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V1: Methoden der Proteinbestimmung
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Methodik:
• Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford sowie der Korrekturverfahren nach Warburg & Christian sowie Kalb & Bernlohr
• UV-Spektren von Protein- und Nukleinsäurelösungen
Photometrie (altgr. φῶς phos ‚Licht‘ und μετρεῖν metrein ‚messen‘) Messverfahren im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichtes mit Hilfe eines Photometers (Wikipedia)
Spektroskopie (klassisch) (lat. spectrum ‚Erscheinung‘ und altgr. σκοπεύω‚ „sehen“) Die Untersuchung der Lichtemission bzw. -absorption von Molekülen und Atomen mit Hilfe von Gitter- und Prismenspektrometern.
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Anwendungsbereiche der Photometrie
• Direkte Konzentrationsbestimmung von Chromophoren(Proteine, Nukleinsäuren, Coenzyme ...)
Versuche 1 und 4• Indirekte Konzentrationsbestimmung nach Bindung farbiger Liganden:
Eichkurve notwendig (Proteinbestimmung nach Bradford)Versuch 1
• Abschätzung der Partikeldichte einer Suspension: Eichkurve bzw. Erfahrungswert notwendig (Bakteriendichte)
Versuch 6• Enzymkinetik (farbiges oder chromogenes Substrat, evtl. Hilfsreaktion)
Versuche 2 und 3Nutzen der quantitativen Proteinbestimmung:
• Beurteilung von Zellaufschlüssen• Beurteilung von Proteinreinigungsverfahren• Bestimmung von Enzymaktivitäten
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Aufbau eines (Spektro)-Photometers
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Proteinbestimmungsmethoden
• Trübungsmessungen (z.B. optische Dichte 600nm)
• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay
• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit
• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)
• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)
Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse
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Proteinbestimmungsmethoden
• Trübungsmessungen
• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay
• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit
• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)
• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)
Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse
BCA assay – Pierce Chemical Company
The bicinchoninic acid (BCA) assay procedure. Addition of copper (II) ions to a protein solution in an alkaline medium reduces the copper (II) ions to copper (I). BCA added to the solution chelates copper (I) in a 2:1 stoichiometry. The BCA-Cu+ complex produces a strong purple color.
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Proteinbestimmungsmethoden
• Trübungsmessungen
• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay
• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit
• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)
• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)
Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse
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Proteinbestimmung nach Bradford
Spektrum des Protein-Farbstoff-Komplexes (595 nm)
Farbstoff allein (465 nm)
Bindung an positiv geladeneSeitenketten
Struktur des FarbstoffsCoomassie Brilliant Blue G-250
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Proteinkonzentration über Komplexbildung
Komplexbildung bei Farbreaktionen• Spezifität und Nachweisempfindlichkeit können durch Komplexbildung
und/oder Farbstoffbindung erhöht werden • Darstellung: Extinktion gegen Konzentration (M oder mg/ml)• Messung nicht über den gesamten Konzentrationsbereich linear: Eichkurve notwendig !• Als Eichprotein wird meist Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) verwendet
E
c
linearer Bereich
SättigungKomplexzerfall
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Proteinbestimmungsmethoden
• Trübungsmessungen
• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay
• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit
• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)
• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)
Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse
Beer-Lambert Gesetz
II0
Sample, conc c
l
𝐼 𝐼𝐼
∆𝐼𝐼
I is the light transmittedby the strip l
∆𝐼𝐼 · 𝑐 · ∆𝑙
The amount of light transmitted depends
on the sample lengthand concentrationconstant
of proportionality
𝑑𝐼𝐼 𝑐 𝑑𝑙 ln
𝐼𝐼 𝑐𝑙 log10
𝐼𝐼 𝜀𝑐𝑙
Estinktionskoeffizient
From http://www.iorodeo.com/content/determining-molar-extinction-coefficient-erythrosin-b
log10𝐼𝐼 𝜀 𝑐 𝑙
E 𝜀 𝑐 𝑙
Extinktion
spezifischeExtinktionskoeffizient
Die gängige Einheit des Extinktionskoeffizienten ist L·mol−1·cm−1.
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UV-Messungen zur Proteinbestimmung
E = -log10 (I / I0) = ε ꞏ c ꞏ d
Extinktionsmessung bei 280 nm zur Quantifizierung von Proteinen• Aromatische Verbindungen (Aminosäuren, Nukleotide)
absorbieren wegen der leichten Anregbarkeit der -Elektronensysteme im UV-Bereich ( = 250-280 nm)
• In Proteinen wird die Absorption überwiegend durch Tryptophan und Tyrosin bestimmt; dafür wird eine Messung bei 280 nmdurchgeführt
Nukleinsäuren
Aminosäuren
Aminosäuren
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Korrekturverfahren zur Proteinbestimmung
Vermeidung von Fehlmessungen bei Rohextrakten• Problem: Nukleinsäuren, Nukleotide und Coenzyme absorbieren
im selben Spektralbereich wie die aromatischen Aminosäuren
• Korrekturmöglichkeit: Rechnerische Berücksichtigung eines möglichen Nukleinsäurebeitrags (E260), oder Einbeziehung der Absorption der Peptidbindung zur Quantifizierung (E230)
• Warburg & Christian: cProtein (mg/ml) = 1,55•E280 – 0,76•E260
• Kalb & Bernlohr: cProtein (µg/ ml) = 183•E230 – 75,8•E260
260 nm
280 nm
230 nm
Protein
DNA
Molekularbiologie 06/15
DNA Konzentrationsbestimmung
DNA Konzentration: -> E260 (möglich um E320 zu korrigieren (Trübung der Lösung)
-> dabei entspricht E260 von 1.0 = 50µg/ml pure dsDNA.
-> Konzentration (µg/ml) = (E260) × dilution factor × 50µg/ml
DNA Reinheit wird bestimmt durch (A260/A280) = (E260) ÷ (E280)
-> saubere DNA hat ein E260/E280 Verhältnis zwischen 1.7–2.0.
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Messungen am Photometer
• Messküvetten müssen absolut sauber und fettfrei sein (Fingerabdrücke!)
• Blindwert (Photometer-Nullpunkt) ist das im Versuch benutzte Verdünnungsmittel
• Messprobe und Verdünnungsmittel bzw. Farbstoffreagenz werden in einem geeigneten Reaktionsgefäß gründlich gemischt und anschließend in die Küvette pipettiert
• Glas- bzw. Quarzküvetten sind sehr empfindlich, werden nur für den jeweiligen Versuch ausgegeben und müssen nach Versuchsende sorgfältig gereinigt zurückgegeben werden.
• Nur Messbereich zwischen 0,1 und 1 ist verlässlich!
Versuch 1 - Methoden der Proteinbestimmung
1. Erstellen einer Eichkurve nach der Bradford-Methode8 Konzentrationen RSA, Eichkurve durch Millimeterpapier
Tip: GUT MISCHEN!!!!2. Proteinbestimmung anhand der Bradford-Eichkurve
ADH, Lysozym, RSA - je 3 x Note: alle nach der gleichen Reaktionszeit messen!
3. UV-Spektren ausgewählter Proteinlösungen – Bestimmung von Messung von 1:10 UND 1:20 verdünnten Lösungen + VergleichNote: Direkt in die Küvette pipettieren
Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!!4. UV-Spektrum einer Nukleinsäurelösung
DNA Probe, Konzentration und Reinheit bestimmenDNA-Spektren mit Protein-Spektren überlagernNote: Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!!
Um Überraschungen zu vermeiden Gleich am Tag der Messung rechnen !!!!