UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

SABRINA GONDIM RIBEIRO MOTA

ENSAIO IN VITRO E ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA DE INIBIDORES DA ENZIMA LANOSTEROL 14α-

DESMETILASE DE Moniliophthora perniciosa

Feira de Santana 2009

SABRINA GONDIM RIBEIRO MOTA

ENSAIO IN VITRO E ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA DE INIBIDORES DA ENZIMA LANOSTEROL 14α-

DESMETILASE DE Moniliophthora perniciosa

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Santos Castilho

Feira de Santana 2009

Dedico esta dissertação aos meus exemplos de vida: meus

pais, Prof. Jorge Marcos Ribeiro Silva e Profa. Mércia

Maria Gondim Ribeiro Silva. Dedico, também, a Tiago

Pinto Mota, que com muito amor e compreensão sempre

me apoiou e estimulou a dar este grande passo estando ao

meu lado e me encorajando nos momentos difíceis.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Marcelo Santos Castilho, orientador desta dissertação, pela

oportunidade de realização conjunta deste trabalho, pela valiosa orientação, pela confiança em

mim depositada, por todo empenho, sabedoria, compreensão e, acima de tudo, exigência.

À Profa. Dra. Tânia Fraga Barros, colaboradora desta dissertação, por sua ajuda

indispensável à realização deste trabalho, interesse, desprendimento e por todo carinho

dedicado.

Aos coordenadores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Prof. Dr.

Aristóteles Góes Neto e Profa. Dra. Angélica Maria Lucchese, pela oportunidade de

crescimento, aprendizado, realização profissional e pessoal.

Aos Profs. Alex Gutterres Taranto e Laurival Villas-Boas por aceitar participar da

Banca de Defesa desta dissertação, proporcionando discussões e sugestões que servirão para

crescimento, aprendizado e incentivo à pesquisa.

Aos meus familiares e amigos que sempre me deram amor e força.

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução dessa

dissertação de Mestrado.

A Fapesb pelo suporte financeiro essencial à realização deste trabalho.

RESUMO

O fitopatógeno causador da vassoura-de-bruxa, Moniliophthora perniciosa, têm causado grandes prejuízos à produção de cacau, principalmente no estado da Bahia, a maior região produtora de cacau do continente Americano. Diante do grande impacto econômico e social decorrente dessa doença, vários programas de controle foram desenvolvidos, contudo eles apresentam baixa eficiência. Tebuconazol, Hexaconazol e Triadmenol, derivados da classe dos triazóis, são ativos tanto in vitro quanto in loco contra M. perniciosa, contudo não existe um estudo sistemático sobre a atividade de derivados de azóis frente a este fitopatógeno. Visando caracterizar a atividade de derivados imidazólicos e triazólicos, frente a M. perniciosa, bem como, criar modelos quantitativos que descrevam sua atividade fungicida, um ensaio de susceptibilidade foi padronizado a partir do método de disco difusão, técnica pour plate e métodos computacionais utilizados nas análises quimiométricas. O método supervisionado SIMCA foi capaz de classificar corretamente 100% dos compostos ativos e inativos, utilizando três componentes principais. O melhor modelo classificatório (distância interclasse de 2,38) diferencia claramente compostos ativos dos inativos e consegue classificar corretamente todos os inibidores do conjunto teste. Os descritores F08[N-Cl], BEHe3, F06[N-Cl] e B06[C-O] apresentam o maior poder discriminante e de modelagem entre as classes. Os inibidores mais potentes têm valores negativos de PC1 e PC2 com JGI4, B06[C-O] e B07[C-O] contribuindo para a maior potência desses compostos. Inibidores muito ativos como Ciproconazol, Tebuconazol e Metconazol têm valores intermediários de eletronegatividade, ausência ou presença do fragmento N-Cl a uma distância topológica de 06 ou 08, presença do fragmento C-O a distância topológica de 06 e 07 e valores elevados de momento dipolo. Palavras-chave: Vassoura-de-bruxa. Derivados de Azóis. Métodos Quimiométricos.

ABSTRACT

Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease in Theobroma cacao, significantly affected cacao production, especially in Bahia state, the largest cocoa producing region of American. Considering the large social and economic impact resulting from this disease, several programs have been developed, however they have low efficiency. Tebuconazole, Hexaconazole and Triadimenol, triazole derivatives, are active both in vitro as in loco against M. perniciosa, however there is no systematic study on the activity of azoles against this phytopatogen. In order to characterize the activity of imidazole and triazoles derivatives, against M. perniciosa, and develop a quantitative model that describe their fungicidal activity, a susceptibility test was standardized from the disk diffusion method, pour plate technique and computational methods were used in the chemometric analysis. The supervised method SIMCA was able to correctly classify 100% of active and inactive compounds, using 3 principle components. The best classification model (interclasse distance of 2.38) clearly differentiates active and inactive compounds and can classify correctly all inhibitors of the test set. The descriptors F08 [N-Cl], BEHe3, F06 [N-Cl] and B06 [C-O] have the greater modeling and discriminating power between the classes. The most potent inhibitors have negative values of PC1 and PC2 with JGI4, B06[C-O] e B07[C-O] contributing to the greater power of these compounds. Inhibitors very active as Ciproconazol, Tebuconazole and Metconazole have intermediate values of eletronegativity, presence or absence of N-Cl fragment a topological distance of 06 or 08, presence of C-O fragment a topological distance of 06 and 07, and high values of dipole moment. Keywords: Witches’ broom disease. Azoles derivates. Chemometric Analysis

LISTA DE ABREVIATURAS

14α-DM 14α-desmetilase 2D Bidimensional 3D Tridimensional - Não houve inibição de crescimento % Porcentagem μM/disc Micromol por disco A Átomo a Coeficiente de ajuste ATCC American type culture collection BDO Biological stove with oxygen demand C Carbono CEPLAC Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira CIM Concentração inibitória mínima Cl Cloro CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CPD Citrato peptona e dextrose CYP Citocromo P 450 D Distância d Distância euclideana DMSO Dimetilsulfóxido F Flúor g gramas HCA Hierarquical Cluster Analysis IPP Difosfato de Isopentenil K Número de vizinhos KNN K-Nearest Neighbors LOO Leave-one-out mL Mililitro mm Millimetro N Nitrogen nm Nanometro O Oxigênio PC Principal Component PCA Principal Component Analysis PLS Parcial Least Square BDA Agar batata dextrose QSAR Quantitative structure relationship RLM Regressão Linear Múltipla S Matriz de Similaridade s Índice de similaridade SDV Decomposição do Valor Singular SIMCA Soft Independent of Class Analogy T Total inibição de crescimento TA Tipo de átomo UFCs Unidades formadoras de colônia US $ Dólar Americano v Descritores originais

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Exportação/Importação Brasileira de cacau em Milhões US$ no período de 1989-2007 sem incluir os custos de transporte como frete e seguro. Adaptado a partir do site Alice Web (http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/). 14 Figura 2: Biossíntese comparativa de isoprenóides estruturais de membrana nos cinco reinos. Adaptado a partir de Brown (1998). 18 Figura 3: Biossíntese simplificada do ergosterol em fungos a partir do esqualeno destacando as enzimas que são alvo das principais classes de inibidores. 1- derivados de alil aminas, 2- derivados de azóis, 3 e 4- derivados de morfolinas. Adaptado a partir de Griffith (2008). 19 Figura 4: Exemplos de derivados de azóis. 21 Figura 5: Estrutura cristalográfica de lanosterol 14α- desmetilase de M. tuberculosis em complexo com fluconazol (código do PDB, 1EA1). 23 Figura 6: Comparação da taxa de toxicidade oral aguda (LD50 mg/Kg) em rato entre os dez agroquímicos e medicamentos mais vendidos em 2003. Adaptado a partir de Delaney e colaboradores (2006). 25 Figura 7: Representação tridimensional da superfécie molecular no sítio ativo de Lanosterol 14α-desmetilase de Micobacterium tuberculosis em complexo com fluconazol (código do PDB, 1EA1). 27 Figura 8: Esquema geral dos estudos de QSAR. 28 Figura 9: Descritores 2D e 3D gerados a partir de fragmentos estruturais. Sendo, A, átomo; D, distância interatômica; e TA, tipo de átomo. 29 Figura 10: Projeção das componentes principais construídas em ordem decrescente da quantidade de variância. Adaptado a partir de Waterbeemd and Rose (2003). 31 Figura 11: Representação do método KNN para classificação de uma nova amostra considerando um vizinho (A) e três vizinhos (B). 33 Figura 12: Representação dos modelos SIMCA com diferentes números de componentes principais para cada classe. Quadrados classe 1 e Triângulos classe 2. 34 Figura 13: Inibição de crescimento de M. perniciosa com 0,6 μM/disco de antifúngico, através da difusão de disco: A Etaconazol; ausência de inibição; B Econazol; halo de 40:38 mm; C Tebuconazol; inibição total de crescimento; D Controle de meio, E Controle de DMSO, F Controle de crescimento, G, H e I Controle de Processo. 43 Figura 14: Análise Hierárquica de Agrupamentos para todos os compostos do conjunto de dados. Compostos ativos estão representados em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. * Conjunto Teste. 44

Figura 15: Análise Hierárquica de Cluster para os compostos do conjunto Treino. Compostos ativos estão representados em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. 48 Figura 16: Análise das componentes principais dos compostos ativos e inativos para o conjunto. 50 Figura 17: Gráfico dos pesos dos descritores para PC1 e PC2. 51 Figura 18: Adequação dos compostos do conjunto Treino à classe inativa e ativa segundo modelo KNN, utilizando quatro vizinhos. 53 Figura 19: Poder discriminante dos descritores selecionados segundo SIMCA. 54 Figura 20: Poder de modelagem dos descritores selecionados segundo SIMCA. 55 Figura 21: Distância interclasse dos compostos ativos e inativos do conjunto treino e teste segundo SIMCA. 55 Figura 22: Padrão de Atividade versus eletronegatividade. O número 1 representa os compostos ativos e 2 os compostos inativos. 59 Figura 23: Análise de componentes principais dos compostos ativos do conjunto treino contra M. perniciosa segundo SIMCA 60 Figura 24: Importância dos descritores selecionados segundo o modelo SIMCA para Componentes Principais 1 e 2. 60

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Derivados imidazólicos e triazólicos comerciais obtidos da empresa Sigma-Aldrich Fisher com grau de pureza igual ou superior as 95%. 35 Tabela 2: Reagentes utilizados no ensaio de susceptibilidade de derivados de azóis frente a M. perniciosa. 36 Tabela 3: Diâmetro dos halos de inibição (mm) formados em cultura de M. perniciosa, obtidos pelo Método de disco difusão, em reposta a derivados imidazólicos e triazólicos comerciais na concentração de 2,4, 1,2 e 0,6 µM por disco. 42 Tabela 4: Descritores presentes no modelo final de SIMCA. 46 Tabela 5: Correlação entre os descritores utilizados nas análises quimiométricas. 49 Tabela 6: Valores dos descritores presentes no modelo final de SIMCA. 57

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 13 1.1 IMPACTO ECONÔMICO E FORMAS DE CONTROLE DA VASSOURA-DE-BRUXA 13 1.2 OBJETIVOS 16 1.2.1 Objetivo geral 16 1.2.2 Objetivos específicos 16 2 REVISÃO DA LITERATURA 17 2.1 A VIA DO ERGOSTEROL 17 2.2 LANOSTEROL 14α-DESMETILASE 19 2.3 DERIVADOS DE AZÓIS 20 2.4 A INDÚSTRIA AGROQUÍMICA E O DESENVOLVIMENTO DE NOVOS PRODUTOS 24 2.5 ESTRATÉGIAS MODERNAS APLICADAS AO PLANEJAMENTO RACIONAL MOLÉCULAS BIOATIVAS 26 2.6 QSAR 28 3 MATERIAIS E MÉTODOS 35 3.1 AQUISIÇÃO DE REAGENTES 35 3.2 ENSAIO SUSCEPTIBILIDADE DE M. perniciosa. DISCO DIFUSÃO 36 3.2.1 Cultivo e obtenção de suspensões homogêneas de unidades formadoras de colônias (UFCS) 36 3.2.2 Preparação das soluções padrões de antifúngicos 37 3.2.3 Impregnação dos discos com antifúngicos 37 3.2.4 Inóculo 38 3.2.5 Leitura dos resultados 38 3.2.6 Controles 38 3.3 ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA 38 3.3.1 Conjunto de Dados 38 3.3.2 Cálculo dos Descritores 39 3.3.3 Seleção de Descritores 39 3.3.4 Validação dos Modelos 39 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40 4.1 PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO DE SUSCEPTIBILIDADE DE M. perniciosa-DISCO DIFUSÃO 40 4.2 ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA 43 4.2.1 Conjunto de Dados 43 4.2.2 Estudos de reconhecimento padrão 45 5 CONCLUSÃO 62 REFERÊNCIAS 63

APÊNDICES 72 APÊNDICE A - ESTRUTURA QUÍMICA E PADRÃO DE ATIVIDADE DO CONJUNTO DE INIBIDORES UTILIZADOS NOS ESTUDOS DE QSAR. (Compostos ativos em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. * Conjunto teste) 73

1 INTRODUÇÃO

1.1 IMPACTO ECONÔMICO E FORMAS DE CONTROLE DA VASSOURA-DE-BRUXA

O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma árvore nativa da região amazônica, cujo

cultivo alcança grande expressão nas regiões tropicais do mundo por conta do valor industrial

e alimentício de suas sementes (amêndoas), que são usadas na produção de chocolate, polpas

e manteiga de cacau (CHAVES; GIANFAGNA, 2007; PURDY; SCHIMIDT, 1996).

Contudo, um dos principais fatores biológicos que limitam a produção mundial do cacau e

seus derivados são infecções fúngicas (ANEJA et al, 2005; MEINHARDT et al, 2008; MEJÍA

et al, 2008). Dentre elas, pode-se destacar a vassoura-de-bruxa (ANEJA et al., 2005; MEJÍA

et al, 2008), causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa (AIME;

PHILLIPS-MORA, 2005) (Agaricales, Marasmiaceae), que se constitui no maior problema

fitopatológico das regiões produtoras de cacau do continente americano (GARCIA et al, 2007;

PEREIRA et al, 2005; PURDY; SCHIMIDT, 1996).

Moniliophthora perniciosa exibe um ciclo de vida hemibiotrófico que se

desenvolve paralelamente aos sintomas na planta (RINCONES et al, 2008). Os sintomas mais

característicos da vassoura-de-bruxa, causados apenas pela fase biotrófica do fungo, são

hiperplasia e hipertrofia dos tecidos meristemáticos infectados, resultando na perda da

dominância apical, aparecimento de frutos partenocárpicos e subseqüente necrose e morte dos

tecidos infectados (CHAVES; GIANFAGNA, 2007; KILARU et al, 2007; RINCONES et al,

2008). O ciclo de vida do patógeno se completa com a produção de basidiocarpos nos tecidos

necróticos da planta. Durante esta segunda fase, o fungo desenvolve um micélio dicariótico

saprofítico com conexões em grampos (CEITA et al, 2007; MEINHARDT et al, 2006).

No Brasil, a doença é endêmica na região amazônica, mas também atinge os

estados do Pará, Rondônia, Mato Grosso, Acre e, especialmente, o Estado da Bahia, principal

pólo produtor de cacau do Brasil. A enfermidade foi detectada no Sul da Bahia em 1989 e

desde então tem ocasionando uma queda drástica na produção de cacau (GARCIA et al, 2007;

GRIFFITH et al, 2003; MEINHARDT et al, 2008; PURDY; SCHIMIDT, 1996) devido,

principalmente, às condições propícias para a rápida disseminação do fungo na região, como,

por exemplo, alta densidade de fazendas de cacau, condições climáticas favoráveis e presença

de variedades da planta altamente suscetíveis (GRIFFITH, 2004); tornando o Brasil de um

país tipicamente exportador, em importador de cacau (MEINHARDT et al, 2008), como pode

ser observado na Figura 1.

14

89/9

0

91/9

2

93/9

4

95/9

6

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8

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0

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0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

FOB

Milh

ões d

e U

S$Exportação/Importação Brasileira

Exportação

Importação

Figura 1: Exportação/Importação Brasileira de cacau em milhões US$ no período de 1989-2008 sem incluir os

custos de transporte como frete e seguro. Adaptado a partir do site Alice Web

(http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/).

Além do impacto econômico, destacam-se ainda prejuízos sociais e ambientais,

visto que a cultura do cacau gera uma grande quantidade de empregos diretos e indiretos.

Após a introdução da doença, muitas fazendas de cacau da região foram abandonadas,

gerando com isso a demissão dos trabalhadores rurais que migraram do campo para as cidades

em busca de alternativas de renda, ampliando ainda mais as favelas e o desemprego nas

grandes cidades. A substituição da cultura do cacau, por outras que não utilizam o

sombreamento, contribuiu também para o desmatamento da Mata Atlântica (PAIM et al,

2006; RINCONES et al, 2006; TREVIZAN; MARQUES, 2002).

Diante do grande impacto econômico, social e ambiental decorrente desta doença,

vários programas de manejo foram desenvolvidos (PEREIRA et al, 1996; PURDY;

SCHIMIDT, 1996; RICONES et al, 2006), como por exemplo, podas fitossanitárias, controle

biológico, controle químico e seleção de cultivares resistentes. No entanto, todas as estratégias

desenvolvidas até o momento permitem controlar apenas parcialmente a doença (OLIVEIRA;

LUZ, 2005).

O manejo fitossanitário, que consiste na remoção de grupos de vassoura infectadas,

adotado com o objetivo de reduzir a fonte de inóculo e os danos causados, possui um custo

elevado e baixa eficácia (SHAW et al, 2007). Enquanto que o controle biológico, utilizando,

15

principalmente, fungos endofíticos do gênero Trichoderma ssp., ainda não apresenta eficácia

suficiente no controle das partes afetadas (ANEJA et al, 2005; LANA, 2004; MEJÍA et al,

2008; SILVA, 2007; DE-SOUZA et al, 2008).

Atualmente, a forma mais econômica, estável e ambientalmente desejável de

controle da vassoura-de-bruxa consiste no emprego de variedades resistentes. No entanto, a

seleção de cultivares clonais resistentes é baseada em informações limitadas sobre a

variabilidade genética do patógeno e do hospedeiro (RICONES et al, 2006; SILVA et al,

2007).

Além disso, uma das grandes preocupações de técnicos e produtores se refere à

perda de resistência dos cultivares clonais utilizados pelos agricultores. Isso se justifica pelo

fato de estudos genômicos demonstrarem que os fungos presentes na região da Bahia são

originários de apenas dois genótipos, enquanto que na Amazônia pelo menos seis genótipos

diferentes foram identificados (RINCONES et al, 2006). Como resultado, os cultivares

resistentes selecionados a partir de genótipos da Bahia, podem ser susceptíveis a novos

genótipos amazônicos que venham a infectar a região cacaueira baiana. De fato, já há relatos

da perda de resistência do genótipo Scavina 6 de Theobroma cacao no Equador, na Amazônia

e no Sul da Bahia (SILVA et al, 2007).

Uma opção para o combate à vassoura-de-bruxa é o controle químico da infecção.

Entretanto, fungicidas tópicos têm pouca ou nenhuma eficácia contra M. perniciosa, fato

relacionado ao crescimento ativo das partes infectadas e necessidade de aplicação regular de

fungicidas durante a estação chuvosa, o que tornaria este procedimento economicamente

inviável. Alternativamente, podem-se utilizar antifúngicos sistêmicos no combate a vassoura-

de-bruxa, contudo a maioria dos agentes testados até o momento têm demonstrado eficiência

somente nos testes in vitro não apresentando esta reprodutibilidade no campo.

Os antifúngicos da classe dos azóis constituem uma exceção: Tebuconazol,

Hexaconazol e Triadmenol, derivados da classe dos triazóis, são ativos tanto in vitro quanto in

loco contra M. perniciosa (MCQUILKEN et al, 1988; OLIVEIRA; LUZ, 2005). Por essa

razão, inibidores da via do ergosterol são considerados uma alternativa viável para o controle

da vassoura-de-bruxa (MCQUILKEN et al, 1988). Esses compostos foram desenvolvidos para

o tratamento de infecções fúngicas nos seres humanos e para tanto tiveram sua atividade

biológica planejada frente à Candida albicans. Embora esses agentes antifúngicos apresentem

atividade contra fitopatógenos, como M. perniciosa, diferenças evolutivas e moleculares entre

esses organismos podem resultar em uma ação limitada dos azóis sobre M. perniciosa ou

mesmo permitir a inibição diferencial da enzima do fungo. Nesse contexto, os derivados de

16

azol podem ser considerados como uma classe de compostos protótipos cuja atividade

inibitória frente a M. perniciosa deve ser otimizada.

A otimização da potência desses compostos pode ter implicações comerciais, pois o

custo dos azóis é um dos principais empecilhos ao seu uso em larga escala no combate da

vassoura-de-bruxa. Esse fato aliado ausência de modelos quantitativos/quimiométricos que

expliquem como a estrutura química de fungicidas da classe dos azóis está relacionada com

sua atividade biológica constituem um sério problema para o desenvolvimento de fungicidas

mais potentes contra M. perniciosa.

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo geral

Criar modelos quantitativos que relacionem a estrutura química de derivados

imidazólicos e triazólicos comerciais com sua atividade fungicida frente à Moniliophthora

perniciosa.

1.2.2 Objetivos específicos

1. Padronizar o ensaio de inibição do crescimento de M. perniciosa.

2. Identificar derivados imidazólicos e triazólicos comerciais com atividade antifúngica

frente a M. perniciosa.

3. Criar modelos de reconhecimento de padrão que descrevam as relações entre a estrutura

química e a atividade biológica dos fungicidas testados, utilizando métodos

supervisionados e não supervisionados.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 A VIA DO ERGOSTEROL

O controle de fitopatologias, causadas por vírus, bactérias, micoplasma e fungos,

pode ser realizado por diferentes métodos, dentre eles aplicações de agroquímicos. Na prática,

a maioria dos agroquímicos disponíveis pertence à classe dos fungicidas que agem ao

interferir diretamente em funções essenciais à sobrevivência dos fungos tais como respiração,

divisão celular, biossíntese de esteróides e etc. (JOLY; LEMARIÉ, 2002; LEROUX, 2003).

Esteróides são derivados isoprenóides que exercem funções essenciais não só em

fungos, mas também em todos os seres eucariotos, pois desempenham um papel fundamental

na integridade da membrana celular, onde estão inseridos, regulando sua fluidez,

permeabilidade e, indiretamente, modulando a atividade e distribuição de proteínas associadas

à membrana, incluindo, enzimas e canais iônicos (DEMEL; DE-KRUFF, 1976;

LEPESHEVA; WATERMAN, 2007).

Além disso, esteróides estão envolvidos em mecanismos de sinalização celular (ex:

rafts lipídicos) (KARPEN et al, 2001) e dão origem a diversas moléculas biologicamente

ativas, como os hormônios (BENVENISTE, 2004).

A biossíntese e estrutura dos esteróides diferem significantemente entre os reinos

(DARNET; RAHIER, 2003) (Figura 2). Plantas superiores, algas, fungos e vertebrados

sintetizam esteróides através de via metabólicas bastante complexas que tem suas origens na

via glicolítica. A cascata enzimática a partir de difosfato de isopentenil (IPP) até 2,3-óxido

esqualeno é comum a todos os eucariotos. No entanto, as rotas biossintética a partir deste

ponto divergem entre os reinos, dando origem a diferentes esteróides; no animal o principal

esteróide sintetizado é o colesterol, enquanto nos fungos encontra-se principalmente o

ergosterol e em plantas superiores o sitosterol (BACH; BENVENISTE, 1997; BENVENISTE,

2004).

18

Figura 2: Biossíntese comparativa de isoprenóides estruturais de membrana nos cinco reinos. Adaptado a partir

de Brown (1998).

Uma descrição detalhada da via dos esteróides pode ser encontrada em Bach e

Benveniste (1997) e em Benveniste (2004). A seguir será dada maior ênfase a via do

ergosterol, e, em particular, a enzima lanosterol 14α-desmetilase, pois nesta via várias etapas

bioquímicas são consideradas importantes alvos para o desenvolvimento de fungicidas

(ARNOLDI et al, 2007; MCEWEN; GUTTERIDGE, 2007).

A biossíntese de ergosterol se inicia com a conversão de esqualeno em esqualeno

epóxido pela ação da enzima esqualeno epoxidase. Esse intermediário é então ciclizado a

lanosterol, o primeiro esteróide dessa rota biossintética (GRIFFTH, 2008). Reações

subseqüentes incluem: metilação em C24, desmetilação em C14 e C4, formação de ligações

duplas no núcleo esteróidal (C5-6 e C7-8), hidrogenação da ligação dupla em C24-28 e

formação da ligação dupla entre C22-23 na cadeia lateral. As reações ocorrem geralmente

nesta ordem, com pequenas variações entre os reinos, principalmente na seqüência de

transformações das últimas três ligações duplas (GRIFFITHS et al, 2003; MERCER, 1984).

No entanto, em todos os organismos a molécula de esteróide só se torna funcional após a

remoção de três grupos metil nas posições C4 e C14 (DARNET; RAHIER, 2003). Na Figura

19

3 é mostrado um esquema simplificado da biossíntese do ergosterol, a partir do esqualeno,

enfatizando as enzimas que são alvo das principais classes de agentes antifúngicos,

atualmente disponíveis.

Figura 3: Biossíntese simplificada do ergosterol em fungos a partir do esqualeno destacando as enzimas que são alvo das principais classes de inibidores. 1- derivados de alil aminas, 2- derivados de azóis, 3 e 4- derivados de

morfolinas. Adaptado a partir de Griffith (2008).

De acordo com o sítio de ação, quatro classes principais de inibidores da via do

ergosterol podem ser identificadas: inibidores de esqualeno epoxidase (ex. derivados de alil

aminas), inibidores de lanosterol 14α-desmetilase (ex. derivados de azóis), inibidores de Δ8, 7

isomerase e Δ14 redutase (ex. derivados de morfolinas), como pode ser visto na Figura 3.

Dentre eles, os mais usados são os derivados de azóis, que agem como inibidores da enzima

lanosterol 14α-desmetilase (LEROUX, 2003).

2.2 LANOSTEROL 14α-DESMETILASE

A enzima lanosterol 14α-desmetilase (14αDM) de levedura, descrita por Yoshida e

colaboradores (AOYAMA; YOSHIDA, 1978; YOSHIDA et al, 1977) foi a primeira

20

monoxigenase do Citocromo P450 de eucariotos inferiores a ter sua estrutura primária

determinada (KALB et al, 1986), sendo então classificada como pertencente a família CYP51.

Evolucionariamente distantes, os membros da família CYP51 apresentam baixa

identidade seqüencial (aproximadamente 30%) (LEPESHVA et al, 2003; LEPESHEVA;

WATERMAN, 2007). No entanto, alinhamentos múltiplos de diversas enzimas homólogas

demonstram que CYP51 está presente em animais, plantas e fungos (YOSHIDA et al, 2000).

Nestes organismos, CYP51 catalisa a remoção oxidativa, régio e estereoseletiva, na

via biossintética de esteróides, do grupo 14α-metil de percussores de esteróides ao

intermediário insaturado Δ14,15 (JI et al, 2000; LEPESHEVA; WATERMAN, 2007; TALELE

et al, 1999). Durante o ciclo catalítico o substrato sofre três reações sucessivas de

monoxigenação, resultando na formação dos intermediários 14α-hidroximetil, 14α-

carboxialdeído e 14α-formil. Em seguida, o grupo 14α-aldeído é eliminado na forma de ácido

fórmico com a introdução de uma insaturação entre os C14 e 15 do esqueleto esteroidal.

CYP51 é o único membro dentro da superfamília do Citocromo P450 que

desempenha o mesmo papel metabólico nos diferentes reinos (JI et al, 2003; LEPESHEVA et

al, 2003). Entretanto, em cada um desses reinos, os substratos que sofrem desmetilação no

C14 diferem quanto à composição da cadeia lateral (por exemplo: lanosterol,

dihidrolanosterol, 24(28)-metileno-24,25-dihidrolanosterol) ou quanto à ausência de um

grupo metil no C4 do esqueleto esteroidal (por exemplo: obtusifoliol) (JI et al, 2000;

LEPESHEVA et al, 2003; LEPESHEVA; WATERMAN, 2007). Isso decorre de diferenças

estruturais no sítio ativo da enzima que permitem sua modulação seletiva (YOSHIDA et al,

2000). Por essa razão e pelo papel fundamental que essa enzima desempenha na biossíntese

de ergosterol, lanosterol 14αDM é considerada um bom alvo para o desenvolvimento de

fungicidas (BARTROLI et al, 1998a, b; DI-SANTO et al, 2005; SHENG et al, 2006).

2.3 DERIVADOS DE AZOL

Os derivados de azol foram sintetizados na década de 70 para o tratamento de

infecções fúngicas em humanos e rapidamente ganharam grande importância para a proteção

de várias lavouras, pois representaram um progresso significante no controle químico de

fitopatologias causadas por fungos (ARNOLDI et al,2000, 2007). Um exemplo conhecido é o

fluconazol, que apesar de desenvolvido pela indústria farmacêutica Jansen foi efetivamente

coberto por uma patente agroquímica antes da sua utilização clínica (DELANEY et al, 2006).

21

Desde então, muitos outros derivados de azol foram sintetizados na tentativa de

aumentar o espectro de ação, seletividade e potência dessa classe de compostos (BARTOLI et

al, 1998a, 1998b; TAFI et al, 1996). Como regra geral, esses compostos têm um anel

heterocíclico de cinco membros com o átomo N1 ligado a outro anel aromático via um ou

mais átomos de carbono alifáticos e podem ser classificados em dois grandes grupos,

imidazólicos ou triazólicos, de acordo com o número de átomos de nitrogênio no anel azol,

Figura 4 (GRIFFITH, 2008).

Figura 4: Exemplos de derivados de azóis.

Derivados de azol agem pela inibição competitiva da enzima lanosterol 14α-

desmetilase acarretando na depleção de ergosterol e no acúmulo de lanosterol e outros

esteróides 14α-metilados na membrana (CHEN et al, 2007; GHANNOUM; RICE, 1999; JI et

al, 2000; SHENG et al, 2006). Estes esteróides induzem mudanças na estrutura e função da

membrana plasmática resultando na redução da atividade de enzimas associadas à membrana,

aumento de permeabilidade celular e, levando, em último caso, à inibição do crescimento e

22

replicação celular (GRIFFTH, 2008; TAFI et al, 1996, 2002; TALELE et al, 1999; TALELE;

KULKARNI, 1999).

A inibição de CYP51 se deve principalmente à interação do átomo de nitrogênio

heterocíclico (N3 para imidazóis e N4 para triazóis) com o átomo de ferro do grupo heme no

sítio ativo da enzima via interações π- π além de interações hidrofóbicas com o grupo heme e

também com o restante do sítio ativo (JI et al, 2003; SHENG et al, 2006; TAFI et al, 1996,

2002).

A inibição diferencial entre a enzima do fungo e do hospedeiro humano é a base da

ação seletiva destes inibidores e esta é determinada pela complementaridade diferencial entre

a estrutura dos agentes azólicos no sítio ativo da enzima dos diferentes organismos (JI et al,

2000, 2003; TAFI et al, 1996; TALELE et al, 1999; TALELE; KULKARNI, 1999). O mesmo

pode ser afirmado para utilização de derivados de azóis como fungicidas em diversas

plantações. A partir dessa constatação, procurou-se planejar derivados de azóis que tivessem

maior complementaridade estérica com o sítio ativo da enzima do fungo.

O planejamento com base na estrutura tridimensional (3D) do alvo terapêutico é

uma estratégia limitada pela ausência de estruturas 3D da enzima lanosterol 14αDM de fungos

obtidas experimentalmente. Esta limitação se deve ao fato de que todas as isoformas da

CYP51 de seres eucariotos, caracterizadas até o momento, serem proteínas associadas à

membrana, dificultando, portanto a resolução de suas estruturas tridimensionais (CHEN et al,

2007; SHENG et al, 2006).

Nesse sentido, a resolução da estrutura cristalográfica da enzima 14α-desmetilase

de Micobacterium tuberculosis em complexo com derivados de azol (fluconazol e 4-

fenilimidazol), Figura 5, deu um novo alento a trabalhos que utilizam técnicas baseadas na

estrutura do alvo macromolecular (PODUST et al, 2001; SHENG et al, 2006; XIAO et al,

2004).

23

Figura 5: Estrutura cristalográfica de lanosterol 14α- desmetilase de Micobacterium tuberculosis em complexo

com fluconazol (código do PDB, 1EA1).

Como forma de exemplificar, o modelo tridimensional da CYP51 de Candida

albicans sugere que o grupo fenil halogenado, dos inibidores azólicos, se encaixa em um

bolsão hidrofóbico e que a cadeia lateral de alguns inibidores, como o itraconazol e o

cetoconazol, ultrapassam o sítio ativo e interage com resíduos no canal de acesso do substrato

(CHEN et al, 2007; JI et al, 2000). De forma análoga, a maior potência do voriconazol frente

ao fluconazol, foi proposta por Fukuoka e colaboradores (2003) como resultado de interações

hidrofóbicas mais fortes com aminoácidos aromáticos no sítio ativo da enzima devido ao

grupo metila adicional desses inibidores.

Uma alternativa que não depende da estrutura 3D do alvo terapêutico, são os

estudos de QSAR (do Inglês, Quantitativity Structure Activity Relationship). Esta estratégia

auxilia na identificação das relações entre a estrutura química e a atividade biológica dos

compostos em estudo, guiando o desenvolvimento de novos fungicidas mais potentes e,

eventualmente, auxiliando no entendimento da topografia do sítio ativo da enzima (TAFI et

al, 1996). De fato, Fratev e Benfenati (2005) demonstraram que é possível identificar, através

de mapas de regressão de modelos de QSAR-3D, as regiões responsáveis pela diferença de

atividade dos derivados de azol frente a fungos leveduriformes e filamentosos. Como

demonstrado por nosso grupo de pesquisa que identificou a importância de substituições

nucleofílicas para maior atividade de derivados de bifonazol frente à Candida albicans

24

(MOTA et al 2009). Isso deixa evidente a importância de técnicas baseadas no ligante para o

desenvolvimento de novos fungicidas e sugere que as exigências estruturais amplamente

estudadas para C. albicans não se aplicam, necessariamente, para M. perniciosa.

2.4 A INDÚSTRIA AGROQUÍMICA E O DESENVOLVIMENTO DE NOVOS

PRODUTOS

O desenvolvimento de novos produtos para a proteção de lavouras é um mercado

em franco desenvolvimento que apresenta um grande número de oportunidades inovadoras

(HARRISON, 1999; SMITH, 2003) em virtude da necessidade crescente, por parte dos

agricultores e da população de maneira geral, pela comercialização de produtos mais eficazes,

seletivos, com menores custos e que causem menores danos ecológicos (ARNOLDI et al,

2007; HARRISON, 1999; JOLY; LEMARIÉ, 2002). O uso de produtos químicos no

ambiente é fortemente regulamentado necessitando de um grande número de provas de

segurança e eficácia antes da autorização para sua comercialização. Por exemplo, para

garantir a segurança do ambiente, os agroquímicos são testados contra um grande número de

animais incluindo, mamíferos, aves, peixes e invertebrados (DELANEY et al, 2006; PRICE;

WATKINS, 2003).

Por essas razões, nos últimos 50 anos o controle químico de pragas passou do uso

indiscriminado de biocidas, como o ácido sulfúrico, creosoto e derivados arsênicos, para

compostos altamente seletivos e potentes com muitas das características dos fármacos

modernos. De fato, a maioria dos agroquímicos modernos tem afinidade na ordem de

nanomolar por um único alvo molecular permitindo assim interações extremamente potentes e

seletivas. Em conseqüência disso, doses cada vez menores de agroquímicos são aplicadas no

ambiente (DELANEY et al, 2006; PRICE; WATKINS, 2003).

Adicionalmente, como pode ser observado na Figura 6, que compara a taxa de

toxicidade oral aguda em ratos entre os 10 agroquímicos e medicamentos mais vendidos em

2003, agroquímicos não são inerentemente mais tóxicos do que medicamentos (DELANEY et

al, 2006).

25

Figura 6: Comparação da taxa de toxicidade oral aguda (LD50 mg/Kg) em rato entre os dez agroquímicos e

medicamentos mais vendidos em 2003. Adaptado a partir de Delaney e colaboradores (2006).

De fato, fármacos e agroquímicos compartilham muitas características inclusive no

que se refere aos projetos de planejamento e desenvolvimento de novos produtos. Em ambos

os casos, as moléculas bioativas são desenvolvidas por ciclos iterativos de síntese e avaliação

de atividade biológica, visando com isso empregar noções similares da REA (Relação entre

Estrutura Química e Atividade) para guiar o planejamento de compostos de interesse

(DELANEY et al, 2006; JOLY; LEMARIÉ, 2002).

Assim como na indústria farmacêutica, o processo inovador de desenvolvimento de

novos produtos no setor agroquímico envolve as seguintes atividades básicas: descoberta de

uma nova entidade química com atividade biológica definida, triagem de compostos em

ensaios biológicos, formulação de produtos para comercialização, ensaios in loco e registro.

Neste processo, a fase de descoberta de novas entidades químicas pode ser conduzida por

diferentes métodos, dentre eles, busca aleatória de compostos líderes, síntese química de

compostos análogos, a partir de fontes naturais ou por planejamento racional (JOLY;

LEMARIÉ, 2002).

26

O desenvolvimento de novos agroquímicos é um processo que leva cerca de dez

anos e tem um custo superior a 150 milhões de dólares (HARRISON, 1999). Esses dados

justificam os investimentos superiores a 2,5 bilhões de dólares realizados pelas dez maiores

companhias do setor na descoberta e desenvolvimento de novos pesticidas no ano de 2004.

(DELANEY et al, 2006, WHEELOCK; MIYAGAWA, 2006). Entretanto, observa-se uma

diminuição na taxa de produtos agrícolas introduzidos no mercado anualmente. Esta redução

coincide com o dramático aumento no tempo e custo para a introdução de um novo produto

no mercado. Na tentativa de reduzir o tempo e acelerar o processo de descoberta de novos

agentes agroquímicos, várias estratégias modernas, como ensaios em larga escala, química

combinatória, genômica, proteômica, metabolômica, quimio e bioinformática estão sendo

empregados (WHEELOCK; MIYAGAWA, 2006; SMITH, 2003).

2.5 ESTRATÉGIAS MODERNAS APLICADAS AO PLANEJAMENTO RACIONAL

MOLÉCULAS BIOATIVAS

As estratégias modernas aplicadas ao planejamento de moléculas bioativas são uma

abordagem interativa e multidisciplinar que envolve a integração de uma grande variedade de

tecnologias e especializações e empregam uma combinação de métodos experimentais e

computacionais (BARREIRO, 2002; RICHON; YOUNG, 2007; GUIDO et al, 2008). Neste

processo, métodos de quimio e bioinformática são ferramentas amplamente empregadas desde

a fase de identificação de novas entidades químicas, até a otimização de propriedades físico-

químicas e estruturais que levam ao aumento da potência e seletividade (CONGREVE et al,

2005; JÓNSDÓTTIR et al, 2005). De fato, um importante passo na ação de moléculas

bioativas, tais como os agroquímicos, é sua interação com receptores biológicos

(VISWANADHAN et al, 1989) e que propriedades físico-químicas e estruturais do receptor e

do ligante governam esta interação (FERREIRA, 2002; GHOSE et al, 1987).

Atualmente, um dos maiores desafios da indústria é a identificação de novas

entidades químicas a partir do amplo espaço químico virtual ou real, gerado pelo advento da

química combinatória, na década de 90 (GUIDO et al, 2008; WATERBEEMD; ROSE, 2003).

Tal situação serviu como estímulo para o desenvolvimento de técnicas alternativas como, por

exemplo, o ensaio virtual, que envolve a análise de grandes coleções de compostos através de

métodos computacionais (MOLFETTA, 2007). De fato, muitos passos da estratégia moderna

de descoberta de novas moléculas biologicamente ativas podem ser conduzidos de um modo

racional pelo uso de métodos computacionais (GUIDO et al, 2008).

27

Em termos gerais, os métodos disponíveis para o planejamento de moléculas

bioativas pode se beneficiar de informações provenientes da estrutura do receptor ou de

ligantes conhecidos, que exercem a atividade biológica desejada (MASON, 2006).

No planejamento baseado na estrutura do receptor (SBDD, do Inglês, Structure

Based Drug Design), o conhecimento da topografia molecular, geralmente obtido por

cristalografia de raio-X ou por técnicas de RMN (Ressonância Magnética Nuclear), permite

identificar os índices de complementariedade molecular entre bioligante-receptor, Figura 7, a

partir do emprego de técnicas computacionais, como por exemplo acoplamento molecular,

definindo-se, conseqüentemente, os diferentes tipos de interações envolvidas (ANDERSON,

2003; KLEBE, 2000).

Figura 7: Representação tridimensional da superfécie molecular no sítio ativo de lanosterol 14α-desmetilase de

Micobacterium tuberculosis em complexo com fluconazol (código do PDB, 1EA1).

Embora esta estratégia ofereça uma série de informações importantes para

otimização da potência e seletividade, sua utilização é limitada nos casos em que os alvos

terapêuticos não possuem sua estrutura tridimensional conhecida (RICHON; YOUNG; 2007

VISWANADHAN et al, 1989), situação na qual se encontra a maioria das enzimas da via do

ergosterol (RUGE et al, 2005).

Uma alternativa bastante empregada nestes casos é a utilização de técnicas de

planejamento baseadas no ligante (LBDD, do inglês Ligand-Based Drug Design). Esta

estratégia se baseia na análise comparativa da similaridade molecular entre moléculas com

28

estrutura e atividade biológica conhecida como, por exemplo, substrato, co-fator, ligante

endógeno ou inibidor, e moléculas desconhecidas, na busca por moléculas inéditas que

apresentem atividade biológica desejada (TROPSHA, 2006; VISWANADHAN et al, 1989).

Quando já se conhecem compostos com a atividade biológica desejada, técnicas de LBDD

podem ser úteis na otimização da potência e seletividade desses compostos. Dentre as

estratégias utilizadas para esta finalidade, pode-se destacar a utilização de estudos de QSAR.

2.6 QSAR

O entendimento de que as interações dos compostos químicos com macromoléculas

biológicas são governadas por forças intermoleculares, como por exemplo, hidrofóbica,

eletrostáticas, polar e estérica, foram críticos para a formulação e desenvolvimento do

paradigma do QSAR (HANSCH; SELASSIE, 2006). A fim de identificar quais dessas forças

têm papel predominante na interação ligante-receptor, descritores baseados na estrutura

molecular dos compostos são gerados e algoritmos computacionais/métodos quimiométricos

são utilizados para correlacionar as características físico-química e estruturais destes (v1, v2,

...vn) com seus respectivos valores de atividade biológica, (IC50, Ki) (GHOSE, et al, 1987),

Figura 8.

Figura 8: Esquema geral dos estudos de QSAR.

29

As características estruturais dos compostos biologicamente ativos são

representadas por descritores, derivados a partir de propriedades físico-químicas e parâmetros

que descrevem hidrofobicidade, efeitos estérico, eletrônico, etc., a partir de gráficos

moleculares quantitativos (descritores topológicos moleculares) ou da representação 3D de

moléculas, e servem como variável independente na representação dos compostos no espaço

químico multidimensional (TROPSHA, 2006).

A precisão da descrição depende do tipo de descritor utilizado. Descritores

quânticos, calculados a partir da função de onda das moléculas, são altamente eficazes,

porém, demandam tempo considerável para serem calculados. Por outro lado, descritores

como tipo de átomos, ligações ou grupos funcionais (descritores 1D- unidimensionais) são

gerados rapidamente, mas pouco eficazes para a diferenciação molecular. Um compromisso

interessante entre esses dois extremos pode ser alcançado com descritores 2D

(bidimensionais) e 3D que são calculados a partir de fragmentos estruturais de forma rápida e

apresentam boa eficácia na descrição das moléculas (Figura 9) (WILLET, 1998).

Figura 9: Descritores 2D e 3D gerados a partir de fragmentos estruturais. Sendo, A, átomo; D, distância

interatômica; e TA, tipo de átomo.

Como centenas de descritores moleculares estão disponíveis para as análises de

QSAR, e apenas um subconjunto deles é estatisticamente significante em termos de

correlação com a atividade biológica, torna-se essencial nas análises quimiométricas uma

seleção preliminar de descritores (GAO et al, 2002).

Dentre as várias ferramentas disponíveis para esta finalidade, pode-se utilizar o

Peso de Fisher que é definido como a medida da distância entre duas categorias ou a distância

normalizada entre duas classes, podendo ser calculado a partir da diferença entre os valores

médios de cada classe dividido pela soma das variâncias das classes, Equação 1.

30

( )2,1,

22,1,

PSDPSD

PSDPSD

SSxxF

+−

= 1

Em que, 1,PDx , 2,PDx descrevem os valores médios das classes 1 e 2,

respectivamente, e 1,PDS , 2,PDS descrevem os desvios padrões para as classes

(CAVALCANTI et al, 2004; WANG et al, 2005).

Na seqüência é preciso fazer a seleção do modelo matemático/método

quimiométrico mais adequado para descrever a propriedade biológica do conjunto de

compostos. Esta escolha depende da qualidade e do tipo de conjunto de dados a ser analisado

(WATERBEEMD; ROSE, 2003). Quando a propriedade biológica é medida de forma

contínua (ex: Ki, IC50), pode-se utilizar modelos de regressão linear. Por outro lado, quando a

propriedade biológica é medida de forma discreta (ex: ativo/inativo) deve-se empregar

métodos classificatórios (KNN, do Inglês- K-Nearest Neighbors, e SIMCA, do Inglês- Soft

Independent Modeling of Class Analogy). Em ambos os casos também pode-se utilizar análise

multivariada dos dados (HCA, do Inglês- Hierarquical Cluster Analysis, e PCA, do Inglês-

Principal Components Analysis) para identificar padrões não evidentes no conjunto de dados

(WATERBEEMD; ROSE, 2003; DUMM, et al, 1978).

Inicialmente, os estudos de QSAR utilizavam Regressão Linear Múltipla (RLM)

para encontrar uma função linear entre variáveis dependentes (descritores físico-químicos e

estruturais) e a variável independente (atividade biológica) (TROPSHA, 2006). Entretanto,

RLM não é adequado para analisar conjunto de dados contendo um grande número de

descritores, geralmente altamente intercorrelacionados ou descrevendo informações

redundantes, porque à medida que o número de descritores se aproxima do número de

compostos no conjunto de dados ocorre um ajuste “forçado” no modelo de RLM. Este ajuste

forçado consiste na obtenção de valores elevados do coeficiente de correlação, decorrente do

número excessivo de descritores incluídos no modelo e não de seu ajuste natural aos valores

observados de atividade (FERREIRA et al, 2002; WHITLEY et al, 2000). Nestes casos outra

técnica estatisticamente mais robusta, a Regressão por Mínimos Quadrados Parciais ou PLS

(do Inglês, Partial Least Square), pode ser utilizada (WATERBEEMD; ROSE, 2003). Este

tipo de regressão se fundamenta na análise de componentes principais como descrito a seguir.

A análise de componentes principais, inicialmente descrita por Pearson em 1901 e

Helling em 1933, é uma técnica estatística multivariada que consiste em reescrever as

31

coordenadas dos compostos e descritores em outro sistema de coordenadas, chamada de

componentes principais (PC’s). Este novo sistema de coordenadas é criado através da

combinação linear das coordenadas originais, onde o conjunto original de dados é projetado

(MOLFETTA et al, 2005; NETO; MOITA, 1998; SHAL; GEMPERLINE, 1990;

WATERBEEMD; ROSE, 2003). De um modo geral, as combinações lineares das m-variavéis

originais podem ser representadas pela Equação 2:

mimiii vavavaPC +++= ...2211 2

Em que, vj (j=1,2,3,..,m) são as descritores originais e aij (para j=1,2,3...,m) são os

coeficientes que medem a importância de cada descritor na i-ésima componente principal

(PCi), ou seja, o peso que cada um deles tem naquela combinação linear. Este peso é o co-

seno do ângulo entre o eixo da componente principal e o eixo da variável original, portanto

ele pode assumir valores entre 1 e -1. Se o coeficiente estiver próximo de zero, menor será a

influência da variável naquela componente principal, mas, se estiver próximo de +/-1 maior a

influência que esta determinada variável tem na descrição da componente principal

(MOLFETA, 2007). Estas PC’s devem ser ortogonais entre si, como pode ser visto na Figura

10, e são construídas pela combinação linear das variáveis originais geralmente utilizando a

técnica de Decomposição do Valor Singular (SDV), de forma que este novo conjunto de

variáveis é construído em ordem decrescente da quantidade de variância (NETO; MOITA,

1998). Como vantagem, as PC’s concentram a maior parte da variabilidade do conjunto de

dados original em poucas variáveis, diminuindo assim a dimensionalidade dos dados sem

perda significativa da informação química (FERREIRA, 2002).

Figura 10: Projeção das componentes principais construídas em ordem decrescente da quantidade de variância. Adaptado a partir de Waterbeemd and Rose (2003).

32

HCA é uma ferramenta de análise multivariada de dados que auxilia na análise

visual da distribuição dos compostos no espaço químico, por representá-los no espaço 2D

enfatizando a formação de agrupamentos segundo as propriedades físico-químicas e

estruturais dos compostos. Os resultados, de natureza qualitativa, são representados na forma

de dendogramas, cujas linhas horizontais representam os compostos e as linhas verticais a

similaridade entre pares de compostos, entre classes de compostos ou entre um composto e

uma classe (FERREIRA, 2002).

Na HCA a distância entre os compostos ou descritores é calculada a partir da

Distância Euclidiana entre eles. Os valores obtidos são utilizados para construir uma matriz de

similaridade S cujos elementos são os índices de similaridade, sij, entre os pontos i e j, que

podem variar de zero (nenhuma similaridade) a um (identidade). Os índices de similaridade

são calculados segundo a expressão:

máx

ijij d

ds −=1

3

Em que, dij representa a distância entre os compostos i e j e dmáx a distância máxima

entre qualquer par de compostos (NETO; MOITA, 1998).

As ferramentas quimiométricas descritas até aqui são classificadas como métodos

de reconhecimento padrão não supervisonados, uma vez que a atividade biológica não é

considerada na análise de PCA e HCA. Os métodos de reconhecimento supervisionado

padrão, por sua vez, englobam técnicas discriminatórias e de modelagem de classes e

desempenham um importante papel na química e em outros campos da ciência. Estas técnicas

utilizam conjunto de compostos, previamente classificados (conjunto treino), para encontrar

regras classificatórias que permitem predizer a qual classe um novo composto deve pertencer

(DASZYKWOSKI et al, 2007; KOWALSKI; BENDER, 1972; SHAL; GEMPERLINE, 1990;

DUNN et al,1978).

Nas técnicas discriminatórias, as regras classificatórias procuram dividir o espaço

químico entre as classes do conjunto treino. Um exemplo desse tipo de abordagem é a

classificação com base em vizinhos próximos (KNN), a qual se baseia na comparação da

distância Euclidiana. A classificação de um composto desconhecido é, então, determinada

com base na distância deste composto em relação aos K compostos mais próximos do

conjunto treino. O composto desconhecido é então atribuído à classe com o maior número de

33

vizinhos relacionados a ela, ou seja, mais próximos (MOLFETA et al, 2005). Um exemplo de

classificação com o método KNN é mostrado na Figura 11. Nesta, o composto desconhecido

(circulo em roxo) é atribuído a classe dos quadrados se apenas um vizinho mais próximo for

considerado, se, entretanto, o número de vizinhos é elevado para três a classificação desse

composto muda.

A. B.

Figura 11: Representação do método KNN para classificação de uma nova amostra considerando um vizinho (A) e três vizinhos (B).

Já, nas técnicas de modelagem de classe como, por exemplo, o SIMCA, limita-se o

espaço químico ao redor das classes, permitindo que um composto desconhecido possa ser

classificado como pertencente a uma das classes ou mesmo a nenhuma delas (GONZÁLEZ-

ARJONA; GONZÁLES, 1998).

Além disso, ao contrário do método KNN, que utiliza todos os descritores para

posicionar os compostos no espaço químico, o método SIMCA, introduzido por Syvante

Wold em 1976, utiliza PCA para reduzir a dimensionalidade dos descritores (WOLD, 1976).

Neste método obtêm-se uma regra classificatória, para o conjunto de dados de m classes

conhecidas, pela construção de uma região de confiança ao redor de cada classe

(DASZYKOWSKI et al, 2007). Para atingir esse objetivo um modelo de PCA com f PC’s é

construído para cada classe do grupo treino separadamente, possibilitando assim, que cada

grupo possa ser descrito em diferentes dimensões, Figura 12. Na etapa seguinte, um

composto cuja atividade é desconhecida, pode ser classificado de acordo com sua projeção no

subespaço definido através de cada modelo de PCA (BRANDEN; HUBERT, 2005).

K=1 K=3

34

Figura 12: Representação dos modelos SIMCA com diferentes números de componentes principais para cada

classe. Quadrados classe 1 e Triângulos classe 2.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 AQUISIÇÃO DE REAGENTES

Foram adquiridos trinta e três (33) derivados imidazólicos e triazólicos comerciais

da empresa Sigma-Aldrich Fisher com grau de pureza igual ou superior as 95% (Tabela 1).

Tabela 1: Derivados imidazólicos e triazólicos comerciais obtidos da empresa Sigma-Aldrich Fisher com grau

de pureza igual ou superior as 95%.

Antifúngico Código Derivado Antifúngico Código Derivado

Azaconazol 34045 Triazólico Bifonazol B8773 Imidazólico

Bromuconazol 46094 Triazólico Cetoconazol K1003 Imidazólico

Ciproconazol 46068 Triazólico Climbazol 36127 Triazólico

Clotrimazol C6019 Imidazólico Diclobutrazol 36764 Triazólico

Difenoconazol 36531 Triazólico Diniconazol 46049 Triazólico

Econazol E4632 Imidazólico Epoxiconazol 36848 Triazólico

Etaconazol 45471 Triazólico Fenbuconazol 46096 Triazólico

Fluconazol F8929 Triazólico Fluotrimazol 45507 Triazólico

Fluquinconazol 46301 Triazólico Flusilazol 45753 Triazólico

Flutriafol 34344 Triazólico Imazalil 36130 Imidazólico

Itraconazol 16657 Triazólico Metconazol 37909 Triazólico

Miclobutanil 34360 Triazólico Miconazol M3512 Imidazólico

Penconazol 36189 Triazólico Prochloraz 45631 Imidazólico

Propiconazol 45642 Triazólico Prothioconazol 34232 Triazólico

Sulconazol S9632 Imidazólico Tebuconazol 36565 Triazólico

Triadimefon 45693 Triazólico Triadimenol 46138 Triazólico

Triticonazol 34172 Triazólico

Todos os demais reagentes utilizados nos ensaios de susceptibilidade a M.

perniciosa estão listado na Tabela 2.

36

Tabela 2: Reagentes utilizados no ensaio de susceptibilidade de derivados de azóis frente a M. perniciosa.

Reagente Marca

Ácido Sulfúrico Quimex

Ágar Batata Dextrose Acumedia Manufactures

Citrato de Magnésio Qeel- Indústrias Químicas Cloreto de Bário P.A. Dihidratado Vetec

Dextrose Difco Laboratories

Dimetilsulfóxido Labsynth Produtos para Laboratórios Ltda.

Peptona Bacteriologica Himedia Laboratories Potássio de Fosfato

Monobásico Quimis

3.2 ENSAIO SUSCEPTIBILIDADE DE M. perniciosa. DISCO DIFUSÃO

Os ensaios de susceptibilidade dos derivados de azol, obtidos comercialmente,

frente a M. perniciosa foram padronizados a partir de adaptações do método de disco difusão,

técnica pour plate (LIMA et al, 1993), e modificações do protocolo NCCLS (National

Committee for Clinical Laboratory Standards) Norma M-44A (Method for Antifungal Disk

Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Guideline).

3.2.1 Cultivo e obtenção de suspensões homogêneas de unidades formadoras de colônias

(UFCS)

A fragmentação e recuperação das hifas foram realizadas conforme descrito por

Filho e colaboradores (2006) com algumas adaptações. A linhagem 948 F de M. perniciosa

obtida da CEPLAC (Comissão Executiva do Plano da Lavora Cacaueira) foi inoculada em

placas de Petri, contendo meio BDA, as quais foram incubadas a 28º C por 10 dias em estufa

de demanda biológica de oxigênio (BDO) marca Quimis. Após incubação e crescimento,

blocos de cerca de 2-3mm de diâmetros foram retirados da periferia do micélio e transferidos

para tubos de ensaio contendo 2g de pérolas de vidro (212-300 micrometros - código G1277)

e submetidos a agitação intensa em Vortex da marca Mixtron Modelo , na velocidade quatro

por três minutos. Alíquotas de 3mL desta suspensão foram então inoculados em frascos de

37

Erlenmeyer contendo 10mL de caldo CPD, suplementado com 2% de glicose e peptona e

incubado sob agitação em Agitador Nova Ética Modelo 109, 200rpm a temperatura ambiente.

Após dez dias, a cultura resultante foi então submetida às mesmas condições de fragmentação

descritas anteriormente e a turvação da suspensão resultante foi ajustada por comparação à

escala 5 McFarland (densidade ótica 0,80-1,00 à 625nm), visando, obter-se uma suspensão

padrão de Unidades Formadoras de Colônia (UFCs/mL) utilizada para os testes de

sensibilidade antifúngica.

3.2.2 Preparação das soluções padrões de antifúngicos

As soluções padrões de agente antifúngico (0,24μM), utilizadas para impregnar os

discos, foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) ou, no caso do fluconazol, em água

estéril a partir do princípio ativo em pó, na concentração mais alta a ser testada (2,4μM), a

partir da qual as outras concentrações foram preparadas por diluição seriada 1:1 (1,2μM e

0,6μM).

As soluções padrão de antifúngicos são preparadas em concentrações de dez vezes

menos concentrada do que a concentração testada, visto que os discos foram impregnados

com 10μL de solução. Em geral, estas soluções padrão não se contaminam, podendo-se

assumir que são estéreis. Pequenos volumes de soluções padrão estéreis foram colocados em

frascos estéreis de polipropileno ou polietileno, selados e armazenados em temperaturas

inferiores à -20°C. Os frascos foram retirados conforme necessário e utilizados no mesmo dia,

sendo o restante descartado.

3.2.3 Impregnação dos discos com antifúngicos

Discos de papel de filtro de 2-3mm de diâmetro foram impregnados em Cabine de

Segurança Biológica, marca Pachane, modelo 430, com 10µL de solução de antifúngico

preparada em DMSO ou água e deixados secar em estufa, marca Fanem, modelo 002CB, a

35oC até completa evaporação do solvente. Todos os testes foram realizados em

concentrações decrescentes de cada composto (2,4μM, 1,2μM e 0.6μM). A concentração

inicial de trabalho, 1,2μM, foi definida tendo como base a maior concentração inicial

(32μg/mL) preconizada pelo NCCLS Norma M38-A nos testes de Diluição em Caldo para

determinação de sensibilidade antifúngica de fungos filamentosos. A fim de se avaliar a

38

sensibilidade de M. perniciosa a maiores e menores concentrações dos compostos fungicidas,

testou-se também o dobro e a metade desta concentração.

3.2.4 Inóculo

Em placa de Petri esterilizada contendo 1mL de suspensão fúngica, ajustada a

escala 5 McFarland, foram adicionados 15mL de BDA fundido e esfriado a 45-50oC. A placa

foi homogeneizada lentamente e após solidificação, os discos impregnados e secos com

antifúngicos foram colocados no centro da placa e levemente pressionados. As placas foram

incubadas em câmara úmida a 280C em estufa de demanda biológica de oxigênio (BDO),

marca Quimis, por dez dias.

3.2.5 Leitura dos resultados

Após o período de incubação, o diâmetro do halo de inibição de crescimento

fúngico foi determinado em milímetros (mm) utilizando uma régua, a partir das extremidades

do halo com total inibição do crescimento. Os experimentos foram realizados em duplicata e

quando os halos diferiram mais de dois mm para o mesmo antifúngico o resultado não foi

considerado e novo procedimento foi realizado.

3.2.6 Controles

Foram feitos controles de crescimento, controle negativo de DMSO e controle de

processo com Aspergillus ninger ATCC 40036 utilizando como antifúngico controle

tebuconazol na concentração de 0.6µM/disco e halo padrão de 30mm.

3.3 ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA

3.3.1 Conjunto de Dados

O conjunto de dados empregado nos estudos de QSAR consiste de trinta e três

inibidores congêneres e estruturalmente diversos da enzima lanosterol 14α-desmetilase e os

respectivos dados de atividade biológica (ativo/não ativo) frente a M. perniciosa determinado

39

na primeira etapa deste trabalho. As estruturas químicas do conjunto de inibidores, associada

ao padrão correspondente de atividade, são apresentadas no APÊNDICE A.

As estruturas tridimensionais dos inibidores de lanosterol 14α-desmetilase foram

construídas utilizando as ferramentas disponíveis no programa computacional SYBYL 7.3

(Tripos Inc., St. Louis, USA), posteriormente submetidas aos procedimentos de minimização

de energia e cálculo de cargas atômicas através do método AM1.

3.3.2 Cálculo dos Descritores

O cálculo dos descritores físico-químicos e estruturais é a primeira etapa para os

estudos de QSAR. Um total de 854 descritores moleculares Bidimensionais (2D) foram

calculados pelo programa DRAGON 5.5 (Talete S.R.L, Milan, Italy) e usados como variável

independente nas análises de QSAR.

3.3.3 Seleção de Descritores

O peso de Fisher foi calculado para todos os descritores 2D, gerados pelo programa

DRAGON 5.5, e aqueles com peso de Fisher maior do que 95% de intervalo de confiança

(média mais duas vezes o desvio padrão) (0,497) foram selecionados. Esta estratégia resultou

em 28 descritores que foram reunidos, autoescalonados e utilizados nas análises exploratórias

não supervisionadas (PCA e HCA) e nos estudos de reconhecimento padrão supervisionados

(SIMCA e KNN) disponíveis no Programa Pirouette 4.0 (Infometrix Inc., Washington, USA).

3.3.4 Validação dos Modelos

A consistência estatística dos modelos matemáticos depende da seleção adequada

do conjunto treino e teste. Deste modo, a partir do conjunto de dados original, 33 inibidores

(compostos 1-33, APÊNDICE A), foram selecionados aleatoriamente 24 moléculas como

representantes do conjunto treino (compostos 1-24, APÊNDICE A), para a construção dos

modelos matemáticos. Enquanto que os outros nove inibidores (compostos 25-33,

APÊNDICE A) foram usados como conjunto teste para fins de validação externa, tomando-se

o cuidado de manter a mesma proporção de compostos ativos e inativos nos conjunto treino e

teste (54,54 % de inativos e 45,45 % de ativos).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO DE SUSCEPTIBILIDADE DE M. perniciosa-DISCO

DIFUSÃO

A triagem in vitro de atividade biológica desempenha um importante papel na

descoberta moderna de moléculas biologicamente ativas, pois o resultado de tais ensaios ajuda

na identificação de substâncias líderes para posterior otimização. Ao mesmo tempo, o

conjunto de dados obtido destes ensaios se torna uma fonte de informação extremamente útil

para a derivação de estudos de REA, etapa chave na otimização de propriedades desejáveis de

novas moléculas bioativas (MAO et al, 2006).

Levando em consideração que a qualidade dos modelos de QSAR depende de um

conjunto de dados estruturalmente diversos e de valores de atividade biológica reprodutíveis e

precisos (WATERBEEMD; ROSE, 2003), torna-se essencial a padronização dos ensaios de

susceptibilidade de M. perniciosa como etapa preliminar aos estudos quimiométricos.

Vários artigos relatam testes de suscetibilidade para M. pernicosa (MCQUILKEN

et al, 1988; WALTERS et al, 2004). Na maioria deles os resultados de susceptibilidade são

medidos em função do raio da colônia ou biomassa fúngica (FILHO et al, 2006). Entretanto

tais medidas podem estar associadas a erros de leitura, como por exemplo, determinação do

raio de uma colônia de fungo filamentoso que não forma uma circunferência com raio

perfeito. Adicionalmente, a determinação da biomassa fúngica é fortemente dependente da

padronização do procedimento de secagem que precede sua determinação.

O NCCLS preconiza um método de referência para ensaios de disco difusão para

leveduras (Norma M-44A), enquanto que para fungo filamentoso apenas testes de diluição em

caldo são preconizados (Norma M-38A). Contudo, métodos de difusão em ágar, tais como

Etest e difusão em disco, são boas alternativas aos testes de diluição em caldo por serem mais

simples e rápidos (LÓPEZ-OLIVIEDO et al, 2006). Adicionalmente, alguns artigos relatam

uma boa correlação entre os métodos de microdiluição em caldo e difusão em disco para

fungos filamentosos, utilizando voriconazol e posaconazol (LÓPEZ-OLIVIEDO et al, 2006;

SERRANO et al, 2004).

Segundo o protocolo NCCLS Norma M38-A, a preparação de suspensões

homogêneas de UFC’s para inocular testes de microdiluição em caldo para fungo filamentoso

utiliza esporangiosporos ou conídios não germinados, de modo que o número de UFC’s da

suspensão é ajustado usando espectrofotômetro. No entanto, M. perniciosa é um fungo

41

hemibiotrófico cuja manutenção da fase biotrófica in vitro foi descrita pouco tempo atrás com

os estudos de Meinhard e colaboradores (2006). Estes pesquisadores, através de um meio rico

em glicerol, desenvolveram um modo de crescimento de M. perniciosa in vitro onde se

consegue manter a estabilidade do crescimento de hifas monocarióticas prevenindo sua

transformação para fase saprofítica, que não produz basidiocarpos in vitro.

Alternativamente, Filho e colaboradores (2006) desenvolveram um método rápido,

prático e reprodutível de obtenção de uma suspensão de fragmentos de hifas de M. perniciosa

que se comportam como UFC’s, facilitando a triagem de fungicidas contra M. perniciosa.

Diante deste cenário, a obtenção da suspensão homogênea de UFC’s, utilizadas nos

testes de atividade antifúngica, foi padronizada a partir de adaptações do método

desenvolvido por Filho e colaboradores (2006). As suspensões obtidas foram ajustadas por

comparação a Escala McFarland 5 e utilizadas nos testes de susceptibilidade.

Através do método de disco difusão foi possível traçar o perfil de susceptibilidade

antifúngica de uma série de 33 antifúngicos derivados de imidazol e triazol frente à M.

perniciosa, cujos resultados guiarão testes futuros de determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM). Não foi observada nenhuma inibição de crescimento fúngico quando foram

testados os antifúngicos Azaconazol, Bifonazol, Bromuconazol, Diclobutrazol, Fluconazol,

Fluotrimazol, Fluquinconazol, Flutriafol, Imazalil, Itraconazol, Miclobutanil e Penconazol.

No entanto, ao serem testados os antifúngicos Metconazol e Tebuconazol o crescimento

fúngico foi inibido por toda a placa. Para os 19 antifúngicos restantes a atividade antifúngica

pode ser observada na Tabela 3, onde cinco antifúngicos apresentaram atividade frente a M.

perniciosa somente na concentração de 2,4μg/disco (Etaconazol, Fenbuconazol, Flusilazol,

Prochloraz e Propiconazol).

42

Tabela 3: Diâmetro dos halos de inibição (mm) formados em cultura de M. perniciosa, obtidos pelo Método de

disco difusão, em reposta a derivados imidazólicos e triazólicos comerciais na concentração de 2,4, 1,2 e 0,6µM

por disco.

Antifúngico

Concentração em µM/disco

0,6 1,2 2,4

Cetoconazol 26 25 30 28 35 35

Ciproconazol 30 30 37 38 T T

Climbazol 40 40 50 50 60 60

Clotrimazol 25 25 25 25 35 35

Difenoconazol 23 24 25 25 30 30

Diniconazol - - 15 15 20 20

Econazol 38 40 47 45 53 55

Epoxiconazol 15 15 18 18 20 20

Etaconazol - - - - 40 40

Fenbuconazol - - - - 25 25

Flusilazol - - - - 25 25

Miconazol 25 25 30 30 35 35

Prochloraz - - - - 15 13

Propiconazol - - - - 15 13

Prothioconazol 10 12 15 15 20 20

Sulconazol 30 30 30 30 40 40

Triadimefon 30 30 30 30 40 40

Triadimenol 25 25 35 35 37 38

Triticonazol 30 32 34 32 35 37

– Não houve inibição do crescimento.

T –Inibição total do crescimento.

43

De acordo com esses resultados, verifica-se que os compostos testados

apresentaram atividade que variam entre a não inibição (Etaconazol - Figura 13A.) até

compostos com grande atividade contra M. perniciosa (Econazol e Tebuconazol- Figura 13B

e 13C, respectivamente). Embora essa técnica não permita avaliar potência, estes dados

sugerem que diferenças na estrutura química desses compostos estão relacionadas com sua

maior, ou menor atividade fungicida frente a M. perniciosa.

Figura 13: Inibição de crescimento de M. perniciosa com 0,6μM/disco de antifúngico, através da difusão de disco: A Etaconazol; ausência de inibição; B Econazol; halo de 40:38mm; C Tebuconazol; inibição total de crescimento; D Controle de meio, E Controle de DMSO, F Controle de crescimento, G, H e I Controle de

Processo.

4.2 ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA

4.2.1 Conjunto de Dados

Visando esclarecer quais fatores físico-químicos e estruturais influenciam na

atividade biológica, modelos de QSAR foram desenvolvidos para todos os 33 derivados de

azol, cuja atividade biológica frente a M. perniciosa foi determinada na etapa anterior.

Considerando o custo da utilização desses fungicidas no combate a M. perniciosa, é

interessante utilizar a menor concentração efetiva contra o fungo, por essa razão o padrão de

atividade dos compostos testados na concentração de 0,6µM de antifúngico/disco foi utilizada

como variável dependente na análise de QSAR (APÊNDICE A).

44

Como a consistência estatística dos modelos de QSAR é fortemente dependente da

escolha adequada do conjunto treino e teste, a diversidade química do conjunto de dados

original foi avaliada por Análise Hierárquica de Agrupamentos (Figura 14), realizada no

programa Pirouett 4.0, usando o método de ligação completo (distância Euclideana) e

descritores auto-escalonados. Como discutido no item 4.2.2.

Figura 14: Análise Hierárquica de Agrupamentos para todos os compostos do conjunto de dados. Compostos ativos estão representados em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. * Conjunto Teste.

O objetivo do auto-escalonamento dos dados é assegurar que as influências

relativas das diferentes variáveis sobre os cálculos sejam independentes de suas unidades. Isto

pode ser conseguido por meio da transformação das variáveis de modo que o valor médio e a

variância (o quadrado do desvio padrão) seja zero e um, respectivamente (MOLFETA, 2007;

WHITHEY et al, 2000).

45

Na Análise Hierárquica de Agrupamentos os compostos são reunidos segundo suas

associações, de acordo com as variáveis escolhidas. Nesta análise quanto menor a distância

entre os pontos, maior a semelhança entre os compostos. Os resultados, de natureza

qualitativa, são representados na forma de dendogramas. Estes dendogramas são

especialmente úteis na visualização de semelhanças entre compostos representadas no espaço

multidimensional, onde, no eixo vertical são colocados os compostos e, no eixo horizontal o

índice de similaridade.

A análise dos agrupamentos demonstraram sete grupos distintos e o composto

Prochloraz, que aparece isolado dos demais agrupamentos, à 60 % de similaridade,

demonstrando boa diversidade estrutural do conjunto de dados. A partir desses dados, os

compostos de todas as famílias (grupos) do conjunto de dados original (compostos 1-33,

APÊNDICE A) foram aleatoriamente divididos em conjunto treino (compostos 1-24,

APÊNDICE A) e conjunto teste (compostos 25-33, APÊNDICE A), tomando-se o cuidado

de manter aproximadamente a mesma proporção (54,54 % de inativos e 45,45 % de ativo) de

compostos ativos e inativos em ambos os conjuntos. Esta estratégia resultou na seleção de

nove compostos como representantes do conjunto teste, utilizados para fins de validação

externa.

4.2.2 Estudos de reconhecimento padrão

Estudos anteriores demonstraram que descritores 2D são capazes de descrever a

atividade de derivados de azol frente a Candida albicans (MOTA et al, 2009). Levando em

consideração que esses descritores eliminam a necessidade de se determinar a conformação

bioativa dos compostos em estudo, essa técnica parece ser vantajosa para o trabalho em

questão, sendo por isso empregados nas análises quimiométricas.

Como os estudos de QSAR 2D requerem o cálculo e seleção de uma variedade de

descritores moleculares, que são utilizados como variáveis independentes no desenvolvimento

de modelos de QSAR, um total de 854 descritores foi calculado pelo programa DRAGON 5.5

e selecionados pelo Peso de Fisher, de acordo com o seguinte critério: Descritores com peso

de Fisher maior do que 0,497, assumindo um intervalo de confiança maior do que 95%, foram

selecionados. Esta estratégia resultou na seleção de 28 descritores (Tabela 4) que foram

reunidos, autoescalonados e utilizados em análises exploratórias não supervisionadas através

de HCA e PCA e nos estudos de reconhecimento padrão supervisionados (KNN e SIMCA).

46

Tabela 4: Descritores presentes no modelo final de SIMCA.

Symbol Description

nX Número de átomos de halogênio.

MATS4m Autocorrelação de Moran calculado entre átomos separados por 4 ligações químicas

ajustado pela massa atômica.

MATS3p Autocorrelação de Moran calculado entre átomos separados por 3 ligações químicas

ajustado pela polaridade

BEHe3 Maior autovalor de índice 3 da matriz de Burden, ajustado pela eletronegatividade

atômica de Sanderson.

BELm8 Menor autovalor de índice 8 da matriz de Burden, ajustado pela massa atômica.

JGI4 Índice de carga topológica media entre átomos separados por 4 ligações químicas.

JGI10 Índice de carga topológica media entre átomos separados por 10 ligações químicas.

nArX Número de X em anel aromático.

C-001 Fragmento CH3R / CH4

C-011 Fragmento CR3X

B04[Cl-Cl] Presença/ausência do fragmento Cl-Cl a distância topológica de 04.

B05[N-Cl] Presença/ausência do fragmento N-Cl a distância topológica de 05.

B06[C-O] Presença/ausência do fragmento of C-O a distância topológica de 06.

B06[N-Cl] Presença/ausência do fragmento N-Cl a distância topológica de 06.

B07[C-O] Presença/ausência do fragmento C-O a distância topológica de 07.

B08[N-Cl] Presença/ausência do fragmento N-Cl a distância topológica de 08.

B09[C-C] Presença/ausência do fragmento C-C a distância topológica de 09.

B09[C-N] Presença/ausência do fragmento C-N a distância topológica de 09.

B10[C-C] Presença/ausência do fragmento C-C a distância topológica de 10.

B10[C-N] Presença/ausência do fragmento C-N a distância topológica de 10.

47

B10[C-Cl] Presença/ausência do fragmento C-Cl a distância topológica de 10.

F04[Cl-Cl] Freqüência do fragmento Cl-Cl a distância topológica de 04.

F04[C-Cl] Freqüência do Fragmento C-Cl a distância topológica de 04.

F05[N-Cl] Freqüência do fragmento N-Cl a distância topológica de 05.

F06[N-Cl] Freqüência do Fragmento N-Cl a distância topológica de 06.

F07[N-Cl] Freqüência do fragmento N-Cl a distância topológica de 07.

F08[C-N] Freqüência do fragmento C-N a distância topológica de 08.

F08[N-Cl] Freqüência do Fragmento N-Cl a distância topológica de 08.

O método não supervisionado HCA (Figura 15) consegue separar os compostos do

conjunto treino em duas classes distintas a 40% de similaridade, porém essa divisão não segue

o perfil de atividade do conjunto. Todavia, vale a pena destacar que 66,7% dos compostos

ativos estão agrupados em duas famílias. A taxa de acerto moderada dessa metodologia pode

ser conseqüência da alta correlação entre os descritores utilizados (Tabela 5) que não

conseguem descrever o espaço químico de forma apropriada.

48

Figura 15: Análise Hierárquica de Agrupamentos para os compostos do conjunto Treino. Compostos ativos estão representados em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. Conjunto teste marcado

com *.

49

Tabela 5: Correlação entre os descritores utilizados nas análises quimiométricas.

MATS4m BEHe3 JGI4 B04[Cl-Cl] B06[C-O] B06[N-Cl] B07[C-O] F04[C-Cl] F04[Cl-Cl] F06[N-Cl] F08[N-Cl]

MATS4m 1 0.05 0.03 0.72 0.01 0.18 0.01 0.55 0.78 0.28 0.27

BEHe3 1 0.004 0.05 0 0.06 0.00 0.02 0.05 0.09 0.20

JGI4 1 0.04 0.46 0.00 0.30 0.01 0.03 0.00 0.00

B04[Cl-Cl] 1 0.00 0.20 0.00 0.72 0.73 0.21 0.157

B06[C-O] 1 0.02 0.78 0 0.00 0.03 0.03

B06[N-Cl] 1 0 0.29 0.15 0.91 0.29

B07[C-O] 1 0 0.00 0.00 0.03

F04[C-Cl] 1 0.71 0.34 0.18

F04[Cl-Cl] 1 0.28 0.33

F06[N-Cl] 1 0.47

F08[N-Cl] 1

50

Uma alternativa para contornar o problema da colinearidade dos descritores é a

utilização da PCA. Este método procura agrupar descritores altamente correlacionados,

substituindo os descritores originais por um número menor de novos descritores, não

correlacionados, chamados de Componentes Principais (PC’s). Diminuindo assim a

dimensionalidade dos dados sem perda significativa da informação química (FERREIRA,

2002; NETO; MOITA, 1998).

Na PCA a matriz de dados inicial, representada por X, é decomposta em duas

matrizes, T e P, Equação 4:

TTPX =

A matriz T descreve as coordenadas dos compostos no novo sistema de PC’s, e a

matriz P indica a importância ou pesos de cada descritor para as PC’s (FERREIRA, 2002;

MOLFETA, 2007; NETO; MOITA, 1998). Essas matrizes podem ser representadas

graficamente a fim de facilitar sua interpretação. Como pode ser observado no gráfico da

matriz T, Figura 16, os compostos ativos estão concentrados entre os valores -2,1 e 1 de PC1,

enquanto que 92,3% dos compostos inativos tem valores de PC1 fora desse intervalo.

Figura 16: Análise das componentes principais dos compostos ativos e inativos para o conjunto.

51

Na análise do gráfico da matriz P, Figura 17, observa-se que MATS4m, BEHe3,

F04[Cl-Cl], F04[C-Cl] e B04[Cl-Cl] são os descritores mais importantes na diferenciação dos

compostos em PC1, pois apresentam as maiores contribuições para esta componente, ou seja,

estes são os descritores que representam as características mais importantes para a atividade

dos compostos ativos. Esses resultados sugerem que existem diferenças físico-químicas e

estruturais que permitam separar os compostos ativos dos inativos no espaço químico definido

pelos descritores selecionados. Essa informação pode ser de grande relevância para se

identificar novos fungicidas contra M. perniciosa, através de ensaios virtuais. A fim de

verificar a taxa de acerto que tal estratégia teria, a PCA foi utilizada para predizer a atividade

dos compostos do conjunto teste. O modelo de PCA consegue classificar corretamente 88 %

do conjunto teste, errando apenas o composto Miclobutanil.

Figura 17: Gráfico dos pesos dos descritores para PC1 e PC2.

Uma vez que os recursos disponíveis para aquisição de moléculas para ensaios

biológicos são limitados, procurou-se corroborar a relevância dos descritores utilizados na

PCA, através da identificação de regras classificatórias que permitissem identificar a que

classe pertence um composto desconhecido, utilizando as técnicas de reconhecimento padrão

supervisionadas KNN e SIMCA (SHAW; VANDENBON, 2007).

Assim como no HCA, o método KNN classifica os compostos considerando a

distância entre eles. Em ambas as técnicas, a distância Euclidiana multivariada entre cada par

52

de compostos do conjunto treino é calculada. Contudo, no HCA considera-se apenas o

composto mais próximo ao espaço químico (um vizinho, K=1), enquanto que no KNN,

determina-se o menor valor de vizinhos (K) que consegue descrever (classificar) corretamente

os compostos do conjunto Treino. O número ótimo de vizinhos é determinado por validação

cruzada LOO (do inglês Leave-one-out). Neste procedimento, cada composto do conjunto de

treinamento é excluído por vez e então classificado usando o restante dos compostos. O

processo é repetido para diferentes valores de K e o número de vizinhos ótimos no modelo

final é determinado com base no número de erros de classificação.

As vantagens desse método podem ser observadas nos resultados a seguir. Ao se

utilizar apenas um e dois vizinhos, a taxa de acerto é de 81,82% para os compostos ativos e

90,91% para os compostos inativos, com 3 vizinhos essa taxa se mantém em 81,82% para os

compostos ativos e aumenta para 100% para os compostos inativos. Com quatro vizinhos a

taxa de acerto se eleva para 90,91% para os compostos ativos e estabiliza em 100% para os

compostos inativos. A inclusão de mais vizinhos não leva a melhora do modelo de KNN.

Utilizando-se o melhor modelo de KNN pode-se classificar corretamente 100% dos

compostos do conjunto teste.

A fim de se investigar as razões para classificação incorreta de compostos do

conjunto treino, pode-se utilizar uma medida do encaixe dos compostos em cada uma das

classes, calculada a partir da comparação entre a distância dos compostos em relação ao

vizinho mais próximo de sua classe e a distância que estima o diâmetro da classe.

A análise gráfica desse tratamento, Figura 18, permite avaliar a qualidade dos

resultados de predição no modelo KNN. Valores iguais ou menores que zero indicam que os

compostos são bem descritos, enquanto que compostos com valores acima do intervalo de

confiança de 95%, onde os eixos se cruzam, não são bem descritos pelo modelo de KNN

(PIROUETTE, 2003).

53

Figura 18: Adequação dos compostos do conjunto Treino à classe inativa e ativa segundo modelo KNN,

utilizando quatro vizinhos.

A predição errônea do composto Prochloraz pode estar relacionada a sua

diversidade química em relação aos demais compostos. Como observado no HCA, Figura 15,

esse composto pertence a uma classe diferente dos demais compostos. O modelo de KNN cria

regras classificatórias que dividem o espaço químico em duas partes (ativos e inativos)

conforme as classes do conjunto treino. Neste caso, um composto desconhecido é classificado

forçosamente como pertencente a uma das classes, mesmo não o sendo. Outra limitação do

modelo KNN é a falta de ferramentas diagnósticas que permitam a identificação das razões

que levam a erros de classificação (GONZÁLEZ-ARJONA; GONZÁLES, 1998). Em função

disso, o conjunto de dados foi submetido à análise pelo método SIMCA.

Neste método, constrói-se uma hipercaixa envolvendo os compostos de cada classe,

onde a atribuição de um composto desconhecido a uma dada classe é baseada no desvio da

projeção da mesma, no espaço definido pelas PC’s, e sua distância das fronteiras da classe em

questão. Diferentemente do KNN, segundo SIMCA um novo composto pode ser classificado

em mais de uma categoria ou mesmo em nenhuma delas (BRANDEN; HUBERT, 2005).

Ao contrário do KNN, que se baseia na distância entre pares de amostras, no

método SIMCA, cada classe do conjunto de treinamento é submetida a uma análise de

componentes principais. Como incorpora PCA na redução das dimensões, SIMCA é muito

54

útil na análise de observações multidimensionais (BRANDEN; HUBERT, 2005). O método

SIMCA permite ainda analisar a influência dos diferentes descritores na separação entre as

classes através da medida do poder de modelagem e poder discriminante de cada descritor

(NETO; MOITA, 1998).

A análise do poder discriminante, Figura 19, e de modelagem, Figura 20, guiou a

seleção de descritores para a otimização do modelo SIMCA. Nesta seleção, os descritores

com os menores valores de poder discriminante e de modelagem foram progressivamente

descartados.

Descritores

0

5

10

15

20

25

MATS4m

BEHe3JG

I4

B04[C

l-Cl]

B06[C

-O]

B06[N

-Cl]

B07[C

-O]

F04[C

-Cl]

F04[C

l-Cl]

F06[N

-Cl]

F08[N

-Cl]

Figura 19: Poder discriminante dos descritores selecionados segundo SIMCA.

55

Descritores

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

MATS4m

BEHe3JG

I4

B04[C

l-Cl]

B06[C

-O]

B06[N

-Cl]

B07[C

-O]

F04[C

-Cl]

F04[C

l-Cl]

F06[N

-Cl]

F08[N

-Cl]

Figura 20: Poder de modelagem dos descritores selecionados segundo SIMCA.

Na Tabela 4 encontram-se marcados em cinza o significado dos descritores

selecionados através dessa estratégia.

O impacto desse protocolo pode ser apreciado a partir do fato que, o modelo

original, com 28 descritores, conseguia classificar corretamente todos os compostos do

conjunto treino com uma distância interclasse de 1,16. Após a eliminação dos descritores a

distância interclasse aumentou para 2,38, Figura 21, sendo capaz de classificar corretamente

100% dos compostos ativos e inativos do conjunto treino, utilizando três PC’s.

0

1

2

3

4

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Distância para a Classe 1

Dist

ânci

a pa

ra a

Cla

sse

2

Ativos

Inativos

Teste Ativos

Teste Inativos

Figura 21: Distância interclasse dos compostos ativos e inativos do conjunto treino e teste segundo SIMCA.

56

A fim de avaliar o poder preditivo deste modelo ele foi empregado para classificar

os compostos do conjunto teste, não utilizado durante a otimização do modelo. Todos os

compostos do conjunto teste tiveram sua atividade predita de forma correta.

Pode-se fazer uma análise preliminar das propriedades estruturais que são mais

importantes para atividade biológica dessa classe de antifúngicos frente a M. perniciosa

analisando-se os descritores que apresentam grande poder discriminante e de modelagem

entre as classes: descritores F08[N-Cl], BEHe3, F06[N-Cl] e B06[C-O], em cinza na Tabela

6.

Os descritores F08[N-Cl] e F06[N-Cl] e BEHe3, maior poder de discriminação

entre as classes, são descritores topológicos originados da representação 2D das moléculas

que caracterizam as estruturas de acordo com seu tamanho, grau de ramificação e formato

geral (LEACH; GILLET, 2007). Além de um alto poder de discriminação entre as classes,

F06[N-Cl] também apresenta o maior poder de modelagem.

F08[N-Cl] e F06[N-Cl] são descritores sub-estruturais que descrevem a freqüência

do fragmento N-Cl a uma distancia topológica 08 ou 06, respectivamente (DRAGON 5.5,

2007). A análise dos dados (Tabela 6) demonstra que inibidores muito ativos (com grande

halo de inibição) frente a M. perniciosa podem (Ciproconazol) ou não (Tebuconazol e

Metconazol) apresentar um destes fragmentos. Enquanto que 50% dos compostos inativos

apresentam o fragmento N-Cl a uma distancia topológica 06 e 08, simultaneamente.

57

Tabela 6: Valores dos descritores presentes no modelo final de SIMCA.

Compostos Atividade MATS4m BEHe3 JGI4 B04[Cl-Cl] B06[C-O] B06[N-Cl] B07[C-O] F04[C-Cl] F04[Cl-Cl] F06[N-Cl] F08[N-Cl]

Climbazol Ativo -0.06 3.64 0.05 0 1 0 1 1 0 0 0

Clotrimazol Ativo -0.01 3.75 0.03 0 0 1 0 3 0 1 0

Ciproconazol Ativo -0.02 3.76 0.04 0 0 0 0 1 0 0 1

Difenoconazol Ativo -0.00 3.76 0.04 0 1 1 1 3 0 1 0

Econazole Ativo 0.17 3.79 0.04 1 0 0 0 4 1 0 0

Epoxiconazol Ativo -0.01 3.78 0.05 0 0 1 0 2 0 1 1

Cetoconazol Ativo 0.30 3.80 0.03 1 1 0 1 3 1 0 0

Metconazol Ativo -0.02 3.73 0.05 0 1 0 1 1 0 0 0

Miconazol Ativo 0.26 3.79 0.04 1 0 0 0 5 2 0 0

Prothioconazol Ativo -0.03 3.66 0.05 0 1 1 0 1 0 1 0

Sulconazol Ativo 0.12 3.79 0.04 1 0 0 0 4 1 0 0

Tebuconazol Ativo -0.02 3.66 0.06 0 1 0 1 1 0 0 0

Triadimefon Ativo -0.06 3.63 0.05 0 1 0 1 1 0 0 1

Triadimenol Ativo -0.06 3.63 0.05 0 1 0 1 1 0 0 1

Triticonazole Ativo -0.02 3.72 0.05 0 1 0 1 1 0 0 0

Azaconazol Inativo 0.24 3.54 0.03 1 0 1 0 3 1 1 1

Bifonazol Inativo -0.09 3.74 0.02 0 0 0 0 0 0 0 0

Bromuconazol Inativo -0.03 3.59 0.03 1 0 1 0 4 1 1 1

Diclobutrazol Inativo 0.27 3.63 0.05 1 1 1 1 3 1 1 1

Diniconazole Inativo 0.27 3.63 0.05 1 1 1 1 3 1 1 1

Etaconazol Inativo 0.25 3.63 0.03 1 0 1 0 3 1 1 1

Fenbuconazol Inativo -0.00 3.78 0.03 0 0 0 0 1 0 0 0

58

Compostos Atividade MATS4m BEHe3 JGI4 B04[Cl-Cl] B06[C-O] B06[N-Cl] B07[C-O] F04[C-Cl] F04[Cl-Cl] F06[N-Cl] F08[N-Cl]

Fluconazol Inativo 0.113 3.783 0.032 0 0 0 0 0 0 0 0

Fluotrimazol Inativo -0.052 3.75 0.019 0 0 0 0 0 0 0 0

Fluquinconazol Inativo 0.17 3.77 0.054 1 1 1 0 4 1 1 1

Flusilazol Inativo -0.081 3.764 0.037 0 0 0 0 0 0 0 0

Flutriafol Inativo -0.054 3.763 0.037 0 0 0 0 0 0 0 0

Imazalil Inativo 0.292 3.498 0.032 1 0 0 0 3 1 0 0

Itraconazol Inativo 0.301 3.87 0.029 1 1 1 1 3 1 1 1

Miclobutanil Inativo 0.001 3.558 0.03 0 0 0 0 1 0 0 1

Penconazol Inativo 0.245 3.488 0.033 1 0 1 0 4 1 1 1

Prochloraz Inativo 0.525 3.574 0.036 1 1 1 1 5 3 2 3

Propiconazol Inativo 0.251 3.645 0.03 1 0 1 0 3 1 1 1

59

BEHe3 é um autovalor de Burden, que está relacionado a eletronegatividade

das moléculas (BURDEN, 1997). Os parâmetros de Burden se baseiam em uma

combinação do número atômico para cada átomo e uma descrição nominal do tipo de

ligação entre átomos adjacentes e não adjacentes. Eles incorporam informações de

conectividade e propriedades atômicas (ex. carga atômica, polarizabilidade, capacidade

de formação de ligação de hidrogênio) que são relevantes nas interações

intermoleculares (GONZALEZ et al, 2005). Observa-se que valores intermediários de

eletronegatividade (valores entre 3,6 a 3,8), Figura 22, estão relacionados a uma maior

atividade fungicida destes compostos.

Figura 22: Padrão de Atividade versus eletronegatividade.

A partir da análise da distribuição dos compostos no espaço definido pela

PC’s, gráfico da matriz T, Figura 23, pode-se observar uma separação entre os

compostos mais potentes, quadrante inferior esquerdo, dos menos potentes. De modo

que os inibidores mais potentes apresentam valores negativos de PC1 e PC2, como por

exemplo, Tebuconazol (-2,08x-1,55), Triadimenol (-2,54x-1,10), Triticonazol (-1,63x-

1,43) e Metconazol (-1,59x-1,42).

60

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

PC1

PC2

CompostosAtivos

Figura 23: Análise de componentes principais dos compostos ativos do conjunto treino contra M.

perniciosa segundo SIMCA.

Análise da importância dos descritores para as PC’s, Matriz P, Figura 24, dos

compostos ativos revela ainda que os descritores que contribuem para valores negativos

de PC1 e PC2 são JGI4, B06[C-O] e B07[C-O] indicando que estes são os descritores

que mais influenciam na grande atividade destes compostos. Vale à pena destacar que

esses descritores não são importantes para diferenciar compostos ativos dos inativos,

Figura 19, contudo eles assumem papel de destaque no planejamento de compostos

mais potentes contra M. perniciosa.

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6

PC1

PC2

Descritores

Figura 24: Importância dos descritores selecionados segundo o modelo SIMCA para as Componente

Principais 1 e 2.

Triadimenol Triticonazol Tebuconazol Metconazol

JGI4

B06[C-O]

B07[C-O]

61

B06[C-O] e B07[C-O] são descritores sub-estruturais que descrevem a

presença do fragmento C-O a uma distancia topológica 06 ou 07, respectivamente

(DRAGON 5.5, 2007). Enquanto que JGI4 é um descritor topológico, conhecido como

índice de carga, que avalia a transferência de carga entre pares de átomos separados por

quatro ligações, e conseqüentemente, a transferência global de carga na molécula, ou

seja, o momento dipolo (GÁLVEZ et al, 1994). Os compostos muito ativos,

Triadimenol, Triticonazol, Tebuconazol e Metconazol apresentam o fragmento C-O a

distância topológica de 06 e 07 e valores elevados momento dipolo (Tabela 6). Esses

dados corroboram com dados da literatura que relatam a importância de interações

eletrostáticas com transferência de carga entre o átomo de nitrogênio heterociclico dos

derivados de azol (N3 para imidazóis e N4 para triazóis) e o átomo de ferro da porção

heme do sítio ativo da lanosterol 14α-desmetilase (JI et al, 2003; SHENG et al, 2006;

TAFI et al, 1996, 2002) para essa classe de inibidores.

5 CONCLUSÃO

O ensaio de susceptibilidade desenvolvido a partir de adaptações do método de

disco difusão, técnica pour plate e adaptações do método de fragmentação de hifas

apresentado por Filho et al (2006), demonstrou-se útil na analise do perfil de susceptibilidade

antifúngica de uma série de 33 antifúngicos derivados de imidazol e triazol frente à M.

perniciosa. Embora essa técnica não permitisse avaliar potência, verificou-se que os

compostos testados apresentaram atividade que variaram entre a não inibição até compostos

com grande atividade contra M. perniciosa. Estes dados sugerem que diferenças na estrutura

química desses compostos estão relacionadas com sua maior, ou menor atividade fungicida

frente a M. perniciosa. Diante desta constatação, procurou-se desenvolver modelos de QSAR

2D, através da analise multivariada de dados, capazes de explicar como esta atividade pode

estar relacionada a fatores físico-químicos e estruturais do conjunto de inibidores. O método

de reconhecimento padrão não supervisionado HCA consegue separar os compostos do

conjunto treino em duas classes distintas, contudo essa divisão não segue o perfil de atividade

do conjunto, provavelmente devido à alta correlação dos descritores utilizados. A análise de

PCA demonstra que compostos ativos apresentam valores específicos de PC1 o que indica

que existem diferenças físico-químicas e estruturais que permitem separar compostos ativos e

inativos no espaço químico definido pelos descritores selecionados. Na seqüência, a utilização

de métodos de reconhecimento supervisionado padrão, KNN e SIMCA, demonstraram uma

melhora progressiva quanto ao grau de acerto. O método KNN tem um taxa de acerto de

90,91% para os compostos ativos e 100% para os compostos inativos. Já o SIMCA foi capaz

de classificar corretamente todos os compostos do conjunto treino e teste sendo que o melhor

modelo apresenta uma distância interclasse de 2,38. Os descritores F08[N-Cl], BEHe3,

F06[N-Cl] e B06[C-O] apresentam o maior poder discriminante e de modelagem entre as

classes e se referem à freqüência ou presença do fragmento N-Cl a uma distância topológica

08 e 06, enquanto que BEHe3 descreve a eletronegatividade dos compostos. Ou seja,

compostos com grande halo de inibição, como Ciproconazol, Tebuconazol e Metconazol, têm

valores intermediários de eletronegatividade e presença ou ausência do fragmento N-Cl a uma

distância topológica de 06 ou 08. A análise PCA dos compostos ativos indica que inibidores

mais potentes têm valores negativos de PC1 e PC2. Sugerindo que o momento de dipolo

(JGI4) e a presença do fragmento C-O a distância topológica de 06 e 07 são importantes para

a maior potência desses compostos. A utilização combinada destes resultados deverá ser útil

no desenvolvimento de derivados azólicos mais seletivos e potentes frente a M. perniciosa.

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APÊNDICES

APÊNDICE A - ESTRUTURA QUÍMICA E PADRÃO DE ATIVIDADE DO CONJUNTO DE INIBIDORES UTILIZADOS NOS ESTUDOS

DE QSAR. (Compostos ativos em letras maiúsculas e compostos inativos em letras minúsculas. * Conjunto teste).

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

1 Azaconazol Inativo

2 Cetoconazol Ativo

3 Ciproconazol Ativo

4 Clotrimazol Ativo

74

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

5 Diclobutrazol Inativo

6 Diniconazol Inativo

7 Econazol Ativo

8 Epoxiconazol Ativo

9 Fenbuconazol Inativo

10 Fluconazol Inativo

75

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

11 Fluquinconazol Inativo

12 Flusilazol Inativo

13 Flutriafol Inativo

14 Imazalil Inativo

76

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

15 Itraconazol Inativo 16 Metconazol Ativo

17 Miconazol Ativo

18 Penconazol Inativo

77

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

19 Prochloraz Inativo

20 Propiconazol Inativo

21 Prothioconazol Ativo

22 Tebuconazol Ativo

23 Triadimenol Ativo

24 Triticonazol Ativo

78

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

25 *Bifonazol Inativo

26 *Bromuconazol Inativo

27 *Climbazol Ativo

28 *Difenoconazol Ativo

29 *Etaconazol Inativo

30 *Fluotrimazol Inativo

79

Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico/

disco

Estrutura Antifúngicos Padrão de

atividade a

0,6 µM de

antifúngico

/disco

Estrutura

31 *Miclobutanil Inativo

32 *Sulconazol Ativo

33 *Triadimefon Ativo