UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · o teste do reconhecimento de objecto, e os...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

MARA YONE SOARES DIAS FERNANDES

EFEITO NEUROPROTETOR DO α-BISABOLOL EM

CAMUNDONGOS SUBMETIDOS Á ISQUEMIA CEREBRAL

FOCAL PERMANENTE

FORTALEZA

2015




FOCAL PERMANENTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Profª. Drª. Geanne Matos de

Andrade

FORTALEZA

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

F41e Fernandes, Mara Yone Soares Dias.

Efeito neuroprotetor do α-bisabolol em camundongos submetidos á isquemia cerebral

focal permanente / Mara Yone Soares Dias Fernandes. – 2015.

108 f. : il.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de

Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2015.

Orientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade.

1. Isquemia Encefálica. 2. Inflamação. 3. Fármacos Neuroprotetores. 4. Anti-Inflamatórios. I.

Título.

CDD 615.1




FOCAL PERMANENTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Aprovada em: 02/07/2015

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________

Profª. Drª. Geanne Matos de Andrade

DFF/FM/UFC

_____________________________________

Profª. Drª. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal

DFP/F/UFC

_____________________________________

Profº Drº Orleâncio Gomes Ripardo de Azevedo

FANOR/DEVRY

"Si ka badu ka ta biradu"

Eugénio Tavares

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me dar saúde para a batalha do dia-a-dia. Sem

ele, nunca conseguiria forças para finalizar este Mestrado.

As minhas irmãs, Amarita e Aya pela cumplicidade e companheirismo desde que eu

me entendo por gente.

Aos meus pais, Zeca e Daluz, por esta conquista. Pelo tempo e paciência dedicados a

minha formação, pelos ensinamentos e exemplos, por estarem sempre presentes e pelo apoio

nas horas mais difíceis.

À minha orientadora, prof.ª Geanne, por quem nutro uma admiração sincera como

pessoa e como pesquisadora, por me orientar neste trabalho, pela confiança, ensinamentos,

apoio e dedicação.

Agradeço aos meus colegas do Laboratório de Neurociência e Comportamento, com

quem tenho a honra e o prazer de trabalhar. Obrigado por compartilhar comigo boa parte do

tempo, os conhecimentos, por estarem sempre disponíveis a prestarem uma ajuda e por

tornarem o ambiente de trabalho um lugar agradável e harmônico. Seria uma má-fé absurda

imaginar este trabalho sem vocês.

A Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade dе fazer о curso. Pelo sеu corpo

docente, direção е administração qυе oportunizaram а janela qυе hoje vislumbro υm horizonte

superior, eivado pеlа acendrada confiança nо mérito е ética aqui presentes.

Agradeço também ao Órgão Financiador FUNCAP, pela bolsa concedida ao longo do

curso.

RESUMO

FERNANDES, MYS. EFEITO NEUROPROTETOR DO α-BISABOLOL EM

CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À DE ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL

PERMANENTE. DEFESA DO MESTRADO, PÓS-GRADUAÇÃO EM

FARMACOLOGIA, UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.

O acidente vascular cerebral (AVE) é uma das principais causa de mortalidade no Brasil,

acometendo cerca de 200.000 indivíduos anualmente. A fisiopatologia do AVE isquêmico

envolve uma complexa cascata de eventos como a inflamação e o estresse oxidativo que

podem à morte neuronal e déficits cognitivos. O α-bisabolol é um álcool sesquiterpeno,

monocíclico, que ocorre na natureza e é encontrado como constituinte majoritário do óleo

essencial sintético da Matricaria chamomilla, que possui atividade antiinflamatória,

antioxidante e anti-apoptótica já descritas. Para avaliar o efeito neuroprotetor deste composto

em camundongos submetidos à oclusão permanente da artéria cerebral media (pMCAO), os

animais foram pré e pós tratados com α-bisabolol nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, v.o,

durante 24, 48, 72, 96 ou 120 horas após a isquemia. Os animais foram avaliados 24h após a

isquêmia para verificar a área de lesão isquêmica, avaliação neurológica e atividade da

mieloperoxidase. 72 horas após a pMCAO, os testes de atividade locomotora, memória de

trabalho e memória aversiva recente foram realizados. 96 horas após a pMCAO foi realizado

o teste do reconhecimento de objecto, e os animais foram eutanasiados para a realização da

Imunohistoquimica para TNF-α, iNOS e GFAP e análise histologica para Cresil violeta e

Fluoro Jade C. Finalmente, 120h após a isquemia, avaliou-se a memória espacial. O α-

bisabolol reduziu significativamente a lesão isquemica e o déficit neurológico e normalizou a

atividade locomotora. O α-bisabolol mostrou proteção contra os déficits nas memórias de

trabalho, espacial, reconhecimento de objeto e aversiva. O α-bisabolol (200 mg/kg) preveniu

significativamente o aumento da MPO e TNF-α no córtex temporal e o aumento do iNOS

tanto no córtex temporal como no estriado. Tambem preveniu o aumento da astrogliose nessas

áreas. O α-bisabolol (200 mg/kg) mostrou protecção contra a morte neuronal. Os resultados

do presente estudo mostraram que o α-bisabolol possui atividade neuroprotetora

provavelmente devido a sua ação antiinflamatória, mas outros mecanismos não podem ser

descartados.

Palavras-chave: Isquemia Encefálica. Inflamação. Fármacos Neuroprotetores. Anti-

Inflamatórios.

ABSTRACT

FERNANDES, MYS. NEUROPROTECTIVE EFFECT α-BISABOLOL IN MICE

SUBMITTED TO ISCHEMIA MODEL PERMANENT FOCAL CEREBRAL. DEFENSE

OF MASTERS, GRADUATE IN PHARMACOLOGY, FEDERAL UNIVERSITY OF

CEARA.

Stroke is the leading cause of mortality in Brazil, affecting about 200,000 individuals

annually. The pathophysiology of ischemic stroke involves a complex cascade of events such

as inflammation and oxidative stress which will lead to neuronal death and cognitive deficits.

The α-bisabolol is a sesquiterpene alcohol, natural, monocyclic, found as main constituents of

the essential oil of Matricaria chamomilla, which has anti-inflammatory, antioxidant and anti-

apoptotic already described. To evaluate the neuroprotective effects of this compound in mice

underwent permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO), the animals were pre

and post treated with α-bisabolol at doses of 50, 100 and 200 mg / kg, orally for 24, 48, 72, 96

or 120 hours after pMCAO. The animals were evaluated 24 hours after ischemia to verify the

area of ischemic damage, and neurological evaluation and myeloperoxidase activity. Seventy-

two hours after pMCAO, the locomotor activity tests, working memory and aversive recent

memory were performed. Ninety six hours after the pMCAO was performed the object

recognition test, and the animals were euthanized for carrying out the immunohistochemistry

for TNF-α, iNOS and GFAP and for histology analyes Cresil violet and Fluoro Jade C.

Finally, 120 h after pMCAO, the spatial memory was evaluated. The α-bisabolol reduced

significantly ischemic damage and neurological deficit and normalized the locomotor activity.

The α-bisabolol showed protection against the deficits in working, spatial, object recognition

and aversive memories. The α-bisabolol (200 mg / kg) significantly prevented the increase of

MPO and TNF-α in the temporal cortex and the increased of iNOS both in the temporal cortex

and in striatum. Also prevented the increase in astrogliosis in there area. The α-bisabolol (200

mg / kg) showed protection against neuronal death. The results of this study showed that α-

bisabolol has neuroprotective activity probably due to its anti-inflammatory action, but other

mechanisms can not be discarded.

Key-word: Brain Ischemia. Inflammation. Neuroprotective Agents. Anti-Inflammatory

Agents.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática do Polígono de Willis................................................. 19

Figura 2 - Cascata neurotóxica na isquemia e reperfusão........................................................ 23

Figura 3 - Resposta inflamatória após isquemia cerebral focal............................................... 27

Figura 4 - Estrutura química do α-bisabolol.......................................................................... 38

Figura 5 - Protocolo experimental........................................................................................... 44

Figura 6 - Cirurgia de isquemia cerebral focal em um camundongo: momento da

aproximação do bisturi eléctrico para coagulação da artéria cerebral média...................... 45

Figura 7 - Arena do Campo Aberto........................................................................................ 49

Figura 8 - Labirinto em Y....................................................................................................... 50

Figura 9 - Aparelho de Esquiva Passiva................................................................................. 51

Figura 10 - Arena para o teste de reconhecimento de objetos................................................. 52

Figura 11 - Labirinto aquático................................................................................................ 53

Figura 12 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o número de total de escores

obtidos na avaliação neurológica de camundongos submetidos à pMCAO............................ 57

Figura 13 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano neuronal

isquêmico de camundongos submetidos à pMCAO................................................................58

Figura 14 - Visualização do dano neuronal isquêmico através da coloração de TTC......... 59

Figura 15 - Fotomicrografias representativas do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a

degeneração neuronal através da coloração com o cresil violeta no córtex temporal 5 dias após

a pMCAO.............................................................................................................................. 60

Figura 16- Avaliação média da intensidade da degeneração neuronal através da coloração com

o cresil violeta no córtex temporal 5 dias após a pMCAO de camundongos tratados com α-

bisabolol................................................................................................................................... 61

Figura 17- Avaliação média da intensidade da degeneração neuronal através da coloração com

o cresil violeta no estriado de camundongos 5 dias após a pMCAO e tratados com α-

bisabolol.................................................................................................................................. 61


degeneração neuronal (coloração por Fluoro Jade C) em camundongos submetidos à

pMCAO.....................................................................................................................................62

Figura 19 - Avaliação da média da intensidade de fluorescência no córtex através da

coloração com Fluoro Jade C 5 dias após a pMCAO de camundongos isquemiados tratados

com α-bisabolol.................................................................................................................... 63

Figura 20 - Avaliação da média da intensidade de fluorescência (MIF) no estriado através da


com α-bisabolol........................................................................................................................ 63

Figura 21 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200mg/kg/dia) sobre o número de cruzamentos no

teste do campo aberto de camundongos submetidos à pMCAO.............................................. 64

Figura 22 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200mg/kg/dia) sobre o número de “rearings” no

teste do campo aberto de camundongos submetidos à pMCAO.............................................. 65

Figura 23 – Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de trabalho de

camundongos submetidos pMCAO........................................................................................ 66

Figura 24 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória aversiva recente de

camundongos submetidos pMCAO........................................................................................ 67

Figura 25 - Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória episódica avaliada

através do teste de reconhecimento de objetos de camundongos submetidos à

pMCAO................................................................................................................................... 68

Figura 26 - Efeito do α-bisabolol (50, 100 e 200 mg/kg) sobre o aprendizado avaliada através

do tempo de latência nos treinos para alcançar a plataforma de camundongos submetidos à

pMCAO. .................................................................................................................................. 70

Figura 27 - Efeito do α-bisabolol (50, 100 e 200 mg/kg) sobre a memória espacial, avaliada

através do parâmetro latência para alcançar a plataforma, de camundongos submetidos à

pMCAO................................................................................................................................... 70

Figura 28– Efeito do α-bisabolol (50, 100 e 200 mg/kg) sobre a memória espacial, avaliada

através do parâmetro número de cruzamentos de camundongos submetidos à

pMCAO.....................................................................................................................................71

Figura 29 - Efeito do α-bisabolol (50, 100 e 200 mg/kg) sobre a memória espacial, avaliada

através do parâmetro tempo de permanência no quadrante, de camundongos submetidos à

pMCAO por oclusão da ACM................................................................................................ 71

Figura 30 - Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO no córtex temporal de

camundongos 24h após a pMCAO …................................................................................... 72

Figura 31 - Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO em corpo estriado de

camundongos 24h após a pMCAO......................................................................................... 73

Figura 32 - Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO no hipocampo de

camundongos 24h após a pMCAO...........................................................................................73


expressão de TNF-α no córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal permanente

por oclusão da artéria cerebral..................................................................................................74

Figura 34 - Efeito neuroprotetor do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de TNF-α no

córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal permanente por oclusão da artéria

cerebral......................................................................................................................................75


expressão de iNOS no córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal permanente

por oclusão da artéria cerebral..................................................................................................76

Figura 36- Efeito neuroprotetor do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de iNOS no

córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal permanente por oclusão da artéria

cerebral......................................................................................................................................77

Figura 37 - Imagens representativas do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a ativação de

astrócitos (GFAP) no córtex temporal e no estriado de camundongos submetidos à

pMCAO….................................................................................................................................78

Figura 38 - Efeito neuroprotetor do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a ativação de astrócitos

(GFAP) no estriado e córtex temporal de camundongos submetidos à pMCAO

...................................................................................................................................................79

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 – Grupos de tratamento................................................................................. 43

Tabela 02- Avaliação neurológica................................................................................ 46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACM artéria cerebral média

AD Doença de Alzheimer

AMPA Ácido amino-3-hidroxi-5-metil-isoxasole-propiônico

ASICs Canais iônicos sensíveis à acidez

ATP Trifosfato de Adenosina

AVE Acidente Vascular Encefálico

CD11c Glicoproteína de integrina expressa por mononocytes e macrófagos, neutrófilos,

células dendríticas mielóides e um pequeno subconjunto de linfócitos.

CE Córtex Entorrinal

cm Centímetros

COX Clicooxigenase

CypD Cyclophilina D

DNA Ácido Dexorribonucléico

DP Doença de Parkinson

eNOS óxido nitrico sintase endotelial

EPM Erro Padrão Médio

FO Falso-operado

FSC Fluxo sanguíneo cerebral

h Hora

H2O2, R-OOH, R-OO Peróxidos

HO Radical hidroxila

HTAB Brometo de cetil trimetil amônio

i.p. Intraperitoneal

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1

ICAM-1 Molécula de adesão intracelular-1

IL Interleucina

iNOS óxido nitrico sintase induzida

iNOS Óxido nítrico sintase induzida

KCl Cloreto de potássio

kg Kilograma

LFA-1 Antigénio 1 associado à função de linfócitos

LOX Lipoxigenase

LTP Potenciação de longa duração

mA Miliampere

Mac-1 Antigénio de macrófagos-1

MCP-1 Proteína quimiotática de monócito-1

mg Miligramas

min Minutos

mL Mililitros

mM Milimolar

NaCl Cloreto de sódio

NF-κB Factor nuclear kappa B

Nm Nanômetro

NMDA N-Metil-D-Aspartato

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido nítrico

O2- Ânion superóxido

O2- Superóxido

OCL- Hipoclorito

ONOO - peroxinitrito

PKC Proteína Quinase C

pMCAO Oclusão permanente da artéria cerebral média

RIPK Receptor-Interação de Proteina Kinase

RLs Espécies reativas ou radicais livres

RN Necrose Regulada

RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RPM Rotações por minuto

s Segundos

SNC Sistema Nervoso Central

TNF-α Fator de necrose tumoral-α

TTC Cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazol

VCAM-1 Molécula-1 de adesão celular vascular

α-Bis α-bisabolol

μL Microlitros

μM Micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 16

1.1 Definição do AVE...............................................................................................................16

1.1.1Epidemiologia e classificação AVE………………………………………………....... 16

1.2 AVE isquêmico................................................................................................................. 17

1. 3 Isquemia Cerebral Focal: Modelos experimentais in vivo…………………….............. 18

1.4 Fisiopatologia do AVE isquêmico.................................................................................... 20

1.4.1 Core e penumbra........................................................................................................... 21

1.4.2 Depleção ATP............................................................................................................... 22

1.4. 3 Cálcio e excitotoxicidade................................................................................................24

1.4.4 Inflamação ...................................................................................................................... 25

1.4.5 Estresse oxidativo........................................................................................................... 28

1.4.6 Apoptose......................................................................................................................... 31

1.5 Memória............................................................................................................................. 33

1.6 Terpenos e neuroproteção.................................................................................................. 36

1.6.1 (−)-α-Bisabolol................................................................................................................ 38

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 40

3 OBJETIVOS........................................................................................................................ 41

3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................... 41

3.2 Objetivos Específicos......................................................................................................... 41

4 MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................42

4.1 Animais ........................................................................................................................ 42

4.2 Drogas............................................................................................................................ 42

4.3 Protocolo Experimental.................................................................................................. ...42

4.4 Isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO)........................ 44

4.5 Avaliação Neurológica …………………………........................................................... 45

4.6 Quantificação do dano isquêmico através da coloração pelo Cloreto de 2,3,5-

Trifeniltetrazol (TTC) .......................................................................................................... 46

4.7 Avaliação da degeneração neuronal através do Violeta de Cresil…………..................... 47

4.8 Avaliação da degeneração neuronal através do Fluoro jade C…………….................. 48

4.9 Avaliação da atividade locomotora (Teste de campo aberto)......................................... 48

4.10 Avaliação da Memória de trabalho -Teste de labirinto em Y…………………...............49

4.11 Avaliação da memória aversiva – Teste da Esquiva Passiva............................................50

4.12 Avaliação da memória episódica – Teste do Reconhecimento de Objetos …............... 51

4.13 Avaliação da Memória espacial-Teste do labirinto aquático…………………............. 52

4.14 Ensaio para Mieloperoxidade (MPO)……….................................................................. 53

4.15 Quantificação do TNF-α e iNOS………………………………………………............ 53

4.16 Avaliação da astrogliose através da imunomarcação com GFAP……………................ 54

4.17 Análise estatística............................................................................................................. 55

5 RESULTADOS.................................................................................................................... 57

5.1 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a avaliação neurológica de camundongos

submetidos a pMCAO.......................................................................................................... 57

5.2 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano isquêmico de camundongos

submetidos à pMCAO............................................................................................................. 58

5.3 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a morte neuronal evidenciada através da

coloração com o cresil violeta no córtex temporal e no estriado de camundongos submetidos a

pMCAO................................................................................................................................... 60


coloração com Fluoro Jade no córtex temporal de camundongos submetidos a pMCAO

................................................................................................................................................. 62

5.5 Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg na atividade locomotora de camundongos

submetidos a pMCAO............................................................................................................. 64

5.6 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de trabalho de camundongos

submetidos à pMCAO.............................................................................................................. 66

5.7 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memórial aversiva de camundongos

submetidos a pMCAO.............................................................................................................. 67

5.8 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória episódica avaliada através do

teste de reconhecimento de objetos em camundongos submetidos à pMCAO

................................................................................................................................................ 68

5.9 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória espacial de camundongos

submetidos à pMCAO ............................................................................................................ 79

5.10 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) no

córtex temporal, corpo estriado e hipocampo de camundongos submetidos a

pMCAO................................................................................................................................... 72

5.11 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de TNF-α no córtex e no estriado de

ratos submetidos a pMCAO..................................................................................................... 74

5.12 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão do iNOS no córtex e no estriado de

ratos submetidos a pMCAO..................................................................................................... 76

5.13 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a ativação de astrócitos evidenciada através da

imunomarcação com GFAP no corpo estriado e córtex temporal de camundongos submetidos

à pMCAO................................................................................................................................. 77

6 DISCUSSÃO........................................................................................................................ 80

7 CONCLUSÃO..................................................................................................................... 91

REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 92

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 Definição do AVE

O Acidente Vascular Encefálico (AVE) é um déficit neurológico súbito que ocorre

quando um vaso sanguíneo que transporta oxigênio e nutrientes para cérebro é bloqueado ou

sofre rupturas. Quando isso acontece uma parte do cérebro fica privada de sangue e,

consequentemente, de oxigênio, que são fundamentais para a sua sobrevivência, e em

decorrência disso ocorre morte das células neuronais (SOCIEDADE AMERICANA DE

CARDIOLOGIA, 2013).

1.1.1 Epidemiologia e classificação do AVE

De acordo com a Organização Mundial de Saúde o AVE é a segunda causa de morte

no mundo e a primeira causa de incapacitação em adultos, acometendo aproximadamente 16

milhões de pessoas por ano, e destas 6 milhões chegam a óbito (BROUNS, 2009). No Brasil,

ocorrem cerca de 100 mil óbitos por ano devido ao AVE (LOTUFO, 2005; WHO, 2011). É a

maior causa de morte e incapacitação crônica no mundo, com grande impacto sobre a saúde

da população, e a principal causa de mortalidade no Brasil, acometendo cerca de 200.000

indivíduos anualmente. (CINCURA et al., 2009; MARTINS et al., 2013). Cerca de 87% são

de origem isquêmica, 10% hemorragias intracerebrais e 3% hemorragias subaracnóideas (GO

et al., 2013).

A incidência do AVE é maior em homens entre 45-85 anos e em mulheres acima de 85

anos e os principais fatores de risco são as doenças cardiovasculares e a arteriosclerose

(AMARENCO et al., 2009). Pesquisas apontaram, também, o tabagismo, diabetes mellitus e,

em particular, a hipertensão arterial como alguns fatores de risco associados ao aparecimento

da doença (FOLSOM, 1999; O’DONNELL, 2010; TANIZAKI, 2000). Sendo a hipertensão

arterial o principal fator de risco, tanto para doenças cardiovasculares como para as cérebro

vasculares. (KANNEL, 1996; WILKINS et al., 2010).

Feigin et al. (2009) mostraram que com o decorrer dos anos tem sido observado uma

diminuição da mortalidade precoce causada por AVE, tanto nos países de alta renda como nos

de média e baixa, mas, em geral, essa taxa de letalidade precoce por AVE em países de baixa

e média renda na última década é de 25% superior às taxas em países de alta renda.

17

O envelhecimento da população pode estar diretamente relacionado com esse aumento

na taxa de mortalidade (GARRITANO et al., 2012). E o fato das mulheres terem uma

expectativa de vida maior que os homens pode explicar o porquê da maior incidência global

de AVE em mulheres do que em homens, já que as mulheres são responsáveis por 60% de

todo os casos (REEVES et al., 2008). Além disso, as mulheres tendem a ter maior

incapacidade após acidente vascular cerebral, que poderia ser uma consequência do longo

prazo da menopausa e da perda da proteção cardiovascular com o decorrer dos anos (XING et

al., 2009).

Atualmente, tem sido observado um aumento no número de pessoas jovens acometidas

AVE e esse crescimento tem despertado um aumento do interesse nas pesquisas com esses

indivíduos, devido ao grande impacto individual e sócio- econômico causado pela elevada

taxa de morbimortalidade que a patologia pode causar nessa população economicamente ativa

(CABRAL, 2008; DER MAUR et al., 2005; PUTAALA, 2010).

O AVE é dividido em duas categorias: isquêmico e hemorrágico. O AVE isquêmico é

resultante da insuficiência de suprimento sanguíneo cerebral, que pode ser transitório ou

permanente, representando, no Brasil, segundo diferentes estatísticas, de 53% a 85% dos

casos de AVE, predominando a sua forma permanente (PIRES, 2004). No AVE hemorrágico

ocorre sangramento no parênquima cerebral ou no espaço subaracnóideo (FERRO;

VERDELHO, 2000; GILGUN-SHERKI et al., 2002).

1.2 AVE isquêmico

A lesão isquêmica cerebral é um evento patológico causado por um bloqueio

temporário ou permanente de algumas estruturas vasculares do SNC. O AVE isquêmico é

uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo (GO et al. 2014), sendo

responsável por 88% de todos os casos. É caracterizado por um desenvolvimento rápido de

sinais e sintomas clínicos através de uma perturbação global ou focal. Esse tipo de derrame

pode durar de 24 horas a semanas e pode levar à morte, sem provocar uma alteração vascular

aparente (SILASI; MURPHY, 2014).

Até o momento, não existe nenhum tratamento reparador para as repercussões da

isquemia e os pacientes podem sofrer uma perda permanente da função cerebral. Abordagens

terapêuticas com a finalidade de reduzir os danos causados nos pacientes que sofrem um AVE

18

têm por intenção reverter os danos neurológicos através da redução da lesão do SNC e

promover, desse modo, a regeneração neural. O curso normal da doença em pacientes

acometidos pelo AVE inclui um período de isquemia aguda, onde as áreas focais sujeitas a

lesão isquêmica são vulneráveis à morte celular. Na fase subaguda, tecido adjacente ao núcleo

isquêmico conhecido por penumbra isquêmica é mais vulnerável a injúrias. A

neuroplasticidade, a angiogênese e a neurogêneses são processos que ocorrem após a

isquemia. O papel da neuroplasticidade e angiogênese após o AVE foi recentemente revisto

(ERGUL et al., 2012; HERMANN; CHOPP, 2012).

Hoje, a única terapia utilizada para o tratamento do AVE isquêmico, uma terapia que

tenta reestabelecer a perfusão no local, é com o fator ativador de plasminogênio tecidual

recombinante (rTPA) (NESBIT et al., 2004). Entretanto, o rTPA tem uma janela terapêutica

estreita, de 3 a 4.5 horas (HACK et al., 2004; WARDLAW et al., 2012), após esse período

existe um risco associado a sua utilização, por poder causar hemorragia intracraniana,

especialmente em pacientes com isquemias severas ou idade avançada (VAN DER WORP;

VAN DER GIJN, 2007).

1.3 Isquemia Cerebral Focal: Modelos experimentais in vivo

Vários modelos de isquemia cerebral foram desenvolvidos nas mais diversas espécies

de animais, desde primatas até porcos, cachorros, ovelhas, gatos, esquilos da Mongólia,

coelhos, ratos e camundongos, com o intuito de lidar com fatores de risco específicos,

determinar processos de reparação neural e para testar novas estratégias neuroprotetoras. Nos

modelos animais de isquemia cerebral ocorre a diminuição do aporte de glicose e oxigênio

para o tecido. Este evento mimetiza a ocorrência de diversos mecanismos fisiopatológicos que

dependem da severidade, duração e localização da lesão isquêmica. (TRAYSTMAN, 2003;

BACIGALUPPI; COMI; HERMANN, 2010).

As artérias carótidas e as artérias vertebrais são os principais vasos de irrigação do

cérebro e se comunicam através do polígono de Willis, uma anastomose arterial que fornece o

suprimento sanguíneo para os hemisférios cerebrais. Este é formado pelas artérias cerebral

anteriores e posteriores, artérias comunicante anterior e posterior e pela carótida interna

(WIKIMIDIA COMMONS, 2008) (Figura 1).

19

Os modelos de oclusão da Artéria Cerebral Média (ACM) podem ser divididos em

modelos que necessitam de craniectomia, realizados através de técnicas cirúrgicas como

eletrocauterização, clampeamento e ligadura da artéria; modelos de oclusão da circulação

posterior, onde as artérias vertebrobasilares são ocluídas; modelos que não necessitam de

craniectomia, onde estão os modelos de embolismo, introdução de fio intraluminal,

fototrombose com corante Rosa de Bengala e modelo da endotelina-1, e modelos de trombose

venosa cerebral. (DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; SICARD; FISHER, 2009; LIU;

MCCULLOUGH, 2011).

Figura 1. Representação esquemática do Polígono de Willis.

Fonte: WIKIMIDIA COMMONS, 2008.

A ACM é a artéria cerebral mais comumente acometida no AVE em humanos, pois ela

irriga a região lateral do hemisfério e estruturas subcorticais. O modelo de oclusão da ACM é

o modelo de isquemia cerebral mais utilizado, pois permite o estudo da isquemia cerebral sem

o efeito da reperfusão. (LIPTON, 1999; DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; SICARD;

FISHER, 2009).

Os modelos experimentais de isquemia in vivo podem ser classificados em globais,

quando afetam todo o cérebro, ou focais, quando afetam uma pequena região, Permanentes

quando não tem recirculação sanguínea, ou transitórios quando seguidos da recirculação

(BREUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).

20

A isquemia cerebral global ocorre quando grandes vasos extracranianos são

interrompidos, reduzindo assim todo o fluxo cerebral, como o que ocorre em alguns distúrbios

circulatórios como o ataque cardíaco ou hipotensão severa. (SCHMIDT-KASTNER;

FREUND, 1991). O processo de isquemia cerebral global resulta em um padrão histológico

previsível, onde algumas populações específicas de neurônios são afetadas (necrose isquêmica

seletiva) (HARUKUNI; BHARDWAJ, 2006). Após seis horas de reperfusão são observadas

algumas alterações morfológicas de lesão isquêmica nessas células. Porém, nos primeiros 15

minutos de reperfusão observa-se microvacuolizações, que desaparecem quase totalmente

após uma hora do retorno do fluxo sanguíneo (WHITE et al., 2000).

O modelo experimental mais utilizado para reproduzir a isquemia cerebral global é a

oclusão dos 4 vasos onde ocorre a cauterização das artérias vertebrais seguida de oclusão

temporária das artérias carótidas comuns. (FAROOQUI, 1994; VALENTIM et al., 1999). Na

isquemia cerebral focal são interrompidas algumas artérias cerebrais específicas, afetando

somente uma pequena parte do cérebro, como ocorre na arteriosclerose. O modelo mais

comum e a oclusão da artéria cerebral media. (FAROOQUI, 1994; LOETSCHER et al.,

2011).

1.4 Fisiopatologia do AVE isquêmico

A isquemia pode ser desencadeada através de uma complexa cadeia de eventos

fisiopatológicos envolvendo diversos mecanismos de dano neuronal. A série de mecanismos

neuroquímicos transitórios ou permanentes provocados pela isquemia cerebral é chamada de

cascata isquêmica, onde os principais mecanismos envolvidos são falência bioenergética,

excitotoxicidade, inflamação, estresse oxidativo e morte celular de neurônios, células da glia e

endoteliais (figura 2) (DIRNAGL; IADECOLA; MOSKOWITZ, 1999; BROUNS; DEYNN,

2009).

1.4.1 Core e penumbra

Dentro do leito vascular cerebral isquêmico há duas grandes zonas de lesão: o core, o

núcleo da zona isquêmica, e a penumbra isquêmica, região que circunda o centro da lesão. O

fluxo sanguíneo diminui de forma crucial no core e gradativamente na região de penumbra,

onde os neurônios perdem a capacidade de exercer suas funções, porém, permanecem

21

estruturalmente intactos, devido ao fato de ainda existir uma perfusão residual proveniente

dos vasos colaterais (LIPTON, 1999; DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; BROUNS; DEYN,

2009).

Em humanos acometidos por isquemia cerebral focal, a região do core é facilmente

visualizada por métodos de imagem, pois a área sofre rapidamente um “infarto” (KELLY et

al., 2001). Essa região e caraterizada por uma rápida despolarização anóxica dentro de 1 a 3

minutos com um aumento concomitante do K+ extracelular para aproximadamente 70 mM

(GIDO; KRISTIAN; SIESJO, 1997). Há ainda uma diminuição acentuada do Ca2+

extracelular dentro de 1 a 2 minutos, significando entrada no tecido. Dessa forma o core

contém neurônios necróticos, como consequência da falência da membrana associada a perda

da homeostase do Ca2+ e glutamato (GONZALEZ et al., 2006).

O fluxo sanguíneo cerebral é considerado um poderoso determinante do resultado

funcional e tecidual em pacientes com AVE isquêmico (MAAS et al., 2009; MENON et al.,

2011), podendo ser reduzido para menos de 15% na zona central do infarto isquêmico, e

menos de 40% na penumbra isquêmica. Depois de um insulto longo o suficiente, ou um

insulto permanente, tanto o core quanto a penumbra se tornam regiões de infarto, enquanto a

região extra-penumbra apresenta somente morte de neurônios isolados, com densidade

insuficiente para causar infarto (LIPTON, 1999).

Astrup et al. (1981) definiram inicialmente a penumbra isquêmica como sendo uma

área cerebral de risco e eletricamente disfuncional devido a redução do fluxo de sangue após

uma lesão isquêmica mas que possui potencial para a recuperação na presença da reperfusão

(BRANSTON et al., 1974; HOSSMANN, 1994; BARON, 1999). Os eventos na penumbra

são menos drásticos, apesar de também levar ao infarto. Nessa região, a morte celular ocorre

menos rapidamente via mecanismos como apoptose e inflamação (GONZALEZ et al., 2006).

O nível de ATP é mantido em torno de 50 – 70% do normal, não caindo o suficiente para

permitir despolarizações anóxicas. Nesta região há neurônios eletricamente silenciosos (que

não respondem ao estímulo elétrico), com seus gradientes iônicos intactos e com neurônios

que podem ter suas membranas despolarizadas se o fluxo não for restaurado rapidamente.

O conceito de penumbra isquêmica evoluiu gradualmente, após vários estudos pré-

clínicos e clínicos que por sua vez mostraram uma variável heterogenicidade relacionados

tanto com o déficit de perfusão como com a resposta molecular, distribuição topográfica e

22

com a evolução da penumbra em relação ao núcleo isquêmico (DEL ZOPPO et al., 2011;

MANNING et al., 2014).

A ausência da atividade sináptica é uma das primeiras consequências da isquemia

(HOFMEIJER, VAN PUTTEN, 2012). Mesmo após várias semanas, existem poucas

evidências de recuperação da região do core da lesão isquêmica. No entanto, na região de

penumbra a capacidade de recuperação é maior (BROWN et al., 2007; WINSHIP; MURPHY,

2008).

1.4.2 Depleção de ATP

O ATP é uma das moléculas intracelulares mais abundantes e de sinalização

pleiotrópica, agindo de uma célula para outra (BURNSTOCK, 2006). A isquemia leva à uma

depleção rápida de ATP (SIEGEL et al., 1983). A interrupção focal do fluxo sanguíneo

cerebral restringe a oferta de substratos metabólicos, particularmente oxigênio e glicose,

levando à depleção dos estoques de energia requeridos para manutenção do gradiente iônico

das células (MARTIN; LLOYD; COWAN, 1999).

O declínio de ATP intracelular inibe os processos celulares dependente do mesmo

(ANDERSON et al., 1996; BIRK et al., 2013; LIU et al., 2014; PEGG, 1986) e provoca

falência das bombas transportadoras de íons dependentes de ATP, principalmente da bomba

sódio-potássio/ATPase, mas também da bomba cálcio-hidrogênio/ATPase, com consequente

aumento na concentração de sódio e cálcio intracelular e de potássio no exterior da célula.

Além disso, devido ao aumento de sódio intracelular e o aporte de sódio-cálcio é revertido,

com maior acúmulo de cálcio no interior da célula (SMITH, 2004; DURUKAN,

TATLISUMAK, 2007; BROUNS; DEYN, 2009).

23

Figura 2. Cascata neurotóxica na isquemia e na recirculação.

Alguns eventos principais são: despolarização descontrolada, excitação por glutamato,

aumento do cálcio intracelular, produção de radicais livre, ativação de enzimas e inflamação.

Fonte: Adaptada de DE KEYSER et al., 1999.

Estudos relataram que após um insulto isquêmico, a concentração intracelular de sódio

aumenta dentro do tecido do núcleo a uma taxa de 2% por hora em seres humanos

(THULBORN et al., 1999; TSANG et al., 2011; TSANG et al., 2009), 5-8%/horas em

macacos (LAVERDE et al., 2009), 12%/hora em coelhos (BARTHA et al., 2004) e 22-

25%/hora nos ratos (JONES et al., 2006; WETTERLING et al., 2012; YUSHMANOV et al.,

2009), o tamanho da lesão do núcleo parece determinar a taxa de aumento de sódio com o

decorrer do tempo (BOADA et al., 2012).

Os canais iônicos sensíveis à acidez (ASICs) são canais de cálcio independentes de

glutamato, e assim na acidose isquêmica esses canais seriam abertos e aumentaria o acúmulo

de cálcio intracelular, sendo este um dos mecanismos de toxicidade da acidose. Estudos

revelam que a acidose é neurotóxica, pois foi demonstrado que o bloqueio de ASICs diminui

24

a lesão isquêmica. Outro mecanismo proposto é que a acidose aumenta a produção de radicais

livres e interfere na síntese protéica através do estresse que promove ao retículo

endoplasmático. Porém, o verdadeiro papel da acidose na isquemia ainda não está esclarecido

(DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; HOSSMANN, 2009).

1.4.3 Cálcio e excitotoxidade

A excitotoxicidade foi descoberta em 1957, quando Lucas e Newhouse descobriram

por acaso que a alimentação de camundongos lactentes com glutamato e sódio destrói os

neurônios na retina. Cerca de uma década depois, John Olney estendeu essa descoberta,

mostrando que as regiões de perda neuronal induzida por glutamato podem ocorrer em todo o

cérebro (Lucas e Newhouse, 1957).

O aparecimento de altas concentrações de glutamato e ATP no espaço extracelular é

indicativo de danos nos tecidos neuronais. Na isquemia todas as células apresentam altas

concentrações intracelulares de glutamato e baixas de ATP (SAYRE et al., 2014; BALTAN,

2014; DING, 2014). Esses mediadores agem como uma neurotoxina levando a morte celular

(OUYANG et al., 2014).

O aumento nas concentraçães de glutamato ativa os receptores NMDA (N-metil-D-

aspartato) e AMPA (ácido α-amino-hidróxi-5- metil-4-isoxazolpropionico) (GINSBERG,

1995). O glutamato pode causar a morte neuronal isquêmica, atuando nos receptores de

NMDA (COLBOURNE et al., 1999), que desempenha um papel fisiológico importante na

potenciação a longo prazo e a formação da memória (COLLINGRIDGE et al., 1983).

O glutamato no meio extracelular irá se ligar aos seus receptores ionotrópicos,

NMDA, que é permeável ao cálcio e em situações fisiológicas seu canal é bloqueado pelo

magnésio, e o AMPA/Cainato, que é permeável ao sódio, potássio e zinco e eventualmente ao

cálcio. A ativação destes receptores induz o aumento do influxo de cálcio para dentro da

célula (DIRNAGL; IADECOLA; MOSKOWITZ 1999; HOSSMAN, 2009; WANG;

MICHAELIS, 2010).

O glutamato também irá se ligar aos seus receptores metabotrópicos, acoplados a

proteína G, induzindo a formação de segundos mensageiros como o IP3, que ativa uma via de

sinalização promovendo estresse ao retículo endoplasmático e ativando genes que levam a

uma adaptação genômica celular (HOSSMAN, 2009).

25

O glutamato sendo liberado principalmente de neurônios do core irá exercer sua ação

nos neurônios da penumbra e em altas concentrações é capaz de induzir a necrose direta pelo

excesso de cálcio intracelular (SMITH, 2004; HOSSMAN, 2009).

Deste modo, a elevada concentração de receptores de NMDA excitatórios sobre as

árvores dendríticas de células piramidais de CA1 do hipocampo explica a vulnerabilidade da

área CA1 do hipocampo ao dano cerebral isquêmico (ESPOSITO et al., 2002). Portanto,

todas as drogas ou substancias isoladas de plantas com capacidade de diminuir os níveis de

neurotransmissores excitatórios ou sua atividade no cérebro, podem ter um potencial

terapêutico para melhorar as consequências e os resultados das condições de isquemia

(GOTTLIEB et al., 2003).

Outro fator que leva ao aumento da concentração de cálcio intracelular é a falência

energética resultante da diminuição da oferta de oxigênio e glicose durante a isquemia que

impede o funcionamento da bomba de Ca2+

ATPase (DOYLE; SIMON; STENZELPOORE,

2008). Além disso o grande influxo de cálcio dentro da célula neuronal leva a ocorrência de

outros mecanismos de dano neuronal como a ativação de calpaínas, proteases que afetam a

integridade estrutural da célula, ativação de fosfolipases que degradam a membrana celular,

além de induzir a expressão e ativação da enzima óxido nítrico sintase induzidas (iNOS).

Além disso, o cálcio é tóxico para a mitocôndria diretamente, e também porque a mitocôndria

tenta sequestrar o cálcio intracelular, uma medida de sobrevivência celular, mas que promove

dano à própria mitocôndria, gerando despolarizações e edema mitocondrial. Nesta situação, os

poros de transição mitocondriais são abertos ocorrendo à liberação de íons e de citocromo C,

que irá promover a formação de radicais livres de oxigênio e morte neuronal por necrose e/ou

apoptose (SMITH, 2004; DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; HOSSMAN, 2009).

1.4.4 Inflamação

A inflamação é uma característica central presente em várias condições

fisiopatológicas em resposta à lesão tecidual e o recrutamento das células de defesa contra os

microrganismos invasores. Os macrófagos são células do sistema imunológico que

desempenham um papel crítico na regulação de respostas inflamatórias. Após a ativação, os

macrófagos secretam vários mediadores inflamatórios, incluindo fator de necrose tumoral

(TNF-α), interleucina (IL-6) espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico (NO) e

prostaglandina E2 (LAWRENCE et al., 2002; LASKIN et al., 2011). O desequilíbrio ou o

26

excesso na produção destes mediadores estão relacionados com a exacerbação de diversas

doenças incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, séptcia, doença pulmonar crônica, colite

ulcerativa, e também carcinogênese (LAWRENCE et al., 2002).

Após o início da isquemia ocorrem alterações microvasculares que incluem alterações

na expressão de moléculas de adesão e aumento da permeabilidade das células endoteliais,

liberação de citocinas reguladoras, acúmulo de leucócitos e plaquetas levando a formação de

trombo. O recrutamento de leucócitos nas regiões isquêmicas requer uma sequência de

eventos que começa com o rolamento de leucócitos ativados no endotélio dos vasos

sanguíneos, ativação de neutrófilos, aderência às células endoteliais e transmigração para o

parênquima cerebral (HUANG; UPADHYAY; TAMARGO, 2006).

A adesão dos leucócitos ao endotélio se dá através da expressão de moléculas de

adesão, que estão distribuídas dentro de três principais classes: selectinas, integrinas e a

superfamília de proteínas de imunoglobulinas (CAM’s) (HUANG; UPADHYAY;

TAMARGO, 2006). Dentre as principais integrinas envolvidas na isquemia estão a LFA-1,

Mac-1 e CD11c que estimulam a adesão celular ao endotélio e modificação conformacional

de leucócitos facilitando a diapedese. E por último, as principais CAM’s envolvidas são

ICAM-1 e -2 e VCAM-1, que promovem interações de forte afinidade dos leucócitos com o

endotélio e estimulam a diapedese (CELEUMANS et al., 2010).

27

A cascata inflamatória também inclui a ativação da fosfolipase A2 que ocorre como

consequência da elevação da concentração do cálcio intracelular. A fosfolipase A2 produz o

ácido aracdônico a partir dos fosfolipídeos de membrana que é metabolizado pela

ciclooxigenase (COX), produzindo prostaglandinas e tromboxanos, ou pela lipoxigenase

(LOX) que produz lipoxinas. A COX do tipo 2 está super expressa após a isquemia e exerce

efeitos tóxicos (NOGAWA et al., 1997) (Figura 03).

Figura 3. Resposta inflamatória após isquemia cerebral focal.

Fonte: Adaptada de BROUNS; DEYNN, 2009.

A micróglia é uma célula imunitária inata que torna-se altamente ativado após insulto

cerebral, após produção de espécies de oxigênio e nitrogênio reativas e citocinas pró-

inflamatórias(TNF-α), (OWONA et al., 2013; SMITH et al., 2012; SHENG et al., 2011).

Vários estudos comprovaram que o excesso da ativação da micróglia e da produção de

citocinas pró-inflamatórias, podem contribuir para o desenvolvimento e progressão de

desordens neurodegenerativas (KIM et al., 2013a; JAYADEV et al., 2013; MORRIS et al.,

28

2013). Além disso, a ativação da micróglia participa na resposta inflamatória associada com a

isquemia cerebral (STRASSBURGER et al., 2008; DENG et al., 2008; KIM et al., 2008).

A mieloperoxidase é uma enzima presente nos grânulos dos neutrófilos e de várias

outras células da linhagem mielóide, principalmente monócitos e macrófagos/micróglia. Após

a sua liberação ela interage com o peróxido de hidrogénio gerando ânion superóxido,

peroxinitrito e outros radicais livres extremamente tóxicos como o hipoclorito (OCL-). Na

isquemia a enzima está envolvida com a indução de apoptose e nitritirosinação de proteínas. É

uma molécula chave na inflamação e têm sido descritas em diversos modelos animais de

isquemia cerebral (BRECKWOLDT et al., 2008).

Devido a isquemia ter um processo inflamatório envolvido em sua fisiopatologia,

como relatado acima (SUGIMOTO; IADECOLA, 2003). Vários estudos pré-clínicos

mostraram que os agentes anti-inflamatórios são eficazes quando administrado até 6 h após a

isquemia (DEL ZOPPO, 2010; HAWKINS et al., 2014). O tratamento com antinflamatórios

não-esteroidais seletivos para a COX-2 apresentou neuroproteção em modelo experimental de

isquemia (SUGIMOTO; IADECOLA, 2003). A utilização do tenoxicam, um inibidor da

COX-2, preveniu a formação de prostaglandinas e diminuiu o dano causado por isquemia

cerebral global transitória (GALVÃO et al., 2005). Com isso estudos com diversas

substâncias com potencial ação anti-inflamatória vem sendo feito e foi observado que o

tratamento com antinflamatórios não-esteroidais seletivos para a COX-2 apresentou

neuroproteção em modelo experimental de isquemia (SUGIMOTO; IADECOLA, 2003). A

utilização do Sulindac, mostrou efeitos neuroprotetores sobre o tecido neural após à isquemia

cerebral / reperfusão (I / R) em ratos (COSAR et al., 2014).

1.4.5 Estresse oxidativo

Na estrutura dos átomos e das moléculas, os elétrons associam-se normalmente em

pares. Define-se espécies reativas ou radicais livres (RLs) espécies independentes que contêm

um ou mais elétrons não pareados (CLARK, 2002). As espécies reativas de oxigênio são

produzidas durante a fosforilação oxidativa mitocondrial, como bioprodutos do metabolismo

aeróbico celular, sendo o oxigênio é o principal fornecedor de RLs. (GILKUN-SHERKI et al.,

2002).

29

Os radicais livres são lesivos por meio de uma variedade de mecanismos: 1)

peroxidação dos ácidos graxos das membranas celulares; 2) oxidação de grupos sulfidrila

inativando uma variedade de enzimas; 3) alterações do DNA, promovendo mutagênese; 4)

inibição da síntese de ATP e consumo de reservas de dinucleotídeos adenínicos da

nicotinamida; 5) direta inativação do óxido nítrico (NO) comprometendo os relaxamentos

vasculares dependentes do endotélio; 6) reagindo com o NO formando o peroxinitrito, um

ânion instável e tóxico; 7) ativação de citocinas como a interleucina-1; 8) ação inibindo a

bomba de Na+/K

+; 9) modulando da atividade de fatores de transcrição como o NF-κB

(GILKUN-SHERKI et al., 2002; SCANDALIOS, 2005; WANG et al., 2005).

O excesso de cálcio intracelular e a ativação dos receptores NMDA levam ao aumento

da produção de NO que pode exercer tanto um papel protetor como deletério na isquemia

(MORO et al., 2004; PRADEEP et al., 2012). O NO é produzido pela enzima óxido nítrico

sintetase (NOS) a partir do aminoácido L-arginina. No cérebro existem três isoformas da

enzima, nNOS, produzida pelos neurônios, eNOS, produzida pelas células do endotélio, onde

estas duas formas se apresentam de forma constitutiva no citoplasma, e a isoforma iNOS,

induzida por processos patológicos e produzida pelas células da glia (astrócitos e micróglia) e

por macrófagos (MORO et al., 2004).

A expressão de iNOS é máxima entre 12 e 48 horas após o início da isquemia in vivo e

a sua imunorreatividade está localizada em neutrófilos, astrócitos e células vasculares no

cérebro isquemiado. Além disso, os neurônios também podem expressar iNOS nesta

condição, tal como tem sido demonstrada utilizando modelos in vitro de isquemia cerebral

(MORO et al., 2004). A maior parte da produção de NO na isquemia se deve a iNOS, essa

produção independe de cálcio, sendo sua expressão dependente de NF-kb, um fator de

transcrição envolvido na resposta inflamatória e estresse oxidativo (MORO et al., 2004;

PRADEEP, 2012).

Quando o NO é produzido a partir da eNOS (óxido nitrico sintase endotelial) ele se

torna protetor devido a vasodilatação que promove, aumentando a oferta de glicose e

oxigênio, além de inibir a agregação e adesão microvascular, porém quando produzido pela

enzimas nNOS (óxido nitrico sintase neuronal) e iNOS (óxido nitrico sintase induzida) possui

efeito deletério pois reage com O2 –

para produzir ONOO– no citoplasma celular (MORO et

al., 2004; PRADEEP et al., 2012). A enzima iNOS é expressa após isquemia e contribuiu

para o dano celular associado a esta condição. De fato, foi demonstrado que o mRNA de

30

iNOS, a proteína e a atividade enzimática são expressas no cérebro, após a isquemia

transitória ou permanente em roedores e em modelos in vitro de isquemia cerebral (MORO et

al., 2004).

O estresse oxidativo é uma condição biológica em que ocorre um desequilíbrio nas

concentrações de moléculas oxidantes e sistema antioxidante fisiológico, o que produz danos

celulares. Evidências indicam que a lesão neuronal induzida por estresse oxidativo é uma

característica importante na etiologia de várias doenças neurodegenerativas, tais como

acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD) e doença de Parkinson (DP)

(FEDERICO et al., 2012; GANDHI; ABRAMOV 2012; SUTACHAN et al., 2012), através

do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo ânion superóxido

(O2-

), radical hidroxila (HO) e peróxidos (H2O2, R-OOH, R-OO). A formação de (ROS) está

associada com o metabolismo mitocondrial, através da ativação e condução de uma cascata de

eventos intracelulares tóxicos resultantes da peroxidação lipídica, elevação mitocondrial Ca2+,

que por sua vez conduz a morte das células.

O aumento da produção de substâncias reativas, dificulta a neutralização por agentes

antioxidantes endógenos, tais como a glutationa e superóxido dismutase, resultando no

estresse oxidativo (SILVA et al., 2002; GILGUN-SHERKI et al., 2002). Esse processo leva a

uma diminuição da resposta antioxidante, podendo causar dano tecidual por agressão a

fosfolipídios, carboidratos, aminoácidos, DNA ou a morte celular por necrose ou apoptose

(KUNZ et al., 2010). O cérebro é um órgão muito sensível ao estresse oxidativo devido a

presença de grande quantidade de ácidos graxos insaturados, grande reserva de ferro, elevada

taxa de metabolismo de oxigênio e por apresentar sistema de defesa vulnerável e ineficiente

contra ERO’s (TARDINI; YOSHIDA, 2003).

1.4.6 Apoptose

Existem três tipos de morte celular: morte celular autofágica, apoptose/necrose, e a

poli (ADPribose) onde a morte celular e mediada por uma polimerase (PARP-1)

(DEGTEREV; YUAN, 2008). Cada um tem sua própria bioquímica e características

morfológicas e cada um desempenha um papel importante na fisiopatologia. A autofágica tem

sido observada em vários modelos de doenças, incluindo modelos de isquemia cardíaca

reperfusão em ratos (MATSUI et al., 2007).

31

A apoptose é um processo geneticamente controlado caracterizado por uma série de

perturbações nas vias de sinalização, que contribuem não só para a morte celular mas,

também, para a remoção dos fagócitos e prevenção das respostas imunes indesejadas

(TAYLOR et al., 2008).

O processo apoptótico tem como principais características a condensação da

cromatina, intensa fragmentação do DNA, formação de protuberâncias na membrana

plasmática e formação de corpos apoptóticos que serão fagocitados por macrófagos (LOVE,

2003). Esse processo é dependente de energia. A morte celular programada é realizada por

uma numerosa família de proteases de cisteína altamente específicas conhecidas como

caspases, que se encontram inativas nas células normais, mas são ativadas pelos sinais

apoptóticos (DANIEL; KORSMEYER, 2004; GHOBRIAL et al., 2005; STRASSER et al.,

2000).

As proteínas da família Bcl-2 é da família das caspases possuem importante papel na

ativação, transdução de sinal e execução da apoptose (YUAN, 2009). Essa proteína atua na

apoptose através da regulação da permeabilidade da membrana mitocondrial. Evidências

sugerem que o citocromo C é liberado pelo poro de transição de permeabilidade (PTP) na

mitocôndria e que a família Bcl-2 regula o PTP após a isquemia cerebral. Fazem parte desta

família de proteínas pró-apoptóticas como Bax, Bcl-Xs, Bak, Bid e Bad, que diminuem o

potencial de membrana da mitocôndria através do PTP facilitando a liberação do citocromo C,

e também proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2 e Bcl-Xl, que conservam o potencial de membrana

e bloqueiam a liberação de citocromo C (LOVE, 2003; SUGAWARA et al., 2004).

A isquemia cerebral pode desencadear um sinal no interior da célula que provoca a

liberação do citocromo C, dando início à via intrínseca de ativação das caspases. As caspases

são sintetizadas como pró-enzimas inativas (pró-caspase) e, quando ativadas, clivam diversos

substratos protéicos (LOVE, 2003; GRIVICICH; REGNE; ROCHA, 2007). A mitocôndria é

o centro da via intrínseca da apoptose, além disso, também pode amplificar e mediar a via

extrínseca (SCHMITT et al., 2002). O citocromo C é liberado no citoplasma formando um

complexo com a APAF-1 (fator ativador de proteases pró-apoptóticas 1) e a caspase-9,

chamado de apoptossomo. Esse complexo promove a clivagem da pró-caspase 9, liberando a

caspase-9 ativa. Uma vez ativada, a caspase-9 ativa a caspase-3 (PETROS; OLEJNICZAK;

FESIK, 2004; RUPNARAIN et al., 2004).

32

A caspase-3 inicia a ativação de caspases e afeta o DNA, promovendo a liberação de

DNAses e de PARPS. Dessa forma a caspase-3 garante a quebra do DNA e,

consequentemente, impede a sobrevivência celular (SUGAWARA et al., 2004). A ativação da

via extrínseca se dá, por exemplo, através da ligação da molécula de Fas ligante (Fas-L)

presente no meio extracelular ao seu receptor Fas, um receptor de superfície pertencente a

família de receptores do TNF. A super expressão de Fas é verificada após isquemia cerebral

focal (SUGAWARA et al., 2004). O complexo Fas/Fas-L desencadeia a ativação do domínio

de morte associado ao Fas (FADD) e a clivagem da pró-caspase 8. A caspase-8 ativa a

caspase-3 que por sua vez age em diversos alvos (FERRER; PLANAS, 2003; SUGAWARA

et al., 2004).

As caspases são efetivas em um grande número de substratos, quebrando diversas

proteínas estruturais vitais, incluindo PARP-1. Vale ressaltar que a ativação de PARP-1 está

envolvida com a necrose, através da depleção de NAD+ e ATP, porém sua quebra resulta nos

produtos de 89 e 28 kDA, característicos da ativação de caspases e morte celular programada

(FERRER; PLANAS, 2003).

Além disso, parece haver um grau de sobreposição entre estes modos diferentes de

morte de células, e particularmente entre a necrose/apoptose e processos mediados por de

PARP-1-.

A necrose é um processo passivo, onde a célula responde ao estresse externo de uma

forma aleatória e descoordenada. Hoje, é evidente que os mecanismos de morte celular vão

além da simples relação apoptose e necrose. Pesquisadores clássicos da morte celular relatam

a existência de novos modos de regulação da morte celular, mas que devido a sua

complexidade ainda não foram descritos (DEGTEREV; YUAN, 2008). A administração do

inibidor necrose/apoptose, o Nec-1 fornece proteção tecidual significativa e melhoramentos

de uma variedade de lesões agudas do tecidual em modelos isquemia/reperfusão em ratos com

lesão por mecanismos de inibição da apoptose (SMITH et al., 2007).

O excesso de ação da poli (ADP-ribosil) em resposta a danos no DNA também pode

levar à morte celular numa série de situações, como o acidente vascular cerebral, lesão

cerebral traumática, e lesão de isquemia/reperfusão em vários órgãos (ANDRABI et al.,

2008). Assim, os inibidores da PARP-1 podem fornecer proteção em ratos submetidos ao

modelo de lesão de isquemia e reperfusão (MARTIN et al., 2000), doenças inflamatórias

33

(MIESEL et al., 1995), neurodegeneração (COSI; MARIEN, 1999) e diabetes (PIEPER et al.,

1999a).

1.5 Memória

A memória é a aquisição (ou aprendizagem), a conservação e a evocação (recordação,

lembrança, recuperação) de informações (IZQUIERDO, 2002). Origina de um processo

evolutivo que permite aos animais adquirir, reter e evocar diversos tipos de informação que

conferem alguma vantagem por comparar situações presentes com experiências prévias

(SHERRY; SCHACTER, 1987).

Mcewen e Sapolsky (1995) caracterizaram a memória como sendo um processo ativo

e dependente de algumas variáveis como o meio e as experiências anteriores. O estado

emocional desempenha um papel de filtro na retenção da memória.

A memória é conceitualmente dívidida em dois tipos, memória “declarativa” e “não

declarativa” (WELKOWITZ et al., 1987; IZQUIERDO et al., 1992). A memória declarativa

também denominada de memória explícita está relacionada com fatos (memória semântica) e

experiências pessoais (memória episódica) que requer a ação do lobo temporal medial

(hipocampo e regiões anatomicamente próximas como o córtex entorrinal, peririnal) e córtex

parahipocampal em conexão com córtex (SQUIRE; ZOLA-MORGAN, 1996; KANDEL et

al., 2000. KANDEL, 2009). A memória recente, ou de curto prazo, está relacionada a eventos

que ocorrem em um periodo de horas ou dias e representa o armazenamento temporário de

informação que é utilizado para planejar uma ação (SQUIRE; ZOLA-MORGAN, 1996.

KANDEL, 1995; KANDEL, 2009).

A memória implícita (inconsciente) é constantemente definida como um fenômeno

não explicito da memória consciente. Isso mostra as incertezas presentes no entendimento

deste tipo de memória. Recentemente a memória foi caracterizada como sendo um

comportamento, porque alguns fatos mostraram que a memória é obtida através da medição

de uma mudança no comportamento após a formação dessa memória. A memória pode ser

ainda melhor conceituada baseada nas mudanças que ocorrem nas conexões sinápticas no

cérebro. Essas alterações produzem uma mudança cerebral, que por sua vez pode ser definida

como memória (MUTSO et al., 2014), e que é o resultado final de uma série de eventos

neurofisiológicos associados com perturbações na eletrofisiologia (LEGA; JACOBS;

34

KAHANA, 2012). As regiões do cérebro relacionadas com à memória de procedimento ou

implícita, são o cerebelo, estriado e a amígdala, que está envolvida com a percepção,

habilidade motora e outras formas de memória não declarativa (KANDEL, 2009).

A definição da memória humana vem evoluindo ao longo tempo, de acordo com a

neurofisiologia da memória. Embora não exista dúvida que o hipocampo é fundamental para a

codificação de uma nova memória consciente (episódica), o seu papel na recuperação dessas

memórias, e a possibilidade de reconsolidação dessas memórias recuperadas, ainda estão

sendo investigadas (EICHENBAUM, 2000, 2007). Além disso, o hipocampo parece participar

em processos independentes da consciência (HENKE, 2010; PARK et al., 2004).

Nos seres humanos, as lesões nas regiões CA1 / Subículo ou hipocampo bilateral que

levam a reduções de volume de mais de 30% são suficientes para causar amnésia grave,

incluindo tanto comprometimento da memória episódica e espacial (REMPEL-CLOWER,

1996; VARGHA-KHADEM et al., 2007). Estudos utilizando como base, algumas lesões em

primatas, mostrou que o córtex perirrinal é crítico para a memória episódica (MEUNIER et

al., 1993, MALKOVA; MISHKIN, 2013).

O septo medial e o hipocampo processam a memória de trabalho e a memória espacial.

O hipocampo também processa a informação temporal, contextual e a memória que leva a

recordação consciente em humanos (BRIONI, 1993; IZQUIERDO et. al., 1992).

Recentemente, um estudo mostrou que neurônios-grade foram encontradas no córtex

entorrinal de primatas (KILLIAN et al., 2013). Esta é uma região onde as informações são

altamente processadas a partir de várias modalidades sensoriais e que, em roedores, a divisão

medial do córtex entorrinal contém neurônios-grade de alta resolução e parece formar parte de

um percurso espacial, semelhante ao espaço-caudal via hipocampo entorrinal-posterior que é

importante para o processamento e consolidação de informações espaciais (MAVIEL et al.,

2004; CZAJKOWSKI et al., 2014).

O córtex frontal age como um local de execução e de controle das várias interações

que ocorrem nas áreas corticais e subcorticais das funções cognitivos e emocionais e do

comportamento motor em vez de ser um dos depósitos finais de memórias de longo prazo. A

organização anatómica e funcional do hipocampo e as interações entre a formação tálamo-

frontal, são de fundamental importância, e exige mais pesquisas (AGGLETON; BROWN,

35

1999). O córtex frontal como um todo, e mais especificamente as áreas frontal medial,

especialmente a área infralimbica, área prelimbica, e a area anterior ao córtex cingulado,

parecem os responsáveis pelo circuito talâmico e límbico, que é critica para a memória

episódica declarativa em diferentes espécies (NIEUWENHUIS; TAKASHIMA, 2010).

Aggleton et al. (2014) mostraram recentemente que o córtex retrosplenial tem

conexões com o núcleo dorso-lateral do tálamo, mas as conexões entre as áreas relacionadas

com a memória espaciais e o córtex pré-frontal dorsolateral por intermédio do tálamo ainda

são pouco conhecidos. Estudos funcionais mostraram que o córtex pré-frontal lateral é

importante para a memória de trabalho (BLUMENFELD; RANGANATH, 2007), enquanto o

córtex frontal medial está relacionado com a consolidação da memória (VAN KESTEREN et

al., 2013).

Os dados de diferentes abordagens experimentais sugerem que o sistema colinérgico

septohippocampal é crucial para a manutenção da integridade da memória (CHANG e OURO

2003, LECOURTIER et al., 2011).

Alguns tipos de agressão como o estresse oxidativo, inflamação, excitotoxicidade,

levam a perda de memória devido à neurodegeneração cerebral. Todos esses processos estão

presentes nas doenças neurodegenerativas e AVE. Grande parte das vítimas de AVE sofram

com problemas de memória e dificuldades na execução das tarefas diárias (HATTORI, 2000;

MAUD, 2006).

Vários autores têm detectado distúrbios na aquisição da memória após oclusão da

artéria cerebral média em animais usando testes como esquiva passiva e labirintos

.(SANDSTROM; ROWAN, 2007; MUMBY et al., 1996; PLAMONDON; MORIN;

CHARRON, 2006). A isquemia ocasiona déficits na memória operacional, acessada através

de tarefas de reconhecimentos de objetos e lugares (MUMBY et al., 1996)

1.6 Terpenos e neuroproteção

As plantas medicinais produzem diversos metabólitos secundários, dentre esses

metabólitos os óleos essenciais vem ganhando destaque nos últimos anos, por apresentarem

efeito antibacteriano, antifúngico e antioxidante. Durante anos tem havido uma atenção

emergente para a produção e implementação dos óleos essenciais na medicina popular. Os

36

óleos essenciais são compostos principalmente por terpenos e terpenóides com baixo peso

molecular (WASEEN; LOW, 2014);

Os terpenos são substâncias lipofílicas, ou seja, insolúveis em água, e é essa sua

característica, que indica a facilidade de uma molécula ser ou não transportada através de uma

membrana (MAZZATORTA et al., 2005). São classificados de acordo com sua unidade de

isopreno como monoterpeno, diterpeno, triterpeno e sesquiterpeno (MURAKAMI et al.,

2004).

Os terpenos de ocorrência natural representam uma fonte de matéria-prima renovável,

sendo muito importante para as indústrias farmacêuticas, de perfumes, de flavorizantes,

agroquímicas, cosméticos e de aromas, além de intermediários sintéticos versáteis, podendo

ser usados na síntese de produtos quirais (ERMAN, 1985; MONTEIRO; VELOSO; 2004).

Essas substâncias vêm sendo muito utilizadas como aditivos na indústria alimentícia e

também na indústria de cosméticos (TSAO; COATS, 1995), por possuírem atividade

antimicrobianas, inseticidas, anticancerígenos, anti-inflamatório, dentre outras (MURAKAMI

et al., 2004; HAN, 2005; GRODNITZKY; COATS, 2002, GRIFFIN et al., 1999).

Ruberto e Baratta (2000) demostraram o efeito antioxidante de vários sesquiterpenos

presentes em diferentes óleos essenciais. Um estudo realizado com o trans-farnesol mostrou a

sua proteção contra o efeito do dano oxidativo causado por 1,2-dimetil-hidrazina no cólon de

ratos Wistar (KHAN; SULTANA, 2011) e por substâncias tóxicas da fumaça do cigarro

(QAMAR; SULTANA, 2008).

Estudos mostraram que vários terpenos apresentaram atividade neuroprotetora frente a

isquemia e a toxicidade induzida pela neurotoxina 6-OHDA, tanto in vitro como in vivo,

exemplo de terpenos com essas atividades são: bilobalídeo e ginkgolídeo (lactona

sesquiterpeno), canabidiol e a Tetra-hidrocanabinol (diterpeno), catalpol (monoterpeno), ácido

seroféndico (diterpeno). (DEFEUDIS, 2002; LOGANI et al., 2000; JACKSON et al., 2005;

LASTRES-BECKER et al., 2005; LI et al., 2004; OSAKADA et al., 2004; HSIAO et al.,

2004; AHMAD et al., 2005).

Estudo realizado por Cionca et al. (2013), demonstrou que o óleo essencial extraído da

Coriandrum sativum, popularmente conhecido como coentro, foi capaz de melhorar a

memória de animais expostos ao β-amilóide pela diminuição do estresse oxidativo. Diversos

37

estudos também demonstraram que alguns óleos essenciais são capazes de proteger o cérebro

da isquemia cerebral, como o realizado por Wang et al. (2012) que concluiram que o óleo

essencial da Lavandula angustifólia possui efeito neuroprotetor frente a isquemia focal

transitória em animal, o que pode ser atribuído ao efeito antioxidante do óleo essencial. A

pesquisa realizada por Chang et al. (2013) observou que o β-cariofileno, um sesquiterpeno

encontrado em diversas plantas, apresenta atividade neuroprotetora em animais submetidos a

isquemia focal permanente, e essa proteção pode se dever a seu efeito anti-inflamatório.

Um outro estudo demonstrou que mesmo existindo vários terpenos com atividade

neuroprotetora, até agora é difícil encontrar estudos que comparam a atividade neuroprotetora

de diferentes terpenóides com a sua estrutura. Os estudos sobre a relação estrutura-atividade

são ferramentas muito úteis em investigar a relação entre a estrutura química de um composto

e a sua bioatividade (HERMENS, 1995; CHUN et al., 2005).

1.6.1 (-)-α-Bisabolol

O α-bisabolol (Figura 4) também conhecido como levomenol é um álcool de

sesquiterpeno, natural, monocíclico, de carateristica lipofilico, possui baixo peso molecular,

volátil, sendo o constituinte majoritário do óleo essencial da Matricaria chamomilla,

popularmente conhecida como camomila, da Vanillosmopsis erythropappa e da Peperônia,

entretanto dentre essas fontes de α-bisabolol a mais utilizada para sua extração é a camomila

(REYNOLDS 1996; VICHNEWSKI et al., 1989; DE LIRA et al., 2009).

Recentemente, α-bisabolol passou a ser utilizado como um componente de perfumes e

cosméticos decorativos, na produção de xampus, sabonetes e produtos de higiene, bem como

em outros produtos não-cosméticos, tais como os detergentes (LEITE, 2011). Além disso, o

α-bisabolol tem sido utilizado como um agente calmante em cosméticos para bebê (BHATIA

et al., 2008).

38

Figura 4. Estrutura química do α-bisabolol

Uma pesquisa demonstrou em um modelo in vitro da barreira hematoencefálica que o

α-bisabolol apresenta características físico-químicas compatíveis com a capacidade de

atravessar a barreira hematoencefálica (PIOCHON et al., 2008).

Esse terpeno possui uma variedade de atividades biológicas, tais como: antifúngica

(VILA et al., 2010), anti-tumororal (CAVALIERI et al., 2004; CHEN et al., 2010; DA

SILVA et al., 2010; PIOCHON et al., 2009) e atividade gastroprotetora (BEZERRA et al.,

2009).

Estudos mostraram que o α-bisabolol foi capaz de proteger a mucosa gástrica de

camundongos Swiss machos com lesões causadas pelo etanol, por reduzir a peroxidação

lipídica e aumentar a atividade da enzima superóxido desmutase, estando essa atividade

relacionada com o seu efeito antioxidante (ROCHA et al., 2011). O α-bisabolol apresentou

também uma atividade protetora contra os danos gástricos causados por ácido acetilsalicílico

(KHAYYAL MT et al., 2001. TORRADOS et al., 1995).

A atividade leishmanicida do α-bisabolol contra a ação promastigotas e amastigotas

intracelulares, também, já foi estudada e essa ação pode ocorrer de forma direta ou indireta,

por meio da produção de mecanismos celulares, tais como a produção de óxido nítrico (NO),

que é a principal molécula efetora que participa da morte intracelular de Leishmania

(LOR´IA-CERVERA, 2013).

Estudos mostraram que α-bisabolol inibe a produção de NO e PGE2, que são

mediadores pro-inflamatórios em macrófagos (RAW264.7) Além disso, o α-bisabolol reduziu

a expressão dos genes que codificam iNOS e COX-2, inibindo a via se sinalização NF-кB e

AP-1 (p38 e ERK). (LEITE, 2011).

39

Um estudo mostrou que o α-bisabolol atua nos canais de cálcio dependentes de

voltagem, inibindo as respostas contráteis no músculo liso traqueal, preferencialmente

causadas pelo influxo de cálcio (SIQUEIRA et al., 2012). Esse mesmo efeito foi observado

recentemente em preparações de aorta (SIQUEIRA et al., 2014).

Os pacientes com AVE apresentam déficits cognitivos (HATTORI, 2000; MAUD,

2006), assim no presente trabalho avaliamos o efeito do α-bisabolol sobre a extensão do dano

neuronal, disfunções neurológicas e alterações na memória dos animais submetidos ao

modelo de isquemia cerebral focal permanente por oclusão da ACM. Este modelo está

padronizado e os resultados como as alterações histológicas, neuroquímicas e

comportamentais já estão comprovados (ASSHAFAQ et al., 2011) o que o torna bastante

utilizado para reproduzir eventos que ocorrem no AVE em humanos.

40

2 JUSTIFICATIVA

O estudo do AVE é importante, principalmente, pelo impacto sócio-econômico que

pode causar ao afetar a população economicamente ativa. E apesar dos esforços das

autoridades no controle da pressão arterial, combate ao tabagismo e controle dos níveis de

colesterol e da diabetes, o Brasil ainda possui altas taxas de mortalidade devido ao AVE.

Visto que a fisiopatologia da isquemia cerebral é complexa e envolve múltiplas vias, iônicas,

enzimáticas e genéticas, que variam em função da profundidade e duração da isquemia torna-

se mais difícil de estabelecer uma única terapia capaz de atuar em um conjunto tão variável de

fatores responsáveis.

Tendo em conta que até o momento, o único fármaco que mostra eficácia significativa

é o ativador tecidual de plasminogênio (tPA), sendo este um biofarmacêutico “destruidor de

coágulo”, entretanto, ele precisa ser administrado no início da trombose e produz benefício

leve, com o risco de o problema circulatório piorar se o derrame for hemorrágico no lugar de

trombótico. A pesquisa por novos fármacos que tenham efeito neuroprotetor vem recebendo

cada vez mais atenção, considerando-o como uma opção terapêutica promissora para o

acidente vascular cerebral isquêmico.

Assim, este projeto procura avaliar o efeito do tratamento com α-bisabolol no

comportamento, memória e dano neuronal de ratos submetidos á isquemia focal devido as

suas ações anti-inflamatórias e antioxidantes como uma estratégia terapêutica no tratamento

do AVE.

41

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos Gerais

Estudar os efeitos protetores do α-bisabolol, sobre o dano neuronal, alteração sensório

motor, memória e inflamação de camundongos swiss submetidos à isquemia cerebral focal

permanente.

3.2 Objetivos Específicos

Induzir dano neuronal usando modelo de isquemia cerebral focal permanente

por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO) em camundongos.

Induzir déficits de memória e motores alterações usando modelo de (pMCAO)

em camundongos.

Avaliar o dano neuronal nos animais isquemiados, pelo tratamento com o α-

bisabolol.

Avaliar as alterações motoras e os déficits de memória nos animais

isquemiados, pelo tratamento com o α-bisabolol.

Verificar o efeito do α-bisabolol sobre resposta inflamatória produzida pelo

modelo de isquemia através da dosagem da atividade da enzima

Mieloperoxidase.

Verificar o efeito do α-bisabolol sobre resposta inflamatória através da

imunorreatividade da iNOS e do TNF-α no estriado e córtex temporal dos

animais submetidos à (pMCAO).

Verificar o efeito do α-bisabolol sobre resposta inflamatória através da ativação

de astrócitos (GFAP) no córtex temporal e corpo estriado dos animais

submetidos à (pMCAO).

42

4 METODOLOGIA

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss, machos, jovens, pesando entre 25 e 35g,

provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC)

e transferidos para o biotério setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia,

Faculdade de Medicina, UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas apropriadas,

forradas com raspas de madeira, com ciclo de claro/escuro de 12h/12h e alimentados com

ração padrão e água à vontade.

No que se refere aos cuidados com os animais este estudo seguiu os princípios éticos

da experimentação animal estabelecidos pelo Conselho Nacional de Controle de

Experimentação Animal (COCEA). O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em

Pesquisa Animal (CEPA) da UFC sob o número de registro 93/2013.

4.2 Drogas

(-)-α-Bisabolol (SIGMA, EUA); Cloridrato de xilazina 2% (Kensol® Laboratórios

König S.A, Argentina); Cloridrato de ketamina 5% (Vetanarcol®, Laboratórios König S.A,

Argentina). Todos os reagentes utilizados eram de grau analítico.

4.3 Protocolo experimental

Foram utilizados cerca de 191 animais divididos entre os grupos falso-operado,

tratados com veículo ou α-Bisabolol (α-Bis) na dose de 200 mg/kg, isquemiados tratados com

veículo e isquemiados tratados com α-Bis nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, por via oral.

Para a realização dos procedimentos experimentais (comportamentais, bioquímica e

imunohistoquímica) os animais foram dividios em grupos:

Grupo 1: 24 horas após a cirurgia foi realizada a avaliação neurológica e a análise

da área do infarto isquêmico pelo método do TTC Cloreto de 2,3,5-

Trifeniltetrazol (TTC) (n=6/grupo).

Grupo 2- 72 horas após a cirurgia foram realizados os testes de campo aberto,

labirinto em Y e esquiva passiva (memória recente) e 96 horas após o teste da

esquiva passiva (memória tardia) (n=10/grupo).

43

Grupo 3- 48 horas após a cirurgia foi realizado o primeiro treino do labirinto

aquático, 72 horas após foi realizado o segundo treino do labirinto aquático, 96

horas após foi realizado o teste de reconhecimento de objetos, e 120 após foi

realizada a retenção do labirinto aquático. Ao final do protocolo 3 os animais

foram perfundidos com parafomaldeído a 4% e seus cérebros fixados com formol

tamponado. Após a realização dos cortes, as fatias foram incubadas “free floating”

e foram utilizadas para as técnicas de imunohistoquímica (TNF-α, iNOS e GFAP)

e para as técnicas de histologia (Cresil-violeta e Fluoro Jade C).

Grupo 4: 24 horas após a indução da isquemia, os animais foram eutanaziados e

seus cérebros foram dissecados (córtex temporal e corpo estriado), seguido de

dosagem bioquímica nessas estruturas cerebrais para avaliar a atividade

enzimática de MPO (n=6/grupo) (Figura 5).

Quanto ao esquema de tratamento os animais foram divididos em 6 grupos, sendo eles

descritos na tabela 1. Em todos os grupos a administração foi realizada por via oral 24 horas

antes da oclusão da ACM e 2, 24, 48, 72, 96 horas após a cirurgia.

Quadro 1. Grupos de tratamento.

44

Figura 5. Protocolo experimental

4.4 Isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO) (Tamura et

al., 1981)

Os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg) e ketamina (90mg/kg)

administrados por via intraperitoneal para o procedimento cirúrgico. A temperatura foi

mantida entre 36,5 e 37º C com o auxílio de uma lâmpada.

Inicialmente foi realizada uma incisão na linha entre o olho esquerdo e a orelha, o

músculo temporal foi rebatido e, posteriormente, realizada uma craniectomia com uma broca

de 1 (mm), seguido da exposição e cauterização da artéria cerebral média. Em seguida a

incisão foi suturada com fio de seda agulhado 4.0, e os animais foram colocados em gaiolas

para recuperação da cirurgia com livre acesso a água e comida. Os animais falso-operados

(FO) foram submetidos aos procedimentos descritos para isquemia, exceto a cauterização da

artéria cerebral média (Figura 06).

45

Figura 6 - Cirurgia de isquemia cerebral focal em um camundongo: momento da

aproximação do bisturi eléctrico para coagulação da artéria cerebral média.

Fonte: Laboratório de Neurociencias e Comportamento-LNC

4.5 Avaliação Neurológica

A Avaliação Neurológica (sensório-motor) foi realizada 24 horas após a isquemia. Os

achados neurológicos foram pontuados utilizando uma escala previamente descrita por Garcia

et al. (1995), (Quadro2).

Seis parâmetros foram avaliados, sendo eles: 1. Atividade espontânea, que analisa a

habilidade do animal de se aproximar das quatro paredes de uma caixa de polipropileno

(30cm de diâmetro) explorando o ambiente; 2. Simetria do movimento das quatro patas, que

avalia se o animal ao ser segurado pela cauda e suspenso no ar mostra simetria nos membros;

3. Estiramento das patas dianteiras, no qual o animal foi levado a caminhar sobre as patas

dianteiras na borda de uma mesa; 4. Escalada, que analisa a capacidade do animal agarrar

firmemente uma grade de ferro ou de fazer movimentos circulares quando o animal é puxado

pela cauda enquanto escala uma grade de ferro; 5. Propriocepção corpórea, na qual o animal é

tocado com uma pinça em ambos os lados do corpo e sua reação é observada, esse parâmetro

analisa a resposta sensorial; 6. Resposta ao toque da vibrissa, no qual com uma pinça é feito

um toque nas vibrissas em ambos os lados do animal, esse parâmetro analisa a resposta

sensorial.

O total de escores dado a cada animal ao fim da avaliação (escore neurológico) varia

de 3 a 18 pontos, representando o somatório dos escores obtido pelo animal em cada

parâmetro analisado.

46

Quadro 2. Avaliação neurológica

Testes Escores

0 1 2 3

Atividade

Espontânea

Animal sem

movimento

Animal não se

ergue e raramente

se movimenta

Animal se

movimenta,

mas não se

aproxima de

três lados da

caixa

Animal se

movimenta e se

aproxima de

três

lados da caixa

Simetria do

movimento

das

quatro patas

Contralateral:

sem

movimento

Contralateral:

raros movimentos

Contralateral:

movimentos

lentos

Ambos os

lados:

movem

simetricamente

Estiramento

das patas

dianteiras

Contralateral:

sem

movimento

Contralateral:

raros movimentos

Contralateral:

movimentos

lentos

Ambos os

lados:movem

Simetricamente

Escalada/

Prensão

… Animal falhou

emescalar e

exibiumovimentos

circulares

Contralateral

com

dificuldade

de subir

agarrar a

grade

Animal escalou

normalmente e

agarra a grade

Propiocepção

Corpórea

…. Contralateral:

sem resposta

Contralateral

<

Ipsilateral

Resposta

Simétrica

Resposta ao

toque da

Vibrissa

…. Contralateral:

sem resposta

Contralateral

< Ipsilateral

Resposta

Simétrica

4.6 Quantificação do dano isquêmico cerebral através da coloração pelo Cloreto de

2,3,5-Trifeniltetrazol (TTC)

A coloração com o 2,3,5-trifeniltetrazol (TTC) é utilizada para identificar e quantificar

as regiões de infarto decorrentes da isquemia cerebral focal. TTC é um sal derivado do MTT

(brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difeniltetrazol) que ao ser reduzido pelas

mitocôndrias viáveis (recebe um próton da succinato desidrogenase) adquire coloração

avermelhada, ficando as células que não são mais viáveis (com enzimas inativas) como uma

coloração pálida (correspondendo a área de infarto) (GOLDLUST et al., 1996).

47

Vinte e quatro horas após a isquemia os animais foram eutanasiados por decapitação e

seus cérebros foram removidos e conservados em salina gelada até o momento dos cortes, os

cérebros foram fatiados na espessura de 2 mm e imersos em solução de 2% de TTC à 37°C

por 30 minutos. Em seguida, as fatias tiveram suas imagens digitalizadas em alta resolução,

sendo analisadas as áreas de infarto e as áreas totais para os cálculos das respectivas

percentagens. Tal metragem foi realizada utilizando-se o software Osíris TM (University of

Geneva, Switzerland).

4.7 Avaliação da degeneração neuronal através do Violeta de Cresil

Neste estudo, a viabilidade celular foi analisada pela coloração de cresil-

violeta. A coloração de cresil-violeta é utilizada para evidenciar os corpúsculos de Nissl

presentes no citoplasma de neurônios viáveis (SCORZA et al., 2005).

Cinco dias após pMCAO, os animais (n=4/grupo), foram anestesiados com xilazina

(10mg/kg) e ketamina (90mg/kg) por via intraperitoneal e perfundidos transcardialmente com

salina, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros foram removidos e fixados

com paraformaldeído a 4% durante 24 h e armazenados em sacarose a 30% (4ºC), até a

realização dos cortes. Os cortes coronais do córtex e estriado foram feitos em um criostato

(Leica CM3050 S, Heidelberg, Alemanha) a -21 ºC, e armazenados free floating em PBS

(4ºC) numa série de “um em seis” de 50 mm (300 mm de intervalo).

Os cortes cerebrais foram mergulhados em água destilada durante um minuto,

posteriormente, foram incubados na solução de cresil-violeta 0,5% em ácido acético, por um

período de três minutos. Em seguida, as lâminas foram desidratadas em álcool (50, 70 e

100%). Em seguida, foram mergulhadas em xilol e montadas com entellan (Merck,

Alemanha). As lâminas foram visualizadas em um microscópio (Nikon Elipse E200) com

aumento de 40x. Foram selecionadas três fatias de cada animal, aleatoriamente, ao longo da

área da lesão e a quantificação das células foi realizada utilizando o software ImageJ (NIH,

Bethesda, MD, EUA) com um gride de 100. As células foram consideradas cresil positivas

quando apresentaram coloração violeta no citoplasma, bem como, aspectos morfológicos

normais (células de forma redonda ou oval com núcleos centralizados). As células foram

consideradas cresil negativas quando apresentaram ausência da coloração violeta associada a

alterações morfológicas, caracterizados por núcleos celulares encolhidos, acompanhados por

48

núcleos picnóticos. Os resultados foram expressos como percentual de células cresil positivas

e negativas.

4.8 Avaliação da degeneração neuronal através do Fluoro jade C (Schmued et al., 2005).

A técnica de coloração do Fluoro-Jade C, foi utilizada para investigar a

degeneração neuronal. Os animais foram perfundidos através do ventrículo esquerdo, com

salina gelada, seguido de paraformaldeido a 4% em PBS. Os cérebros foram removidos e

fixados em formol tamponado por 24 horas, após esse período foram armazenados em solução

crioprotetora de sacarose a 30% em geladeira. O tecido foi cortado em fatias no criostato e as

fatias as foram montadas em lâminas gelatinizadas.

As lâminas foram imersas, durante 5 minutos numa solução básica de álcool, que

consiste em: 0,01% de NaOH (0,01g para 100ml) em 80% de etanol, e depois em etanol a

70% durante 2 minutos e água ultrapura durante 2 minutos. Em seguida foram incubados sob

agitação, em 0,06% de permanganato de potássio durante 10 minutos, (protegidos da luz),

lavadas em água durante 2 minutos e incubadas, sob agitação durante 10 minutos, na solução

0,0001% de Fluoro-jade C, em 0,1% de ácido acético, e lavadas novamente em águas

ultrapura 3vezes (1 minuto de cada vez). Após secagem das lâminas (ao ar livre), as lâminas

foram mergulhadas em xilol (câmara de exaustão) durante 1 minuto e montadas com o meio

de montagem Entellan.

A marcação com Fluoro-jade C foi quantificada em séries de 8 seções coronais (40µm

de espessura e espassamento de 300µg), representativas do estriato e córtex de 4 animais de

cada grupo experimental. A quantificação da Média de intensidade de Fluorescência (MIF),

utilizada para mensuração, foi calculada através do programa Image J. Foi feita uma média

para os valores MIF, obtidos para o grupo controle (FO) e todos os outros calculados como

percentagem desse valor, sendo representados como média do controle ± EPM.

4.9 Avaliação da atividade locomotora (Teste de campo aberto)

O teste do campo aberto foi originalmente descrito por Hall (1934) para

analisar o estado emocional em ratos. O teste foi realizado com o intuito de aferir a

capacidade locomotora dos animais, baseado no modelo de Broadhurst (1957). O campo

aberto consiste de uma arena quadrada (30 x 30 x 15 cm) de acrílico preto com o piso

dividido em nove quadrantes iguais (figura 7).

49

No teste o animal foi colocado na arena e deixado para explorar o ambiente por 5

minutos, durante este período foi registrado o número de quadrantes atravessados pelo animal

(número de cruzamentos). Também foi avaliado o número de vezes que o animal se levantou

para explorar o ambiente, mantendo-se suspenso apenas pelas patas traseiras, caracterizando o

comportamento exploratório do tipo rearing. A arena foi limpa com álcool a 20% após cada

teste, para evitar interferência do cheiro de urina e fezes no teste.

Figura 7. Arena do Campo Aberto.

Fonte: Laboratório de Neurociencias e Comportamento-LNC

4.10 Avaliação da memória de trabalho - Teste do labirinto em Y

A memória operacional ou de trabalho foi avaliada através do teste do labirinto em Y.

Nesse teste o animal é colocado em um labirinto em forma de Y com os três braços iguais

(SARTER et al., 1988). Os animais apresentam forte tendência de alternar a entrada nos

diferentes ambientes. O labirinto em Y é composto por 3 braços de madeira com 16 cm de

altura, 5 cm de largura e 40 cm de comprimento (Figura 8).

50

Figura 8. Labirinto em Y

Fonte: Laboratório de Neurociências e Comportamento-LNC

Para a avaliação da memória os braços foram numerados. O animal foi colocado no

aparelho e durante 8 minutos as sequências dos braços os quais os animais entrarem foram

anotadas. Foi considerado acerto cada vez que o animal entrou em 3 diferentes braços sem

repetição. O resultado foi expresso em porcentagem e obtido através da seguinte fórmula

matemática:

4.11 Avaliação da memória aversiva – Teste da Esquiva Passiva (Gold, 1986)

O teste de esquiva passiva envolve a tendência natural do animal de explorar além da

plataforma e o aprendizado de evitar o choque, um componente aversivo que constitui uma

resposta condicionada.

O aparelho consiste de uma caixa de acrílico (48 x 22 x 22), com o piso constituído

por uma plataforma e uma grade eletrificada (Figura 9). O animal foi colocado na plataforma

e deixado para ambientação no aparelho durante um 1 minuto, e depois retirado. Após 30

segundos, o animal foi colocado novamente na plataforma. O animal ao descer da plataforma

recebeu um choque de 0,5 mA, durante 1 segundo, com o tempo de latência para entrar sendo

registrado, até um máximo de 5 minutos (treino). Retirou-se o animal e após 15 minutos este

foi colocado novamente na plataforma e registrou-se a latência de descida (avaliação da

51

memória recente). A retenção do aprendizado (avaliação da memória tardia) foi testada após

24 h, quando o animal foi colocado na plataforma e o tempo de latência para a descida da

plataforma foi registrada, nessa etapa o animal não recebeu o choque.

Figura 9. Aparelho de Esquiva Passiva. (Insight LTDA.)

4.12 Avaliação da memória episódica – Teste do Reconhecimento de Objetos (Ennaceur;

Delacour, 1988).

O teste de reconhecimento de objetos é baseado na tendência natural dos animais

buscarem o novo. Durante o treino o animal foi colocado numa arena quadrada (30 x 30 x 15

cm) de acrílico preto contendo dois objetos iguais (OI) e, durante 10 min, ele podia explorar o

ambiente e os objetos (Figura 10 A). Após 1h, um dos objetos iguais foi substituído pelo

objeto novo (ON) e o animal foi colocado novamente na arena (teste) (Figura 10 B). Durante

5 min o tempo que o animal utilizou explorando cada um dos objetos foi anotado. O resultado

foi expresso como índice de reconhecimento e foi obtido através da seguinte fórmula

matemática: (tempo ON – tempo OI)/ (tempo ON+ tempo OI).

52

Figura 10. Arena com objetos.


4.13 Avaliação da memória espacial - Teste do Labirinto Aquático

Nesta versão do labirinto aquático os roedores aprendem a nadar a uma distância mais

curta possível das bordas de um tanque de água para uma plataforma escondida abaixo da

superfície. Eles aprendem guiados por pistas nas paredes ou outros estímulos visuais externos

ao tanque. Esta tarefa espacial é dependente do hipocampo.

O animal foi colocado de forma aleatória em uma piscina circular (90 cm de diâmetro e

60 cm de profundidade) contendo água turva (30 cm de altura) com tinta branca não tóxica à

26 °C, dividida espacialmente em quatro quadrantes, devendo encontrar uma plataforma (7cm

de diâmetro) submersa 2cm (Figura 11). O animal teve 60s para achar a plataforma (que

permaneceu no mesmo local em todos os treinos) e lá permaneceu por 10s. Este treino foi

realizado quatro vezes por dia com intervalos de 30s entre os treinos, durante dois dias

(aprendizagem) e 48h após o último treino, os animais foram submetidos ao teste, agora sem a

plataforma, onde foi avaliada a aquisição da memória. Na ocasião, o animal permaneceu na

piscina por 60s e foi registrado o tempo em que o animal permanece no quadrante em que a

plataforma deveria estar, o tempo de latência para encontrar o local da plataforma e o número

de vezes em que ele cruzou o local exato da plataforma (MORRIS et al., 1984).

53

Figura 11. Labirinto aquático.


4.14 Ensaio para Mieloperoxidase (MPO)

A Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos dos neutrófilos,

sendo utilizada como marcador para o conteúdo dessas células nos tecidos. A extensão da

acumulação de neutrófilos no hipocampo, estriado e córtex temporal foi mensurada através da

técnica de Bradley et al. (1982), com algumas modificações, 24 horas após a cirurgia. As

amostras foram homogeneizadas em tampão HTAB (5g de HTAB em 1L de tampão de

fosfato de potássio, pH 6), sendo 1mL de tampão para cada 50mg de tecido. Em seguida, as

amostras foram centrifugadas a 14000 rpm a 4˚C por 2 minutos. Adicionou-se 30μL do

sobrenadante da amostra e 200μL da solução de o-dianisidina contendo 1mL de peróxido de

hidrogênio a 30%.

A absorbância foi medida nos tempos 0:1 e 3 minutos no comprimento de onda

460nm. Os resultados foram expressos como unidades de MPO por mg de tecido. E uma

unidade de MPO equivale à quantidade que degrada 1μmol/min de peróxido de hidrogênio

(BRADLEY et al., 1982).

4.15 Avaliação da imunoreatividade para (TNF-α e iNOS).

Cinco dias após pMCAO, os animais (n=4/grupo), foram anestesiados com xilazina

(10mg/kg) e ketamina (90mg/kg) por via intraperitoneal e perfundidos transcardialmente com

salina, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS. Os animais foram eutanasiados, e os

cérebros foram removidos e fixados com paraformaldeído a 4% durante 24 h e armazenados

54

em sacarose a 30% (4ºC), até a realização dos cortes. Os cortes coronais do córtex e estriado

foram feitos em um criostato (Leica CM3050 S, Heidelberg, Alemanha) a -21 ºC, e

armazenados free floating em PBS (4ºC) numa série de “um em seis” de 50 mm (300 mm de

intervalo).

Para a realização da técnica de imunohistoquímica, as fatias cerebrais foram lavadas

três vezes durante 10 min (cada) com PBS e incubadas (PBS + 10% de metanol e 1,05% de

peróxido de hidrogênio), durante 40 minutos à temperatura ambiente, para bloquear a

atividades da peroxidase endógena. Depois de lavar 3 vezes durante 10 min (cada) com PBS e

tendo bloqueadas as proteínas endógenas com 10% de soro normal de cabra em PBS

suplementado com Triton X-100 (solução de bloqueio) durante duas horas à temperatura

ambiente, as secções foram incubadas com os anticorpos primários (anti-TNF-α,1: 250 ou

anti-iNOS, 1: 400, Santa Cruz Biotechnology) diluída em solução a 4°C de bloqueio durante

48 h. As secções foram então lavadas três vezes durante 10 min (cada), em PBS e

subsequentemente incubadas com conjugado de avidina-biotina-peroxidase de rábano

(coloração Sistema ABC, Santa Cruz Biotechnology), durante 30 min. Após a lavagem, as

lâminas foram incubadas com cabra anti-coelho biotinilado (anticorpo secundário), diluído

1:500 em solução de bloqueio. Como revelador foi utilizado o DAB. As fatias foram

montadas em entellan (Merck, Alemanha), e visualizadas sob um microscópio (Nikon Elipse

E200) com aumento de 40x. Foram selecionadas três fatias de cada animal, aleatoriamente, ao

longo da área da lesão e a quantificação das células foi realizada utilizando o software ImageJ

(NIH, Bethesda , MD, EUA). As células foram consideradas positivas para TNF-α e iNOS

quando apresentaram uma coloração acastanhada. Os resultados foram expressos como

número de células TNF-α e iNOS positivas.

4.16 Avaliação da astrogliose através da imunomarcação com GFAP

Os astrócitos possuem um papel fundamental na manutenção da homeostase cerebral.

Eles possuem a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) do inglês Glial Fibrillary Acidic Protein,

uma proteína exclusiva dos astrócitos que os diferencia dos demais tipos celulares

(O’CALLAGHAM; SRIRAM, 2005). Essa proteína é expressa em processos

neuroinflamatórios (SWANSON et al., 2004). Assim, neste trabalho, a ativação da astrogliose

foi evidenciada pela imunoreatividade de GFAP.

55

Para isso, cinco dias após pMCAO, os animais (n=4/grupo), foram anestesiados com

xilazina (10mg/kg) e ketamina (90mg/kg) por via intraperitoneal e perfundidos

transcardialmente com salina, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros foram

removidos e fixados com paraformaldeído a 4% durante 24 h e armazenados em sacarose a

30% (4ºC), até a realização dos cortes. Os cortes coronais do córtex e estriado foram feitos em

um criostato (Leica CM3050 S, Heidelberg, Alemanha) a -21 ºC, e armazenados free floating

em PBS (4ºC) numa série de “um em seis” de 50 mm (300 mm de intervalo).

As fatias foram lavadas três vezes em PBS por 5 min e depois simultaneamente

permeabilizadas e bloqueadas com TBS (0,05 M Tampão Trizma base com 150 mM de NaCl,

pH 7,2) contendo 0,2 % Triton X-100 e 10 % de soro de cabra, por 1 hora a temperatura

ambiente. Em seguida, foram incubadas, free-floating, com o anticorpo primário preparado

em solução de bloqueio (anti-GFAP, 1:500, rabbit policlonal, Sigma-Aldrich, Portugal)

overnight a temperatura ambiente e depois lavadas 3 vezes por 10 min cada em PBS.

Posteriormente, foi realizada a incubação por 2 horas com o anticorpo secundário (goat anti-

rabbit), dependendo do animal no qual o primário foi produzido, conjugado com o

fluorocromo Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Portugal), diluído a 1:200 em solução de bloqueio.

Após serem lavadas mais 3 vezes em PBS e serem contracoradas com DAPI (Vector

Laboratories, UK), as fatias foram montadas em lâminas gelatinizadas usando o meio

fluoromount (Sigma) e deixadas secar protegidas da luz. A visualização foi realizada no

microscópio de fluorescência Zeiss Axiovert 200 (Axiovision software 4.6, PG-Hitec,

Portugal).

Foram selecionadas três fatias de cada animal, aleatoriamente, ao longo da área da lesão

e a quantificação das células foi realizada utilizando o software ImageJ (NIH, Bethesda , MD,

EUA). Os resultados foram expressos como a média da intensidade de fluorescência a partir

da % da média dos controles.

4.17 Análise Estatística

Antes da realização dos testes estatísticos foi realizado o teste de normalidade para

todos os dados. Para avaliação dos escores neurológicos foram utilizados os testes de

Kruskall-Wallis e Dunn e os valores expressos em mediana (mínimo e máximo). Para a

56

análise estatística dos testes comportamentais, bioquímicos, de imunohistoquímica e

histologia foram realizados os testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney, sendo os resultados

expressos como média ± erro padrão da média. O critério de significância utilizado foi de p <

0,05. O programa de computador usado foi Graph Pad Instat® 5.0.

57

5 RESULTADOS

5.1 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a avaliação neurológica de

camundongos submetidos a isquemia focal permanente por oclusão da artéria cerebral

média (pMCAO)

Os animais submetidos a oclusão da artéria cerebral média (pMCAO) apresentaram

déficits neurológicos significativos 24h após a isquemia, em relação aos animais falsos

operados. Mediana (minimo e máximo): (FO: 18 (17-18); pMCAO: 15 (13-17), apresentando

principalmente diminuição da capacidade de responder a estímulos e movimentar o lado

contralateral á isquemia. Os animais tratados com o α-bisabolol nas doses de 100 e 200mg/kg

apresentaram diminuição significativa dos déficits neurológicos causados pela pMCAO (α-

Bis 50: 15 (14-18); α-Bis 100: 17 (16-18); α-Bis 200: 17 (16-18) (Figura 12).

Figura 12. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o número de total de escores

obtidos na avaliação neurológica de camundongos submetidos à pMCAO (n = 8/grupo).

200 50 100 20012

14

16

18

20

a

b b

FO

Esc

ore

s

pMCAO

pMCAO + -Bis

Os valores representam a mediana (mínimo e máximo). a vs FO, b vs pMCAO. p<0.05. Teste

de Kruskal-Wallis e Dunn.

58

5.2 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano isquêmico de camundongos

submetidos à pMCAO.

O efeito do α-bisabolol sobre o dano neuronal isquêmico foi analisado 24 horas após a

cirurgia. Os animais falsos operados apresentaram menor dano isquêmico cerebral, em relação

aos animais isquemiados (FO: 0,83 ± 0,17%; pMCAO: 10,83 ± 1,38%). O animais tratados

com α-bisabolol na dose de 100 e 200 mg/kg, apresentaram menor porcentagem de área

isquêmica em relação aos animais isquemiados (α-Bis 100: 4,67 ±0,88 %; α-Bis: 2,17±0,60%)

(Figura 13 e 14).

Figura 13. Visualização do dano neuronal isquêmico através da coloração de TTC entre os

grupos.

Observar a area isquemica (setas).

59

Figura 14. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano neuronal isquêmico de

camundongos submetidos à pMCAO (n=8/grupo)

200 50 100 2000

5

10

15

b

FO

a

b

pMCAO + -Bis

pMCAO

Áre

a d

e in

fart

o (

%)

Os valores representam média ± EPM. a vs FO, b vs pMCAO, p<0.05. Teste de Kruskal-

Wallis seguido do teste Mann-Whitney.

60


coloração com o cresil violeta no córtex temporal e no estriado de camundongos

submetidos a pMCAO

Foi observada uma maior morte neuronal no córtex (Cresil positivo%, FO:

84,77±0,83%; pMCAO: 26,65±1,95%, e cresil negativo%, FO: 15,25±0,81%; pMCAO:

73,35±3,93%) e no estriado (Cresil positivo FO: 84,77±0,83%; pMCAO: 26,65±1,97%, e

Cresil negativo%, FO: 26,78±2,84%; pMCAO: 78,50±4,63%) de camundongos 5 dias após a

indução da isquemia. O tratamento com o α-bisabolol na dose de 200 mg/kg mostrou um

efeito citoprotetor, tanto no córtex (Cresil positivo %, pMCAO + α-Bis 200: 59,90±2,79% e

Cresil negativo pMCAO + α-Bis 200: 40,10±2,79%) como no estriado (Cresil positivo

pMCAO + α-Bis 200: 59,90±2,79 % e Cresil negativo pMCAO + α-Bis 200: 38,80±1,48%)

dos animais isquemiados (Figuras 15, 16 e 17).

Figura 15. Fotomicrografias representativas do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a

degeneração neuronal avaliada através da coloração com o cresil violeta no córtex temporal 5

dias após a pMCAO.

61

Figura 16. Avaliação da viabilidade celular da coloração com o cresil violeta no córtex

temporal 5 dias após a pMCAO de camundongos tratados com α-bisabolol.

200 2000

20

40

60

80

100Cresil (+)

Cresil (-)

a

a

b

b

FO pMCAO + -Bis

Via

bil

ida

de

Celu

lar

no

Có

rtex

(%)

a vs FO, b vs pMCAO, p<0,05. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores

representam a média ± EPM.

Figura 17. Avaliação da viabilidade celular através da coloração com o cresil violeta no

estriado de camundongos 5 dias após a pMCAO e tratados com α-bisabolol.

200 2000

20

40

60

80

100Cresil (+)

Cresil (-)

a

a

b

b

FO pMCAO + -Bis

Via

bil

ida

de

Celu

lar

no E

stri

ad

o (

%)



62


coloração com Fluoro Jade no córtex temporal de camundongos submetidos a pMCAO.

Na figura 18 observamos uma maior morte neuronal observada pelo aumento da

intensidade de fluorescência no córtex e no estriado de camundongos 5 dias após a indução da

isquemia. Os animais isquemiados apresentaram aumento na média de intensidade de

fluorescência no córtex (FO: 2,05±0,67 pMCAO: 108,8±14,69), e no estriado (FO: 1,25±0,25.

pMCAO: 27,58±16,03) representando maior degeneração neural. O tratamento com o α-

bisabolol previniu esse efeito no córtex (pMCAO + α-Bis 200: 39,75±9,30) mas nao no

estriado (pMCAO + α-Bis 200: 24,88±2,09). (Figura 19 e 20).

Figura 18. Fotomicrografias representativas (40x) do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre

a degeneração neuronal (coloração por Fluoro Jade C) em camundongos submetidos à

pMCAO.

63

Figura 19. Avaliação da média da intensidade de fluorescência (MIF) no córtex através da


com α-bisabolol.

200 2000

50

100

150

FO

a

b

pMCAO + -Bis

Cél

ula

s F

J-C

pos

itiv

as(%

)

Có

rtex



Figura 20. Avaliação da média da intensidade de fluorescência (MIF) no estriado através da


com α-bisabolol.

200 2000

10

20

30

40

a

FO pMCAO++Bis

Cél

ula

s F

J-C

po

siti

va

s(%

)

Est

ria

do

a vs FO, b vs pMCAO, p<0,05. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney.ANOVA. Os

valores representam a média ± EPM.

64

5.5 Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg sobre a atividade locomotora de

camundongos submetidos a pMCAO

A atividade locomotora foi avaliada 72 horas após a pMCAO. O grupo pMCAO

obteve menor número de crossings e menor número de “rearings” em relação ao grupo falso

operado demontrando assim déficit na atividade locomotora dos animais isquemiados

(Crossings: FO: 104,9±8,81; pMCAO: 61,63±3,75; Rearings: FO: 15,38±3,16; pMCAO: 3,50

± 0,78). Os animais tratados com α-bisabolol na dose de 200mg/kg/dia apresentaram uma

diminuição significativa do déficit de atividade locomotora (Crossings: FO + α-Bis 200:

93,25±4,19; pMCAO + α-Bis 50: 57,75±2,34; pMCAO + α-Bis 100: 80,13±7,37; pMCAO +

α-Bis 200: 97,25±11,85; Rearings: FO + α-Bis 200: 20,13± 2,72; pMCAO + α-Bis 50: 10,75

± 1,81; pMCAO + α-Bis 100: 14,88 ± 1,83; pMCAO + α-Bis 200: 19,38± 2,52) (Figura 21 e

22).

Figura 21. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200mg/kg) sobre o número de crossings no teste

do campo aberto de camundongos submetidos à pMCAO.

200 50 100 2000

50

100

150

a

b

FO pMCAO+ -Bis

pMCAO

Nº

de

Cro

ssin

gs

a vs FO; b vs pMCAO, p< 0,05. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores


65

Figura 22. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200mg/kg/dia) sobre o número de “rearings” no

teste do campo aberto de camundongos submetidos à pMCAO.

200 50 100 2000

5

10

15

20

25

a

b

b

FO pMCAO+ -Bis

pMCAO

Nº

de

rear

ing

s

a vs FO; b vs pMCAO, p < 0,05. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores


66

5.6 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de trabalho de

camundongos submetidos à pMCAO

Os animais submetidos à pMCAO apresentaram déficit na memória de trabalho e esse

efeito foi prevenido significativamente pelo α-bisabolol na dose de 200mg/kg (Número de

alternações espontanêas: FO: 76,88±2,33 %; FO + α-Bis 200: 76,13± 4,07%; pMCAO:

58,75±4,14%; pMCAO + α-Bis 50: 60,63±4,49 %; pMCAO + α-Bis 100:70,63±2,70%)

pMCAO + α-Bis 200: 78,63±4,66% (Figura 23).

Figura 23. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de trabalho de

camundongos submetidos pMCAO (n = 8/grupo).

200 pMCAO 50 100 2000

20

40

60

80

100

a

b

FO pMCAO + -Bis

Alt

ern

açõ

es e

spon

tân

eas(

%)

a vs FO, b vs pMCAO, p<0,05, testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores


67

5.7 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memórial aversiva de

camundongos submetidos a pMCAO

Os animais isquemiados apresentaram déficits significativos na memória recentes e

tardia, respectivamente 72 e 96 horas após a indução da isquemia, quando comparado com o

controle (Mem. Recente: FO: 184,4±31,20s; pMCAO: 37,50±8,47s; Mem. Tardia: FO:

135,6±26,89s; pMCAO: 13,75±3,53s). O tratamento com o α-bisabolol na dose de 100 e de

200mg/kg preveniu tanto os déficits na memória recente, como na memória tardia. (Mem.

Recente: FO + α-Bis 200: 157,1±33,60s; pMCAO + α-Bis 50: 41,13±9,25s; pMCAO + α-Bis

100: 159,5±24,48s; α-Bis +200 pMCAO: 160,0±38,63s), Mem. Tardia: FO + α-Bis 200:

182,0±30,07s; pMCAO + BISA 50: 17,29±6,672s; pMCAO + α-Bis100: 152,3±38,22s;

pMCAO + α-Bis200: 155,9±40,171,83s). (Figura 24).

Figura 24. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória aversiva recente de

camundongos submetidos pMCAO (n = 8/grupo).

a vs FO, b vs pMCAO p<0,05, testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores

representam a média±EPM. MR-memoria recente, MT-memoria tardia.

68

5.8 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória episódica avaliada

através do teste de reconhecimento de objetos em camundongos submetidos à pMCAO

Os animais submetidos à oclusão da artéria cerebral média apresentaram déficit na

habilidade de reconhecer um novo objeto, 96 horas após a isquemia, em relação aos animais

falso-operados (FO: 0,34±0,07; pMCAO: 0,02±0,08), apresentando menor índice de

reconhecimento. O tratamento com o α-bisabolol na dose de 100 e 200 mg/kg diminuiu

significativamente este déficit (FO + α-Bis 200: 0,31±0,06; pMCAO + α-Bis 50: 0,26±0,07;

pMCAO + α-Bis 100: 0,32±0,05; pMCAO + α-Bis 200: 0,36±0,08). (Figura 25).

Figura 25. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória episódica avaliada

através do teste de reconhecimento de objetos de camundongos submetidos à pMCAO (n =

8/grupo).

200 50 100 200-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

FO

a

bb

pMCAO + -BIS

Índ

ice

de

reco

nh

ecim

ento


representam a média EPM

69

5.9 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória espacial de camundongos

submetidos à pMCAO

Na avaliação do aprendizado na memória espacial realizado 48 e 72 horas após a

isquemia, os animais isquemiados apresentaram maior déficit em relação ao FO nos tempos 2,

3 e 7 (Treino 2: FO: 19,00±5,55s; pMCAO: 52,56±4,81s; Treino 3: FO: 16,25±5,39s;

pMCAO: 47,88±6,87s; Treino 7: FO: 10,00±1,88s; pMCAO: 42,50±7,24s), e não

significativo nos tempos 1, 4, 5, 6 e 8.

O α-bisabolol (200 mg/kg) diminuiu o déficit de aprendizado induzido pela isquemia no

treino 2 (pMCAO + α-Bis 200: 19,33± 5,30), treino 3 (pMCAO + α-Bis 200: 22,50± 7,25).

Treino 7 (pMCAO + α-Bis 200: 16,00± 6,61). (Figura 26). O α-bisabolol na maior dose não

mostrou diferença em relação ao animal FO.

Na avaliação da retenção da memória espacial, 120 horas após a isquemia, os animais

isquemiados apresentaram déficits significativos nos parâmetros latência para alcançar a

plataforma e o número de cruzamentos não foi significativo (Latência: FO: 3,13±0,52s; FO +

α-Bis 200: 7,13±0,96s; + pMCAO: 12,00±1,32s. Número de cruzamentos: FO: 8,38±0,50s;

FO + α-Bis 200: 8,88±1,025s; pMCAO: 6,33±0,77s. Tempo de permanência no quadrante:

FO: 22,13±1,51s; FO + α-Bis 200: 22,33±1,89s; pMCAO: 11,50±1.07s). (Figura 27, 28 e 29).

O tratamento com o α-bisabolol nas doses de 200 mg/kg preveniu o aumento da

latência, e aumentou o tempo de permanência no quadrante. O mesmo não foi observado com

o número de cruzamentos. Latência (figura 27): pMCAO + α-Bis 50: 11,75±1,40s; pMCAO +

α-Bis 100: 11,36±1,40s; pMCAO + α-Bis 200: 5,75±0,83s. Tempo de permanência no

quadrante (figura 28): pMCAO + α-Bis 50: 13,13±1,86s; pMCAO + α-Bis 100: 18,38±2,02s;

pMCAO + α-Bis 200: 18,00±1,15s. Número de cruzamentos (figura 29): pMCAO + α-Bis 50:

6,00±0,60s; pMCAO + α-Bis 100: 6,50±0,50s; pMCAO + α-Bis 200: 7,37±0,50s.

70

Figura 26. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre o aprendizado avaliado através do tempo

de latência nos treinos para alcançar a plataforma de camundongos submetidos à pMCAO (n

= 8/grupo).

0 1 2 3 4 5 6 7 80

20

40

60FOpMCAO

-Bis 200

a

b

a

b

a

b

Latê

ncia

(s)



Figura 27. Efeito do α-bisabolol (50, 100 e 200 mg/kg) sobre a memória espacial, avaliada

através do parâmetro latência para alcançar a plataforma, de camundongos submetidos à

pMCAO (n = 8/grupo).

200 50 100 2000

5

10

15a

b

FO pMCAO + -Bis

pMCAO

Tem

po

de

late

nci

a (s

)


representam a média ±EPM.

71


através do parâmetro número de cruzamentos, de camundongos submetidos à pMCAO (n =

8/grupo).

200 50 100 2000

10

20

30

FO pMCAO + -Bis

a

b b

pMCAO

Tem

po

de

per

ma

nên

cia

no q

uad

ran

te (

s)

a vs FO, b vs pMCAO p<0,05, testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores



através do parâmetro tempo de permanência no quadrante, de camundongos submetidos à

pMCAO (n = 8/grupo).

200 50 100 2000

5

10

15

FO pMCAO + -Bis

pMCAO

N c

ruza

men

tos

p<0,05, testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média ± EPM.

72

5.10 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) no

córtex temporal, corpo estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO

Na avaliação da enzima mieloperoxidase, 24h após a indução da isquemia por oclusão

da artéria cerebral média, os animais isquemiados apresentaram aumento significativo da

MPO no córtex temporal por U/mg de tecido (FO: 1,95± 0,60u/mg de tecido; pMCAO:

22,63±2,88 u/mg tecido) mas não houve aumento no corpo estriado (FO: 2,02±0,60; pMCAO:

1,88±0,40), e no hipocampo (FO: 1,17±0,24; pMCAO: 1,41±0,45). O tratamento com o α-

bisabolol diminuiu significativamente esses valores no córtex (FO + α-Bis 200: 1,33±0,35;

pMCAO + α-Bis 200: 3,82±1,64) e não promoveu alterações no corpo estriado e no

hipocampo (Corpo estriado: FO + α-Bis 200: 1,40±0,63; pMCAO + α-Bis 200: 1,15±0,56;

Hipocampo: FO + α-Bis 200: 0,70±0,11; pMCAO + α-Bis 200: 0,97±0,14). (Figuras 30, 31 e

32).

Figura 30. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO no córtex temporal de

camundongos 24h após a pMCAO.

200 2000

10

20

30

a

b

FO pMCAO + -Bis

Un

idad

e d

e M

PO

/mg

de

tecid

o(

có

rte

x)



73

Figura 31. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO em corpo estriado de


200 2000

1

2

3

FO pMCAO + -Bis

Un

ida

de

de

MP

O/m

g d

e

te

cid

o (

es

tria

do

)

Teste de Kruskal-Wallis e teste de Mann-Whitney. Os valores representam a média ± EPM.

Figura 32. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre os níveis de MPO em hipocampo


200 2000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

FO pMCAO + -Bis

Un

idad

e d

e M

PO

/mg

de

tecid

o (

hip

oca

mp

o)

Teste de Kruskal-Wallis e teste de Mann-Whitney. Os valores representam a média ± EPM.

74

5.11 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a imunorreatividade de TNF-α no córtex e

no estriado de ratos submetidos á pMCAO

Os animais isquemiados apresentaram aumento da imunorreatividade do TNF-α no

córtex e no estriado. Número de celulas TNF-α positivas, no córtex (FO: 6,00±1,23; pMCAO:

40,50±3,97) e no estriado (FO: 3,00±0,82; pMCAO: 22,00±3,76) 5 dias após a pMCAO e o

tratamento com o α-bisabolol na dose de 200 mg/kg diminui esta imunorreatividade do TNF-α

no córtex dos animais isquemiados (pMCAO + α-Bis 200: 26,00±3,72) (Figuras 33 e 34).

Figura 33. Fotomicografias reprsetativas (40x) do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a

munrreativdade do TNF-α no córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal

permanente por oclusão da artéria cerebral.

75

Figura 34. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a imunorreatividade do TNF-α no córtex

e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal permanente por oclusão da artéria cerebral.

200 2000

10

20

30

40

50Córtex

Estriado

a

ab

FO pMCAO + -Bis

Nº

célu

las

TN

F

+

a

vs FO, b vs pMCAO, p<0,05. Teste de Kruskal-Wallis e teste de Mann-Whitney. Os valores


76

5.12 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão do iNOS no córtex e no estriado

de ratos submetidos á pMCAO

Na figura 35 observamos um aumento da imunorreatividade do iNOS no córtex.

Número de células iNOS+ (FO: 8,25±3,04; pMCAO: 317,5±7,35) e no estriado (FO:

7,50±6,84; pMCAO: 314,0±10,30) de camundongos 5 dias após a indução da isquemia. O

tratamento com o α-bisabolol na dose de 200 mg/kg diminui significativamente esta

imunorreatividade do iNOS no córtex (pMCAO + α-Bis 200: 54,75±3,45) e no estriado

(pMCAO + α-Bis 200: 54,50±5,20) dos animais isquemiados (Figuras 35 e 36).

Figura 35. Fotomicografias representativas (40x) do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre

imunorreatividade de iNOS no córtex e no estriado de ratos submetidos a isquemia focal

permanente por oclusão da artéria cerebral.

77

Figura 36. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a imunorreatividade de iNOS no córtex e

no estriado de ratos submetidos á isquemia focal permanente por oclusão da artéria cerebral.

200 2000

100

200

300

400Córtex

Estriadoa a

b b

FO pMCAO + -Bis

Nº

célu

las

iNO

S+

Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. a vs FO, b vs pMCAO, p<0,05. Os valores


78

5.13 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a ativação de astrócitos evidenciada através

da imunomarcação com GFAP no corpo estriado e córtex temporal de camundongos

submetidos à pMCAO

Os animais isquemiados apresentaram aumento de marcação fluorescente vermelha,

mostrando aumento de astrócitos ativados no córtex temporal (FO: 100,7±7,20; pMCAO:

1389,00±228,5) e no estriado (FO: 61,13±16,36; pMCAO: 890,8±80,96) 5 dias após a

pMCAO e o tratamento com α-bisabolol na dose de 200 mg/kg diminui significativamente o

aumento da ativação de astrócitos nos animais isquemiados no córtex (pMCAO + α-Bis 200:

203,1±52,02) e no estriado (pMCAO + α-Bis 200: 208,1±38,33) (Figuras 37, 38).

Figura 37. Fotomicrogrfias representativas (40x) do efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre

a ativação de astrócitos (GFAP) no córtex temporal e no estriado de camundongos submetidos

à por pMCAO.

79

Figura 38. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a ativação de astrócitos (GFAP) no

estriado e córtex temporal de camundongos submetidos à pMCAO. a vs FO, b vs pMCAO,

p<0,05.

200 2000

500

1000

1500

2000Cortex

Estriadoa

a

bb

FO pMCAO + -BisMéd

ia d

a i

nte

nsi

da

de

de

Flu

ore

scên

cia

(% d

a m

édia

do

s co

ntr

ole

s)

Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média ± EPM.

80

6 DISCUSSÃO

O AVE é uma das principais causas de morte e invalidez nos seres humanos

(LLOMBART et al., 2013; CHAPMAN et al., 2014). É um evento agudo que gera impactos

econômicos, psicológicos e sociais em longo prazo, o que muitas vezes representa uma

ameaça à vida dos pacientes, pois a maioria deles sofrem deficiências, como paralisia, perda

de memória e problemas de fala, requerendo cuidados extras e acompanhamento

especializado (FEIGIN et al., 2014; EISSA et al. 2014; KREITZER et al., 2013).

A lesão inicial provocada pelo AVE leva a morte neuronal por necrose, no entanto o

maior dano neuronal é desencadeado pela apoptose que ocorre horas e dias depois, sendo

causada por lesão secundária devido à inflamação e estresse oxidativo (ROSAMOND et al.

2008). Estes mecanismos de lesão secundária dificultam o processo de reparação neuronal,

levando a deficiência crônica a longo prazo (MOSKOWITZ; LO; IADECOLA, 2010).

Infelizmente, a única terapia comprovadamente eficaz para a neuroproteção e reparação

neuronal após o AVC até o momento é o rTPA, porém, principalmente, devido a natureza

bifásica (aguda e crônica) da doença e limitada compreensão dos mecanismos diferenciais

envolvidos nestas fases o seu uso ainda é limitado (MAK et al., 2013). Para a recuperação

funcional, ensaios clínicos mostram que drogas neuroprotetoras falharam devido à falta de

eficácia na fase crônica. Portanto, uma terapia ideal deve melhorar a fase aguda, bem como a

crônica, por mecanismos bem esclarecidos.

A extensão da área de infarto é constantemente citada em vários trabalhos como

indicador primário dos danos causados pela isquêmia cerebral em modelos animais

(CALLONI et al., 2010). O 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) é um sal, que na presença de

enzimas mitocondriais é reduzido, o que leva ao aparecimento de uma coloração intensa,

devido ao formazan formado (GOLDLUST et al., 1996). Estudos mostraram que apenas uma

isquemia prolongada, pode levar a formação de uma coloração confiável do teste de TTC.

(BARTH; MODY, 2011; POPP et al., 2009), levando em consideração que, lesões

mitocôndriais irreversíveis no cérebro, só ocorrem após um longo período de isquemia.

Nossos resultados mostraram que 24 horas após a cirurgia, os animais isquemiados

apresentaram uma área de infarto isquêmico no córtex e no estriado, corroborando com os

resultados obtidos por MElani et al. (2003, 2006). O tratamento com o α-bisabolol diminuiu

significativamente a área de infarto. Lee et al. (2002) mostraram que algumas classes de

substâncias naturais, como flavonoides e terpenóides, presentes no extrado de Ginkgo biloba

81

reduziram a área de infarto em modelos permanentes e transitórios de isquemia cerebral. Esta

ação neuroprotetora é, pelo menos parcialmente, mediado devido a melhora do fluxo

sanguineo cortical, na área de infarto.

As células neuronais são extremamente sensíveis a mudanças no fluxo sanguíneo.

Estudos mostraram que a função neuronal pode ser comprometida com apenas 10 minutos

após a isquemia (OECHMICHEN; MEISSNER., 2006). Vários modelos de isquemia cerebral

já mostraram que as células neuronais no núcleo morrem rapidamente após esse evento.

Entretanto, as estratégias terapêuticas utilizadas até agora para resgatar esses neurônios não

foram eficazes e como consequência disso, tem sido dado cada vez mais atenção na zona de

penumbra, porque nessa região a morte neuronal pode ser prorrogada por dias ou semanas

(BROUNS; DE DEYN, 2009; LAMBERTSEN; BIBER; FINSEN., 2012). Apesar de ser uma

ferramenta muito útil para a avaliação do dano isquêmico, a coloração por TTC não identifica

quais tipos celulares encontram-se alterados. No presente trabalho a integridade neuronal foi

avaliada através da coloração por cresil-violeta e técnica de Fluoro-Jade.

A coloração de cresil-violeta tem sido amplamente utilizado como método histológico

para identificar danos celulares no sistema nervoso (ALVAREZ-BUYLLA; LING; KIRN,

1990). As células danificadas mostram varias carateristicas, incluindo um corpo celular

encolhido com picnose (BARTUS et al., 1995). O Fluoro-Jade C (FJC), é um derivado

aniônico de fluoresceína que é útil para a coloração histológica de neurônios em degeneração

(GU et al., 2012; SCHMUED; HOPKINS., 2000). Vários estudos mostraram que em alguns

eventos isquêmicos como enfartos em seres humanos (PETITO et al., 1987) ou isquemia

cerebral em roedores (KIRINO, 1982), existem maior indice de células FJB positivos.

Nesse presente estudo verificamos que, cinco dias após a cirurgia, os animais

isquemiados apresentam lesão cortical e estriatal, tanto por um aumento da marcação por

fluoro jade, quanto pela perda significativa de células cresil positiva. A diminuição de células

cresil-violeta positivas, no estriado e no córtex, de animais submetidos à oclusão da MCAO

também foi observada por Lee et al. (2003), além disso, o tratamento com extrato do rizoma

de Acori graminei preveniu a diminuição da número de células cresil-positiva e o déficit de

memória espacial induzidos por isquemia. Corroborando com nossos achados, Knapp et al.

(2014) observaram que a oclusão da MCA provocou um aumento de células FJC-positivas ao

longo dos córtices somatossensoriais ipsilaterais à isquemia.

82

O tratamento com α-bisabolol preveniu a morte neuronal induzida por pMCAO, tanto

através da avaliação por cresil-violeta (córtex e estriado), quanto por fluoro jade (córtex). O

presente trabalho é o primeiro a demonstrar a ação neuroprotetora do α-bisabolol um alcool

sesquiterpeno em modelo de isquemia cerebral. Foi demonstrado que diterpenos, lipofílicos

derivados do extrato de Danshen (Miltiorrhiza radix salvia), como cryptotanshinone (CTs),

dihydrotanshinone I (DTSi), Tanshinona I (ETI), Tanshinona IIA (TsIIA) e Tanshinona IIB,

são capazes de preservar as células cresil positivas em modelo de isquemia cerebral

transitoria (PARK et al., 2012).

Achados morfológicos, histoquímicos e moleculares mostraram que a morte celular

induzida por hipoxia-isquemia, está relacionada principalmente com os processos de apoptose

e necrose (BANASIAK; HADDAD, 1998). Diversos autores têm demonstrado que produtos

naturais são eficazes em prevenir a apoptose induzida por isquemia. Apesar de não haver

estudos demonstrando a ação anti-apoptótica do α-bisabolol em neurônios, estudos com

huperzina A um composto do sesquiterpeno de ocorrência natural encontrado na Huperzia

serrata firmoss e em quantidades variáveis em outras espécies, incluindo H. huperzia, H.

carinat, e H. aqualupian têm demonstrado ação anti-apoptótica. Hemendinger et al. (2008),

utilizando, tanto a linhagem neuronal NSC34, quanto cultura organotípica de medula

espinhal, demonstraram que a administração da huperzina A teve ação protetora contra a

apoptose induzida por estaurosporina e por peróxido de hidrogênio (HEMENDINGER, et al.,

2008). Em cultura primária de neurônios hipocampais, a huperzina A preveniu a apoptose

induzida por privação de soro, por inibir a ativação da caspase-3 e a liberação do citocromo c

mitocondrial Zhou e Tang (2002).

A oclusão distal da pMCAO nos roedores afeta principalmente o córtex

somatosensorial e a parte motora do córtex lateral. No presente estudo, animais isquemiados

apresentaram infarto isquêmico cortical e estriatal. Os danos causados nessas áreas levam ao

comprometimento do desempenho sensório e motor em roedores, produzindo assim déficits

neurológicos (FRERET et al.,, 2009; BALKAYA et al., 2013). Para avaliarmos os déficits

neurológicos sensório-motores dos animais foi utilizada a escala de Garcia (GARCIA et al.,

1995) pela qual mostramos que 24 h após a lesão isquêmica os animais apresentam déficits

neurológicos significativos. Yang et al. (2015) demonstraram que após pMCAO, por inserção

do fio, em camundongos C657BL/6, os animais apresentavam déficits neurológicos

acentuados quando avaliados 12 h, 48 h ou 72 h após pMCAO. Corroborando com os

83

resultados do presente estudo. O tratamento com α-bisabolol na dose de 100, 200mg/kg

diminuiu significativamente a extensão da área de infarto e déficits neurológicos,

demostrando um efeito protetor deste composto no modelo de pMCAO.

Hyun-Joo et al. (2013) mostraram que o β-cariofileno, um sesquiterpeno biciclico

natural, pode reduzir o comprometimento cortical quando administrado antes da indução de

MCAO, com bloqueio por 2 horas e 24 horas de reperfusão, em camundongos. Esta ação

observada por b-cariofileno pode estar parcialmente relacionada com à redução de alguns

mediadores inflamatórios, como TNF-α já que no estudo comprova-se que o b-cariofileno não

protege a morte neuronal pela excitotoxicidade. Com o α-bisabolol não existem estudos em

modelos de isquemia, sendo o presente trabalho pioneiro. No entanto, já foi obsevado que o α-

bisabolol inibe a resposta inflamatória induzida por LPS em macrófagos (RAW264.7), cultura

de macrófagos, através da inativação de NF-kB (KIM et al., 2011). Provavelmente este

mecanismo pode estar atuando nos efeitos do α-bisabolol mostrado por nós.

O AVE causa alterações comportamentais. Os acometidos costumam apresentar

alterações locomotores (HACKE et al., 1996). Esse prejuízo motor está relacionado com

disfunção mesocorticoestriatal (KALIVAS et al., 1988). Neste estudo, a atividade locomotora

dos animais foi avaliada no teste de campo aberto, através da observação do número de

crossings (exploração horizontal) e do número de rearings (exploração vertical). Animais

induzidos à isquemia experimental geralmente apresentam déficits motores. A lesão

isquêmica focal apresenta-se principalmente no córtex e corpo estriado. Por conseguinte,

danos a essas áreas podem levar a uma redução da função motora (ZHANG, 2013).

No presente trabalho, os animais isquemiados apresentaram comprometimento motor

significativo tanto na exploração horizontal, quanto na exploração vertical. Esses resultados

são consistentes com os achados de Sheng (2010). No entanto, essa alteração não

comprometeu os animais a realizarem os testes de memória. O α-bisabolol na dose de 100 e

de 200 mg/kg preveniu os déficits locomotores. Esses resultados corroboram com os achados

de Kanhere et al. (2013) que mostraram que terpenóides isolados da Hygrophila auriculata

foram capazes de prevenir prejuízos locomotores em animais submetidos a isquemia cerebral

transitória global.

Pacientes que sobrevivem a AVE, geralmente, apresentam déficits de memória e de

aprendizado (TAHAMTAN et al., 2013). Neste estudo, a memória dos animais isquemiados

84

foi analisada através do teste de Y-maze (Labirinto em Y), esquiva passiva, labirinto aquático

de Morris e pelo teste de reconhecimento de objetos. O comportamento de alternações

espontâneas analisadas no labirinto em Y é utilizado como medida de memória de trabalho

(HUGHES, 1990). Esse teste é fundamentado na forte tendência que os animais apresentam

de explorar novos ambientes e nesse, são descartadas influências como artifícios

motivacionais por situações de recompensa ou emocionais por estímulos aversivos. Também,

esse teste proporciona uma dissociação entre aprendizagem e memória visto que não é

necessário aprender regras (DELLU et al., 1994).

O hipocampo e o córtex pré-frontal estão envolvidos neste tipo de memória. O córtex

pré-frontal anatomicamente está conectado ao hipocampo ventral e indiretamente ao

hipocampo dorsal através do tálamo (YOO et al., 2008). A exploração de um novo ambiente

nos animais depende da integridade de sistemas límbicos e não límbicos como prosencéfalo

basal, o hipocampo, o tálamo, o córtex pré-frontal, o corpo estriado dorsal, além do sistema

vestibular e cerebelo (LALOND, 2002).

O Y-maze foi realizado 72 horas após a indução de pMCAO onde se observou que os

animais isquemiados apresentaram déficits na memória de trabalho. Estes resultados são

consistentes com os achados de Zhou et al. (2014). O tratamento com o α-bisabolol na dose

de 200 mg/kg preveniu os animais isquemiados desses déficits. O caltapol, um monoterpeno,

preveniu gerbil contra os déficits na memória de trabalho após isquemia cerebral global

transitória. O seu efeito neuroprotetor se deu pela indução da atividade antioxidante endógena

e pela sua capacidade de reduzir a formação de NO (LI et al., 2004).

A esquiva passiva é um dos testes mais utilizados para avaliar a memória e o

aprendizado em animais (HUANG et al., 2011; PAKPOUR et al., 2010). Neste modelo, que

lida com a memória emocional envolvida com a memória de alerta, ansiedade ou adversidade

associada a um evento, o sistema límbico, do qual fazem parte, o hipocampo, amígdala, septo

medial, bulbo olfatório e áreas talâmicas anteriores estão envolvidos (BRIONI, 1993;

IZQUIERDO et al., 1993). Os modelos de isquemia cerebral através da oclusão da artéria

cerebral média produzem prejuízos na memória aversiva de camundongos (YAMAMOTO et

al., 1989; YONEMORI et al., 1999; HATTORI, 2000).

O α-bisabolol, nas doses de 100 e 200 mg/kg, preveniu o déficit de memória recente e

tardia no teste da esquiva passiva. Chen et al. (2014) mostraram recentemente que animais

85

submetidos à isquemia cerebral experimental e tratados com asiaticoside, um triterpeno

isolado a partir de Centella asiática (L.),apresentaram uma prevenção da memória recente e

tardia no teste de esquiva passiva. Ainda, terpenos isolados da espécie Abies koreana

previniram déficits na memória aversiva em animais induzidos a demência com escopolamina

e avaliados no teste de esquiva passiva (KIM et al., 2006).

No presente trabalho, a memória episódica foi avaliada através do teste de

reconhecimento de objectos, que se baseia na tendência natural dos animais para explorar

preferencialmente objetos novos (ENNACEUR, 1988). Esse é um teste robusto, muito

utilizado para avaliar algumas regiões do cérebro como hipocampo, córtex perirrinal

(WIN‐SHWE; FUJIMAKI; 2011). A tarefa do reconhecimento de objeto está intimamente

relacionada com o bom funcionamento do hipocampo e a codificação, consolidação,

recuperação da memoria por sua vez esta relacionada com o córtex perirrinal (WINTERS et

al., 2008).

No presente estudo os animais isquemiados apresentaram déficit na memória

episódica, que foi avaliada 96 h após a pMCAO. Esses resultados são consistentes com os de

Mcauliffe et al. (2009) que demostraram déficits na memória episódica (baixo desempenho no

reconhecimento do novo objeto) em camundongos submetidos à hipóxia/isquemia. O α-

bisabolol na dose de 200 mg/kg preveniu os animais isquemiados dos déficits na memória

episódica. Esses resultados corroboram com os de Sung et al. (2013). Eles observaram que a

administração do extrato da raiz de valeriana e ácido valerênico, ricos em terpenos,

melhoraram significativamente a memória episódica em animais no teste de reconhecimento

de objeto.

Em 1984, Morris descreveu o teste do labirinto aquático, que é considerado um

modelo robusto para avaliação de déficits na aprendizagem e na memória espacial, o qual

vem sendo muito utilizado em vários modelos de estudos sobre o AVE experimental

(MARKGRAF et al., 1994; MARKGRAF et al., 1992. MARKGRAF et al., 1997;

YONEMORI, 1999).

As referências externas a piscina, são fundamentais para formar uma percepção global

de localização que depende, principalmente, do hipocampo (MORRIS, 1984). Estudos

mostraram uma correlação significativa entre a aquisição na tarefa de Morris, com a extensão

da perda neuronal na região CA1 e CA2 do hipocampo (KEMPPAINENA, et al., 2014), onde

86

foi demostrado que camundongos com deficiência nos receptores NMDA na região CA1, tem

um desempenho prejudicado no labirinto aquático (TSIEN; HUERTA; TONEGAWA., 1996).

Porém, além do hipocampo, a memória espacial estudada através do teste do labirinto

aquático também depende de outras regiões cerebrais como o corpo estriado, assim como

demonstrado por Block, Kunkel e Schwarz (1993), onde a injeção estriatal de ácido

quinolínico induziu alterações no desempenho de ratos no labirinto aquático de plataforma

submersa (D’HOOGE; DE DEYNN, 2001). Um estudo recente mostrou que a isquemia

cerebral global/reperfusao provoca déficits de memória espacial em ratos quando comparado

com o grupo controle (LIANG et al., 2015).

Nosso trabalho mostrou que os animais isquemiados apresentaram déficit na memória

espacial e o tratamento com α-bisabolol preveniu esse efeito. Esses resultados são

consistentes com os de Wang et al. (2006); Lim et al. (2010) e Yang et al. (2013). Eles

demonstraram que a administração oral subcrônica de huperzine A, após a isquemia cerebral

transitória/reperfusão, preveniu os déficits na memória espacial avaliados no labirinto

aquático. A huperzina A, é um sesquiterpeno inibidor reversível e seletivo da

acetilcolinesterase (AChE) e tem sido utilizado no tratamento clínico da doença de Alzheimer

na China (XU et al., 1995; WANG et al., 2006) e isso poderia ser um possivél mecânismo de

acção do α-bisabolol.

Após uma lesão cerebral ou acidente vascular cerebral isquêmico, são observadas

algumas respostas neuroinflamatórias (LIESZ et al., 2011), onde a fase aguda inicia-se com a

morte neuronal por necrose e apoptose (RAGHUPATHI, 2004), que são processos

relacionados com uma resposta inflamatória rápida, envolvendo tanto a infiltração de células

imunes no sangue (neutrófilos, monócitos, leucócitos) (FAMAKIN, 2014) como também, a

ativação da micróglia. Este processo neuroinflamatório inicial pode ser tanto benéfico como

prejudicial, dependendo do subtipo e da distribuição temporal das células inflamatórias e do

espaço ao redor delas (KREUTZBERG, 1996; RAM HANSING et al., 2011; AGUZZI et al.,

2013; JEONG et al., 2013).

A mieloperoxidase (MPO), é uma enzima derivada da ativação dos neutrófilos e

monócitos e que possui atividade pró-inflamatória, possui, também, propriedades pró-

oxidativas (KOCH et al., 2014). Ela catalisa a formação de ácido hipocloroso a partir de

peróxido de hidrogênio na presença de íons cloreto, para formar o ácido hipocloroso (HClO),

87

uma espécie reativas de oxigênio potente (EROS) (BROWN; GANEY 1995; HAMPTON et

al. 1998; NIAN-SHENG et al., 2010).

Tu et al. (2010), demonstraram que 24 h após oclusão da artéria cerebral média nos

núcleos da base a MPO atinge o seu pico de atividade principalmente no corpo estriado e no

córtex. Recentemente, um estudo mostrou que a hipoxia-isquêmica neonatal leva a um

aumento na expressão da MPO no córtex cerebral (PIMENTEL et al., 2015).

No presente trabalho a dosagem da mieloperoxidase foi realizada 24 h após a indução

da pMCAO e foi observado um aumento da sua concentração no córtex temporal dos animais

isquemiados, em comparação com os animais falsos-operados, corroborando com os achados

de outro autor que verificou que a concentração de MPO permanece aumentada por mais

tempo no córtex do que no estriado, podendo ainda ser encontrada no córtex 120 horas após a

lesão (WANG et al., 2004). O tratamento com o α-bisabolol nas doses de 100 e de 200mg/kg,

foi capaz de reduzir a concentração da MPO no córtex cerebral. Rocha et al. (2011)

mostraram que o alfa-bisabolol (100 e 200mg/kg, por via oral) reduziu a concentração da

MPO em animais com lesões gástricas induzidas pelo etanol devido a sua atividade

antiinflamatória. Fernández et al. (2001) demonstraram que a aplicação tópica de lupeol, um

triterpeno, reduz significativamente a atividade da MPO e estimula a produção de PGE2 pelos

macrófagos.

O TNF-α, uma citocina pró-inflamatória, (CLAUSEN et al., 2008; WATTERS;

O'CONNOR, 2011; LAMBERTSEN et al., 2012; GÁLEA; BROUGH., 2013) é secretada

principalmente após a ativação dos macrófagos e desempenha uma importante função em

várias condições, tais como a inflamação, imunomodulação, citotoxicidade e apoptose

(AGGARWAL; NATARAJAN, 1996; TAYLOR et al., 2004). O TNF-α pode induzir a

produção de outros mediadores inflamatórios como a IL-1 e o ICAM-1 e, ainda, ativa o NF-

kB, aumentando assim o grau de lesão isquêmica (LE et al., 2000). Recentemente, um estudo

mostrou um aumento nos níveis do TNF- α no líquido cérebro espinhal, após a pMCAO (SHI

et al., 2015).Os nossos resultados mostraram que os animais isquemiados apresentaram um

aumento na imunoreatividade para TNF-α no córtex temporal e no estriado, e os animais

tratados com o α-bisabolol paresentaram uma redução significativa no córtex temporal. Rocha

et al. (2011) mostraram que o α-bisabolol foi capaz de diminuir os níveis do TNF-α no fluido

peritoneal de ratos com peritonite induzida por carragenina, mostrando assim, possuir

propriedade antiinflamatoria. Um outro estudo utilizando o modelo de pMCAO mostrou que

88

o Madecassoside, um triterpeno, reduz significativamente os níveis de citocinas pró-

inflamatórias (LUO et al., 2014).

Tu et al. (2014) mostraram em seus trabalhos que a isquemia cerebral pela pMCAO

promove o aumento nos níveis do iNOS no córtex e corpo estriado. Os nossos resultados

demonstraram um aumento da imunorreatividade para iNOS no córtex temporal e no corpo

estriado nos animais submetidos a pMCAO. O tratamento com o alfa-bisabolol (200mg/kg)

preveniu os animais dessa imunoreatividade. Um estudo recente demonstrou que o álcool

perílico, um monoterpeno encontrado em óleos essenciais, como hortelã (Mentha spicata),

cerejas (Prunus avium L.) frutas cítricas, diminui os níveis do iNOS causado pela MCAO in

vivo (TABASSUM et al., 2014). Tendo em conta que o modelo de isquemia focal utilizado

resulta em infarto principalmente no córtex, caudado e putamen (LIPTON, 1999), os nossos

resultados sugerem que o efeito neuroprotetor do alfa-bisabolol pode estar relacionado, pelo

menos em parte, a diminuição da resposta inflamatória, com diminuição da infiltração de

neutrófilos e ativação microgrial.

A micróglia é uma célula do sistema imunológico presente no SNC, que é ativada

rapidamente em resposta a uma lesão cerebral ou em processos neurodegenerativos, e

sintetizam algumas citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento, espécies reativas de

oxigênio, óxido nítrico, e glutamato. A ativação da micróglia é considerada um processo

crucial para a defesa do hospedeiro, mas a ativação em excesso pode provocar consequências

deletérias e neurotóxicas (FUMAGALLI et al., 2013; LUHESHI et al., 2011; YANG et al.,

2014). Assim, o desenvolvimento de agentes que reduzem a ativação da micróglia no cérebro

e inibam a liberação de citocinas pró-inflamatórias é considerado uma estratégia terapêutica

importante para AVC isquêmico.

Embora o papel da astrogliose após um evento isquêmico continua a ser uma questão

de debate (BARRETO et al., 2011), várias correlações positivas entre a astrogliose e o

tamanho da área de infarto tem sido mostrado em diversos estudos que envolvem os processos

da lesão isquêmica através da liberação e expressão de citocinas pró-inflamatórias

(BUCHHOLDET et al., 2007; CHU et al., 2012; MAO et al., 2012; XUAN et al., 2012).

Os resultados obtidos no nosso trabalho mostraram que os animais isquemiados

apresentaram aumento da expressão de GFAP, um marcador de astrócito ativado,

(ANDEROVA et al., 2011; LANGDON et al., 2008; PANICKAR; NORENBERG, 2005;

89

SIMAO et al., 2012; TULSULKAR; SHAH, 2013) no córtex temporal e no corpo estriado 5

dias após pMCAO, corroborando com alguns autores que observaram que o número de

células GFAP-positivas (astrogliose) estava aumentado no córtex 4 dias após isquemia

cerebral focal permanente (NAKASE et al., 2003) e na penumbra isquêmica 24 h, e 3, 7 e 14

dias após a isquemia cerebral focal transitória (WANG et al., 2008; ZHANG et al., 2013) e

também foi observado um aumento da ativação dos astrócitos no hipocampo em modelo de

isquemia global transitória (KIM et al., 2011). O tratamento com α-bisabolol na dose de 200

mg/kg diminuiu a astrogliose no córtex e corpo estriado 5 dias após a pMCAO. Um estudo

recente mostrou que o D9- tetra-hidrocanabinol, um terpenoide possuem a capacidade de

inibir o aumento da expressão de GFAP em modelos de danos cerebral (CASTELLI et al.,

2014). Um outro estudo mostrou que a luteína, uma substancia pertencente a classe dos

terpenos, foi capaz de inibir a expressão do GFAP retinal em modelo de isquemia e

reperfusão (LI et al., 2012).

Após um evento isquêmico é verificado que ocorre a produção de radicais de oxigênio

que danificam os tecidos e inicia uma cascata de eventos celulares deletérios como a

inflamação, morte celular, e por fim levar a falência do órgão (FONDEVILA et al., 2003).

Em condições fisiológicas, os efeitos tóxicos das espécies reativas de oxigênio podem ser

prevenidos por algumas enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase (SOD), glutationa

peroxidase (GPx) e catalase, e também por outros antioxidantes não enzimáticos. Um excesso

na produção desses radicais, leva ao estresse oxidativo, que pode ter um efeito deletério na

função e integridade estrutural de tecidos biológicos (SILVA et al., 2002).

Sabe-se que o α-bisabolol é um potente antioxidante. Vinholes et al. (2013) e Rocha et

al. (2011) relataram a sua ação nos modelos de inflamação e de nocicepção em ratos. O

estresse oxidativo é melhor observado no modelo de isquemia/ reperfusão devido a um grande

aumento na produção de radicais de oxigênio após a reperfusão, não sendo tão perceptível no

modelo de isquemia cerebral focal permanente utilizado neste trabalho, por isso não foi

realizada nenhuma avaliação para investigar o efeito do estresse oxidativo neste trabalho.

Entretanto, não deve-se descartar o efeito antioxidante do α-bisabolol como mecanismo de

neuroproteção.

Neste trabalho, foi demonstrado que camundongos submetidos à isquemia focal

permanente apresentaram déficits na memória devido á lesões nas áreas envolvidas com os

tipos de memória avaliados no modelo de isquemia utilizado, principalmente no estriado e

90

córtex e demonstrou-se também, pela primeira vez, o efeito neuroprotetor do α-bisabolol

administrado por via oral sobre os déficits de memória induzidos por este modelo, porém o

mecanismo pelo qual o mesmo exerce seu efeito ainda não está totalmente esclarecido

podendo ser em parte devido ao seu efeito antiinflamatório, como demostrado neste trabalho.

Desde modo, é importante a continuidade dos estudos para que se possa revelar o

mecanismo, ou mais de um mecanismo, pelo qual o α-bisabolol exerce esse efeito. Este

composto apresenta potencial como um possível adjuvante no tratamento do AVC,

melhorando, possivelmente, não só aspectos inflamatórios neurodegenerativos mas também

cognitivos dos pacientes. É uma substância que pode ser testada em humanos, pois possui

baixa toxicidade e é amplamente distribuída em vegetais. Desta forma, o α-bisabolol pode

tornar-se uma nova ferramenta farmacológica, pela sua propriedade anti-inflamatório e por

sua capacidade proteger o dano neuronal.

91

7 CONCLUSÃO

No presente estudo foi demonstrado que o sesquiterpeno α-bisabolol em animais

isquemiados, preveniu da morte neuronal, diminuindo os déficits neurológicos, a área de

infarto isquêmico, preveniu os déficits na memória de trabalho e na memória aversiva,

diminuiu os eventos inflamatórios induzidos pela lesão isquêmica, por diminuir a atividade da

MPO no córtex temporal, da imunoreatividade para TNF-α, iNOS e GFAP no córtex temporal

e corpo estriado de animais submetidos a pMCAO.

Esses resultados demonstraram que o sesquiterpeno α-bisabolol: possui ação

neuroprotetora, e que pelo menos em parte, esta ação pode ser atribuída a sua atividade anti-

inflamatória.

92

REFERÊNCIAS

AHMAD, A. S.; ANSARI, M. A.; AHMAD, M.; SALEEM, S.; YOUSUF, S.; HODA, M. N.;

ISLAM, F. Neuroprotection by crocetin in a hemi-parkinsonian rat model. Pharmacol.

Biochem. Behav., v. 81, p. 805–813, 2005.

AHMAD, A.; KHAN, A.; AKHTAR, F.; YOUSUF S.; XESS I.; KHAN LA.; MANZOOR N.

“Fungicidal activity of thymol and carvacrol by disrupting ergosterol biosynthesis and

membrane integrity against Candida”. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., v. 30, n. 1, p.

41–50, 2011.

ALVAREZ-BUYLLA, A.; LING, C. Y.; KIRN, J. R. Cresyl violet: a red fluorescent Nissl

stain. J. Neurosci. Methods, v. 33, p.129-133, 1990.

ANDERSON, S. E.; DICKINSON, C. Z.; LIU, H.; CALA, P. M. Effects of Na-K-2Cl

cotransport inhibition on myocardial Na and Ca during ischemia and reperfusion. Am. J.

Physiol. Cell Physiol., v. 270, p. C608–C618, 1996.

BALTALARLI, A.; OZCAN, V.; BIR F.; AYBEK H.; SACAR M.; ONEM G.; GOKSIN I.;

DEMIR S.; TEKE Z. Ascorbic acid (vitamin C) and ilioprost attenuate the lung injury caused

by ischemia/reperfusion of the lower extremities of rats. Ann. Vasc. Surg., v. 20, p. 49, 2006.

BANASIAK, K. J.; HADDAD, G. G. Hypoxia-induced apoptosis: effect of hypoxic severity

and role of p53 in neuronal cell death. Brain Res, p. 797, v.295–304, 1998.

BANG, O. Y.; SAVER, J. L.; KIM, S. J.; KIM, G. M.; CHUNG, C. S.; OVBIAGELE B.;

LEE KH.; LIEBESKIND DS. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for

acute ischemic stroke. Stroke, v. 42, n. 3, p. 693–699, 2011.

BANG, O.Y.; SAVER, J. L.; BUCK, B. H.; ALGER, J.R.; STARKMAN, S.; OVBIAGELE,

B., et al. Impact of collateral flow on tissue fate in acute ischaemic stroke. J. Neurol.

Neurosurg. Psychiatry, v. 79, n. 6, p. 625–629, 2008.

BARTHA, R.; LEE, T. Y.; HOGAN, M. J.; HUGHES, S.; BARBERI, E.; RAJAKUMAR, N.;

MENON RS. Sodium T2*- weighted MR imaging of acute focal cerebral ischemia in rabbits.

Magn Reson Imaging, v.22, p. 983–991, 2004.

BARTUS, R. T.; DEAN, R. L.; CAVANAUGH, K.; EVELETH, D.; CARRIERO, D. L.;

LYNCH, G. Time-related neuronal changes following middle cerebral artery occlusion:

implications for therapeutic intervention and the role of calpain. J Cereb Blood Flow Metab,

v. 15, p.969-79, 1995.

BERETTA, S.; RIVA, M.; CARONE, D.; CUCCIONE, E.; PADOVANO, G.; RODRIGUEZ,

M. V.; PAPPADÁ GB.; VERSACE A.; GIUSSANI C.; SQANZERLA EP, FERRARESE C.

Optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal

middle cerebral artery occlusion. J. Vis. Exp, v. 17, n. 72, p. 1-7, 2013.

93

BIRK, A. V.; LIU, S.; SOONG, Y.; MILLS, W.; SINGH, P.; WARREN, J. D.; SESHAN, S.

V.; PARDEE, J. D.; SZETO, H. H. The mitochondrial-targeted compound SS-31 re-energizes

ischemic mitochondria by interacting with cardiolipin. J. Am. Soc. Nephrol., v. 24, p. 1250–

1261, 2013.

BOADA, F. E.; QIAN, Y.; NEMOTO, E.; JOVIN, T.; JUNGREIS, C.; JONES, S. C.;

WEIMER J.; LEE V. Sodium MRI and the assessment of irreversible tissue damage during

hyper-acute stroke. Transl. Stroke Res., v.3, p. 236–245, 2012.

BOUVIER, F.; RAHIER, A.; CAMARA, B. Biogenesis, molecular regulation and function of

plant isoprenoids. Progr. Lipid Res., v. 44, p. 357–429, 2005.

BREHM-STECHER, B. F. AND JOHNSON, E. A. Sensitization of Staphylococcus aureus

and Escherichia coli to antibiotics by the sesquiterpenoids nerolidol, farnesol, bisabolol, and

apritone. Antimicrob. Agents Chemother., v. 47, n. 10, p. 3357–3360, 2003.

BROUGHTON, B. R.; REUTENS, D. C.; SOBEY, C. G. Apoptotic mechanisms after

cerebral ischemia. Stroke, v. 40, n.5, p.331–339, 2009.

BROUNS, R.; DE DEYNA, P. P. The complexity of neurobiological processes in acute

ischemic stroke. Clin. Neurol. Neurosurg., v. 111, p. 483–495, 2009.

CAVALIERI, E.; MARIOTTO, S.; FABRIZI, C.; CARCERERI, A.; GOTTARDO, R.;

LEONE, S.; BERRA, L.V.; LAURO, G. M.; CIAMPA, A. R.; SUZUKI, H. α-Bisabolol, a

nontoxic natural compound, strongly induces apoptosis in glioma cells. Biochem. Biophys.

Res. Commun., v. 315, p. 589–594, 2004.

CHAN, P. H. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain. J.

Cereb. Blood Flow Metab., v. 21, p.2–14, 2001.

CHUN, H. S.; CHANG, H. J.; CHOI, E. H.; KIM, H. J.; KU, K. H. Molecular and absorption

properties of 12 soy isoflavones and their structure–activity relationship with selected

biological activities. Biotechnol. Lett., v. 27, p. 1105–1111, 2005.

CHUN, H. S.; KIM, J. M.; CHOI, E. H.; CHANG, N. Neuroprotective effects of several

korean medicinal plants traditionally used for stroke remedy. J. Med. Food, v. 11, p.246-251,

2008.

COLBOURNE, F.; LI, H.; BUCHAN, A. M.; CLEMENS, J. A. Continuing postischemic

neuronal death in CA1: influence of ischemia duration and cytoprotective doses of NBQX and

SNX-111 in rats. Stroke, v. 30, p.662-668, 1999.

COLLINGRIDGE, G. L.; KEHL, S. J.; MCLENNAN, H. The antagonism of amino acid-

induced excitations of rat hippocampal CA1 neurones in vitro. J. Physiol., v. 334, p.19-31,

1983.

DAMODARAN, T.; HASSAN, Z. B.; NAVARATNAM, V.; MUZAIMI, M.; NG, G.;

MÜLLER, C. P.; LIAO, P.; DRINGENBERG, H. C.Time course of motor and cognitive

94

functions after chronic cerebral ischemia in rats. Behav. Brain Res., v. 275, p. 252-258,

2014.

DANTON, G. H.; DIETRICH, W.D. Inflammatory mechanisms after ischemia and stroke. J

Neuropathol. Exp. Neurol., v. 62, p.127–136, 2003.

DARRA, E.; ABDEL-AZEIMB, S.; MANARA, A.; SHOJI, K.; MARECHAL, J.D.;

MARIOTTO, S.; CAVALIERI E, PERBELLINI, L.; PIZZA, C.; PERAHIA, D.; CRIMI, M.;

SUZUKI, H. Insight into the apoptosis-inducing action of alpha-bisabolol towards malignant

tumor cells: involvement. Arch. Biochem. Biophys., v. 476, p.113–123, 2008.

DAVALOS, A.; SHUAIB, A.; WAHLGREN, N. G. Neurotransmitters and pathophysiology

of stroke: evidence for the release of glutamate and other transmitters/mediators in animals

and humans. J. Stroke Cerebrovasc. Dis., v. 9, n.6, p.2-8, 2000.

DE SIQUEIRA, RJB.; FREIRE, W. B. S.; VASCONCELOS-SILVA, A. A.; FONSECA-

MAGALHÃES, P. A.; LIMA, F.J.B.; BRITO, T. S.; MOURÃO. L. T. C.; RIBEIRO, R. A.;

LAHLOU, S.; MAGALHÃES, P. J. C. In-vitro characterization of the pharmacological

effects induced by (−)-α-bisabolol in rat smooth muscle preparations. Can. J. Physiol.

Pharmacol., v.90, p.23–35, 2012.

DEFEUDIS, F.V. Bilobalide and neuroprotection. Pharmacol. Res., v. 46, p. 565–568, 2002.

DEVRIES, A. C.; NELSON, R. J.; TRAYSTMAN, R. J.; HURN, P. D. Cognitive and

behavioral assessment in experimental stroke research: will it prove useful? Neurosci.

Biobehav. Rev., v. 25, p. 325-342, 2001.

D'HOOGE, R.; DE DEYN, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of

learning and memory. Brain Res. Brain Res. Rev., v. 36, p. 60-90, 2001.

DOBREK, L.; THOR, P. Glutamate NMDA receptors in pathophysiology and

pharmacotherapy of selected nervous system diseases. Postepy Hig. Med. Dosw, v.65, p.

338-346, 2011.

DOYLE, K. P.; SIMON, R. P.; STENZEL-POORE, M. P. Mechanisms of ischemic brain

damage. Neuropharmacology, v.55, p. 310–318, 2008.

ENNACEUR, A.; DELACOUR, J. A new one-trial test for neurobiological studies of

memory in rats. Behav. Brain Res., v. 31, p. 47-59, 1988.

ERMAN, W. E. Chemistry of the monoterpenes: an encyclopedic handbook. New York:

Marcel Dekker, 1985.

ESNEAULT, E.; CASTAQNE, V.; MOSER, P.; BONNY, C.; BERNAUDIN, M. D-JNKi, a

peptide inhibitor of c-Jun N-terminal kinase, promotes functional recovery after transient

focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience, v. 152, p. 308-320, 2008.

ESPOSITO, E.; ROTILIO, D.; DI MATTEO, V.; DI GIULIO, C.; CACCHIO, M.; ALGERI,

S. A review of specific dietary antioxidants and the effects on biochemical mechanisms

related to neurodegenerative processes. Neurobiol. Aging, v. 23, p.719-735, 2002.

95

FEDERICO, A.; CARDAIOLI, E.; DA POZZO, P.; FORMICHI, P.; GALLUS, G.N.; RADI,

E. Mitochondria, oxidative stress and neurodegeneration. J. Neurol. Sci., v. 322, p. 254–262,

2012.

FEIGIN, V. L.; LAWES, C. M.; BENNETT, D. A.; BARKER-COLLO, S. L.; PARAG, V.

Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a

systematic review. Lancet Neurol., v.8, n. 4, p. 355-369, 2009.

FERRO, J. M.; VERDELHO, A. Epidemiologia, fatores de risco e prevenção primária do

AVC. Pathos, p. 7-15, 2000.

FLOYD, R. A. Role of oxygen free radicals in carcinogenesis and brain ischemia. FASEBJ,

v. 4, p.2587–2597, 1990.

FOLSOM, A. R.; ROSAMOND, W. D.; SHAHAR, E.; COOPER LS.; ALEKSIC N.; NIETO

FJ.; RASMUSSEN ML.; WU KK. Prospective study of markers of hemostatic function with

risk of ischemic stroke. The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study

Investigators. Circulation, v.100, p.736-742, 1999.

FRANTSEVA, M. V.; CARLEN, P. L.; PEREZVELAZQUEZ, J. L. Dynamics of

intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramida lneurons. Free

Radic. Biol. Med, v. 31, p. 1216–1227, 2001.

FREI, B.; ENGLAND, L.; AMES, B. N. Ascorbate is an outstanding antioxidant in human

blood plasma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 86, p. 6377–6381, 1989.

FRERET, T.; BOUET, V.; LECONTE, C. Behavioral Deficits After Distal Focal Cerebral

Ischemia in Mice: Usefulness of Adhesive Removal Test. Behav. Neurosci., v. 123, n. 1, p.

224-230, 2009.

FUMAGALLI, S.; PEREGO, C.; ORTOLANO, F.; DE SIMONI, M. G. CX3CR1 deficiency

induces an early protective inflammatory environment in ischemic mice. Glia, v. 61, p. 827–

842, 2013.

GANDHI, S.; ABRAMOV, A.Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid.

Med. Cell. Longev, v. 2012, p. 1-11, 2012.

GARCIA, J. G. Neurological Deficit and Extent of Neuronal Necrosis Attributable to Middle

Cerebral Artery Occlusion in Rats. Stroke, v. 26, p. 627-635, 1995.

GARRITANO, C. R.; LUZ, P. M.; PIRES, M. L. E.; BARBOSA, M. T. S.; BATISTA, K. M.

Análise da tendência da mortalidade por Acidente Vascular Cerebral no Brasil no século XXI.

Arq. Bras. Cardiol., v. 98, n. 6, p. 519-527, 2012.

GOLDLUST, E. J.; PACZYNSKI, R. P.; HE, Y. Y.; HSU, C. Y.; GOLDBERG, M. P.

Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-

stained rat brains. Stroke, v. 27, p. 1657–1662, 1996.

GONÇALVES, O.; PEREIRA, R.; GONÇALVES, F.; MENDO, S.; COIMBRA, M. A.;

ROCHA, S. M. Evaluation of the mutagenicity of sesquiterpenic compounds and their

96

influence on the susceptibility towards antibiotics of two clinically relevant bacterial strains.

Mut. Res., v. 723, p. 18–25, 2011.

GOTTLIEB, M.; WANG, Y.; TEICHBERG, V. I. Blood-mediated scavenging of

cerebrospinal fluid glutamate. J. Neurochem., v. 87, p. 119-126, 2003.

GRIFFIN, S. G.; WYLLIE, S. G.; MARKHAM, J. L.; LEACH, D. N. The role of structure

and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity. Flavour

and Fragrance Journal, v. 14, p. 322–332,1999.

GRODNITZKY, J. A.; COATS, J. R. QSAR evaluation of monoterpenoids' insecticidal

activity. J. Agric. Food Chem., v. 50, p. 4576–4580, 2002.

GU, Q.; SCHMUED, L. C.; SARKAR, S.; PAULE, M. G.; RAYMICK, B. Onestep labeling

of degenerative neurons in unfixed brain tissue samples using Fluoro-Jade C. J. Neurosci.

Methods, v. 208, p. 40–43, 2012.

GUO, C.; TONG, L.; XI, M.; YANG, H.; DONG, H.; WEN, A. Neuroprotective effect of

calycosin on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats. J. Ethnopharmacol., v. 144,

p.768–774, 2012.

GUO, X.; MENG, Q.; LIU, Q.; WANG C.; SUN H PENQ J.; MA X.; KAKU T.; LIU K.

JBP485 improves gentamicininduced acute renal failure by regulating the expression and

function of Oat1 and Oat3 in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., v. 271, n. 2, p. 285–295, 2013.

HACKE W, DONNAN G.; FIESCHI C.; KASTE M.; VON KUMMER R.; BRODERICK

JP, BROTT T.; FRANKEL M.; GROTTA JC.; HALEY EC JR.; KWIATKOWSKI

T.; LEVINE SR, LEWANDOWSKI C.LU M, LYDEN P, MARLER JR.; PATEL S.; TILLEY

BC.; ALBERS G, BLUHMKI E.; WILHELM M.; HAMILTON S; ATLANTIS TRIALS

INVESTIGATORS; ECASS TRIALS INVESTIGATORS; NINDS RT-PA STUDY GROUP

INVESTIGATORS. Association of outcome with early stroke treatment: pooled analysis of

ATLANTIS, ECASS and NINDS rt-PA stroke trials. Lancet, v. 363, p. 768 – 774, 2004.

HAN, Y. Ginkgo terpene component has an anti-inflammatory effect on Candida albicans-

caused arthritic inflammation. Int. Immunopharmacol., v. 5, p. 1049–1056, 2005.

HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, v. 144,

p. 646–674, 2011.

HATTORI, K.; LEE, H.; HURN, P. D.; CRAIN, B. J.; TRAYSTMAN, R. J.; DEVRIES, A.

C. Cognitive deficits after focal cerebral ischemia in mice. Stroke, v. 31, p. 1939-1944, 2000.

HERMENS, J. Prediction of environmental toxicity based on structure–activity relationships

using mechanistic information. Sci. Total Environ., v. 171, p. 235–242, 1995.

HERNANDEZ-CERUELOS, A.; MADRIGAL-BUJAIDAR, E.; DE LA CRUZ, C. Inhibitory

effect of chamomile essential oil on the sister chromatid exchanges induced by daunorubicin

and methyl methanesulfonate in mouse bone marrow. Toxicol. Lett., v. 135, n. 1-2, p. 103–

110, 2002.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hacke%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Donnan%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fieschi%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kaste%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=von%20Kummer%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Broderick%20JP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Broderick%20JP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brott%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Frankel%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Grotta%20JC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Haley%20EC%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwiatkowski%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwiatkowski%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Levine%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lewandowski%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lu%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lyden%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marler%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Patel%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tilley%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tilley%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Albers%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bluhmki%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilhelm%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hamilton%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15016487

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ATLANTIS%20Trials%20Investigators%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ATLANTIS%20Trials%20Investigators%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ECASS%20Trials%20Investigators%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=NINDS%20rt-PA%20Study%20Group%20Investigators%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=NINDS%20rt-PA%20Study%20Group%20Investigators%5BCorporate%20Author%5D

97

HOSSMANN, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia

Neuropathol., v. 47, n. 3, p. 213-227, 2009.

HOSSMANN, K. A. Pathophysiology and Therapy of Experimental Stroke. Cell. Mol.

Neurobiol., v. 26, p. 7-8, 2006.

HSIAO, G.; FONG, T. H.; TZU, N. H.; LIN, K. H.; CHOU, D. S.; SHEU, J. R. A potent

antioxidant, lycopene, affords neuroprotection against microglia activation and focal cerebral

ischemia in rats. In Vivo, v. 18, p. 351–356, 2004.

HUGHES, R. N. Phylogenetic comparisons. In: DENBER, W. N.; RICHMAN, L. L. (Ed.).

Spontaneous Alternation Behavior. New York: Springer Verlag, 1990. p. 39–59.

IZQUIERDO, I.; DA CUNHA, C.; ROSAT, R.; JERUSALINSKY, D.; FERREIRA, M. B.

C.; MEDINA, J. H. Neurotransmitter receptors involved in memory processing by the

amygdala, medial septum and hippocampus of rats. Behav. Neural Biol., v. 58, p. 16–25,

1992.

IZQUIERDO, I.; MEDINA, J. H. Memory Formation: The Sequence of Biochemical Events

in the Hippocampus and Its Connection to Activity in Other Brain Structures. Neurobiol.

Learning Memory, v. 68, p. 285–316, 1997.

JACKSON, S. J.; DIEMEL, L. T.; PRYCE, G.; BAKER, D. Cannabinoids and

neuroprotection in CNS inflammatory disease. J. Neurol. Sci., v. 233, p. 21–25, 2005.

JACOBSON, M. D.; WEIL, M.; RAFF, M. C. Programmed cell death in animal development.

Cell, v. 88, p. 347–354, 1997.

JONES, S. C.; KHARLAMOV, A.; YANOVSKI, B.; KIM, D. K,.; EASLEY, K. A.;

YUSHMANOV, V. E., et al. Stroke onset time using sodium MRI in rat focal cerebral

ischemia. Stroke, p. 37, v. 883–888, 2006.

KAMATOU, G. P. P.; VILJOEN, A. M. A review of the application and pharmacological

properties of α-bisabolol and α-bisabolol-rich oils. J. Am. Oil Chem. Soc., p. 87, v.1–7,

2010.

KANNEL, W. B. Blood pressure as a cardiovascular risk factor: prevention and treatment.

JAMA, v. 275, p. 1571-1576, 1996.

KHAYYAL, M. T.; EL-GHAZALY, M. A.; KENAWY, S,A.; SEIF-EL-NASR, M.;

MAHRAN, L. G.; KAFAFI, Y. A.; OKPANYI, S.N. Antiulcerogenic effect of some

gastrointestinally acting plant extractsand their combination. Arzneimittelforschung, v. 51,

p. 545–553, 2001.

KIM, D.H.; JEON, S. J.; SON, K. H.; JUNQ, J. W.; LEE, S.; YOON, B. H.; CHOI, J. W.;

CHEONG, J. H.; KO, K. H.; RYU, J. H. Effect of the flavonoid, oroxylin A, on transient

cerebral hypoperfusion induced memory impairment in mice. Pharmacol. Biochem. Behav.,

v. 85, p. 658–668, 2006.

98

KIM, J.M.; KIM, S.; KIM, D. H.; LEE, C. H.; PARK, S. J.; JUNG, J. W.; KO, K. H.;

CHEONG, J. H.; LEE, S. H.; RYU, J. H. Neuroprotective effect of forsythiaside against

transient cerebral global ischemia in gerbil. Eur. J. Pharmacol., v. 660, p. 326–333, 2011.

KIRINO, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain

Res., v. 239, p. 57–69, 1982.

KIRINO, T. Delayed neuronal death. Neuropathology, v. 20, Suppl., p.S95–S97, 1982.

KOCH, C.; HENRICH, M.; HEIDT, M. C. Sequential analysis of myeloperoxidase for

prediction of adverse events after suspected acute coronary ischemia. Clin. Cardiol., v. 37, n.

12, p. 744-749, 2014.

KOUROUNAKIS, A. P.; REKKA, E. A.; KOUROUNAKIS, P. N. Antioxidant activity of

guaiazulene and protection against paracetamol hepatotoxicity in rats. J. Pharm.

Pharmacol., v. 49, p. 938–942, 1997a.

KOUROUNAKIS, A. P.; REKKA, E. A.; KOUROUNAKIS, P. N. Effect of guaiazulene on

some cytochrome P450 activities. Implication in the metabolic activation and hepatotoxicity

of paracetamol. Arch. der Pharmazie, v. 330, p. 7–11, 1997b.

LA ROCCA G, DI STEFANO A, ELEUTERI E, ANZALONE R, MAGNO F, CORRAO

S, LORIA T, MARTORANA A, DI GANGI C, COLOMBO M, SANSONE F, PATANÈ

F, FARINA F, RINALDI M, CAPPELLO F, GIANNUZZI P, ZUMMO G.Oxidative stress

induces myeloperoxidase expression in endocardial endothelial cells from patients with

chronic heart failure. Basic Res. Cardiol., v.104, p. 307–320, 2009.

LALOND, R. The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neurosci. Behav. Rev.,

v. 26, p. 91-104, 2002.

LAMBERTSEN, K. L.; BIBER, K.; FINSEN, B. Inflammatory cytokines in experimental and

human stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 32, p. 1677–1698, 2012.

LASTRES-BECKER, I.; MOLINA-HOLGADO, F.; RAMOS, J. A.; MECHOULAM, R.;

FERNÁNDEZ-RUIZ, J. Cannabinoids provide neuroprotection against 6-hydroxydopamine

toxicity in vivo and in vitro: relevance to Parkinson's disease. Neurobiol. Dis., v.19, p. 96–

107, 2005.

LAVERDE, G. C.; JUNGREIS, C. A.; NEMOTO, E.; BOADA, F. E. Sodium time course

using 23Na MRI in reversible focal brain ischemia in the monkey. J. Magn. Reson. Imaging,

v. 30, p. 219–223, 2011.

LEE CH, MOON SM, YOO KY, CHOI JH, PARK OK, HWANG IK, SOHN Y, MOON

JB, CHO JH, WON MH. Long-term changes in neuronal degeneration and microglial

activation in the hippocampal CA1 region after experimental transient cerebral ischemic

damage. Brain Res., v. 1342, p.138-149, 2010.

LEE, E. J.; CHEN, H. Y.; WU, T. S.; CHEN, T. Y.; AYOUB, I. A.; MAYNARD, K. I. Acute

Administration of Ginkgo biloba Extract (EGb 761) Affords Neuroprotection Against

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=La%20Rocca%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Di%20Stefano%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eleuteri%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Anzalone%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Magno%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Corrao%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Corrao%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Loria%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Martorana%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Di%20Gangi%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Colombo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sansone%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Patan%C3%A8%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Patan%C3%A8%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Farina%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rinaldi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cappello%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Giannuzzi%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zummo%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19030913

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20CH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moon%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yoo%20KY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Choi%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20OK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hwang%20IK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sohn%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moon%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moon%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cho%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Won%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20423705

99

Permanent and Transient Focal Cerebral Ischemia in Sprague-Dawley Rats. J. Neurosci.

Res., v. 68, p. 636–645, 2002.

LEE, H. J.; CHO, H. S.; PARK, E.; KIM, S.; LEE, S. Y.; KIM, C. S.; KIM, D. O. K.; KIM, S.

J,. CHUN, H. S. Rosmarinic acid protects human dopaminergic neuronal cells against

hydrogen peroxide-induced apoptosis. Toxicology, v. 250, p. 109–115, 2008.

LEE, J.; JUNG, E.; KIM, Y.; LEE, J.; PARK, J.; HONG, S.; HYUN, C. G.; PARK, D.; KIM,

Y. S. Rosmarinic acid as a downstream inhibitor of IKK-b in TNF-a-induced upregulation of

CCL11 and CCR3. Br. J. Pharmacol., v. 148, p. 366–375, 2006.

LEGA, B. C.; JACOBS, J.; KAHANA, M. Human hippocampal theta oscillations and the

formation of episodic memories. Hippocampus, v. 22, p. 748–746, 2012.

LEO, A.; HANSCH, C.; JOW, P. Y. C. Dependence of hydrophobicity of apolar molecules on

their molecular volume. J. Med. Chem., v.19, p. 611–615, 1976.

LI, D. Q.; DUAN, Y. L.; BAO, Y. M.; LIU, C. P.; LIU, Y.; AN, L. J. Neuroprotection of

catalpol in transient global ischemia in gerbils. Neurosci. Res., v. 50, p. 169–177, 2004.

LI, X.; YU, C.; LU, Y.; GU, Y.; LU, J.; XU, W.; XUAN, L.; WANG, Y. Pharmacokinetics,

Tissue Distribution, Metabolism, and Excretion of Depside Salts from Salvia miltiorrhiza in

Rats. Drug Metab. Disposition, v. 35, n. 2, p. 234-239, 2007.

LI YW, ZHANG Y, ZHANG L, LI X, YU JB, ZHANG HT, TAN BB, JIANG LH, WANG

YX, LIANG Y, ZHANG XS, WANG WS, LIU HG. Protective effect of tea polyphenols on

renal ischemia/reperfusion injury via suppressing the activation of TLR4/NF-κB p65 signal

pathway. Gene, v. 542, p. 46–51, 2014.

LIM CS, JIN DQ, MOK H, OH SJ, LEE JU, HWANG JK, HA I, HAN JS. Antioxidant and

antiinflammatory activities of xanthorrhizol in hippocampal neurons and primary cultured

microglia. J. Neurosci. Res., v. 82, p. 831–838, 2005.

LIPTON, P. Ischemic Cell Death in Brain Neurons. Physiol Rev., v. 79, p. 1431-1568, 1999.

LIU, S.; SOONG, Y.; SESHAN, S. V.; SZETO, H. H. Novel cardiolipin therapeutic protects

endothelial mitochondria during renal ischemia and mitigates microvascular rarefaction,

inflammation, and fibrosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol., v. 306, p. F970–F980, 2014.

LOGANI, S.; CHEN, M. C.; TRAN, T.; LE, T.; RAFFA, R. B. Actions of Ginkgo Biloba

related to potential utility for the treatment of conditions involving cerebral hypoxia. Life

Sci., v. 67, p. 1389–1396, 2000.

LORÍA-CERVERA EN, SOSA-BIBIANO EI, VILLANUEVA-LIZAMA LE, VAN

WYNSBERGHE NR, CANTO-LARA SB, BATÚN-CUTZ JL, ANDRADE-NARVÁEZ FJ. Nitric oxide production by Peromyscus yucatanicus (Rodentia) infected with Leishmania

(Leishmania) mexicana. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 108, n. 2, p. 172–177, 2013.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20YW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yu%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20HT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tan%20BB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20LH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20YX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20YX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20XS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20WS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20HG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24630969

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lim%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jin%20DQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mok%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oh%20SJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20JU%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hwang%20JK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ha%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Han%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16273545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lor%C3%ADa-Cervera%20EN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sosa-Bibiano%20EI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Villanueva-Lizama%20LE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Van%20Wynsberghe%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Van%20Wynsberghe%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Canto-Lara%20SB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bat%C3%BAn-Cutz%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andrade-Narv%C3%A1ez%20FJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23579796

100

LOTUFO, P. A. Stroke in Brazil: a neglected disease. São Paulo Med J., v. 123, n. 1, p. 3-4,

2005.

LOVE, S. Apoptosis and brain ischemia. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry,

v. 27, p. 267-282, 2003.

LUCAS, D. R.; NEWHOUSE, J. P. The toxic effects of sodium l-glutamate on the inner

layers of the retina. Arch. Opthalmol., v. 58, p.193–201, 1957.

LUCAS, J. A. Encycopledia of the Human Brain. Memory Overview, v. 1, p. 817 –833,

2002.

LUHESHI, N. M.; KOVACS, K. J.; LOPEZ-CASTEJON, G.; BROUGH, D.; DENES, A.

Interleukin-1alpha expression precedes IL-1beta after ischemic brain injury andis localised to

areas of focal neuronal loss and penumbral tissues. J. Neuroinflammation, v. 8, p. 186, 2011.

LV, R.; ZHOU, W.; YANG, J. J.; JIN, Y.; XU, J. G. Hydroxyethylstarch inhibits intestinal

production of cytokines and activation of transcription factors in endotoxaemic rats. J. Int.

Med. Res., v. 33, p. 379-388, 2005.

MAAS, M. B.; LEV, M. H.; AY, H.; SINGHAL, A. B.; GREER, D.M.; SMITH, W.S.

Collateral vessels on CT angiography predict outcome in acute ischemic stroke. Stroke, v. 40,

p. 3001–3005, 2009.

MALMANN, A. B.; FUCHS, S. C.; GUS, M.; FUCHS, F. D.; MOREIRA, L. B. Population-

Attributable Risks for Ischemic Stroke in a Community in South Brazil: A Case-Control

Study. PLoS ONE, v. 7, n. 4, p. 35680, 2012.

MARGAILL, I.; PLOTKINE, M.; LEROUET, D. Antioxidant strategies in the treatment of

stroke. Free Radic. Biol. Med., v. 39, p. 429–443, 2005.

MAROOF, N.; PARDON, M. C.; KENDALL, D. A. Endocannabinoid signalling in

Alzheimer’s disease. Biochem. Soc. Trans., v. 41, n. 6, p. 1583-1587, 2013.

MARTIN-QUINTAL, Z.; GARCIA-MISS, M.D.R.; MUT-MART´IN, M.; MATUS-MOO,

A.; TORRES-TAPIA, L. W.; PERAZA-SANCHEZ, S.R. The leishmanicidal effect of (3S)-

16, 17-didehydrofalcarinol, an oxylipin isolated from Tridax procumbens, is independent of

NO production. Phytother. Res., v. 24, n. 7, p. 1004–1008, 2010.

MASSARO, A. R. Triagem do AVC isquêmico agudo. Rev. Soc. Cardiol. Rio Grande do

Sul, v. 7, 2006.

MAUD, A. Memory loss after stroke. Am. Acad. Neurol., v.24, p. 67, 2006.

MAXWELL, S. R. J.; LIP, G. Y. H. Reperfusion injury: a review of the pathophysiology,

clinical manifestations and therapeutic options. Int. J. Cardiol., v. 58, p. 95, 1997.

MAZZATORTA, P.; SMIESKO, M.; PIPARO, E.L.; BENFENATI, E. QSAR model for

predicting pesticide aquatic toxicity. J. Chem. Inform. Model., v. 45, p. 1767–1774, 2005.

101

MCAULIFFE, J. J.; LOEPKE, A. W.; MILES, L.; JOSEPH, B.; HUGHES, E.; VORHEES,

C. V. Desflurane, isoflurane, and sevoflurane provide limited neuroprotection against

neonatal hypoxia-ischemia in a delayed preconditioning paradigm. Anesthesiology, v. 111, p.

533-546, 2009.

MCEWEN, B. S.; SAPOLSKY, R. M. Stress and cognitive function. Curr. Opin.

Neurobiol., v. 5, p. 205–216, 1995.

MELANI, A.; GIANFRIDDO, M.; VANNUCCHI, M. G.; CIPRIANI, S.; BARALDI, P. G.;

GIOVANNINI, M. G.; PEDATA, F. The selective A2A receptor antagonist SCH 58261

protects from neurological deficit, brain damage and activation of p38 MAPK in rat focal

cerebral ischemia. Brain Res., p. 1 0 7 3 – 1 0 7 4, 2006.

MELANI, A.; PANTONI, L.; BORDONI, F.; GIANFRIDDO, M.; BIANCHI, L.;

VANNUCCHI, M. G.; BERTORELLI, R.; MONOPOLI, A.; PEDATA, F. The selective A

receptor antagonist SCH 58261 reduces striatal 2A transmitter outflow, turning behavior and

ischemic brain damage induced by permanent focal ischemia in the rat. Brain Res., v. 959, p.

243–250, 2003.

MENON BK, SMITH EE, MODI J, PATEL SK, BHATIA R, WATSON TW, HILL

MD, DEMCHUK AM, GOYAL M.Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts

clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J.

Neuroradiol., v. 32, p. 1640–1645, 2011.

MITEFF, F.; LEVI, C. R.; BATEMAN, G. A.; SPRATT, N.; MCELDUFF, P.; PARSONS,

M. W. The independent predictive utility of computed tomography angiographic collateral

status in acute ischaemic stroke. Brain, v. 132, p. 2231–2238, 2009.

MORALES-YUSTE, M.; MORILLAS-MARQUEZ, F.; MARTIN-SANCHEZ, J.; VALERO-

LOPEZ, A.; NAVARRO-MOLL, M.C. Activity of (-) -bisabolol against Leishmania

infantum promastigotes. Phytomedicine, v. 17, p. 279–281, 2010.

MORO, M. A.; ALMEIDA, A.; BOLANOS, J. P.; LIZASOAIN, I. Mitochondrial respiratory

chain and free radical generation in stroke. Free Radic. Biol. Med., v. 39, n. 10, p. 1291-304,

2005.

MORRIS, R. Developments of a water-maze procedure for stugying spatial learning in the rat.

J. Neurosci. Methods, v 11, p. 47-60, 1984.

MUN KC, LEE HG, LEE TH, KIM YH, KWAK CS, KIM SP, CHANG EJ, PARK SB. Effect of

modified polyhemoglobin on the ischemia/reperfusion injury in kidney. Transplant. Proc., v.

35, p. 99, 2003.

MURAKAMI, A.; TANAKA, T.; LEE, J.-Y.; SURH, Y.-J.; KIM, H.W.; KAWABATA, K.;

NAKAMURA, Y.; JIWAJINDA, S.; OHIGASHI, H. Zerumbone, a sesquiterpene in

subtropical ginger, suppresses skin tumor initiation and promotion stages in ICR mice. Int. J.

Cancer, v. 110, p. 481–490, 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menon%20BK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Smith%20EE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Modi%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Patel%20SK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bhatia%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Watson%20TW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hill%20MD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hill%20MD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Demchuk%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Goyal%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21799045

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mun%20KC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20HG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20TH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20YH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwak%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20SP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chang%20EJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20SB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12591324

102

MURPHY, T. H.; LI, P.; BETTS, K.; LIU, R. Two-photon imaging of stroke onset in vivo

reveals that NMDA-receptor independent ischemic depolarization is the major cause of rapid

reversible damage to dendrites and spines. J. Neurosci., v. 28, p. 1756–1772, 2008.

MUTSO AA, PETRE B, HUANG L, BALIKI MN, TORBEY S, HERRMANN

KM, SCHNITZER TJ, APKARIAN AV. Reorganization of hippocampal functional

connectivity with transition to chronic back pain. J. Neurophysiol., v. 111, p. 1065–1076,

2014.

NAKASE, T.; FUSHIKI, S.; NAUS, C. C. G. Astrocytic Gap Junctions Composed of

Connexin 43 Reduce Apoptotic Neuronal Damage in Cerebral Ischemia. Stroke, v. 34, p.

1987-1993, 2003.

NESBIT, G. M; LUH, G.; TIEN, R.; BARNWELL, S. L. New and future endovascular

treatment strategies for acute ischemi stroke. J. Vasc. Interv. Radiol., v. 15, p. S103 –S110,

2004.

NEUHAUS-CARLISLE K, V.; WAGNER, H. Screening of plant extracts and plant

constituents for calcium-channel blocking activity. Phytomedicine, v. 4, p. 67–71, 1997.

O'DONNELL MJ, XAVIER D, LIU L, ZHANG H, CHIN SL, RAO-MELACINI

P, RANGARAJAN S, ISLAM S, PAIS P, MCQUEEN MJ, MONDO C, DAMASCENO

A, LOPEZ-JARAMILLO P,HANKEY GJ, DANS AL, YUSOFF K, TRUELSEN T, DIENER

HC, SACCO RL, RYGLEWICZ D, CZLONKOWSKA A, WEIMAR C, WANG X, YUSUF

S; INTERSTROKE INVESTIGATORS. Risk factors for ischaemic and intracerebral

haemorrhagic stroke in 22 countries (the INTERSTROKE study): a case-control study.

Lancet, v. 376, p.112-123, 2010.

OECHMICHEN, M.; MEISSNER, C. Cerebral hypoxia and ischemia: the forensic point of

view: a review. J. Forensic Sci., v. 51, p. 880–887, 2006.

OHTAKI, H.; TAKEDA, T.; DOHI, K.; YOFU, S.; NAKAMACHI, T.; SATOH, K.;

HIRAIZUMI, Y.; MIYAOKA, H.; MATSUNAGA, M.; SHIODA, S. Increased mitochondrial

DNA oxidative damage after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosci.

Res., v. 58, p. 349–355, 2007.

OSAKADA, F.; KAWATO, Y.; KUME, T.; KATSUKI, H.; SUGIMOTO, H.; AKAIKE, A.

Serofendic acid, a sulfur-containing diterpenoid derived from fetal calf serum, attenuates

reactive oxygen species-induced oxidative stress in cultured striatal neurons. J. Pharmacol.

Exp. Therap., v. 311, p. 51–59, 2004.

PANDOLFO, P.; MACHADO, N.J.; KÖFALVI, A.; TAKAHASHI, R.N.; CUNHA, R.A.

Caffeine regulates frontocorticostriatal dopamine transporter density and improves attention

and cognitive deficits in an animal model of attention deficit hyperactivity disorder. Eur.

Neuropsychopharmacol., v. 23, n. 4, p. 317-328, 2013.

PARK OK1, CHOI JH, PARK JH, KIM IH, YAN BC, AHN JH, KWON SH, LEE JC, KIM

YS, KIM M, KANG IJ, KIM JD, LEE YL, WON MH. Comparison of neuroprotective effects of

five major lipophilic diterpenoids from Danshen extratc against experimentally induced

transient cerebral ischemic damage. Fitoterapia, v. 83, p. 1666–1674, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mutso%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petre%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Huang%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Baliki%20MN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Torbey%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Herrmann%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Herrmann%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schnitzer%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Apkarian%20AV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24335219

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=O%27Donnell%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xavier%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chin%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rao-Melacini%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rao-Melacini%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rangarajan%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Islam%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pais%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McQueen%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mondo%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Damasceno%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Damasceno%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lopez-Jaramillo%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hankey%20GJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dans%20AL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yusoff%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Truelsen%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Diener%20HC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Diener%20HC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sacco%20RL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ryglewicz%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Czlonkowska%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weimar%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yusuf%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yusuf%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20561675

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=INTERSTROKE%20investigators%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20OK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Choi%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Park%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20IH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yan%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ahn%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kwon%20SH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20JC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20YS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20YS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kang%20IJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20YL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Won%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23022532

103

PEGG, D. E. Organ preservation. Surg. Clin. North Am., v. 66, p. 617–632, 1986.

PETITO, C. K.; FELDMANN, E.; PULSINELLI, W. A.; PLUM, F. Delayed hippocampal

damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology, v. 37. p.1281–1286, 1987.

PETITO, C.K.; TORRES-MUNOZ, J.; ROBERTS, B.; OLARTE, J. P.; NOWAKJRT. S.;

PULSINELLI, W. A. DNA fragmentation follows delayed neuronal death in CA1 neurons

exposed to transient global ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 17, p. 967–

976, 1997.

PETREA RE, BEISER AS, SESHADRI S, KELLY-HAYES M, KASE CS, WOLF PA. Gender

differences in stroke incidence and poststroke disability in the Framingham heart study.

Stroke, v. 40, p.1032-1037, 2009.

PETRONILHO, S.; MARASCHIN, M.; COIMBRA, M. A.; ROCHA, S. M. In vitro and in

vivo studies of natural products: a challenge for their valuation. The case study of Chamomile

(Matricaria recutita L.). Industrial Crops and Products, v. 40, 1–12, 2012.

PRADEEP, H.; DIYA, J. B.; SHASHIKUMAR, S.; RAJANIKANT, G. K. Oxidativ estress—

assassin behind the ischemic stroke. Fol. Neuropathol., v. 50, p.219–230, 2012.

QAMAR, W.; SULTANA, S. Farnesol ameliorates massive inflammation, oxidative stress

and lung injury induced by intratracheal instillation of cigarette smoke extract in rats: An

initial step in lung chemoprevention. Chem. Biol. Interact., v. 176, p. 79–87, 2008.

REED, J. C. Apoptosis-based therapies. Nat. Rev. Drug Discov., v. 1, p. 111–112, 2002.

REEVES MJ, BUSHNELL CD, HOWARD G, GARGANO JW, DUNCAN PW, LYNCH

G, KHATIWODA A, LISABETH L. Sex differences in stroke: epidemiology, clinical

presentation, medical care, and outcomes. Lancet Neurol., v. 7, p. 915-926, 2008.

RITZ, M.F.; CURIN, Y.; MENDELOWITSCH, A.; ANDRIANTSITOHAINA, R. Acute

treatment with red wine polyphenols protects from ischemia-induced excitotoxicity, energy

failure and oxidative stress in rats. Brain Res., v. 1239, p. 226–234, 2008.

RIVA M, PAPPADÀ GB, PAPADAKIS M, CUCCIONE E, CARONE D, MENENDEZ

VR, SGANZERLA EP, BERETTA S.Hemodynamic monitoring of intracranial collateral

flowpredicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol., v.

233, p. 815–820, 2012.

ROCHA, S. M.; COELHO, E.; VINHOLES, J.; COIMBRA, M. A. Grapes and wine from

Vitis vinifera L. as a potential source of sesquiterpenoids. In: SINGH, V. K.; GOVIL, J. M.;

AHMADE, K.; SHARMA, R. K. (Ed.). Recent progress in medicinal plants. Houstoun:

Studium Press, 2006. p. 253-272.

SOCORRO S ROSA MDO S, MENDONÇA-FILHO RR, BIZZO HR, DE ALMEIDA

RODRIGUES I, SOARES RM, SOUTO-PADRÓN T, ALVIANO CS, LOPES AH. Antileishmanial activity of a linalool-rich essential oil from Croton cajucara. Antimicrob.

Agents Chemother., v. 47, n. 6, p. 1895–1901, 2003.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petrea%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beiser%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Seshadri%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kelly-Hayes%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kase%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wolf%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19211484

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reeves%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bushnell%20CD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Howard%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gargano%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Duncan%20PW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lynch%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lynch%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khatiwoda%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lisabeth%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18722812

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Riva%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pappad%C3%A0%20GB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papadakis%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cuccione%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Carone%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menendez%20VR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menendez%20VR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sganzerla%20EP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beretta%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22193110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=do%20Socorro%20S%20Rosa%20Mdo%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mendon%C3%A7a-Filho%20RR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bizzo%20HR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Almeida%20Rodrigues%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Almeida%20Rodrigues%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Soares%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Souto-Padr%C3%B3n%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alviano%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lopes%20AH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12760864

104

RUBERTO, G.; BARATTA, M. T. Antioxidant activity of selected essential oil components

in two lipid model systems. Food Chem., v. 69, p. 167–174, 2000.

SABOGAL, A. L. M. A.; ARANGO, C. S. A.; CARDONA, G. P.; CÉSPEDES, A. E. A

torvastat in protects GABAergic and dopaminergic neurons in the nigrostriatal system in

anexperimental rat model of transient focal cerebral ischemia. Biomedica, v. 34, p. 207–217.

SANTORO, G. F.; CARDOSO, M. G.; GUIMARÃES, L. G.; FREIRE, J. M.; AND

SOARES, M. J. Anti-proliferative effect of the essential oil of Cymbopogon citratus (DC)

Stapf (lemongrass) on intracellular amastigotes, bloodstream trypomastigotes and culture

epimastigotes of Trypanosoma cruzi (Protozoa: Kinetoplastida). Parasitology, v. 134, p.

1649–1656, 2007.

SATTLER, R.; TYMIANSKI, M. Molecular Mechanisms of Glutamate Receptor-Mediated

Excitotoxic Neuronal Cell Death. Mol. Neurobiol., v. 4, p. 107-129, 2001.

SAYRE, L. M.; SMITH, M. A.; PERRY, G. Chemistry and biochemistry of oxidative stress

in neurodegenerative disease. Curr. Med. Chem., v. 8, p. 721–738, 2001.

SCHEPER, V. P.; KETELA, M.; VAN, D. P. I.; VISSER-MEILY, J. M.; LINDEMAN, E.

Comparing contents of functional outcome measures in stroke rehabilitation using the

international classification of functioning, disability and health. Disabil. Rehabil., v. 29, p.

221-230, 2007.

SCHMITT, C.A.; FRIDMAN, J.S.; YANG, M.; BARANOV, E.; HOFFMAN, R.M.; LOWE,

S.W. Dissecting p53 tumor suppressor functions in vivo. Cancer Cell, v.1, p. 289–298, 2002.

SCHMUED, L.C.; HOPKINS, K. J. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the

localization of neuronal degeneration. Brain Res., v.874, p.123–130, 2000.

SCUDERI, C.; VALENZA, M.; STECCA, C.; ESPOSITO, G.; CARRATU, M. R.;

STEARDO, L. Palmitoylethanolamide exerts neuroprotective effects in mixed neuroglial

cultures and organotypic hippocampal slices via peroxisome proliferator-activated receptor-α.

J. Neuroinflammation, v. 9, p. 49, 2012.

SELL, C. (Ed.). The chemistry of fragrances: from perfumer to consumer. 2nd

ed. Dorset,

UK: RSC Publishing, 2000.

SHENG, H.; WNAG, Y. Correlation of locomotor activity and brain infarction in rats with

transient focal ischemia. J. Neurosci. Methods, v. 186, p. 150–154, 2010.

SIEGEL, N. J.; AVISON, M. J.; REILLY, H. F.; ALGER, J.R.; SHULMAN, R. G. Enhanced

recovery of renal ATP with postischemic infusion of ATP-MgCl2 determined by 31P-NMR.

Am. J. Physiol. Renal Fluid Electrolyte Physiol., v. 245, p. F530–F534, 1983.

SILASI, G.; MURPHY, T. H. Stroke and the connectome: how connectivity guides

therapeutic intervention. Neuron, v. 83, p. 1354–1368, 2014.

SLATER, T. F. Free radical mechanisms in tissue injury. Biochem. J., v. 222, p. 1, 1984.

105

SQUIRE, L. R.; ZOLA, S. M. Structure and function of declarative and nondeclarative

memory systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 93, n. 24, p. 13515-13522, 1996.

STOLLG, G.; JANDER, S. The role of microglia and macrophages in the pathophysiology of

the CNS. Prog. Neurobiol., v. 58, p.233–247, 1999.

SUN HJ, L. I. H.; ZOU, Z.; SHI, X.Y. Protective effects of hydroxyethylstarch 130/0.4

against myocardial ischemia/reperfusion injury in rats. Chin. Med. J., v. 124, p. 291-297,

2011.

SUTACHAN JJ, CASAS Z, ALBARRACIN SL, STAB BR 2ND, SAMUDIO I, GONZALEZ

J, MORALES L, BARRETO GE.Cellular and molecular mechanisms of antioxidants in

Parkinson’s disease. Nutr. Neurosci, v. 15, p. 120–126, 2012.

SUTHERLAND, B. A.; PAPADAKIS, M.; CHEN, R. L.; BUCHAN, A. M. Cerebral blood

flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol., v. 589, p. 4105–

4114, 2011.

TAMURA, A.; GRAHAM, D. I.; MCCULLOCH, J.; TEASDALE, G. M. Focal cerebral

ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences

following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 1, p. 53-60,

1981.

TANIZAKI Y, KIYOHARA Y, KATO I, IWAMOTO H, NAKAYAMA K, SHINOHARA

N, ARIMA H, TANAKA K, IBAYASHI S, FUJISHIMA M. Incidence and risk factors

forsubtypes of cerebral infarction in a general population: the Hisayama Folsom1999,

O’Donnell, 2010. Tanizaki, 2000 study. Stroke, v. 31, p. 2616-2622, 2000.

TATMAN, D.; MO, H. Volatile isoprenoid constituents of fruits, vegetables and herbs

cumulatively suppress the proliferation of murine B16 melanoma and human HL-60 leukemia

cells. Cancer Lett., v. 175, p. 129–139, 2002.

TAYLOR, R. C.; CULLEN, S. P.; MARTIN, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the

cellular level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v. 9, p. 231–224, 2008.

THULBORN, K. R.; GINDIN, T. S.; DAVIS, D.; ERB, P. Comprehensive MR imaging

protocol for stroke management: tissue sodium concentration as a measure of tissue viability

in nonhuman primate studies and in clinical studies. Radiology, v. 213, p. 156–166, 1999.

TORRADO, S.; AGIS, A.; JIMENEZ, ME.; CADORNIGA, R. Effect of dissolution profile

and (−)- alpha-bisabolol on the gastrotoxicity of acetylsalicylic acid. Pharmazie, v. 50, v.2,

p.141–143, 1995.

TSANG A, STOBBE RW, ASDAGHI N, HUSSAIN MS, BHAGAT YA, BEAULIEU

C, EMERY D, BUTCHER KS. Relationship between sodium intensity and perfusion deficits in

acute ischemic stroke. J. Magn. Reson. Imaging, v. 33, p. 41–47, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sutachan%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Casas%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Albarracin%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stab%20BR%202nd%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Samudio%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gonzalez%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gonzalez%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Morales%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Barreto%20GE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22732354

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tanizaki%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kiyohara%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kato%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iwamoto%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakayama%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shinohara%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shinohara%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arima%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tanaka%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ibayashi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fujishima%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11062284

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsang%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stobbe%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Asdaghi%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hussain%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bhagat%20YA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beaulieu%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beaulieu%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Emery%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Butcher%20KS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21182119

106

TSANG, A.; STOBBE, R.; HUSSAIN, S.; BHAGAT, Y.; BEAULIEU, C.; EMERY, D.

Sodium Image Intensity Increases in Ischemic Core Tissue, but not Penumbra in Acute and

Sub-Acute Stroke. Stroke, 2009.

TU, X. K.; YANG, W. Z.; WANG, C. H.; SHI, S. S.; ZHANG, Y. L.; CHEN, C. M.; YANG,

Y. K.; JIN, C. D.; WEN, S. Zileuton Reduces Inflammatory Reaction and Brain Damage

Following Permanent Cerebral Ischemia in Rats. Inflammation, v. 33, p. 344-352, 2010.

VALKO M, RHODES CJ, MONCOL J, IZAKOVIC M, MAZUR M. Free radicals, metals and

antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact., v. 160, p. 1, 2006.

VAN DER WORD, H. B; VAN GIJN, J. Clinical practice: acute ischemic stroke. N. Engl. J.

Med., v. 357, p. 572-579, 2007.

VELDHUIS WB, VAN DER STELT M, WADMAN MW, VAN ZADELHOFF

G, MACCARRONE M, FEZZA F, VELDINK GA, VLIEGENTHART JF, BÄR PR, NICOLAY

K, DI MARZO V. Neuroprotection by the endogenous cannabinoid anandamide and arvanil

against in vivo excitotoxicity in the rat: role of vanilloid receptors and lipoxygenases. J.

Neurosci., v. 23, p. 4127–4133, 2003.

VELDHUIS WB, VAN DER STELT M, WADMAN MW, VAN ZADELHOFF

G, MACCARRONE M, FEZZA F, VELDINK GA, VLIEGENTHART JF, BÄR PR, NICOLAY

K, DI MARZO V. (+)-epi- -bisbolol is the wound-healing principle of Peperomia galioides:

investigation of the in vivo wound-healing activity of related terpenoids. J. Nat. Prod., v. 64,

n. 10, p. 1357–1359, 2001.

VINHOLES, J.; RUDNITSKAYA, A.; GONÇALVES, P.; MARTEL, F.; COIMBRA, M. A.;

ROCHA, S. M. Hepatoprotection of sesquiterpenoids: A quantitative structure–activity

relationship (QSAR) approach. Food Chem., v. 146, p. 78-84, 2014.

VISCOMI, M.T.; ODDI, S.; LATINI, L.; PASQUARIELLO, N.; FLORENZANO, F.;

BERNARDI, G.; MOLINARI, M.; MACCARRONE, M. Selective CB2 receptor agonism

protects central neurons from remote axotomy-induced apoptosis through the PI3K/Akt

pathway. J. Neurosci., v. 29, p. 4564–4570, 2009.

VUORELA, H.; VUORELA, P.; TORNQUIST, K.; ALARANTA, S. Calcium channel

blocking activity: screening methods for plant derived compounds. Phytomedicine, v. 4,

p.167–180, 1997.

WAHL, F.; ALLIX, M.; PLOTKINE, M.; BOULU, R. G. Neurological and behavioral

outcomes of focal cerebral ischemia in rats. Stroke, v. 23, p. 267-272, 1992.

WALL, P. M.; BLANCHARD.; MARKHAM.; YANG, M.; BLANCHARD, D. C.

Infralimbic D1 receptor agonist effects on spontaneous novelty exploration and anxiety-like

defensive responding in CD-1 mice. Behav. Brain Res., v. 152, p. 67–79, 2004.

WANG, J.; XU, H.; JIANG, H.; DU, X.; SUN, P.; XIE, J. Neurorescue Effect of Rosmarinic

Acid on 6-Hydroxydopamine-Lesioned Nigral Dopamine Neurons in Rat Model of

Parkinson's Disease. J. Mol. Neurosci., v. 47, n. 1, p. 113-119, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Valko%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16430879

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rhodes%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16430879

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moncol%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16430879

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Izakovic%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16430879

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mazur%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16430879

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Veldhuis%20WB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20der%20Stelt%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wadman%20MW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20Zadelhoff%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maccarrone%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fezza%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Veldink%20GA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vliegenthart%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=B%C3%A4r%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nicolay%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Di%20Marzo%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Veldhuis%20WB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20der%20Stelt%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wadman%20MW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maccarrone%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fezza%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Veldink%20GA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vliegenthart%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=B%C3%A4r%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Di%20Marzo%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12764100

107

WANG, Q.; SUN, A.Y.; SIMONYI, A.; KALOGERIS, T.J.; MILLER, D.K.; SUN, G.Y.;

KORTHUIS, R.J. Ethanol preconditioning protects against ischemia/reperfusion-induced

brain damage: Role of NADPH oxidase-derived ROS. Free Radic. Biol. Med., v. 43, p.

1048–1060, 2007.

WANG, Q.; TANG, X. N.; YENARI, M. A. The inflammatory response in stroke. J.

Neuroimmunol., v. 184, n. 1/2, p. 53–68, 2007.

WANG, W.; REDECKER, C.; YU, Z. Y.; XIE, M. J.; TIAN, D. S.; ZHANG, L.; BU, B. T.;

WITTE, O. W. Rat focal cerebral ischemia induced astrocyte proliferation and delayed

neuronal death are attenuated by cyclin-dependent kinase inhibition. J. Clin. Neurosci., v. 15,

p. 278–285, 2008.

WANG, X.; MICHAELIS, E. K. Selective neuronal vulnerability to oxidative stress in the

brain. Aging Neurosci., v 30, p.12, 2010.

WARDLAW, J. M.; MURRAY, V.; BERGE, E.; DEL ZOPPO, G.; SANDERCOCK, P.;

LINDLEY, R. L, 2205 COHEN, G., 2012. Recombinant tissue plasminogen activator for

acute ischaemic 2206 stroke: an updated systematic review and meta-analysis. Lancet, v. 379,

p. 2364– 2207, 2372.

WETTERLING, F.; GALLAGHER, L.; MACRAE, I. M.; JUNGE, S.; FAGAN, A. J.

Regional and temporal variations in tissue sodium concentration during the acute stroke

phase. Magn. Reson. Med., v. 67, p. 740–749, 2012.

WHO. The top 10 causes of death. Geneva, 2011. Disponível em:

<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/index.html>. Acesso em: 1 out. 2012.

WILKINS K, CAMPBELL NR, JOFFRES MR, MCALISTER FA, NICHOL M, QUACH

S, JOHANSEN HL, TREMBLAY MS. Blood pressure in Canadian adults. Health Rep., v. 21,

p.37-46, 2010.

WINK, M. Evolutionary advantage and molecular modes of action of multi-component

mixtures used in phytomedicine. Curr. Drug Metab., v. 9, p. 996–1009, 2008.

WINSHIP, I. R., MURPHY, T. H. In vivo calcium imaging reveals functional rewiring of

single somatosensory neurons after stroke. J. Neurosci., v. 28, p. 6592–606, 2008.

WIN-SHWE, T. T.; FUJIMAKI, H. Acute administration of toluene affects memory retention

in novel object recognition test and memory function-related gene expression in mice. J.

Appl. Toxicol., v. 32, p. 300-304, 2012.

WINTERS, B. D.; SAKSIDA, L. M.; BUSSEY, T. J. Object recognition memory:

neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav.,

v. 32, p. 1055–1070, 2008.

XIAO, Y.; GUAN, Z. Z.; WU, C. X.; LI, Y.; KUANG, S. X.; PEI, J. J. Correlations Between

Cholinesterase Activity and Cognitive Scores in Post-Ischemic Rats and Patients with

Vascular Dementia. Cell Mol. Neurobiol., v. 32, p. 399–407, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilkins%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Campbell%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Joffres%20MR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McAlister%20FA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nichol%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Quach%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Quach%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Johansen%20HL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tremblay%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20426225

108

XING, D.; NOZELL, S.; CHEN, Y. F.; HAGE, F.; OPARIL, S. Estrogen and mechanisms of

vascular protection. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., v. 29, p.289-95, 2009.

YAMAMOTO, M.; TAMURA, A.; KIRINO, T.; SHIMIZU, M.; SANO, K. Effects of a new

thyrotropin-releasing hormone derivative on behavioral changes after focal cerebral ischemia

in rats. Stroke, v. 20, p. 362-366, 1989.

YANG, F.; WANG, Z.; WEI, X.; HAN, H.; MENG, X.; ZHANG, Y.; SHI, W.; LI, F.; XIN,

T.; PANG, Q.; YI, F. NLRP3 deficiency ameliorates neurovascular damage in

experimentalischemic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 34, p. 660–667, 2014.

YONEMORI, F.; YAMADA, H.; YAMAGUCHI, T.; UEMURA, A.; TAMURA, A. Spatial

memory disturbance after focal cerebral ischemia in rats. J. Cereb. Blood Flow Metab., v.

16, p. 973-980, 1996.

YOO, D. Y; JUNG, H. Y; NAM, S. M; KIM, J. W; CHOI, J. H.Valeriana officinalis Extracts

Ameliorate Neuronal Damage by Suppressing Lipid Peroxidation in the Gerbil Hippocampus

Following Transient Cerebral Ischemia. J. Med. Food, v. 18, n. 6, p. 642-647, 2015.

YOO, K. Y.; HWANG, I. K.; KIM, J. D.; KANG, I. J.; PARK, J.; YI, J. S.; KIM, J. K.; BAE,

Y. S.; WON, M. H. Antiinflammatory effect of the ethanol extract of Berberis koreana in a

gerbil model of cerebral ischemia/reperfusion. Phytother. Res., v. 22, p. 1527, 2008.

YRJANHEIKKI, J.; KEINANEN, R.; PELLIKKA, M.; HOKFELT, T.; KOISTINAHO, J.

Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95, p. 15769–15774, 1998.

YU, Y. M.; KIM, J. B.; LEE, K. W.; KIM, S. Y.; HAN, P. L.; LEE, J. K. Inhibition of the

cerebral ischemic injury by ethylpyruvate with a wide therapeutic window. Stroke, v. 36, p.

2238–2243, 2005.

YUSHMANOV, V. E.; KHARLAMOV, A.; YANOVSKI, B.; LAVERDE, G.; BOADA, F.

E.; JONES, S. C. Inhomogeneous sodium accumulation in the ischemic core in rat focal

cerebral ischemia by Na-23 MRI. J. Mag. Reson. Imaging, v. 30, p. 18–24, 2009.

ZÉTOLA, V. H. F.; NÓVAK, E. M.; CAMARGO, C. H. F.; CARRARO JÚNIOR, H.;

CORAL, P.; MUZZIO, J. A.; IWAMOTO, F. M.; COLETE, M. V. D.; WERNRCK, L. C.

Acidente vascular cerebral em pacientes jovens. Arq. Neuropsiquiatr., v. 59, n. 3B, p. 740-

745, 2001.

ZHANG, S.; BOYD, J.; DELANEY, K.; MURPHY, T. H. Rapid reversible changes in

dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia. J. Neurosci., v.25, p. 5333–

5338, 2005.

ZHANG, X.; YEUNG, P. K.; McALONAN, G. M.; CHUNG, S. S.; CHUNG, S. K.

Transgenic mice over-expressing endothelial endothelin-1 show cognitive deficit with blood–

brain barrier breakdown after transient ischemia with long-term reperfusion. Neurobiology of

Learning and Memory, v. 101(C), p. 46-54, 2013.

109

ZHANG, Z.; CHOPP, M.; POWERS, C. Temporal profile of microglial response following

transient (2 h) middle cerebral artery occlusion. Brain Res., v. 744, p. 189–198, 1997.

ZYGMUNT, P. M.; LARSSON, B.; STERNER, O.; VINGE, E.; HÖGESTÄTT, E. D.

Calciumantagonistic properties of the sesquiterpene T-cadinol and related substances:

structure–activity studies. Pharmacol. Toxicol., v. 73, p.3-9, 1993.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · o teste do reconhecimento de objecto, e os...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · o teste do reconhecimento de objecto, e os...