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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β- LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE ORIGEN AVIAR. Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el Grado o Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSLAVAS TUTOR: Dr. CHRISTIAN VINICIO VINUEZA BURGOS Msc. Quito, Diciembre 2015

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-

LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE

ORIGEN AVIAR.

Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el Grado o

Título de Médico Veterinario Zootecnista

AUTOR:

CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSLAVAS

TUTOR:

Dr. CHRISTIAN VINICIO VINUEZA BURGOS Msc.

Quito, Diciembre 2015

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DEDICATORIA

A mis madres, Nidia y Nancy

A una hermana, Estefanía

A mis Abuelos, Luis y María Laura

A mi familia.

Por enseñarme cada día que la manifestación más grande del amor se

expresa a través de la esperanza, la bondad y la comprensión.

Por hacer que todo tenga un sentido y valga la pena.

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AGRADECIMIENTOS

Primeramente, quiero expresar mis mayores agradecimientos al Dr.

Christian Vinueza, por su gran calidad humana, su respaldo continuo, y

por compartir su filosofía de vida y de trabajo en el transcurso de este

estudio. En segundo lugar, agradezco al Centro Internacional de Zoonosis

(CIZ), a su director, personal científico y administrativo, por todo su apoyo

en el desarrollo de este proyecto.

Además, agradezco a la Dra. María Inés Baquero, al Dr. Carlos Gómez y

a todo el personal del Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia, por su constante y amigable apoyo en

todo el camino de este trabajo.

Finalmente, agradezco a todos mis amigos, que siempre me ha apoyado

en el camino académico y de la vida.

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AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSLAVAS, en calidad de Autor

del trabajo de investigación o tesis realizada sobre “IDENTIFICACIÓN DE

GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN

CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE ORIGEN AVIAR”, por el

presente, autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer

uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que

contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de

investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la

presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo

establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley

Intelectual y su Reglamento.

En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de diciembre de 2015

-----------------------------------

Cristian Andrés Narváez Manosalvas

C.I.: 1003144316

[email protected]

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INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado “IDENTIFICACIÓN DE

GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN

CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia coli DE ORIGEN AVIAR”,

presentado por el señor CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSALVAS

para optar por el Grado de Médico Veterinario Zootecnista; dejo

constancia que he leído mencionado trabajo, y en tal virtud, considero que

reúne todos los requisitos y méritos para ser sometido a la presentación

pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de diciembre de 2015

-----------------------------------

Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos Msc.

C.I.: 1713266227

[email protected]

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APROBACIÓN DE TRIBUNAL

IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-

LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE

ORIGEN AVIAR.

El tribunal constituido por:

Presidente: Dra. María Inés Baquero.

Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos.

Vocal Principal: Dr. Gustavo Salgado.

Vocal Suplente: Dr. Freddy Proaño.

Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la

obtención del título o grado de Médico Veterinario Zootecnista,

presentado por el Sr. Cristian Andrés Narváez Manosalvas.

Con el título:

“Identificación de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en

cepas BLEE y AmpC de Escherichia coli de origen aviar”.

Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO

En la Ciudad de Quito, a _____________________ de 2015.

Para constancia de lo actuado firman:

Presidente: Dra. María Inés Baquero. ______________________

Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos. ______________________

Vocal Principal: Dr. Gustavo Salgado. ______________________

Vocal Suplente: Dr. Freddy Proaño. ______________________

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ÍNDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ..................................................................................................................... iii

LISTA DE CUADROS ........................................................................................................ xv

LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................................... xvii

RESUMEN .......................................................................................................................... xix

INTRODUCCION ..................................................................................................................1

CAPITULO I ...........................................................................................................................3

EL PROBLEMA ....................................................................................................................3

Planteamiento del problema .........................................................................................3

Justificación .....................................................................................................................5

Objetivos: ..........................................................................................................................6

CAPITULO II ..........................................................................................................................7

MARCO TEORICO ...............................................................................................................7

Antecedentes de la Investigación ...............................................................................7

Fundamentación Teórica ...............................................................................................8

Escherichia coli ...........................................................................................................9

Importancia de la resistencia bacteriana ............................................................14

Antimicrobianos ........................................................................................................17

La resistencia en E. coli ...........................................................................................23

Identificación molecular de genes CTX-M, SHV, TEM y CMY .........................26

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La PCR ........................................................................................................................ 28

CAPÍTULO III ...................................................................................................................... 30

METODOLOGIA ................................................................................................................ 30

Determinación de los métodos a utilizar ................................................................ 30

Tipo de investigación .............................................................................................. 30

Diseño de la investigación ..................................................................................... 30

Descripción de la zona de estudio ....................................................................... 30

Procedimiento de la investigación ....................................................................... 31

CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 38

RESULTADOS ................................................................................................................... 38

Presentación de los resultados ................................................................................ 38

Discusión de los resultados ...................................................................................... 41

CAPITULO V ...................................................................................................................... 44

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................. 44

Conclusiones ................................................................................................................ 44

Recomendaciones........................................................................................................ 45

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................... 46

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LISTA DE CUADROS

Tabla 1. Clasificación sistemática de E. coli ............................................................................. 10

Tabla 2. Clasificación de los β-lactámicos ................................................................................ 18

Tabla 3. Clasificación de las β-lactamasas ............................................................................... 22

Tabla 4. Número de cepas BLEE y AmpC elegidas para el estudio...................................... 31

Tabla 5. Primers utilizados en el estudio ................................................................................... 33

Tabla 6. Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de la PCR ......................... 34

Tabla 7. Protocolo utilizado en la identificación del gen CTX-M ............................................ 34

Tabla 8. Protocolo utilizado en la identificación del gen SHV ................................................. 35

Tabla 9. Protocolo utilizado en la identificación del gen TEM ................................................ 35

Tabla 10. Protocolo utilizado en la identificación del gen CMY .............................................. 35

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Ecología de los antibióticos y la resistencia antibiótica.. ...................................... 16

Gráfico 2. Resultado de una PCR para los genes de estudio. .............................................. 38

Gráfico 3. Cepas BLEE que presentan al menos uno de los tres genes de

estudio ............................................................................................................................................ 39

Gráfico 4. Número de genes CTX-M, SHV y TEM encontrados en las 212 cepas

BLEE ............................................................................................................................................... 39

Gráfico 5. Número de genes tipo BLEE encontrados en la misma cepa ............................. 40

Gráfico 6. Cepas AmpC que presentan el gen CMY ............................................................... 40

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE ORIGEN AVIAR.

Autor: Cristian Andrés Narvaez Manosalvas

Tutor: Dr. Christian Vinueza Msc.

Fecha: Diciembre, 2015

RESUMEN

Escherichia coli es un bacilo gramnegativo que reside en el tracto

gastrointestinal de los animales. Generalmente es un saprofito, sin

embargo existen patotipos capaces de causar enfermedad. Cepas de E.

coli que presentan genes que codifican para β-lactamasas van en

continuo aumento, lo cual es causa de preocupación para la salud pública

mundial. La presente investigación tuvo como objetivo reportar la

presencia de los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY en una colección de E.

coli BLEE obtenida de la industria avícola ecuatoriana. Se utilizaron

primers específicos de cada gen para identificar las secuencias de interés

mediante una PCR. De 212 cepas BLEE analizadas se encontró una

prevalencia de los genes CTX-M, TEM y SHV en el 90,6%, 42% y 10,4%

respectivamente. De las 67 cepas con fenotipo AmpC, el 91% resultaron

positivas a la presencia del Gen CMY. Estos resultados demuestran la

variedad de β-lactamasas presentes en la industria avícola ecuatoriana,

por lo que se recomienda la implementación de estudios adicionales que

ayuden a determinar la epidemiología de estos genes en el país.

Palabras clave: Escherichia coli, saprofito, patotipos, genes

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

IDENTIFICATION OF RESISTANCE GENES TO β-LACTAM ANTIBIOTICS IN ESBL/AmpC Escherichia coli ISOLATED FROM POULTRY.

ABSTRACT

Escherichia coli is a gram negative bacillus that resides in the

gastrointestinal tract of animals. Generally it is a saprophyte, but there are

pathotypes that cause disease. E. coli strains that have genes encoding β-

lactamases are continuously increasing, and are of global concern for

public health. The present study aimed to report the presence of CTX-M,

SHV, TEM and CMY genes in a collection of ESBL E. coli obtained from

the Ecuadorian poultry industry. Gene-specific primers were used to

identify sequences of interest by PCR. From 212 ESBL strains analyzed

prevalence of CTX-M, TEM and SHV genes was found in 90.6%, 42% and

10.4% respectively. From the 67 strains with AmpC phenotype, 91%

tested positive for the presence of Gen CMY. These results demonstrate

the variety of β-lactamases present in Ecuador's poultry industry. The

implementation of additional studies will help to determine the

epidemiology of these genes in Ecuador.

Keywords: Escherichia coli, commensal, pathovars, genes

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INTRODUCCION

Escherichia coli es una bacteria gramnegativa que reside en el tracto

gastrointestinal de animales de sangre caliente (Zhou et al., 2015). La

mayoría de estos microorganismos corresponden a cepas no patógenas,

sin embrago, se han descrito cepas capaces de causar enfermedad en

humanos y animales (K. S. Baker, 2014; Dale & Woodford, 2015; Hasan

et al., 2011; Pitout, 2012).

El amplio uso de antibióticos para tratar infecciones bacterianas en

humanos y animales ha conducido a la presencia cada vez mayor de

bacterias resistentes a los antibióticos. Microorganismos que tienen la

capacidad de transmitir sus genes de resistencia a otras especies

bacterianas (Korzeniewska, Korzeniewska, & Harnisz, 2013; Livermore,

2012; Valentin et al., 2014).

El creciente número de bacterias resistentes a los β-lactámicos es de

particular importancia. Estos antibióticos son usados ampliamente en

medicina humana y veterinaria. El mecanismo más importante de esta

resistencia se debe a cepas productoras de β-lactamasas (Brouwer et al.,

2014; de Been et al., 2014; Jamborova et al., 2015; Smet et al., 2010; C.

Suárez & Gudiol, 2009).

Cepas de E. coli productoras de β-lactamasas de espectro extendido

(BLEE) o cepas tipo AmpC han sido aisladas de animales de producción,

siendo estos un reservorio de bacterias resistentes (Egervärn et al., 2014;

P. M. C. Huijbers et al., 2014; Reuland et al., 2015). Estos

microorganismos representan un riesgo en la transmisión de genes de

resistencia como lo han demostrado estudios en criadores de animales de

abasto (Hammerum et al., 2014).

Las principales enzimas tipo BLEE son: CTX-M, SHV y TEM (Kaarme,

Molin, Olsen, & Melhus, 2013; Moghaddam, Forghanifard, & Moshrefi,

2012). Dentro de este grupo CTX-M han tenido un aumento dramático,

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siendo la más prevalente en todo el mundo (Brigante et al., 2005;

Feizabadi et al., 2010; Peerayeh, Eslami, Memariani, & Siadat, 2013).

En el grupo de las β-lactamasas tipo AmpC, CMY-2 es la más

frecuentemente encontrada en cepas de E. coli en todo el mundo

(Bortolaia, Hansen, Nielsen, Fritsche, & Guardabassi, 2014; Ohnishi et al.,

2013).

El presente estudio fue realizado en los laboratorios de Bacteriología de la

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y laboratorios de Biología

Molecular del CIZ. Se aplicaron técnicas microbiológicas y moleculares,

que permitieron determinar la existencia y prevalencia de genes tipo CTX-

M, SHV, TEM y CMY en la industria aviar, que confieren resistencia hacia

antibióticos β-lactámicos.

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CAPITULO I

EL PROBLEMA

Planteamiento del problema

Los antibióticos han sido sin duda una de las drogas más exitosas de la

sociedad (Wright, 2011). Son ampliamente usados en la medicina humana

y veterinaria (Hernández, 2010; Schaumburg et al., 2014). Su amplio uso

ha sido correlacionado con el aumento de la resistencia antimicrobiana

(Lázaro, Iglesias, López, & Fernández, 2010). Esta resistencia tiene sus

peores consecuencias en los hospitales, especialmente en las unidades

de cuidados intensivos (Cisneros et al., 2010).

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la resistencia

bacteriana hacia los antibióticos es una de las tres mayores amenazas

para la salud (Piddock, 2012).

Se estima que en Europa, aproximadamente 400.000 pacientes cada año

sufren de una infección por bacterias resistentes a múltiples fármacos y

aproximadamente 25.000 mueren como consecuencia directa de esta

infección (Monnet, 2010).

La propagación de patógenos resistentes es un grave problema en la

salud pública de todo el mundo (Pomares et al., 2014; Rasheed,

Thajuddin, Ahamed, Teklemariam, & Jamil, 2014). A pesar de esta

creciente y continua resistencia bacteriana, diversos factores no han

permitido el desarrollo de nuevos antibióticos (García, 2010).

La introducción de antibióticos β-lactámicos, fue un gran paso en la

terapia de la medicina en contra de las infecciones bacterianas (C. M.

Dierikx et al., 2012; Randall et al., 2014; Wagner, Gally, & Argyle, 2014).

Estos antibióticos son muy utilizados, especialmente en infecciones

nosocomiales causadas por bacterias gramnegativas como E. coli

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(Sedláková et al., 2014; Sun et al., 2010). Sin embargo, el desarrollo de

bacterias que poseen β-lactamasas de tipo BLEE o AmpC, es uno de los

mecanismos más comunes de resistencia en bacterias gramnegativas

hacia los mencionados antibióticos (Curello & MacDougall, 2014; Fischer

et al., 2014; Sharma, Sharma, & Ray, 2010).

Las infecciones causadas por E. coli productora de β-lactamasas limitan

severamente las opciones terapéuticas. Estas patologías se asocian con

un mayor tiempo de tratamiento, una mayor morbilidad y mortalidad

(Blaak et al., 2014; Knudsen & Andersen, 2014; von Salviati, Laube,

Guerra, Roesler, & Friese, 2015).

La prevalencia de E. coli productora de BLEE se ha incrementado tanto

en medicina humana como veterinaria (Mo et al., 2014). Este aumento es

una causa de preocupación para la salud pública, puesto que estos genes

son fácilmente transferibles entre bacterias. Además, los plásmidos que

albergan estos genes de resistencia, frecuentemente se acompañan de

genes que confieren resistencia hacia otros antibióticos (quinolonas y

aminoglucósidos), limitando de esta forma las opciones terapéuticas

(Endimiani, Rossano, Kunz, Overesch, & Perreten, 2012; Hayakawa et al.,

2013; Koga et al., 2015; Martinez, Garzón, & Mattar, 2012; Tofteland,

Dahl, Aasnæs, Sundsfjord, & Naseer, 2012).

Se ha propuesto que la propagación de infecciones causadas por BLEE,

especialmente del tipo CTX-M, es mayor en los países en vías de

desarrollo. Esto podría deberse a diversos factores socioeconómicos,

entre ellos, la auto-prescripción de antibióticos que se venden sin receta

médica (Villegas, Kattan, Quinteros, & Casellas, 2008).

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5

Justificación

El problema de la resistencia a los antimicrobianos que presentan las

bacterias repercute en la práctica microbiológica, terapéutica,

epidemiológica y de la salud pública (L. Martínez & Calvo, 2010). Por esta

razón, el uso adecuado de los antimicrobianos requiere la participación

activa de varios sectores, ya que estos compuestos se encuentran entre

los fármacos más utilizados en los centros de salud (Gudiol, 2010;

Sánchez, Palomo, Ortega, & Ribas, 2010). Es así que en Europa, el

Centro Europeo para la Prevención y el Control de las Enfermedades

(ECDC) ha realizado varias campañas con este propósito (Campos,

Pérez, & Oteo, 2010).

Un informe de la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de Estados

Unidos (IDSA) menciona que E. coli productora de BLEE requiere con

urgencia nuevas terapias (Peirano & Pitout, 2010).

La identificación de microorganismos productores de β-lactamasas en el

laboratorio clínico requiere personal capacitado e infraestructura

adecuada. Los estudios microbiológicos deben complementarse con

técnicas moleculares. De esta manera se pueden suministrar datos útiles

para una terapéutica adecuada y los factores de riesgo asociados con las

infecciones, para identificar la relación clonal entre microorganismos y

describir su epidemiología (Kaftandzieva, Trajkovska-Dokic, & Panovski,

2011; L. Martínez & Calvo, 2010; Sharma et al., 2010; J. Stuart et al.,

2010).

Estos precedentes han sido un motivo para la implementación de

programas de monitoreo de la resistencia a los antibióticos en los

animales productores de alimentos (Cindy Maria Dierikx, 2013).

En vista de la importancia en el área de la Salud Pública a nivel mundial

que se da a las cepas de E. coli productoras de β-lactamasas y los

escasos los estudios realizados en Ecuador sobre la presencia de genes

CTX-M, SHV y TEM en cepas BLEE, y del gen CMY en cepas AmpC de

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E. coli. El presente estudio identifico la presencia de estos genes, así

como su frecuencia en cepas de E. coli de origen aviar. De esta manera

permitió tener un sustento científico para que en el futuro se pueda tomar

medidas adecuadas del manejo de antibióticos en la industria avícola

ecuatoriana.

Objetivos:

GENERAL:

Identificar genes de resistencia a antibióticos β-Lactámicos en cepas

BLEE y AmpC de E. coli de origen aviar, pertenecientes al banco de

cepas de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la

Universidad Central del Ecuador (UCE), utilizando técnicas de Biología

Molecular.

ESPECIFICOS:

1. Obtener ADN de cepas BLEE y AmpC de E. coli, pertenecientes al

banco de cepas de la FMVZ de la UCE.

2. Identificar la presencia de genes CTX-M, SHV y TEM, del banco de

cepas BLEE de E. coli, perteneciente al laboratorio de bacteriología

de la FMVZ de la UCE mediante la utilización de la PCR.

3. Identificar la presencia del gen CMY, del banco de cepas AmpC de

E. coli, perteneciente al laboratorio de bacteriología de la FMVZ de

la UCE mediante la utilización de la PCR.

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CAPITULO II

MARCO TEORICO

Antecedentes de la Investigación

La forma en que se utilizan los antibióticos en la producción avícola ha

cambiado, especialmente en países europeos. La fuerza impulsora del

cambio radica en la noción de los potenciales riesgos percibidos con esta

práctica en la salud pública. Es así que los primeros estudios realizados

en Gran Bretaña demostraron la resistencia de E. coli a múltiples

antimicrobianos en muestras provenientes de la flora fecal de pollos de

engorde (Singer & Hofacre, 2006).

En Holanda se realizó un estudio para determinar la prevalencia de cepas

tipo BLEE y AmpC en E. coli, de muestras provenientes de pollos y del

personal que laboraba en granja (C. Dierikx et al., 2013).

En España de 260 muestras fecales tomadas mediante hisopado rectal de

pollos vivos, 237 cepas (91,1%) fueron caracterizadas como E. coli tipo

BLEE (Abreu et al., 2014).

En Ecuador en el 2014 se realiza un estudio para determinar la

prevalencia de E. coli BLEE. Las muestras se tomaron a partir de ciegos

de pollos faenados en camales de la provincia de Pichincha. De 145

muestras analizadas el 86,89% resultaros positivas (126/145) (Vásconez,

2015). Un estudio posterior en el 2015 cuantificó E. coli BLEE en puntos

críticos de control en los mismos camales, indicando que las mayores

cargas bacterianas de E. coli se encuentran en el eviscerado (Perez,

2015).

Adicionalmente, varios estudios realizados en hospitales del Ecuador, así

como en otros países, han reportado la presencia de microorganismos

productores de BLEE, entre ellos, E. coli (Alarcón, Obregón, & Suárez,

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2011; Albarado et al., 2009; Arce, Llontop, Alarcón, & Lopez, 2014; León

& Pacheco, 2010; Pavón, Zalazar, Morales, & Rojas, 2011; Sana et al.,

2011).

Por último, un estudio realizado en comunidades del norte de la costa

ecuatoriana, concluyó que hay una fuerte correlación entre la virulencia y

resistencia a los antibióticos en E. coli (Zhang et al., 2015).

Por lo expuesto anteriormente, el tema de la resistencia hacia los

antibióticos causada por microorganismos productores de enzimas Tipo

BLEE y AmpC es de particular importancia a nivel mundial. Esta

importancia es tanto en la salud pública humana como veterinaria. El

presente trabajo permite aportar información de genes que confieren

resistencia a los antibióticos β-lactámicos presentes en la industria aviar.

Fundamentación Teórica

Generalmente se considera a los microorganismos como agentes

productores de enfermedades, pero no todos son dañinos, la mayoría son

apatógenos, muchos son muy útiles en la alimentación, industria,

ecología, etc. (Stanchi, 2007). Los microorganismos están ampliamente

distribuidos en el ambiente. En los organismos vivos constituyen la "flora

normal" en piel, mucosas e intestinos. Su importancia en Medicina

Veterinaria radica en que algunos de ellos, además de causar

enfermedad en los animales, tienen carácter zoonósico (Stanchi, 2007;

Winn et al., 2013c).

En el grupo de los microorganismos, las bacterias comprenden el mayor

grupo de patógenos (Stanchi, 2007; Winn et al., 2013c). Estas son

organismos unicelulares que contienen un ADN carente de membrana

nuclear (procariotas), ARN, junto con la maquinaria necesaria para crecer

y autorreplicarse. Si bien su estructura interna es simple, su envoltura

celular es compleja. Formando parte de esta envoltura se encuentra la

pared celular, que permite dividir las bacterias de acuerdo con su

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capacidad de retener o no un colorante (Tinción de Gram) en

grampositivas y gramnegativas (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009c;

Stanchi & Gentilini, 2007b; Winn et al., 2013c).

La enterobacterias son el grupo más grande y diverso de bacilos

gramnegativos. Se recuperan frecuentemente de muestras clínicas y se

encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza (tierra, agua, sobre

las plantas, y tubo digestivo de humanos y animales) (Murray, Rosenthal,

& Pfaller, 2009b; Winn et al., 2013b). Estas Pueden ser agrupadas en tres

categorías: patógenos principales, patógenos oportunistas y no

patógenos. Los principales patógenos animales, E. coli, especies de

Salmonella y especies de Yersinia causan principalmente enfermedades

entéricas y sistémicas (Quinn et al., 2011).

Escherichia coli

Historia

Fue un pediatra nacido en Alemania en 1857, Theodor Escherich, que

tras estudios realizados en el tracto gastrointestinal de infantes presento

sus conclusiones acerca de la morfología, propiedades y efectos de las

poblaciones bacterianas, entre ellas Bacterium coli commune (bacilo de

colon común, conocido como Escherichia coli) (Fernández, Rodriguez,

Rodriguez, & Gomez, 2003; Shulman, Friedmann, & Sims, 2007). La

clasificación taxonómica de este bacilo se muestra en la Tabla 1.

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Tabla 1. Clasificación sistemática de E. coli

Reino: Procariotas

División: Gracilicutes

Clase: Escotobacteria

Orden: Eubacteriales

Familia: Enterobacteriaceae

Tribu: Escherichieae

Género: Escherichia

Especie: coli

Fuente: Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2010a; Parma, 2007

Modificado por: El autor

Morfología

E. coli es un bacilo recto gramnegativo, mide entre 1,5 µm x 6 µm. Forma

colonias circulares de bordes continuos, convexas y en medios

diferenciales presenta brillo metálico (Parma, 2007; Winn et al., 2013c).

Elementos constitutivos

E. coli contiene un citoplasma morfológicamente simple, rodeado de una

membrana citoplasmática, la cual está delimitada por una pared celular

compleja y una membrana externa. Su material genético no está separado

del citoplasma por una membrana. Presenta ribosomas, fimbrias, flagelos

para la locomoción, y solo algunas cepas presentan cápsula (Parma,

2007; Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008).

Citoplasma: en él se encuentran enzimas, iones, gránulos con

reserva de alimentos, ribosomas y el material genético, el ADN

(Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009a; Winn et al., 2013a).

Membrana citoplasmática: es el principal punto de contacto con el

medio externo (Willey et al., 2008). Posee una doble capa de

fosfolípidos (no contiene esteroles) (Murray et al., 2009a). Cumple

varias funciones, entre ellas, el mantenimiento de un potencial

eléctrico, transporte hacia el interior y exterior celular, producción de

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energía y polímeros y replicación del ADN, debido a la presencia de

diversas enzimas (Brooks et al., 2010a; Foster, 2004; Murray et al.,

2009a; Winn et al., 2013a).

El periplasma: ubicado entre la membrana plasmática y la capa de

peptidoglucano, es un compartimento altamente viscoso ocupado por

diversas proteínas, tales como las β-lactamasas (Ruiz, Kahne, &

Silhavy, 2006).

Pared bacteriana: es externa a la membrana citoplasmática, confiere

la rigidez suficiente para mantener la forma celular (Winn et al.,

2013a). Protege a la célula de la lisis osmótica y sustancias tóxicas

(Willey et al., 2008). Estructuralmente está compuesta por dos capas:

1) una capa delgada de peptidoglucano (5% a 10% de la pared

celular) y 2) una membrana externa (Murray et al., 2009a).

Capa de peptidoglucano: es una malla formada por cadenas

lineales de polisacáridos unidas mediante péptidos (Murray et al.,

2009a). A diferencia de las bacterias grampositivas en

gramnegativas es una capa laxa, con un grosor de

aproximadamente 2 a 7 nm (Willey et al., 2008; Winn et al., 2013a).

La glucosamina tras una serie de reacciones enzimáticas da lugar

al disacárido GlcNAc-MurNAc, el que se une a una cadena

polipeptídica mediante transglucosilasas. En el exterior celular las

cadenas disacárido-polipeptídicas se entrecruzan entre sí mediante

un grupo de enzimas denominadas proteínas de unión a la

penicilina (PBP, penicillin binding protein) (Marcela & Monge, 2013;

Murray et al., 2009a; Winn et al., 2013e).

Membrana externa: compuesta por un lipopolisacárido que

contribuye a la carga negativa en la superficie bacteriana, la

adhesión, formación de biopelículas, permeabilidad selectiva y

protección de las defensas del huésped. Consta de tres

componentes: 1) el lípido A, también llamado endotoxina, su

estructura general es idéntica en todas las enterobacterias, 2)

polisacárido central, similar entre especies o géneros bacterianos y

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3) polisacárido O, llamado también antígeno O, provoca una

respuesta inmune y confiere particularidad serológica en especies

bacterianas (serotipos), mediante el cual se puede diferenciar

distintas cepas como la O157:H7 de E. coli (Murray et al., 2009a;

Stanchi & Gentilini, 2007b; Willey et al., 2008; Winn et al., 2013a).

Nucleoide: Su material genético, el cromosoma, es una molécula

circular única de ADN bicatenario (Murray et al., 2009a; Willey et al.,

2008).

Plásmidos: Además del cromosoma, muchas procariotas contienen

ADN extracromosómico, el plásmido, que puede ser circular o lineal,

capaz de replicarse en forma autónoma. Aunque su información

genética no es esencial, posee relativamente pocos genes que pueden

codificar para factores de virulencia, como la resistencia a los

antimicrobianos (plásmidos R) (Harbottle, Thakur, Zhao, & White,

2006; Moreno M, González E, & Beltrán, 2009; Willey et al., 2008;

Winn et al., 2013a).

Ribosomas: están formados por proteínas y ARN. Son las estructuras

físicas donde se sintetizan proteínas. (Willey et al., 2008).

Flagelos: son apéndices filiformes que se extienden desde la

membrana plasmática hacia afuera (Willey et al., 2008). Permiten que

las bacterias se dirijan hacia los nutrientes o se alejen de sustancias

tóxicas (Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2010b). E. coli

presenta flagelos perítricos, sin embrago, existen cepas sin flagelos

carentes de movilidad (Parma, 2007).

Pilosidades o fimbrias: estas estructuras presentan un menor

diámetro y longitud que los flagelos (Stanchi & Gentilini, 2007a). Es

aceptado el término fimbria para describir estructuras relacionadas con

la adherencia bacteriana y el término pili sexual, a estructuras

relacionadas con la transferencia de ADN en la conjugación bacteriana

(Brooks et al., 2010b; Stanchi & Gentilini, 2007a).

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Patotipos de E. coli

Desde que E. coli se descubrió ha sido muy estudiada en numerosos

laboratorios de todo el mundo, no solo es un habitante intestinal

inofensivo, también un patógeno altamente versátil (Hacker & Blum-

Oehler, 2007; Sun et al., 2010). Normalmente coloniza el tracto

gastrointestinal pocas horas después del nacimiento. La mayoría de las

cepas son comensales y rara vez causan enfermedad (Kaper, Nataro, &

Mobley, 2004; Meng, LeJeune, Zhao, & Doyle, 2013). Sin embargo, hay

cepas que han adquirido factores de virulencia específicos que les

confieren una mayor capacidad de adaptación a nuevos nichos, dando

lugar a patotipos que pueden causar enfermedad en presencia de

determinados factores predisponentes (Croxen & Finlay, 2009; Kaper et

al., 2004; Quinn et al., 2011). En general las cepas patógenas de E. coli

se pueden dividir en aquellas que causan enfermedades entéricas y

extraintestinales. Los patotipos que pueden producir enfermedad entérica

en humanos y animales de manera general incluyen a: 1) ETEC (E. coli

Enterotoxigénica), 2) AEEC (E. coli Adherente) y 3) EAggEC (E. coli

Enteroagregativa) (Pereira et al., 2013; Quinn et al., 2011). Los patotipos

que tienen la capacidad de producir enfermedad extraintestinal,

denominados de manera general como ExPEC (E. coli patogénica

Extraintestinal) provocan enfermedades en animales y seres humanos

(colibacilosis) (Copes, 2007; Danzeisen, Wannemuehler, Nolan, &

Johnson, 2013). En los animales estas ExPEC pueden a su vez

subdividirse en: 1) APEC (E. coli patogénica Aviar), 2) SEPEC (E. coli

Septicémica), 3) UPEC (E. coli Uropatogénica) y 4) patógenos

Oportunistas (Dai et al., 2010; Quinn et al., 2011).

Colibacilosis Aviar

Esta enfermedad infecciosa causada por E. coli afecta a aves de todas las

edades, es considerada como una de las principales causas de morbilidad

y mortalidad. Causa fuertes pérdidas económicas en la industria avícola

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de todo el mundo (Dziva & Stevens, 2008; Lutful Kabir, 2010; Oosterik,

Peeters, Mutuku, Goddeeris, & Butaye, 2014). El riesgo de esta

enfermedad aumenta con la presencia de factores que deterioran el

estado inmunológico de las aves. El reservorio más importante es el tracto

intestinal de mamíferos y aves. Además, está presente en las heces, agua

y alimentos contaminados (Lutful Kabir, 2010; Parma, 2007).

Las medidas preventivas están encaminadas a prevenir la contaminación

en los huevos, tener una infraestructura adecuada, implementar buenas

medidas de bioseguridad, realizar el control de plagas, entre otras (Lutful

Kabir, 2010). A pesar de que la mayoría de las cepas APEC aviares y

ExPEC humanas difieren, algunos trabajos sugieren que una posible

fuente de cepas ExPEC que colonizan humanos provendrían de carne de

aves contaminada (Danzeisen et al., 2013). Hay estudios que indican que

cepas patógenas para humanos se han aislado ocasionalmente de aves

de corral enfermas y sanas (Lutful Kabir, 2010). Cepas de E. coli

resistentes a los antibióticos procedentes del intestino de las aves,

pueden contaminar las canales durante el faenamiento y ser ingeridas. De

esta manera, bacterias multirresistentes podrían colonizar el tracto

intestinal humano, transferir sus genes de resistencia a bacterias

patógenas y causar infección (Dziva & Stevens, 2008; Lutful Kabir, 2010;

Oosterik et al., 2014; Singer & Hofacre, 2006).

Importancia de la resistencia bacteriana

Después de muchos años fuera de la luz pública, la resistencia a los

antimicrobianos adquiere importancia mundial en la agenda política y

científica, haciéndose presente en los medios de información general,

traspasando los límites de la literatura médica (Alós, 2014; S. Baker,

2015). Según la OMS, la resistencia de los microorganismos hacia los

antibióticos es uno de los mayores problemas que enfrenta la salud

pública mundial (Galán, Moreno, & Baquero, 2014). Las infecciones

nosocomiales son un problema que enfrentan los centros de salud. Hasta

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el 10% de los pacientes hospitalizados adquieren una infección

intrahospitalaria, valores similares tanto en la práctica humana como

veterinaria (en pequeñas especies) (Buriticá, Echeverry, Jaimes, &

Gómez, 2012). Al mantener pacientes en estado infeccioso, no solo

aumentan los costos de los tratamientos si no también se facilita la

transmisión de la enfermedad a otras personas (Alós, 2014; Fernandes,

Amador, Oliveira, & Prudêncio, 2014; Fica, 2014; Galán et al., 2014). En

los centros de salud de muchos países la resistencia a múltiples drogas

en infecciones por bacilos gramnegativos, ha restringido severamente las

opciones terapéuticas (Carlet et al., 2011). Se estima que 25000 personas

fallecen cada año en Europa por infecciones causadas por bacterias

resistentes a los antibióticos, particularmente aquellas productoras de

BLEE. Un reciente informe de los Centros para el Control y la Prevención

de Enfermedades (CDC) estima que por lo menos 2 millones de

enfermedades y 23000 muertes al año en los EE.UU. fueron causadas

por microorganismos resistentes (Blair, Webber, Baylay, Ogbolu, &

Piddock, 2015; Laxminarayan et al., 2013; Sütterlin et al., 2014).

Causas que favorecen la presencia de bacterias resistentes

Según la organización mundial de la salud, el excesivo e inapropiado uso

de antibióticos en la medicina humana y veterinaria, se considera la más

importante causa de la creciente resistencia bacteriana (Hansen,

Hoffmann, McCullough, van Driel, & Del Mar, 2015; Rodríguez-Rojas,

Rodríguez-Beltrán, Couce, & Blázquez, 2013). Recientes estudios

mencionan que las concentraciones de antibióticos muy por debajo de la

concentración mínima inhibitoria (CIM) seleccionan bacterias resistentes

(Fica, 2014). Estas bajas concentraciones de antibióticos se encuentran

en muchos entornos naturales (aguas residuales, ríos, lagos e incluso en

el agua de beber), también en los pacientes, ganado, acuacultura y

agricultura, durante el uso de antibióticos. Estos factores conllevan a un

ciclo continuo de antibióticos, con el riesgo de seleccionar bacterias

resistentes en el medioambiente donde se espera que la probabilidad de

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la transferencia horizontal de genes de resistencia sea alta (Andersson &

Hughes, 2014; Blaak et al., 2015; Dahshan, Abd-Elall, Megahed, Abd-El-

Kader, & Nabawy, 2015; J. L. Martínez, Coque, & Baquero, 2015) .

Además de seleccionar bacterias resistentes, se ha documentado en E.

coli que dosis subletales de antibióticos se correlacionan

significativamente con un aumento en la mutagénesis por diversos

mecanismos. Este hecho aumenta la variabilidad genética y la capacidad

de resistir la acción de los antimicrobianos (Rodríguez-Rojas et al., 2013).

En el Gráfico 1 se muestra la ecología de los antibióticos y la resistencia a

estos.

Gráfico 1. Ecología de los antibióticos y la resistencia antibiótica. Los antibióticos se liberan en el medio ambiente, ejerciendo una presión selectiva sobre las bacterias, favoreciendo el desarrollo de cepas resistentes. Tomado de: Andersson & Hughes, 2014

El uso de pequeñas dosis de antibióticos en la industria animal es una

práctica difundida. Es así que en Estados Unidos entre el 2009 y 2010 se

emplearon 4 veces más de antibióticos en animales que en humanos,

especialmente como promotores de crecimiento (Alós, 2014; Carlet et al.,

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2011; Fica, 2014). En los países de bajos ingresos, estos antibióticos

suelen ser de la misma clase a los que se utilizan en la terapia humana

(S. Baker, 2015; Laxminarayan et al., 2013). Las bacterias y sus genes de

resistencia pueden diseminarse de los animales a los humanos, a través

del contacto directo y la cadena alimentaria (Grave et al., 2014; Leigue,

Moura, Aguilar, Pestana, & Lincopan, 2013). La fuente más probable de

bacterias resistentes en los alimentos de origen animal sería la

contaminación de las canales con los intestinos de los animales durante la

matanza, así como en otras etapas de la cadena alimentaria. Se estima

que de las 100000 - 200000 toneladas de antibióticos fabricados cada

año, la mayoría son utilizados en la agricultura, horticultura y sector

veterinario (Laxminarayan et al., 2013).

Antimicrobianos

Un antimicrobiano se define como toda sustancia de origen natural o

sintético que inhibe el desarrollo o mata a un microorganismo. Los

antibióticos tienen estas mismas propiedades, excepto que son

producidos de manera natural por microorganismos (Gentilini, 2007). Fue

Alexander Fleming en 1928, quien descubrió la penicilina al mirar como

en una placa de agar se había inhibido el crecimiento de Staphylococcus

aureus por un hongo, Penicillium notatum, hecho que dio lugar a la

revolución de la terapia antiinfecciosa (Capita & Calleja, 2013). Los

antibióticos son clasificados de acuerdo a su mecanismo de acción

(Sumano & Ocampo, 2006).

β-lactámicos. La mayoría de antibióticos que inhiben la síntesis de la

pared celular se clasifican como β-lactámicos (Alós, 2014; Gentilini, 2007).

Tienen semejanza estructural al sustrato de las PBP, por lo que inhiben la

formación del peptidoglucano, dando como resultado final la lisis

bacteriana (Murray et al., 2009a; Winn et al., 2013a). La clasificación de

estos antibióticos se muestra en la Tabla 2.

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Inhibidores de las β-lactamasas (IBL). Son compuestos que presentan

semejanza estructural a los β-lactámicos, por tanto pueden unirse a las β-

lactamasas evitando la hidrólisis de los β-lactámicos, manteniendo de

esta manera el mecanismo de acción de estos (Winn et al., 2013e).

Tabla 2. Clasificación de los β-lactámicos

CLASE GRUPO ALGUNOS EJEMPLOS

β-lactámicos Penicilinas naturales Penicilina G, Penicilina V

Penicilinas resistentes a penicilinasas Meticilina, Nafcilina, Oxacilina, Cloxacilina

Aminopenicilinas Ampicilina, Amoxicilina

Carboxipenicilinas Carbenicilina, Ticarcilina

Ureidopenicilinas Mezlocilina, Piperacilina

Carbapenenmes Imipenem, Meropenem

Monobactámicos Aztreonam

Combinaciones de β-lactámicos con inhidores de

β-lactamasas

Amoxicilina-Clavulánico, Ampicilina-

Sulbactam

Carbacefem Loracarbef

Cefalosporinas de primera generación Cefalotina, Cefalexina, Cefazolina,

Cefaloridina

Cefalosporinas de segunda generación Cefaclor, Cefámandol, Cefuroxima ,

Cefatrizina

Cefalosporinas de tercera generación Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftacidima,

Cefixima, Ceftiofur

Cefalosporinas de cuarta generación Cefepima, Cefpiroma

Cefamicinas Cefoxitina, Cefotetán

Glucopeptidos Glucopeptidos Vancomicina, Teicoplanina

Fosfomicinas Fosfomicina

Otros Bacitracina, Fosfomicina, Isoniacida,

Cicloserina.

Fuente: Gentilini, 2007; Winn et al., 2013e Modificado por: El Autor.

Resistencia de los microorganismos a los antibióticos

Desde su descubrimiento en el siglo pasado, los antibióticos han permitido

la sobrevivencia de millones de individuos a infecciones bacterianas, lo

cual ha aumentado la esperanza de vida en la población. Sin embargo, su

utilidad se ha visto amenazada por la creciente resistencia bacteriana,

definida como la capacidad que tienen las bacterias a sobrevivir en

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determinadas concentraciones de antibióticos que serían letales para

otras de su misma especie (Alós, 2014; Carlet et al., 2011). Esta

resistencia aumenta frente a la exposición de un antimicrobiano, ya que

en presencia de este, únicamente crecerán las bacterias resistentes a él

(Alós, 2014; Fica, 2014). Se ha dicho que esta resistencia no es otra cosa

que la expresión de arcaicos mecanismos de sobrevivencia que permitían

que las bacterias sobrevivan en ambientes agresivos (Casellas, 2011;

Spellberg, Bartlett, & Gilbert, 2013). Es así que, estudios realizados sobre

la resistencia bacteriana a los antimicrobianos, demuestran que en la

amazonia ecuatoriana existen bacterias ambientales que poseen genes

de resistencia hacia antibióticos como ampicilina, tetraciclina y

eritromicina, en áreas sin intervención humana (Valencia, 2009). Este

problema es agravado por la existencia de bacterias que presentan más

de un mecanismo para resistir la acción de los antibióticos y que tienen la

capacidad de transmitirlo a su descendencia, o a otras especies

bacterianas (Moreno M et al., 2009).

Tipos y mecanismos generales de resistencia

Natural o intrínseca: es propia de la morfología y fisiología de la

especie, presente en el genoma de todo un género microbiano

hacia antibióticos específicos (Gentilini, 2007).

Mutacional: producida por cambios espontáneos en la secuencia

de nucleótidos del ADN. El cambio puede darse en genes

preexistentes o adquiridos (Gentilini, 2007).

Adquirida: se debe a la transferencia horizontal de genes de

resistencia anteriormente inexistentes en la bacteria, mediante

conjugación, transformación o transducción (Gentilini, 2007;

Moreno M et al., 2009).

Conjugación: el mecanismo más importante, lo usan bacterias

gramnegativas e incluso grampositivas, una bacteria donadora

transfiere su material genético (plásmidos) a una receptora

mediante el pili sexual (Gentilini, 2007; Winn et al., 2013e). Los

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elementos que participan en la transferencia son: 1) plásmidos,

2) transposones, que son pequeñas secuencias de ADN que

pueden moverse e integrarse entre plásmidos, de un cromosoma

a un plásmido o viceversa y no se autorreplican y 3) integrones,

secuencias de ADN que no pueden transponerse, pero se

asocian a transposones y plásmidos. Estos pueden integrar

varios genes de resistencia. Esta integración implica que el uso

de un antibiótico que induzca la expresión de un gen de

resistencia, seleccione resistencia hacia otros antibióticos, cuyos

genes de resistencia están en el integrón (Alós, 2014; Gentilini,

2007). El plásmido de E. coli aviar, el Papec-O2-R, contiene

genes de resistencia a metales pesados, un gen de resistencia a

compuestos de amonio cuaternario, y hasta ocho genes de

resistencia a antibióticos diferentes. Todos o alguno de estos

genes pueden estar bajo presión de selección en el entorno de

las aves de corral, lo cual hace suponer que la persistencia de la

resistencia hacia un antibiótico determinado puede presentarse

en ausencia al mismo (Singer & Hofacre, 2006).

Transformación: en este proceso el ADN desnudo de una

bacteria presente en el medio extracelular, puede incorporarse al

genoma de otra bacteria y expresarse, generalmente se da entre

géneros muy relacionados (Gentilini, 2007; Moreno M et al.,

2009).

Transducción: el ADN de un plásmido es incorporado y luego

transferido a otra bacteria mediante un virus que infecta

bacterias (bacteriófago) (Moreno M et al., 2009).

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Mecanismos de resistencia hacia antibióticos β-

lactámicos

Modificaciones de las PBP: cambios estructurales en las PBP por

mutaciones en los genes que las codifican da lugar a una menor

afinidad hacia todos los antibióticos β-lactámicos (Gentilini, 2007;

Marcela & Monge, 2013; Moreno M et al., 2009).

Inactivación enzimática mediada por β-lactamasas: las β-

lactamasas son un mecanismo frecuente de resistencia, inactivan

los antibióticos mediante ruptura del anillo β-lactámico y se ubican

a nivel extracelular o en el espacio periplásmico (Gentilini, 2007;

Moreno M et al., 2009; Urumova, 2015). Los bacilos gramnegativos

se caracterizan por una producción de β-lactamasas mucho más

variada y compleja que las bacterias grampositivas (Winn et al.,

2013e). Estas enzimas han sido clasificadas en base a su

secuencia de aminoácidos, perfiles inhibitorios e hidrolíticos y

actualmente en características específicas de cada enzima

(Marcela & Monge, 2013). Se ha descrito alrededor de 963 tipos de

β-lactamasas funcionales diferentes, En la Tabla 3 se indica la

clasificación de estas enzimas (Bush & Jacoby, 2010). La mayoría

de las nuevas β-lactamasas se diferencian entre sí por el cambio

de un único aminoácido en su secuencia proteica, pero con

profundos efectos para el manejo de las enfermedades infecciosas

(Winn et al., 2013e). Estas subclases de enzimas pueden degradar

diferentes antibióticos pertenecientes a un mismo grupo (Blair et

al., 2015).

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Tabla 3. Clasificación de las β-lactamasas

Familia

de

Enzimas

Grupo funcional

o subgrupo

No. de enzimas Enzimas representativas

CMY 1, 1e 50 CMY -1 a CMY- 50

TEM 2b, 2be, 2br, 2ber 172

2b 12 TEM -1, TEM – 2, TEM – 13

2be 79 TEM -3. TEM- 10, TEM-26

2br 36 TEM-30 (IRT-2), TEM -31 (IRT-

3),TEM – 163

2ber 9 TEM -50 (CMT- 1), TEM -158

(CMT -9)

SHV 2b, 2be, 2br 127

2b 30 SHV -1, SHV – 11, SHV -89

2be 37 SHV – 2, SHV – 3, SHV – 115

2br 5 SHV – 10, SHV – 72

CTX-M 2be 90 CTX –M -1, CTX-M-44, a CTX –

M- 92

PER 2be 5 PER -1 a PER – 5

VEB 2be 7 VEB -1 a VEB- 7

GES 2f 15 GES – 2 a GES -7, GES -15

KPC 2f 9 KPC- 2 a KPC-10

SME 2f 3 SME -1, SME- 2, SEM -3

OXA 2d, 2de, 2df 158

2d 5 OXA -1, OXA -2, OXA -10

2de 9 OXA -11, OXA – 14, OXA -15

2df 48 OXA -23, OXA – 51, OXA -58

IMP 3a 26 IMP -1, IMP -26

VIM 3a 23 VIM – 1, VIM – 23

IND 3a 8 IND -1, IND -2, IND -2a, IND -3,

a IND -7

Fuente: Bush & Jacoby, 2010 Modificado por: El Autor

Disminución de la permeabilidad: se da cuando el antibiótico no

puede ingresar a la célula a través de las porinas de las bacterias

gramnegativas. Esta resistencia puede ser natural, como en el caso

de las porinas de P. aeruginosa que pueden ser hasta 90 veces

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menos permeables que las de E. coli. La resistencia adquirida se

debe a mutaciones en los genes que las codifican, dando lugar a la

modificación en el tamaño, carga eléctrica de las porinas o a una

menor expresión, lo que afecta el acceso de los antibióticos a las

PBP (Babic, Hujer, & Bonomo, 2006; Gentilini, 2007; Marcela &

Monge, 2013; Moreno M et al., 2009; C. J. Suárez, Kattán,

Guzmán, & Villegas, 2006; Vila & Marco, 2010).

Bombas de Eflujo: son canales proteicos bacterianos que pueden

expulsar moléculas de antibióticos u otras moléculas tóxicas para

las bacterias del citoplasma o periplasma (Gentilini, 2007).

La resistencia en E. coli

La resistencia a muchas clases de antimicrobianos en E. coli humana y

animal se ha reportado en todo el mundo. Esta multirresistencia presenta

un desafío importante para la eficacia terapéutica. Por tanto, la detección

de estas Enterobacteriaceae resistentes se ha convertido en un tema de

preocupación mundial, tanto en medicina humana como veterinaria. La

resistencia a antibióticos β-lactámicos que presenta E. coli ha sido bien

documentada, siendo el mecanismo principal la producción de enzimas

tipo BLEE o AmpC (Brunton, Reeves, Snow, & Jones, 2014; Meunier,

Jouy, Lazizzera, Kobisch, & Madec, 2006).

β-lactamasas tipo BLEE

Este grupo de enzimas pueden hidrolizar una gran variedad de β-

lactámicos, mas no cefamicinas ni carbapenémicos y son inhibidas por el

ácido clavulánico. La amplia difusión de estas enzimas en los hospitales y

animales de producción es de gran preocupación y representa un

problema para el tratamiento de enfermedades infecciosas. (Brunton et

al., 2014; Fica, 2014; Silva et al., 2012). En este grupo se encuentran

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enzimas de las familias TEM, SHV, CTX-M, y otras con menor prevalencia

como PER, VEB, BES, GES, TLA, SFO y OXA (Navarro, Calvo, Cantón,

Fernández-Cuenca, & Mirelis, 2011; Poole, 2004). La resistencia de cepas

productoras de BLEE a los β-lactámicos suele asociarse con la resistencia

a los aminoglucósidos, fluoroquinolonas y clotrimoxazol, dado que los

genes que confieren tal resistencia suelen ubicarse en el mismo plásmido

(Egea et al., 2012; Gentilini, 2007; Moreno M et al., 2009; Silva et al.,

2012). Cepas de E. coli tipo BLEE han sido detectadas en todo el mundo.

Son las enzimas más prevalentes en Enterobacteriaceae, asociadas con

infecciones nosocomiales (Carattoli, 2008; Liebana et al., 2013; Paterson

& Bonomo, 2005). También han sido aisladas en humanos y animales

sanos, así como en productos alimenticios como la carne, el pescado, y

leche cruda (James Stuart et al., 2012; Zurfluh, Hachler, Nuesch-

Inderbinen, & Stephan, 2013). Se ha estimado que la prevalencia de E.

coli tipo BLEE a nivel hospitalario en América Latina, Asia, Europa y

Norte América, es del 13,5%, 12,0%, 7,6%, y 2,2% respectivamente

(Falagas & Karageorgopoulos, 2009).

Detección fenotípica de E. coli BLEE

La detección de enzimas BLEE no siempre es fácil, pues su fenotipo

depende de la cantidad de enzima producida y de la presencia o no de

otros mecanismos de resistencia. La detección fenotípica de estas

enzimas se fundamenta en su capacidad de hidrolizar cefalosporinas de

tercera y cuarta generación, y que son inhibidas por el ácido clavulánico.

Existen diversas pruebas basadas en esta acción inhibitoria, entre ellas la

técnica de disco-difusión. Esta prueba se fundamenta en el diámetro de

los halos de inhibición de algunos antibióticos betalactámicos y en la

sinergia producida entre cefalosporinas de amplio espectro o

monobactámicos con el ácido clavulánico (Navarro et al., 2011).

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β-lactamasas tipo AmpC

Estas enzimas pertenecientes a la clase molecular C de Ambler (Navarro

et al., 2011). Están codificadas por el gen AmpC, resisten la acción de

cefalosporinas, bencilpenicilinas y cefemicidas, no son inhibidas por

inhibidores de β-lactamasas ni EDTA, lo que obliga a los hospitales a

usar carbapenems cuando estas enzimas están presentes en infecciones

bacterianas (Blaak et al., 2015; Fica, 2014; Marcela & Monge, 2013). La

producción de enzimas AmpC puede ser constitutiva o inducible. Cuando

se expresa constitutivamente, puede hacerlo a niveles basales cuando la

localización es cromosómica o en grandes cantidades cuando es de

localización plasmídica. La forma inducible se da por exposición a

antibióticos β-lactámicos, cuando los productos de degradación de la

pared celular activan la proteína AmpR, la cual a su vez activa la

expresión del gen ampC, el que codifica para β-lactamasas tipo AmpC

(Navarro et al., 2011; Rubin & Pitout, 2014; C. J. Suárez et al., 2006). Los

genes blaAmpC plasmídicos procedentes del cromosoma bacteriano

incluyen a CIT, DHA, ACC, FOX, MOX, EBC, ACT y CMY (Navarro et al.,

2011; C. J. Suárez et al., 2006). Los plásmidos que llevan genes AmpC

pueden acompañarse de genes de resistencia a los aminoglucósidos,

cloranfenicol, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, trimetoprim,

mercurio, así como los genes para otras β-lactamasas tipo BLEE (Jacoby,

2009; Urumova, 2015).

Detección fenotípica de E. coli AmpC

Los métodos fenotípicos utilizados en la detección de cepas de E. coli

productoras de enzimas AmpC plasmídicas suelen ser económicos y

sencillos, pero no en cepas que presentan una AmpC cromosómica

natural o la expresen constitutivamente a un nivel muy basal como en E.

coli. El indicador de mayor utilidad es su resistencia a inhibidores de β-

lactamasas. Los más adecuados por su eficacia, sencillez y bajo costo

son el método sinérgico de doble disco y el de discos combinados con

inhibidores (Navarro et al., 2011).

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Identificación molecular de genes CTX-M, SHV, TEM y CMY

Luego de una identificación fenotípica de cepas BLEE o AmpC, la

identificación final se lleva a cabo por la caracterización molecular de los

genes que confieren resistencia, utilizando la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) (Helmy & Wasfi, 2014; Liebana et al., 2013; Mezger et

al., 2015).

Genes tipo CTX-M

Los genes BLEE más extendidos son aquellos que codifican enzimas

CTX-M. Estos han tenido éxito en la colonización intestinal migrando del

cromosoma de especies del género Kluyveraba a plásmidos de E. coli

(Alós, 2014; Liebana et al., 2013; Smet et al., 2010). Estas enzimas

comprenden cinco subfamilias en las que existe gran variabilidad. Estas

subfamilias comprenden a CTX-M1, CTX-M2, CTX-M8, CTX-M9 y CTX-

M25 (Fica, 2014). En la actualidad 150 variantes han sido identificadas,

las cuales predominan sobre las enzimas TEM y SHV. El nombre CTX-M

se deriva de la actividad preferente de las enzimas para hidrolizar

cefotaxima o ceftriaxona, mientras que el '' M '' se refiere a Munich, ciudad

donde estas enzimas fueron descritas por primera vez. Una de las

propiedades de éstas enzimas es su amplia distribución en varias partes

del mundo a nivel nosocomial y comunitario (Fica, 2014; Rubin & Pitout,

2014).

La colonización intestinal de personas sanas por enterobacterias

productoras de enzimas BLEE tipo CTX-M ha alcanzado niveles de

pandemia en pocos años, se calcula que hay 1.753 millones de personas

colonizadas por bacterias productoras de estas enzimas (Alós, 2014). De

particular importancia son las enzimas CTX-M-14 y CTX-M-15, como

causas importantes en infecciones de las vías urinarias y del torrente

sanguíneo (Rubin & Pitout, 2014). Estas bacterias se han identificado en

zorros, animales de compañía, equinos, aves, cerdos, ganado, codornices

y conejos en muchos países como: Corea, Japón, China, países

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europeos, etc. (Alós, 2014; Blair et al., 2015; Carattoli, 2008; Rubin &

Pitout, 2014; Stefani et al., 2014; Sun et al., 2010; Wasyl, Hasman,

Cavaco, & Aarestrup, 2012; Zheng et al., 2012).

Genes tipo SHV

Estos genes se originan a partir del cromosoma de K. pneumoniae (Smet

et al., 2010). Estas enzimas fueron descritas por primera vez en la década

de 1970 cuando se demostró su capacidad de hidrolizar penicilinas y

cefalosporinas de primera generación. A partir de 1980 se describe su

capacidad de generar resistencia a cefalosporinas de tercera generación.

En la actualidad 182 variantes SHV han sido descritas. Se ha identificado

en aves, caballos, cerdos, perros, alimentos para animales, etc. en

distintos países (Carattoli, 2008; Lazarus, Paterson, Mollinger, & Rogers,

2015; Pouget, Coutinho, Reid-Smith, & Boerlin, 2013; Stefani et al., 2014;

Sun et al., 2010; Wasyl et al., 2012).

Genes tipo TEM

El primer tipo de enzima descrita mediada por un plásmido, la TEM-1, se

aisló en 1965 en Grecia (Atenas) de un paciente llamado Temoneira a

partir de E. coli de un cultivo de sangre (Grover, Sahni, & Bhattacharya,

2013; Paterson & Bonomo, 2005; Shah, Hasan, Ahmed, & Hameed,

2004). Originalmente confería resistencia a penicilinas y cefalosporinas de

primera generación. Las mutantes que han aparecido muestran un mayor

espectro de resistencia. Se han descrito 216 variantes de TEM (Rubin &

Pitout, 2014).

Genes tipo CMY

Entre las enzimas tipo AmpC, CMY representa con mucho la β-lactamasa

más frecuente en la ganadería europea (Laube et al., 2013). CMY-2 es la

enzima con la distribución geográfica más amplia y una causa importante

de la resistencia a β-lactámicos (Smet et al., 2010). Esta enzima se ha

identificado a nivel global, tanto en animales como piensos (Jacoby, 2009;

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Jure et al., 2011; Lazarus et al., 2015; Nilsson, Borjesson, Landén, &

Bengtsson, 2014; Vingopoulou et al., 2014; Wasyl et al., 2012).

La PCR

El diagnóstico de agentes infecciosos suele requerir el uso de

aislamientos bacteriológicos junto a la identificación y sensibilidad a los

antibióticos del agente aislado (Craver, 1988; Fournier, Dubourg, &

Raoult, 2014). La PCR (The polymerase chain reaction) permite este

diagnóstico sin la necesidad de un cultivo (Craver, 1988), pues tiene la

capacidad de replicar de manera automatizada segmentos específicos de

ADN in vitro, creando millones de copias de estas secuencias (Bej,

Mahbubani, & Atlas, 1991; Erlich, 1989). La estrategia de la PCR en la

identificación de marcadores de resistencia es adecuada en la

identificación de genes de resistencia particulares, lo cual permite

instaurar medidas terapéuticas adecuadas (Fournier et al., 2014).

Fundamento

La PCR es una reacción enzimática que amplifica exponencialmente

secuencias específicas de ADN (Tamay de Dios, Ibara, & Velasquillo,

2013). Esta reacción es similar a la que ocurre en una célula cuando se

divide en dos células hijas (Renneberg, 2012). El método consiste en

ciclos automáticos y repetitivos de tres pasos: 1) desnaturalización del

ADN, 2) hibridación del cebador y 3) extensión del cebador por la ADN

polimerasa. Cada uno de estos pasos necesita grados variables de

temperatura (Bej et al., 1991; Renneberg, 2012). Los tres pasos

mencionados constituyen un ciclo que puede durar de 3 a 5 minutos, que

se repite de 20 a 40 veces (Craver, 1988; Erlich, 1989).

Interpretación de los resultados

Si las secuencias de ADN diana han sido amplificadas, y una cantidad

suficiente de ADN está presente en la muestra, este puede detectarse

mediante electroforesis en un gel de agarosa. La electroforesis en gel de

agarosa permite identificar el tamaño de los ácidos nucleicos en base a su

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tamaño y carga eléctrica. El ADN al tener una carga eléctrica neta

negativa, migra a través del gel hacia el polo positivo, (Craver, 1988;

Giovambattista et al., 2007; Karp, 2009; Winn et al., 2013d).

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CAPÍTULO III

METODOLOGIA

Determinación de los métodos a utilizar

Tipo de investigación

El presente estudio fue una investigación observacional y descriptiva.

Diseño de la investigación

Esta investigación empleó un diseño observacional descriptivo, pues se

estudió en un grupo de cepas características de interés, sin manipulación

de las variables. También fue retrospectiva transversal, pues parte de un

banco de cepas clasificadas como BLEE y AmpC de E. coli, sin que se

haga un seguimiento posterior de las mismas (Jaramillo, 2010).

Descripción de la zona de estudio

El trabajo de laboratorio se realizó en los laboratorios de Bacteriología de

la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad

Central del Ecuador y laboratorios de Biología Molecular del Centro

Internacional de Zoonosis (CIZ). Laboratorios ubicados en las calles

Jerónimo Leitón y Gato Sobral, dentro de la ciudadela Universitaria,

cantón Quito, en la provincia Pichincha.

Población

La población objeto de estudio correspondió al banco de cepas BLEE y

AmpC de E. coli, de la FMVZ, proveniente del proyecto: “Estudio de

Prevalencia de Escherichia coli BLEE, Campylobacter spp. y Salmonella

en el tracto gastrointestinal de pollos faenados en camales industriales de

la Provincia de Pichincha”.

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Muestra

Se realizó un muestreo probabilístico aleatorio del banco de cepas BLEE

y AmpC de E. coli de origen aviar, para identificar la presencia o ausencia

de las variables de interés: los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY. En la

Tabla 4 se indica el número total de cepas.

Tabla 4. Número de cepas BLEE y AmpC elegidas para el estudio

Cepas BLEE

Cepas AmpC

212 67 Fuente: Investigación directa

Procedimiento de la investigación

El estudio se realizó en tres etapas: 1) recolección de la información, 2)

procesamiento de las muestras en el laboratorio y 3) procesamiento de la

información obtenida.

Recolección de la información

Los códigos de las cepas tipo BLEE y AmpC, y el grupo de muestreo al

que pertenecieron, se obtuvo a partir de la base de datos del proyecto

anteriormente descrito.

Procesamiento de las muestras en el laboratorio

1. Fase microbiológica

Técnica de aislamiento de E. coli BLEE

Procedimiento de siembra

Las cepas BLEE y AmpC almacenadas en microtubos a -80oC, se

descongelaron.

Se tomó una asada del microtubo y se realizó una dispersión del inóculo

bacteriano en una caja Petri. Esta caja tuvo el medio TBX más Cefotaxime

(TBX+C), selectivo para el crecimiento de cepas de E.coli productoras de

β-lactamasas (Blaak et al., 2015).

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Incubación

Luego de la siembra las muestras se incubaron a 37 grados centígrados

por 24 horas.

Identificación morfológica

Un crecimiento positivo se determinó por la presencia de colonias

brillantes azul-verdosas.

2. Fase molecular

Obtención de ADN

Se seleccionó con un asa dos o tres colonias de cada cepa. Las colonias

se suspendieron y homogenizaron en 300 µl de agua destilada estéril en

tubos Ependorf® de 1.5 ml. Estos tubos se colocaron en gradillas

flotantes, y se sometieron a ebullición durante 20 minutos. De esta

manera se obtuvieron lisados bacterianos con el ADN suspendido en los

tubos, que se almacenaron a -20oC. A partir de estos lisados, se trabajó

en la identificación de los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY. Este

protocolo de trabajo se obtuvo de estudios similares realizados por: O.

Ahmed, Omar, Asghar, & Elhassan, 2013; Izadi, Nasab, Mood, & Meshkat,

2014; Vali et al., 2014.

Procesamiento de la mezcla maestra (mastermix) en la PCR

Los reactivos utilizados para que se lleve a cabo la PRC de los genes de

estudio fueron los siguientes:

1. Template (ADN): Se trabajó con 212 lisados de cepas BLEE y 67

lisados de cepas AmpC. Como control de calidad, debido a

posibles contaminaciones con ADN exógeno, y verificación del

tamaño del amplicón esperado en cada corrida de la PCR se utilizó

dos controles: 1) un control positivo, que corresponde al ADN de

las cepas TIAC. La TIAC 809, 361, 430 y 811 se utilizaron para los

genes CTX-M, SHV, TEM, la y CMY y 2) un control negativo, agua

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ultrapura. El uso de estos controles en reacciones de la PCR se ha

mencionado en estudios anteriores (Bej et al., 1991; Craver, 1988).

2. Primers, para los 4 genes a identificar, se utilizó 4 pares de

primers (Tabla 5)

3. El kit GoTaq® Flexi DNA Polymerase de Promega, que incluye:

GoTaq® Flexi Buffer 5X, MgCl2 Solution, 25mM1, PCR, GoTaq®

DNA Polymerase (5u/µl)

4. Nuclease-Free Water® de Promega

5. Nucleotide Mix®, 10mM de Promega

Las cantidades necesarias de reactivos para una reacción se describen

en la Tabla 6. La mezcla de estos reactivos se colocó en tubos de PCR,

los cuales fueron ubicados en el termociclador con el programa

correspondiente al gen a identificarse.

Tabla 5. Primers utilizados en el estudio

GEN

PRIMERS TAMAÑO

CTX-M Forward CTX-MU1 5'-ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC-3' 600pb

Reverse CTX-MU2 5'-TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG-3'

SHV Forward SHVOS5 5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3' 850pb

Reverse SHVOS6 5'-GATTTGCTGATTTCGCTCGG-3'

TEM Forward TEM front P1 5'-GCGGAACCCCTATTTG-3' 1000pb

Reverse TEM-C-R-ny 5'-ACC AAT GCT TAA TCA GTG AG-3'

CMY Forward Queprev cmy-2 sart 5'-ATGATGAAAAAATCGTTATGCTGC-3' 1000pb

Reverse cmy-group2-R5'GCTTTTCAAGAATGCGCCAGG-3'

Fuente: (Arlet, Rouveau, & Philippon, 1997; Hasman, Mevius, Veldman, Olesen, &

Aarestrup, 2005; Kar et al., 2015; Kruger et al., 2004; Olesen, Hasman, & Aarestrup, 2004; Sharma et al., 2010). Modificado por: El Autor

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Tabla 6. Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de la PCR

Reactivo C. inicial C. final Volumen para una reacción

Agua - - 15,875µl

Template ? ? 1µl

Buffer 5x 1x 5µl

MgCl2 25mM 2mM 2µl

dNTP Mix 10mM 0,2mM 0,5µl

Primer 1 100pmol/µl 1pmol/µl 0,25µl

Primer 2 100pmol/µl 1pmol/µl 0,25µl

Polimerasa 5U/µl 0,025U/µl 0,125µl

Total 25µl

Fuente: Investigación directa

De los 212 lisados provenientes de cepas BLEE, por cada uno se

identificó la presencia de los genes CTX-M, SHV y TEM. Los programas

utilizados para la identificación de estos genes se indican en las tablas 7,

8, 9 respectivamente. En la Tabla 10 se puede observar el programa

utilizado en la identificación del gen CMY.

Tabla 7. Protocolo utilizado en la identificación del gen CTX-M

Programa del termociclador para gen CTX-M

Etapa To Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1

Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35

Hibridación de los primers 62 ° 1min

Extensión de la cadena 72 ° 1min

Elongación final 72 ° 7min 1

Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1

Fuente: Hasman et al., 2005

Modificado por: El Autor

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Tabla 8. Protocolo utilizado en la identificación del gen SHV

Programa del termociclador para gen SHV

Etapa To Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1

Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35

Hibridación de los primers 62 ° 1min

Extensión de la cadena 72 ° 1min

Elongación final 72 ° 7min 1

Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1

Fuente: Arlet et al., 1997 Modificado por: El Autor

Tabla 9. Protocolo utilizado en la identificación del gen TEM

Programa del termociclador para gen TEM

Etapa To Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1

Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35

Hibridación de los primers 53 ° 1min

Extensión de la cadena 72 ° 1min

Elongación final 72 ° 8min 1

Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1

Fuente: O. Ahmed et al., 2013; Olesen et al., 2004; Paterson et al., 2003; Sharma, Sharma, & Ray, 2010 Modificado por: El AutoR

Tabla 10. Protocolo utilizado en la identificación del gen CMY

Programa del termociclador para gen CMY

Etapa To Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1

Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35

Hibridación de los primers 63 ° 1min

Extensión de la cadena 72 ° 1min

Elongación final 72 ° 10min 1

Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1

Fuente: Kruger et al., 2004 Modificado por: El Autor

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Electroforesis

Una vez terminado el programa en el termociclador, las muestras fueron

sometidas a electroforesis. Para que esta se lleve a cabo se necesitó de

los siguientes componentes:

1. Ultra Pure Agarose InvitrogenTM

2. TBE 5 x, CHEM CruzTM

3. SYBER®Safe, DNA gel Stain, InvitrogenTM

4. Bench Top 100bp DNA Ladder de Promega

5. Amplicones a ser identificados

6. Control positivo

7. Control negativo

Técnica de la electroforesis e interpretación de los resultados

En 50ml de TBE a 0,5X, se agregó 0,5g de agarosa (preparación al

1%), esta mezcla se disolvió calentándola en un microondas por 2

minutos.

Una vez realizada la disolución, se agregó 5µl de SYBER®Safe (1µl

por cada 10ml de solución) y se agito la solución hasta

homogenizarla.

La mezcla, se vertió en un molde, se colocaron peines y después

de 20 minutos, se enfrió y se formó un gel.

Una vez enfriado el gel, se retiró los peines, quedando pequeños

pocillos descubiertos. Este gel se colocó en la cámara de

electroforesis. En los pocillos, se colocaron los amplicones a

identificar, los controles y el marcador molecular.

El tiempo de la corrida electroforética fue de 30 minutos, a 100

voltios y 400 miliamperios.

Terminada la electroforesis, el gel se colocó en un sistema digital

de fotodocumentación de geles, sistema que por acción de luz ultra

violeta, permitió visualizar el ADN como bandas. Los fundamentos

de esta técnica se obtuvieron de: Craver, 1988; Giovambattista et

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al., 2007; Karp, 2009; Tamay de Dios et al., 2013; Winn et al.,

2013d.

Procesamiento de la información obtenida

1. Técnica de procesamiento de los datos

Los códigos y resultados de cepas BLEE y AmpC se almacenaron en una

base de datos y se representaron en una tabla bidimensional, cada

columna y fila con un código único con su respectivo resultado. Dicha

tabla se efectuó en una hoja de cálculo de Microsoft Excel ®.

2. Análisis de los datos

Los resultados obtenidos se analizaron porcentualmente en base a los

grupos de muestreo y al total de muestras analizadas. Para el análisis de

los datos se utilizó una hoja de cálculo de Microsoft Excel ®.

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A B

C D

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

Presentación de los resultados

Despues de realizar la PCR se observaron las bandas específicas de

cada gen como se puede visualizar en el Grafico 2.

Gráfico 2. Resultado de una PCR para los genes de estudio. A) CTX-M, B) SHV, C) TEM, D) CMY, Pos. control positivo, NEG. control negativo, bp. bases pareadas Fuente: Investigación directa

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De las 212 cepas BLEE analizadas, el 99% (210) resultaron positivas para

la presencia de al menos uno de los tres genes de estudio (Gráfico 3)

Gráfico 3. Cepas BLEE que presentan al menos uno de los tres genes de estudio Fuente: Investigación directa

De las 212 cepas BLEE analizadas el 90,6% (192) resultaron positivas al

gen CTX-M, 42% (89) positivas a TEM y 10,4% (22) positivas a SHV y.

Estos resultados se muestran en el Gráfico 4.

Gráfico 4. Número de genes CTX-M, SHV y TEM encontrados en las 212 cepas BLEE Fuente: Investigación directa

1%

99%

NEGATIVAS

POSITIVAS

91%

42%

10%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CTX-M TEM SHV

positivas

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40

De los tres genes BLEE analizados 118 cepas (55,7%) presentaron un

solo gen, 88 (41,5%) presentaron dos genes, 3 (1,4%) presentaron los

tres genes y 3 (1,4%) no presentaron resultados positivos (Gráfico 5).

Gráfico 5. Número de genes tipo BLEE encontrados en la misma cepa Fuente: Investigación directa

De las 67 cepas con fenotipo AmpC, 61 cepas (91%) resultaron positivas

a la presencia del Gen CMY (Gráfico 6).

Gráfico 6. Cepas AmpC que presentan el gen CMY Fuente: Investigación directa

56%42%

1% 1%

1 gen

2 genes

3 genes

0 genes

9%

91%

NEGATIVAS

POSITIVAS

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41

Discusión de los resultados

El objetivo del presente estudio fue identificar la presencia de genes de

resistencia a antibióticos β-Lactámicos en 279 cepas de E. coli con

fenotipo BLEE/AmpC, pertenecientes al banco de cepas de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador,

mediante PCR. De las 212 cepas caracterizadas como tipo BLEE, el gen

más prevalente correspondió a CTX-M (90,6%), seguido de TEM (42%) y

SHV (10,4%).

A pesar de que distintos estudios en la industria avícola reportan

prevalencias menores de los genes de resistencia estudiados en esta

investigación, las proporciones de los mismos son similares. Es así que

En Holanda de 22 cepas de E. coli, CTX-M fue positivo en el 54,6%, TEM

en el 13,4% y SHV en el 4,6% (Cindy Dierikx, van Essen-Zandbergen,

Veldman, Smith, & Mevius, 2010). Otro estudio realizado en Holanda

encontró que en 49 de estas colonias de bacterias que presentaron

resistencia hacia los β-lactámicos, el gen CTX-M se logró identificar en el

63,3% de las cepas y TEM en el 2% (Patricia M.C. Huijbers et al., 2015).

En Francia de 301 cepas se identificó la presencia de CTX-M en el 69,1%

y TEM en el 14% (Baron et al., 2014). En Bélgica de 51 cepas, el 43,14%

fueron positivas a CTX-M y el 15,7% a TEM (Smet et al., 2008). En Suecia

se investigó la presencia de E. coli BLEE/AmpC en la carne de pollo y se

identificó CTX-M en el 9,1% y TEM en el 4,6% (Borjesson, Egervarn,

Lindblad, & Englund, 2013). La falta de reportes de genes SHV en estos

estudios puede atribuirse al pequeño número de muestras analizadas. Sin

embargo, todos estos estudios indican que la prevalencia de CTX-M es la

más alta, seguido de TEM y SHV, en concordancia a los resultados

obtenidos en la presente investigación.

A diferencia de los resultados expuestos, varios estudios en Europa y Asia

han reportado que el segundo gen más prevalente en E. coli aislado en la

industria avícola fue SHV. Así en Japón, España, Alemania y Holanda, se

han reportado prevalencias de SHV en el 14%, 11%, 47% y 29% de

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42

muestras respectivamente (Blaak et al., 2015; Blanc et al., 2006; Cortes et

al., 2010; Hiki et al., 2013; P. M. C. Huijbers et al., 2014; Reich,

Atanassova, & Klein, 2013).

Otras investigaciones han reportado que TEM es el gen más prevalente

en este tipo de muestras. Por ejemplo, en Portugal, Alemania, Rumania,

Holanda y Egipto se han reportado prevalencias del 48,2%, 53,6%,

43,3%, 37,16% y 50% de TEM respectivamente. (A. M. Ahmed,

Shimamoto, & Shimamoto, 2013; Blaak et al., 2014; C. Dierikx et al., 2013;

Cindy M. Dierikx, van der Goot, Smith, Kant, & Mevius, 2013; Laube et al.,

2013; Laube, Friese, von Salviati, Guerra, & Rösler, 2014; Maciuca et al.,

2015; Silva et al., 2012).

Las diferencias encontradas en las prevalencias de SHV y TEM en estos

estudios pueden ser atribuidas a factores geográficos, biológicos o

ambientales (Cindy M. Dierikx et al., 2013; Patricia M.C. Huijbers et al.,

2015).

En cuanto a las combinaciones de genes tipo BLEE encontradas en el

presente estudio, el 55,7% de las cepas presento un solo gen, el 41,5%

dos genes y el 1,4% tres genes. En concordancia con nuestros

resultados, estudios en España y Holanda han demostrado que la mayor

parte de cepas analizadas de E. coli BLEE presentaron un solo gen

codificante de β-lactamasas (Blanc et al., 2006; P. M. C. Huijbers et al.,

2014). Además, otras investigaciones han reportado la presencia de hasta

tres genes de resistencia en E. coli aislados de la industria avícola (Laube

et al., 2013; Maciuca et al., 2015; Reich et al., 2013).

Estos hallazgos demuestran la importancia de cepas de E. coli

productoras de BLEE en la medicina veterinaria, pues son una causa de

preocupación para la salud pública. Los genes de resistencia en estas

cepas son fácilmente transferibles entre bacterias, lo cual puede provocar

que los mismos se transfieran a bacterias potencialmente patógenas para

el ser humano (Andersson & Hughes, 2014; Endimiani et al., 2012; Koga

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43

et al., 2015; Laxminarayan et al., 2013; Mo et al., 2014; Ojer-Usoz et al.,

2013).

Por último, se ha reportado que la frecuencia del gen CMY en cepas

BLEE/AmpC de E. coli en muestras procedentes de la industria avícola,

varía de acuerdo al país. Así, en países europeos, CMY se ha reportado

con prevalencias que van del 12% al 86% (Baron et al., 2014; Blanc et al.,

2006; C. Dierikx et al., 2013; Cindy M. Dierikx et al., 2013; Cindy Dierikx et

al., 2010; P. M. C. Huijbers et al., 2014; Patricia M.C. Huijbers et al., 2015;

Laube et al., 2013, 2014; Maciuca et al., 2015; Reich et al., 2013; Smet et

al., 2008). Mientras que en Egipto y Japón se ha reportado prevalencias

del 15 % y 68% respectivamente (A. M. Ahmed et al., 2013; Hiki et al.,

2013; Kameyama et al., 2013).

La mayoría de estos estudios tienen una prevalencia menor de CMY a la

reportada en la presente investigación. Esto puede ser atribuido a que

dichas investigaciones determinan la presencia en cepas BLEE/AmpC de

E. coli, mientras que el presente estudio parte de cepas fenotípicamente

confirmadas como AmpC en las cuales se esperaría que la prevalencia

de genes AmpC sea Mayor.

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44

CAPITULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones

La prevalencia del gen CTX-M es elevada en comparación a los

genes TEM y SHV en las cepas BLEE de origen aviar.

La prevalencia del gen CMY es dominante en las cepas AmpC

analizadas.

La prevalencia de los genes identificados, refleja la variedad de β-

lactamasas presentes en la industria avícola ecuatoriana, lo que

podrían tener un impacto en la salud pública de los consumidores

de carne de pollo.

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45

Recomendaciones

Realizar una subtipificación de la familia de los genes CTX-M

encontrados en el presente estudio.

Identificar otros genes de importancia epidemiológica en las cepas

BLEE y AmpC negativas a los primers utilizados en esta

investigación.

Ejecutar estudios moleculares longitudinales desde las granjas

avícolas hasta los productos terminados, para determinar la

epidemiologia de estos genes en la cadena alimenticia.

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