UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA … · Agradeço primeiramente a Deus , por...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ANA JÉRSIA ARAÚJO

ESTUDO DAS PROPRIEDADES CITOTÓXICA DA NOR- β-LAPACHONA E SEU

DERIVADO NITROFENILAMINO EM CÉLULAS HL-60

FORTALEZA

2009

ANA JÉRSIA ARAÚJO

ESTUDO DAS PROPRIEDADES CITOTÓXICAS DA NOR-β-LAPACHONA E SEU

DERIVADO NITROFENILAMINO EM CÉLULAS HL-60

Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Orientadora: Dra. Raquel Carvalho Montenegro

Co-orientadora: Profª Dra Letícia Veras Costa Lotufo

FORTALEZA

2009

A687e Araújo, Ana Jérsia Estudo das propriedades citotóxicas da Nor-β-Lapachona e seu derivado nitrofenilamino em células HL-60 / Ana Jérsia Araújo. – Fortaleza, 2009. 95 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Raquel Carvalho Montenegro Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do

Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza-Ceará, 2009 1. Leucemia Promielocítica Aguda 2. Naftoquinonas 3. Testes de Toxicidade 4. Apoptose I. Montenegro, Raquel Carvalho (orient.) II. Título. CDD: 616.99419

ANA JÉRSIA ARAÚJO

ESTUDO DAS PROPRIEDADES CITOTÓXICAS DA NOR- β-LAPACHONA E

SEU DERIVADO NITROFENILAMINO EM CÉLULAS HL-60

Dissertação submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em

Farmacologia como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de

mestre em Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________

Dra. Raquel Carvalho Montenegro (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo (Co-orientadora)


__________________________________________________

Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves


__________________________________________________

Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade


Este documento encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca setorial a referida universidade. A citação de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde que seja feita em conformidade com as normas da ética científica.

À Deus e a minha família por toda a ajuda

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus , por estar presente em todos os momentos da minha vida, dando-me força nos momentos difíceis, pelos muitos momentos de alegria proporcionados e pelas vitórias conquistadas;

À Dra. Raquel Carvalho Montenegro , pela orientação neste trabalho, por todas as oportunidades ofertadas em todo este período e pelos ensinamentos que contribuíram muito para a minha formação;

À Dra. Letícia Veras Costa Lotufo pela competência e simplicidade, pelos bons conselhos, incentivo e orientação e pelos inesquecíveis momentos de descontração;

À Dra. Cláudia Pessoa , pelo incentivo em implantar novas técnicas no laboratório e pela busca por novos recursos para o mesmo;

Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes , pelo incentivo e contribuição à pesquisa

no Laboratório de Oncologia Experimental e pelo seu bom-humor;

À Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves , por sempre nos receber de braços

abertos em seu laboratório e pelos excelentes momentos de descontração;

Ao Delano , namorado dedicado e companheiro, pela ajuda nesse e em todos

os trabalhos desenvolvidos na minha vida acadêmica, pela tranqüilidade, apoio e

acima de tudo, pelo amor que sente por mim (completamente correspondido);

À minha mãe, pela torcida e por estar sempre orando por mim. Pelo apoio em

todas as minhas decisões, incentivo aos estudos e dedicação;

Aos meus “projetos” de sogro e sogra, pelo espaço sempre reservado para os

estudos, pelo carinho, torcida e apoio em todos os momentos;

Aos amigos do Laboratório de Oncologia Experimental: Adriana Carvalho,

Bruno Cavalcanti, Bruno, Carla Sombra, Cecília Carvalho, Deisy, Elthon Gois,

Germano, Hemerson Iury, Igor, Kézia Lacerda, Kristiana Mousinho, Patrícia Marçal,

Paula Abreu, Rafael, Vanessa, Venúcia, Washington Bastos, Zé Roberto e a todos

que de forma direta ou indireta me ajudaram e que proporcionaram um convívio

agradável dentro e fora do LOE. Em especial, agradeço a Evelyne Alves e Arinice

Costa , por toda a ajuda e companheirismo, Danilo Damasceno , Paula Jimenez ,

Felipe Rocha e Diego Veras , pelos ensinamentos, ajuda e pelos momentos de

descontração dentro e fora do laboratório.

Às professoras que aceitaram participar dessa banca: Dra. Geanne Matos de

Andrade, Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, Dra. Letícia Veras Costa Lotufo e

Dra. Raquel Carvalho Montenegro.

Aos professores, frutos do LOE, Márcio Roberto, Gardênia Militão, Daniel

Bezerra, Marne Vasconcellos e Paulo Michel.

As secretárias Adelânia Marinho e Sheyla por sempre estarem dispostas a

ajudar, pelo apoio e torcida para que tudo de melhor nos aconteça. Obrigada pela

dedicação e pelos bons conselhos;

Aos técnicos: Paulo , D. Fátima e em especial Erivanda França , Silvana

França e a Rogéria Montenegro pela constante ajuda dentro do laboratório e pelas

conversas agradáveis;

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Chiquinho ,

Alana , Carlos , Iris , Márcia e em especial a Aura Rhanes pela paciência e ajuda

em todos os momentos;

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Banco do Nordeste do Brasil - BNB

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e T ecnológico - CNPq

Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP

Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa - FUNCAP

Instituto Claude Bernard - InCb

RESUMO

O esqueleto quinona foi identificado como um importante grupo farmacofórico

para atividade citotóxica de vários compostos utilizados na clínica, constituindo ainda

uma das maiores classes de agentes anticâncer. A β-lapachona é uma das quinonas

mais estudadas nos últimos anos. Suas aplicações mais importantes estão

relacionadas às ações contra várias células tumorais. Seu derivado, nor-β-lapachona

(composto 1), tem atividade anticâncer similar. Assim, o objetivo desse trabalho foi

avaliar o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto 1 e de seu

derivado nitrofenilamino (composto 2) em células leucêmicas HL-60. Inicialmente foi

investigado o efeito desses compostos na viabilidade de células HL-60 após 24

horas de incubação, mostrando CI50 de 2,92 e 0,48 µM para os compostos 1 e 2,

respectivamente. Acerca da seletividade celular, o composto 1 mostrou forte

seletividade para células tumorais, enquanto que o seu derivado foi apenas

parcialmente seletivo. Estudos feitos em células HL-60 indicaram que o composto 2

induz morte celular por apoptose como mostrado pelas mudanças morfológicas,

fragmentação do DNA, despolarização da membrana mitocondrial e externalização

da fosfatidilserina. Ambos compostos aumentaram a geração de espécies reativas

de oxigênio (EROs). Nossos resultados sugerem que a introdução do radical

nitrofenilamino na posição 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade da nor-β-

lapachona em células HL-60. Esses achados apontam para o potencial dessas

quinonas sintéticas como modelo para a produção de novos compostos com

propriedades anticâncer.

Palavras-chave: Leucemia Promielocítica Aguda; Naftoquinonas; Testes de

Toxicidade; Apoptose.

ABSTRACT

The quinone moiety has been identified as an important pharmacophoric

group for cytotoxic activity of several compounds clinically used, constituting just one

of the major classes of anticancer agents. β-lapachone is one of the most studied

quinones in the last years. Its most important applications are related to its action

against several cancer cells. Its derivative, nor-β-lapachone (compound 1), has

similar anticancer activity. Thus, the aim of this work was to evaluate the mechanism

of action involved in nor-β-lapachone and its nitrophenylamino derivative (compound

2) cytotoxicity in a leukemia cells model of HL-60 cell line. Initially it was investigated

the effect of both the compounds on HL-60 cells viability after 24 hours of incubation,

showing IC50 values of 2.92 and 0.48 µM to compounds 1 and 2, respectively.

Considering the selectivity, compound 1 showed strong selectivity to cancer cells,

while its derivative was only partially selective. Studies performed in HL-60 cells, after

24 hours, indicated that compound 2 induces cell death by apoptosis as showed by

morphological changes, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization

and phosphatidylserine externalization. Both tested compounds increased generation

of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest that a nitrophenylamino

radical introduction at position 3 of the furane ring enhances the cytotoxicity of nor-β-

lapachone in HL-60 cell line. These findings highlight the potential of these synthetic

quinones as prototypes molecules to produce new compounds with anticancer

properties.

Keywords: Leukemia Promyelocytic Acute; Naphthoquinones; Toxicity Tests;

Apoptosis.

LISTA DE FIGURAS

1 - Esquema das fases do ciclo celular......................................................... 16

2 - Esquema das fases da mitose................................................................ 18

3 - Esquema dos pontos de checagem do ciclo .......................................... 19

4 - Características morfológicas dos principais tipos de morte celular....................................................................................................... 22

5 - Esquema da via intrínsica da apoptose................................................... 26

6 - Esquema da via extrínsica da apoptose.................................................. 27

7 - Estruturas do paclitaxel e seu análogo docetaxel................................... 30

8 - Estruturas da vimblastina e vindesina..................................................... 30

9 - Estruturas da camptotecina e seus derivados irinotecano e topotecano............................................................................................... 31

10 - Estruturas de quinonas utilizadas na terapia anticâncer......................... 32

11 - Estruturas dos principais grupos de quinonas (benzo-, nafto- e antraquinona)........................................................................................... 33

12 - Estruturas do lapachol e da β-lapachona................................................ 34

13 - Ciclo redox das quinonas: redução de quinonas a semiquinonas e hidroquinonas.......................................................................................... 36

14 - Estruturas da nor-β-lapachona (composto 1) e seu derivado nitrofenilamino (composto 2)................................................................... 39

15 - Efeito dos compostos 1 e 2 na viabilidade de células leucêmicas HL-60 determinado por exclusão de azul de tripan após 24 horas de incubação................................................................................................. 53

16 - Análises morfológicas de células HL-60 por coloração de May-Grünwald-Giemsa após 24 horas de incubação como os compostos 1 e 2............................................................................................................

55

17 - Efeito dos compostos 1 e 2 na viabilidade de células HL-60 coradas com LA/BE determinado por microscopia de fluorescência após 24 horas de incubação................................................................................. 56

18 - Efeito dos compostos 1 e 2 em células HL-60 sobre a densidade celular determinada por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo após 24 horas de incubação....................................................

57

19 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a integridade de membrana de células leucêmicas HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação...................................

58

20 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a fragmentação de DNA de células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação................................................................................................ 59

21 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a distribuição do ciclo celular em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação................................................................................................ 60

22 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre o potencial transmembrânico em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando rodamina 123, após 24 horas de incubação............................ 61

23 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a externalização da fosfatidilserina em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando Anexina V-PE e 7-AAD, após 24 horas de incubação................................................................................................ 62

24 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a geração de EROs em células HL-60 determinado por citometria de fluxo utilizando H2-DCF-DA, após 1 e 3 horas de incubação.............................................................................. 63

LISTA DE TABELAS

1 - Efeito dos compostos 1 e 2 na citotoxicidade de células leucêmicas (HL-60) e normais (CMSP) após 24 horas de incubação................................................................................................. 52

2 - Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a incorporação do BrdU em células HL-60 após 24 horas de incubação......................................................... 54

LISTA DE ABREVIATURAS

AIF Fatores de indução de apoptose

APAF-1 Fator apoptótico ativado por protease

ANOVA Análise de variância

7AAD 7 amino-actinomicina

BrdU Bromodeoxiuridina

CMSP Células Mononucleares de Sangue Periférico

DAB Diaminobenzidina

DCF Diclorofluoresceina

DISC Complexo de sinalização indutor de morte

DMSO Dimetilsulfóxido

E.P.M. Erro Padrão da Média

EROs Espécies reativas de Oxigênio

FADD Domínio de morte associado ao Fas

H2-DCF-DA Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina

IAP Inibidores de apoptose

ICAD Inibidor de DNase ativada por caspase

LA/BE Laranja de Acridina/ Brometo de Etídio

LMC Leucemia mielóide crônica

MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium

NAC N-acetil-L-cisteína

NQO1 NAD(P)H: quinona oxirredutase

PARP Poli (ADP-ribose) polimerase

PBS Phosphate Buffer Solution (Tampão Fosfato)

PE Ficoertitrina

PI Iodeto de propídeo

PMA Forbol-12-miristato-13-acetato

PS Fosfatidilserina

RPMI Roswell Parrk Memorial Institute Medium

TNF Fator de necrose tumoral

TNFR Receptores do fator de necrose tumoral

U Unidade

UV Ultra-Violeta

∆Ψm Potencial transmembrânico da mitocôndria

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 16

1.1 Câncer ......................................................................................................... 16

1.2 Morte celular ............................................................................................... 21

1.3 Produtos naturais e a importância da síntese qu ímica .......................... 28

1.4 Quinonas ..................................................................................................... 32

2 OBJETIVOS ................................................................................................ 38

2.1 Geral ............................................................................................................ 38

2.2 Específicos .................................................................................................. 38

3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 39

3.1 Materiais utilizados .................................................................................... 39

3.2 Metodologias experimentais ..................................................................... 39

3.2.1 Síntese das quinonas.................................................................................. 39

3.2.2 Estudo da atividade citotóxica..................................................................... 39

3.2.2.1 Avaliação da atividade citotóxica – Teste do MTT...................................... 40

3.2.2.2 Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro – Alamar Blue.............................................................................................................. 41

3.2.3 Estudo do mecanismo de ação em células HL-60....................................... 42

3.2.3.1 Avaliação da atividade antiproliferativa em células leucêmicas HL-60 através da exclusão por azul de tripan......................................................... 42

3.2.3.2 Avaliação da atividade antiproliferativa através da incorporação do BrdU............................................................................................................. 43

3.2.3.3 Análise morfológica-Coloração por May-Grünwald-Giemsa...................... 44

3.2.3.4 Coloração diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina......................................................................................................... 45

3.3 Citometria de fluxo ..................................................................................... 46

3.3.1 Determinação da integridade de membrana celular.................................... 46

3.3.2 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA..................................... 47

3.3.3 Determinação do Potencial Transmembrânico Mitocondrial....................... 48

3.3.4 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina (PS)........................... 48

3.3.5 Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) intracelulares................................................................................................ 49

4 RESULTADOS ............................................................................................. 51

4.1 Citotoxicidade dos compostos 1 e 2 em células H L-60.......................... 51

4.2 Mecanismo de ação dos compostos 1 e 2 ............................................... 52

4.3 Análise das mudanças morfológicas ....................................................... 54

4.4 Análise da citometria de fluxo .................................................................. 57

5 DISCUSSÃO............................................................................................... 64

6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 72

REFERÊNCIAS........................................................................................................ 73

ANEXO...................................................................................................................... 91

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

A integridade contínua de todo organismo depende da habilidade de seus

componentes celulares de manter a fidelidade do material genético durante a divisão

celular. A principal tarefa do ciclo celular é, portanto, permitir e garantir a replicação

do DNA livre de erros, a segregação cromossômica e a citocinese (FISCHER et al.,

2004).

O ciclo celular é uma seqüência intrínseca de eventos que permite o

crescimento e a replicação das células. É o mecanismo que governa o destino das

células, interpreta os sinais de crescimento recebidos e decide se a célula deve

continuar sua proliferação (FOSTER, 2008). O ciclo celular é subdividido em quatro

subfases: G1, S, G2 e M (VERMEULEN et al., 2003) (Figura 1).

Figura 1: Esquema das fases do ciclo celular

No estado de não-crescimento ou não-competência (fase G0), as células

permanecem quiescentes até que algum estímulo as induza ao estado de

competência ou crescimento, onde se inicia o processo de replicação do DNA e

culmina com a divisão celular (LOURO et al., 2002).

17

As células que estiverem aptas a se replicar movem-se da fase G0 (fase de

repouso) para a fase G1 do ciclo, entrando então na fase de síntese de DNA (fase

S). A fase S é seguida pela fase G2, onde as células se preparam para entrar na

mitose e se dividir (HARTWELL; KASTAN, 1994).

A fase G1 (primeiro intervalo) do ciclo celular precede o início da síntese de

DNA (fase S). É nesta fase que proteínas e RNA são sintetizados e que ocorre a

estimulação do crescimento celular ou a parada temporária (fase G0) da mesma. A

decisão crítica é tomada em uma fase de transição que é chamada de ponto de

restrição ou ponto R. Tendo passado o ponto de restrição no final da fase G1, a

célula entrará na fase S, onde a síntese de DNA ocorre (KING et al., 1996; LOURO

et al., 2002).

Na fase de síntese (fase S), todo o DNA deve ser fidedignamente replicado.

Após essa fase, uma célula pode estar pronta para entrar diretamente na fase M

(mitose), no entanto, a maioria das células retarda a entrada nessa fase para um

segundo intervalo (fase G2), onde o ciclo celular é interrompido para que os sistemas

de reparo do DNA possam conferir e corrigir erros, excisar adutos e substituir bases

erradas antes do prosseguimento do ciclo (LOURO et al., 2002; WEINBERG, 2008).

Assim, os processos de reorganização geral na síntese celular ocorrem durante a

fase G2, incluindo a regulação do dano não reparado do DNA (FOSTER, 2008).

Durante a mitose, as células que estão se proliferando sofrem várias

mudanças estruturais e morfológicas, que são caracterizadas por condensação da

cromatina, formação do fuso, fragmentação do envelope nuclear e reorganização do

citoesqueleto (VAKIFAHMETOGLU et al., 2008). A fase M (mitose) constitui-se

principalmente de quatro subfases distintas: prófase, metáfase, anáfase e telófase,

que culmina com a citocinese e divisão do citoplasma, resultando em duas novas

células (JACKSON et al., 2007; WEINBERG, 2008) (Figura 2).

18

Figura 2: Fases da mitose Fonte: Adaptada de Jackson et al. (2007)

Para garantir a estabilidade genética, o ciclo celular possui os pontos de

checagem, também conhecidos como checkpoints, que são mecanismos

responsáveis pelo monitoramento dos eventos celulares e impedem a proliferação

de células com algum dano não reparado (LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008;

WEINBERG, 2008). Os pontos de checagem impõem um controle de qualidade para

assegurar que a célula tenha completado apropriadamente todos os requisitos de

uma fase do ciclo celular antes de ser autorizada a avançar para a próxima fase.

Assim, os checkpoints operam ao longo de todo o ciclo celular (FOSTER, 2008).

Atualmente, três checkpoints são descritos: Checkpoint de dano do DNA, que está

apto a bloquear o ciclo celular nas fases G1, S, G2 e mitose; Checkpoint de

replicação do DNA, que monitora a progressão através da fase S; Checkpoint do

fuso mitótico (“mitotic spindle checkpoint”), que monitora a ligação dos cromossomos

aos microtúbulos (FISCHER et al., 2004; FOSTER, 2008). (Figura 3).

19

Figura 3: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular

A ativação de um ponto de checagem possibilitará o reparo das lesões

detectadas. Caso o reparo não seja possível, o ciclo celular será interrompido ou a

célula será induzida a morte (FISCHER et al., 2004).

Nas células tumorais, os checkpoints são freqüentemente ignorados,

resultando em instabilidade genética e conseqüente vantagem proliferativa de

células cancerosas, quando comparadas com as células normais (FISCHER et al.,

2004). As células tumorais mostram uma perda no controle da proliferação celular

(ponto de restrição) e, muitas vezes, tornam-se independentes de sinais mitogênicos

para a sua progressão através das diferentes fases do ciclo celular (HANAHAN;

WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002). A perda do controle da proliferação celular

envolve mutações em genes reguladores do ciclo celular, os proto-oncogenes e

genes supressores tumorais, o que caracteriza o câncer como uma doença genética

(LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Dessa forma, as alterações nos mecanismos

de regulação do ciclo celular tornam a célula apta a passar pelo ciclo celular sem a

devida checagem e, portanto fazendo com que esta acumule uma série de mutações

20

que contribuem para o surgimento das características malignas do tumor, como

auto-suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos

inibidores de crescimento, evasão da morte celular programada (apoptose),

potencial replicativo ilimitado, angiogênese e invasão tecidual e metástase

(HANAHAN; WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Portanto, as

células cancerosas diferem das células normais, pelo fato de continuarem a crescer

e se dividir, não obedecendo ao controle biológico natural do organismo (HANAHAN;

WEINBERG, 2000).

Mesmo após importantes avanços no entendimento das neoplasias, o câncer

apresenta-se como a segunda causa de morte por doenças no mundo, sendo

diagnosticados cerca de 10 milhões de novos casos a cada ano (SCHOTTENFELD;

BEEBE-DIMMER, 2005). Nos Estados Unidos avalia-se que metade dos homens e

um terço das mulheres irão desenvolver cânceres durante suas vidas (AMERICAN

CANCER SOCIETY, 2007). No Brasil, as estimativas para o ano de 2009 apontam

que ocorrerão cerca de 466.730 novos casos de câncer (BRASIL, 2009).

Atualmente, as terapias anticâncer mais usadas, após a cirurgia, são a

quimioterapia, a radiação ionizante, a imunoterapia e a terapia gênica (KUMAR et

al., 2004). A quimioterapia consiste em um tratamento a base de fármacos que

interferem no processo de crescimento e divisão celular de células cancerígenas

(SOUZA et al., 2007). O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células

neoplásicas, preservando as células normais (FULDA; DEBATIN, 2004).

No entanto, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o

tratamento do câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado por

causa de falhas nos esquemas terapêuticos, altos índices de recidivas, redução da

sobrevida dos pacientes e dos efeitos adversos, o que leva a uma contínua busca

por novos fármacos (SALGALLER; LODGER, 1998). O fármaco ideal deve aumentar

a especificidade, protegendo tecidos normais, minimizar o desconforto dos pacientes

e aumentar a eficácia, resultando na erradicação da massa heterogênea do tumor

(BRANNON-PEPPAS; BLANCHETTE, 2004). Diante desse quadro, é importante que

novas estratégias como o restabelecimento do controle do ciclo celular com drogas

que agem nos pontos de checagem, possam ser disponibilizadas como uma

estratégia viável na terapia anticâncer (FISCHER et al., 2004).

21

Nos últimos anos, muitos pesquisadores têm focado seus estudos para

compreender as alterações moleculares e genéticas responsáveis pela malignidade

dos tumores. Dentre as terapias mais modernas, destaca-se a terapia-alvo. Esta tem

como objetivo agir em alvos presentes somente em células tumorais, alvos estes

com o papel na carcinogênese e na sobrevida dessas células (ROSA et al., 2008).

Dentre as drogas-alvo em uso clínico podemos citar o mesilato de imatinib

(Glivec®), um inibidor de tirosina quinase (Bcr-Abl) que se destacou no tratamento de

leucemia mielóide crônica (LMC) (DRUKER et al., 2001), e ao Trastuzumab

(Herceptin®), um anticorpo monoclonal humanizado utilizado em pacientes com

câncer de mama HER2 positivo (SLAMON; PEGRAM, 2001; SLAMON et al., 2001;

PICCART-GEBHART et al., 2005; JOENSUU et al., 2006). Dessa maneira, o uso de

quimioterápicos no tratamento antineoplásico tem como finalidade induzir a morte

das células tumorais (FULDA; DEBATIN, 2004) sem, no entanto atingir as células

normais, ou que, se houver algum efeito tóxico, que este seja reduzido nas células

normais.

1.2 Morte celular

O equilíbrio entre a proliferação e a morte celular regula e controla o número

de células no organismo. A cascata de eventos, bioquímicos e fisiológicos, que leva

a mudanças na síntese de macromoléculas, na homeostase celular, na regulação do

volume celular, e finalmente na perda da viabilidade celular está intimamente

relacionada às mudanças morfológicas características de cada tipo de morte celular

(TINARI et al., 2008).

A morte celular pode ser classificada de acordo com sua aparência morfológica

(apoptose, necrose, autofagia ou catástrofe mitótica – Figura 4), critérios com base

em enzimas (com ou sem o envolvimento de nucleases ou de classes distintas de

proteases, tais como caspases, catepsinas e glutaminases), aspectos funcionais

(programada ou acidental, fisiológica ou patológica) ou características imunológicas

(imunogênicas ou não imunogênicas) (MELINO, 2001; OKADA; MAK, 2004;

GALLUZZI et al., 2007).

22

Figura 4: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia. Fonte: Bruin e Medema (2008)

A morte celular programada é uma forma geneticamente controlada de

suicídio celular que é crucial para o desenvolvimento e homeostase de organismos

multicelulares (KIM et al., 2006). São descritos três tipos de morte celular

programada (BURSCH et al., 2000; KIM, 2005):

� Tipo I: é a morte celular por apoptose, que inclui mudanças morfológicas tais

como compactação celular, prolongamentos da membrana plasmática,

chamados de “blebbing”, e extensiva condensação da cromatina e

fragmentação internucleossomal de DNA.

� Tipo II: é a morte celular por autofagia. Esta é caracterizada pela formação de

vacúolos autofágicos no citoplasma de células que estão em processo de

morte.

� Tipo III: é a morte celular por necrose, onde a célula perde rapidamente a sua

integridade de membrana, extravasando seu conteúdo intracelular.

23

A expressão “catástrofe mitótica” tem sido utilizada para definir um processo

que pode levar a morte celular. Ainda não há uma definição totalmente aceita para

esse termo, no entanto alguns pesquisadores definiram catástrofe mitótica, em

termos morfológicos, como um tipo de morte celular resultante de mitose aberrante,

que geralmente culmina na formação de células grandes micronucleadas e

cromatina descondensada (SWANSON et al., 1995; IANZINI; MACKEY, 1997;

RONINSON et al., 2001).

A apoptose é caracterizada por ser uma via de morte essencial para a

homeostase do organismo, sendo responsável pelo controle da população celular

em tecidos específicos, nos órgãos e estruturas em formação (LOURO et al., 2002).

O processo de morte na apoptose ocorre de maneira altamente controlada,

permitindo a fagocitose dos componentes das células danificadas, evitando assim

uma resposta imune e subseqüente processo inflamatório (VAN CRUCHTEN; VAN

DEN BROECK, 2002).

O processo apoptótico é caracterizado por mudanças morfológicas típicas e

bem definidas, além da formação de corpos apoptóticos que contém material nuclear

e citoplasmático que são subseqüentemente fagocitados por macrófagos, não

havendo assim extravasamento de material pró-inflamatório (KERR et al., 1972)

(Figura 4). Dentre as mudanças bioquímicas características da apoptose estão a

clivagem proteolítica por caspase (RICCI; ZONG, 2006), externalização da

fosfatidilserina (PS) (FADOK et al., 1992; DENECKER et al., 2001), mudanças na

permeabilidade da membrana mitocondrial com perda do potencial de membrana

(KROEMER; REED, 2000; RICCI; ZONG, 2006), liberação de proteínas presentes

no espaço intermembranar da mitocôndria (VAN LOO et al., 2002), dentre outras.

Há duas vias distintas de sinalização molecular que levam à morte celular por

apoptose, a via intrínseca ou mitocondrial e a via extrínseca ou via do receptor de

morte (NAGATA, 1997; CORY; ADAMS, 2002; DANIAL; KORSMEYER, 2004;

GRIVICICH et al., 2007).

A via intrínseca é geralmente ativada em resposta a sinais de estresse intra

e/ou extracelulares. Os sinais de estresse intracelulares tais como danos ao DNA,

altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), hipoxia, infecção viral e

24

ativação de oncogenes (HENGARTNER, 2000; RICCI; ZONG, 2006; BRUIN;

MEDEMA, 2008) levam à permeabilização da membrana mitocondrial externa.

Além da função de produzir energia na forma de ATP, a mitocôndria atua em

um papel crítico na regulação da morte celular por apoptose. A permeabilização da

membrana mitocondrial induz a formação de poros por onde são liberadas pequenas

moléculas do seu espaço intermembranar (PARONE et al., 2002; KIM et al., 2006).

Essas moléculas são proteínas apoptogênicas que incluem citocromo c (LIU et al.,

1996), Smac/DIABLO (DU et al., 2000), AIF (Fatores de indução de apoptose)

(SUSIN et al., 1999) e endonuceases (LI et al., 2001), resultando em apoptose

caspase dependente e caspase independente (DONOVAN; COTTER, 2004).

Um dos reguladores mais importantes da abertura desses poros são

membros da família de proteínas Bcl-2 anti- e pró-apoptóticas, tais como Bcl-2/BclXL

e Bax/Bak, respectivamente. Estas proteínas atuam na membrana externa da

mitocôndria e são responsáveis pelo controle do fluxo de proteínas apoptogênicas

através de canais especializados. Esses canais regulam a saída do citocromo c bem

como de outras proteínas que são liberadas da mitocôndria para o citosol (ROSSÉ

et al., 1998; WEINBERG, 2008). O citocromo c fica aprisionado no espaço

intermembranar da mitocôndria, onde atua na transferência de elétrons como parte

da fosforilação oxidativa (HIRSCH et al., 1997; WEINBERG, 2008).

Durante o processo de apoptose, as moléculas de citocromo c são liberadas

para o citosol (HIRSCH et al., 1997) onde se associa a proteína Apaf-1 (fator

apoptótico ativado por protease), ATP e a procaspase 9 para formar um complexo

denominado apoptossomo (LI et al., 1997; BUDIHARDJO et al., 1999; ACEHAN et

al., 2002). Diferente das outras caspases, a procaspase 9 não é ativada por uma

simples clivagem, ela precisa estar ligada à Apaf-1 para ser ativada (RODRIGUEZ;

LAZEBNIK, 1999; STENNICKE et al., 1999; ZOU et al., 1999). O apoptossomo pode

então recrutar a procaspase 3, que é clivada e ativada pela caspase 9 ativa. A

caspase 3 então ativa outras caspases executoras constituindo uma cascata de

sinalização que culmina com a clivagem de vários substratos de morte tais como

ICAD (inibidor de DNase ativada por caspase), laminas da superfície interna da

membrana nuclear, proteínas do citoesqueleto, como a actina, plectina e vimentina,

25

que leva as conhecidas mudanças morfológicas da apoptose ocorrendo a morte

celular (Figura 5) (LI et al., 1997; REED, 1997; WEINBERG, 2008).

Enquanto o citocromo c atua na ativação de caspases, outra proteína

conhecida como Smac/DIABLO que também é liberada da mitocôndria juntamente

com o citocromo c, atua inibindo um grupo de proteínas antiapoptóticas chamadas

de IAPs (inibidores de apoptose). Proteínas da família IAP podem se ligar e inibir

sítios ativos das caspases 3, 6 e 7, bloqueando-as ou pela inibição da atividade

proteolítica das caspases ou por degradá-las. Entretanto, quando a Smac/DIABLO é

liberada da mitocôndria, ela é capaz de antagonizar esses IAPs protegendo as

caspases da inibição por essas moléculas, permitindo a continuidade do processo

apoptótico (Figura 5) (DU et al., 2000; VERHAGEN et al., 2000; EKERT et al., 2001;

SUZUKI et al., 2001; WEINBERG, 2008).

26

Figura 5: Esquema da via intrínseca da apoptose. Fonte: Weinberg (2008)

A via extrínseca é induzida por receptores de morte que estão localizados na

superfície da célula (VAN CRUCHTEN; VAN DEN BROECK, 2002). Tais receptores

de morte pertencem a família dos receptores do fator de necrose tumoral (TNFR)

que incluem Fas, TNFR1, DR3, DR4 e DR5 (Figura 7) (LOCKSLEY et al., 2001) e

estão envolvidos na transdução de sinais que resultam na morte celular

(ZIMMERMANN et al., 2001).

Os ligantes dos receptores de morte são membros da família de proteínas do

fator de necrose tumoral (TNF), que inclui TNF-α, TRAIL e ligante Fas (FasL). Uma

27

vez ativados pela ligação de seus ligantes, os domínios de morte desses receptores

ligam-se e ativam uma proteína associada denominada FADD (domínio de morte

associado à Fas) no citoplasma (CHINNAIYAN et al., 1995; CHINNAIYAN et al.,

1996). O complexo resultante é chamado DISC (complexo de sinalização indutor de

morte) que atua na conversão das procaspases iniciadoras (8 e/ou 10) em suas

respectivas caspases ativas através de clivagem autoproteolítica (Figura 6)

(DONEPUDI et al., 2003; WEINBERG, 2008). Após ativação das procaspases 8 e

/ou 10 em suas caspases ativas, estas últimas convergem na cascata apoptótica

intrínseca clivando e ativando as caspases executoras (3, 6 e 7) culminando assim

com morte celular por apoptose (BUDIHARDJO et al., 1999; WEINBERG, 2008).

Figura 6: Esquema da via extrínseca da apoptose Fonte: Weinberg (2008)

Ao contrário da apoptose, a necrose tem sido considerada como uma forma

descontrolada de morte celular (BRUIN; MEDEMA, 2008), no entanto trabalhos

28

recentes sugerem que a necrose também pode ocorrer através de uma morte celular

programada (BURSCH et al., 2000; KIM, 2005). Esse processo constitui uma forma

de morte celular passiva e independente de energia (PROSKURYAKOV et al.,

2003). Os marcos desse tipo de morte envolve alterações dramáticas na

mitocôndria, incluindo despolarização mitocondrial, depleção de ATP, geração de

EROs (espécies reativas de oxigênio), perda da homeostase de cálcio, além de

causar vacuolização citoplasmática, perda de integridade da membrana, inchaço da

célula seguido de lise completa, sem formações de vesículas, e desintegração das

organelas. O rompimento brusco da membrana plasmática causa extravasamento

de mediadores inflamatórios como citocinas e pirógenos desencadeando o processo

inflamatório (LOURO et al., 2002; RODRIGUES et al., 2006; ZONG; THOMPSON,

2006). A necrose não é observada durante o processo normal de eliminação celular,

que ocorre durante o desenvolvimento e a homeostase de tecidos normais

(SCHWARTZ; OSBORNE, 1993). A necrose ocorre tipicamente em grupos de

células adjacentes expostas as mesmas condições não fisiológicas, levando a uma

amplificação da lesão ao tecido afetado (DUVALL; WYLLIE, 1986).

Zong e Thompson (2006) sugeriram que algumas formas de necrose não são

processos passivos, mas uma via bastante regulada, semelhante a apoptose. Esse

tipo de necrose estaria presente nas doenças neurodegenerativas, doenças

inflamatórias, infecções e câncer, bem como em outros processos. Dentre as

características morfológicas da necrose programada estão a despolarização

mitocondrial, ativação de proteases (não-caspase), perda da homeostase de cálcio,

depleção de ATP e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs).

1.3 Produtos naturais e a importância da síntese qu ímica

Os recursos naturais renováveis como plantas, microorganismos,

invertebrados e vertebrados, de uma forma geral, são fontes extremamente

importantes de compostos bioativos (MANN, 2002). E, apesar do interesse na

modelagem molecular, na química combinatória e outras técnicas de síntese

química pelas instituições de pesquisa e indústrias farmacêuticas, os produtos

naturais são uma importante fonte de novos agentes terapêuticos contra doenças

infecciosas, câncer, dislipidemias e imunomodulação (ROCHA et al., 2001;

NEWMAN et al., 2003; BUTLER, 2004). Em 1982, Hartwell listou mais de 3000

29

espécies de plantas que tinham sido usadas no tratamento de cânceres

(HARTWELL, 1982).

A importância da diversidade química dos produtos naturais e seus derivados

para a descoberta de novos fármacos têm despertado interesse da indústria

farmacêutica. Em 2005, a Sociedade Americana de Química destacou uma lista de

46 fármacos que tiveram um enorme impacto na saúde, onde, dentre estas 80% são

compostos sintéticos, que vão desde a aspirina (ácido acetil salicílico), com

estrutura química simples, sendo o analgésico mais utilizado no mundo, ao taxol

(paclitaxel) com estrutura química complexa, usado no tratamento de neoplasias,

entre outros (DAEMMRICH; BOWDEN, 2005).

Nos últimos 50 anos, as pesquisas de novas moléculas levaram a descoberta

de mais de 100 novos fármacos que adentraram ao arsenal para o tratamento de

neoplasias malignas, sendo, na sua maioria, derivados ou protótipos de produtos

naturais (WAGNER-DÕBLER et al., 2002). O paclitaxel (Taxol), um diterpeno

isolado inicialmente da Taxus brevifloria Nutt. (Taxaceae) como agente citotóxico

(KINGSTON, 1996; KINGSTON, 2005) atuando como inibidor do crescimento celular

impedindo a despolimerização dos microtúbulos (BARREIRO; FRAGA, 2002), é um

exemplo interessante que demonstra a importância da síntese ou semi-síntese

química na descoberta de novos agentes anti-neoplásicos. Devido à dificuldade de

isolamento e baixo rendimento, somente após 20 anos de sua descoberta, o

Paclitaxel foi utilizado para testes clínicos. No entanto, para produzir 360g do

composto, cerca de 4000 árvores foram sacrificadas, tornando inviável seu uso

(MANN, 2002). Este problema somente foi solucionado quando Potier e seus

colaboradores descobriram que das folhagens de Taxus baccata poderia se extrair

uma quantidade maior de um precursor, 10-deacetilcaccatin III, que facilmente

poderia ser convertido em Paclitaxel e em análogos mais potentes como o Docetaxel

(Taxotere) (GUERITTE-VOEGELIN et al., 1991). Este último é um taxóide, semi-

sintético, duas vezes mais potente que o composto natural (Figura 7) (BARREIRO;

FRAGA, 2002).

30

Figura 7: Estrutura do paclitaxel e seu análogo docetaxel

De fato, o melhor impacto de compostos isolados de plantas como protótipo

para novas drogas é percebido na área do tratamento de neoplasias (NEWMAN et

al., 2003). Neste aspecto, pode-se citar além do paclitaxel, a vimblastina e vincristina

(Catharanhtus roseus G. Don) com o análogo vinorelbina e vindesina (Figura 8)

(JOHNSON et al., 1996), Camptotecina (Camptotheca acuminata Decne) com os

análogos irinotecano e topotecano (Figura 9), entre outros, todos usados no

tratamento de diferentes tipos de câncer (SCHWARTSMANN et al., 2002). O

sucesso terapêutico dessas substâncias estimula a procura de novos agentes

quimioterápicos derivados de produtos naturais mais ativos e com menos efeitos

colaterais. Assim, há uma maior probabilidade de se encontrar uma droga

promissora no âmbito terapêutico e/ou preventivo do câncer.

Figura 8: Estruturas da vimblastina e do seu derivado vindesina

31

Figura 9: Estruturas da camptotecina e dos derivados irinotecano e topotecano

Como dito anteriormente, os produtos naturais de uma forma direta ou

indiretamente constituem um potente arsenal na busca de novas drogas com

atividade antitumoral. Nesse contexto, as quinonas se apresentam como um

composto químico de grande interesse para indústria farmacêutica. Dentre as várias

quinonas utilizadas na terapia anticâncer podemos citar a daunorrubicina, a

doxorrubicina e a mitoxantrona (ASCHE, 2005) (Figura 10).

32

Figura 10: Estruturas quinonas utilizadas na terapia anticâncer

1.4 Quinonas

As quinonas representam uma importante classe de compostos de ocorrência

natural ou produto de síntese com uma grande variedade de funções (THOMSON,

1987; ASCHE, 2005). O esqueleto quinona foi identificado como um importante

grupo farmacofórico para a atividade citotóxica de vários compostos utilizados na

clínica (DRISCOLL et al., 1974; LIU et al., 2004), constituindo ainda uma das

maiores classes de agentes anti-tumorais (ASCHE, 2005).

As quinonas são compostos orgânicos que podem ser considerados como

produtos da oxidação de fenóis; da mesma forma, a redução de quinonas pode

também originar os correspondentes fenóis, sendo uma reação de dois sentidos.

Sua principal característica é a presença de dois grupos carbonílicos que formam

um sistema conjugado com pelo menos duas ligações duplas C-C. Assim, em

função do ciclo no qual o sistema de duplas e cetonas conjugadas está inserido,

têm-se os três grupos principais de quinonas: benzoquinonas – um anel benzênico;

33

naftoquinonas - um anel naftalênico; antraquinonas - um anel antracênico (Figura

11) (SIMÕES et al., 2002).

Figura 11: Estruturas dos principais grupos de quinonas: benzoquinona (A), naftoquinona (B) e antraquinona (C)

As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de

distribuição natural. Em estudos farmacológicos, as quinonas mostram variadas

atividades destacando-se, dentre outras, as propriedades microbicidas, anti-

inflamatórias e antitumorais (MONKS et al., 1992).

Drogas que possuem um grupamento quinona tais como antraquinonas e

mitoxantronas apresentam uma excelente atividade anti-neoplásica na clínica

oncológica, sendo bastante aceito que a citotoxicidade de quinonas esteja

relacionada à geração de espécies reativas de oxigênio, além da inibição da enzima

topoisomerase-II, levando a quebra da molécula de DNA (MATES; SÁNCHEZ-

JIMÉNEZ, 2000). No entanto, a contribuição exata da subestrutura quinona para

seu efeito antitumoral permanece incerta (ASCHE, 2005).

O lapachol e seus derivados estão associadas com numerosas atividades

biológicas como bactericida, fungicida, anti-malária, tripanossomicida e antitumoral

(GUIRAUD et al., 1994; de ANDRADE-NETO et al., 2004; RAVELO et al., 2004;

FERREIRA et al., 2006).

A β-lapachona (3,4-diidro-2,2-dimetil-2H-naftol [1,2-b] piran-5,6-diona) é o

derivado mais importante do lapachol com atividade antitumoral promissora (Figura

12). β-lapachona é uma orto-naftoquinona naturalmente obtida de uma árvore nativa

da América do Sul, Tabebuia avellanedae (SCHAFFNER-SABBA, 1984). Este

composto apresenta um amplo leque de atividades farmacológicas, tais como

34

atividades antibacteriana, antifúngica, tripanossomicida, anti-retroviral e

antiinflamatória (LOPES et al., 1978; SCHUERCH; WEHRLI, 1978; GOIJMAN;

STOPPANI, 1985; GUIRAUD et al., 1994; MANNA et al., 1999). Além disso, a β-

lapachona é um potente agente anticâncer, sendo efetivo contra uma variedade de

células tumorais humanas (SCHAFFNER-SABBA, 1984; PLANCHON et al., 1995;

2001; LI et al., 1999a, PINK et al., 2000a, 2000b), inibindo até mesmo tumores

resistentes a terapias convencionais (LI et al., 1995; PLANCHON et al., 1995; OUGH

et al., 2005).

Figura 12: Estruturas do lapachol e da β-lapachona.

O mecanismo exato do efeito citotóxico desse composto permanece

desconhecido, no entanto, alguns estudos mostraram que a β-lapachona causa

parada em fases específicas do ciclo celular podendo levar à apoptose (LI et al.,

1993; PLANCHON et al., 1995; LI et al., 1995; LI et al., 1999b) ou à necrose (LI et

al., 1999b) dependendo da célula alvo, tempo e da dose testada (WELLER et al.,

1997). O processo de morte induzido por esta quinona é independente de dano

direto ao DNA (PARDEE et al., 2002).

Suas atividades podem ser atribuídas a geração de espécies reativas de

oxigênio (EROs), que é conhecido por causar apoptose em células de leucemia

humana (PLANCHON et al., 1995; PINK et al., 2000b; TAGLIARINO et al., 2001),

desprogramar a síntese de DNA (KUMAR; HARVEY, 1995) e inibir enzimas como

topoisomerases I (LI et al., 1993) e II (FRYDMAN et al., 1997), causar clivagem da

35

poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase 3 e aumentar a atividade proteolítica

da procaspase 9 (GUPTA et al., 2002).

A geração de EROs intracelular é um processo inevitável e muitas vezes

fisiologicamente importantes (SKULACHEV, 1996). As EROs podem ser produzidas

durante a respiração celular na mitocôndria e por sistemas enzimáticos distintos,

incluindo aquelas dos peroxissomos e a oxidação espontânea de lipídeos

(KAMATA; HIRATA, 1999; WEINBERG, 2008). Dentre as EROs liberadas da

mitocôndria estão o íon superóxido (O2 •–), o oxigênio singlet, o peróxido de

hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxilas (•OH) (WEINBERG, 2008).

As EROs possuem papéis bastante controversos. Em situações de não

estresse elas atuam promovendo a proliferação celular, no entanto, na presença de

estresse, parecem ativar e modular a morte celular via apoptose e/ou necrose.

Segundo Jabs (1999), os níveis de EROs são aumentados em células expostas a

situações de estresse, incluindo o tratamento com drogas anticâncer que irão

promover a ativação de proteínas pró-apoptóticas, induzindo a morte celular

(BENHAR et al., 2001; DAVIS et al., 2001; TOBIUME et al., 2001). As Eros também

podem atuar diretamente na maquinaria apoptótica por acelerar a despolarização

mitocondrial e disfunção durante a fase efetora da apoptose (JABS, 1999). Assim, a

mitocôndria é a maior fonte de EROs durante o curso da apoptose (CAI; JONES,

1999).

Um dos campos de pesquisa bastante explorado atualmente para o

tratamento de diversos tipos de câncer, consiste no desenvolvimento de novas

drogas que sejam capazes de promover a geração de EROS (VERMA, 2006;

RIDNOUR et al., 2006), tais como quinonas (KOVACIC; SOMANATHAN, 2006),

compostos nitroaromáticos (TOCHER, 1997) e sais imino (KOVACIC; BECVAR,

2000; KOVACIC; COOKSY, 2005). Estudos anteriores mostraram que alguns tipos

de câncer apresentam-se em um elevado estado de estresse oxidativo, mesmo

quando sua maquinaria antioxidante trabalha em capacidade máxima. Alguns

autores sugerem que em níveis mais elevados de EROs, as células tumorais sofrem

danos que podem levá-las à morte, enquanto que células normais não são afetadas.

Assim, compostos geradores de EROs podem mostrar seletividade para alguns tipos

de células tumorais (PELICANO et al., 2004; GUPTE; MUMPER, 2007).

36

A enzima NAD(P)H: quinona oxirredutase (NQO1), uma flavoproteína

encontrada na maioria das células eucarióticas, é também chave para a ação da β-

lapachona (PINK et al., 2000b). A NQO1 catalisa uma redução de dois elétrons de

quinonas, como β-lapachona ou menadiona, usando ou NADH ou NADPH como

doador de elétrons. As quinonas são diretamente reduzidas a hidroquinonas pelo

NQO1, evitando o seu estado intermediário (instável e altamente reativo) de

semiquinona (Figura 13). As semiquinonas são excelentes geradores de radicais

livres, iniciando o ciclo redox que resulta na geração de superóxidos (PINK et al.,

2000a, 2000b). A redução da β-lapachona pela NQO1 aumenta sua ação citotóxica,

incluindo inibição do crescimento e apoptose. Essa enzima é superexpressa em

tumores de mama, cólon, pulmão e próstata (MALKINSON et al., 1992; MARIN et al.,

1997; OUGH et al., 2005) o que torna o grupo quinona assim como seus derivados,

potentes agentes terapêuticos para esses tipos de tumores (ASHWELL et al., 2006).

Entretanto, esse mecanismo não parece ser exclusivo visto que também é

observado a indução de apoptose pela β-lapachona em células deficientes em

NQO1, como células HL-60 e MDA-MB-468 (PINK et al., 2000b). Com isso, tem sido

sugerido que a atividade antitumoral da β-lapachona está relacionada a diferentes

mecanismos de ação dependendo do tipo de célula estudada.

Figura 13: Ciclo redox das quinonas: redução de quinonas a semiquinonas e hidroquinonas Fonte: Asche (2005)

37

Substâncias que promovam o estresse oxidativo produzindo EROs

diretamente nas células, inibindo o aparato antioxidativo (KONG; LILLEHEI, 1998),

causando desequilíbrio no estado redox intracelular ou atuando como catalisadores

na toxicidade das EROs (FRY; JACOB, 2006) são bons candidatos para o

tratamento do câncer (HILLARD et al., 2008).

É sabido que a grande maioria dos quimioterápicos usados na prática clínica,

não possui especificidade para as células tumorais, levando a toxicidade também

para as células normais. As células com alta taxa de proliferação como as das

mucosas e cabelo, são uma das células mais prejudicadas, desencadeando efeitos

colaterais como mucosite e alopecia. Assim, a indústria farmacêutica procura cada

vez mais fármacos que sejam mais eficazes e mais seletivos. A β-lapachona,

diferente de muitas drogas utilizadas na quimioterapia convencional, induz apoptose

em células transformadas, mas não em células com taxa de proliferação normal

(CHAU et al., 1998; LI et al., 2003). No entanto, apesar da grande seletividade desse

composto para células tumorais, estudos mostraram que a dose máxima tolerada,

quando administrada via oral diariamente por um mês, é de 200mg/kg em ratos e

100mg/kg em cachorros. Em doses mais elevadas, a β-lapachona causa ulceração

gástrica e perda de eritrócitos, mas sem sinais de supressão da medula óssea (LI et

al., 1995).

Nesse âmbito, a remodelagem de compostos a partir da β-lapachona pode

aumentar a eficácia dessa classe de compostos e diminuir os seus efeitos adversos.

A nor-β-lapachona (composto 1) é um derivado da β-lapachona que mostrou

citotoxicidade em algumas linhagens de carcinoma humano, com CI50 variando de 2

a 2,5 µM (KONGKATHIP et al., 2003). Já o seu derivado nitrofenilamino (composto

2) foi anteriormente descrito como um composto com forte atividade citotóxica contra

várias linhagens de células tumorais, após 72 h de incubação, apresentando CI50

abaixo de 1µg/mL (da SILVA Jr et al., 2007).

Neste contexto, o objetivo desse trabalho é avaliar a atividade citotóxica e o

possível mecanismo de ação dos compostos 1 e 2.

38

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo desse trabalho foi avaliar as propriedades citotóxicas e possíveis

mecanismo de ação da 2,2-dimetil-3-(3-nitrofenilamino)-2,3-di-hidronafto [1,2-b]

furan-4,5-diona (composto 2) e de seu protótipo, nor-β-lapachona (composto 1) em

células leucêmicas humanas (HL-60), visando avaliar o mecanismo de ação.

2.2 Objetivos Específicos

� Determinar o potencial citotóxico in vitro dos compostos 1 e 2 em linhagem

leucêmica humana (HL-60) após 24 horas de exposição;

� Determinar a seletividade dos compostos 1 e 2 utilizando células

mononucleares de sangue periférico de voluntários saudáveis;

� Avaliar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade induzida pelos

compostos 1 e 2 em células leucêmicas (HL-60) após 24 horas de incubação

utilizando diversas metodologias como análises morfológicas, integridade de

membrana celular, fragmentação de DNA, análise do ciclo celular, despolarização

mitocondrial, externalização da fosfatidilserina e geração de espécies reativas de

oxigênio.

39

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais utilizados

Os equipamentos, soluções, reagentes e fármacos utilizados estão listados no

anexo A.

3.2 Metodologia Experimental

3.2.1 Síntese das quinonas

O derivado nitrofenilamino da nor-β-lapachona (composto 2) foi sintetizado

(da SILVA Jr et al., 2007) e cedido pelo Prof. Dr. Vítor Francisco Ferreira da

Universidade Federal Fluminense e seu aluno Eufrânio Nunes da Silva Júnior, em

colaboração com a Profa. Dra Marília Oliveira Fonseca Goulart da Universidade

Federal de Alagoas. As amostras foram mantidas a - 20ºC em soluções estoque de

DMSO a 1mg/mL.

Figure 14: Estruturas dos compostos estudados: (1): 2,3-dihidro-2,2-dimetilnafto [1,2-b] furan- 4,5-diona (nor-β-lapachona) e (2): 2,2-dimetil-3-(3-nitrofenilamino)-2,3-di-hidronafto [1,2-b] furan-4,5-diona.

3.2.2 Estudo da atividade citotóxica

Cultivo da Linhagem tumoral

Células leucêmicas (HL-60) foram cultivadas em frascos plásticos para cultura

(Corning, 75 cm2, volume de 250 mL para células em suspensão); utilizando o meio

de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de

antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células foram incubadas em estufa a 37°C

(1) (2)

40

com atmosfera de 5% de CO2, seguido da observação do crescimento celular com

ajuda de microscópio de inversão a cada 24 horas (BUTLER; DAWSON, 1992).

3.2.2.1 Avaliação da atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais in

vitro - Teste do MTT

Princípio do Teste

O ensaio consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal

3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio (MTT) para formazan,

pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente na mitocôndria da célula

viável (MOSMANN, 1983), permitindo, dessa maneira, quantificar a porcentagem de

células vivas.

Procedimento Experimental

As células foram distribuídas em multiplacas de 96 cavidades numa

densidade de 3 x 105 células/mL. As substâncias testes (0,009 – 5 µg/mL) foram

incubadas durante 21 horas juntamente com a suspensão de células. Após o

período de incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 min), e o

sobrenadante foi descartado. Cada cavidade recebeu 150 µL da solução de MTT

(10% em meio RPMI 1640) e foi reincubada durante 3 horas, em estufa a 37°C e a

5% CO2. Após esse período, as placas foram novamente centrifugadas (3000

rpm/10 min), o sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi ressuspendido em

150µL de DMSO para a quantificação do sal reduzido nas células vivas. As

absorbâncias foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no

comprimento de onda de 595 nm.

Análise dos Dados

Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos erros-

padrão. O gráfico absorbância x concentração foi registrado e determinado a sua

concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo (CI50) e seus

respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) realizado a partir de regressão

não-linear no programa GraphPad Prism Software versão 5.0.

41

3.2.2.2 Avaliação da atividade antiproliferativa em células mononucleares de sangue

humano periférico (CMSP) – Ensaio do Alamar Blue

Princípio do Teste

Com o objetivo de estudar a seletividade dos compostos em estudo na

proliferação de células normais, o ensaio do alamar blue foi realizado com célula

mononucleares de sangue periférico (CMSP), que inclui linfócitos e monócitos. O

alamar blue, recentemente identificado como resazurina (O'BRIEN et al., 2000), é

um indicador fluorescente/colorimétrico, onde em sua forma oxidada apresenta uma

coloração azul (não fluorescente/célula não viável) e em sua forma reduzida uma

coloração rósea (fluorescente/célula viável). Assim como o MTT, o alamar blue

reduz-se em células vivas, e assim pode ser quantificado e utilizado para avaliar a

viabilidade celular (AHMED et al., 1994).


As células mononucleares foram isolados a partir de uma amostra de cerca

de 5 mL de sangue periférico de voluntários sadios, acrescida de 5 mL de PBS. As

etapas até o isolamento incluíram a adição de 3 mL de Ficoll, seguida por 30

minutos de centrifugação a 1500rpm, e feita aspiração das células mononucleares

presentes na região intermediária entre as hemácias e o soro (“nuvem de linfócitos”).

A suspensão de linfócitos foi transferida para um outro tubo ao qual foi acrescido

PBS até o volume de 11 mL, sendo centrifugado por 20 min a 1000 rpm. O

sobrenadante foi descartado e o pellet de linfócitos foi ressuspendido em 2 mL de

meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino, 100 U/mL penicilina,

100 µg/mL estreptomicina para uma concentração final de final 3 x 105 células/mL.

Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada para induzir a proliferação dos linfócitos. Após

24 horas de incubação das células, as substâncias em estudo foram adicionadas em

concentrações seriadas (0,009 - 5 µg/mL) juntamente com 10 µL da solução estoque

(0,312 mg/mL) de alamar blue e incubadas por 24 horas em estufa a 37°C com

atmosfera de 5% de CO2 e 95 % de umidade. A doxorrubicina (0,009 - 5 µg/mL) foi

utilizada como controle positivo. Após o período de incubação as absorbâncias

foram medidas no espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 570 nm

(reduzido) e 595 nm (oxidado).

42

Análise dos Dados

A proliferação celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: %

proliferação = ALW – (AHW x R0) x 100. Onde, ALW e AHW são as absorbâncias no

menor e maior comprimento de onda, respectivamente. O R0 foi calculado utilizando

a seguinte fórmula: R0=AOLW/AOHW. Onde, AOLW e AOHW são as absorbâncias do

meio adicionado ao alamar blue subtraído das absorbâncias do meio isolado nos

comprimentos de onda menor e maior, respectivamente. A absorbância foi medida

usando um leitor de multiplacas (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter,

Inc. Fullerton, Califórnia, EUA). O efeito da droga foi quantificado como a

porcentagem da absorbância controle a 570 nm e a 595 nm. Os compostos foram

testados em diluição seriada, em duplicata ou triplicata, e suas CI50 (concentração

inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e respectivos intervalos

de confiança de 95% (IC 95%) foram determinados a partir de regressão não-linear

utilizando o programa Prism versão 5.0 (GraphPad Software).

3.2.3 Estudo do Mecanismo de Ação em células leucêmicas (HL-60)

Células da linhagem HL-60, na concentração de 3 x 105 células/mL, foram

incubadas por 24 horas e examinadas ao microscópio óptico de inversão. As

concentrações das drogas utilizadas foram estimadas a partir do valor da CI50 do

composto 2 encontrada no método do MTT para esta mesma linhagem celular após

incubação por 24 horas. Assim as concentrações escolhidas foram de 1,0 e 2,0 µM

para a nor-β-lapachona (composto 1) e 0,5; 1,0; 2,0 µM para o composto 2. Os

grupos do controle negativo receberam a mesma quantidade de DMSO. A

doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo (VERAS et al, 2004).

3.2.3.1 Teste de citotoxicidade in vitro – Viabilidade celular por Exclusão do azul de

tripan

Princípio do Teste

O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar separadamente as

células viáveis das células mortas pela substância testada. O corante penetra em

todas as células, porém somente as células viáveis conseguem bombear o tripan

43

para fora, sendo possível dessa maneira, observar uma coloração azulada nas

células metabolicamente inativas (PERES; CURI, 2005).


A uma alíquota de 90µL da suspensão de células foi adicionado 10µL do

corante azul de tripan (0,4%). As células viáveis e as não viáveis foram

diferenciadas e contadas em câmara de Newbauer, contando-se as células de dois

quadrantes diagonalmente opostos. A Doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como

controle positivo (VERAS et al., 2004).

Análise dos Dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de 3

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida do teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p<0,05).

3.2.3.2 Ensaio antiproliferativo - Incorporação do BrdU

Princípio do Teste

A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a timina. Assim,

quando as células estão sintetizando seu DNA, o BrdU é incorporado no lugar da

timina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por técnicas

imunohistoquímicas (PERA et al., 1977).


O BrdU foi adicionado 3h antes do término do período de incubação com a

droga (21h), para que seja incorporado ao DNA das células em mitose. Após o

período de três horas, lâminas foram preparadas e colocadas para secar ao ar livre

por 2h. Após o período de secagem foram fixadas em metanol por 1 minuto. As

células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução desnaturante

(formamida) por 90 minutos a 70ºC e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS,

as células foram circuladas com caneta hidrofóbica e incubadas com anticorpo

44

primário por 120 minutos em estufa bacteriológica em câmara úmida. As células

foram incubadas com anticorpo secundário biotinado por 20 minutos e, em seguida,

com a solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos. Foi adicionado o

cromógeno diaminobenzidina (DAB) por aproximadamente 1minuto e em seguida,

removido com água destilada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina de

Harrys a 0,1% (PERA et al., 1977).

Análise dos Dados

Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom

(incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados foram

expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 2). A

proporção de células marcadas em marrom e não-marcadas entre os diferentes

grupos foi comparada pelo teste ANOVA com nível de significância de 5 % (p < 0,05)

usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

3.2.3.3 Análise morfológica - Coloração por May-Grünwald-Giemsa

Princípio do Teste

A coloração utilizada nesse experimento se baseia em interações

eletrostáticas entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul de

metileno (corante básico), eosina (corante ácido), entre outros componentes básicos

que permite distinguir o citoplasma e o núcleo, sendo possível analisar a célula

quanto a sua integridade nuclear, bem como alterações no citoplasma. Essa técnica

é bastante indicada para estudo do padrão de morte celular (apoptose/necrose).


Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 3 x 105

células/mL foram incubadas por 24 horas com as drogas e examinadas ao

microscópio de inversão. Para observar a morfologia, 50µL da suspensão de células

foram adicionadas à centrífuga de lâmina (cytospin). Após a adesão das células na

lâmina, a fixação foi feita com metanol por 1 minuto e a coloração por May-

Grunwald, por 10 segundos, seguida pelo Giemsa por mais 10 segundos.

45

Análise dos Dados

As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio para

avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle (não-

tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia em microscopia

óptica.

3.2.3.4 Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de Acridina /

Brometo de Etídio

Princípio do Teste

O método de contagem diferencial laranja de acridina /brometo de etídio

permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou

necrose através da contagem diferencial por fluorescência com base em alterações

morfológicas nucleares e citoplasmáticas (MCGAHON et al., 1995). Este método

baseia-se na revelação das células (controle e tratadas) com a coloração por

brometo de etídio (BE) e laranja de acridina (LA) no núcleo. A LA intercala-se ao

DNA, conferindo aparência verde ao núcleo celular, sendo capaz de atravessar

membranas intactas. O brometo de etídio é incorporado majoritariamente por células

não viáveis (com instabilidade de membrana), intercalando-se ao DNA corando-o de

laranja; ligando-se fracamente ao RNA, que se mostrará com uma coloração

vermelha. As células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo

uniformemente corado de verde pela LA. O BE marca muito fracamente e às vezes

não marca, pois não atravessa a membrana íntegra. As células em apoptose inicial

(membrana ainda intacta) apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo

(condensação da cromatina) e não são marcadas por BE. Podem ser observadas as

alterações da membrana em decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos.

As células em necrose (lesão na membrana) apresentaram um padrão de coloração

uniforme, laranja-avermelhada e não há formação de corpos apoptóticos (CURY-

BOAVENTURA et al., 2003).


A suspensão de células controle ou tratadas com os compostos 1 e 2 foi

transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5 min em baixa rotação. O

46

sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 20 µL de

solução de PBS. Em seguida, 1 µL da solução de LA/BE foi adicionado a cada tubo

e uma alíquota dessas células foi transferida para uma lâmina e montado com

lamínula para, em seguida, ser contada considerando cada evento celular de

interesse (GENG et al., 2003).

Análise dos Dados

Foram contadas 300 (trezentas) células, em duplicata, cada amostra para

quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e apoptóticas).

As lâminas foram montadas e fotografadas para registro visual dos efeitos. Para

verificação de ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de

Dunnett (p<0,05).

3.3 Citometria de Fluxo

A citometria de fluxo é uma técnica utilizada para se determinar diferentes

características das partículas biológicas. Os citômetros analisam as células ou

partículas em meio líquido que passam através de uma fonte de luz. O desvio da luz,

que está relacionado diretamente com a estrutura e morfologia das células, e a

fluorescência são determinados para cada partícula que passa pela fonte de

excitação. Após a aquisição do desvio da luz e fluorescência de cada partícula, a

informação resultante pode ser analisada utilizando-se um computador com

programa específico acoplado ao citômetro (SHAPIRO, 1995).

Para todos os compostos testados, cinco mil eventos foram avaliados por

experimento e os debris celulares foram omitidos da análise. A fluorescência de

células de HL-60 foram então determinadas por citômetro de fluxo Guava EasyCyte

Mine usando o software Guava Express Plus após 24 horas de incubação. Cinco mil

eventos foram analisados para cada replicata em três experimentos independentes.

3.3.1 Determinação da integridade da membrana celular - viabilidade celular

Princípio do Teste

47

O teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo penetrar nas células

cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao DNA emitir alta fluorescência

quando é excitado pelo laser. As células com membrana íntegra emitem baixa

fluorescência (SHAPIRO, 1995).


Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi

incubada com 100µL de uma solução de PI a 50µg/mL (diluído em tampão fosfato).

Após 5 minutos as amostras foram analisadas por citometria de fluxo. Foram obtidas

informações sobre morfologia celular (espalhamento frontal e lateral da luz, o que

corresponde ao tamanho e granulosidade relativa entre as células, respectivamente)

e integridade de membrana utilizando-se o filtro para o espectro do vermelho

(DARZYNKIEWICZ et al., 1992).

3.3.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação do DNA por citometria de fluxo

Princípio do Teste

Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo ligar-se ao DNA.

Inicialmente a membrana plasmática das células foram lisadas por um detergente,

permitindo que o iodeto de propídeo (PI) ligue-se ao DNA de todas as células.

Células com o DNA íntegro emitirão alta fluorescência, já núcleos com condensação

da cromatina e DNA fragmentado incorporam menos PI e por isso emitem menor

fluorescência, sugestivo de apoptose. Além disso, o PI consegue intercalar

proporcionalmente a quantidade de DNA da célula, podendo então mensurar as

fases do ciclo celular, através da quantidade de DNA presente em cada fase do ciclo

celular.



incubada com 100µL de uma solução de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1 % de

Triton X-100 e 2 µg/mL iodeto de propídio em PBS). Após um período de 30

minutos, onde os tubos permaneceram no escuro, as amostras foram analisadas no

citômetro de fluxo (NICOLETTI et al., 1991).

48

3.3.3 Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria por citometria de

fluxo

Princípio do Teste

Esse teste baseia-se na capacidade da mitocôndria seqüestrar um corante

fluorescente, rodamina 123. Quando esta organela apresenta potencial

transmembrânico inalterado, as células que seqüestraram a rodamina emitem alta

fluorescência quando atingidas pelo laser. Alterações no potencial mitocondrial

transmembrânico levam ao efluxo da rodamina de dentro da mitocôndria, gerando

eventos que emitirão menor fluorescência comparado com as células que possuem

mitocôndrias normais.



incubada com 200µL de uma solução de solução de rodamina 1 µg/mL. Após 15

minutos de incubação no escuro, as amostras foram centrifugadas a 2000rpm/5min.

O sobrenadante foi então descartado e 100 µL de PBS foi adicionado em cada

amostra. Após um período de 30 minutos incubadas no escuro, as amostras foram

analisadas no citômetro de fluxo (CURY-BOAVENTURA et al., 2004).

Análise dos dados


experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças

significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5%

(p < 0,05).

3.3.4 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina – Anexina V

Princípio do Teste

Um dos principais processos que ocorrem na apoptose é a perda da

assimetria da membrana fosfolipídica com a translocação da fosfatidilserina da

membrana interna da bicamada lipídica para superfície celular. A externalização da

49

PS ainda continua como um processo não totalmente conhecido, mas sabe-se que a

externalização da fosfatidilserina funciona como um sinal da célula para que os

macrófagos as fagocitem, antes da perda da integridade da membrana celular

(VERMES et al., 1995).


A externalização da fosfatidilserina foi analisada por citometria de fluxo após

coloração da fosfatidilserina com a anexina V (VERMES et al., 1995). Foi utilizado o

kit Guava Nexin para determinar apoptose inicial e tardia. Células foram lavadas

duas vezes com PBS gelado e ressuspendidas em 135 µL de PBS com 5 µL de 7-

amino-actinomicina (7AAD) e 10 µL de anexina V conjugada com ficoeritrina (PE).

As células foram gentilmente agitadas e incubadas por 20 minutos em temperatura

ambiente (20–25°C) no escuro. Posteriormente, as células foram analisadas por

citometria de fluxo (EasyCyte/Guava Technologies). Anexina V é uma proteína

ligada a um fosfolipídio que tem alta afinidade por PS. 7AAD, é um corante

hidrofílico impermeável em células intactas, e é utilizado como um indicador da

integridade da membrana celular. A fluorescência da anexina V conjugada com a

ficoeritrina foi mensurada por fluorescência amarela-583nm e o 7AAD na

fluorescência vermelha a 680nm. A percentagem de células viáveis e de células

apoptóticas inicial e tardia foi calculada.

Análise dos Dados


experimentos realizados em triplicata. Para verificação da ocorrência de diferenças


variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnett, com nível de significância de 5%

(p < 0,05).

3.3.5 Determinação da geração de espécies reativas de oxigênio intracelulares

Princípio do Teste

As espécies reativas de oxigênio intracelulares foram monitoradas utilizando o

diacetato de 2’7’-diclorohidrofluoresceina (H2-DCF-DA), que é convertido em um

50

produto altamente fluorescente denominado de diclorofluoresceína (DCF) na

presença de espécies reativas de oxigênio intracelulares (LEBEL et al., 1992).


No final do tratamento de 1 e 3 horas com as amostras teste, as células foram

incubadas a 20 µM de H2-DCF-DA e mantidas a 37°C por 30 minutos no escuro.

Após terminar o período total de incubação as células foram centrifugadas por duas

vezes, lavadas e ressuspendidas em tampão PBS e analisadas imediatamente

utilizando citometria de fluxo com comprimento de onda de excitação e emissão de

490 e 530 nm, respectivamente. PMA (Forbol-12-miristato-13-acetato) foi utilizado

como controle positivo.

Análise dos dados

Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram

expressos como a média ± erro padrão da média de três experimentos

independentes realizados em triplicata. Para verificação da ocorrência de diferenças


variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnett, com nível de significância de 5%

(p < 0,05).

51

4 RESULTADOS

4.1 Atividade citotóxica da nor- β-lapachona (composto 1) e seu derivado

nitrofenilamino (composto 2) pelo ensaio do MTT e e nsaio de seletividade pelo

método do Alamar blue

Inicialmente, foi determinado o efeito citotóxico dos compostos 1 e 2 sobre o

crescimento de células leucêmicas (HL-60) e em células mononucleares de sangue

periférico de voluntários saudáveis. Os valores de CI50, determinados após 24 horas

de exposição com as substâncias estão representados na tabela 1.

Como apresentado na tabela 1, ambos os compostos testados exibiram forte

efeito inibitório na proliferação das células HL-60 após 24 horas de incubação.

Baseado nos dados obtidos de dois experimentos independentes realizados em

duplicata, os valores de CI50 dos compostos 1 e 2 foram de 2,92 µM e 0,48 µM,

respectivamente (Tabela 1). Esses dados mostram que a adição do radical

nitrofenilamino na posição três do anel furano da nor-β-lapachona aumentou o efeito

citotóxico sobre células HL-60.

Para analisar a seletividade dos compostos testados sobre as células

tumorais, foi realizado o ensaio antiproliferativo do alamar blue com células

mononucleares de sangue periférico de voluntários sadios (CMSP). Comparando os

valores de CI50 dos compostos testados em células HL-60 e CMSP podemos

verificar que o composto 1 apresentou maior seletividade para células tumorais

quando comparado ao seu derivado nitrofenilamino (Tabela 1), apresentando CI50

maior que 17µM, enquanto o composto 2 apresentou CI50 de 3,02 µM. Assim

podemos observar que a modificação estrutural do composto 1, com a adição do

radical nitrofenilamino na posição 3, aumenta a atividade citotóxica em ambas

células tumorais e normais.

52

Tabela 1: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) na citotoxicidade de células leucêmicas (HL-60) e normais (CMSP) após 24 horas de incubação, respectivamente.

MTT

(HL-60)

Alamar blue

(CMSP) Compostos

CI50 µµµµg/mL ( µµµµM) CI50 µµµµg/mL ( µµµµM)

Composto 1 0,84 (2,92)

(0,73 - 0,97) > 5 (17,38)

Composto 2 0,17 (0,48)

(0,15 - 0,20)

1,07 (3,02)

(0,88 – 1,31)

Doxorrubicina 0,3 (0,5)

(0,2 - 0,4) > 5 (8,3)

Nota: Os resultados são apresentados em valores de CI50 com um intervalo de confiança de 95% obtido por regressão não-linear a partir de três experimentos independentes, feitos em duplicata.

4.2 Mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade d os compostos 1 e 2

A fim de investigar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos

compostos 1 e 2, células HL-60 foram utilizadas como modelo. As concentrações

testadas foram baseadas nos valores de CI50 do composto 2 após 24 horas de

incubação. A doxorrubicina, na concentração de 0,5 µM, foi utilizada como controle

positivo.

4.2.1 Viabilidade celular pelo método de exclusão por azul de tripan

Como dito anteriormente, esse ensaio é um método direto de avaliação do

potencial citotóxico de substâncias. A análise da viabilidade celular na linhagem

leucêmica HL-60 por exclusão de azul de tripan, após 24 horas de exposição,

demonstrou que o composto 2, nas maiores concentrações testadas (1,0 e 2,0 µM),

reduziu significativamente o número de células viáveis quando comparadas ao

controle negativo. Apenas na concentração de 2,0 µM foi observado um pequeno

aumento no número de células não-viáveis. Já o composto 1 não apresentou

alterações significativas quando comparadas ao controle negativo. A doxorrubicina,

utilizada como controle positivo, diminuiu consideravelmente o número de células

viáveis, aumentando discretamente o número de células não-viáveis (Figura 15).

53

0

20

40

60

80

Composto 1 Composto 2

*

*

*

*

*

(µµµµM)

Células viáveis Células não viáveis

Controle Dox 1,01,0 2,0 2,00,5

Núm

ero

de c

élul

as(x

10

4cé

ls/m

L)

Figura 15: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) na viabilidade de células leucêmicas HL-60 determinado por exclusão de azul de tripan depois de 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem a média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 3). *p < 0,05 comparado ao controle por ANOVA, seguida de Dunnett.

4.2.2 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU

Posteriormente, para relacionar a atividade antiproliferativa dos compostos

testados à inibição da síntese de DNA, foi realizado o ensaio de incorporação do

BrdU. Neste ensaio foi observado que células HL-60 tratadas com o derivado

nitrofenilamino (composto 2) , na maior concentração (2µM), foi capaz de inibir cerca

de 30% a proliferação celular, como mensurado pela incorporação do BrdU após 24

horas de incubação (p < 0,05). Já as células tratadas com o seu protótipo, composto

1 (2,0 µM), não mostraram diferença estatística quando comparadas ao controle

negativo. A doxorrubicina, utilizada como controle positivo, causou 33% de inibição

da proliferação celular (Tabela 2).

54

Tabela 2: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a incorporação do BrdU expresso em porcentagem do número de células, avaliada através da incorporação do 5-bromo-2´-deoxyuridina (BrdU) em células leucêmicas HL-60 após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Doxorrubicina (0,5µM) foi usado como controle positivo.

Compostos Concentração (µM) BrdU positivo (%) T/C

Controle - 56,71 -

Doxorrubicina 0,5 38,17* 0,67

Composto 1 2,0 53,50 0,94

0,5 57,00 1,0

1,0 49,00 0,86 Composto 2

2,0 39,75* 0,7

Nota: Os dados correspondem à média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 2). * p < 0,05, ANOVA, seguida de Dunnett. 4.3 Análise das mudanças morfológica 4.3.1 Coloração diferencial por May-Grünwald-Giemsa

A análise por microscopia de luz das células HL-60 coradas com May-

Grünwald-Giemsa revelou diversas mudanças morfológicas induzidas pelas

substâncias testadas. Após 24 horas em cultura, células HL-60 do grupo controle

negativo (não-tratadas) exibiram uma morfologia típica de células não aderidas, tais

como, membrana íntegra, células pleomórficas, nítida visualização tanto da

membrana plasmática quanto nuclear (Figura 16 A). As células tratadas com o

protótipo, composto 1, nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM, assim como as células

tratadas com a menor concentração do composto 2 (0,5 µM) não apresentaram

mudanças morfológicas quando comparadas ao controle negativo (Figuras 16 C, 16

D e 16 E). Por outro lado, células tratadas com o composto 2, nas concentrações de

1,0 e 2,0 µM, apresentaram morfologia consistente com células em processo de

apoptose, incluindo redução do volume celular, condensação da cromatina e

fragmentação nuclear (Figuras 16 F e 16 G). Na maior concentração testada (2,0

µM), o composto 2 também levou ao aparecimento de características de necrose,

como eosinofilia e perda da integridade de membrana (Figura 16 G). A doxorrubicina

55

(0,5µM), utilizada como controle positivo, induziu redução do volume celular,

condensação da cromatina e fragmentação nuclear em células de HL-60, todas as

características condizentes com apoptose (Figura 16 B).

Figura 16: Análise morfológica de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24 horas de incubação, coradas por May-Grünwald-Giemsa e visualizadas por microscopia óptica. (A): controle negativo tratado apenas com o veículo utilizado para diluir as substâncias. (C) e (D): células tratadas com nor-β-lapachona (composto 1) nas concentrações de 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (E), (F) e (G): células tratadas com o derivado nitrofenilamino (composto 2) nas concentrações 0,5 µM, 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (B): controle positivo tratado com doxorrubicina (0,5µM). Células em apoptose indicadas pelas setas pretas e célula em necrose indicada pela seta vermelha.

4.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio

Para confirmar que a atividade antiproliferativa do composto 2 relaciona-se

com a indução de apoptose e necrose, a análise morfológica das células tratadas

com as substâncias teste foi investigada utilizando a coloração diferencial de laranja

56

de acridina e brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O

percentual de células viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado. Células

viáveis, com coloração verde uniforme e morfologia normal, foram observadas em

células HL-60 do grupo controle negativo, atingindo mais de 85% das células

contadas. O tratamento das células com o composto 1, em ambas as concentrações

testadas, não causou alterações significativas no padrão morfológico de células HL-

60 quando comparadas ao controle negativo. No entanto, na concentração

intermediária do composto 2 (1,0 µM) foi observado um aumento de 19,1% na

porcentagem de células em processo de apoptose (Figura 17). Já na maior

concentração (2,0 µM) o composto 2 causou uma redução da porcentagem de

células viáveis para 61,33% (p < 0,05). Essa redução foi acompanhada por um

aumento de 36,17% de células com características de apoptose e apenas um

discreto aumento de 2,5% de células em necrose. Já a doxorrubicina, utilizada como

controle positivo, causou 82,17% de apoptose, diminuindo drasticamente o

percentual de células viáveis (Figura 17).

Figura 17: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) na viabilidade de células leucêmicas HL-60 coradas com Laranja de acridina/Brometo de etídeo determinado por microscopia de fluorescência após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). *p < 0,05. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet.

57

4.4 Análises da citometria de fluxo

4.4.1 Integridade de membrana celular e concentração de células determinada por

citometria de fluxo

A integridade da membrana celular e a concentração de células foram

determinadas por citometria de fluxo após 24 horas de incubação com as amostras

teste. O corante iodeto de propídio foi utilizado para corar o núcleo de células com

dano na membrana celular.

Como observado na figura 18, ambos os compostos causaram diminuição na

concentração de células de maneira dose-dependente.

Figura 18: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a densidade de células leucêmicas HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

Entretanto, na avaliação da integridade de membrana utilizando iodeto de

propídeo, corante hidrofílico permeável somente em células com membrana

rompida, mostrou que somente na maior concentração do composto 2 (2,0µM)

houve uma pequena perda na integridade da membrana celular (92,27%) (Figura

58

19). Esses dados que corroboram com os resultados dos experimentos

anteriormente descritos. Já as células tratadas com o composto 1 e o controle

positivo (doxorrubicina) não apresentaram diferenças estatísticas quando

comparadas ao controle negativo (Figura 19).

Figura 19: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a integridade de membrana de células leucêmicas HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.4.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA determinada por citometria

de fluxo

A progressão do ciclo celular e a fragmentação internucleossomal do DNA

das células HL-60 tratadas com os compostos 1 e 2 foram realizadas por citometria

de fluxo e analisadas através do programa ModFit LT 3.1. Os resultados mostraram

que tanto o controle positivo (doxorrubicina) quanto as duas maiores concentrações

do composto 2 causaram aumento significante na fragmentação de DNA (p < 0,05).

Após 24 horas de exposição, células não tratadas apresentaram 18,9% de

fragmentação, enquanto as células tratadas com o composto 2 nas concentrações

de 1,0 µM e 2,0 µM causaram 47,2% e 83,5% de fragmentação de DNA,

respectivamente. O composto 1, em ambas as concentrações testadas, não causou

fragmentação significativa do DNA. Já a doxorrubicina, utilizada como controle

59

positivo, mostrou que 94,2% das células apresentavam DNA fragmentado (Figura

20).

Figura 20: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a fragmentação de DNA de células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

Quanto à progressão das fases do ciclo celular, nenhum dos compostos

testados interferiu em fases específicas do ciclo celular, sugerindo um mecanismo

ciclo-independente. Pôde-se observar uma tendência de diminuição da fase G2/M

nas células tratadas com a maior concentração do composto 2, no entanto não foi

estatisticamente significante (Figura 21). A doxorrubicina, utilizada como controle

positivo, reduziu da porcentagem de células em G2/M (Figura 21).

60

Figura 21: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a distribuição do ciclo celular em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 em G2/M comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.4.3 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria

Para avaliar o papel da mitocôndria na apoptose induzida pelos compostos

testados, a capacidade de induzir alterações no potencial transmembrânico da

mitocôndria (∆Ψm) foi avaliada por citometria de fluxo através da incorporação do

corante Rodamina 123. Como observado na figura 22, o controle positivo

(Doxorrubicina) e o composto 2, nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM, induziram

despolarização mitocondrial em células de HL-60. Células tratadas com o composto

2, nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM, apresentaram 21,71% e 33,94% de

despolarização mitocondrial, respectivamente, enquanto que o controle negativo

apresentou apenas 7,45%. Por outro lado, o composto 1 não apresentou efeito

significativo quando comparado ao controle negativo (Figura 22). A doxorrubicina,

utilizada como controle positivo, causou 74,86% de despolarização mitocondrial

(Figura 22).

61

Figura 22: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre o potencial transmembrânico em células HL-60 determinado por citometria de fluxo utilizando rodamina 123, após 24 horas de incubação (H). (A): controle negativo tratado apenas com o veículo utilizado para diluir as substâncias. (C) e (D): células tratadas com o composto 1 nas concentrações de 0,5 µM, 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (E), (F) e (G): células tratadas com o composto 2 nas concentrações 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (B): controle positivo tratado com doxorrubicina (0,5µM). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. 4.4.4 Determinação da Externalização da fosfatidilserina

A fim de confirmar o tipo de morte celular induzida pelo composto, a

externalização da fosfatidilserina foi avaliada por citometria de fluxo. Como

observado na figura 23, ambos os compostos testados reduziram a porcentagem de

células viáveis e aumentaram o percentual de células em apoptose inicial e tardia,

62

no entanto, somente o composto 2 aumentou o percentual de células em processo

tardio de necrose. A doxorrubicina apresentou aumento significativo na porcentagem

de células em apoptose inicial e um pequeno aumento de células com apoptose

tardia (Figura 23).

Figura 23: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2), na concentração de 2,0µM, sobre a externalização da fosfatidilserina em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando Anexina V-PE e 7-AAD, após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

4.4.5 Determinação da geração de espécies reativas de oxigênio

A produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi

determinada por citometria de fluxo utilizando o corante fluorescente diacetato de

2,7-diclorodihidrofluoresceína (H2-DCF-DA) após 1 e 3 horas de incubação com as

amostras teste. Como observado na figura 24, em ambos os tempos, tanto o

composto 1 quanto o composto 2 induziram a produção de EROs em células HL-60.

Essa geração de EROs aumentou de maneira dose-dependente e foi reduzida de

63

maneira tempo-dependente (Figura 24). Assim a produção de EROs na primeira

hora de incubação foi bem maior que após 3 horas de exposição, sugerindo que os

efeitos pró-apoptóticos do composto 2 observado em todos os testes já descritos

pode ser causado por um rápido estresse oxidativo, levando as células a morte por

apoptose seguida por necrose.

Figura 24: Efeito da nor-β-lapachona (composto 1) e do seu derivado nitrofenilamino (composto 2) sobre a geração de EROs em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando H2-DCF-DA, após 1 e 3 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias testadas. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) na concentração de 1,0 µM foi utilizado como controle positivo. Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.

64

5 DISCUSSÃO

Os agentes anticâncer são, em grande parte, obtidos direta ou indiretamente

de produtos naturais, e atuam na inibição do crescimento de células tumorais

(CRAGG et al., 2005; NEWMAN et al., 2003). Estes agentes não precisam ser

necessariamente o melhor composto para o uso farmacêutico (KINGSTON, 1996),

podendo ser utilizados como protótipos para a síntese de análogos mais

promissores. A obtenção de análogos é um processo comumente utilizado para

descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica, e isso pode ser feito

através de estudos da relação entre a estrutura e atividade biológica servindo de

base para a otimização molecular (GARRETT; WORKMAN, 1999; WILSON;

DANISHEFSKY, 2007). Neste processo, tem-se por objetivo o desenho racional e o

desenvolvimento de uma segunda geração de agentes com características

melhoradas, tais como o aumento da eficácia e da estabilidade, a melhora das

propriedades farmacocinéticas e a diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND;

GANESAN, 2004).

As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de

distribuição natural ou produto de síntese com uma grande variedade de funções em

sistemas biológicos (ASCHE, 2005). Esses são de interesse tanto farmacológico

quanto toxicológico uma vez que vários fármacos clinicamente importantes na

terapia do câncer contêm o núcleo quinona (como as antraciclinas, mitoxantrona e

saintopina) apresentando excelente atividade anti-câncer (FOYE, 1995; MONKS;

JONES, 2002). Nos últimos anos intensificou-se o interesse nestas substâncias, não

só devido à sua importância nos processos bioquímicos vitais, como também ao

destaque cada vez maior que apresentam em variados estudos farmacológicos

(SILVA et al., 2003).

Muitos análogos estruturalmente relacionados às naftoquinonas de origem

natural e sintética, tais como plumbagina, lapachol, menadiona e seus derivados,

estão sendo estudados devido ao seu potencial anticâncer contra várias linhagens

de células tumorais in vitro e in vivo (NOTO et al., 1989; NGO et al., 1991; SRINIVAS

et al., 2004; HSU et al., 2006; ESTEVES-SOUZA et al., 2007). Dentre as

naftoquinonas com potencial citotóxico, a β-lapachona tem sido uma das mais

estudadas nos últimos anos (da SILVA Jr et al., 2007), sendo que as implicações

65

mais importantes desse composto estão relacionadas à sua atividade citotóxica

contra várias linhagens de células tumorais humanas e baixa citotoxicidade para

células normais, indicando que a β-lapachona atua seletivamente em células

tumorais. (LI et al., 2000; PARDEE et al., 2002; LI et al., 2003; da SILVA Jr et al.,

2007). A nor-β-lapachona (composto 1), derivada da β-lapachona, também possui

potencial anticâncer (KONGKATHIP et al., 2003; da SILVA Jr et al., 2007) e vários

derivados arilaminos da nor-β-lapachona têm sido descritos, apresentando forte

atividade citotóxica contra diversas linhagens de células tumorais humanas (da

SILVA Jr et al., 2007). Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo

investigar o mecanismo citotóxico do composto 1 e de seu derivado nitrofenilamino

(composto 2) em células leucêmicas HL-60 após 24 horas de exposição.

Inicialmente, o potencial citotóxico dos compostos em estudo foram

determinadas através do ensaio do MTT após 24 horas de incubação. Os resultados

apresentados acima mostram que a introdução do grupamento nitrofenilamino

(composto 2) na posição 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade da nor-β-

lapachona (composto 1) contra células HL-60 em aproximadamente 6 vezes,

apresentando valores de CI50 de 2,92 µM e 0,48 µM para o composto 1 e 2,

respectivamente.

Esses dados corroboram com o estudo feito em 2007 por da Silva Jr e

colaboradores, onde foi demonstrado que os compostos 1 e 2 possuem potencial

citotóxico contra diversas linhagens de células tumorais, apresentando valores de

CI50 de 1,75 µM e 0,33 µM, respectivamente em células HL-60 após 72 horas de

exposição.

Alguns trabalhos sugerem que a incorporação de esqueletos ariloaminos,

arilotióis ou halogenados em quinonas contribuem para a melhoria da eficácia

biológica (TANDON et al., 2004; RYU et al., 2003), o que foi condizente com nosso

trabalho.

Muitos fármacos atualmente utilizados no tratamento do câncer agem inibindo

a progressão do ciclo celular, e como conseqüência inibem a proliferação celular

(ANAZETTI et al., 2003). Um dos grandes problemas evidenciados no tratamento do

câncer, utilizando quimioterápicos, são os seus efeitos colaterais. Grande parte

66

desses efeitos deve-se, principalmente, a baixa seletividade desses fármacos por

células tumorais, onde as células normais mais afetadas são as que se proliferam

rapidamente, como as células da pele, do trato gastrintestinal e do sangue

(ANAZETTI et al., 2003). Assim, a busca por novos quimioterápicos tem como

objetivo principal aumentar a seletividade e a efetividade dessas substâncias,

procurando eliminar apenas as células tumorais e preservando as células normais.

Ao considerar os efeitos colaterais da quimioterapia, é de grande importância

verificar se a droga teste causa danos a células que estão se dividindo normalmente,

tais como linfócitos (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI et al., 2003). Desse modo,

células mononucleares de sangue periférico de voluntários saudáveis foram

utilizadas para avaliar a seletividade os compostos 1 e 2 para células tumorais.

Como observado, o composto 1 mostrou forte seletividade para as células tumorais.

Essa seletividade também foi observada em células mononucleares de sangue

periférico (CMSP) estimulado por fitohemaglutinina tratadas com β-lapachona (LI et

al., 2003). No entanto, a presença do radical nitrofenilamino inibiu parcialmente essa

seletividade, apresentando CI50 aproximadamente seis vezes maior quando

comparado a CI50 em células HL-60, no mesmo período de exposição.

Os resultados dos testes antiproliferativos de exclusão por azul de tripan e

inibição da incorporação do BrdU corroboraram com o ensaio do MTT, onde o

composto 2 apresentou maior atividade antiproliferativa que seu protótipo (composto

1) nas concentrações testadas. A atividade antiproliferativa mensurada pela

incorporação do BrdU mostrou que o composto 2 age de maneira dose-dependente

sugerindo que o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade desse composto

está relacionado à inibição da proliferação celular que foi mensurada pela inibição da

síntese de DNA. Muitas substâncias utilizadas na terapia do câncer apresentam

essa característica, onde o seu derivado apresenta maior atividade, como o

etoposídeo que foi obtido da modificação estrutural do principal constituinte da

Podophyllum peltada, a podofilotoxina. Esta última apresenta atividade citostática

moderada, enquanto seu análogo, etoposídeo, possui efeitos anti-câncer (CHEN et

al., 1984).

Drogas que induzem morte celular por apoptose em linhagens de células

tumorais podem ser úteis na quimioterapia (ZAMAI et al., 2001; LOS et al., 2003;

67

BRADY, 2004). Apoptose é uma forma de morte celular de fundamental importância

em vários sistemas biológicos, pois desempenha um papel essencial no

desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na regulação da resposta imune, na

eliminação de células senescentes e na morte celular induzida por quimioterápicos

(HU; KAVANAGH, 2003; VERMEULEN et al., 2005). A morte celular via apoptose

pode ser identificada por uma série de alterações morfológicas na célula como

diminuição do volume celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear,

formação de corpos apoptóticos e de prolongamentos da membrana plasmática

(“blebs”). Já a necrose ocorre por uma ação rápida da droga na célula e é

caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e perda da integridade da

membrana plasmática (KERR et al., 1972; DARZYNKIEWICZ et al., 1992;

STRASSER et al., 2000).

As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante quase

todo o processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas. Confirmando

os resultados do MTT e do teste de exclusão por azul de tripan, os compostos 1 e 2

reduziram significantemente a concentração de células de maneira dose-

dependente. Na análise da integridade de membrana, somente as células tratadas

com 2,0 µM do composto 2 sofreram perda da integridade de membrana, dados

estes que corroboram com os resultados obtidos pelo colorações por May-Grünwald

Giemsa e LA/BE.

Vários estudos demonstraram que β-lapachona induz apoptose em diferentes

tipos de células (PLANCHON et al., 1995; HUANG; PARDEE, 1999; LEE et al.,

2006; LIEN et al., 2008; SHAH et al., 2008). Essa quinona é descrita por induzir

seletivamente apoptose em células transformadas, mas não em células de

proliferação normal. Propriedade essa distinta e não compartilhada com os demais

agentes quimioterápicos convencionais (LI et al., 2003). Dessa forma, a introdução

de um grupo nitrofenilamino aumentou a atividade citotóxica do composto 1 e

manteve o mesmo padrão de morte celular que o observado pela β-lapachona, sem,

no entanto, manter a seletividade para células tumorais (PLANCHON et al., 1995;

HUANG; PARDEE, 1999; LEE et al., 2006; LIEN et al., 2008; SHAH et al., 2008).

A apoptose também pode ser caracterizada pela condensação e quebra do

68

DNA, que é detectada em uma fração denominada sub-G1 na citometria de fluxo, e

por mudanças na membrana plasmática, bem caracterizada pela externalização da

fosfatidilserina (RAFFRAY; COHEN, 1997).

A análise da fragmentação do DNA feita por citometria de fluxo, confirmou as

observações morfológicas feitas tanto por May-Grünwald-Giemsa quanto por LA/BE,

mostrando que o grupo nitrofenilamino aumenta a atividade do composto 2. Como

mostrado no ensaio de fragmentação nuclear por citometria de fluxo, o composto 1

não foi capaz de causar uma fragmentação significativa do DNA nas concentrações

testadas. No entanto, com as mesmas concentrações do protótipo, o composto 2

causou mais de 80% de fragmentação do DNA na maior concentração testada

(Figura 19). Efeito este semelhante ao observado nas células tratadas com a

doxorrubicina (controle positivo), droga bastante empregada no tratamento clínico de

leucemias (ASCHE, 2005). Dessa forma, uma diminuição no número de células

pode ser interpretado como uma diminuição na proliferação, entretanto a

manutenção da integridade da membrana celular aliado a fragmentação de DNA

leva a conclusão de que o composto 2 induz apoptose nas células HL-60.

Muitas drogas anticâncer atuam interferindo no ciclo celular. Algumas são

fase-específica e outras fase-inespecífica (de ALMEIDA et al., 2005). O mecanismo

envolvido na interação da β-lapachona no ciclo celular não está completamente

esclarecido e parece estar relacionado com o tipo celular, uma vez que a parada em

uma fase específica do ciclo celular depende da célula testada (PLANCHON et al.,

1995; LI et al., 1995; HUANG; PARDEE, 1999; LI et al., 2003). Em células

leucêmicas HL-60 e em algumas linhagens tumorais de próstata, por exemplo, a β-

lapachona causa um aparente bloqueio na fase G0/G1 (PLANCHON et al., 1995). Já

em células de hepatoma (HepA2) o bloqueio é feito na fase S (LAI et al., 1998).

Apesar da ação da β-lapachona sobre as fases do ciclo celular, a citotoxicidade de

seus derivados (compostos 1 e 2), no tempo e nas concentrações testadas, não está

relacionada a uma fase específica do ciclo celular. Apenas o composto 2, na

concentração de 2µM, demonstrou uma tendência à diminuição de G2/M. Como a

β-lapachona, seus derivados podem ter ações diferentes em diferentes linhagens,

sendo necessário mais estudos para a elucidação do mecanismo de ação.

69

Outro parâmetro analisado foi a despolarização da membrana mitocondrial. A

mitocôndria atua em papel central na regulação da sinalização apoptótica (GREEN,

1998; GOGVADZE; ORRENIUS, 2006). Mudanças no potencial de membrana

mitocondrial são eventos iniciais que ocorre após a indução da apoptose,

principalmente pela via intrínseca ou via mitocondrial (HAN et al., 2006; ORRENIUS,

2004). Assim, quando proteínas pró-apoptóticas são liberadas do espaço

intramembranar da mitocôndria, através de um poro formado na membrana externa,

haverá também a saída de H+, causando despolarização mitocondrial

(HENGARTNER et al., 2000). A alteração no potencial transmembrânico

mitocôndrial é um modo para verificação indireta da ativação da via intrínseca

(ORRENIUS, 2004). Assim, as células HL-60 tratadas com o composto 2

apresentaram significante despolarização mitocondrial quando tratadas com 1,0 µM

e 2,0 µM, sugerindo que esse composto induz ativação da via intrínseca da

apoptose. Estudos realizados com a β-lapachona demonstram que a via intrínseca

está envolvida na morte celular por apoptose (LI et al., 1999b), o que corrobora com

os dados dos compostos 2.

Um dos principais processos que ocorrem na apoptose é a perda da

assimetria da membrana fosfolipídica com a translocação da fosfatidilserina da

membrana interna da bicamada lipídica para superfície celular (VERMES et al.,

1995). A fosfatidilserina é um fosfolipídio interno de membrana, que ao ser

externalizado sinaliza para os macrófagos que a célula seja fagocitada, evitando a

liberação do conteúdo celular no meio (ZIMMERMANN et al., 2001). A indução de

apoptose foi mensurada através da externalização da fosfatidilserina, utilizando uma

dupla coloração com 7-AAD e Anexina V conjugada a ficoeritrina (PE), onde os

compostos 1 e 2 induziram a externalização da fosfatidilserina na dose de 2µM,

sendo que o derivado apresentou atividade significantemente maior que seu

protótipo.

Os parâmetros analisados por citometria e coloração diferencial confirmam as

alterações morfológicas compatíveis com apoptose de células tratadas com o

composto 2, que também são observadas em células tratadas com a β-lapachona

(GUPTA et al., 2002; LI et al., 2000; LI et al., 1999a; LI et al., 1999b), mas não com

composto 1 nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM. Apesar do aumento de células

70

necróticas observadas na dose de 2µM, esse evento é, possivelmente, secundário à

apoptose, visto que na apoptose, quando não há a completa fagocitose dos corpos

apoptóticos, haverá a degradação dos seus constituintes intracelulares levando a

célula à necrose, sendo este processo denominado necrose secundária (ZIEGLER;

GROSCURTH, 2004).

É conhecido que as quinonas geram espécies reativas de oxigênio e que

estes podem ativar vias intracelulares que levam à apoptose (RICCI; ZONG, 2006).

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são constituídas por uma variedade de

moléculas e radicais livres derivados do oxigênio molecular (TURRENS, 2003). Já o

conjunto de processos deletérios resultantes de um desbalanço entre a formação

excessiva de EROs e o sistema de defesa antioxidante é denominado estresse

oxidativo (TURRENS, 2003; ANDREYEV et al., 2005).

As EROs são conhecidas não somente por atacar o DNA, mas por afetar

componentes celulares tais como proteínas e lipídios (EVANS et al., 2004). As EROs

tem sido consideradas moléculas chave que podem seletivamente modificar

proteínas e portanto regular a sinalização celular, incluindo a apoptose. Uma

variedade de agentes anticâncer induzem apoptose através da geração de EROs

(MIZUTANI et al., 2002; KIM et al., 2005; MIZUTANI et al., 2005). O mecanismo

citotóxico de muitas naftoquinonas, como a juglona, a plumbagina e a menadiona,

tem sido associado à excessiva geração de EROS tais como radicais superóxido,

oxigênio singlet e peróxido de hidrogênio (INBARAJ; CHIGNELL, 2004; CHUNG et

al., 1999; SEUNG et al., 1998). De acordo com os resultados, a citotoxicidade dos

compostos testados pode estar relacionada com a geração de espécies reativas de

oxigênio (EROs), visto que os níveis intracelulares de Eros aumentou nas células

tratadas com os compostos 1 e 2.

Muitas drogas utilizadas na terapia do câncer tais como daunorrubicina,

doxorrubicina, mitoxantrona, bleomicina e cisplatina promovem estresse oxidativo

pela produção de EROs (RUSSO et al., 1984; NOVAK; KHARASCH, 1985;

MANSAT-de MAS et al., 1999; MINOTTI et al., 2001; BAEK et al., 2003). O estresse

oxidativo é conhecido por afetar um número de funções celulares incluindo a

integridade de membrana celular (CEJAS et al., 2004) e causar instabilidade

genômica induzindo danos ao DNA (HIGUCHI, 2003).

71

O tratamento de células leucêmicas HL-60 com ambos compostos testados

levaram a um aumento dos níveis intracelulares de EROs de maneira concentração-

dependente, chegando a níveis máximos de 70,6% e 89% em células tratadas com

os compostos 1 e 2 na concentração de 2,0 µM, respectivamente na primeira hora

de exposição. Vários trabalhos demonstraram que a β-lapachona promove elevação

dos níveis de H2O2 e O2•– em células deficientes em NAD(P)H: quinona oxirredutase

(NQO1), como células de leucemia HL-60. Esse aumento nos níveis de EROs induz

a apoptose em estágios posteriores (SHIAH et al., 1999; PINK, et al., 2000),

Indicando que o mecanismo de indução de apoptose observado pelo tratamento do

composto 2 pode estar parcialmente relacionado a geração de EROs em HL-60,

visto que também há uma indução de EROS pelo composto 1 sem no entanto levar

a célula à apoptose. Portanto, novos estudos devem ser realizados para elucidação

do mecanismo de ação dos compostos testados e o envolvimento das EROS na

indução da apoptose.

72

6 CONCLUSÃO

Os resultados sugerem que a introdução do radical nitrofenilamino na posição

3 do anel furano (composto 2) aumenta a citotoxicidade da nor-β-lapachona

(composto 1) contra células HL-60 em aproximadamente seis vezes, no entanto,

essa aumento da citotoxicidade vem acompanhado pela perda parcial da

seletividade para células tumorais. O composto 2 induz morte celular por apoptose,

além de aumentar os níveis de espécies reativas de oxigênio. Esses achados

apontam para o potencial de quinonas sintéticas como protótipo para a produção de

novos compostos com propriedades anticâncer.

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ANEXO A – MATERIAIS UTILIZADOS

Equipamentos

Agitador de placa Shaker PSU – 2T plus

Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2

Agitador de tubo, Donner AD 8850

Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di

Centrífuga Centimicro FANEN Modelo 212

Centrífuga de lâminas, Serocito®, Centrifuge Mod. 2400, FANEM®

Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403

Centrífuga Excelsa Baby I FANEN Modelo 206

Citômetro de fluxo Guava EasyCyte Mine

Espectrofotômetro de placa, DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter, Inc. Fullerton, California, USA

Estufa de secagem e esterilização FANEM Modelo 315 SE

Fluxo laminar VECO

High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek 3000, Beckman Coulter

Incubadora de células (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow

Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070

Microondas, Panasonic

Microscópio de fluorescência, Olympus Modelo BX41

Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot

Microscópio óptico OPTON TNB-04T-PL/PZO-Labimex Modelo Studar lab

pHmetro, Micronal B474

Pipetas automáticas, Gilson

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3.1.2. Soluções e Reagentes

NOMES CONCENTRAÇÕES MARCA

Alamar Blue 0,312 mg/mL Sigma

Álcool Etílico 70% Vetec

0,2 g Eosina-Azul de Metileno

(May- Grunwald) Metanol q.s.p. 100 mL de solução

Reagen

Giemsa - Bioclin

1mg de iodeto de propídeo Boehringer

Iodeto de propídeo 1mg/mL

PBS q.s.p. -

Meio de cultura de células RPMI 1640

Diluído em água deionizada e esterelizada, filtrado em filtro millipore – 0,22 mm – e complementado com 10% SBF, 1% de glutamina, 1% de antibióticos, 1% de bicarbonato de sódio (0,75%) e 25 mM de HEPES

Cultilab

20 mg de MTT Sigma

MTT

PBS q.s.p. 100 mL de solução -

Penicilina 10.000 U.I./mL Cultilab

Penicilina - estreptomicina

Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab

8,5 g de Cloreto de sódio (0,85%) Labsynth

1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) Reagen

Solução salina (para

hemólise)

H2O q.s.p 1 L de solução -

93

Soro fetal bovino - Cultilab

8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth

2,14 g de NaHPO4.7H2O Labsynth

0,276 g de NaHPO4.H20 Labsynth

Tampão fosfato (PBS)

H20 q.s.p. 1 L de solução(pH = 7,2) -

DMSO Vetec

1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma® Anticorpo anti-BrdU

BSA 5 % q.s.p. 500 µL de solução Dako

Anticorpo biotinilidado anti-imunoglobulina de camundongo

1 µL de anticorpo anti-imunoglobulina

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução

Sigma®

BrdU 10mM - Sigma®

1mg de brometo de etídeo Sigma® Brometo de Etídio 100 µg/mL PBS q.s.p 10 mL de solução -

Citrato de Sódio - Grupo Química

Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®

EDTA - Qeel

1 µL de Estreptavidina – peroxidase Sigma® Estreptavidina – peroxidase

BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução Dako®

5 µL de DAB Immunotech

1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05M) pH= 7,6

Proquímios Diaminobenzidina (DAB)

2 µL de H2O2 Proquímios

Cloreto de sódio 1,5 M - SSC 10X

Citrato de sódio 0,15 M

94

H2O

8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®

2,14 g de NaHPO4.7H2O Labsynth®

0,276 g de NaHPO4.H20 Labsynth® Tampão fosfato (PBS)

H20 q.s.p. 1 L de solução (pH = 7,2) -

Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®

Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios®

Tampão Tris (TBS) 10X

H2O -

50 mL de Tripsina 2,5 % Cultilab®

0,125 g de EDTA Proquímios® Tripsina 0,25%

450 mL de PBS -

Triton X -100 - Isofar

Fármaco

Doxorrubicina Zodiac (fornecida pela farmácia do Instituto do Câncer do Ceará –

ICC).

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