1

Role of λ5 in B Cell Development

Kitamura et al. 1992

Supplemental Material

2

Homologe RekombinationHomologe Rekombination

Zielgen

Neo

Neo

Wildtype

Deletions-vektor

Rekombi-nierter Lokus

TKHSV

3

Acyclovir (ZoviraxAcyclovir (Zovirax®) ®)

Acyclovir, ein Purinanalog, hat hohe Affinität zu viraler TK

Acyclovir wird durch Thymidinkinase phos-phoryliert und als Nukleotidanalog in DNA eingebaut

DNA Elongation wird terminiert

Struktur Wirkungsmechanismus

4

Selektion gegen zufällige IntegrationSelektion gegen zufällige Integration

Zielgen

Neo TKHSV

Neo

HomologeRekombination

Neo+

TKHSV-

Neo TKHSV

Zufällige Insertiondes gesamten Vektors

Neo+

TKHSV+

Neo TK

Zufällige, partielle Insertion des Vektors

Neo+

TKHSV-

5

Homologe RekombinationHomologe Rekombination

Zielgen

Neo

Neo

Wildtype

Deletions-vektor

Rekombi-nierter Lokus

6

Konstruktion des Konstruktion des λλ5 Deletions-Vektor5 Deletions-Vektor

neoDeletions-

vektor

Wildtyp-Lokus

KloniertesFragment

„Promoter“-Deletion

neo

„Neo“-Insertion

Vektor

7

Homologe RekombinationHomologe Rekombination

neo Deletions-vektor

Wildtyp-Lokus

neo DeletierterLokus

PCR

8

Knockout MäuseKnockout Mäuse

Blastozyteninjektion

9

Chimäre Agouti-Maus

Main Entry: agou·tiPronunciation: &-'gü-tEFunction: nounEtymology: French, from Spanish agutí, from TupiDate: 1625

1 : any of a genus (Dasyprocta) of tropical American rodents about the size of a rabbit

2 : a grizzled color of fur resulting from the barring of each hair in several alternate dark and light bands

Chimäre MäuseChimäre Mäuse

10

Southernblotanalyse von Maus-DNASouthernblotanalyse von Maus-DNA

EcoRI EcoRI

1 2

10.2

neo

1 2

EcoRIEcoRI EcoRI

7.5 2.5

Sonden

11

Von der chimären zur hetero- und homozygoten Von der chimären zur hetero- und homozygoten Knockout-MausKnockout-Maus

ChimäreMaus

Rag2-/-

C57Bl6

Rag2-/-

Rag2-/- Rag2-/-F1

(nicht nach Mendel)

12

Oberflächenmarker zur Bestimmung des Oberflächenmarker zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums Differenzierungsstadiums

D JH VH DJH

SpätePro-B-Zelle

SpätePrä-B-Zelle

UnreifeB-ZelleFrühe Prä-B-

Zelle

Stamm-zelle

FrühePro-B-Zelle

V J

IgM

B220

ReifeB-Zelle

IgD

Große Zellen Kleine Zellen

13

Blut

Milz

Milz

+/+ -/+ -/-

Milz

Lymphozyten in Blut und Milz

14

B-lymphoide Zellen im Knochenmark

15

Analyse der λ5-KO-MausWolfgang Schuh (Jäck Lab)

16

Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung B-lymphoider Vorläuferzellen B-lymphoider Vorläuferzellen

Stamm- Prä-Pro- Pro- Frühe Prä- Späte Prä- Unreife Reife Plasma- Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle zelle

CD19

c-kit CD25

D JH VH DJHVL JL

IgM IgM

IgD

RAG-/-

Ig

µm-/-

5-/-

VpreB-/-

µDys-/-

JH-/-

)

µ

Prä-BZR

B220 (CD45)

17

Bl/6 WT Rag2 KO 5 KO (7weeks)

CD19

CD19

CD

19C

-kit

CD

25

IgM

BM

14,17 0,09 7,56

27,37 2,2 8,7

25,13 6.97 10,4

18

Bl/6 WT Rag2 KO 5 KO(7weeks)

CD

19

IgM

CD

4

CD8

Spleen

47,7 0,1 16,6

19

Serum-Ig

20

Humorale ImmunantwortT-unabhängig T-abhängig

21

B-lymphoide Zelle im Peritoneum

22

Allelausschluss

+/+-/-

Methode: Photoimmunfluoreszenz

23

Iso-, Allo- Idiotypic Markers

C57Bl/6 (μb)

Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert.

Anti-isotypische AK(gegen Epitope in C-Regionen

der H- und L-Kette)

Anti-idiotypische AK(gegen Epitope in V-Regionen

der H- und L-Kette)

BALB/c (μa)

Anti-allotypische AK(gegen ein bestimmtes Epitop

In C-Region)

24

Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen?? Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen??

ER

Konstitutiv vom ER

ER

cytoplasm ?

Konstitutiv von der Zelloberfläche

Ligand

cytoplasm

ER

Liganden induziert

cytoplasm

?

?