UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
FILIPE NOBRE CHAVES
ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR
HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES
POTENCIALMENTE MALIGNAS.
FORTALEZA
2013
FILIPE NOBRE CHAVES
ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR
HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES
POTENCIALMENTE MALIGNAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Faculdade de
Farmácia, Odontologia e Enfermagem da
Universidade Federal do Ceará, como um dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre
em Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Profa. Dra. Karuza Maria Alves
Pereira
FORTALEZA
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
C438a Chaves, Filipe Nobre.
Análise da marcação imunohistoquímica do fator induzido por hipóxia-1α em carcinoma
epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. / Filipe Nobre Chaves. – 2013.
78 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia
e Enfermagem. Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Clínica Odontológica.
Orientação: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira.
1. Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. 2. Neoplasias Bucais. 3. Lesões Pré-
Cancerosas. 4. Carcinoma de células escamosas . I. Título.
CDD 616.99431
FILIPE NOBRE CHAVES
ANÁLISE DA MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO FATOR INDUZIDO POR
HIPÓXIA-1α EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL E EM LESÕES
POTENCIALMENTE MALIGNAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Odontologia, da Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Odontologia.
Aprovada em: 26 de dezembro 2013
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Prof. Dr. Karuza Maria Alves Pereira (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC campus Sobral
________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Wildson Gurgel Costa
Universidade Federal do Ceará – UFC
__________________________________________________
Profa. Dra. Roberta Barroso Cavalcante
Universidade de Fortaleza - UNIFOR
A Deus e a Nossa Senhora , que tem a cada
dia renovado minha força para vencer os
obstáculos da vida e momentos de cansaço.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Rosangela e Hélder, pela dedicação à nossa família e por
demonstrarem, a cada dia, o valor do trabalho.
À minha noiva Vilminha, que está comigo em todos os desafios, me fortalecendo e
ajudando a vencê-los, além do amor incondicional.
Ao meu irmão, Samir, um verdadeiro amigo e confidente.
Aos meus familiares, por me darem uma base de pedra perante os ventos da vida,
Ao meu amigo Paulim, pela ajuda intelectual, estatística e pessoal durante o desenrolar
do estudo.
À minha orientadora, Professora Karuza, pelos grandes ensinamentos científicos,
pessoais e morais transmitidos. Sou imensamente grato pela sua disponibilidade, palavras de
incentivo e ajuda profissional.
Ao Professor Fábio, ao qual devo grande parte da minha formação profissional e
pessoal. Obrigado pela confiança, oportunidades, além de me dar oportunidade de conhecer
cada vez mais essa grande pessoa que você é, um ser humano impecavelmente inteligente,
simples e acessível, não medindo esforços para transmitir toda a sua sabedoria.
Ao meu “irmão” Samuel, um verdadeiro amigo, pronto para mover montanhas.
À Professora Ana Paula e ao professor Fabrício Bitu, por investir e confiar neste
projeto, bem como pelo nosso trabalho diário, formando um forte vínculo entre Laboratório
de Patologia Bucodental e Universidade Federal do Ceará campus Sobral.
Aos técnicos em anatomia patológica Alceu Machado e Júnior, não apenas pelos
impecáveis cortes histológicos e análise imunohistoquímica, mas especialmente pela
paciência.
À bolsista Sthefane pela ajuda e disponibilidade interminável.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Patologia Bucodental Artur, Clarissa, Thales,
Malena, Carol, Ealber, Mariana, Laryssa, Camila e Erasmo pela amizade, companhia e troca
de experiências.
Aos bolsistas de iniciação científica Khalil, Larissa e Laís. Sem seu esforço esse
trabalho não seria possível. Obrigado por transformar todos os momentos de trabalho de
bancada em instantes de alegria e descontração.
Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFC, Clínica de Métodos
Diagnóstico I e II e ao Laboratório de Patologia Bucodental, por me permitir fazer parte e
ajudar no crescimento e reconhecimento do serviço.
Ao programa REUNI, pela concessão da bolsa de estudos.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
FUNCAP, pelo apoio financeiro e por acreditar em nossa pesquisa.
“Importante é ser feliz”
RESUMO
Introdução: Hipóxia constitui em uma característica comum de tumores sólidos, como em
cânceres de cabeça e pescoço, e nessas condições, uma via de sinalização envolvendo um
regulador de resposta a oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) tem-se
destacado, na tentativa de permitir uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do
câncer. Objetivo: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em
lesões potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Métodos:
Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise imuno-
molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos
biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Utilizou-se a técnica
imunohistoquímica da Estreptoavitina-Biotina com o anticorpo HIF-1 (marca Abcam,
diluição 1:200, 60 minutos, recuperação antigênica com citrato pH6 Pascal), analisando 05
campos de cada caso no aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco
campos foi somado e considerou-se como unidade amostral o percentual de células imuno-
positivas para HIF-1α conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade
desta última. Os resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de
Student e ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os
níveis de significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de
HIF-1α em 58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO,
com diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com
marcação nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e
CEO (2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com
imunomarcação positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve
aumento significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada
(p=0.029) e forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da
expressão, nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu
envolvimento em estágios iniciais da carcinogênese oral. Relevância Clínica: Buscar o
entendimento das complexas vias de sinalização, bem como do microambiente tumoral, e
diferentes comportamentos biológicos no câncer oral.
Palavras-chave: Subunidade alfa do Fator 1 Induzível por Hipóxia. Neoplasias Bucais.
Lesões Pré-Cancerosas. Carcinoma de Células Escamosas.
ABSTRACT
Introduction: Hypoxia is a common feature in solid tumors, such as head and neck cancers,
and in these conditions a signaling pathway involving a response regulator oxygen, called
hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) we have highlighted in an attempt to provide a better
understanding of tumor biology of cancer. Objective: To investigate the role of HIF-1 in oral
squamous cell carcinoma and premalignant lesions presenting oral epithelial dysplasia.
Methods : Observational, analytical and cross through the diagnosis and immuno-molecular
analysis of malignant and premalignant lesions. 10 biopsied cases with histopathological
diagnosis of the CEO and DEO 10 cases were included. It was used the technique of
immunohistochemistry Estreptoavitina-Biotin with HIF-1 antibody (Abcam mark, 1:200
dilution, 60 min pH6 citrate antigen retrieval Pascal) analysis of 05 fields each case at 400X
magnification. The number of cells in each of five fields was added and the sample was
considered as a unit the percentage of positive cells immuno-HIF-1α nuclear and cytoplasmic
as well as intensity thereof. The results were obtained and compared between groups by the
Student and multifactor ANOVA followed by Bonferroni post-test t test, based on the
significance levels of 5%. Results: Cytoplasmic expression of HIF-1α was observed in 58.4 ±
6.0% of the epithelial cells of the DEO and 77.8 ± 3.9% of the cells of the CEO, with a
significant difference (p = 0.022). The percentage of cells positive for HIF-1α nuclear staining
also showed significant difference (p = 0.021) between DEO (0.2 ± 0.1%) and CEO (2.4 ±
0.8). There was no significant difference between the percentage of cells with weak positive
immunostaining in the cytoplasm between DEO and CEO (p = 0.337), however, a significant
increase in the percentage of cells with moderate cytoplasm staining (p = 0.029) and strong (p
= 0.031) between DEO and CEO. Conclusion: One increasing the expression, nuclear and
cytoplasmic HIF-1α DEO to CEO was observed, suggesting their involvement in the early
stages of oral carcinogenesis. Clinical Relevance: Seek understanding of the complex
signaling pathways, as well as the tumor microenvironment, and different biological
behaviors in oral cancer.
Keywords : Hypoxia-Inducible Factor-1α, Alpha Subunit. Mouth Neoplasms. Precancerous
Condition. Carcinoma, Squamous Cell.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em
ambientes normóxico e hipóxico........................................................... 18
FIGURA 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em
Citoplasma............................................................................................. 43
FIGURA 3 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em
núcleo..................................................................................................... 44
FIGURA 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente
por HIF-1α em Citoplasma.................................................................... 45
FIGURA 5 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em
Citoplasma por Gênero.......................................................................... 46
FIGURA 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente
por HIF-1α em Citoplasma por Gênero................................................. 47
FIGURA 7 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em
Nucleo por Gênero................................................................................. 48
FIGURA 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em
espécimes de displasia epitelial oral (DEO)........................................... 49
FIGURA 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em
espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO)................................. 50
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por
localização topográfica da peça de biópsia............................................ 42
LISTA DE ABREVIATURAS
ARNT
Arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease
bHLH Basic helix-loop-helix
CEO
Carcinoma epidermóide oral
CSC
Células tronco cancerígenas
DEO
Displasia epitelial oral
DNA Ácido desoxirribonucleico
EPO
Eritropoietina
GLUT-1
Transportador de glicose - 1
HIF
Fator induzido por hipóxia
HPV
Papilomavirus Humano
HRE Complexo de resposta a hipóxia
INCA
Instrituto Nacional de Câncer
LPM
Lesões potencialmente malignas
PCNA
Antígeno de proliferação nuclear
pVHL
Proteína supressora tumoral de von Hippel-Lindau
VEGF
Fator de crescimento vascular endotelial
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................ 13
1.1 Fator Induzido por Hipóxia (HIF) 15
2 PROPOSIÇÃO............................................................................................................ 20
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 20
2.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 20
3 CAPÍTULOS............................................................................................................... 21
3.1 CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido
por Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente
malignas.......................................................................................................................... 22
4 CONCLUSÃO GERAL.............................................................................................. 51
5 REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 52
ANEXOS...................................................................................................................... 56
13
1 INTRODUÇÃO GERAL
Câncer tem sido grande alvo de estudos e investigações científicas por ser uma
importante causa de morbidade e mortalidade em todo mundo, sendo, atualmente,
considerado como a segunda maior causa de morte no mundo, atrás de mortalidades
relacionadas a doenças coronarianas; por isso os fatores relacionados ao câncer apresentam
grande relevância em pesquisas científicas. (SCULLY, 2005). Cânceres orais continuam
sendo uma doença letal para mais de 50% dos casos diagnosticados anualmente e, em grande
parte, isso se deve ao fato de a maioria dos casos serem diagnosticados em estágios avançados
da doença (WARNAKULASURIYA, 2009).
O CEO representa o sexto câncer mais frequente no mundo, abrangendo uma ampla
variação geográfica. Em países de alto risco (Sri Lanka, Índia e Paquistão), câncer oral pode
ser a neoplasia maligna mais comum entre homens e contribuir com até 25% de todos os
novos casos de câncer (WARNAKULASURIYA, 2010). França, Austrália, Hungria,
Espanha, Canadá e Brasil também apresentam altas taxas de incidência de tumores em
cavidade oral (WARNAKULASURIYA, 2009).
De acordo com o Instituto Nacional do Câncer do Brasil (INCA), em previsão para o
ano de 2012, estimou-se 9.990 novos casos de câncer oral em homens e 4.180 em mulheres.
Esses valores correspondem a um risco estimado de 10 novos casos a cada 100 mil homens e
4 a cada 100 mil mulheres, sendo essa predileção pelo sexo masculino observada na maioria
dos países. No Nordeste, excluindo os tumores da pele (não melanoma), o câncer da cavidade
oral é o quarto mais comum entre homens (6 casos/100 mil homens) e oitavo mais comum
entre mulheres (3 casos/100 mil mulheres). No Ceará, estimam-se 430 novos casos para 2012,
estando entre os três estados com maior incidência da região Nordeste, atrás apenas de Bahia
e Pernambuco (INCA, 2012a; INCA, 2012b).
O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) representa aproximadamente 90% das
neoplasias em cavidade oral, apresentando uma etiologia multifatorial. Não há um agente ou
fator causador isolado, claramente definido ou aceito, mas tanto fatores extrínsecos quanto
intrínsecos podem estar associados (SCULLY, 2005). Agentes químicos (fumo e álcool),
físicos (radiação) e infecciosos (vírus oncogênicos) podem alterar a estrutura genética
promovendo múltiplas alterações no genoma celular. O acúmulo dessas alterações genéticas,
incluindo ativação ou supressão de oncogenes e genes supressores tumorais, leva ao
desequilíbrio no ciclo celular, gerando danos ao DNA celular e a perda do controle do ciclo
14
de divisão da célula, favorecendo uma instabilidade genética (NAGPAL, 2003).
Normalmente, o prognóstico do câncer de boca no Brasil é considerado ruim. Embora a
cavidade oral seja facilmente acessível à exploração, o que torna mais fácil a detecção de
lesões incipientes, o diagnóstico do câncer oral, em estágio assintomático é incomum
(NEVILLE et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).
CEO apresenta um prognóstico bastante oneroso, sendo observado severas sequelas
terapêuticas em decorrência dos tratamentos tardios associados a graves comprometime ntos
psíquicos desses pacientes, encorajando pesquisas adicionais sobre fatores que podem
modificar a evolução da doença (MASSANO et al., 2006). Apesar dos grandes avanços e
descobertas, o prognóstico desse tipo de câncer ainda é pobre, com taxa de sobrevida
estimada de 56% em cinco anos (KADEMANI et al., 2005).
Desordens potencialmente malignas também estão associadas a carcinogênese oral,
sendo que CEOs têm sido documentados em associação ou precedidos por uma lesão
potencialmente maligna (LPM). Leucoplasia, eritroplasia, eritroleucoplasia e queilite actínica
são as principais desordens envolvidas no surgimento de lesões malignas intraorais (BARNES
et al., 2005; WARNAKULASURIYA, 2007). Quando o desfecho de um grande número de
lesões potencialmente malignas é revisto, a freqüência de transformação em lesão maligna é
maior do que o risco associado a uma mucosa normal ou não-alterada, ressaltando a
importância do diagnóstico precoce dessas lesões para o correto tratamento e
acompanhamento dessas patologias (WARNAKULASURIYA, 2008).
LPMs podem apresentar alterações morfológicas e citológicas que caracterizam um
quadro histopatológico de displasia epitelial oral (DEO), o qual demonstra um maior
potencial de transformação maligna para CEO quando comparado com o tecido epitelial
normal (WARNAKULASURIYA, 2007; SILVEIRA et al., 2009). Histologicamente, as
células epiteliais malignas invadem a lâmina própria subjacente, organizadas em ninhos,
cordões e/ou lençóis, ou isoladamente. Estas células exibem atipias, tais como: pleomorfismo
celular, aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromatismo nuclear, formação de pérolas
de ceratina, dentre outras (SCULLY, 2005). Assim, o diagnóstico histopatológico de DEO é
considerado um importante indicativo de transformação para CEO (BARNES et al., 2005;
BRENNAN et al., 2007; WARNAKULASURIYA, 2007).
Carcinoma epidermóide evolui a partir de um complexo processo resultante da
exposição a agentes carcinogênicos e inclui várias etapas constituídas de mudanças genéticas,
epigenéticas e metabólicas. Exposição crônica a esses agentes levam a instabilidade genética
15
nas células epiteliais da mucosa oral, desenvolvimento de lesões potencialmente malignas e,
posteriormente, ao carcinoma invasivo. Muitos estudos tem revelado o importante papel
desempenhado por proto-oncogenes e genes supressores tumorais durante o curso de evolução
do câncer oral (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012).
Anormalidades afetando proteínas relacionadas à proliferação celular, angiogênese e
metástase também tem sido reportadas e relacionadas com o prognóstico do tumor
(BRINKMAN; WONG 2006; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012).
Na prática clínica, o planejamento do tratamento e avaliação do prognóstico para CEO é
principalmente baseado no estadiamento tumoral (sistema TNM). No entanto, essa
classificação fornece informações limitadas sobre a resposta do tratamento à agressividade
biológica e prognóstico (HEO et al., 2012). Portanto, novos marcadores moleculares que
buscam prever o prognóstico e a agressividade tumoral devem ser estudados de forma
individualizada, procurando estabelecer e definir prognóstico e, assim, buscar alternativas ao
tratamento do câncer oral.
Esforços tem sido direcionados tanto à descoberta de proteínas e moléculas que
funcionam como alvos terapêuticos quanto ao melhor entendimento das vias de sinalização
moleculares funcionantes durante a inicialização e progressão tumoral. Estudos recentes
evidenciam novos achados sobre câncer de cabeça e pescoço, conduzindo a uma melhor
compreensão das características biológicas desses tumores, bem como fornecendo mais
opções de tratamento, como novos agentes terapêuticos dirigidos contra múltiplos alvos
moleculares (HADDAD et al., 2008). Nesse contexto uma das vias que já vem sendo
estudada, inclusive para o CEO, é do Fator Induzido por Hipóxia.
1.1 Fator Induzido por Hipóxia (HIF)
O comportamento biológico das neoplasias malignas, incluindo o CEO, é complexo,
pois o crescimento e a disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular
neoplásica, mas também das respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para
tal, que uma variedade de interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o
sistema imune e o tecido conjuntivo (NAGPAL, 2003). Mais recentemente, tem-se destacado
o estudo sobre o metabolismo enérgico das células tumorais, buscando uma melhor
compreensão sobre a biologia tumoral do câncer (MORENO-SÁNCHEZ et al., 2007).
A carcinogênese oral é um processo complexo e vários genes podem estar alterados. A
16
evolução e progressão do carcinoma oral são promovidas por múltiplas alterações celulares e
moleculares no epitélio oral. Proteínas geneticamente alteradas podem exercer efeitos
importantes nas neoplasias malignas. Mais recentemente, têm-se destacado as proteínas do
metabolismo celular (STRYER, TYMOCZO, JEREMY 2004; DEMASI et al., 2010).
Hipóxia é uma situação comum nos cânceres, importante nos tumores localmente
agressivos, pois com o crescimento tumoral, a lesão rapidamente ultrapassa sua
vascularização, gerando déficit de nutrientes e oxigênio, principalmente em tumores sólidos.
Lembrando que todas as células do nosso organismo necessitam de oxigênio para exercer sua
função metabólica normal, incluindo a fosforilação oxidativa, a capacidade das células
cancerosas de adaptação à hipóxia, transitória ou extensa, é essencial para a sobrevivência
tumoral (BRAHIMI-HORN; POUYSSÉGUR 2006; RYU et al., 2010; PEREZ-SAYANS et
al., 2011; OLIVEIRA; RIBEIRO-SILVA, 2011). CEO é caracteristicamente uma neoplasia
localmente agressiva com rápida progressão; nesses tumores, a concentração de oxigênio (O2)
é significantemente reduzida. Sugere-se que o caráter invasivo e metastático do CEO esteja
relacionado a uma consequência de sua adaptação ao microambiente hipóxico (RYU et al.,
2010; ECKERT et al., 2011; PEREIRA et al., 2013).
Resposta celular aos níveis de oxigênio é monitorada, em parte, pela atividade
transcricional dos fatores induzidos por hipóxia. Nessas condições, uma via de sinalização
envolvendo um regulador da resposta ao oxigênio, chamado de Fator Induzido por Hipóxia
(HIF), é ativada (BRAHIMI-HORN et al., 2006; HEDDLESTON et al., 2010; SUN et al.,
2012). HIF é um fator de transcrição que, em hipóxia, coordena a indução e repressão de
vários genes que controlam múltiplas funções celulares tais como angiogênese, metabolismo,
invasão/metástase e apoptose/sobrevida celular (BRAHIMI-HORN et al., 2006). O HIF-1 é
um fator transcricional que exerce um papel essencial na resposta adaptativa das células em
meio à baixa concentração de oxigênio (BRENNAN et al., 2005). Em alguns cânceres, a
superexpressão de HIF-1 é associada ao aumento da mortalidade (BRENNAN et al., 2005,
ECKERT et al., 2011). Recentemente descoberto, o complexo molecular do HIF-1 consiste
em uma base, hélice-alça-hélice-PAS, heterodímera composta de duas subunidades, uma alfa
(α) e beta (β), a subunidade α não é constitutiva e é sensível ao oxigênio, já a subunidade β,
também chamada de ARNT (arylhidrocarbon-receptor translocador nuclease), é expressa
constitutivamente na célula, expressando uma proteína de 91–94 kDa. O gene que codifica
HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) e sob hipóxia, o núcleo celular gera
uma resposta por meio da mensagem transmitida por HIF-1α (BRENNAN et al., 2005;
17
ECKERT et al., 2012; PEREIRA et al., 2013).
O Fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1 α) é um fator de transcrição que exerce um
papel na homeostase celular em resposta a hipóxia, desempenhando papel relevante na
carcinogênese (HEDDLESTON et al., 2010; KEITH, B. et al., 2011; SUN et al., 2012;
PEREIRA et al., 2013), através da sobre regulação de mais de 100 genes envolvidos na
adaptação tumoral como no transporte glicolítico, alterando o microambiente tumoral,
estabilização de pH, angiogênese e agindo sobre células-troncos cancerígenas (ECKERT et
al., 2012; PEREIRA et al., 2013). Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como
fator de crescimento endotelial), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da
proteína ras podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do
gene supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da
VEGF e EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais,
resultando na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e
crescimento tumoral. Assim expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão câncer bucal
através da promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula
tumoral (LIN et al., 2008; PEREIRA et al., 2013).
Normalmente, em células bem oxigenadas, a molécula de HIF-1α é hidroxilada através
da enzima prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e de prolina 564 (Pro-564)
(ECKERT et al., 2012). Após hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a uma proteína
supressora tumoral de von Hippel-Lindau (pVHL), que promove a degradação e eliminação
do fator através da complexo enzimático ligase E3-ubiquitina (SEMENZA et al., 2010;
PEREIRA et al., 2013). Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de
inibição do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e
consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP (PEREIRA et al.,
2013) (Figura 1).
18
Figura 1: Mecanismo de ação do fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1) em ambientes normóxico e hipóxico.
PHD, domín io hidroxilase prolil; PRO 402, prolina 402; pVHL, von Hippel -Lindau supressor de tumor; E3UB,
E3 ubiqu itina ligase; HRE, elemento de resposta a hipóxia; CA IX, an idrase carbônica IX; VEGF, fator de
crescimento endotelial vascular; PDGF-β , derivado de plaquetas growth factor-β; GLUT 1, transportador de
glicose 1; CSC, de células-tronco do câncer.
Fonte: (PEREIRA et al., 2013).
Os HIFs também têm a atividade basal aumentada no compartimento neoplásico.
Porém, esse nível de reforço da atividade transcricional ainda não é completamente entendido.
O fluxo de tensão de oxigênio utilizado pelas células neoplásicas é consequência de algumas
características do meio tumoral, como vascularidade, difusão do oxigênio deficiente em
virtude da expansão tumoral e fluxo sanguíneo irregular. Tem sido descrito, também que ciclo
constante de hipóxia no tumor permite o reforço do potencial metastático e atividade
transcricional do HIF (HEDDLESTON et al., 2010; PEREIRA et al., 2013).
Uma variedade de alterações genéticas no interior das células tumorais podem ocorrer
sob condições de hipoxia celular. Essas alterações podem ajudar a células tumorais a
sobreviverem em um microambiente hipóxico através do aumento da indução ou estabilização
do HIF-1α, que é um importante ativador da transcrição de um grande número de genes (KIN
19
et al., 2007; PEREIRA et al., 2013).
Observa-se que o oxigênio é uma molécula essencial para muitos processos biológicos,
como metabolismo, proliferação e sobrevida celular. Hipóxia também está associada com
resistência a radioterapia e quimioterapia, e também contribui para manutenção das células-
troncos cancerígenas, bem como promove o estado indiferenciado destas (HEDDLESTON et
al., 2010; SUN et al., 2012). Células neoplásicas necessitam e fazem uso da sensibilidade ao
oxigênio das proteínas induzidas por hipóxia, representadas pelo HIF, que também mostra
uma atividade basal aumentada no compartimento neoplásico. Porém, esse nível de reforço da
atividade transcricional ainda não é completamente entendido.
Considerando o papel da hipóxia na progressão tumoral e a escassez de estudos
utilizando esses marcadores para estes eventos biológicos em DEO e CEO, o propósito desse
estudo foi analisar a imunoexpressão do HIF-1α em casos de DOE e CEO, visando contribuir
para o entendimento do comportamento biológico do câncer oral, além da busca por
marcadores de prognóstico para esta neoplasia.
20
2 PROPOSIÇÃO
2.1 Objetivo Geral
Analisar a participação do fator induzido por hipóxia-1α (HIF-1α) em casos de
carcinomas epidermóides orais, bem como em lesões potencialmente malignas associadas a
displasia epitelial oral.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em carcinomas
epidermóides orais;
Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α em displasias epiteliais
orais;
Comparar a expressão imunohistoquímica da proteína HIF-1α entre os casos de
displasias epiteliais orais e carcinoma epidermóide oral;
Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α segundo sexo, idade e localização;
Correlacionar a imunoexpressão do HIF-1α com classificação histopatológica das
displasias epiteliais.
21
3 CAPÍTULO
Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará, que regulamenta o formato
alternativo para dissertações de Mestrado e teses de Doutorado, e permite a inserção de
artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato (Anexo A).
O projeto de pesquisa foi submetido a apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica da
Universidade Federal do Ceará sob o número do parecer 137.019, sendo aprovado em
01/11/12 sob o CAAE: 06720312.3.0000.5054 (Anexo B).
O participante da pesquisa é convidado como voluntário e esclarecido sobre as
informações dos dados e objeto de estudo do referido projeto. Em caso de aceite, é assinado o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo C), que está em duas vias. Uma delas
será entregue ao pesquisado e a outra pertence ao pesquisador responsável. Foi ressaltado que
em caso de recusa não haverá penalizações nem alteração no plano de tratamento. Foi
também fornecido o telefone, para dúvidas, do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal do Ceará pelo telefone.
Assim sendo, esta dissertação é composta por um capítulo contendo um artigo
científico que será submetido para publicação no periódico “Oral Oncology” (Anexo D),
conforme descrito abaixo:
Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell
carcinoma and potentially malignant lesions.
Chaves FN, Alves KMA.
22
3.1 CAPÍTULO 1: Análise da marcação imunohistoquímica do Fator Induzido por
Hipóxia-1α em carcinoma epidermóide oral e em lesões potencialmente malignas. Este
artigo seguiu as normas de publicação do periódico Oral Oncology (ISSN 1368-8375)
Autores:
Filipe Nobre Chaves
Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia
Posição: Estudante de Mestrado em Odontologia
Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Diagnóstico Oral,
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil.
Karuza Maria Alves Pereira
Grau acadêmico: Bacharel em Odontologia, Mestre em Patologia Oral; Doutora em Patologia
Oral
Posição: Professora Adjunta II da Universidade Federal do Ceará- Campus Sobral
Afiliação institucional: Departamento de Clínica Odontológica, Setor de Patologia Oral,
Universidade Federal do Ceará campus Sobral, Sobral, Brasil.
Autor de Correspondência: Filipe Nobre Chaves
Endereço: Rua Ministro Joaquim Bastos, Fátima – Fortaleza, Ceará, Brasil. CEP: 60415-040
Telefone Residencial: 55-85-9922-1498
E-mail: [email protected]
23
Title page
Immunohistochemistry analysis of hypoxia induced factor-1α in oral squamous cell
carcinoma and potentially malignant lesions.
Filipe Nobre Chaves DDSa*; Karuza Maria Alves Pereira DDS, MSc, PhDb
aPostgraduate Student, School of Dentistry, Department of Clinical Dentistry, Federal University of
Ceará, Fortaleza, Brazil.
bAdjunct Professor, Division of Oral Pathology, School of Dentistry, Federal University of Ceará –
campus Sobral, Sobral, Brazil
Competing interests: None declared
Funding: None
*Corresponding author.: Filipe Nobre Chaves
Rua Alexandre Barauna, 949, Rodolfo Teofilo, 60430-160, Fortaleza, Ceara, Brazil. Federal
University of Ceará, Department of Dental Clinic, School of Dentistry. Phone/Fax: +55 85
3366 8232. E-mail address: [email protected]
24
RESUMO
Objetivos: Investigar o papel do HIF-1 em carcinoma epidermóide oral (CEO) e em lesões
potencialmente malignas que apresentam displasia epitelial oral (DEO). Materiais e
Métodos: Estudo observacional, analítico e transversal, através do diagnóstico e análise
imuno-molecular de lesões malignas e potencialmente malignas. Foram incluídos 10 casos
biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e 10 casos de DEO. Realizou estudo
imunohistoquímico com anticorpo anti-HIF-1α, analisando 05 campos de cada caso no
aumento de 400X. O número de células em cada um dos cinco campos foi somado e
considerou-se como unidade amostral o percentual de células imuno-positivas para HIF-1α
conforme marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última. Os
resultados foram obtidos e comparados entre grupos por meio dos testes t de Student e
ANOVA multifatorial, seguido do pós-teste de Bonferroni, tomando como base os níveis de
significância de 5%. Resultados: Foi observado uma expressão citoplasmática de HIF-1α em
58.4±6.0% das células epiteliais das DEO e em 77.8±3.9% das células dos CEO, com
diferença significante (p=0.022). O percentual de células positivas para HIF-1α com marcação
nuclear também mostrou diferença significante (p=0.021) entre DEO (0.2±0.1%) e CEO
(2.4±0.8). Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação
positiva fraca em citoplasma entre DEO e CEO (p=0.337), no entanto, houve aumento
significante no percentual de células com marcação citoplasmática moderada (p=0.029) e
forte (p=0.031) entre DEO e CEO. Conclusão: Foi observada uma aumento da expressão,
nuclear e citoplasmática, de HIF-1α de DEO para CEO, sugerindo seu envolvimento em
estágios iniciais da carcinogênese oral.
Palavras-chave: fator induzido por hipóxia-1α, câncer oral, lesões pré-cancerosas, carcinoma
de células escamosas
25
INTRODUÇÃO
O comportamento biológico das neoplasias malignas é complexo, pois o crescimento e a
disseminação do câncer dependem não só da proliferação celular neoplásica, mas também das
respostas dos tecidos normais do hospedeiro. É necessário, para tal, que uma variedade de
interações ocorra entre as células tumorais, a rede vascular, o sistema imune e o tecido
conjuntivo [1]. Mais recentemente, tem-se destacado o estudo sobre o metabolismo enérgico
das células tumorais, buscando uma melhor compreensão sobre a biologia tumoral do câncer
[2].
Hipóxia focal é encontrada na maioria dos tumores sólidos, devido às alterações
quantitativas e qualitativas na vasculatura do tumor, que promovem a uma redução local da
disponibilidade de oxigênio. Isso constitui uma característica comum de tumores sólidos em
câncer de cabeça e pescoço e outros tipos de câncer. Esse meio hipóxico é relevante em
tumores localmente agressivos, que apresentam rápido crescimento tumoral que geralmente
não são acompanhados pela vascularização ou neoformação vascular e, frequentemente, as
células tumorais necessitam de suplementação de nutrientes e oxigênio para realizar seu
metabolismo normal [3,4]. Essa baixa concentração de oxigênio estimula uma cascata de vias
moleculares, resultando em angiogênese, glicólise e mudanças no ciclo celular. Nestas
condições, uma via de sinalização envolvendo um regulador de resposta a oxigênio, chamado
de Fator Induzido por Hipóxia (HIF), é ativada [3,5,6].
O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel
essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio [3,6].
Quando ativado, HIF-1 pode induzir a transcrição de mais de 60 genes, como uma tentativa
de evitar a morte celular pela hipóxia tumoral, importantes na proliferação celular e para a
carcinogênese [4]. A expressão de HIF-1α pode, portanto, fornecer informações valiosas para
informar a escolha do tratamento ou para avaliar o p rognóstico [6], sendo considerado um
26
marcador de prognóstico tumoral para CEOs [7].
Diante da escassez de estudos evidenciando o papel do HIF-1 na biologia tumoral do
câncer de boca, o presente estudo busca analisar a participação do HIF-1α em Carcinomas
Epidermóides Orais, bem como em Lesões Potencialmente Malignas que apresentam graus
histopatológicas com característica de Displasias Epiteliais Orais, visando contribuir para o
melhor entendimento da carcinogênese oral.
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho consistiu em um estudo observacional e prospectivo, analítico e
transversal, através do diagnóstico e análise imuno-molecular de lesões malignas e
potencialmente malignas. A população do estudo envolveu todos os espécimes cirúrgicos
oriundos de lesões malignas (carcinomas epidermóides orais) e potencialmente malignas (que
apresentem graus histopatológicos de displasias epiteliais) de pacientes atendidos no
Ambulatório de Estomatologia / Métodos de Diagnóstico da Universidade Federal do Ceará -
Campus Sobral durante o período de dezembro de 2012 a dezembro de 2013.
Foram incluídos casos biopsiados com diagnóstico histopatológico de CEO e DEO,
cujo os espécimes tenham quantidade suficiente de material disponível nos blocos de parafina
para análises morfológica e imunohistoquímica. Foram excluídos da amostra os casos que
apresentaram quantidade insuficiente de material emblocado em parafina para estudo
morfológico e amostras com material insuficiente para realização da análise
imunohistoquímica. Os casos em que os pacientes não permitiram a realização da pesquisa,
bem como pacientes sem autorização do responsável também não foram incluídos na
pesquisa. A amostra foi dimensionada para proporcionar um poder de 80% e uma confiança
de 95% para detectar diferença imunohistoquímica (expressão dos marcadores estudados)
relevante entre os grupos de pacientes com lesões bucais.
27
Dados prévios [7], [8], [9] e [10] foram utilizados, e para que tais requisitos sejam
satisfeitos, o tamanho da amostra foi calculado em 10 casos de CEO e 10 casos de DEO. A
esse valor, já foi avaliado 20% para suprir eventuais perdas, de modo que o tamanho final da
amostra foi estimado em 20 pacientes. Amostra pode ser elevada em virtudo do número de
casos observdaos na população do ESTUDO (do período já mencionado - 12/11 a 12/13)
Essa pesquisa foi submetida à apreciação e aprovada pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Universidade Federal do Ceará / PROPESQ do Departamento de Medicina Clínica
da Universidade Federal do Ceará.
Análise Imunohistoquímica
Parte do tecido coletado emblocado em parafina foi utilizado para a confecção de
lâminas, referentes aos casos selecionados. Estas foram avaliadas à microscopia de luz através
de cortes histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica de Hematoxilina/Eosina
(H/E), para o diagnóstico histopatológico e imuno-histoquímico. Após a confirmação
diagnóstica, os espécimes foram novamente submetidos a cortes 5 μm de espessura e
montados em lâminas de vidro previamente preparadas com adesivo à base de organosilano
(3- aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co®, St Louis, MO, USA).
Os cortes foram submetidos ao anticorpo anti HIF-1α pela técnica imunohistoquímica
da estreptoavidina-biotina (Labeled StreptAvidin Biotin – LSAB). Esta consistiu
resumidamente nos seguintes passos: as secções passaram por dois banhos em xilol, durante
dez minutos cada. Em seguida, foram imersas em três passagens de álcool absoluto, sendo
posteriormente lavadas em água corrente e, logo após, uma passagem em água destilada. A
recuperação antigênica foi realizada com citrato pH 6.0, por 30 minutos a 99oC. À
temperatura ambiente, as secções foram mergulhadas em uma solução de bloqueio de
peróxido de hidrogênio a 3% durante 10 minutos. Em seguida, realizou-se a incubação com o
anticorpo monoclonal de coelho anti HIF-1 alpha (clone EP1215Y, Abcam®, Cambridge,
28
MA, USA) por 60 minutos à Temperatura Ambiente (TA), na diluição de 1:200, e,
posteriormente, lavadas com solução de tampão fosfato-salino, PBS (phosphate buffered
saline).
As amostras foram incubadas com o anticorpo secundário LSAB Kit (DAKO®,
Carpinteria, CA, USA) por 10 minutos à TA. Em seguida, foi feita a incubação em solução
cromógena preparada com DAB, durante 10 minutos em câmara escura (DAKO®,
Carpinteria, CA, USA). Posteriormente, os espécimes foram lavados em água corrente e, em
seguida, com água destilada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina e depois
foram desidratados em álcool e diafanizadas em xilol.
Por fim, foi realizado a montagem em lâminas de vidro, as quais foram examinadas
em microscópio óptico NIKON® Eclipse E200. Como controle positivo, utilizaram-se
carcinomas de fígado e pulmão, paralelamente ao controle interno por linfócitos,
paralelamente às secções incubadas, foi realizado o controle negativo, excluindo-se a
aplicação do anticorpo primário.
Análise do padrão de marcação imunohistoquímica e de marcação quantitativa
O parâmetro de positividade da marcação imunohistoquímica do antígeno em todos os
espécimes incluídos na amostra consistiu nas células que exibiram coloração acastanhada em
núcleo ou citoplasma, independentemente da intensidade da imunomarcação. Foram
selecionados aleatoriamente cinco campos, no aumento de 400x, visualizando-se através do
microscópio óptico supracitado, e fotografados em câmera digital SONY® Cyber-shot DSC-
H10 de 8,1 megapixeis, com zoom óptico 10x em máxima resolução.
A análise quantitativa da expressão do anticorpo HIF-1α foi realizada através da
contagem do número de células imunomarcadas. Essa contagem, em valores absolutos, foi
realizada em células imunomarcadas dos casos de lesões potencialmente malignas que
apresentavam microscopicamente graus de displasias epiteliais oral e nos casos de carcinomas
29
por um único observador, previamente calibrado, em momentos distintos, através do
programa Image J (Image and Processing Analysis in Java – Rasband, W.S., ImageJ, National
Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2004).
Na avaliação da qualidade de imunomarcação, foram atribuídos escores de acordo
com o padrão de marcação imuno-histoquímico positivo, sendo o valor atribuído de acordo
com a razão média entre a quantidade de células imunopositivas sobre o total de células
contadas, modificado de [11], na qual a intensidade da imunomarcação foi descrita e dividida
em: fraca imunomarcação (1), moderada (2) e intensa imunomarcação (3).
O número de células em cada um dos cinco microcampos foi somado e considerou-se
como unidade amostral o percentual de células imunopositivas para HIF-1α conforme
marcação nuclear e citoplasmática, bem como intensidade desta última.
Análise estatística
Os dados categóricos (sexo) foram analisados por meio do teste Exato de Fisher e os
dados quantitativos foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov,
expressos em forma de média ± erro-padrão da média (dados paramétricos) e comparados
entre grupos por meio dos testes t de Student e ANOVA multifatorial seguido do pós-teste de
Bonferroni.
Adotou-se índice de significância p < 0.05 para todas as avaliações, realizadas no
software GraphPad Prism versão 5.0 para Windows®.
RESULTADOS
Um total de 20 casos foi obtido neste estudo, sendo 10 amostras de CEO e 10
amostras de displasias. Destes, 11 eram homens e 9 mulheres; igualmente distribuídos em
ambos os grupos (DEO: 5 homens e 5 mulheres / CEO: 6 homens e 4 mulheres) (p=1.000). A
30
média de idade geral foi de 63.1±2.8 anos, sem diferença significante entre os dois grupos de
estudo (DEO: 61.7±4.0 e CEO: 64.9±3.9 anos, p=0.585).
Com relação ao perfil de imuno-marcação para HIF-1α, pôde-se observar que
58.4±6.0% das células epiteliais das displasias e 77.8±3.9% das células dos CEO avaliados
mostraram imuno-marcação citoplasmática positiva, com diferença significante entre os dois
grupos de estudo (p=0.022) (Figura 2). O percentual de células positivas para HIF-1α com
marcação nuclear também mostrou diferença significante entre os grupos de DEO (0.2±0.1%)
e CEO (2.4±0.8) (p=0.021) (Figura 3).
Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação
positiva fraca em citoplasma entre DEO (34.5±2.1%) e os CEOs (30.5±3.6%) (p=0.337); no
entanto, houve aumento significante no percentual de células marcadas com intensidade
moderada no CEO (31.5±3.8%) em relação às displasias (17.7±4.2%) (p=0.029), bem como
com intensidade forte (17.3±4.6% e 5.4±2.3%, respectivamente) (p=0.031) (Figura 4).
O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação
com os sexos masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e feminino (DEO: 54.7±8.1
e CEO: 76.5%) (p=0.350) (Figura 5). Quanto ao sexo, o percentual de imunomarcação
citoplasmática fraca no sexo masculino (DEO: 35.6±3.8 e CEO: 23.3±4.0%) e no sexo
feminino (DEO: 33.5±2.2% e CEO: 35.2±4.5%) não apresentaram diferenças significatica
(p=0.093). Da mesma forma, o sexo não influenciou de forma significante o percentual de
imunomarcação citoplasmática moderada, onde o sexo masculino DEO: 20.4±6.7 e CEO:
26.3±7.6%) apresentou imunomarcação sem diferença significativa em relação ao sexo
feminino (DEO: 15.0±5.7 e CEO: 31.6±4.8%) (p=0.398). O perfil de percentual de células
com imunomarcação citoplasmática forte também não mostrou diferença entre DEO e CEO
mediante análise do sexo (p=0.415), sendo que o homens apresentaram uma imunoexpressão
de 8.4±3.8% e 20.0±8.4%, em displasias e carcinomas respectivamente, e as mulheres
31
apresentaram uma imunomarcação de 6.2±4.0% e 9.7±4.2% em displasias e carcinomas
respectivamente (Figura 6).
Por outro lado, o percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens
mostrou aumento significante nos CEO (5.5±1.6%) em relação às DEO (0.1±0.1%) quando
comparado ao aumento da imunomarcação nuclear nos CEO (1.2±0.5%) em relação às
displasias (0.2±0.2%) de mulheres (p=0.003) (Figura 7).
Com relação ao perfil de imunomarcação mediante localização topográfica, os dados
se encontram dispostos na Tabela 1.
DISCUSSÃO
O Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1) é um fator transcricional que exerce um papel
essencial na resposta adaptativa das células em meio à baixa concentração de oxigênio.
Consiste em um complexo heterodimérico de transcrição que funciona como um regulador-
mestre da homeostase de oxigênio e é passível de sofrer mudanças conformacionais em
resposta a diferentes concentrações de oxigênio [3,6,12].
O complexo transcricional HIF-1 consiste em duas subunidades, a subunidades α e β,
que dimerizam para formar o complexo HIF-1. A subunidade HIF-1β, também conhecida
como aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ou ARNT, é expressa
constitutivamente e está presente no núcleo celular. Já a subunidade HIF-1α, presente no
citoplasma celular, é sensível ao oxigênio e têm como função o transporte da mensagem de
hipóxia ao núcleo celular promovendo a geração de uma resposta celular ao meio de baixa
concentração de oxigênio [5,12,13,14]. Ambas subunidades α e β consistem em uma base
helix- loop-helix (bHLH) e PER-ARNT-SIM (PAS) de domínio, como bHLH e PAS,
contendo factores de transcrição que mediam a ligação de DNA e a dimerização. O gene que
codifica HIF-1α está localizado no cromossomo 14 (14q21-q24) [12,13].
32
Normalmente em células bem oxigenadas, HIF-1α é hidroxilada através da enzima
prolil hidroxilase em resíduos de prolina 402 (Pro-402) e prolina 564 (Pro-564) [12,14]. Após
hidroxilação, os resíduos de HIF-1α ligam-se a proteína supressora tumoral, o ligante von
Hippel-Lindau (pVHL), que promove sua degradação através do complexo enzimático da E3-
ubiquitina [12,15]. Outra possibilidade de inibição do HIF-1α é através do fator de inibição
do HIF-1, que hidroxila Asparagina 803 por meio de domínio de transativação e
consequentemente bloqueia a ligação de co-ativadores de p300 e CBP [14].
Em resposta à hipóxia tumoral, HIF-1α é ativado e translocado para o núcleo celular,
onde dimeriza com HIF-β, recrutas co-ativadores p300/CBP e induz a expressão dos seus
alvos transcricionais através da ligação a elementos que formam um complexo de resposta a
hipóxia (HRE), que estão presentes no promotor ou regiões potenciadoras do HIF-1 genes
alvo [12,13,16].
O papel do HIF-1α na cacinogênese se dá pelo transporte da mensagem de hipóxia ao
núcleo celular, que promove uma resposta ao estresse hipóxico ao atuar no controle de mais
de 100 genes envolvidos na adaptação tumoral, como o transporte glicolítico e relacionados à
alteração do microambiente tumoral, por meio da ação na estabilização de pH e angiogênese
[12,17,18,19].
A expressão/superexpressão de HIF-1α é comumente encontrada numa variedade de
neoplasias malignas, incluindo várias neoplasias extra-gnáticas, como no carcinoma renal
[20], de bexiga [21], em trato digestivo [22], câncer de mama [23], em ovário [24], do
endométrio [25], do colo do útero [26], e em câncer de cabeça e pescoço [27]. Assim, o HIF-
1α pode consistir em um biomarcador de certos tipos de malignidades humanas e pode
desempenhar um papel importante na carcinogênese humana.
Eckert et al. [7] estudaram o HIF-1α e o Transportador de Glicose-1 (GLUT-1) em
carcinomas epidermóides, através da imunohistoquímica, na qual evidenciaram elevada
33
expressão dessas proteínas, além de sugerirem que uma superexpressão de HIF-1 possa estar
associada a um pior prognóstico, implicando que HIF-1 possa ser utilizada como marcador de
prognóstico tumoral.
A análise imunohistoquímica do presente estudo demonstrou imunomarcação de HIF-
1α em todos os casos de CEO e de DEO, condizente com alguns trabalhos que obtiveram
100% de expressão positiva em todos os casos de CEO analisados, como no estudo de [17] e
[28], e diferindo do trabalho de [7] no qual não foi observada imunomarcação em 13,4% dos
espécimes, mesmo assim, ainda persistindo em uma porcentagem significante dos casos,
indicando que o HIF-1α está envolvido no processo da carcinogênese.
A imunoexpressão de HIF-1α em CEO foi de 77.8%, um valor próximo ao encontrado
em estudos semelhantes, como o estudo de [7] (86,6%) e [8] (63,5%). Já a Imunoexpressão de
HIF-1α em DEO foi de 58.4%, valor próximo ao de [17], onde 67% das células apresentaram
imunomarcação. Ressaltamos que poucos estudos, apenas o estudo de [17], avaliam a
expressão de HIF-1α em DEO e CEO, dificultando a comparação entre os dados.
O presente estudo apresenta uma análise diferente da expressão de HIF-1α, na qual a
imunoexpressão é observada quantitativamente e qualitativamente no citoplasma e no núcleo
célular. Na literatura, encontramos trabalhos com metodologias diferentes, como o trabalho de
Eckert et al. [7] que avaliou apenas a imunomarcação citoplasmática, enquanto Lin et al. [17]
considerou apenas a contagem da imunomarcação nuclear. Dessa forma, este estudo procura
fornecer mais informações sobre a participação do HIF-1α nos estágios iniciais da progressão
tumoral.
São escassos na literatura os trabalhos que comparam e avaliam a expressão
imunohistoquímica de HIF-1α em carcinomas e displasias epiteliais orais, contudo, a grande
maioria dos trabalhos mostram fortes evidências de que carcinomas apresentam uma
imunomarcação mais intensa, principalmente marcação nuclear, quando comparado com
34
displasias [7,8,17]. Neste estudo, os resultados seguiram o que a literatura relata, sendo
evidenciada uma maior imunoexpressão nuclear e citoplasmática (moderada a forte) de HIF-
1α em carcinomas, quando comparados a displasias.
Quanto à expressão nuclear do HIF-1α, o presente estudo observou diferença
significativa na imunoexpressao entre CEO e DEO (p=0.021), sendo observado um aumento
gradual e significativo na expressão nuclear de HIF-1α de DEO para CEO, corroborando com
o estudo de Lin et al. [17], que encontrou imunoexpressão nuclear significativamente
diferente entre DEO severa e DEO moderada com CEO. Esse significativo aumento da
expressão de nuclear displasias para carcinomas sugere que o HIF-1α tenha papel importante
em eventos precoces da carcinogênese oral [17]. Contudo, a porcentagem de células com
expressão nuclear de HIF-1α foi bem pequena, apenas 2.4±0.8% dos carcinomas e raros casos
de displasias (0.2±0.1%), mas corroboram com o trabalho de Koukourakis et al. [29], que
também observou uma marcação nuclear em 6% dos casos.
Em DEO, a imunomarcação de HIF-1α não se restringiu ao terço médio do epitélio, mas
também está presente na camada basal e superficia l do epitélio (Figura 8). A expressão
nuclear de HIF-1α em amostras de CEO mostrou-se focal ou difusa. Quando focal, a
imunomarcação nuclear concentrou-se em áreas circundantes de regiões necróticas, em
células tumorais com elevada produção de ceratina e na borda infiltrante tumoral (Figura 9).
Essa imunoexpressão de HIF-1α foi mais forte em células adjacentes a áreas de necrose das
células tumorais e sugerem a presença de tecido neoplásico induzido por HIF-1α em
carcinomas [7].
É destacado que imunoexpressão, principalmente uma forte imunomarcação, de HIF-1α
pode estar associado a progressão tumoral, através do estímulo à angiogênese e à estimulação
direta de células cancerígenas [17]. Isso porque essa superexpressão é observada sob
condições em que as células necessitam de capacitação de energia para seu crescimento e
35
proliferação [7,8].
Ressalta-se neste estudo uma diferença significativa (p=0.003) de imunomarcação
nuclear de HIF-1α em carcinomas quanto ao sexo, onde o sexo masculino apresentou uma
imunomarcação significativamente maior quando comparado ao sexo feminino,
possivelmente em virtude da maior incidência de CEO e de fatores de risco associados a esse
grupo.
Na atual pesquisa, imunomarcação citoplasmática foi diferente entre CEO e DEO, onde
foi observado um maior expressão de HIF-1α em carcinomas, semelhantes ao trabalho de
Eckert et al. [7]. No presente estudo foram observados que em 77.8±3.9% das células dos
CEO apresentavam imuno-marcação citoplasmática positiva, corroborando com Fillies et al.
[8], na qual níveis detectáveis de HIF-1α foram encontrados em 63,5%.
No presente estudo, a imunoexpressão citoplasmática do HIF-1α foi significativamente
diferente entre CEO e DEO (p=0.022). Em CEO a imunoexpressão citoplasmática foi de
77,8%, corroborando com o estudo de Eckert et al. (2011) onde apresentou 86,6% marcação
citoplasmática, bem maior que observado no estudo de Koukourakis et al. [29], onde 36% das
células tiveram expressão positiva, e de Fillies et al. [8], onde 15,5% das células
apresentavam marcação citoplasmática em CEOs.
Foi observado um aumento significativo de imunomarcação citoplasmática moderada
(p=0.029) e forte (p=0.031) em carcinomas, quando comparados às displasias. Koukourakis et
al. [29] relataram que uma forte imunomarcação citoplasmática é um achado tumoral
específico e que reflete a regulação das vias de sinalização do HIF. Eckert et al. [7]
observaram que a expressão de HIF-1α foi significativamente correlacionada com a taxa de
sobrevida, pacientes cujos tumores demonstraram uma alta expressão citoplasmática de HIF-
1α apresentaram uma taxa de sobrevida bem menor quando comparados com imunomarcação
fraca.
36
Tem sido relatado que certos fatores de crescimento (como fator de crescimento
endotelial - VEGF), citocinas (como prostraglandinas E2), e sobre-expressão da proteína ras
podem aumentar a expressão de HIF-1α em células tumorais, bem com perda do gene
supressor tumoral p53. Além disso, HIF-1α pode controlar a expressão de genes da VEGF e
EPO, que possuem capacidade de proliferação e migração de células endoteliais, resultando
na promoção da angiogênese e EPO, promovendo o aumento da proliferação e crescimento
tumoral. Assim, expressão de HIF-1α pode aumentar a progressão do câncer bucal através da
promoção da angiogênese tumoral e estimulação direta do crescimento de célula tumoral [17].
A expressão de HIF-1α exerce efeito significativo na progressão tumora l, e pacientes
com elevada expressão de HIF-1α apresentaram uma taxa de sobrevida 3,49 vezes menor
quando comparada a neoplasias orais com pouca expressão dessa proteína [18]. Beasley et al.
[30] e Fillies et al. [8] propuseram a forte expressão do HIF-1α como um marcador
independente para taxa de sobrevida em pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço de
células escamosas. Santos et al. [4] sugerem a utilização da expressão da proteína HIF-1α
como um marcador tumoral de carcinoma de células escamosas para avaliar melhor as opções
terapêuticas à mão, especialmente na decisão do tratamento radioterápico pós-operatório e ao
estabelecimento de um correto prognóstico afim de evitar recidivas e necessidades de novas
intervenções terapêuticas.
Adicionalmente, no presente estudo, DEO apresentaram uma rara, mas presente,
marcação nuclear, além de elevada imunoexpressão citoplasmática de HIF-1α. Esses achados
podem refletir o envolvimento da HIF-1 nos estágios iniciais da carcinogênese [7,8,17]. De
acordo com o alto índice de marcação observado no CEO e em DEO, acredita-se que a
expressão do HIF-1 possa ser um determinante para o fenótipo tumoral e, portanto, sugere-se
que seja um indício de fenótipo maligno com maior potencial de agressividade [7].
Lin et al. [17] analisaram a expressão do HIF-1α em carcinomas epidermóides e
37
displasias epiteliais orais e observaram que os casos mais agressivos de CEO tiveram maior
expressão do HIF-1α, com correlação significativa entre a elevada expressão nuclear dessa
proteína com o tamanho do tumor e metástase para linfonodos regionais. Além disso, a
imunoexpressão aumentava entre os casos de displasias para os CEO. Assim, acredita-se que
a expressão do HIF-1α pode ser considerada um evento inicial na carcinogênese oral.
Em 2009, Uehara et al. [31] estudaram a expressão do HIF-1α e do antígeno de
proliferação nuclear (PCNA) em casos de carcinomas orais, encontrando maior índice de
marcação do HIF-1α (12,1%) nos pacientes com pior prognóstico e com metástase nos
linfonodos regionais. Nesse mesmo estudo, não observaram correlação entre HIF-1 e PCNA.
Com base nesses resultados, os autores sugerem que o HIF-1 parece exercer um importante
papel nas metástases em linfonodos regionais e pior prognóstico para pacientes com CEO.
Um dos papéis do HIF-1α é na carcinogênese e progressão tumoral. Koukourakis et al.
[29] observaram que uma superexpressão do HIF-1α está associada a um comportamento
mais agressivo de carcinomas orais e a uma elevada resistência ao tratamento radioterápico.
Já Keith et al. [19], em análise univariada, observaram que o aumento da expressão de HIF-1α
esteve correlacionado a um prognóstico ruim para casos de CEC orais.
CEO orais apresentam rápido crescimento local, com potencial significativo de invasão
local e metástases. Apesar do tratamento agressivo, a taxa de sobrevida em cinco anos ainda
se mantém sombria. O planejamento do tratamento e o prognóstico para o câncer oral são
estimados com base no aspecto clínico, por meio do sistema TNM e pelo aspecto
histopatológico [32]. No entanto, a classificação TNM é limitada, pois não fornece
informações sobre a agressividade biológica e resposta a tratamento, sendo impossível prever
com exatidão o prognóstico [32,33]. Portanto, novos marcadores moleculares que possam
predizer o prognóstico e a agressividade tumoral necessitam ser estudados, buscando um
tratamento individualizado para o câncer de boca e, nesse contexto, o HIF-1α é elencado
38
como um marcador que pode contribuir para a identificação de novos prognósticos e fatores
preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante.
CONCLUSÃO
Como conclusão do estudo, verificou-se que há uma maior expressão, nuclear e
citoplasmática, do HIF-1α em carcinomas do que em displasias, sugerindo que a expressão do
HIF-1α desempenha um papel importante na carcinogênese oral. Essa proteína pode ser
elencada como um possível marcador de progressão tumoral e estar correlacionada com o
prognóstico do câncer de cavidade oral. Portanto, sugere-se que a superexpressão dessa
proteína seja um indício de malignidade e da apresentação de um prognóstico mais agressivo.
No entanto, ainda necessita-se de mais estudos que comprovem essa real associação.
RELEVÂNCIA CLÍNICA
O Fator Induzido por Hipóxia consiste em um regulador-chave da resposta celular à
hipóxia celular e presumivelmente desempenha um papel central no controle do crescimento
do tumor. Polimorfismos ou mutações foram recentemente identificados, podendo promover
sua maior expressão.
A taxa de sobrevida do carcinoma epidermóide oral não mudou significativamente ao
longo das últimas décadas. Assim, compreender o desenvolvimento e progressão deste tipo
tumoral é fundamental para uma bem-sucedida intervenção terapêutica. Um melhor
conhecimento da sua biologia poderia contribuir para a identificação de novos prognósticos e
fatores preditivos permitindo a adaptação de cirurgia e terapia adjuvante.
Assim, estudos com HIF-1a ajudam a reflectir na adaptação de células tumorais ao meio
hipoxico e na sua contribuição para invasão tumoral.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos Laboratórios de Patologia Bucal da Universidade Federal do
Ceará e ao Laboratório de Histologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
39
Ceará campus Sobral pela colaboração técnica e estrutural para o desenvolvimento dessa
pesquisa, e à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP), pelo auxílio na realização deste trabalho e concessão de bolsa de estudo ao
estudante de pós-graduação.
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42
TABELAS
Tabela I: Perfil de Imunomarcação por HIF-1α mediante caracterização por localização
topográfica da peça de biópsia.
Percentual de Células imuno-positivas para HIF-1α
Citoplasma Núcleo
Citoplasma
Marcado
Levemente
Citoplasma
Marcado
Moderadamente
Citoplasma
Marcado
Fortemente
CEO Gengiva (n=1) 67.7 3.7 32.1 30.9 4.6 Palato (n=1) 90.3 0.1 17.5 31.5 41.2
Mucosa Jugal (n=2) 78.6±12.7 3.15±2.5 20.7±1.2 32.7±14.5 25.25±0.6 Língua (n=3) 57.6±13.8 1.3±0.9 30.9±10.5 17.5±8.2 9.2±7.0
DEO
Lábio (n=5) 58.2±9.6 0.1±0.1 33.8±2.8 16.4±7.2 7.9±3.8 Assoalho bucal (n=1) 67.4 1.0 30.7 14.6 22.1 Língua (n=1) 74.6 0.1 40.1 29.4 5.1
Palato (n=3) 53.6±13.0 0.0±0.0 35.2±5.6 17.0±8.5 1.4±0.7
Dados expressos em forma de média±EPM.
43
FIGURAS
Figura 2 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma:
imunomarcação citoplasmática positiva em 58.4±6.0% das DEOs e em 77.8±3.9% dos CEOs, independente da intensidade, com diferença significante entre os dois grupos (p=0.022).
44
Figura 3 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Núcleo:
imunomarcação nuclear positiva em 0.2±0.1% das DEOs e em 2,4%±0.8 dos CEOs com diferença significante entre os dois grupos (p=0.021).
45
Figura 4 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-
1α em Citoplasma: imunomarcação fraca em citoplasma de 34.5±2.1% das DEO e em
30.5±3.6% de CEOs sem diferença significante entre os dois grupos (p=0.337); imunomarcação moderada em citoplasma de 17.7±4.2% das DEOs e em 31.5±3.8% de CEOs com diferença significante (p=0.029); imunomarcação forte em citoplasma de 5.4±2.3% das
DEOs e em 17.3±4.6% dos CEOs com diferença significante (p=0.031).
46
Figura 5 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Citoplasma
por Gênero: Imunomarcação citoplasmática em sexo masculino (DEO: 64.0±9.2% e CEO: 69.7±11.9%) e em sexo feminino (DEO: 54.7±8.1 e CEO: 76.5%), não foi observada
diferença significativa (p=0.350).
47
Figura 6 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas Qualitativamente por HIF-
1α em Citoplasma por Gênero:
Imunomarcação citoplasmática fraca em DEO (Homens - 35.6±3.8% / Mulheres - 33.5±2.2%) e em CEO (Homens - 23.3±4.0% / Mulheres - 35.2±4.5%) não apresentou diferenças significativas entre sexos (p=0.093). Imunomarcação citoplasmática moderada em DEO
(Homens - 20.4±6.7% / Mulheres - 15.0±5.7%) e em CEO (Homens - 26.3±7.6% / Mulheres - 31.6±4.8%) não foi observado diferença em relação ao sexo (p=0.398). Imunomarcação
citoplasmática forte em DEO (Homens - 8.4±3.8% / Mulheres - 6.2±4.0%) e CEO (Homens - 20.0±8.4% / Mulheres - 20.0±8.4%) não houve diferença entre sexos (p=0.415).
48
Figura 7 - Percentual de Células Epiteliais Imuno-marcadas por HIF-1α em Nucleo por
Gênero: Aumento significante de imunomarcação nuclear em CEO (5.5±1.6%) com relação à
DEO (0.1±0.1%) no sexo masculino quando comparado ao aumento da imunomarcação nuclear em CEO (1.2±0.5%) com relação à DEO (0.2±0.2%) do sexo feminino (p=0.003).
13
Figura 8 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de displasia epitelial oral (DEO). (A) DEO exibindo imunomarcação nuclear. (B) DEO evidenciando imunomarcação extensa em células epitelias, exceto na camada basal e parabasal. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica, também apresentaram imunomarcação de HIF-1α. (400x).
14
Figura 9 - Detecção da expressão do Fator Induzido por Hipóxia-1 (HIF-1α) em espécimes de carcinoma epidermóide oral (CEO). (A) CEO bem diferenciado exibindo imunomarcação nuclear em numerosas células. (B) CEO moderadamente diferenciado evidenciando imunomarcação nuclear e citoplasmática moderada a forte. As células inflamatórias crónicas, como controle interno da reação imunoistoquímica,
também apresentaram imunomarcação de HIF-1α (400x).
13
4 CONCLUSÃO GERAL
Da avaliação dos resultados obtidos, pode-se concluir que:
A imunomarcação citoplasmática para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença
significante entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imunomarcação em CEO;
A imunomarcação nuclear para HIF-1α em CEO e DEO apresentou diferença significante
entre esses dois grupos de estudo, com aumento da imuno-marcação em CEO;
Não houve diferença significante entre o percentual de células com imunomarcação
positiva fraca em citoplasma entre CEO e DEO;
Houve aumento significante na imunomarcação citoplasmática moderada e forte de CEO
em relação às DEO;
O percentual de imunomarcação citoplasmática para HIF-1α não mostrou associação entre
os sexos;
O percentual de imunomarcação nuclear para HIF-1α em homens mostrou aumento
significante nos CEO em relação às DEO quando comparado com a imunomarcação em
mulheres.
14
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NA, X. et al. Overproduction of vascular endotelial growth factor related to von Hippel-Lindau tumor suppressor gene mutations and hypoxia- inducible factor- 1a expression in renal
cell carcinomas. J. Urol., v. 170, n. 1, p. 588–592, 2003.
NAGPAL, J.K.; DAS, B.R. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol., v.39, p.213-221, 2003.
NAKANO, Y. et al. Oral administration of K-11706 inhibits GATA binding activity, enhances hypoxia- inducible factor 1 binding activity, and restores indicators in an in vivo mouse model of anemia of chronic disease. Blood, v. 104, n. 13, p. 4300-4307, Dec. 2004.
NAKAYAMA, K. et al. Hypoxiainducible factor 1alpha (HIF-1 alpha) gene expression in
human ovarian carcinoma. Cancer Lett., v. 176, n. 1, p. 215–223, 2002.
NEVILLE, B.W. et al. Patologia Oral & Maxilofacial. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009.
OLIVEIRA, L. R.; RIBEIRO-SILVA, A. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in oral squamous cell carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 40, n. 3, p.
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OLIVER, R. J. et al. Prognostic value of facilitative glucose transporter Glut-1 in oral squamous cell carcinomas treated by surgical resection; results of EORTC Translational
Research Fund studies. Eur. J. Cancer, v. 40, n. 4, p. 503-507, Mar. 2004.
17
PEREIRA, K.M., et al. Oxygen metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review). Oncol.
Lett., v. 6, n. 2, p. 311-316, 2013.
RAVINDRAN, G.; DEVARAJ, H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with
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RYU, M. H. et al. Hypoxia- inducible factor-1alpha mediates oral squamous cell carcinoma invasion via upregulation of alpha5 integrin and fibronectin. Biochem. Biophys. Res.
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SCULLY, C. Oral cancer; evidence for sexual transmission. Br. Dent. J., v.199, n. 4, p.203-207, Aug. 2005.
SILVEIRA, E. J. D. Lesões orais com potencial de malignização: análise clínica e morfológica de 205 casos. J. Bras. Patol. Med. Lab., v.45, n.3, p.233-238, 2009.
SIVRIDIS, E. et al. Tumor and Angiogenesis Research Group. Association of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha with activated angiogenic pathways and prognosis in patients with endometrial carcinoma. Cancer, v. 95, n. 1, p. 1055–1063, 2002.
SOUSA, F.A.C.G. et al. Alterações gênicas e câncer bucal – uma breve revisão. RBPO, v.3, n.1, p.20-25, jan./mar. 2004.
STRYER, L.; TYMOCZO, J. L.; JEREMY, M. Bioquímica. 5. ed. São Paulo: Guanabara Kooogan, 2004.
SUN, W. et al. Mitochondrial mutations contribute to HIF1alpha accumulation via increased
reactive oxygen species and up-regulated pyruvate dehydrogenease kinase 2 in head and neck squamous cell carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 15, n. 2, p. 476-484, Jan. 2009.
THEODOROPOULOS, V.E. et al. Hypoxia- inducible factor 1a expression correlates with
angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer. Eur. Urol., v. 46, p. 200–208, 2004.
UEHARA, M. et al. Hypoxia- inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma and its relation to prognosis. Oral Oncol., v. 45, n. 3, p. 241-246, Mar. 2009.
VLEUGEL, M.M. et al. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1a
expression in invasive breast cancer. J. Clin. Pathol., v. 58, n. 1, p. 172–177, 2005.
ZHENG, Y. et al. Overexpression of HIF-1alpha indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis. Oncol. Lett., v. 5, n. 4, p. 1285-
1289, Apr. 2013.
ZHOU, H. et al. The hypoxia-inducible factor-responsive proteins semaphorin 4D and vascular endothelial growth factor promote tumor growth and angiogenesis in oral squamous
cell carcinoma. Exp. Cell Res., May 2012.
18
ZHU, G. Q. et al. Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play
distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma. Clin. Cancer
Res., v. 16, n. 19, p. 4732-4741, Oct. 2010.
ANEXO A – SEGUIMENTO DO REGIMENTO INTERNO
19
ANEXO B – PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA
20
ANEXO C – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, de uma pesquisa. Após ser esclarecido(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine
ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado(a) de forma alguma. Em caso de dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará
pelo telefone: (85) 3366-8338.
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA: Título do Projeto: “IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α E CD133 EM DISPLASIAS
EPITELIAIS ORAIS E CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS.”
Pesquisadora Responsável: Filipe Nobre Chaves
Endereço e Telefone para contato : Rua Min. Joaquim Bastos, 471 apto. 1502- Fátima –
CEP: 60415-040 – Tel: (85) 34912963; Cel: (85) 99221498
Orientador: Profa. Dra. Karuza Maria Alves Pereira
O propósito deste estudo é analisar a exressão imunohistoquímica do fator indutor por
hipóxia (HIF-1α) e da célula-tronco CD133 nos casos de carcinomas epidermóides e em displasias epiteliais orais, buscando marcadores de prognóstico para o câncer oral.
Está garantido o sigilo de todos os dados obtidos na pesquisa, assim como o direito de retirada do consentimento da participação na pesquisa a qualquer momento.
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO:
Eu_____________________________________________, portador do RG ___________________________, abaixo assinado, concordo em participar, como sujeito, do estudo intitulado “IMUNOEXPRESSÃO DE HIF-1α E CD133 EM
DISPLASIAS EPITELIAIS ORAIS E CARCINOMAS EPIDERMÓIDES ORAIS ”. Fui devidamente informado e esclarecido pelo pesquisador, sobre a pesquisa, os
procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido que não terei qualquer prejuízo financeiro e que posso retirar meu consentimento a qualquer momento. Foi garantido, também,
o anonimato e o sigilo dos meus dados durante todas as fases da pesquisa, inclusive após a publicação da mesma.
Sobral, ___/___/___ ____________________________ __________________________
Assinatura do Sujeito da Pesquisa Assinatura do Pesquisador
21
ANEXO D – NORMAS DE PUBLICAÇÃO EM PERIÓDICO
ORAL ONCOLOGY
Guide for Authors
Oral Oncology accepts the following article types for publication:
Editorial: Authors who are considering submitting an editorial should contact the Editor-in-
Chief with a brief outline of the proposed contribution before submission. Editorials are
welcome on any topic; however, they may also be related to work previously published
in Oral Oncology. Editorials have no abstract and no keywords, and are usually restricted to
1500 words, up to 10 references and up to 2 tables or figures if not agreed otherwise with the
Editor-in-Chief. The Editor-in-Chief can be contacted at [email protected].
Original Research Articles: Original research articles which have not been published
previously, except in a preliminary form, may be submitted as original full length research
papers. Research articles must contain an abstract, a list of up to ten keywords, and are limited
to between 3,500 and 5,000 words in length.
Review Articles: Review articles which are topical and are a critical assessment of any aspec t
of head and neck are welcome. Review articles must contain an abstract, a list of up to ten
keywords, and are limited to 5,000 words in length. Authors whose manuscripts exceed 5,000
words are advised to contact the Editorial Office prior to submission
Letters to the Editor: Letters to the Editor relating to published work in Oral Oncology are
welcome. Letters should be closely related to the contents of the article they refer to. No other
(unrelated) letters will be considered for publication.
22
After reading the Guide for Authors, please visit our online submission system to submit your
manuscript:http://ees.elsevier.com/oo.
Submission checklist
It is hoped that this list will be useful during the final checking of an article prior to sending it
to the journal's Editor for review.
Ensure that the following items are present:
One Author designated as corresponding Author:
E-mail address
Full postal address
Telephone(s) and fax numbers
• All necessary files have been uploaded
• Keywords (as comprehensive as possible)
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
• The Author Form has been completed and uploaded to EES
Further considerations:
• Manuscript has been "spellchecked" and is written in good English
• Title is clear and unambiguous
• If the manuscript is an original research article it should contain a structured abstract, if the
manuscript is a review article it should contain an unstructured abstract
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including
the Web)
23
• Colour figures are clearly marked as being intended for colour reproduction on the Web
(free of charge) and in print or to be reproduced in colour on the Web (free of charge) and in
black-and-white in print
• If only colour on the Web is required, black and white versions of the figures are also
supplied for printing purposes
• The manuscript conforms to the limits imposed on original research and review articles
(3,500 words for original research articles and 5,000 words for review articles, excluding the
abstract, keywords, references, tables and figures)
For any further information please contact the Author Support Department at
Prior to Submission
Oral Oncology will consider manuscripts prepared according to the guidelines adopted by the
International Committee of Medical Journal Editors ("Uniform requirements for manuscripts
submitted to biomedical journals", available as a PDF from http://www.icmje.org). Authors
are advised to read these guidelines.
Open Access
This journal offers authors two choices to publish their research;
1. Open Access
• Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted reuse
• An Open Access publication fee is payable by authors or their research funder
2. Subscription
• Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient groups
through our access programs (http://www.elsevier.com/access)
24
• No Open Access publication fee
All articles published Open Access will be immediately and permanently free for everyone to
read and download. Permitted reuse is defined by your choice of one of the following
Creative ommons user licenses:
Creative Commons Attribution-Non Commercial-ShareAlike (CC BY-NC-SA): for non-
commercial purposes, lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts
and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a
translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text and data mine the
article, as long as they credit the author(s), do not represent the author as endorsing their
adaptation of the article, do not modify the article in such a way as to damage the author’s
honor or reputation, and license their new adaptations or creations under identical terms (CC
BY NC SA).
Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs (CC-BY-NC-ND): for non-
commercial purposes, lets others distribute and copy the article, and to include in a collective
work (such as an anthology), as long as they credit the author(s) and provided they do not
alter or modify the article.
Creative Commons Attribution (CC-BY): available only for authors funded by organizations
with which Elsevier has established an agreement. For a full list please
see http://www.elsevier.com/fundingbodies
Elsevier has established agreements with funding bodies. This ensures authors can comply
with funding body Open Access requirements, including specific user licenses, such as CC-
BY. Some authors may also be reimbursed for associated publication
fees. http://www.elsevier.com/fundingbodies
25
To provide Open Access, this journal has a publication fee which needs to be met by the
authors or their research funders for each article published Open Access. Your publication
choice will have no effect on the peer review process or acceptance of submitted articles. The
Open Access publication fee for this journal is 2500 USD, excluding taxes.
Learn more about Elsevier’s pricing policy http://www.elsevier.com/openaccesspricing
Previous Publication
Submission of an article implies that the work described has not been published previously
(except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis), that it
is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all
authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out,
and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in English or in any
other language, without the written consent of the Publisher.
Online-only Publication
Oral Oncology offers authors the opportunity to select online-only publication as their
preferred option for publishing original research papers in the journal, rather than print
publication. Letters to the Editor which are accepted for publication and errata and corrigenda
will be published online-only and will not appear in print.
Any material which is published online-only will be published online on ScienceDirect as
paginated and fully citable electronic article. It will be listed in the contents page of a printed
issue and the full citation and abstract will be published in print. The citation and abstract of
26
the paper will also still appear in the usual abstracting and indexing databases, including
PubMed/Medline, Current Contents/Clinical Medicine and the Science Citation Index.
Authors will be asked to select which publication option they would prefer when submitting
their paper to the Editorial Office.
Randomised Controlled Trials
All randomised controlled trials submitted for publication in Oral Oncology should include a
completed Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) flow chart. Please refer
to the CONSORT statement website at http://www.consort-statement.org for more
information. Oral Oncology has adopted the proposal from the International Committee of
Medical Journal Editors (ICMJE) which require, as a condition of consideration for
publication of clinical trials, registration in a public trials registry. Trials must register at or
before the onset of patient enrolment. The clinical trial registration number should be included
at the end of the abstract of the article. For this purpose, a clinical trial is defined as any
research project that prospectively assigns human subjects to intervention or comparison
groups to study the cause-and-effect relationship between a medical intervention and a health
outcome. Studies designed for other purposes, such as to study pharmacokinetics or major
toxicity (e.g. phase I trials) would be exempt. Further information can be found
at www.icmje.org.
Ethics
Work on human beings that is submitted to Oral Oncology should comply with the principles
laid down in the Declaration of Helsinki; Recommendations guiding physicians in biomedical
27
research involving human subjects. Adopted by the 18th World Medical Assembly, Helsinki,
Finland, June 1964, amended by the 29th World Medical Assembly, Tokyo, Japan, October
1975, the 35th World Medical Assembly, Venice, Italy, October 1983, and the 41st World
Medical Assembly, Hong Kong, September 1989. The manuscript should contain a statement
that the work has been approved by the appropriate ethical committees related to the
institution(s) in which it was performed and that subjects gave informed consent to the work.
Studies involving experiments with animals must state that their care was in accordance with
institution guidelines. Patients' and volunteers' names, initials, and hospital numbers should
not be used.
Patient Consent Guidelines
Studies on patients or volunteers require ethics committee approval and informed consent
which should be documented in your paper.
Patients have a right to privacy. Therefore, identifying information, including patients'
images, names, initials, or hospital numbers, should not be included in videos, recordings,
written descriptions, photographs, and pedigrees unless the information is essential for
scientific purposes and you have obtained written informed consent for publication in print
and electronic form from the patient (or parent, guardian or next of kin where applicable). If
such consent is made subject to any conditions, Elsevier must be made aware of all such
conditions. Written consents must be provided to Elsevier on request.
Even where consent has been given, identifying details should be omitted if they are not
essential. If identifying characteristics are altered to protect anonymity, such as in genetic
pedigrees, authors should provide assurance that alterations do not distort scientific meaning
and Editors should so note.
28
If such consent has not been obtained, personal details of patients included in any part of the
paper and in any supplementary materials (including all illustrations and videos) must be
removed before submission.
Conflict of Interest
By means of a "Conflict of interest statement", all authors must disclose any financial and
personal relationships with other people or organisations that could inappropriately influence
(bias) their work. If there are no conflicts of interest, please state "None declared". This
document should be uploaded as a separate file alongside the submitted manuscript.
Role of the Funding Source
All sources of funding should be declared as an acknowledgment at the end of the text.
Authorship and Acknowledgments
All authors must be accredited on the paper and all must submit a completed Author
Form with their submission. The form must be signed by the corresponding author on behalf
of all authors and can be scanned and uploaded to EES. If you are unable to upload your
Author Form to EES, please contact the Editorial Office ([email protected]) for
further information. No subsequent change in authorship will be possible.
Copyright
29
Upon acceptance of an article, Authors will be asked to transfer copyright (for more
information on copyright seehttp://authors.elsevier.com). This transfer will ensure the widest
possible dissemination of information. A letter will be sent to the corresponding Author
confirming receipt of the manuscript. A form facilitating transfer of copyright will be
provided.
If excerpts from other copyrighted works are included, the Author(s) must obtain written
permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has
preprinted forms for use by Authors in these cases: contact Elsevier's Rights Department,
Philadelphia, PA, USA: phone (+1) 215 239 3804, fax (+1) 215 239 3805, e-mail
[email protected]. Requests may also be completed on- line via the Elsevier
homepage (http://www.elsevier.com/locate/permissions).
Authors' Rights
As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you are
referred to:http://www.elsevier.com/authorsrights.
Manuscript Submission
Submission to Oral Oncology proceeds totally online. Use the following guidelines to prepare
your article. Via the "Author Gateway" page of this journal (http://authors.elsevier.com/) you
will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system
automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article,
which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files
are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for
30
further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's
decision and requests for revision, takes place by e-mail and via the Author's homepage,
removing the need for a hard-copy paper trail.
General Points
We accept most wordprocessing formats, but Word, WordPerfect or LaTeX is preferred.
Always keep a backup copy of the electronic file for reference and safety. Save your files
using the default extension of the program used.
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The text
should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible. Most
formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not
use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold
face, italics, subscripts, superscripts etc. Do not embed "graphically designed" equations or
tables, but prepare these using the wordprocessor's facility. When preparing tables, if you are
using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row. If
no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The electronic text should be prepared
in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Author Gateway's
Guide to Publishing with Elsevier:http://authors.elsevier.com). Do not import the figures into
the text file but, instead, indicate their approximate locations directly in the electro nic text and
on the manuscript. See also the section on Preparation of electronic illustrations.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spellchecker" function of
your wordprocessor.
Word Limits
31
Original research articles submitted to the journal must be 3,500 words in length or less
(excluding the abstract, keywords, references, tables and figures). Review articles submitted
to the journal must be 5,000 words or less in length (excluding the abstract, keywords,
references, tables and figures).
Presentation of Manuscript
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not a
mixture of these). Italics are not to be used for expressions of Latin origin, for example, in
vivo, et al., per se. Use decimal points (not commas); use a space for thousands (10 000 and
above).
Language Polishing
Authors who require information about language editing and copyediting services pre- and
post-submission please visit http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/
languagepolishing or contact [email protected] for more information. Please note
Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any products, goods or services offered
by outside vendors through our services or in any advertising. For more information please
refer to our Terms and Conditions:http://www.elsevier.com/wps/find/termsconditions.cws_
home/termsconditions
Provide the following data on the title page:
32
Title: Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoid
abbreviations and formulae where possible.
Author names and affiliations: Where the family name may be ambiguous (e.g., a double
name), please indicate this clearly. Present the Authors' affiliation addresses (where the actual
work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter
immediately after the Author's name and in front of the appropriate address. Provide the full
postal address of each affiliation, including the country name, and, if available, the e-mail
address of each Author.
Corresponding Author: Clearly indicate who is willing to handle correspondence at all stages
of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone and fax numbers
(with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete
postal address.
Present/permanent address: If an Author has moved since the work described in the article
was done, or was visiting at the time, a "Present address"' (or "Permanent address") may be
indicated as a footnote to that Author's name. The address at which the Author actually did
the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are
used for such footnotes.
Suggestions for reviewers: Please supply the names of up to three potential reviewers for your
manuscript. Please do not suggest reviewers from your own institution, previous or current
collaborators. Please provide full names, addresses and email addresses of suggested
reviewers. Please note: the final choice of reviewers is that of the Editor and the journal
reserves the right not to use reviewers which have been suggested by the authors.
Abstract: A concise and factual abstract of no more than 250 words is required. The abstract
must be structured for original research articles and articles reporting the results of clinical
33
trials. The abstract should be divided by subheadings as follows: Objectives, Materials and
Methods, Results and Conclusion.
The abstract should not be structured for review articles. The abstract should state briefly the
purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often
presented separate from the article, so it must be able to stand alone.
Keywords: Immediately after the abstract provide a maximum of ten keywords, to be chosen
from the Medical Subject Headings from Index Medicus. These keywords will be used for
indexing purposes. It is usually necessary to include keywords such as Oral Cancer, or Head
and Neck cancer
Abbreviations: Define abbreviations or acronyms that are not standard in this field at their
first occurrence in the article: in the abstract but also in the main text after it. Ensure
consistency of abbreviations throughout the article.
Text: This should start on the third page and should be subdivided into the following sections:
Introduction, Patients (or Materials) and Methods, Results, and Discussion.
References: Responsibility for the accuracy of bibliographic citations lies entirely with the
authors.
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and
vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. "Unpublished data" and
"Personal communications" are not allowed. As an alternative, say in the text, for example,
'(data not shown)' or '(Dr F.G. Tomlin, Karolinska Institute)'. Citation of a reference as "in
press" implies that the item has been accepted for publication and a copy of the title page of
the relevant article must be submitted.
Indicate references by superscript numbers in the text. The actual authors can be referred to,
but the reference numbers must always be given. Number the references in the reference list
in the order in which they appear in the text.
34
Examples:
1. Llewellyn CD, Johnson NW, Warnakulasuriya KAAS. Risk factors for squamous cell
carcinoma of the oral cavity in young people - comprehensive literature review. Oral
Oncol 2001;37(5):401-418.
2. Gullick WJ, Venter DJ. The c-erbB2 and its expression in human tumors. In: Waxman J,
Sikora K, editors. The molecular biology of cancer. Oxford: Blackwell Scientific, 1989. p. 38-
53.
3. Scully C, Cawson RA. Medical Problems in Dentistry. 5th edition Oxford: Butterworth-
Heinemann. 2004
For more than 6 authors that first 6 should be listed followed by "et al". For further details
you are referred to "Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical
Journals" (J Am Med Assoc 1997; 277 : 927-934) (see
also http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/terms_cond.html).
Figure Captions, Tables, Figures and Schemes
Present these, in this order, at the end of the article. They are described in more detail below.
High-resolution graphics files must always be provided separate from the main text file (see
Preparation of illustrations).
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article, using
superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text, and this
feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in the text
and present the footnotes themselves on a separate sheet at the end of the article. Do not
include footnotes in the Reference list.
35
Table footnotes
Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes
to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid
vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do
not duplicate results described elsewhere in the article.
Nomenclature and Units
Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of units
(SI). If other quantities are mentioned, give their equivalent in SI.
Preparation of Electronic Illustrations
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.
• Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Helvetica, Times, Symbol.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide all illustrations as separate files and as hardcopy printouts on separate sheets.
• Provide captions to illustrations separately.
36
• Produce images near to the desired size of the printed version.
• A detailed guide on electronic artwork is available on our
website: http://authors.elsevier.com/artwork
You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here.
Formats
Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please "save as"
or convert the images to one of the following formats (Note the resolution requirements for
line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below.):
EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as "graphics".
TIFF: Colour or greyscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.
TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.
TIFF: Combinations bitmapped line/half- tone (colour or greyscale): a minimum of 500 dpi is
required.
DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft Office
applications please supply "as is".
Please do not:
• Supply embedded graphics in your wordprocessor (spreadsheet, presentation) document;
• Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution
is too low;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
37
If, together with your accepted article, you submit usable colour figures then Elsevier will
ensure, at no additional charge, that these figures will appear in colour on the Web (e.g.,
ScienceDirect and other sites) in addition to colour reproduction in print.
Captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the
figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a descr iption of the
illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all symbols
and abbreviations used.
Line drawings
The lettering and symbols, as well as other details, should have proportionate dimensions, so
as not to become illegible or unclear after possible reduction; in general, the figures should be
designed for a reduction factor of two to three. The degree of reduction will be determined by
the Publisher. Illustrations will not be enlarged. Consider the page format of the journal when
designing the illustrations.
Do not use any type of shading on computer-generated illustrations.
Photographs (halftones)
Remove non-essential areas of a photograph. Do not mount photographs unless they form part
of a composite figure. Where necessary, insert a scale bar in the illustration (not below it), as
opposed to giving a magnification factor in the caption.
Note that photocopies of photographs are not acceptable.
Preparation of supplementary data
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Elsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific
research. Supplementary files offer the Author additional possibilities to publish supporting
applications, movies, animation sequences, high-resolution images, background datasets,
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is directly usable, please ensure that data is provided in one of our recommended file formats.
Authors should submit the material in electronic format together with the article and supply a
concise and descriptive caption for each file. For more detailed instructions please visit our
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AudioSlides
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article. AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online
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their own words and to help readers understand what the paper is about. More information
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will automatically receive an invitation e-mail to create an AudioSlides presentation after
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