Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE E-CADERINA, β-CATENINA, INTEGRINAS α2β1 E α3β1 EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES DE CAVIDADE ORAL Goiânia 2013 MARIANA SILVEIRA SOARES

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE E-CADERINA, β-CATENINA, INTEGRINAS α2β1 E

α3β1 EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES DE CAVIDADE ORAL

Goiânia

2013

MARIANA SILVEIRA SOARES

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MARIANA SILVEIRA SOARES

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE E-CADERINA, β-CATENINA, INTEGRINAS

α2β1 E α3β1 EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES DE CAVIDADE ORAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Odontologia da Faculdade de

Odontologia da Universidade Federal de Goiás

para obtenção do título de Mestre em Odontologia,

área de concentração Clínica Odontológica.

Linha de Pesquisa: Estudo das manifestações

clínicas e tratamento das lesões do sistema

estomatognático.

Orientador: Prof. Dr. Elismauro Francisco de

Mendonça

Co-orientadora: Profª. Drª. Aline Carvalho Batista

GOIÂNIA

2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

BANCA EXAMINADORA DE DEFESA DE MESTRADO

Aluna: Mariana Silveira Soares

Orientador: Prof. Dr. Elismauro Francisco de Mendonça

Co-orientadora: Profª. Drª. Aline Carvalho Batista

Membros:

1. Prof. Dr. Elismauro Francisco de Mendonça

2. Prof. Dr. Brunno Santos de Freitas Silva

3. Prof. Drª. Vera Aparecida Saddi

Membros Suplentes:

1. Profª Dr. Claudio Rodrigues Leles

2. Profª Drª. Nádia do Lago Costa

Data: 13/08/2013

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Dedico este trabalho...

Aos meus pais Else e Luiz, pelo exemplo de persistência e amor incondicional.

À minha irmã Marina, pela amizade sincera.

À minha prima Juliana, minha irmã de coração.

Ao meu namorado Daniel, pelo apoio e compreensão.

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AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador professor Elismauro Francisco de Mendonça, pela competência em

seus conhecimentos científicos, pela confiança, por me dar a oportunidade de acertar,

tendo paciência com meus erros. Muito obrigada!

À professora Aline Carvalho Batista, agradeço o incentivo e ensino. Sua colaboração

foi fundamental para a conclusão dessa etapa.

Ao professor Claudio Rodrigues Leles, sua contribuição foi de grande importância

para a conclusão desse trabalho.

A toda equipe do Centro Goiano de Doenças da Boca, meus sinceros agradecimentos.

Aos colegas de pós-graduação, Alexandre, Ana Paula, Gabriela, Geovanna, Hellen,

Heloísa, Hianne, Felipe, Mariana, Marília, Mayara, Monique, Thiago Souza, Tiago

Tavares, pelas palavras de conforto nos momentos difíceis e pelos sorrisos

compartilhados nos momentos de alegria.

À colega e amiga Marília, pelos ensinamentos nas primeiras reações de

imunoistoquímica e por estar sempre disposta a ajudar.

À acadêmica Juliana Andrade de Mendonça, exemplo de dedicação e responsabilidade,

meus sinceros agradecimentos.

À professora Sandra Lúcia Venturin Von Zeidler, pela confiança e apoio.

À minha família pelo incentivo e amigos, pela compreensão e apoio incondicional em

todos os momentos.

A Deus, por cada dia nesta caminhada.

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AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS

À Universidade Federal de Goiás, que me concedeu a bolsa de mestrado e permitiu minha

dedicação exclusiva ao programa e a dissertação.

À Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação, que realizou a aquisição de parte dos

materiais necessários para este trabalho.

À Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Goiás, na pessoa da professora

Enilza Maria Mendonça de Paiva.

Ao Hospital Araújo Jorge/ ACCG, que permitiu o acesso às amostras utilizadas neste

estudo e onde realizei estágio clínico.

Ao Centro Goiano de Doenças da Boca onde realizei meu estágio clínico.

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“O sucesso nasce do querer, da determinação e

persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não

atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no

mínimo fará coisas admiráveis.”

José de Alencar

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SUMÁRIO

1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ..................................................................... 15

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL .. 15

1.2 METÁSTASE ................................................................................................................ 16

1.3 MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR .................................................................. 17

1.3.1 E-caderina ................................................................................................................. 19

1.3.2 β-catenina .................................................................................................................. 21

1.3.3 Via Wingless-int ....................................................................................................... 23

1.3.4 Via de Transição Epitélio-Mesenquimal ................................................................ 24

1.3.4 Integrina α2β1 .......................................................................................................... 26

1.3.5 Integrina α3β1 .......................................................................................................... 27

1.3.6 Relação da E-caderina e β-catenina e Integrinas α2β1 e α3β1 com o CEC oral 29

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 34

3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 35

3.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 35

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 35

4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 36

4.1 OBTENÇÃO, SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ......................... 36

4.2 TÉCNICAS EMPREGADAS ....................................................................................... 37

4.2.1 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina) ............................................................ 37

4.2.2 Técnica de Imuno-histoquímica ............................................................................. 37

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4.3 ANÁLISE QUALITATIVA E SEMI-QUANTITATIVA DOS DADOS .................... 40

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS .................................................................... 40

5 PUBLICAÇÃO ................................................................................................................ 41

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 68

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 69

ANEXO A- PARECER DO CEP-UFG ................................................................................ 91

ANEXO B- PARECER CEP- ACCG/ HOSPITAL ARAÚJO JORJE ............................. 92

ANEXO C- BANCO DE DADOS ......................................................................................... 93

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FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Representação esquemática da família das integrinas.

Figura 2 Esquema simplificado representando a ligação homofílica da

molécula de E-caderina em queratinócitos.

Figura 3 Esquema simplificado da via de sinalização Wnt/β-catenina.

Figura 4 Modelo esquemático simplificado do processo de transição epitelio-

mesenquimal (EMT).

Quadro 1 Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina

α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias.

Quadro 2 Protocolos e especificações dos anticorpos primários, secudários e

reagentes utilizados na técnica de imuno-histoquímica.

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SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

ACCG Associação de Combate ao Câncer em Goiás

CEC Carcinoma Espinocelular

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CL Centro da Lesão

CNLM Células Metastáticas nos Linfonodos Cervicais

DAB Diaminobenzindina

E-cad E-caderina

FCT Fator de Células T

FPL Fator Potencializador Linfoide

FIT Fronte de Invasão Tumoral

HAJ Hospital Araújo Jorge

HE Hematoxilina e Eosina

INCA Instituto Nacional do Câncer

N Número de Amostras

OMS Organização Mundial de Saúde

P Probabilidade

TEM Transição Epitélio Mesenquimal

TNM Refere-se á classificação clínica, sendo T = Tumor Primário, N =

Linfonodo Regional e M = Metástase à Distancia (Tumor Node

Metastasis)

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UFG Universidade Federal de Goiás

Wnt Wingless-int

β-cat β-catenina

ρ Letra grega Rho que indica o coeficiente de correlação de Sperman

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RESUMO

A E-caderina (E-cad), β-catenina (β-cat), α2β1 e α3β1 integrinas desempenham papéis

importantes na adesão celular e alterações de sua expressão têm sido relatadas em diversos

tipos de neoplasias. No entanto, sua participação na progressão e metastase do carcinoma

espinocelular oral (CEC) permanece controversa. O objetivo deste estudo foi investigar a

imunoexpressão da E-cad, β-cat e integrinas α2β1 e α3β1 na CEC não-metastático e

metastático e em células metastáticas de linfonodos cervicais positivos. A imunoexpressão

das moléculas foi avaliada em quarenta amostras de CEC, no centro de Lesão (CL), fronte de

invasão tumoral (FIT) e células neoplasicas de linfonodos metastáticos (MLNC) e

classificadas como baixa expressão (<50%) ou alta expressão (≥ 50%). A baixa expressão em

membrana citoplasmática de E-cad e elevada expressão citoplasmática foi observada no CL e

no FIT nos grupos não metastático e metastático. No CL, a β-cat apresentou

significativamente menor expressão em membrana citoplasmática no CEC metastático (P =

0,013) e no FIT foi observada baixa expressão em ambos os grupos. As integrinas

apresentaram alta expressão citoplasmática granular, independentemente da presença de

metástases no CL e no FIT. Quando a expressão das moléculas foi comparada no CEC

metastático no CL, FIT e nas CNLM, a E-cad e a β-cat apresentaram uma diminuição

significativa de expressão em membrana celular (P = 0,007 e P = 0,043, respectivamente) e

em citoplasma (P = 0,021 e P = 0,002, respectivamente). Integrinas apresentaram alta

expressão citoplasmática no CL, FIT e CNLM. Em conclusão, a expressão anormal de E-cad

e β-cat com perda de expressão em membrana citoplasmática e alta expressão em citoplasma

somada à alta expressividade de integrinas α2β1 e α3β1 contribuem para o processo de

metástase linfonodal no CEC.

Palavras-chave: Metástase Linfática. Carcinoma de Células Escamosas. Moléculas de

Adesão Celular.

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ABSTRACT

ASSESSMENT OF THE EXPRESSION OF E-CADHERIN, β-CATENIN, α2β1

AND α3β1 INTEGRINS IN ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA

The E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles

in cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several

neoplasms. Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC)

progression and metastasis remains controversial. The aim of this study was to

investigate the immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-

metastatic and metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph

nodes. Molecules’ immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in

Lesion’s Center (LC), Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells

(MLNC) and classified as low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low

cytoplasmic membrane expression of E-cadherin and high cytoplasmic expression was

observed in LC and in the ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-

catenin presented significantly lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic

OSCC (P= 0.013) and in ITF low expression was noticed in both groups. Integrins

presented highly granular cytoplasmic expression regardless of the presence of

metastasis and in LC or ITF. When molecules’ expression was compared in metastatic

OSCC in LC, ITF and MCLN, the E-cadherin and β-catenin presented a significant

decrease of cytoplasmic membrane (P= 0.007 and P= 0.043, respectively) and

cytoplasmic expression (P= 0.021 and P= 0.002, respectively). Integrins presented high

cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion, abnormal expression of

E-cad and β-cat with loss of membranous and high cytoplasmic expression added to

high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrin contribute to lymph node metastasis in

OSCC.

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Key words: Oral Cancer; Squamous Cell Carcinoma; Cell Adhesion; Lymphatic

Metastasis.

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1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL

O câncer de cavidade oral representa um relevante problema global de saúde

pública. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou no ano de 2008 a ocorrência

de 263.020 novos casos e 127.654 óbitos em decorrência desse câncer em todo o mundo

(Ferlay et al., 2008). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou 14.170

novos casos para o ano de 2012, apresentando esta neoplasia como a décima primeira

mais frequente no gênero feminino e a quinta no gênero masculino (Brasil, 2012).

O carcinoma de células escamosas ou espinocelular (CEC) representa

aproximadamente 90% das neoplasias malignas da cavidade oral (Zini, Czerninski e

Sgan-Cohen, 2010). A etiologia do CEC oral é multifatorial e está diretamente

relacionada à quantidade e tempo de consumo de álcool e tabaco; e infecções pelo

Papiloma Vírus Humano (HPV) (Zini, Czerninski e Sgan-Cohen, 2010; Brasil, 2012). O

etilismo associado ao tabagismo aumenta em 30 vezes o risco para o desenvolvimento

do CEC de cavidade oral (Brasil, 2012), porém, em aproximadamente 20% dos casos os

pacientes não apresentam histórico de consumo dessas substâncias e a etiologia não está

clara (Vargas-Ferreira et al., 2012). Dentre os outros fatores de risco que poderiam

contribuir no desenvolvimento desta neoplasia estão: higiene oral deficiente, perda

dentária, líquen plano oral, infecção pelo vírus da hepatite A e C, alterações genéticas e

imunodeficiências (Curado e Hashibe, 2009; Bachar et al., 2011).

O CEC oral atinge principalmente indivíduos com idade média de 50 anos e do

gênero masculino, porém a incidência no gênero feminino vem aumentando nas últimas

décadas, provavelmente devido ao maior consumo de tabaco e álcool entre as mulheres

(Durazzo et al., 2005; Warnakulasuriya, 2009). A língua corresponde a 50% dos sítios

anatômicos intra-orais acometidos, outros sítios incluem o soalho oral, palato mole e

gengiva (Warnakulasuriya, 2009).

A evolução e o prognóstico do CEC dependem de vários fatores dentre os quais:

estadio da neoplasia, sítio anatômico de localização e o tratamento empregado (Jan et

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al., 2011). O tamanho do tumor, o grau de anaplasia (segundo a gradação histológica de

malignidade da OMS) e a presença de metástase linfonodal são indicadores

independentes que representam um pior prognóstico para pacientes com CEC oral

(Arduino et al., 2008).

1.2 METÁSTASE

O CEC é uma lesão de comportamento biológico agressivo caracterizado pela

habilidade de produzir metástase para os linfonodos regionais e que apresenta uma taxa

significativa de recorrência e mortalidade (Koontongkaew, 2013). A presença de

metástase lifonodal é considerada o primeiro indício de disseminação tumoral e um

indicador independente de pior prognóstico (Noguti et al., 2012). Aproximadamente

40% dos pacientes portadores de CEC apresentam metástase linfonodal. Estudos

prévios demonstraram que 25 % a 50% dos pacientes com metástase linfonodal atingem

cinco anos de sobrevida após o diagnóstico e entre os pacientes que não apresentaram

metástase este índice varia entre 75% a 88% (Myers et al., 2001; Greenberg et al.,

2003).

O processo metastático representa um processo contínuo e complexo que

compreende etapas sequenciais e seletivas, incluindo a proliferação celular, invasão da

membrana basal subjacente ao tumor, motilidade através da matriz celular; penetração

nos vasos sanguíneos e linfáticos, sobrevida na circulação, extravasamento da

circulação para o tecido alvo, sobrevida e crescimento na forma de metástase

(Woodhouse, Chuaqui e Liotta, 1997; Feller, Kramer e Lemmer, 2012).

A metástase linfonodal e sistêmica envolve interações entre as células

neoplásicas e entre as células neoplásicas e o os tecidos saudáveis do hospedeiro e é

dependente de fatores biológicos do tumor primário como a expressão de determinados

genes e proteínas (Koontongkaew, 2013). A capacidade das células tumorais para

migrar, invadir os tecidos e vasos sanguíneos, infiltrar e colonizar tecidos distantes

depende em parte da expressão de inúmeras moléculas de adesão (Lyons e Jones, 2007).

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1.3 MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR

A adesão celular desempenha um papel fundamental na organização tecidual e nas

funções fisiológicas dos órgãos e tecidos (Gumbiner, 1996). As moléculas de adesão

celular são proteínas expressas na superfície célular e participam das interações célula-

célula e célula-matriz extracelular. Várias famílias de moléculas de adesão celular são

conhecidas: integrinas, caderinas, selectinas, imunoglobulinas e outras como o CD44

(glicoproteína envolvida nas interações célula-célula). Estas moléculas estão envolvidas

na sinalização entre o interior e o exterior da célula, no crescimento e ploriferação, na

organização espacial e migração celular. Desta forma, participam tanto dos processos

biológicos normais quanto dos processos patológicos como no desenvolvimento de

processos neoplásicos benignos e malignos, nos últimos participando ativamente do

processo de metástase tumoral (Lyons e Jones, 2007; Rajarajan et al., 2012).

As Caderinas representam um grande grupo de moléculas de adesão formadas

por uma única cadeia transmembrana de glicoproteinas com um domínio extracelular e

intracelular. Dentre as caderinas, a E-caderina (E-cad) expressa no epitélio, tem sido a

mais investigada (Kudo et al., 2004; Gould Rothberg e Bracken, 2006; Boo et al., 2007;

Shapiro e Weis, 2009; Hong et al., 2011; Carneiro et al., 2012; Vered et al., 2012).

As caderinas atuam essencialmente promovendo a adesão célula-célula por meio

de ligações homofílicas dependentes de íons de cálcio e são essenciais para a formação

dos tecidos sólidos. Esta função adesiva é dependente da ligação com um grupo de

proteínas regulatórias citoplasmáticas que formam uma ligação com o citoesqueleto: as

cateninas (Lyons e Jones, 2007).

As caderinas também interagem com as integrinas (Higgins et al., 1998;

Whittard et al., 2002; Chattopadhyay et al., 2003; Weber, Bjerke e Desimone, 2011)

que representam a maior família de moléculas de adesão celular conhecida. O nome

“integrina” deve-se a importante função dessas moléculas na manutenção da integridade

da ligação matriz extracelular ao citoesqueleto celular. São glicoproteínas expressas na

membrana celular, compostas por uma combinação heterodimérica entre duas

subunidades não covalentes: α, que determina os ligantes da molécula de integrina e β,

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que conectada ao citoesqueleto afeta múltiplas vias de sinalização. Atualmente são

conhecidas 16 diferentes subunidades α e 8 β, sendo que 24 diferentes heterodimeros já

foram identificados (Figura 1). (Mccall-Culbreath e Zutter, 2008; Barczyk, Carracedo e

Gullberg, 2010).

Constitutivamente as integrinas mais abundantes no epitélio são a integrina

α2β1, que representa um ligante de colágeno, a integrina α3β1, ligante de laminina 5, e

a integrina α6β4, também um receptor de laminina (Watt, 2002).

Figura 1: Representação esquemática da família das integrinas. Nos vertebrados, a

família das integrinas contém 24 heterodímeros conhecidos que apresentam uma

subunidade α e uma subunidade β. Dentre os principais ligantes das integrinas estão o

colágeno, a laminina, leucócitos e moléculas que contenham a sequencia de

aminoácidos RGD (arginina, glicina e asparagina) como a fibronectina, o fibrinogênio e

a vitronectina. Adaptado de Barczyk, Carracedo e Gullberg, 2010 (Barczyk, Carracedo

e Gullberg, 2010).

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A contribuição do complexo caderina-catenina e das integrinas para o

desenvolvimento, invasão, metástase e pior prognóstico já foi relatada em diferentes

neoplasias, incluindo o câncer de pulmão, câncer de mama, o adenocarcinoma

prostático, o tumor pseudopapilar de pâncreas e o CEC oral (Kudo et al., 2004; Lyons e

Xie, 2005; Diniz-Freitas et al., 2006; Zhang et al., 2006; Audard et al., 2008; Mitchell

et al., 2010; Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012). Além do mais, elas participam

de vias de sinalização celular que também contribuem para o processo metastático como

a via de transição epitélio-mesenquimal (TEM) e a via Wingless-int (Wnt) (Brabletz et

al., 2005; Kim et al., 2009; Chaw et al., 2012; Zhou et al., 2012).

1.3.1 E-caderina

A E-cad é uma glicoproteína 120-kDa codificada pelo gene CDH1, localizado

no cromossomo16q22.1 que promove a adesão celular por meio de ligações cálcio-

dependentes aos domínios extracelulares das moléculas de E-cad das células adjacentes

(Diniz-Freitas et al., 2006; Zhao et al., 2012). Predominantemente as moléculas de E-

cad realizam ligações homofílicas, porém sua a interação com a integrina αEβ7 também

já foi descrita. Por meio dessa interação a E-cad participaria da migração linfocitária em

tecidos epiteliais (Higgins et al., 1998).

A porção citoplasmática de E-cad interage com outros componentes da adesão

celular, em particular com as proteínas p120-catenina, γ-catenina e β-catenina (β-cat).

Por meio da ligação com a β-cat á α-catenina este complexo de adesão se liga ao

citoesqueleto de actina, mediando assim a estabilidade mecânica celular (Tanaka et al.,

2003) (Figura 2).

No epitélio normal a E-cad é expressa na superfície da membrana citoplasmática

celular, nas camadas espinhosas inferiores e nas células da camada basal, onde não está

expressa na região basal da membrana citoplasmática (Bankfalvi et al., 2002). Esta

molécula está envolvida na transdução de sinais que controlam vários eventos celulares,

incluindo diferenciação, crescimento, polaridade e migração celular (Larue et al., 1996).

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20

A expressão contínua na superfície celular e atividade funcional da E-cad são

necessárias para que as células permaneçam firmemente associadas no epitélio. Na sua

ausência, outras proteínas que promovem adesão e junção celular expressas nas células

epiteliais não são capases de suportar a adesão intercelular. Em virtude de sua

capacidade de manter o estado geral de adesão entre as células epiteliais a E-cad atua

como um importante supressor de invasão e metástase em tumores de origem epitelial

(Gumbiner, 1996).

Figura 2: Esquema simplificado representando a ligação homofílica da molécula

de E-caderina em queratinócitos. O domínio extracelular da molécula liga-se ao

domínio extracelular de outra molécula de E-cad por meio dos íons de Cálcio. Enquanto

isso o domínio intracelular liga-se a molécula de β-cat que por sua vez liga-se a α-

catenina que se liga ao citoesqueleto de actina. Adaptado de Perry et al., 2010 (Perry et

al., 2010).

Evidências sugerem que a diminuição de sua expressão na membrana celular,

bem como a metilação do gene CDH1 estão diretamente envolvidas na progressão,

perda de diferenciação celular, metástase e menor sobrevida em diversas neoplasias

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(Gould Rothberg e Bracken, 2006; Boo et al., 2007; Hong et al., 2011; Vered et al.,

2012).

A alteração de expressão dessa molécula com deslocamento para o citoplasma foi

relatada por Lewis-Tuffin et al. (2010) em glioblastoma e por Audard, et al. (2008) em

tumor pseudopapilar de pâncreas (Audard et al., 2008; Lewis-Tuffin et al., 2010). Além

do mais, Kaur, et al (2009) observaram a diminuição de imunoexpressão em membrana

citoplasmática e um aumento na expressão citoplasmática de E-cad em CEC oral, sendo

que essa expressão anormal foi mais frequente em tumores pouco diferenciados (Kaur et

al., 2009).

A expressão nuclear acompanhada da perda de expressão em membrana dessa

proteína também já foi reportada no carcinoma de Merkel, tumor de célula granulosa de

ovário e tumor pseudopapilar do pâncreas (Han et al., 2000; Serra et al., 2007; Chetty,

Serra e Salahshor, 2008a; El-Bahrawy et al., 2008; Ohishi et al., 2011). No núcleo,

acredita-se que esta molécula possa desempenhar funções que contribuam para

progressão das neoplasias, atuando como um fator anti-apoptótico, por exemplo, (Ferber

et al., 2008; Vered et al., 2012) embora seu papel ainda não tenha sido elucidado

(Chetty, Serra e Salahshor, 2008b). Além do mais, Chetty e Serra. (2008) observaram

que a expressão nuclear de E-cad esteve correlacionada com invasão, metástase

linfonodal e metástase à distância em tumor endócrino do pâncreas (Chetty e Serra,

2008a).

1.3.2 β-catenina

A β-cat é uma proteína citoplasmática multifuncional que atua tanto na adesão

celular mediada pela E-cad quanto na transdução de sinais celulares, participando

principalmente como fator de transcrição na via Wnt (Johnson e Rajamannan, 2006) e

da indução da via TEM (Nakamura e Tokura, 2011) que serão explanadas a seguir. Esta

proteína é essencial para o estabelecimento e manutenção das camadas epiteliais e

proporciona uma ligação mecânica entre as junções intercelulares e as proteínas do

citoesqueleto. Mutações genéticas da β-cat são responsáveis pela perda de adesão

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celular e invasão tumoral mesmo na presença de expressão normal de E-cad (Oyama et

al., 1994).

Em condições fisiológicas, a imunoexpressão de β-cat é observada no citoplasma

celular na região adjacente á membrana citoplasmática dos queratinócitos, pois a maior

parte da β-cat disponível na célula está associada a E-cad no complexo caderina-

catenina (Xu e Kimelman, 2007). Os níveis de β-cat livre no interior do citoplasma são

fortemente regulados e mantidos baixos pela ação de um complexo composto de

degradação formado pela proteína axina que se liga a polipose adenomatosacoli (APC),

glicogênio sintase quinase 3-β (GSQ3-β) e outras proteínas que fosforilam a β-cat

resultando em uma degradação rápida (Figura 3) (Aberle et al., 1997). Em contraste, o

acúmulo nuclear e citoplasmático de β-catenina é observado em linhagens celulares de

câncer de cólon (Han et al., 2013), câncer de próstata (Chesire et al., 2000) e CEC oral

(Gao et al., 2005).

A participação da β-cat nas neoplasias parece estar principalmemte associada a

sua participação na adesão celular (Nelson e Nusse, 2004; Kim et al., 2013), ao seu

envolvimento na via TEM (Brabletz et al., 2005; Howard et al., 2011), e na via Wnt

(Pannone et al., 2010), embora seu papel como supressor de apoptose (Han, R. et al.,

2013) e na indução de ploriferação celular (Syed et al., 2008) também já tenham sido

reportados.

Vários estudos têm relatado a indução de um pior prognóstico devido perda de

expressão em membrana celular e presença de expressão em citoplasma e núcleo dessa

molécula, em CEC de esôfago (Situ et al., 2010), carcinoma hepatocelular (Zulehner et

al., 2010), CEC de laringe (Galera-Ruiz et al., 2012) e adenocarcinoma de pulmão (Kim

et al., 2013), dentre outras neoplasias. Embora existam trabalhos que tenham observado

alterações de expressão dessa molécula, a associação com os dados clínico-patológicos

não foi relatada (Freitas Rde et al., 2010; Ronkainen et al., 2010). Além do mais, o

papel da β-cat como supressor tumoral, quando expressa em núcleo e citoplasma,

também já foi evidenciado na literatura tornando ainda esse tema mais controverso

(Arozarena et al., 2011).

Page 24: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

23

1.3.3 Via Wingless-int

Os genes e proteínas da via Wnt são reguladores da proliferação e diferenciação

celular, e a suas vias de sinalização envolvem proteínas que participam diretamente da

transcrição gênica e adesão celular. A via Wnt participa ativamente no desenvolvimento

embrionário e no mecanismo homeostático em tecidos adultos. Porém, também está

envolvida em processos neoplasicos, tendo sido descoberta inicialmente como um

proto-oncogene (Nusse e Varmus, 1982).

Atualmente são conhecidos 19 genes participantes da via Wnt, que podem ser

divididos em duas classes: a que funciona por meio da sinalização da β-catenina (via

canônica) e a independente de β-cat, que compreende as vias não-canônicas. A via

canônica é a mais estudada (Johnson e Rajamannan, 2006; Iwai et al., 2010).

Na ausência do ligante Wnt, os níveis de β-cat no interior da célula são

fortemente regulados e mantidos baixos (Liu e Millar, 2010). Na presença do ligante

Wnt, a β-cat que se acumula no citoplasma sofre translocação para o núcleo, onde

interage com o fator de célula T (FCT)/ fator potencializador linfóide (FPL), ativando a

transcrição de genes alvos (Terry et al., 2006), Dentre os genes alvo transcrito pela via

Wnt/canônica estão oc-myc, (conhecido como um oncogene), o CD44 (participa da

adesão célula-matriz), a MMP-7 (uma enzima que participa da degração da matriz

extracelular) e Ciclina D1 (reguladora do ciclo celular). A importância desses genes no

CEC oral e em outras neoplasias também já foi relatada (Do, Park e Lim, 2004; Chuang

et al., 2008; Le Bras et al., 2011; He et al., 2012; Rajarajan et al., 2012; Lu et al., 2013)

Page 25: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

24

Figura 3: Esquema simplificado da via de sinalização Wnt/β-catenina. Na

ausência da atuação da Via de sinalização Wnt/canônica(Esquerda) a β-cat

citoplasmática está associada com polipose adenomatosa coli (APC) e proteínas Axin, e

é fosforilada por glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) e caseína quinase I (CKI) sob

essas condições, o fator potencializador linfóide (LEF) e fator de células t (TCF

transcrição no núcleo estão associados com os co-repressores da transcrição, tais como

Groucho, e a transcrição de genes alvo Wnt é reprimida. Quando ocorre a associação do

ligante WNT ao receptor (FZD) Frizzled, a fosforilação da β-cat é inibida, permitindo

que esta molécula se acumule no citoplasma e seja translocada para o núcleo. No núcleo

β-cat interage com o fator potencializador linfóide (LEF) e fator de células t (TCF) e

outros co-activadores transcricionais para iniciar a transcrição de genes alvo como a

MMP-7, c-myc, ciclina D1 e CD44 (Liu e Millar, 2010).

1.3.4 Via de Transição Epitélio-Mesenquimal

A via TEM é um processo que precede a invasão e progressão tumoral, que

envolve a diminuição da expressão de proteínas como a E-caderina, bem como a perda

de polaridade apical-basal, reorganização do citoesqueleto, a aquisição de um fenótipo

semelhante aos fibroblastos com o aumento de expressão de proteínas mesenquimais

(Baum, Settleman e Quinlan, 2008; Mandal et al., 2008).

Page 26: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

25

A via TEM participa da embriogênese, onde é indispensável para a diferenciação

e migração de células especializadas e para a formação da complexa estrutura dos

órgãos internos; do reparo tecidual e fibrose, contribuindo com a geração de fibroblastos

na idade adulta; e está presente na progressão de diversas neoplasias, induzindo um

fenótipo mesenquimal às células de origem epitelial e contribuindo para o aumento da

motilidade celular, capacidade de invasão dos tecidos adjacentes e consequentemente

para a metástase (Guarino, 2007; Nakamura e Tokura, 2011).

As células epiteliais normais são polarizadas e fortemente ligadas umas às outras

por junções intercelulares mediadas por E-caderina o que impede a motilidade dessas

células (Mandal et al., 2008). Durante a transição epitélio mesenquimal ocorre à

diminuição de expressão de E-caderina e consequente perda das junções intercelulares,

o que causa dissociação das células adjacentes, além disso, há o aumento de expressão

de proteases degradadoras da matriz extracelular e de proteínas comumente expressas

pelas células mesenquimais, como a vimentina, N-caderina e actina de músculo liso o

que confere a aquisição características mesenquimais ás células de origem epitelial,

tornando-as capazes de migrar e invadir tecidos adjacentes (Nakamura e Tokura, 2011).

Figura 4: Modelo esquemático simplificado do processo de transição epitelio-

mesenquimal (EMT). Vários fatores, tais como TGF-b, EGF e a via Wnt/ β-catenina

atuam numa cascata de sinalização induzindo a expressão de fatores de transcrição

(dentre os quais estão SNAI1, SNAI2 TWIST1) nas células epiteliais, que por sua vez

conduzem à diminuição da expressão de E-caderina (codificada pelo gene CDH1),

o aumento da expressão de N-caderina (codificada pelo gene CDH2), vimentina e

Page 27: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

26

fibronectina e reorganização do citoesqueleto induzindo a aquisição de características

morfológicas e funcionais das células mesenquimais. Adaptado de Nakamura et al.2011

(Nakamura e Tokura, 2011).

1.3.4 Integrina α2β1

A integrina α2β1 é um receptor de colágeno e laminina que é expressa por

células endoteliais, plaquetas (Kasirer-Friede, Kahn e Shattil, 2007), algumas células do

sistema imunológico como os linfócitos T, células Natural Killer e mastócitos (Mccall-

Culbreath, Li e Zutter, 2008; Boisvert et al., 2010), fibroblastos (Tsai, Lin e Chao,

2013), e no epitélio, é predominantemente expressa na membrana celular de

queratinócitos da membrana basal (Watt, 2002). Esta molécula participa da organização

da matriz extracelular e do citoesqueleto, modulação da migração celular (Watt, 2002;

San Antonio et al., 2009) e inflamação (Mccall-Culbreath, Li e Zutter, 2008).

A integrina α2β1 também pode interagir heterotipicamente com a E-cad

possivelmente participando do processo de regulação da adesão célula-célula e

consequentemente da estratificação e arquitetura celular (Whittard et al., 2002).

Alterações na expressão desta integrina já foram associadas a diversos processos

patológicos como sangramentos (Nieuwenhuis et al., 1985) e formação de coágulos

patológicos (Carlsson et al., 1999), doenças autoimunes (Mccall-Culbreath, Li e Zutter,

2008) e a progressão de diversas neoplasias malignas como, câncer de ovário (Shield et

al., 2007), mama (Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012), próstata (Ramirez et al.,

2011), melanoma (Vuoristo et al., 2007) e carcinoma de células escamosas (Tran et al.,

2011).

O papel da Integrina α2β1 na metástase das células neoplásicas não está claro.

Vários estudos in vivo e in vitro com diferentes desenhos metodológicos apresentam

resultados conflitantes (Shield et al., 2007; Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012).

Haidari et al. (2012) demonstraram em um estudo in vitro com linhagens de células

neoplásicas de mama altamente invasivas e não invasivas que esta molécula de adesão é

responsável por desencadear o processo de ligação das células mamárias neoplásicas

invasivas ás células endoteliais, o que por sua vez, contribui para a ruptura das junções

Page 28: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

27

aderentes endoteliais e induz a migração transendotelial das células invasivas o que

facilitaria o processo metástatico em carcinoma de mama (Haidari et al., 2012).

Com resultados contrários Ramirez et al, (2011) em uma investigação em

modelos animais e espécimes humanos de câncer de mama relataram que a perda de

expressão desta integrina contribuiu para a invasão vascular e para o processo

metastático e estava associada a menor sobrevida. Em outra investigação relatada no

mesmo trabalho foi avaliada a expressão gênica da subunidade α2 em espécimes

humanos de próstata normal, neoplasia intra-epitelial prostática (NIP), câncer de

próstata e células metastáticas de câncer de próstata e o nível de expressão do gene de

integrina α2 apresentou menor expressão em NIP e câncer de próstata em comparação a

próstata normal e maior diminuição de expressão nas células metastáticas em

comparação aos outros grupos. A diminuição de expressão desta integrina foi um

preditor de metástase e menor sobrevida. Segundo os autores, estas observações

sugerem que a integrina α2β1 é um supressor de metástase nas neoplasias de mama e

próstata (Ramirez et al., 2011), o que demonstra a controvérsia ainda existente a

respeito do papel dessa molécula na progressão das neoplasias.

1.3.5 Integrina α3β1

A integrina α3β1 é um ligante preferencial de laminina-5, mas também pode

interagir com colágeno (tipos I e IV), fibronectina, laminina-1 e entactina/nidogênio.

Dentre os locais onde esta integrina é altamente expressa está a membrana basolateral

de queratinócitos basais na epiderme onde atua na organização da matriz extracelular,

na angiogênese, nos processos de reparo tecidual (Kreidberg, 2000; Mitchell et al.,

2009) e também na migração celular e na produção de metaloproteinases (Kreidberg,

2000; Ziober, Silverman e Kramer, 2001).

Estudos prévios atestaram como a sinalização mediada por esta integrina pode

regular respostas biológicas complexas em múltiplos níveis para determinar a

morfologia e comportamento celular (Wang et al., 1999; Chattopadhyay et al., 2003).

Em uma investigação in vitro com culturas celulares provenientes de dúctos renais de

camundongos com deficiência de integrina a3β1 Wang, et al (1999) comprovaram que

Page 29: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

28

esta molécula participa da adesão intercelular e da organização do citoesqueleto, sendo

a função do complexo caderina-catenina dependente da expressão da integrina a3β1

(Wang et al., 1999). Posteriormente, Chattopadhyay et al. (2003) demonstraram que

esta integrina se associa à proteína transmembrana tetraspanina CD151 (proteína de

superfície celular que está envolvida na diferenciação e mobilidade celular) formando

um complexo estável que promove a associação do complexo caderina-catenina ao

citoesqueleto de actina e também é capaz de estimular a adesão intercelular

(Chattopadhyay et al., 2003).

Além disso, Hodivala-Dilke et al (1998) em um estudo com modelos animais

compararam a capacidade adesiva e migratória de queratinócitos de camundongos

normais e com deficiência de expressão de integrina a3β1 demonstraram que os

queratinócitos que não expressavam integrina a3β1 apresentaram maior migração e

melhor adesão que os queratinócitos normais aos componentes da MEC que são ligantes

preferenciais de outras integrinas, como o colágeno tipo I, a laminina-1 e

fibrolectina,em detrimento à laminina 5. Assim, os autores sugerem que esta molécula

pode estar associada à regulação da função de outras integrinas (Hodivala-Dilke et al.,

1998).

O papel da integrina α3β1 no desenvolvimento e metástase de neoplasias tem

sido amplamente investigado. O aumento da expressão dessa molécula foi associado

com a recorrência do tumor em carcinoma de próstata (Pontes-Junior et al., 2010),

menor grau de diferenciação celular em carcinoma adenoide cístico (Miguel et al.,

2012) maior invasividade e ocorrência de metástase em câncer de mama (Morini et al.,

2000; Mitchell et al., 2010). Além disso, a participação desta integrina na Via TEM

também tem sido relatada. Em um estudo in vito, Kim et al. (2009) descreveram que

esta integrina coordena a interação entre as vias de sinalização mediadas pela β-cat e

Smad regulando a resposta do TGF-β e participando da ativação da via TEM (Kim et

al., 2009). Entretanto, vários outros estudos que investigaram o papel desta molécula de

adesão em diversas neoplasias, como: carcinoma de mama, carcinoma espinocelular

oral, carcinoma de cólon e carcinoma de próstata também relatam a possível

participação dessa molécula como supressor tumoral (Dedhar et al., 1993; Gui et al.,

1995; Hashida et al., 2002; Ohara et al., 2009). Assim, não existe consenso a respeito

do papel integrina α3β1 na progressão tumoral.

Page 30: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

29

1.3.6 Relação da E-caderina e β-catenina e Integrinas α2β1 e α3β1 com o CEC oral

O papel da E-caderina e da β-catenina na evolução e prognóstico no CEC oral

vem sendo amplamente discutido (Diniz-Freitas et al., 2006; Mahomed, Altini e Meer,

2007; Cai et al., 2008; Vered et al., 2012). Diniz-Freitas et al. (2006) avaliaram a

expressão de E-caderina em 47 casos de CEC oral e relatou que a expressão fraca ou

ausente desta proteína foi associada a um padrão histológico mais invasivo e à

metástase regional (Diniz-Freitas et al., 2006).

Mahomed et al. (2007) realizaram a análise imunohistoquímica em amostras de

CEC de 30 pacientes sendo 19 com metástase linfonodal e 11 livres de metástase com o

objetivo de investigar o papel E-caderina e da β-catenina como marcadores de metátase

linfonodal e afirmaram que as duas proteínas desempenham um importante papel na

perda de diferenciação e evolução do CEC, embora não tenha sido possível associa-las a

presença de metástase (Mahomed, Altini e Meer, 2007).

Em um estudo realizado por Lopes et al. (2009) por meio da técnica de

imunoistoquímica foi avaliada a expressão de E-caderina e β-catenina em 15 CECs de

lingua e 15 CECs de lábio inferior e observaram que não houve associação entre

diferenças na expressão dessas proteínas e o sítio da lesão, ou a presença de metástase

linfonodal nodal, porém houve associação significativa entre a diminução da expressão

dessas proteínas na membrana citoplasmática e o maior grau de invasividade tumoral

(Lopes et al., 2009).

Em uma investigação realizada por Cai et al. (2008), no qual foram avaliados 76

casos de CEC oral foi observada uma associação significativa entre a baixa expressão

em membrana citoplasmática de β-catenina e a presença metástase linfonodal. Nesta

investigação a expressão de β-cat também foi investigada em 16 linfonodos metastáticos

de CEC e foi ausente em 13 amostras. Os autores concluíram que a avaliação da

expressão β-catenina é útil do ponto de vista clínico, especialmente para selecionar os

pacientes que necessitam de esvaziamento cervical, além do mais, esses pacientes

devem ser submetidos a um minucioso acompanhamento (Cai et al., 2008).

Page 31: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

30

A contribuição das integrinas α2β1 e α3β1 na progressão do CEC oral também

tem sido investigada e aparentememte essas moléculas participam ativamente da

carcinogênese embora seu papel não esteja completamente elucidado (Dyce et al., 2002;

Nagata et al., 2003; Kurokawa et al., 2008; Ohara et al., 2009; Amaral Pereira et al.,

2013). Segundo Zhang et al. (2006), em um estudo in vitro, a perda de expressão da E-

caderina está associada a conversão de lesões pré-malígnas em CEC por meio de

invasão incipiente das células tumorais, sendo que a perda de função da E-caderina está

associada ao aumento de adesão célula-matriz que parece estar associada ao aumento de

expressão imunoistoquímica das subunidades de integrina α2, α3 e β1 (Zhang et al.,

2006).

Ohara et al. (2009), analizaram a expressão imunohistoquímica das subunidades

α3, α6 e β1 de integrinas no fronte de invasão tumoral em 100 casos de CEC oral, os

autores constataram que pacientes que apresentaram altos níveis de expressão (>50%)

dessas subunidades de integrina tiveram sobrevida maior do que aqueles com baixos

níveis de expressão (≤ 50%). A diminuição da expressão da subunidade β1 também

apresentou correlação positiva com menor grau de diferenciação celular e a diminuição

da expressão das subunidades α3 e β1 foram relacionadas a presença de metástase

linfonodal (Ohara et al., 2009).

Amaral Pereiraet al. (2012) investigaram a imunoexpressão das integrinas α2β1,

α3β1 e α5β1 em 15 casos de CEC de língua e 15 de lábio e relataram uma forte

imunomarcação predominantemente citoplasmática e granular nos casos estudados.

Neste estudo não foi observada associação entre a expressão das integrinas e o sítio

anatômico investigado, a presença de metástase e o grau de diferenciação celular Porém,

os autores afirmam que a imunoexpressão atípica presenciada em citoplasma celular,

que contrasta com a expressão em queratinócitos normais (somente em membrana),

sugere um aumento na expressão dessas proteínas e uma participação ativa dessas

moléculas de adesão na evolução do CEC, além do mais, provavelmente outras funções

dessas integrinas além das adesivas, como a regulação da proliferação e sobrevivencia

celular estão sendo requeridas pelas células neoplásicas (Amaral Pereira et al., 2013).

Considerando, portanto que as integrinas α2β1, α3β1, a E-caderina e β-catenina

desempenham importantes papéis tanto nos tecidos normais quanto no desenvolvimento

de inúmeras neoplasias (Quadro 1) e que seu papel na progressão e metástase no CEC

Page 32: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

31

oral ainda não foi completamente elucidado, a hipótese que fundamentou este estudo foi

que a baixa expressão de E-cad e β-cat em membrana citoplasmática bem como o a

presença de expressão dessas moléculas em citoplasma e núcleo associadas a um alta

expressão das integrinas α2β1 e α3β1 estão associadas a ocorrencia de metástase

linfonodal. .

Page 33: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

[Digite texto]

Quadro 1: Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias.

Tecidos Normais Neoplasias

Expressão Função Expressão Função

E-caderina Membrana citoplasmática

celular nas camadas

espinhosas inferiores e

nas células da camada

basal (Bankfalvi et al.,

2002).

Adesão célular e arquitetura

tecidual,

Diferenciação, crescimento,

polaridade e migração celular

(Larue et al., 1996).

Membrana citoplasmática;

Expressão em citoplasma e

núcleo (Audard et al.,

2008; Chetty e Serra,

2008b; Berx e Van Roy,

2009)

Em membrana atua como supressora tumoral

(Berx e Van Roy, 2009)

Em citoplasma associada ao crescimento

tumoral e migração celular (Audard et al.,

2008)

Em núcleo pode atuar como fator inibidor de

apoptose e já foi associada à invasão

metástase linfonodal e metástase á distância

(Ferber et al., 2008 Vered et al., 2012;

Chetty, Serra e Asa, 2008)

β-catenina

Citoplasma celular na

região submembranosa

em queratinócitos em

tecidos epiteliais (Xu e

Kimelman, 2007).

Participação no complexo

caderina-catenina atuando na

adesão célula-célula e

manutenção da arquitetura

celular (Oyama et al., 1994)

Região submembranosa;

Presença de expressão em

citoplasma

e núcleo (Oyama et al.,

1994) .

Em região submembranosa atua como

supressora tumoral (Oyama et al., 1994).

Em citoplasma e núcleo participação na via

Wnt e está associada a maior invasividade e

metástase (Xu e Kimelman, 2007; Cai et al.,

2008; Han, R. et al., 2013)

31

Page 34: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

32

Quadro 1: Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias (continuação).

Tecidos Normais Neoplasias

Expressão Função Expressão Função

Integrina α2β1

Membrana citoplasmática celular

em plaquetas, algumas células do

sistema imunológico como os

linfócitos T, células Natural Killer

e mastócitos, fibroblastos e

queratinócitos da membrana basal

(Watt, 2002; Kasirer-Friede, Kahn

e Shattil, 2007; Mccall-Culbreath,

Li e Zutter, 2008; Boisvert et al.,

2010; Tsai, Lin e Chao, 2013)

Organização da matriz extracelular

e do citoesqueleto, adesão célula-

célula, modulação da migração

celular e inflamação (Watt, 2002;

Whittard et al., 2002; San Antonio

et al., 2009; Mccall-Culbreath et

al., 2011).

Expressão em membrana;

Expressão citoplasmática

relatada (Haidari et al.,

2012; Amaral Pereira et

al., 2013).

Aumento de expressão

associado tanto a invasão

quanto a supressão tumoral

(Ramirez et al., 2011; Haidari

et al., 2012)

Integrina α3β1 Membrana basolateral de

queratinócitos basais nos tecidos

epiteliais (Kreidberg, 2000;

Mitchell et al., 2009)

Organização da matriz extracelular,

angiogênese, reparo tecidual,

migração celular, produção de

metaloproteinases, organização do

citoesqueleto, regulação da função

de outras integrinas (Hodivala-

Dilke et al., 1998; Wang et al.,

1999; Chattopadhyay et al., 2003)

Membrana celular;

Expressão

citoplasmática

relatada (Zhang et

al., 2006; Amaral

Pereira et al., 2013).

Aumento de expressão associado a

maior invasividade tumoral, maior

recorrência e metástase, porém

atividade como supressora tumoral

também é relatada. (Dedhar et al.,

1993; Gui et al., 1995; Hashida et

al., 2002; Ohara et al., 2009;

Miguel et al., 2012)

Page 35: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

34

2 JUSTIFICATIVA

Os critérios que justificaram a realização desta investigação são apresentados abaixo:

1. A necessidade da busca de marcadores que possibilitem o maior entendimento do

processo de metástase do CEC de boca, uma vez que este está relacionado a um pior

prognóstico (Arduino et al., 2008; Jan et al., 2011; Noguti et al., 2012).

2. A controvérsia de dados encontrados na literatura que indicam a participação dessas

moléculas de adesão na progressão e metástase do CEC oral e em outras neoplasias

(Becker et al., 1999; Carneiro et al., 1999; Choi et al., 2003; Diniz-Freitas et al., 2006;

Cai et al., 2008; Chetty, Serra e Asa, 2008; Berx e Van Roy, 2009; Ohara et al., 2009;

Freitas Rde et al., 2010; Chaw et al., 2012; Haidari et al., 2012; Vered et al., 2012;

Amaral Pereira et al., 2013)

3. A escassez de trabalhos investigando a expressão de E-cad, β-cat e integrinas α2β1

e α3β1 em conjunto em casos de CEC oral.

Page 36: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

35

3 OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Investigar por meio de imunihistoquímica a expressão de E-cad, β-cat, Integrina

α2β1 e α3β1 em amostras de CEC de cavidade oral sem e com metástase linfonodal, e

nas células metastáticas linfonodais e correlacionar com dados clínico-patológicos.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Comparar a expressão de E-caderina, β-catenina e integrinas α2β1 e α3β1 no

parênquima tumoral no centro da lesão, fronte de invasão tumoral e nas células

metastáticos dos linfonodos positivos.

2. Verificar se há associação entre a expressão destas moléculas e o processo de

metástase linfonodal.

3. Investigar a relação da expressão dessas quando presentes em membrana

citoplasmática, citoplasma e núcleo.

4. Investigar a relação entre a expressão das moléculas e as variáveis clinico-

patológicas.

5. Investigar a relação entre a presença de metástase linfonodal e a sobrevida dos

pacientes.

Page 37: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

36

4 METODOLOGIA

4.1 OBTENÇÃO, SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Esta pesquisa é um estudo de coorte retrospectivo que foi aprovado pelo Comitê

de Ética em Pesquisa da UFG protocolo nº 337/11 e Comitê de Ética em Pesquisa

(CEP) do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás

(HAJ/ACCG) protocolo nº 002/2012 (Anexos A e B).

Para este estudo foram selecionadas amostras teciduais de lesões primárias de

CEC de cavidade oral não metastáticos e metastáticos representados pelos linfonodos

cervicais de pacientes submetidos à cirurgia no período de 2001 a 2004 no Serviço de

Cabeça e Pescoço, contidas em blocos parafinados, arquivados no laboratório de

anatomopatologia do HAJ/ACCG.

Considerando as amostras de CEC selecionadas, três grupos foram constituídos:

grupo 1- amostras de CEC primário de cavidade oral não metastático; grupo 2- amostras

de CEC primário com metastase linfonodal e 3- amostras de linfonodos cervicais

positivos do grupo 2.

Como critério de inclusão foram selecionados casos de CEC oral incluidos em

blocos parafinados em bom estado de conservação e com tecido suficiente e prontuários

que contesse informações clinicas-patológicas e demográficas pertinentes ao estudo.

Como critérios de exclusão foram considerados: blocos defeituosos e prontuários

com dados incompletos; CEC de outra localização; casos sem seguimento clínico e

blocos de casos que foram submetidos a tratamentos prévios antes da remoção cirúrgica

da lesão (quimioterapia e ou radioterapia etc); e casos de recidivas.

Para definição das amostras os casos selecionados foram revisitados por 02

patologistas experientes (A.C.B e R.C.G.A) que confirmaram o diagnóstico registrado

no Serviço de anatomopatológica, tanto do tumor primário quanto dos linfonodos

comprometidos. A amostra total do estudo foi de 40 casos CEC oral, sendo 18 não

metastáticos e 22 metastáticos.

As características clínicas analisadas foram: idade, gênero, tabagismo, etilismo,

tamanho da lesão primária (T) segundo a classificação TNM (Brasil, 2004); localização

Page 38: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

37

da lesão primária; sobrevida (tempo em meses obtido a partir da data do diagnóstico até

a última data de seguimento ou óbito do paciente), ocorrência de recidiva e a presença

ou não de metástase em linfonodos.

As características microscópicas consideradas foram: gradação tumoral segundo

OMS (Pindborg et al., 1997) e a imunoexpressão de E-cad, β-cat, Integrinas α2β1 e

α3β1 no parênquima tumoral e nas células neoplásicas presente nos linfonodos

comprometidos.

4.2 TÉCNICAS EMPREGADAS

4.2.1 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina)

O material selecionado, incluído em parafina, foi seccionado em micrótomo

(Leica RM2165), obtendo-se de cada bloco cortes consecutivos de 5μm, que foram

colocados sobre lâminas histológicas e corados pelo método de Hematoxilina e Eosina

(HE). Esses cortes foram utilizados para confirmação e caracterização microscópica das

amostras.

4.2.2 Técnica de Imuno-histoquímica

Cortes seriados de 3µm foram obtidos e estendidos sobre lâminas de vidro

silanizadas (A3648 - EasyPath) e submetidos à técnica imunoistoquímica para a

identificação dos seguintes antígenos: E-caderina, β-catenina e Integrinas α2β1 eα3β1.

Inicialmente, os cortes sobre as lâminas foram desparafinizados e hidratados por

meio de: 1-xilol, 3 vezes, 10 minutos cada vez; 2-álcool absoluto, 3 vezes, 2 minutos

cada vez; 3-álcool etílico 95% 1 vez, 2 minutos; 4- alcool etílico 70% uma vez, 2

minutos;5- solução salina tamponada (PBS), Ph=7.2 2 vezes, 1 minuto; 6- água

destilada aquecida, 2 minutos.

Para a exposição antigênica as lâminas foram incubadas a 95°C com auxílio de

Banho Maria Digital (DeLeo) por 25 min (Quadro 2), porteriormente foram retiradas do

Banho Maria Digital e permaneceram em temperatura ambiente por 10 minutos para

resfriamento progressivo (E-cad, β-cat e integrina α3β1) ou incubadas em estufa a 37°C

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38

por 30 minutos (integrina α2β1). Imediatamente foram lavadas em PBS e foram

incubadas em solução de Peroxido de Hidrogênio 3% por 30 min para bloqueio da

peroxidase endógena e lavadas novamente com PBS.

Em seguida para o bloqueio das ligações proteicas inespecíficas as lâminas

foram incubadas no reagente Background Sniper do Kit MACH4– Universal HRP-

Polymer kit (BioCare, USA) (E-cad); Protein Block Serum Free do Kit

CSA, Catalyzed Signal Amplification System (Dako, USA) (Integrina α2β1 e α3β1); e

PBS-BSA (β-cat). Imediatamente as lâminas foram incubadas com os anticorpos

primários, por 18horas e mantidas na temperatura de 4°C. Todas as diluições foram

realizadas utilizando solução de soro albumina bovina diluída em PBS (PBS-BSA) a

1%. As diluições dos anticorpos foram determinadas em etapa de padronização (Quadro

2).

Após o período de incubação com os anticorpos primários foram realizadas

lavagens consecutivas com PBS e, posteriormente as lâminas foram incubadas com

soluções pós-anticorpo de cada Kit de anticorpo secundário de acordo com as

especificações do fabricante (Quadro 2). Novamente as lâminas foram lavadas com

PBS, e a seguir, procedemos à revelação da reação utilizando o 3.3’- Diaminobenzidina

(DAB) em uma solução cromogênica à temperatura ambiente (Quadro 2). A reação foi

interrompida com água destilada e as lâminas contra-coradas com hematoxilina por 20

segundos, á temperatura ambiente. Após serem lavadas em água corrente por 10

minutos, as lâminas foram desidratadas com álcoois: 1- álcool 70%, uma vez por 1

minuto; 2- alcool 95%, uma vez por 1 minuto; 3- ácool absoluto, 3 vezes por 1 minuto e

passadas em xilol por 2 minutos e montadas com solução de resina não aquosa

(entellan-Mikroskopie-Merck). O controle positivo foi feito com amostras de

hiperplasia fibrosa da mucosa oral, e o controle negativo foi obtido omitindo o

anticorpo primário que foi substituído por uma solução de 1% de PBS-BSA.

.

Page 40: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

38

Quadro 2: Protocolos e especificações dos anticorpos primários, secudários e reagentes utilizados na técnica de imuno-histoquímica.

Antígeno Anticorpo primário Diluição e tempo de

incubação

Anticorpo secundário Exposição

antigênica

Tempo de exposição ao

DAB

E-caderina Anti-E-caderina humana

(clone NCH-38, Dako,

USA)

1:200 por 18 horas MACH4– Universal

HRP-Polymer kit

(BioCare, USA)

Tampão citrato,

pH=6.0 a 95oC por

25 min

2 minutos

β-catenina Anti-β-catenina humana

(clone E-5, Santa Cruz

Biothecnology, Santa

Cruz, C.A. USA)

1:100 por 18 horas Universal LSAB™+

Kit/HRP, Rb/Mo/Goat

(Dako, USA)

EDTA Tris Base

pH=9.0 a 95oC por

25 min

5 minutos

Integrina α3β1 Anti-intergrina humana

α3β1 (clone M-KID2

Chemicon

International,Temeluca,

C.A., USA)

1:50 por 18 horas CSA, Catalyzed Signal

Amplification System

(Dako, USA)

Tampão citrato,

pH=6.0 a 95oC por

25 min

3 minutos

Integrina α2β1 Anti-integrina humana

α2β1 (clone BHA2,1

Chemicon International,

Temeluca, C.A., USA)

1:50 por 18 horas CSA, Catalyzed Signal

Amplification System

(Dako, USA)

Pepisina 0,5% a

37° por 30 min

2 minutos

Page 41: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

40

4.3 ANÁLISE QUALITATIVA E SEMI-QUANTITATIVA DOS DADOS

As amostras, submetidas à técnica da imuno-histoquímica, foram avaliadas

considerando as células E-cad+, β-cat

+, Integrina α2β1

+ e Integrina α3β1

+. As análises

foram realizadas utilizando microscópio óptico para cinco examinadores Axio

ScopeA1 (Carl Zeiss International) na objetiva de 400x por dois examinadores

simultaneamente. Eventuais desacordos foram discutidos até que se obtivesse consenso.

Na análise qualitativa a nos tumores primários foram investigadas a presença de

expressão em membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo, tanto no Centro da Lesão

(CL) quanto no Fronte Invasão Tumoral (FIT) e nas Células Neoplasicas nos Linfonodos

Metastaticos (CNLM).

Na análise semi-quantitativa, para cada amostra, foram analisados 5 campos

microscópicos alternados nas regiões de CL ,FIT e nas células neoplásicas CNLM. A partir

dos resultados os casos foram agrupados de acordo com a porcentagem de células que

apresentaram marcação positiva sendo alocados em: baixa expressão ≤ 50% e alta

expressão > 50% de acordo com o preconizado por estudos anteriores (Kurtz et al., 2006;

Foschini et al., 2008; Ohara et al., 2009).

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os dados foram armazenados e submetidos aos testes estatísticos no software

estatístico SPSS versão 17.0 para Windows. A análise comparativa foi realizada entre o

grupo 1 e o grupo 2 e entre o grupo 2 e o grupo 3 por meio dos testes estatísticos Qui-

quadrado e Teste exato de Fisher. O teste de correlação de Sperman foi utilizando para

investigar a correlação entre a expressão das moléculas investigadas. O teste de Kaplan-

Meier seguido de Log-Rank foi utilizado para estimar a sobrevida dos pacientes em relação

à expressão das moléculas e em relação a presença de metástase. O nível de significância

estatística considerado foi p< 0,05.

Page 42: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

41

5 PUBLICAÇÃO

Título da Publicação:

Immunoexpression of E-cadherin, β-catenin α2β1 and α3β1 integrins in oral

squamous cell carcinoma and metastatic lymph nodes

Formatação da publicação seguindo as normas da revista Tumor Biology.

Page 43: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

42

Immunoexpression of E-cadherin, β-catenin α2β1 and α3β1 integrins in oral

squamous cell carcinoma and metastatic lymph nodes

Mariana Silveira Soaresª; Juliana Andrade Mendonçab; Marília Oliveira Moraisª; Claudio

Rodrigues Lelesc; Aline Carvalho Batista,

d; Elismauro Francisco de Mendonça

d

ª DDS; Graduate Student of Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás,

Brazil

b Undergrate student of Medical School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brasil

c DDS, MS, PhD; Professor of Department of Restorative Dentistry, Dental School, Federal

University of Goiás, Goiânia, Brazil

d DDS, MS, PhD; Professor of Department of Stomatology (Oral Pathology and

Radiology), Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil

Correspondence to:

Elismauro Francisco de Mendonça

Disciplina de Patologia Geral e Bucal, Faculdade de Odontologia,

Universidade Federal de Goiás

Praça Universitária S/N

Setor Universitário CEP: 74605-220

Phone/Fax: +55 62 3209 6327

E-mail: [email protected]

Page 44: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

43

Abstract

The E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles in

cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several neoplasms.

Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC) progression and

metastasis remains controversial. The aim of this study was to investigate the

immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-metastatic and

metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph nodes. Molecules’

immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in Lesion’s Center (LC),

Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells (MLNC) and classified as

low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low cytoplasmic membrane

expression of E-cadherin and high cytoplasmic expression was observed in LC and in the

ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-catenin presented significantly

lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic OSCC (P= 0.013) and in ITF low

expression was noticed in both groups. Integrins presented highly granular cytoplasmic

expression regardless of the presence of metastasis and in LC or ITF. When molecules’

expression was compared in metastatic OSCC in LC, ITF and MCLN, the E-cadherin and

β-catenin presented a significant decrease of cytoplasmic membrane (P= 0.007 and P=

0.043, respectively) and cytoplasmic expression (P= 0.021 and P= 0.002, respectively).

Integrins presented high cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion,

abnormal expression of E-cad and β-cat with loss of cytoplasmic membrane and high

cytoplasmic expression added to high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrin

contributing to lymph node metastasis in OSCC.

Key-words: oral cancer; squamous cell carcinoma; cell adhesion; lymphatic metastasis.

Page 45: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

44

Introduction

Oral Squamous cell Carcinoma (OSCC) is the most common malignancy of the oral

cavity [1]. This tumor is a biologically aggressive lesion characterized by the ability to

metastasize to regional lymph nodes and by a significant rate of recurrence and mortality

[2]. Lymph node metastasis is present in approximately 40% of patients with OSCC and is

an independent indicator of poor prognosis [3].

E-cadherin (E-cad), a cell adhesion molecule expressed in epithelial tissues, is a

transmembrane glycoprotein that promotes cell adhesion through calcium-dependent

binding to the extracellular domain of E-cad molecules in adjacent cells [4]. This function

depends on association with β-catenin (β-cat), a multifunctional cytoplasmic protein that,

through its association with α-catenin, creates a link between E-cad and the actin

cytoskeleton [5].

The altered immunoexpression of E-cad and β-cat and loss of function of the

cadherin-catenin complex has been associated with several malignant tumors in humans

including OSCC [6-9]. Previous investigations have shown that the loss of E-cad

membranous expression is associated with lymph node metastasis, high invasiveness,

recurrence and poor prognosis [6, 10-12], while the cytoplasmic and nuclear expression

have already been reported in several malignances [13, 14]. Likewise, the loss of β-cat

membranous expression, and cytoplasmic and nuclear accumulation has been reported in

different malignant tumors [15-20]. Furthermore, β-cat participates in two important

pathways present in the progression of neoplasms: the Wingless-wnt signaling pathway

(Wnt), a powerful regulator of cell proliferation and differentiation [21, 22], and Epithelial-

mesenchyme Transition (EMT), which induces a mesenchymal phenotype to cells of

epithelial origin, mainly inducing the loss of E-cad expression and contributing to invasion

and metastasis [23-25]. Notwithstanding, in OSCC, investigations about the relationship

between the immunoexpression of E-cad, β-cat and the occurrence of metastasis have

yielded conflicting results; this remains controversial [19, 20, 26, 27].

Page 46: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

45

Interestingly, it was previously reported that E-cad also interacts with α2β1 and

α3β1 integrins [28, 29], which are cell adhesion molecules expressed in keratinocytes [30,

31] . In normal tissues, α2β1 is a collagen and laminin receptor and α3β1 is a ligand of

laminin-5, which mainly participates in the organization of the extracellular matrix and

cytoskeleton and in the modulation of cell migration [30-32]. Alterations in the expression

of α2β1 and α3β1 integrins and their subunits has been reported in several neoplasms and

both high and low expression have been associated with invasion and metastasis [33-38].

In squamous cell carcinoma, loss of intercellular adhesion mediated by E-cad was

previously linked to elevated cell surface expression of α2, α3 and β1 integrins which was

associated with the conversion of pre-malignancy to cancer in keratinocyte cell lines [39].

Nevertheless, despite evidence that implicates α2β1 and α3β1 in malignancies progression,

little is known about their roles in tumorigenesis or how they regulate malignant cell

behavior; there are few studies that investigate these in OSCC [36, 40].

The aim of the present study was to investigate the immunoexpression of E-cad, β-

cat, α2β1 and α3β1 integrins in OSCC without and with lymph node metastasis and at the

respective metastatic cervical lymph nodes.

Materials and method

Samples

This study was approved by the Federal University of Goiás Ethics Committee for

human subjects, registered under number 339/11. The samples consisted of surgically

excised specimens from forty patients with primary OSCC obtained from the

Anatomopathology Division of Aráujo Jorge Hospital, Association of the Combat of

Cancer of Goiás State, Brazil. For this study, paraffin blocks in good condition and with

sufficient tissue for analysis were included from patients with OSCC submitted to surgery

during 2001 to 2004. Patients with squamous cell carcinoma in other sites, those without

clinical follow-up, and those who received radiotherapy, chemotherapy, or any other

treatment before surgery were excluded from our study. The clinical data and follow-up

information (recurrence, survival date and death) were obtained from medical records.

Page 47: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

46

Considering the samples selected, three groups were formed: 1 - samples of primary non-

metastatic OSCC; 2 - samples of primary metastatic OSCC; and 3- samples of positive

cervical lymph node from group 2.

Light microscopy

Specimens were fixed in 10% buffered formalin (pH 7.4) and were paraffin

embedded. The microscopic features were evaluated from the analysis of one 5-μm section

of each sample, stained with hematoxylin and eosin. The sections were examined by light

microscopy by two pathologists (A.C.B and R.C.G.A) to confirm the presence or absence

of lymph node metastasis and characterize the OSCC. All OSCC sections were graded

according to the World Health Organization (WHO) classification of tumors [41].

Immunohistochemistry technique

Samples investigated in this study were tested for mouse monoclonal E-cadherin

(clone SPM471, Spring Bioscience, C.A. USA; dilution 1:200); mouse monoclonal β-

catenin (clone E-5, Santa Cruz Biotechnology, C.A. USA; dilution 1:100); mouse

monoclonal Integrin α2β1 (clone BHA2,1 Chemicon International, Temeluca, C.A., USA;

dilution 1:50); and mouse monoclonal Integrin α3β1 (clone M-KID2 Chemicon

International, Temeluca, C.A., USA; dilution 1:50). Paraffin-embedded tissues were

sectioned (3 μm) and collected in series on glass slides coated with 2% 3-

aminopropyltriethsilane (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). The sections were

deparaffinized in xylene, rehydrated in decreasing concentrations of alcohol, washed in

buffer saline solution (PBS) (pH 7.2) and then incubated in citrate buffer (pH 6.0) (for anti-

E-cad and anti-Integrin α3β1), or in Tris- EDTA buffer (pH 9.0) (for anti-β-catenin) at

95°C in a digital water bath (DeLeo) for 20 minutes; or with pepsin for 30 minutes in a

37°C stove (for anti-Integrin α2β1) for antigen retrieval. Afterwards, the sections were then

washed as before and immersed in 3% hydrogen peroxide diluted in PBS for 30 min,

washed and incubated in a blocking reagent. They were subsequently subjected to the

Page 48: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

47

primary antibody reaction in a moist chamber overnight at 4°C. After washing in PBS, the

sections were treated with MACH4– Universal HRP-Polymer kit (BioCare, USA) for anti-

E-cadherin; a streptavidin-biotin immunoperoxidase method, (LSAB kit, DAKO,

Carpinteria, CA) for anti-β-catenin; and CSA, Catalyzed Signal Amplification System

(Dako, USA) for anti-α2β1 integrin and anti-α3β1 integrin according to the supplier's

protocol. The slides were then incubated in 3,3’-Diaminobenzidine in a chromogen solution

(Dako) for 2 to 5 min at room temperature. Finally, the sections were stained with Mayer´s

hematoxylin and were covered. The positive control was fibroepithelial hyperplasia from

oral mucosa and the negative control was obtained by omitting the primary antibody that

was substituted by 1% PBS-BSA solution.

Evaluation of immunoreactivity

The staining was evaluated in Lesions’ Center (LC), Tumor Invasion Front (TIF)

and Metastatic Lymph Nodes Cells (MLNC) using a x400 magnification lens in a multi-

view microscope. The evaluation was performed simultaneously by two examiners who

were unaware of the clinical and morphological data. Occasional disagreements were

discussed until consensus was reached.

For the qualitative evaluation the pattern of E-cadherin, β-catenin expression was

considered positive when present in cytoplasmic membrane, cytoplasm and/or nucleus. The

cytoplasmic membrane immunostaining for E-cad and β-cat was considered positive only

when continuous cytoplasmic membrane staining was observed, independent of the

intensity of the staining. Already, the integrin expression was considered positive when

present in the neoplastic cell, independent of the cell region and intensity of the staining.

For the semi-quantitative analysis, five alternate fields were evaluated and the

samples were classified in two categories: low expression (≤50%) and high expression

(>50%) of cells showed positive staining [36, 42, 43].

Statistical analysis

Page 49: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

48

The statistical analysis was performed using SPSS (statistical package for the social

sciences), Windows, version 17.0. The X2 test and Fisher exact test were used to evaluate

the relation between the molecules’ expression pattern in group 1 and 2, the pattern in

group 2 and 3, and between the molecules’ expression pattern and clinicopathological

features. The correlation in the expression patterns among E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 was

performed using Spearman’s test. The Kaplan-Meier estimator was used to investigate the

survival of patients considering metastatic and non-metastatic cases of OSCC. A level of

significance of 0.05 (P<0.05) was adopted for all tests.

Results

Clinical findings

The assessment of 40 patients with OSCC (22 with cervical lymph node metastasis

and 18 without) revealed an age range varying from 24 to 90 (mean = 57) and a

predominance of males (62.5%). Main clinical and microscopic findings are summarized in

table 1.

E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 expression patterns in non-metastatic and metastatic

OSCC.

In LC we observed a higher percentage of low expression of E-cad in the

cytoplasmic membrane in group 2 than in group 1, although there was no statistically

significant difference between the groups. In ITF, both groups presented low expression of

E-cad. A high cytoplasmic expression of E-cad in LC and ITF were observed in both

groups. The nuclear expression was predominantly lower in LC and ITF in both groups.

The β-cat expression in cytoplasmic membrane was significantly lower in group 2

in LC (P=0.013); nevertheless, in ITF, both groups presented low cytoplasmic membrane

expression. The β-cat cytoplasmic expression was predominantly higher in groups 1 and 2

in LC and ITF. Additionally, nuclear expression was low in LC and ITF and there was no

difference between groups 1 and 2.

Page 50: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

49

Integrins presented a high granular cytoplasmic staining and expression in

desmosomes was also observed. There was no significant difference between the integrins

expression in groups 1 and 2 in LC or ITF. These results are summarized in table 2.

E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 expression patterns in metastatic OSCC and in

MLNC

We compared the molecular expression of the neoplastic cells from group 2 with

group 3 (MLNC). The results are summarized in table 3. There was a significant low

expression in the cytoplasmic membrane of E-cad and β-cat in ITF when compared to the

LC region and this low expression of E-Cad and β-cat was also observed in the MLNC.

When the expression of these molecules in the cytoplasm was analyzed, we observed a high

expression in the primary tumoral parenchyma and a lower expression in the MCLN. (fig. 1

and 2).

The α2β1 and α3β1 integrins showed predominantly cytoplasmic immunostaining in

the LC, ITF and MLNC. However, we only observed the presence of staining in

desmosomes in LC and ITF (fig. 3 and 4).

Correlation of expression patterns among E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 in non-

metastatic, metastatic OSCC and MLNC.

When the correlation between molecules expression in group 1, 2 and 3 were

investigated, significant correlations were only observed in group 2. A strong positive

correlation was observed between E-cad expression in the cytoplasm with α3β1 expression

(ρ= 0.860; P= 0.001) and with α2β1 (ρ= 0.975; p < 0.001).

Association of the clinicopathological findings with the expression of E-cadherin, β-

catenin, integrin α2β1 and integrin α3β1

Only recurrence showed an association with high expression of α3β1 in ITF (P=0.004). In

addition, all patients who presented recurrence also exhibited high expression of α3β1. No

significant association was observed between molecular immunoexpression and tumor size,

histological grading or survival. However, it was observed that patients from the metastatic

Page 51: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

50

group had a minor survival rate. With regard to the last follow-up, the mean survival time

was 80.3 months (95% CI = 51.8- 108.7) for patients with non-metastatic OSCC and 38.3

months (95% CI = 15.4-61.2) for patients with metastatic OSCC (P= 0.014).

Discussion

The major determinant of prognosis in cases of OSCC is cervical metastasis [3].

Our data corroborate with these information showing that the presence of metastasis is

associated with low survival. Hence, the comprehension of the metastatic process is

important to the clinical management of OSCC. Our findings demonstrated that metastatic

carcinomas, when analyzing LC, presented significantly lower expression of β-cat in the

cytoplasmic membrane. The expression of E-cad in the cytoplasmic membrane was lower

in metastatic oral SCC, although there was no statistically significant difference between

the two groups. Furthermore, there was a loss of expression in the cytoplasmic membrane

of E-cad and β-cat from LC to ITF in both groups. Interestingly, this loss of expression was

also observed in MLNC. The cytoplasmic expression of E-cad and β-cat was high in

metastatic and non-metastatic carcinomas in the center and invasive front of the tumor and

there was a loss of expression in MLNC, while nuclear expression of both molecules was

predominantly lower, regardless of the presence of metastasis in LC, ITF and MLNC.

Concerning integrins, high expression was detected in LC and ITF in non-metastatic and

metastatic OSCC, and similarly high expression was observed in MLNC.

The association between low cytoplasmic membrane expression of β-cat and lymph

node metastasis was previously reported in OSCC [19, 44, 45]. This association could be

explained by the fact that the β-cat expressed in the cytoplasmic membrane is linked to E-

cad and is essential to the function of this molecule and cell adhesion. Hence, genetic

mutations of β-cat and loss of its expression, despite the normal expression of E-cad,

contribute to the loss of cell adhesion, cell motility and migration [5, 46].

Abnormal β-cat cytoplasmic expression was also observed in our study and,

although was not possible to associate this with the metastasis process in this investigation,

this kind of staining was previously linked to β-cat participation on the transcription of Wnt

pathway target genes such as cyclin D1, matrix metalloproteinase 7 and CD-44, which

Page 52: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

51

participate in cell proliferation, extracellular matrix degradation and cell migration,

respectively, and to the participation of β-cat in the EMT pathway, contributing to tumor

invasion and metastasis [47-49].

E-cad expression in the cytoplasmic membrane was lower in the metastatic group

than in the non-metastatic group; however, no significant statistical difference was

observed. These findings were also reported by Mahomed et al. [50], but contrast with

others studies of OSCC [42, 51]. According to Vered et al. [26], the controversy regarding

E-cadherin immunoexpression and its potential as a prognostic marker is probably due to

the variability of the methods used to assess the immunohistochemical staining and to

factors such as the tumor microenvironment, which may influence the studies’ results.

Interestingly, in our investigation, we observed high E-cad cytoplasmic expression and low

nuclear expression in OSCC in both groups; however, it was not possible to verify

association between these staining patterns and the presence of metastasis.

The low expression in the cytoplasmic membrane and high expression in the

cytoplasm is indicative of the abnormal behavior of neoplastic cells from OSCC [52].

Cytoplasmic expression of E-cad was also observed in pseudopapillary tumor of the

pancreas [13] in glioblastoma [53] and associated to and to loss of cell differentiation of

OSCC [52]. According to Kaur et al. [52] there are several possibilities that may explain

the E-cad cytoplasmic immunostaining, including an increased production rate, and a

failure to translocate or to anchor onto the cell membrane. Furthermore, the release of

intercellular contact E-cad molecules could result in endocytic uptake in membrane

vesicles, which could result in cytoplasmic immunostaining.

Likewise, nuclear expression of E-cad has been reported in numerous neoplasms

[54-57]. The role of E-cad in the nucleus is not clear; however, it is believed that it might

contribute to neoplasm progression as an anti-apoptotic factor [26], and it was previously

correlated to invasion, lymph node metastasis and distant metastasis in pancreatic endocrine

tumor [14]. In OSSC, studies have mainly concentrated their investigations on membranous

staining [42, 50, 58], so evidence about cytoplasmic and nuclear staining is scarce [52, 59].

Our study corroborates this evidence.

Page 53: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

52

Substantial data strongly suggest that neoplastic cells from ITF differ substantially

from neoplastic cells in LC [50, 60, 61]. ITF might consist of the most aggressive cells,

which have the ability to metastasize [62]; hence, we explored the relation between the

molecules’ expression and metastasis in LC and ITF. Despite no differences in expression

being observed in non-metastatic and metastatic groups in ITF, a significant decrease of E-

cad and β-cat cytoplasmic expression was observed in ITF when compared to LC. These

data suggest that the decrease of cytoplasmic membrane expression of these molecules

contributes to invasiveness and thereby to metastasis to lymph nodes, which are similar to

previous investigations [44, 50, 61].

In the present study, the α2β1 and α3β1 integrins presented predominantly higher

granular cytoplasmic expression and their expression was also observed in desmosomes.

Furthermore, there was no difference between integrin expression in LC and ITF.

Cytoplasmic staining for both of these integrins was also observed by Amaral-Pereira et al.

[40], who suggested that this abnormal expression is probably due to an increased

expression of these proteins when compared to normal keratinocytes and that other

functions of integrins, and not only adhesion properties, are required by neoplastic cells.

Additionally, no differences in staining were observed in non-metastatic and

metastatic groups, although the association between these integrins and metastasis has been

reported in OSCC and other carcinomas [34-36]. Interestingly, we observed association

between high α3β1 expression in ITF and the presence of recurrence in OSCC, which was

previously reported in prostate cancer [63] and could suggest the value of this molecule as a

prognostic marker.

In MLNC we observed low expression of E-cad, corroborating the results of Kaur et

al. [52], who reported negative E-cad expression in the majority of lymph nodes evaluated,

however there results contrast with other studies [64, 65] that reported E-cad increased

expression in metastatic lymph nodes, showing the controversies about this issue.

Likewise, in MLNC, low β-cat expression was also observed, which corroborates the

results reported by Cai et al. [19], who reported negative β-cat expression in the majority of

lymph nodes analyzed.

Page 54: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

53

To our knowledge, this is the first study that has investigated the expression of α2β1

and α3β1 in OSCC in primary sites and in MLNC. In lymph nodes, highly positive staining

of α2β1 was observed in lymphocytes; these findings were expected since the expression of

this integrin has been already reported in lymphocytes, where it operates in inflammatory

responses [66, 67]. In MLNC, high expression of both integrins was noticed; this could

indicate that α2β1 and α3β1 actively contribute to cell migration in lymph node metastasis,

as reported by Fennewald et al. [68], who identified the α2β1 and α3β1 integrins as specific

receptors that mediate interactions between tumor cells and laminin under conditions that

are consistent with lymphodynamic flow in head and neck squamous cell carcinoma. This

suggests that these interactions may be critical for tumor cell growth and survival within the

lymph node microenvironment.

When the correlation of molecules’ expression in metastatic OSCC was

investigated, we observed a significant and strong positive correlation between E-cad

cytoplasmic expression and α2β1 and α3β1 integrins at the primary site. Although,

interactions between cadherins and integrins [28, 29, 69] and the association of loss of E-

cad and increased cytoplasmic membrane expression of α2β1 and α3β1 in squamous cell

carcinoma had been previously noticed [39], this is the first investigation that reports a

correlation between cytoplasmic expression of E-cad, α2β1 and α3β1 integrins. This

correlation is probably an indication that the loss of intercellular adhesion due to abnormal

expression of E-cad in neoplastic cells is related to increased adhesion to the extracellular

matrix mediated by integrins, which could contribute to the process of lymph node

metastasis in OSCC.

Conclusion

In conclusion, our results suggest that the abnormal expression of E-cad and β-cat

with loss of expression in the cytoplasmic membrane and high expression in the cytoplasm,

coupled with high expression of integrins α2β1 and α3β1, are related to a loss of

intercellular adhesion, increased adhesion of neoplastic cells to the extracellular matrix and

Page 55: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

54

consequently the greater motility and cell migration, contributing to the process of lymph

node metastasis in oral SCC.

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Page 62: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

61

Acknowledgements

The authors thank the Anatomopathology Division of Araujo Jorge Hospital, Association

of the Combat of Cancer of Goiás State, Brazil.

Page 63: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

62

Table 1. Clinical and pathological data on the patients.

Clinical and microscopic features Patients (%)

Age

<50 37.5

≥50 62.5

Gender

Male 62.5

Female 37.5

Tobacco

Yes 82.5

No 17.5

Alcohol consumption

Yes 70

No 30

Location

Oral tongue 52.5

Floor of the mouth 32.5

Others 15

T stage*

T1-T2 28.9

T3-T4 71.1

Clinical outcome

Dead 60

Alive (overall survival) 40

Lynph node metastasis

Yes 22

No 18

Recurrence

Yes 17

No 23

Histological grading (WHO grade)

I-II 82.5

III-IV 17.5

* 2 missing cases

Page 64: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

63

Table 2: E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins expression pattern in non-metastatic and

metastatic OSCC

Tumors’ Center (%) Invasion Tumor Front (%)

Group 1 Group 2 P-value Group 1 Group 2 P-value

E-cad(CM)

Low 61.1 72.7 0.435ª 100 100 ----

High 38.9 27.3 0 0

E-cad (C)

Low 11.1 22.7 0.297b

22.2 13.6 0.383b

High 88.9 77.3 77.8 86.4

E-cad (N)

Low 88.9 86.3 0.598b

100 100 ----

High 11.1 13.7 0 0

β-cat (CM)

Low 50 86.3 0.013ª* 100 100 ----

High 50 13.7 0 0

β-cat (C)

Low 22.2 4.5 0.115b

33.3 31.8 0.919a

High 77.8 95.5 66.7 68.2

Β-cat (N)

Low 83.3 100 0.083b

100 100 ----

High 16.7 0 0 0

α2β1

Low 0 0 ---- 10 10 0.763b

High 100 100 90 90

α3β1

Low 40 30 0.500b

30 50 0.325b

High 60 70

70 50

Group 1: non-metastatic OSCC; Group 2: metastatic OSCC; Abbreviations: CM,

cytoplasmic membrane; C, cytoplasmic; N, nuclear; a X

2 Test;

b Fisher’s Exact test. *

significant P-value < 0.05.

Page 65: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

64

Table3. Qui-square test for expression of proteins in metastatic OSCC and in MLNC.

TC (%) IT F n (%) MLNC n (%) P- value

E- cad (CM)

Low 72.7 100 95.5 0.007*

High 27.3 0 4.5

E-cad (C)

Low 22.7 13.6 50 0.021*

High 77.3 86. 6 50

E-cad (N)

Low 86.4 100 91 0.220

High 13.6 0 9

β-cat (CM)

Low 86.4 100 100 0.043*

High 13.6 0 0

β-cat (C)

Low 4.5 31.8 54.5 0.002*

High 95.5 68.2 45.5

Β-cat (N)

Low 100 100 100 -----

High 0 0 0

α2β1

Low 0 10 20 0.329

High 100 90 80

α3β1

Low 30 50 20 0.350

High 70 50 80

Abbreviations: TC, tumor’s center; ITF invasive tumor front; MLNC, metastatic lynph

node cells; M, cytoplasmic membrane; C, cytoplasmic; N, nuclear; n, number. * significant

P-value < 0.05.

Page 66: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

*

*

64 C

A

A A

B A

Figure 1, A, B, C: E-cad immunoexpression in LC (A) and ITF

(B) presented low cytoplasmic membrane (arrows), high

cytoplasmic expression and low nuclear expression (asterisks).

In MLNC (C) E-cad showed Low expression in cytoplasmic

membrane, cytoplasm and nucleus. X 400 (A to C).

Page 67: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

Figure 2, A, B, C: β-cat immunoexpression in LC (A) and ITF

(B) presented low cytoplasmic membrane expression (arrows),

high cytoplasmic expression and low nuclear expression

(asterisks). In MLNC (C) β-cat showed Low expression in

cytoplasmic membrane, cytoplasm and nucleus. X 400 (A to

C).

*

*

65 C

A

A A

B A

Page 68: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

Figure 3, A, B, C: The α2β1 integrin presented high granular

cytoplasmic immunoexpression in LC (A), ITF (B) and MLNC

(C). In LC and ITF the α2β1 was expressed in desmosomes

(arrows). In lymph nodes positive immunostainig was observed

in neoplastic cells (asterisks) and in lymphocytes (arrows). X

400 (A to C).

*

66 C

A

B A

A A

Page 69: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

Figure 4, A, B, C: The α3β1 integrin presented high granular

cytoplasmic immunoexpression in LC (A), ITF (B) and MLNC

(C). In LC and ITF the α3β1expression was also observed in

desmosomes (arrows). x 400 (A to C).

67

A A

B A

C A

Page 70: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este foi o primeiro estudo a investigar a imunoexpressão da integrinas α2β1 e

α3β1em CEC oral no sítio primário e nas células neoplásicas dos respectivos linfonodos

metastáticos e a investigar a correlação da imunoexpressão dessa molécula com a E-

caderina e β-catenina.

Além do mais, investigamos a expressão das moléculas de E-caderina e β-

catenina não somente em membrana citoplasmática, onde estão expressas nos

queratinócitos normais, mas também no citoplasma e núcleo onde provavelmente

desempenham outros papeis, que não na adesão celular e que podem ser de grande

importância para a progressão tumoral.

Os nossos resultados sugerem que a expressão anormal de E-cad e β-cat com

perda de expressão na membrana citoplasmática e expressão elevada no citoplasma,

juntamente com a expressão elevada de integrinas α2β1 e α3β1, estão relacionadas com

uma perda de adesão intercelular, aumento da adesão de células neoplásicas á matriz

extracelular e, consequentemente, a uma maior motilidade celular e migração,

contribuindo para o processo de metástase linfonodal no CCE oral.

Estudos futuros são necessários para a elucidação do papel da E-caderina quando

expressa em citoplasma e núcleo, bem como sua relação com as integrinas. Além do

mais, a expressão citoplasmática das integrinas, diferente da expressão normal relatada

em membrana nos queratinócitos, bem como sua contribuição para o CEC quando

expressas em citoplasma também demanda maiores investigações. Assim, o estudo

dessas moléculas de adesão e os mecanismos que contribuem para sua expressão

aberrante, bem como sua participação no CEC representam uma importante linha de

investigação.

Page 71: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

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Page 93: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

ANEXO A- PARECER DO CEP-UFG

Page 94: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

ANEXO B- PARECER CEP- ACCG/ HOSPITAL ARAÚJO JORJE

Page 95: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

ANEXO C- BANCO DE DADOS

casos metastase nodal: 0-não; 1- sim GradaçãoIdade GênenroSítio T- extensão do tumor primário 1- 1; 2- 2; 3- 3; 4- 4; X - 9.N- metástase em linfonodo regional 0- 0; 1- 1; 2- 2; 3- 3; 9- XM- metástase à distância 0- 0; 1- 1; x - 9.TabagismoEtilismodata do laudo do APData da ultima avaliaçãodata do diag. De recidivapresença de recidiva: 0- não 1- simdesfecho 1- óbito; 0- perda de segmento 2- em acompanhamento

1 1 2 68 1 1 3 0 0 1 0 11.02.200404.10.200401.10.2004 0 0

2 1 2 45 2 1 4 0 0 1 1 06.02.200103.03.2001 0 1

3 1 2 53 1 3 4 2 0 1 1 16.12.200225.02.200422.07.2003 1 1

4 1 3 51 1 2 3 0 0 1 1 31.10.200024.08.200115.08.2001 1 1

5 1 2 63 2 1 4 0 0 1 1 26.12.200020.02.2001 0 1

6 1 2 59 1 2 3 1 0 1 1 08.02.200121.01.201017.12.2009 1 0

7 0 2 48 1 2 2 0 0 1 1 23.11.200017.12.2009 0 0

8 0 2 88 2 2 2 2 9 0 0 25.05.200523.05.2007 0 0

9 1 2 35 2 1 1 0 0 1 0 09.12.200211.09.2003 0 1

10 0 3 63 1 2 4 1 0 1 1 15.03.200411.02.2007 0 0

11 0 2 47 1 2 2 0 0 1 1 07.03.200123.09.2012 0 2

12 1 3 40 2 1 4 1 0 1 1 10.12.200231.12.2005 0 1

13 1 2 74 1 2 4 9 0 1 1 11.09.200205.01.2003 0 1

14 0 2 81 1 3 3 1 0 1 1 04.07.200125.11.201025.11.2007 1 0

15 1 2 61 1 1 3 0 0 1 1 15.12.199905.02.200204.04.2001 1 0

16 0 1 67 1 2 2 2 0 1 0 09.08.200013.02.200231.10.2001 1 1

17 1 2 48 2 1 2 1 0 1 1 02.03.200115.06.200305.03.2002 1 1

18 1 3 80 1 2 0 0 01.08.200106.01.2002 0 1

19 1 2 61 1 1 3 0 0 1 1 23.03.200127.09.200411.03.2004 1 0

20 1 2 61 1 2 4 0 0 1 1 03.11.199901.07.200030.05.2000 1 1

21 0 1 57 2 1 4 0 0 0 0 06.11.200019.04.2012 0 2

22 0 2 53 1 2 4 1 0 1 1 26.12.200029.04.200523.10.2002 1 1

23 0 3 90 2 2 3 0 0 0 0 04.11.200313.05.2005 0 0

24 0 3 24 1 2 3 0 0 1 1 26.11.200215.04.2003 0 1

25 0 2 42 2 2 2 0 0 1 1 02.02.200116.10.2002 0 1

26 1 1 41 2 2 2 2 0 1 1 07.01.200104.10.2011 0 0

27 1 1 59 1 1 4 1 0 1 1 23.02.200219.09.200330.06.2003 1 1

28 1 2 70 1 1 4 0 0 1 1 14.04.200430.04.2004 0 1

29 0 2 40 2 3 9 9 9 1 1 22.07.200209.01.2009 0 1

30 1 2 52 1 2 3 2 0 1 1 04.02.200303.07.2003 0 1

31 1 2 69 2 3 4 0 0 1 04.03.200418.10.200602.10.2006 1 0

32 0 2 68 2 4 3 0 0 1 23.04.200409.07.2004 0 0

33 1 1 53 1 1 4 1 0 1 1 06.12.200019.04.200205.07.2001 1 1

34 0 2 33 1 2 3 0 0 0 0 20.12.200128.10.200809.06.2005 1 0

35 1 3 43 2 2 4 2 0 1 1 05.10.200018.08.2001 0 1

36 1 2 56 1 2 2 0 0 1 1 06.01.20031.07.200110.05.2001 1 1

37 0 2 66 1 2 3 0 0 0 0 11.02.200324.01.200401.09.2003 1 1

38 0 2 62 1 1 4 2 0 1 1 14.05.200310.09.2003 0 1

39 0 2 67 2 4 2 0 0 0 0 22.03.200217.12.2003 0 0

40 0 2 42 1 2 1 0 0 1 1 11.01.200029.06.200403.12.2003 1 1

Page 96: Avaliação da expressão de E-caderina, β-catenina, integrinas α2β1 ...

casoE-cad membrana centroE-caderina citoplasma centroE-caderina núcleo centroE-cad fronte membrana citoplasmáticaE-caderina fronte citoplasmaE-caderina fronte núcleoE-cad linfonodo membranaE-caderina citoplasma linfonodoe-caderina núcleo linfonodoB-cat membrana centroB-cat membrana frontB-cat membrana linfonodoB-cat citoplama linfonodob-catenina citoplasma centroB-catenina citoplasma fronteB-cat núcleo linfonodob-catenina núcleo centrob-catenina núcleo fronte Integrina a3b1/ centro superfícieIntegrina a3b1 fronteIntegrina a3b1 linfonodoIntegrina a2b1 centroIntegrina a2b1 fronteIntegrina a2b1 linfonodo

1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1

2 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1

3 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0

4 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

5 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

6 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1

7 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1

8 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1

9 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

10 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1

11 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

12 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0

13 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1

14 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1

15 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0

16 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1

17 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

18 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

19 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

20 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1

21 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

22 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

23 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

24 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0

25 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

26 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

27 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0

29 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

30 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

31 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

32 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

33 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

35 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

36 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0

37 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1

38 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1

39 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1

40 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1