TUGAS MATA KULIAH

TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA

(BIK 504)

OLEH :

SOGANDI

G851130241

PROGRAM STUDI BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

Sandwich ELISA for Hemoglobin A2 Quantification and

Identification of β-Thalassemia Carriers

Surakit Kuntaruk, Thanusak Tatu, Tiemjan Keowkarnkash, Watchara Kasinrerk

© The Japanese Society of Hematology, 2010

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah uji yang berdasarkan

pada sebuah plate yang dirancang untuk mendeteksi dan mengukur zat seperti

peptida, protein, antibodi dan hormon. Nama lain, seperti enzyme immunoassay

(EIA), juga digunakan untuk menggambarkan teknologi yang sama. Dalam

ELISA, antigen harus bergerak ke permukaan padat dan kemudian kompleks

dengan antibodi yang terkait dengan enzim. Deteksi dilakukan dengan menilai

aktivitas enzim terkonjugasi melalui inkubasi dengan substrat untuk menghasilkan

produk terukur. Unsur yang paling penting dari strategi deteksi ini adalah interaksi

antigen-antibodi yang sangat spesifik.

ELISA biasanya dilakukan di 96-well (atau 384-well) plate polystyrene,

yang secara pasif akan mengikat antibodi dan protein. Hal ini akan mengikat dan

mengimobilisasi reagen yang membuat ELISA begitu mudah untuk dirancang dan

dilakukan. Reaktan dari ELISA bergerak ke permukaan plate yang memudahkan

untuk memisahkan ikatan dari bahan nonikatan selama pengujian tersebut.

Kemampuan untuk membersihkan bahan nonspesifik terikat membuat ELISA

sebagai alat yang ampuh untuk mengukur analit tertentu dalam sebuah preparat

kasar.

ELISA dapat dilakukan dengan sejumlah modifikasi pada prosedur

dasarnya. Langkah kuncinya adalah imobilisasi antigen, dapat dilakukan dengan

adsorpsi langsung ke pelat uji atau tidak langsung melalui antibodi capture yang

telah melekat pada plate. Antigen tersebut kemudian dideteksi baik secara

langsung (antibodi primer berlabel) maupun tidak langsung (antibodi sekunder

berlabel). Format uji ELISA yang paling kuat adalah uji sandwich. Jenis uji

capture disebut "sandwich" assay karena analit yang akan diukur terikat antara

dua antibodi primer yaitu antibodi yang mengikat dan antibodi deteksi.

Gambar 1. Gambaran umum teknik ELISA

Dalam uji tersebut, antigen yang menarik bergerak oleh adsorpsi langsung

ke pelat uji atau dengan terlebih dahulu melekatkan antibodi capture ke

permukaan plate. Deteksi antigen kemudian dapat dilakukan dengan

menggunakan antibodi enzim-terkonjugasi primer (deteksi langsung) atau

mencocokan satu set dari antibodi primer berlabel dan enzim-terkonjugasi

sekunder (deteksi tidak langsung).

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan dua metode ELISA, yaitu

metode Indirect ELISA dan Sandwich ELISA.

Indirect ELISA

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA

yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi

dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan

suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik yang tertaut

enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel

yang diuji.

Gambar 2. Gambaran umum teknik indirect ELISA

Tahapan pada Indirect ELISA :

1. Coating plate ELISA

Coating dicapai melalui adsorpsi pasif antigen ke plate uji. Metode yang

paling umum untuk lapisan plate melibatkan penambahan 2-10 pg/ml dari

protein yang dilarutkan dalam buffer basa seperti phosphate-buffered saline

(pH 7,4) atau karbonat- buffer bikarbonat (pH 9,4). Pertama mikrotiter diisi

dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik

tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter selama

inkubasi dalam inkubator pada 370C selama semalam. Dalam penelitian ini

peneliti menggunakan 10μg/mL Hbs sebagai antigennya dengan buffer

bikarbonat pH 9,6.

2. Langkah pencucian

Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak

menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan

mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang

mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.

3. Penambahan Buffer Blocked

Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial

untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas

assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-

to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang

diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking.

4. Penambahan Antibodi Primer

Langkah ini melibatkan penambahan pendeteksi antibodi (larutan sampel)

yang diarahkan terhadap couting antigen. Larutan sampel yang mengandung

antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter,

sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang

diinginkan. Antibodi biasanya diencerkan dalam buffer blocked untuk

mencegah penempelan protein nonspesifik, peneliti menggunakan larutan 2%

BSA-PBS. Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama satu jam. Selanjutnya,

mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi

dengan antigen spesifik. Peneliti menggunakan 0,05% Tween-PBS sebanyak 4

kali.

Gambar 3. Proses pembilasan mikrotiter

5. Penambahan antibodi sekunder (konjugasi enzim antibodi)

Langkah selanjutnya adalah penambahan antibodi sekunder, yang

diencerkan dalam buffer block dan ditujukan terhadap antibodi primer. Diikuti

dengan inkubasi sampai terjadi pengikatan antibodi sekunder dengan enzim-

terkonjugasi. Pilihan antibodi enzim konjugasi ditentukan oleh tujuan dari

pengujian tersebut. Antibodi tersebut diproduksi terhadap imunoglobulin (Ig)

spesies di mana antibodi mendeteksi diproduksi dan disebut konjugasi anti-

spesies. Dengan demikian, jika mendeteksi antibodi yang diproduksi pada

kelinci, antibodi berlabel enzim akan menjadi anti-kelinci Ig di alam. Ini

memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dalam penggunaan konjugat anti-

spesies dalam kekhususan yang berbeda dari konjugasi dapat digunakan untuk

mendeteksi Ig tertentu yang mengikat dalam pengujian tersebut. Misalnya,

konjugat anti-spesies bisa menjadi anti-IgM, IgG1, IgG2 dan sebagainya.

Enzim dapat dihubungkan dengan protein seperti streptavidin jika antibodi

primer adalah berlabel biotin. Enzim yang paling umum digunakan (HRP) dan

alkaline phosphatase (AP). Enzim lain telah digunakan juga, tetapi mereka

belum diterima secara luas karena pilihan substrat terbatas. Ini termasuk β-

galaktosidase, acetylcholinesterase dan katalase. Dalam penelitian ini, peneliti

menggunakan immunoglobin anti-tikus horseradish peroxidase (HRP) sebagai

konjugat antispesiesnya.

6. Langkah pencucian

Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder

tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik dengan

buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4

kali pembilasan.

7. Penambahan substrat

Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.

Pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi

dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik

yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan

substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan

penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.

Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui

katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA

dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)

merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish

peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-

Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak

beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan substrat

TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin) Pemilihan substrat tergantung pada

sensitivitas uji yang diperlukan dan instrumentasi tersedia untuk sinyal deteksi

(spektrofotometer, fluorometer atau luminometer).

8. Larutan penghenti reaksi

Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi

dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk

mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai

intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.

Misalnya untuk substrat TMB bereaksi dengan horseradish peroxidase (HRP)

antibodi sekunder terkonjugasi untuk menghasilkan warna biru. Pada penelitian

ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada pembacaan 450 nm.

Kuantifikasi

Spektrofotometer yang dirancang khusus untuk dapat melalui sumur

mikrotiter baik secara tunggal atau dalam baris. Beberapa pembaca plat ELISA

yang tersedia, dengan meningkatnya tingkat kecanggihan. Beberapa di

antaranya menyediakan pengukuran densitas optik sementara beberapa tabulasi

data menerapkan analisis statistik. Kompatibilitas dengan komputer kecil, dan

ketersediaan program yang sesuai untuk memproses hasil dan mengubah

pembacaan densitas optik ke konsentrasi protein adalah hal-hal tambahan yang

penting untuk dicari ketika memilih instrumen. Sebagian besar pembaca

ELISA dapat diatur untuk mengukur absorbansi warna yang dihasilkan oleh

reaksi enzim-antibodi terkonjugasi pada substrat masing-masing pembaca

lempeng yang bekerja dengan sebuah sinar jenis tertentu dari cahaya pada

masing-masing sampel dalam lempeng sumur mikro. Mode deteksi yang umum

untuk tes lempeng adalah absorbansi, intensitas fluoresensi, luminescence,

waktu diselesaikan fluoresensi dan fluoresensi polarisasi. Sebuah sumber

cahaya menerangi sampel menggunakan panjang gelombang tertentu (dipilih

oleh filter optik, atau monokromator), dan detektor cahaya yang terletak di sisi

lain dari langkah-langkah awal (100%) cahaya yang disebarkan melalui

sampel, jumlah cahaya yang ditransmisikan biasanya akan berhubungan

dengan konsentrasi molekul terikat, ini disebut deteksi penyerapan. Kisaran

aplikasi deteksi intensitas fluoresensi jauh lebih luas daripada saat

menggunakan deteksi absorbansi, tapi instrumentasi biasanya lebih mahal.

Kelemahan metode indirect ELISA

Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA

direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada

saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan

antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,

sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu

pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik

tertaut enzim signal.

Kelebihan metode indirect ELISA

1. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang dijual bebas.

2. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh

penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada

wadah berbeda.

3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki

beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder

Sandwich ELISA untuk Kuantifikasi HbA2

Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi

(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua

(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.

Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA

sandwich.

Gambar 4. Gambaran umum teknik Sandwich ELISA

Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA

direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak

perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat

berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut

enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada

antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigen (sisi interaksi dengan antibodi) atau

antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA

sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,

sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam

pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk

mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada

suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA

sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan

akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Gambar 5. Diagram skematik kompetitif immuno assay

Gambar 6. Format nonkompetitif immuno assay

Tahapan pada Sandwich ELISA :

1. Coating plate ELISA

Pada ELISA sandwich, pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang

mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat

menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter. Dalam penelitian ini

antibodi penangkapnya menggunakan anti-HbA2 mAb ThalA2-1 sebanyak 10

μg/ml yang dilarutkan dalam buffer karbonat/bikarbonat pH 9,6 pada suhu 40C

dan didiamkan selama semalam.

2. Tahap pencucian

Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang

tidak menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan

mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung

0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.

Gambar 7. Proses pencucian plate

3. Penambahan Buffer Blocking

Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial

untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas

assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-

to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang

diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking. Dalam

penelitian ini menggunakan BSA 2%.

4. Penambahan larutan antigen

Larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke

dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi

penangkap dengan antigen yang diinginkan. Dalam penelitian ini dengan

penambahan HbA2 yang telah dimurnikan dengan konsentrasi dari 3.125

sampai 100 μg/ml yang ada dalam hemolisat sampel. Kemudian diinkubasi

selama 1 jam pada suhu 370C.

5. Tahap pencucian

Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak

berinteraksi dengan antibodi penangkap pada dinding lubang mikrotiter dengan

cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS)

yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.

6. Penambahan Enzim Konjugat Antibodi

Lalu, kedalam lubang mikrotiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi

detektor, sehingga pada lubang mikrotiter tersebut terjadi interaksi antara

antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Dalam penelitian ini

menggunakan FITC-conjugated anti-HbA2 mAb ThalA2-2 dengan konsentrasi

10 μg/ml dan diinkubasi pada pada suhu 370C selama satu jam untuk

membiarkan FITC-conjugated yang telah dilabel dengan antibodi berikatan

dengan molekul HbA2.

7. Tahapa pencucian

Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor

yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik.

8. Penambahan substrat

Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.

Pada tahap akhir ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim

signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah

berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat

dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan

penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.

Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui

katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA

dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)

merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish

peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-

Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak

beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan HRP-

conjugated rabbit anti-FITC antibody yang telah ditambahkan kedalam plate

dan pewarnaan dengan TMB substrat (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin).

9. Penambahan larutan penghenti reaksi

Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi

dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk

mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai

intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.

Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada

pembacaan 450 nm.

Gambar 8. Plate ELISA yang sudah terbetuk warnanya

Jumlah HbA2 dalam sampel yang diuji diperoleh dengan menerjemahkan

OD 450 nm untuk unit konsentrasi (μg/ml) dengan menggunakan kurva standar

yang dikembangkan di plate yang sama. Jumlah relatif HbA2 sebagai persentase

dari total Hb (% HbA2) kemudian dihitung menggunakan persamaan berikut :

[kadar HbA2 dalam mg/ml] / [Hemoglobin total dalam mg/ml] x 100

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi

tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi

penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang mikrotiter dan Afinitas

dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen. Sebenarnya,

teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA

terdahulu, yaitu ELISA direct.

Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat

spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat

berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi

detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan,

yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat

multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi

antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

Interpretasi Kurva ELISA

Grafik diatas menunjukkan bahwa konsentrasi suatu sampel akan

berbanding terbalik dengan banyaknya jumlah antibodi yang terikat.

Hasil

Produksi dan karakterisasi mAbs menjadi HbA2

Untuk mengubah mAbs menjadi HbA2, dua tikus Balb/c diimunisasi

dengan HbA2 yang telah dimurnikan dengan interval 2 minggu. Setelah imunisasi

ketiga, respon antibodi poliklonal untuk HbA2 di kedua tikus itu cukup kuat (titer

[1:32,000). Seekor tikus dipilih untuk generasi hibridoma. Supernatan budaya

hyrbidomas yang dihasilkan diuji dengan indirect ELISA menggunakan berbagai

jenis Hbs sebagai antigen. Dua klon hibridoma menghasilkan antibodi yang dapat

mengenali HbA2 tapi tidak untuk Hbs. Kedua mAbs yang isotipe dengan IgG1.

Hasilnya menunjukkan bahwa mAbs ThalA2-1 dan ThalA2-2 khusus bereaksi

terhadap HbA2 dan dapat digunakan untuk membangun ELISA untuk kuantifikasi

HbA2.

Pengembangan sandwich ELISA untuk kuantisasi HbA2

Sebagai tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan ELISA

yang efektif untuk kuantifikasi HbA2, jenis ELISA terpilih menjadi sistem assay.

Dengan diproduksinya mAbs anti-HbA2, sandwich ELISA telah berhasil

dikembangkan. Anti-HbA2 mAb ThalA2-1 digunakan sebagai antibodi pertama

untuk lapisan plate sebagai penangkap molekul HbA2 dalam sampel. Yang kedua

anti-HbA2 mAb ThalA2-2 yang berlabel dengan FITC digunakan untuk

mendeteksi HbA2 yang terikat. HRP conjugate ditambahkan ke sistem untuk

mendeteksi pengikatan antibodi FITCl ke plate. Dengan sistem ini, kurva standar

mendeteksi HbA2 dalam kisaran 3,125-100 μg/ml mengikuti hukum Beer dengan

OD 450 nm berkisar 0,191-1,732 diperoleh gambar dibawah ini.

Kekhasan sandwich ELISA divalidasi menggunakan ELISA yang

dikembangkan untuk mengukur berbagai jenis Hbs. Hanya HbA2 yang dapat

dideteksi oleh ELISA.

Penilaian keandalan tingkat HbA2 ditentukan oleh sandwich dikembangkan

ELISA

ELISA yang dikembangkan telah digunakan untuk penentuan kadar HbA2

yang terdapat di hemolysates diperoleh dari berbagai penelitian. Analisis

hubungan jelas menunjukkan bahwa kadar HbA2 ditentukan oleh sandwich

ELISA berkorelasi sangat baik dengan yang ditentukan oleh metode HPLC.

Untuk memanfaatkan tingkat HbA2 untuk diagnosis thalassemia, cut-off poin dari

tingkat HbA2 dibuat dari nilai-nilai pada batas 2SD, yang berkisar masing-masing

2,5 dan 4,0% untuk sandwich ELISA dan HPLC. Sandwich ELISA yang

dikembangkan mampu mengukur kadar HbA2 dalam HbE-bearing (HbE sifat dan

homozigot HbE), yang tidak bisa dilakukan oleh HPLC konvensional.

ELISA yang dikembangkan kemudian diterapkan dalam penentuan tingkat

HbA2 di diketahui sampel darah rutin dan diagnosis yang diperoleh kemudian

dibandingkan dengan yang dihasilkan dengan metode HPLC. Analisis dari 112

sampel darah rutin menunjukkan bahwa teknik ELISA yang dikembangkan

memiliki kapasitas yang sebanding untuk mendeteksi heterozigot β-thalassemia

dengan teknik HPLC dengan sensitivitas 100%, 95% spesifisitas, akurasi 95%,

nilai prediksi 82,3% positif dan 100% nilai prediksi negatif .

Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah berhasil mengembangkan ELISA

sandwich untuk kuantifikasi HbA2. Teknik ini sederhana, cepat dan dapat

digunakan untuk mengidentifikasi operator β-thalassemia. Oleh karena itu dapat

diadaptasi untuk skrining skala besar untuk β -thalassemia di daerah endemik.

Dengan demikian, peneliti mendorong penggunaan strategi ini dalam penyaringan

untuk β -thalassemia di negara-negara yang memiliki keterbatasan sumber daya.

Referensi

Graphad Prism. 2003. Step-by-Step Examples Nonlinear Standard Curves: RIA

and ELISA. Graphad software. San Diego, CA.

Ibrahim A. Darwish. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in

Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances.

International journal of Biomedical science. vol. 2 no. 3 september 2006.

Kuntaruk, Surakit; Thanusak Tatu; Tiemjan Keowkarnkah et al. 2010. Sandwich

ELISA for hemoglobin A2 quantification and identification of β-

thalassemia carriers. Hematol journal. DOI 10.1007/s12185-009-0490-3.

SeraCare. 2013. Technical Guide for ELISA (Protocols & Troubleshooting). 800-

638-3167: www.kpl.com

Yang and Ma. 2009. Western Blotting and ELISA Techniques. Sciencepub journal.

1(2):67-86.