esclareçam a progressão da gengivite para periodontite ainda não estejam claros, estes podem atuar de forma distinta entre os indivíduos, mostrando que a patogênese da perda óssea periodontal difere entre pacientes, sítios e períodos (American Academy of Periodontology, 1999). Levando-se em

consideração que uma resposta imunológica completa requer atividades celulares e humorais, também se pode especular que tais dissonâncias entre os resultados podem estar relacionadas com amostras colhidas em períodos diferentes de manifestação da doença. Já o estudo que extraiu as amostras de tecidos gengivais de indivíduos diferentes em cada grupo (grupo controle com indivíduos saudáveis, grupo com gengivite e grupo com periodontite) também não encontrou diferenças nos níveis do INF-γ entre os grupos com gengivite e periodontite (Zhang et al., 2010). Nesse caso, não houve a influência da susceptibilidade individual à doença periodontal.

A similaridade na expressão do INF-γ demonstrada nos 3 grupos, sugere que essa citocina pode ser ativada em diferentes estágios da inflamação, sendo facilmente estimulada frente à uma inflamação subclínica. Tal fato contraindica sua utilização como marcador de atividade de perda de suporte periodontal. Os níveis elevados do INF-γ podem significar tanto um papel protetor como o de destruição, fato atribuído ao seu caráter bifásico (Kelchtermans et al., 2008). Para o seu uso como marcador diagnóstico, seria necessário uma melhor definição do seu papel no estado de saúde e doença. Para isso, se faz necessária a realização de novos estudos com amostras significativas de tecidos gengivais para análise da expressão genética do INF-γ e de outras citocinas que possam contribuir para o entendimento do processo.

CONCLUSÃO

Não foi possível observar diferenças na expressão do INF-γ em biópsias gengivais nos sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa quando comparados a indivíduos saudáveis, o que pode ser atribuído ao caráter bifásico do INF-γ, já que o mesmo pode exercer tanto um papel protetor como o de destruição. A baixa detecção do INF-γ no fluido gengival, dentro das limitações do estudo, pode sugerir que este talvez não seja o método de eleição para a detecção do INF-γ.

ABSTRACT

The aim of this study was to analyze the expression of interferon-gamma (INF-γ) in gingival biopsies from shallow and deep sites in patients with severe chronic periodontitis and correlate the expression of INF-γ in the gingival crevicular fluid (GCF). Biopsies were collected from 22 deep sites, 18 shallow sites and 14 control sites. The GCF samples were collected from 12 deep and 8 shallow sites. Probing pocket




depth (PPD), clinical attachment level (CAL), visible plaque index (VPI) and gingival bleeding index (GBI) were analysed. The morphological and immunohistochemical analysis were performed. The intensity of staining of INF-γ in tissues was evaluated semi-quantitatively. We observed a trend for a similar pattern of staining in the shallow and deep sites, with a predominance of weak staining in deep sites. There were no significant differences among the three groups. There was no significant correlation (Spearman) with the expression of INF-γ

in the epithelial and connective tissues with the clinical data and with the GCF. We conclude that there were no differences in the expression of INF-γ in gingival biopsies in shallow and deep sites of pacients with periodontitis compared to healthy subjects, which may be attributed to the biphasic character of INF-γ.

UNITERMS: Interferon-gamma, Periodontitis, Gingival crevicular fluid, Immunohistochemistry, Biopsy.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- Page RC, Offenbacher S, Schroeder HE, Seymour GJ, Kornman

KS. Advances in the pathogenesis of periodontitis: summary of

developments, clinical implications and future directions. Periodontol

2000 1997; 14: 216-248.

2- Teng YT. The role of acquired immunity and periodontal disease

progression. Crit Rev Oral Biol Med 2003; 14(4): 237-252.

3- Assuma R, Oates T, Cochran D, Amar S, Graves DT. IL-1 and TNF

antagonists inhibit the inflammatory response and bone loss in

experimental periodontitis. J Immunol 1998; 160(1): 403-409.

4- Isaacs A, Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon. Proc R

Soc Lond B Biol Sci 1957; 147(927): 258-267.

5- Goodbourn S, Didcock L, Randall RE. Interferons: cell signalling,

immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J

Gen Virol 2000; 81(10): 2341-2464.

6- Hervas-Stubbs S, Perez-Gracia JL, Rouzaut A, Sanmamed MF, Le Bon

A, Melero I. Direct effects of type I interferons on cells of the immune

system. Clin Cancer Res 2011; 17(9): 2619-2627.

7- De Klerck B, Carpentier I, Lories RJ, Habraken Y, Piette J, Carmeliet

G et al. Enhanced osteoclastic development in collagen-induced

arthritis in interferon-gamma receptor knock-out mice as related to

increased splenic CD11b+ myelopoiesis. Arthritis Res Ther 2004; 6

(3): R220-R231.

8- Gao Y, Grassi F, Ryan MR, Terauchi M, Page K, Yang X et al. IFN-gamma

stimulates osteoclast formation and bone loss in vivo via antigen-driven

T-cell activation. J Clin Invest 2007; 117(1): 122-132.

9- Fujihashi K, Yamamoto M, Hiroi T, Bamberg TV, McGhee JR, Kiyono

H. Selected Th1 and Th2 cytokine mRNA expression by CD4(+) T cells

isolated from inflamed human gingival tissues. Clin Exp Immunol

1996; 103(3): 422-428.

10- Dutzan N, Vernal R, Hernandez M, Dezerega A, Rivera O, Silva N

et al. Levels of interferon-gamma and transcription factor T-beta in

progressive periodontal lesions in patients with chronic periodontitis.

J Periodontol 2009; 80(2): 290-296.

11- Zhang S, Crivello A, Offenbacher S, Moretti A, Paquette DW, Barros

SP. Interferon-gamma promoter hypomethylation and increased

expression in chronic periodontitis. J Clin Periodontol 2010; 37(11):

953-961.

12- de Lima Oliveira AP, de Faveri M, Gursky LC, Mestnik MJ, Feres M,

Haffajee AD et al. Effects of periodontal therapy on GCF cytokines in

generalized aggressive periodontitis subjects. J Clin Periodontol 2012;

39(3): 295-302.

13- Rescala B, Rosalem W Jr, Teles RP, Fischer RG, Haffajee AD, Socransky SS

et al. Immunologic and microbiologic profiles of chronic and aggressive

periodontitis subjects. J Periodontol 2010; 81(9): 1308-1316.

14- Rosalem W, Rescala B, Teles RP, Fischer RG, Gustafsson A, Figueredo

CM. Effect of non-surgical treatment on chronic and aggressive

periodontitis: clinical, immunologic, and microbiologic findings. J

Periodontol 2011; 82 (7): 979-989.

15- American Academy of Periodontology. International workshop for a

classification of periodontal diseases and conditions. Ann Periodontol

1999; 4(1): 1-112.

16- Ainamo J, Bay I. Problems and proposals for recording gingivitis and

plaque. Int Dent J 1975; 25(4): 229-235.

17- Lappin DF, MacLeod CP, Kerr A, Mitchell T, Kinane DF. Anti-

inflammatory cytokine IL-10 and T cell cytokine profile in periodontitis

granulation tissue. Clin Exp Immunol 2001; 123(2): 294-300.

18- Zappa U, Reinking-Zappa M, Graf H, Espeland M. Cell populations and

episodic periodontal attachment loss in humans. J Clin Periodontol

1991; 18(7): 508-515.

19- Valverde P, Kawai T, Taubman MA. Selective blockade of voltage-

gated potassium channels reduces inflammatory bone resorption

in experimental periodontal disease. J Bone Miner Res 2004; 19(1):

155-164.

20- Górska R, Gregorek H, Kowalski J, Laskus-Perendyk A, Syczewska M,

Madaliński K. Relationship between clinical parameters and cytokine

profiles in inflamed gingival tissue and serum samples from patients




with chronic periodontitis. J Clin Periodontol 2003; 30(12): 1046-1052.

21- Page RC, Schroeder HE. Pathogenesis of inflammatory periodontal

disease. A summary of current work. Lab Invest 1976; 34(3): 235-249.

22- Navarrete M, García J, Dutzan N, Henríquez L, Puente J, Carvajal P et

al. IFN-γ, IL-6, IL-4, and FXIII-A as indirect markers of the classical and

alternative macrophage activation pathways in chronic periodontitis.

J Periodontol 2014; 85(5): 751-60.

23- American Academy of Periodontology. The pathogenesis of periodontal

diseases: informational paper. J Periodontol 1999; 70: 457-470.

24- Kelchtermans H, Billiau A, Matthys P. How interferon-gamma keeps

autoimmune diseases in check. Trends Immunol 2008; 29(10): 479-

486.

Endereço para correspondência:

Tatiane Flôr Coelho de Souza Breves Beiler

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Boulevard 28 de Setembro, 157 - 2º andar - sala 10

Pavilhão Mario Franco Barrozo - Vila Isabel

CEP: 20551-030 - Rio de Janeiro - RJ

E-MAIL: [email protected]

Tel: (21) 9953-74495


EXPRESSÃO DO INTERFERON-γ EM BIÓPSIAS GENGIVAIS … · O grupo teste foi composto por 22...

Documents

Transcript of EXPRESSÃO DO INTERFERON-γ EM BIÓPSIAS GENGIVAIS … · O grupo teste foi composto por 22...