UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · ISO/TR International Organization for...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

INSTITUTO SUPERIOR DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas

de espectro extendido (BLEE) en granjas avícolas de reproductoras pesadas en las

provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la obtención del título de

Magíster en Producción y Sanidad Avícola

AUTOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila

TUTOR: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos Ph.D.

Quito, 2018

ii

© DERECHOS DEL AUTOR

Yo, RODRIGO DAVID EGAS DAVILA, en calidad de autor del trabajo de titulación

“Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas


provincias de Napo y Pastaza, Ecuador”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador

hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta

obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su

reglamento.

Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización

y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

En la ciudad de Quito a los 19 días del mes de Octubre de 2018.

_______________________________

Rodrigo David Egas Dávila

C.I. 1715810857

[email protected]

mailto:[email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, Christian Vinicio Vinueza Burgos, en calidad de tutor del trabajo de titulación,

modalidad proyecto de investigación, para la obtención del Título de Magister en

Producción y Sanidad avícola, elaborado por el estudiante RODRIGO DAVID EGAS

DAVILA, del programa de posgrado Maestría en Sanidad Avícola, de la facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, considero que

el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios para ser sometido a la evaluación por

parte del jurado examinador que se asigne, por lo que APRUEBO, a fin de que el trabajo

sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad

Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de Octubre de 2018.

_____________________________

Christian Vinicio Vinueza Burgos Ph.D.

C.I. 1713266227

iv

APROBACION DEL TRIBUNAL

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas


provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

El tribunal constituido por:

Marco Cisneros, Presidente; María Belén Cevallos, Vocal Principal; Freddy Proaño, Vocal

Suplente y Christian Vinueza, Tutor.

Luego de receptar el Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la

obtención del Título de Magíster en Producción y Sanidad Avícola, presentado por el Sr.

Rodrigo David Egas Dávila, MVZ con el título de “Aislamiento e identificación de

Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)

en granjas avícolas de reproductoras pesadas en las provincias de Napo y Pastaza,

Ecuador”.

Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO

En la ciudad de Quito, a los cuatro días del mes de diciembre de 2018.

Para la constancia de lo actuado firman:

Dr. Marco Cisneros Presidente ___________________

Dra. María Belén Cevallos Vocal Principal ___________________

Dr. Freddy Proaño Vocal Suplente ___________________

Dr. Christian Vinueza Tutor ___________________

v

DEDICATORIA

A mis padres por ser mi ejemplo de esfuerzo, honestidad y profesionalismo

A la memoria de mi querida abuelita Zoily †

Dr. Rodrigo Egas Dávila

RED

vi

AGRADECIMIENTOS

Expreso mis más sinceros agradecimientos a:

Al Dr. Christian Vinueza, Ph.D. Director e Investigador de la Unidad de Investigación de

Enfermedades Transmitidas por Alimentos y Resistencia a los Antimicrobianos

(UNIETAR) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central

del Ecuador, por su acertada dirección en la realización de esta tesis.

A la empresa AVITALSA, en nombre de su gerente Dr. Manuel Acosta, por toda la ayuda

prestada para la realización de esta investigación.

Al Dr. Guillermo Tamayo y todo el personal técnico y operativo perteneciente a

ORIAVESA, por la colaboración entregada para esta tesis.

Al Sr. José Luis Medina, MVZ y la Srta. Sofía de Janón, MVZ, por su colaboración en el

área de laboratorio, así como a todas las personas que forman el equipo de trabajo de

UNIETAR.

vii

TABLA DE CONTENIDO

pág.

© DERECHOS DEL AUTOR ------------------------------------------------------------------------------ ii

APROBACIÓN DEL TUTOR ----------------------------------------------------------------------------- iii

DEDICATORIA ------------------------------------------------------------------------------------------------v

AGRADECIMIENTOS -------------------------------------------------------------------------------------- vi

APROBACION DEL TRIBUNAL ------------------------------------------------------------------------- iv

TABLA DE CONTENIDO --------------------------------------------------------------------------------- vii

LISTA DE TABLAS -------------------------------------------------------------------------------------------x

LISTA DE FIGURAS ---------------------------------------------------------------------------------------- xi

LISTA DE ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------- xii

LISTA DE ABREVIATURAS ---------------------------------------------------------------------------- xiii

RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------------------- xv

ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------- xvi

1. INTRODUCCION ----------------------------------------------------------------------------------------- 1

2. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------------------- 2

2.1 GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------- 2

2.2 ESPECIFICOS --------------------------------------------------------------------------------------- 2

3. MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 3

3.1 Salmonella --------------------------------------------------------------------------------------------- 3

3.1.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Salmonella ------------------------ 3

3.1.2 Características generales -------------------------------------------------------------------- 4

3.1.3 Epidemiología ----------------------------------------------------------------------------------- 5

3.1.4 Aspectos de Salud Pública ------------------------------------------------------------------ 5

3.1.5 Diagnóstico de laboratorio ------------------------------------------------------------------- 9

viii

3.1.6 Aislamiento e Identificación ------------------------------------------------------------------ 9

3.2 Escherichia coli -------------------------------------------------------------------------------------- 10

3.2.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Escherichia ---------------------- 10

3.2.2 Características generales ------------------------------------------------------------------- 10

3.2.3 Epidemiología ---------------------------------------------------------------------------------- 11

3.2.4 Aspectos de Salud Pública ----------------------------------------------------------------- 12

3.2.5 Diagnóstico de laboratorio ------------------------------------------------------------------ 13

3.2.6 Aislamiento e Identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC --------------------- 13

3.3 Resistencia a los antibióticos -------------------------------------------------------------------- 14

3.3.1 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos ------------------------------------ 15

3.3.2 β – lactamasas --------------------------------------------------------------------------------- 19

3.3.2.1 Clasificación β - lactamasas ----------------------------------------------------------- 20

3.3.2.2 Tipos de β – lactamasas de espectro extendido de mayor importancia --- 22

3.3.2.3 Enzimas AmpC --------------------------------------------------------------------------- 23

3.4 Pruebas de resistencia antimicrobiana ------------------------------------------------------- 24

4 MATERIALES Y METODOS -------------------------------------------------------------------------- 26

4.1 Descripción de la zona de estudio ------------------------------------------------------------- 26

4.2 Diseño de estudio----------------------------------------------------------------------------------- 26

4.3 Procedimientos de laboratorio ------------------------------------------------------------------ 27

4.3.1 Aislamiento e identificación de Salmonella --------------------------------------------- 27

4.3.2 Serotipificación para Salmonella ---------------------------------------------------------- 28

4.3.3 Antibiograma Salmonella -------------------------------------------------------------------- 28

4.3.4 Aislamiento e identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC --------------------- 30

4.3.5 PCR para detección de genes: blaCTX-M, blaSHV, blaTEM y blaCMY en Salmonella

y E. coli BLEE/AmpC --------------------------------------------------------------------------------- 31

ix

4.4 Técnicas de procesamiento y análisis de datos -------------------------------------------- 32

4.5 Análisis Estadístico --------------------------------------------------------------------------------- 32

5 RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------------------------- 33

5.1 Salmonella -------------------------------------------------------------------------------------------- 33

5.1.1 Resultados aislamiento Salmonella ------------------------------------------------------ 33

5.1.2 Serotipos del género Salmonella ---------------------------------------------------------- 33

5.2 Escherichia coli -------------------------------------------------------------------------------------- 37

5.2.1 Resultados aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC ------------------------------ 37

5.2.2 Resistencia genotípica cepas Escherichia coli BLEE/AmpC ---------------------- 38

6 DISCUSION ----------------------------------------------------------------------------------------------- 40

7 CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------------------------------------- 43

8 RECOMENDACIONES --------------------------------------------------------------------------------- 44

BIBLIOGRAFIA ---------------------------------------------------------------------------------------------- 45

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 60

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1: Clasificación taxonómica de Salmonella ........................................................... 3

Tabla 2: Clasificación de especies y subespecies de Salmonella ................................... 4

Tabla 3: Clasificación serogrupos y serotipos a investigar de Salmonella ...................... 4

Tabla 4: Clasificación taxonómica de Escherichia coli .................................................. 10

Tabla 5: Familias de antibióticos y mecanismo de acción ............................................ 15

Tabla 6: Esquemas clasificación β-lactamasas ............................................................ 22

Tabla 7: Lista de Antibióticos usados y tabla de interpretación..................................... 29

Tabla 8: Secuencias primers para prueba PCR genes de resistencia blaCTX-M, blaTEM,

blaSHV, blaCMY, temperatura hibridación, tamaño amplicón, controles positivos, fuente . 31

Tabla 9: Resultados del aislamiento Salmonella en granjas ......................................... 33

Tabla 10: Resultados serotipificación somática y flagelar aislados de Salmonella ....... 34

Tabla 11: Patrones de resistencia antibiótica y genes de resistencia en aislados de

Salmonella ..................................................................................................................... 35

Tabla 12: Aislados de Salmonella resistentes a cada antibiótico utilizado en la

investigación .................................................................................................................. 37

Tabla 13: Resultados muestras para aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC en

granjas ........................................................................................................................... 38

Tabla 14: Tasas y número de genes de los grupos blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY en

aislados de E. coli BLEE/AmpC, detectados mediante prueba de PCR ........................ 38

Tabla 15: Tasas de combinaciones de genes de resistencia encontradas en aislados de

E. coli BLEE/AmpC ........................................................................................................ 39

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismos de resistencia bacteriana .......................................................... 17

Figura 2: Mecanismos de difusión genética de resistencia bacteriana ......................... 19

Figura 3: Antibiograma cepa Salmonella ...................................................................... 29

Figura 4: Colonia E. coli BLEE/AmpC en agar Chromocult® ........................................ 30

Figura 5: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de Salmonella ................. 36

Figura 6: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de E. coli BLEE/AmpC .... 39

xii

LISTA DE ANEXOS

Anexo A: Método basado en Norma INEN NTE 1529-15:2009 para aislamiento

Salmonella ..................................................................................................................... 61

Anexo B: Esquema aislamiento Salmonella (Cepas móviles) ...................................... 65

Anexo C: Método para serotipificación de aislados de Salmonella .............................. 66

Anexo D: Flujograma de serotipificación somática (O) para S. Enteritidis, S.

Typhimurium y S. Infantis .............................................................................................. 71

Anexo E: Flujograma de serotipificación flagelar (H) S. Enteritidis, S. Typhimurium y S.

Infantis ........................................................................................................................... 72

Anexo F: Esquema aislamiento E. coli ......................................................................... 73

Anexo G: Hoja de registro de toma y envío de muestras en granja ............................. 75

Anexo H: Método PCR simple para detección de genes β – lactámicos ...................... 76

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

µg microgramos

ADN Acido Desoxirribonucleico

ATCC American Type Culture Collection

BLEE Beta Lactámicos de Espectro Extendido

BPW Buffered Peptone Water

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CLSI Clinical & Laboratory Standards Institute

CMI Concentración Mínima Inhibitoria

CONAVE Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador

ECDC European Centre for Disease Prevention and Control

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EFSA European Food Safety Authority

ESBL Extended Spectrum β - Lactamases

ESCMID European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases

ETA Enfermedades Transmitidas por Alimentos

ISO/TR International Organization for Standardization

LIA Lysine Iron Agar

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Light

MSP Ministerio de Salud Pública

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NTE INEN Norma Técnica Ecuatoriana Instituto Ecuatoriano de Normalización

xiv

OIE Organización Internacional de Epizootias

Pb Pares bases

PCR Polymerase Chain Reaction

RAM Resistencia a los Antimicrobianos

RPM Revoluciones por minuto

SNT Salmonella No Tifoidea

TBE Tris Borate EDTA

TSI Triple Sugar Iron

UE Unión Europea

UFC Unidades Formadoras de Colonias

UNIETAR Unidad de Investigación Enfermedades Transmitidas por Alimentos

XLD Xylose Lysine Deoxycholate

xv

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de

β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en granjas avícolas de reproductoras

pesadas en las provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

AUTOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila


RESUMEN

El objetivo del presente trabajo de investigación fue el de aislar Escherichia coli BLEE/AmpC

y S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis en muestras obtenidas de granjas de reproductoras

pesadas. Para esto, se utilizaron hisopos de barrido en los galpones de crianza y producción.

También se estudió la resistencia fenotípica de los aislados de Salmonella y se identificó los

genes de resistencia a antibióticos beta lactámicos en las dos bacterias.

Salmonella se identificó en el 15,3% (n = 22/144) de las muestras. El único serotipo identificado

fue S. Infantis (n = 5). Los aislados de S. Infantis prestan resistencia fenotípica a 5 o más

antimicrobianos. Se identificaron genes de resistencia en el 40,9% (n = 9/22) de los aislados de

Salmonella. En todos los casos de S. Infantis se detectó el gen blaCTX-M. El gen blaCMY fue

identificado en los 4 productos de Salmonella del grupo B.

E. coli BLEE / AmpC se identificó en el 78,5% (n = 113/144) de las muestras. Se identificaron

genes de resistencia en el 97,1% (n = 33/34) de los aislados. Se detectó 1 solo gen en el 76,5%

(n = 26/34), 2 genes en el 17,6% (n = 6/34) y 3 genes en el 2,9% (n = 1/34) de las muestras. El

gen blaCMY estuvo en el 65,4% (n = 17/26), blaCTX-M en el 30,8% (n = 8/26), blaSHV en el 3,8% (n =

1/26) mientras que blaTEM no fue identificado.

En conclusión, este estudio demuestra que los patrones de resistencia a los antibióticos se

encuentran presentes en las bacterias de granjas avícolas de reproductoras pesadas. Futuras

investigaciones dilucidarán la importancia epidemiológica de estos hallazgos.

PALABRAS CLAVES: β-LACTAMASAS / BLEE / REPRODUCTORAS PESADAS / NAPO /

PASTAZA

xvi

Isolation and identification of Salmonella and Escherichia coli producer of

extended-spectrum β-lactamases (ESBL) in poultry farms of broiler breeders in the

provinces of Napo and Pastaza, Ecuador.

AUTHOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila


ABSTRACT

The objective of this research was to isolate Escherichia coli BLEE / AmpC and S. Enteritidis,

S. Typhimurium and S. Infantis in samples obtained from farms of broiler breeders. For this, boot

swabs were used in the breeding and production sheds. The phenotypic resistance of the

Salmonella isolates was also studied, and the beta-lactam antibiotic resistance genes were

identified in the two bacteria.

Salmonella was identified in 15.3% (n = 22/144) of the samples. The only serotype identified was

S. Infantis (n = 5). Isolates of S. Infantis had phenotypic resistance to 5 or more antimicrobials.

Resistance genes were identified in 40.9% (n = 9) of the Salmonella isolates. In all cases of S.

Infantis, the blaCTX-M gene was detected. The blaCMY gene was identified in the 4 Salmonella

products of group B.

E. coli ESBL / AmpC was identified in 78.5% (n = 113/144) of the samples. Resistance genes

were identified in 97.1% (n = 33/34) of the isolates. A single gene was detected in 76.5% (n =

26/34), 2 genes in 17.6% (n = 6/34) and 3 genes in 2.9% (n = 1/34) of isolates. The blaCMY gene

was identified in 65.4% (n = 17/26), blaCTX-M in 30.8% (n = 8/26), blaSHV in 3.8% (n = 1/26)

meanwhile blaTEM was not identified.

In conclusion, this study demonstrates that antibiotic resistance patterns are present in the

bacteria of poultry farms of broiler breeders. Future research will elucidate the epidemiological

importance of these findings

KEYWORDS: β-LACTAMASES / ESBL / BROILER BREEDERS / NAPO / PASTAZA

1

1. INTRODUCCION

Salmonella enterica no tifoidea y Escherichia coli son miembros de la familia Enterobacteriaceae

en su mayoría actúan como comensales en el tracto gastrointestinal de animales (Shahada et al.,

2013). La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por

microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori) (OIE, 2008).

La salmonelosis tiene distribución mundial y se considera un importante problema de salud

pública (Herrera & Jabib, 2015). Una proporción de serovares de Salmonella entérica consisten

en patógenos zoonóticos que causan enfermedades transmitidas por alimentos en humanos, a

pesar de que cepas de E. coli actúan como flora normal en el tracto intestinal de animales y

humanos, algunos son importantes patógenos intestinales y extra intestinales (Shahada et al.,

2013).

El género Salmonella especie enterica subespecie enterica presenta más de 2500 serovares

diferentes, algunos con una gran virulencia y resistencia a los antibióticos (Gómez Vega, 2013;

Gil-Setas et al., 2002; Widén et al., 2013).

La infección debida a serovariedades no tíficas de Salmonella representa un problema de salud

pública nacional e internacional, que se ha agudizado con la apertura económica y la

globalización, debido a que el consumo de carne de pollo, huevos y subproductos se ha

incrementado en todo el mundo y existe sustancialmente un mayor riesgo de infección (Uribe &

Suárez, 2006).

Las aves de corral son por mucho el vehículo principal de estos patógenos en la cadena

alimentaria (Vinueza-Burgos et al., 2016). Los productos avícolas son importantes vehículos en

la transmisión y han sido incriminados en varios brotes de Salmonella (Chuma et al., 2013).

En muchos países se ha encontrado una alta proporción de cepas de Salmonella con resistencia

múltiple a los antibióticos (Buitrago et al., 2006; Uribe & Suárez, 2006). Existen preocupaciones

acerca de Salmonella y su resistencia debido a información obtenida a través de diferentes

estudios, siendo S. Typhimurium la serovariedad más conocida como multiresistente aislada de

diferentes animales domésticos (Sonali Rivera Corona et al., 2012).

Las bacterias resistentes pueden causar enfermedades en humanos o transmitir sus genes de

resistencia a las bacterias patógenas (Vinueza-Burgos et al., 2016).

2

En Ecuador, los esfuerzos han estado enfocados en controlar S. Enteritidis y S. Typhimurium en

aves de corral debido a problemas de salud pública (Cushicóndor, 2017). El serovar Infantis fue

el más constante y frecuente a lo largo de la línea de crianza (Villagómez Estrada, 2015;

Villagómez Estrada, Logacho Pilataxi, & Vinueza Burgos, 2017).

En todo el mundo, el uso de antibióticos en las prácticas de crianza es una preocupación

importante ya que esto puede promover el desarrollo de bacterias resistentes a múltiples

fármacos. Los antibióticos en los sistemas de producción avícola son ampliamente utilizados para

prevenir, controlar y tratar las infecciones bacterianas, así como promotores del crecimiento

(Seiffert et al., 2013; Villagómez Estrada, 2015)

La información obtenida en este estudio será valiosa para mejorar los controles sanitarios

implementados contra E. coli y Salmonella, conocer sí existen los serotipos que se buscan y

poder tomar medidas concretas para controlarlos; así mismo permitirá una mejor vigilancia y uso

adecuado de las drogas para tratamientos antibióticos en las parvadas de reproductoras pesadas.

2. OBJETIVOS

2.1 GENERAL

Determinar la presencia de Salmonella y Escherichia coli BLEE/AmpC en granjas de

reproductoras pesadas en las provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

2.2 ESPECIFICOS

Aislar Salmonella, en granjas de aves reproductoras pesadas en las provincias de Napo y

Pastaza, Ecuador basándonos en el método de la norma INEN NTE 1529-15:2009.

Aislar Escherichia coli BLEE/AmpC en granjas de aves reproductoras pesadas en las provincias

de Napo y Pastaza, Ecuador basado en el método de la norma ISO 16649-1:2001.

Tipificar los fenotipos de Salmonella y Escherichia coli BLEE/AmpC resistentes a antibióticos,

mediante la técnica de difusión de disco Kirby Bauer y por medio de PCR para detección de genes

de resistencia.

3

3. MARCO TEORICO

3.1 Salmonella

3.1.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Salmonella

En el siglo XIX el agente causal de la fiebre tifoidea fue identificado y se lo llegó a conocer

eventualmente como Salmonella, la cual debe su nombre a David Elmer Salmon, médico

veterinario que dirigía los estudios que en 1884 llevaron a su descubrimiento (Delgado

Fernández, 2015). Salmon y Smith realizaron el primer aislamiento de Bacillus cholera-suis, ahora

llamada Salmonella enterica (S. enterica) subespecie enterica serovar choleraesuis de un cerdo

diagnosticado con cólera, mientras Smith fue el primero en identificar realmente al organismo, a

Salmon se le atribuyó su descubrimiento y terminó llevando su nombre (Cosby et al., 2015; Rivera

Calderón et al., 2012).

Tabla 1: Clasificación taxonómica de Salmonella

Dominio BACTERIA

Filo Proteobacteria

Clase Gammaproteobacteria

Orden Enterobacteriales

Familia Enterobacteriaceae

Género Salmonella

Fuente: OIE, 2008; Rivera Calderón et al., 2012;

Delgado Fernández, 2015

De acuerdo con la nomenclatura actual, que refleja avances recientes en la taxonomía, el género

Salmonella incluye solo 2 especies importantes: S. enterica y S. bongori. Un sistema de

clasificación taxonómica que divide a S. enterica en seis subespecies: I enterica, II salamae, IIIa

arizonae, IIIb diarizonae, IV houtenae, VI indica (Rivera Calderón et al., 2012). Se ha propuesto

una tercera especie S. subterranea, tras el aislamiento de una única cepa ambiental poco usual

(OIE, 2008; Delgado Fernández, 2015).

4

Tabla 2: Clasificación de especies y subespecies de Salmonella

Especie Subespecie

Salmonella enterica enterica (I)

salamae (II)

arizonae (IIIa)

diarizonae (IIIb)

houtenae (IV)

indica (IV)

Salmonella bongori

Salmonella subterranea

Fuente: Uribe & Suárez, 2006; OIE, 2008;

Delgado Fernández, 2015, Villagómez Estrada, 2015

3.1.2 Características generales

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae (Barreto et al., 2016). Son un

grupo diverso de bacterias Gram negativas, de 2-5µm de longitud y 0.7-1.5µm de diámetro,

aerobios y anaerobios facultativos, que pueden ser móviles o inmóviles, no forman esporas, con

flagelos perítricos, exceptuando Salmonella Gallinarum (Gómez Vega, 2013). En las cepas

móviles hay que tener en cuenta las implicaciones que poseen en salud pública (Mantilla et al.,

2010).

Reducen nitratos a nitritos, son negativos a pruebas de indol, ureasa y oxidasa, su temperatura

óptima de crecimiento es de 35°C - 40°C dependiendo del serotipo y la matriz usada para su

aislamiento; no se desarrolla bien a bajas temperaturas, el congelamiento no la destruye, resiste

la deshidratación. Los serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica, son

antigénicamente diferenciados por reacciones de aglutinación, el esquema de Kauffman-White

es usado para asignar el serotipo, los antígenos presentes en la superficie bacteriana incluyen

los somáticos (O), antígenos flagelares (H) y capsulares (Vi) (Cosby et al., 2015).

Tabla 3: Clasificación serogrupos y serotipos a investigar de Salmonella

Especie Subespecie Serogrupo Serotipo

Salmonella enterica enterica (I) B Typhimurium C Infantis D Enteritidis

Fuente: Difco, 2012

5

3.1.3 Epidemiología

La Salmonella habita en el tracto intestinal de los animales, mamíferos, aves y reptiles, incluso el

hombre (Herrera & Jabib, 2015). La capacidad de las cepas de Salmonella adaptadas al

hospedador para provocar una colonización o infección persistente es fundamental para la

transmisión, pues estos pacientes o animales actúan como reservorios de la bacteria (Seiffert et

al., 2013).

Alrededor del mundo, la producción y distribución a gran escala de alimentos disemina los

patógenos, esto sumado a la resistencia generada a las drogas antibióticas, provoca nuevos

desafíos para controlar y prevenir la infección por Salmonella (Majowicz et al., 2010).

Salmonella enterica como patógeno zoonótico, puede pasar rápidamente de animales a humanos

a través del consumo de carne contaminada, productos animales y otros productos alimenticios,

contaminados con material fecal animal, mismo que contamina agua y alimento por ende

contribuye a la diseminación de Salmonella en el ambiente (Cosby et al., 2015).

Cerca del 75% de los patógenos emergentes son zoonóticos. La principal estrategia para el

control de las enfermedades infecciosas zoonóticas debe incluir la limpieza de la cadena de

producción desde la parte superior en el caso de enfermedades de transmisión vertical como

salmonelosis, medidas de higiene en toda la cadena de producción, vacunación, tratamiento y

programas de educación y erradicación (Hafez, 2014).

En reproductoras pesadas los serovares de mayor importancia y para los cuales existen

programas de vigilancia dentro de la UE son: S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow

y S. Hadar (EFSA & ECDC, 2017).

En el Ecuador, la carne de pollo es la mayor fuente de proteína animal para la población, con un

consumo promedio per cápita de 35 kg por habitante por año (CONAVE, 2013); mediante un

estudio llevado a cabo en broilers donde se muestrearon 388 lotes provenientes de 120 granjas

durante 1 año, se aisló Salmonella en el 16% de los lotes y el serotipo S. Infantis fue el

mayormente encontrado con un 84% (Vinueza & De Zutter, 2017).

3.1.4 Aspectos de Salud Pública

La salmonelosis es una de las ETA, que con más frecuencia se notifican a nivel mundial (Majowicz

et al, 2014; Sonali Rivera Corona et al., 2012). Es una de las dos enfermedades más importantes

6

y que con mayor periodicidad se transmiten de las aves a los seres humanos, rara vez causa

enfermedad en aves y en personas infectadas provoca cuadros de diarrea (Hafez, 2014).

Existen muchas especies animales que presentan este microorganismo en el intestino,

manifestando la enfermedad o manteniéndose como portadores sanos eliminando la bacteria a

través de las heces fecales, a estos patógenos se los denomina Salmonella no tifoidea, que

incluyen S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis (Guerrero Ibarra, 2017).

Las serovariedades no tifoideas de Salmonella enterica (Salmonella), son la causa principal de

ETA a nivel mundial (Chuma et al., 2013).

La cualidad de las especies de Salmonella para causar infección en los seres humanos está dada

por la capacidad de adherencia y colonización a las células epiteliales intestinales y a otras

especializadas que recubren las placas de Peyer (Cosby et al., 2015). Se trata de una potencial

infección zoonótica asociada a gastroenteritis, siendo un problema de salud pública en países

desarrollados y en vías de desarrollo (Majowicz et al., 2010; Trung et al., 2017).

El 99% de los serovares responsables por las infecciones en el hombre y animales de sangre

caliente son miembros de la subespecie enterica (I) (Sonali Rivera Corona et al., 2012). Una

proporción de los serovares de S. enterica consisten en patógenos zoonóticos que causan

enfermedad alimentaria en humanos (Shahada et al., 2013).

La salmonelosis está entre las zoonosis de mayor prevalencia en países desarrollados, en

Estados Unidos (USA), Canadá, Dinamarca, Inglaterra y Noruega, se han reportado brotes de

salmonelosis principalmente transmitida por alimentos; más del 64% de los casos por

S. Enteritidis en USA, se deben al consumo de huevos contaminados, con alrededor de 200.000

personas enfermas cada año (Rivera Calderón, 2012).

Salvo pocos países a nivel mundial, Salmonella se detecta en casi todas las etapas de la cadena

de producción de alimentos, de los más de 2600 serovares conocidos, solo el 10% se encuentran

en la industria avícola (carne y huevos). Los serovares S. Enteritidis y S. Typhimurium, son de

suma importancia para la salud humana y pueden colonizar el intestino de las aves sin que éstas

presenten síntomas (Velhner et al., 2017).

En USA se estiman 1.3 - 1.4 millones de casos de enfermedad alimentaria debido a salmonelosis

cada año siendo uno de los mayores patógenos causantes de ETA, causando 20.000

hospitalizaciones con un costo aproximado de 14.6 billones de dólares y ocasionando 500

muertes; S. Enteritidis y S. Typhimurium fueron los serotipos mayormente reportados en

7

enfermedad humana, Salmonella Kentucky fue el serotipo más aislado en programas de vigilancia

de carcasas de pollo (Parveen et al., 2007; Cosby et al., 2015).

El creciente aumento de casos de salmonelosis humana también ha sido asociado con frutas y

vegetales contaminados. Tradicionalmente la enfermedad ha sido unida al consumo de alimentos

contaminados de origen animal en especial aves y productos avícolas. La problemática de la

resistencia antimicrobiana y sobre todo la multirresistencia a los antibióticos se ha incrementado

entre numerosos serotipos de Salmonella recuperados de animales y humanos a nivel mundial

(Parveen et al., 2007).

Para el año 2016, los 28 países miembros de la Unión Europea (UE) reportaron 94.530 casos

confirmados de salmonelosis resultando en 128 muertes dando una incidencia de 20.4 casos por

cada 100.000 habitantes, siendo la segunda infección gastrointestinal zoonótica en la UE. Son 5

serovares los mayormente responsables de los casos de Salmonella en humanos: S. Enteritidis,

S. Typhimurium, S. Typhimurium monofásica, S. Infantis y S. Derby (EFSA & ECDC, 2017). Estos

serovares fueron designados por la Comisión Europea como “serovares de importancia para la

salud pública” (Parra et al., 2002; Carrique-Mas & Davies, 2008).

El impacto global en la salud humana por SNT es elevado, con 93.8 millones de casos, de éstos,

80 millones son transmitidos por alimentos y provocan 155.000 muertes cada año (Majowicz et

al., 2010; Ao et al., 2015; Widén et al., 2013; Vinueza-Burgos et al., 2016).

En Brasil, en el periodo 2000 - 2015, según datos del Ministerio de Salud, Salmonella fue

considerada con el mayor agente causal de ETA (Moura et al., 2018).

En el Ecuador se han reportado hasta la semana 35 del año 2018 un total de 1147 casos de

salmonelosis transmitida por agua y alimentos (MSP, 2018). Las aves de corral son el principal

vehículo de estos patógenos en la cadena alimentaria (Vinueza-Burgos et al., 2016)

La enfermedad por SNT es una de las principales causas de enfermedad diarreica a nivel mundial

(Ao et al., 2015), aunque provoca gastroenteritis auto limitada, puede terminar en infecciones

invasivas graves que necesitarán tratamiento adecuado con antibióticos (Moura et al., 2017).

De todas las serovares descritos, solamente un 10% han sido aisladas de aves de corral y de

éstas solo una pequeña proporción de serovariedades han sido encontradas en explotaciones

avícolas S. Enteritidis y S. Typhimurium tienen capacidad de invadir tejidos como el aparato

reproductor de gallina infectando los huevos en formación en el oviducto (Terzolo & Ríos, 2008).

8

La mayoría de casos de SNT en humanos se deben a infección alimentaria o por transmisión

entre personas, incluso por exposición ambiental y ocupacional con animales, incluidos los de

granja, lo cual es más común en naciones que buscan desarrollarse pues una gran cantidad de

habitantes están involucrados en la crianza de ganado y aves, generalmente en instalaciones

poco tecnificadas, con bajo nivel de bioseguridad y protección, lo cual incrementa el contacto

entre humanos y animales (Trung et al., 2017).

En los países miembros de la UE según la Directiva Europea 1003/2005, la ocurrencia de

S. Enteritidis y S. Typhimurium en lotes de reproductoras en edad adulta fue ≤ 1%; sin embargo,

también apuntaron a los serovares S. Hadar, S. Virchow y S. Infantis que son de significancia en

salud pública en la UE (Carrique-Mas & Davies, 2008; Velhner et al., 2017). En Europa el serovar

predominante es S. Enteritidis (59-62%), seguido de S. Typhimurium con el (13-17%) (Parra et

al., 2002; Carrique-Mas & Davies, 2008).

En USA, se reportan 9.4 millones de casos de ETA, así el Centro para el Control y Prevención de

Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés), estima anualmente que de estos casos 1,028

millones (11%), provocan 19.000 hospitalizaciones y 400 muertes por infección con serovares de

SNT; los serotipos de Salmonella mayormente aislados en los programas de vigilancia entre los

años 2007 - 2008 fueron: Salmonella Kentucky, Heidelberg, Typhimurium y Typhimurium (var 5).

Los animales para consumo humano son la fuente primaria de infección por salmonelosis, la

diseminación ocurre por el consumo de aves de corral, carne de res, cerdo, huevos y productos

frescos contaminados con Salmonella viable de las heces animales (Parra et al, 2002; Cosby et

al., 2015; Hsieh et al., 2016).

La proporción de casos de enfermedad humana en la UE debido a S. Infantis, el cuarto serovar

más común en humanos, ha permanecido estable. S. Infantis fue mayormente reportada en

broilers y pavos y ha sido capaz de difundirse masivamente en toda la cadena de producción de

broilers (EFSA & ECDC, 2017).

La UE en 2016 reporta prevalencias de Salmonella en lotes de reproductoras para los serotipos

principalmente obtenidos en programas de vigilancia así: S. Enteritidis (0,32%), S. Typhimurium

(0,16%) y S. Infantis (0,06%). (EFSA & ECDC, 2017).

En Ecuador un estudio en carcasas de pollo a edad de faenamiento, el serotipo con mayor

prevalencia fue Salmonella Infantis (83.9%), S. Enteritidis (14.5%) y S. Corvallis (1.6%) (Vinueza-

Burgos et al., 2016).

9

3.1.5 Diagnóstico de laboratorio

El diagnóstico de Salmonella se puede realizar a partir de muestras ambientales, alimento y

tomando en cuenta que producen septicemia en las aves, en especial en las debilitadas o para

descarte, es conveniente órganos internos, siendo de elección el hígado, vesícula biliar, bazo,

páncreas y contenido cecal; también se puede realizar cultivos de ambiente de granja con hisopos

de arrastre de material fecal de cama. En reproductoras pesadas se puede hacer un pool de

meconio de alrededor de 500 pollitos de diferentes cajas de transporte. (Terzolo & Ríos, 2008;

Widén et al, 2013).

La Comisión de Regulación de la UE en el año 2010, definió la estrategia de muestreo para

detectar Salmonella, en lotes de reproductoras adultas de Gallus gallus y para gallinas ponedoras

en el año 2011, el mismo se debe hacer mientras las aves se encuentren en las instalaciones

avícolas y también luego de la salida de estas. Entre los métodos más convenientes para realizar

dichos muestreos con el objetivo de ejecutar análisis bacteriológicos de instalaciones o galpones

avícolas encaminadas a encontrar Salmonella, está el muestreo con zapatones o el método de

hisopos de arrastre (Buhr et al., 2007; Velhner et al., 2017).

3.1.6 Aislamiento e Identificación

Los métodos de cultivo son los más usados por su alta selectividad y sensibilidad, luego se los

somete a ensayos bioquímicos y serológicos para su identificación definitiva. Las etapas

necesarias para aislamiento e identificación de Salmonella siguen una secuencia que comienza

con el pre enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo, mismo que se utiliza para viabilizar el

crecimiento de la bacteria en el inicio del aislamiento, seguido del enriquecimiento selectivo que

permite la multiplicación de Salmonella pues ésta compite con otras enterobacterias y las inhibe

en gran proporción aunque no totalmente siendo los medios más comunes son: selenite cisteína,

tetrationato, rappaport-vassiliadis, para la siembra o plaqueo los medios más comunes son

MacConkey (MC), Salmonella-Shigella (SS), Hektoen (HE), verde brillante (VB), xilosa lisina

desoxicolato (XLD) (Nascimento et al, 2000; Pérez et al, 2004; Widén et al, 2013).

El método de serotipificación bajo el esquema de Kauffmann White es un valioso complemento

de la identificación bioquímica y tiene una gran utilidad del lado epidemiológico para determinar

prevalencia, fuentes infección y vías transmisión de la enfermedad. Es uno de los métodos de

referencia para la clasificación actual de los serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica

(Wattiau et al., 2011; Villagómez Estrada, 2015; Melo Durán, 2015; Sánchez Chugchilán, 2016;

10

Quintero, 2016; Chumbi, 2017; Cushicóndor, 2017). La serotipificación es esencial para la

identificación de variantes de esta bacteria (Widén et al, 2013).

3.2 Escherichia coli

3.2.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Escherichia

Un pediatra nacido en Alemania en 1857, Theodor Escherich, que tras estudios realizados en el

tracto gastrointestinal de infantes presentó sus conclusiones acerca de la morfología,

propiedades y efectos de las poblaciones bacterianas, entre ellas Bacterium coli commune (bacilo

del colon común, conocido como Escherichia coli) (Narváez Manosalvas, 2015; Pérez, 2015).

El género Escherichia comprende 5 especies; E. blattae; E. coli; E. fergusonii; E. hermanni y E.

vulneris. De las 5 especies solamente E. coli tiene relevancia clínica tanto en el hombre como en

los animales (Villagrán Ramírez, 2017).

Tabla 4: Clasificación taxonómica de Escherichia coli

Dominio Bacteria

Reino Bacteria

Filo Proteobacteria

Clase Gamma Proteobacteria

Orden Eubacteriales

Familia Enterobacteriaceae

Tribu Escherichiae

Género Escherichia

Especie coli

Fuente: Salmerón García, 2007; Pérez, 2015

3.2.2 Características generales

El género Escherichia, y, en concreto, la especie coli, es un bacilo gramnegativo de la familia

Enterobacteriaceae, puede medir entre 1-1.5µm x 2-6µm, estando solos o en pares (Pérez, 2015);

no esporulados, móviles con flagelos perítricos o inmóviles, es aerobia o anaerobia facultativa,

11

capaz de fermentar lactosa y glucosa, con la producción de gases y ácidos diversos (Salmerón

García, 2007; Villagrán Ramírez, 2017).

Esta bacteria crece en medios comunes por ser microorganismo con pocas exigencias nutritivas

(Janón González, 2016). E. coli está formada por cápsula, pared bacteriana, membrana externa,

pili o fimbrias y flagelos (Pérez, 2015).

Se considera que el hábitat “normal” de E. coli es el colon de organismos de sangre caliente (aves

y mamíferos). La mayoría de estos microorganismos son comensales en los seres humanos y

animales y están presentes en el medio ambiente. Algunas cepas de E. coli, son patógenas para

humanos y animales al producir factores de virulencia específicos (Salmerón García, 2007; Abreu

et al., 2013; Narváez Manosalvas, 2015; Janón González, 2016).

La bacteria puede causar enfermedad en animales como las aves, en las cuales se denomina

colibacilosis, cuyo tratamiento puede ser hecho con antibióticos (Farrokhnazar et al., 2016).

Se clasifican en más de 170 serogrupos, según su antígeno somático (O) por las características

antigénicas de su LPS (lipopolisacárido), y en serotipos por la combinación de antígenos O y H

(flagelares). Se han descrito seis patotipos de E. coli productora de diarrea: enterotoxigénica

(ETEC), enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC),

enteroagregativa (EAEC) y de adherencia difusa (ADEC) (Seiffert et al., 2013; Villagrán Ramírez,

2017).

3.2.3 Epidemiología

El principal reservorio de E. coli BLEE/AmpC en humanos es el tracto digestivo, su transmisión

se facilita por contacto a través de las manos así se ha sabido de transmisión plasmídica y

bacteriana de estas enzimas entre personas por contacto directo; ciertos alimentos de origen

animal en especial las aves de corral y en concreto los broilers son fuente de transmisión de

enzimas BLEE al hombre; se ha detectado E. coli BLEE/AmpC en las heces fecales de animales

tanto destinados al consumo, compañía y salvajes (Abreu et al., 2013).

La colibacilosis es una de las más frecuentes ETA, reportándose en todo el mundo y provocando

millones de casos anualmente (Muzo Suquillo, 2017).

La crianza de aves de traspatio que se promueve y consolida como fuente de ingresos

económicos y estrategia de suplementación nutricional en África, Asia y América Latina, facilita

12

el contacto entre humanos y aves transmitiendo así cepas de E. coli resistentes a los antibióticos

(Braykov et al., 2016).

En el 2009, la UE reportó una prevalencia media de aislados de E. coli resistentes a

cefalosporinas de espectro extendido que fue del 8.5% con un rango de 0% para Dinamarca al

26.4% en España, en Suiza en el 2011 la prevalencia fue del 25%. En Asia la prevalencia está

en un rango ente el 8 al 60% (Seiffert et al., 2013).

En seres humanos, diversos investigaciones como la realizada en Tailandia, revelaron la

presencia de E. coli BLEE en 52% (141) personas, no obstante en China y España las cifras son

del 7% y 6,7% respectivamente, en muestras fecales de individuos sanos. En Alemania, se

detectó (211/3344) personas colonizadas con E. coli BLEE (Aguilar-Zapata, 2016).

En México, un estudio realizado en un centro de salud en personas con proceso infeccioso de

vías urinarias concluyó que el 88% de los urocultivos fueron positivos a E. coli y de éstos el 30%

eran causados por cepas BLEE (Aguilar-Zapata, 2016). Otro estudio hospitalario entre los años

2008-2009, reveló que de un total de 1412 aislamientos realizados, 1184 (83.9%) corresponden

a E. coli BLEE (Paredes Gago, 2013).

En Ecuador, entre los años 2005-2009, según datos del departamento de microbiología del

Hospital Vozandes Quito, 35/56 aislamientos de cepas BLEE corresponden a E. coli,

representando un 62.5% (León Astudillo & Pacheco Quito, 2010).

En aves, las infecciones por E. coli, que provocan colibacilosis son transcendentes y lideran las

causas de las cuantiosas pérdidas económicas que se provocan por las elevadas tasas de

morbilidad y mortalidad a nivel mundial así como costos de tratamientos, retraso en crecimiento

de animales y disminución de ganancia de peso, decomisos en plantas de proceso y afectación

de la calidad de carne y huevos, siendo por tanto no aptos para el consumo humano (Ewers et

al., 2004; Giovanardi et al., 2005; Muzo Suquillo, 2017).

3.2.4 Aspectos de Salud Pública

E. coli es responsable de una variedad de infecciones intestinales y extraintestinales, provocando

diarrea, infecciones urinarias y abdominales en seres humanos (Seiffert et al., 2013).

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria en el 2011 reportó 1.93 casos de infección por

cada 100.000 habitantes, cifra que incrementó y que para el 2013 aumentó en un 159,4% con

4000 casos confirmados en relación con el 2011 (Muzo Suquillo, 2017).

13

La detección de E. coli BLEE/AmpC en animales destinados al consumo humano y productos

animales comestibles se ha convertido en una gran preocupación para los consumidores, esto

representa un gran desafío para médicos y veterinarios ya que estas cepas de E. coli BLEE/AmpC

pueden inactivar antibióticos β – lactámicos (Kar et al., 2014).

3.2.5 Diagnóstico de laboratorio

3.2.6 Aislamiento e Identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC

La enumeración de E. coli en alimentos y fuentes medioambientales ha sido extensamente

estudiada y en la última década ha incrementado el uso de sustratos cromogénicos en medios

de cultivo para la identificación de E. coli. El agar Chromocult® es un medio selectivo diferencial

que contiene dos sustratos cromogénicos para la detección de coliformes totales y E. coli, estos

son la β – glucoronidasa o X-GLUC, la cual es específica para el 96% de E. coli y la β -

galactosidasa o Salmon-GAL. E. coli es β – galactosidasa y β – glucoronidasa positiva y las

colonias desarrollan un color azul obscuro o violeta en el agar, además contiene tergitol que inhibe

el crecimiento de bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas (Turner et al., 2000;

González et al., 2003; Muzo Suquillo, 2017).

Existen otros métodos para identificación de microorganismos basados en la proteómica que

estudia y caracteriza las proteínas expresadas en el genoma (proteoma), las técnicas más usadas

se basan en electroforesis y espectrometría de masas, la segunda analiza con gran precisión la

composición de diferentes elementos químicos al permitir la medición de iones derivados de

moléculas categorizándolos en función de su relación masa/carga. La espectrometría de masas

MALDI-TOF, MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – desorción/ionización por láser

asistida por matriz) y TOF por el analizador (Time of flight – tiempo de vuelo), es de gran interés

en microbiología para la identificación bacteriana, su objetivo es determinar género y especie del

microorganismo, existen múltiples kits comerciales que usan sistema MALDI-TOF. Esta es una

prueba rápida, confiable, fiable, barata; pero requiere calibraciones y controles de calidad

frecuentes (Bou et al, 2011).

14

3.3 Resistencia a los antibióticos

Los antibióticos son sustancias fabricadas por diversas especies de microrganismos (bacterias,

hongos) o de forma sintética que inhiben la proliferación o replicación de otros gérmenes

provocando su destrucción (Pérez, 2015; Cruz Marruffo, 2016).

En el año 1929, Alexander Fleming aisló y cultivó el hongo Penicillium que producía una sustancia

que provocaba lisis de un cultivo de estafilococos la cual denominó Penicilina, que se podría

considerar con el primer antibiótico, desde ese tiempo los científicos han descubierto y

desarrollado numerosas clases de antimicrobianos ejerciendo efectos bacteriostáticos y

bactericidas (García Vázquez, 2011; Cosby et al., 2015; Villagrán Ramírez, 2017).

La introducción de los antibióticos en la práctica clínica representó una de las más importantes

intervenciones para el control de las enfermedades infecciosas (Alós, 2015).

Desde su descubrimiento en la llamada “era de los antibióticos” en los años 1950, las drogas

antimicrobianas han sido ampliamente utilizadas en producción animal por los siguientes motivos:

(a) tratamiento de animales enfermos: colibacilosis, cólera aviar e infecciones respiratorios

(b) profilaxis para prevención de infecciones en situaciones específicas de riesgo

(c) promotores de crecimiento para incrementar la tasa de ganancia diaria de peso o eficiencia

alimenticia y así mejorar la producción (Furtula et al., 2010; Seiffert et al., 2013).

El uso de antibióticos en dosis sub terapéuticas se ha incrementado por la alta demanda de

productos de origen animal a nivel mundial. En Asia debido a la bonanza económica que

experimenta; el consumo promedio mundial de antibióticos en animales para consumo humano

fue estimado en el 2010 en 63.151 toneladas; para las aves esto corresponde a un consumo de

antimicrobianos de 0.148 mg por cada kg de carne producida. Se espera un aumento de la

utilización de antibióticos en producción animal del 67% para el 2030. Los mayores consumidores

de antibióticos son Brasil, Rusia, India, China y Sudáfrica, debido a la crianza intensiva donde los

antimicrobianos se usan a dosis sub terapéuticas (Brower et al., 2017).

Los antibióticos β – lactámicos incluyen las penicilinas, cefalosporinas y carbapenems que son

los 3 mayores grupos representantes, los efectos de estas drogas son mediados por la habilidad

de interferir con un grupo de proteínas de enlace o unión a penicilina las cuales están involucradas

en la síntesis de peptidoglucano que compone la pared celular (Cosby et al., 2015).

15

En el año 2006, la UE, prohibió el uso de antibióticos promotores de crecimiento en el alimento

de animales en respuesta a la evidencia que sugiere que los éstos impulsaron el surgimiento y la

diseminación de la resistencia (Brower et al, 2017).

Tabla 5: Familias de antibióticos y mecanismo de acción

Mecanismo de acción Familias antibióticas

Inhibición síntesis de pared celular

Penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactams,

glicopéptidos

Inhibición síntesis de proteínas Tetracilinas, aminoglucósidos,

macrólidos, lincosamidas

Inhibición de síntesis de ADN Fluoroquinolonas

Inhibición competitiva de síntesis de ácido fólico

Sulfonamidas, trimethoprim

Fuente: Marshall, 2004

3.3.1 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos

Se entiende por resistencia a los antimicrobianos (RAM), el mecanismo mediante el cual la

bacteria puede disminuir la acción de los agentes antimicrobianos principalmente por el uso

indiscriminado de los mismos en humanos y producciones animales (Rivera Calderón, 2012);

Otros autores la definen como la capacidad natural o adquirida de las bacterias para evitar la

acción bactericida o bacteriostática de un agente antibacteriano o crecer en presencia de este a

dosis o concentraciones terapéuticas (García Vázquez et al., 2011; Alós, 2015; Janón González,

2016).

La multirresistencia es la capacidad adquirida por los gérmenes contra diferentes agentes

antimicrobianos (Villagrán Ramírez, 2017).

Algunos de los factores importantes para el desarrollo de RAM incluyen: presiones selectivas, la

proliferación de clones bacterianos con multiresistencia y la incapacidad para detectar fenotipos

emergentes. Las presiones selectivas pueden incluir el uso excesivo o incorrecto de los

antibióticos en el tratamiento de enfermedades humanas y animales, así como la supervivencia

16

de bacterias a los tratamientos con antimicrobianos generando cepas resistentes (Cosby et al.,

2015).

La RAM es un problema de salud pública en USA y a nivel mundial que se ha incrementado

dramáticamente y que afecta a diversos ámbitos, tanto en medicina humana, veterinaria,

seguridad alimentaria y ambiental (Abreu et al., 2013; Braykov et al., 2016; Hsieh et al., 2016;

Vergara et al., 2017).

La resistencia a múltiples drogas fue detectada por primera vez entre las enterobacterias (E. coli,

Salmonella) entre los años 1950 – 1960; por ende no es nueva, pero el número de organismos

resistentes, las zonas geográficos afectadas por la resistencia hacia los antibióticos y la amplitud

de resistencia en organismos simples no tienen precedentes. Enfermedades y agentes

etiológicos de las mismas que se pensaban controlados por los antibióticos han regresado con

nuevas categorías de resistencia a estos tratamientos (Marshall, 2004).

Muchos de estos patógenos han obtenido o están obteniendo material genético para

efectivamente bloquear la acción de los antibióticos y algunos de estos microorganismos han

llegado a ser resistentes a múltiples fármacos o tipos de drogas.

Existen 2 vías primarias que la bacteria utiliza para el desarrollo de resistencia antimicrobiana y

son:

a) La natural, intrínseca o espontánea en la cual mutaciones ocurren naturalmente mismas que

pueden ser sustituciones de bases, mutaciones de cambio de marco, delecciones de material

genético o inserciones de elementos de ADN, dando al microorganismo la habilidad de resistir

los efectos letales de un antibiótico.

b) La adquirida en la cual la bacteria capta material genético de otra bacteria (intercambio ADN),

ambas son formas de modificación genética de los microorganismos para sobrevivir.

Los factores de resistencia están en forma de plásmidos, transposones o integrones que se

mueven entre bacterias ya sea a través de conjugación, transformación o transducción (Cosby et

al., 2015) (Figura 1).

17

Figura 1: Mecanismos de resistencia bacteriana


Los bacteriófagos líticos o fagos, son virus que replican al interior de una bacteria y la lisan.

Poseen especificidad hacia cada bacteria, se unen a receptores de superficie, introducen su

genoma en la bacteria para producir muchas nuevas partículas virales que por acción enzimática,

se liberan matando a la bacteria y liberando gran número de fagos, amplificando así el efecto

antibacteriano (Borie et al., 2008). Los bacteriófagos pueden ser un componente natural, no

tóxico, factible y de bajo costo para el control de Salmonella en aves de corral (Fiorentin, Vieira,

& Barioni Jr, 2005).

En infecciones por Salmonella, múltiples investigaciones, demuestran que mediante la

administración de una mezcla de bacteriófagos se obtiene la reducción de la colonización de las

especies Enteritidis y Typhimurium a nivel intestinal en pollos broilers experimentalmente

infectados, disminuyendo con ello la posibilidad de contaminación de sus productos (Toro et al.,

2005; Borie et al., 2008; Ariza Suárez & Naranjo Espinosa, 2017).

18

La RAM en patógenos bacterianos en humanos no existía antes del uso de estas drogas por el

hombre y su prevalencia era baja; con su uso masivo se ha constatado a nivel mundial un

aumento importante en la prevalencia de la resistencia. Además la colonización intestinal de

personas sanas por enterobacterias productoras de BLEE, la mayoría del tipo CTX-M, ha

alcanzado niveles de pandemia, calculando 1753 millones de personas colonizadas a nivel

mundial, así hay una evolución de patógenos importantes a la resistencia y multirresistencia, lo

cual concuerda con el gran uso de antimicrobianos desde hacen 70 años (Alós, 2015).

Los animales son considerados como los reservorios de bacterias gram negativas RAM y su

impacto en la salud humana ha atraído la atención mundial. La masiva e indiscriminada aplicación

de diferentes tipos de drogas antibióticas en el contexto veterinario ha favorecido la selección y

difusión de bacterias gram negativas multirresistentes a los antibióticos, en particular cepas de E.

coli y Salmonella (Parveen et al., 2007; Seiffert et al., 2013; Vergara et al., 2017).

Numerosos estudios sugieren que el uso extendido de antimicrobianos contribuye a incrementar

la RAM y desde que estos son adicionados a las dietas animales las poblaciones bacterianas son

continuamente expuestas a dosis subterapéuticas, lo cual contribuye a la emergencia y difusión

de la resistencia a los antibióticos (Brower et al., 2017).

Se pueden describir algunos mecanismos de resistencia en bacterias:

(a) mutaciones de las dianas de los antibióticos hacia las proteínas de enlace

(b) reducción de la permeabilidad de la pared celular (interrupción de las proteínas - porinas)

c) sistemas o bombas eflujo (expulsión del antibiótico)

d) Inactivación enzimática por la producción de enzimas (cromosómicas y plasmídicas); este

último mecanismo es el más común en las bacterias de la familia Enterobacteriaceae (Drawz &

Bonomo, 2010; García Vázquez et al., 2011; Seiffert et al., 2013) (Figura 2).

19

Figura 2: Mecanismos de difusión genética de resistencia bacteriana


3.3.2 β – lactamasas

La primera β - lactamasa fue identificada en Bacillus (Escherichia coli) antes del uso clínico de la

penicilina, hace más de 70 años Abraham & Chain la describieron como B. coli “penicilinasa”, no

pensaron que ésta sería clínicamente importante desde que la penicilina fue la droga de elección

para el tratamiento contra infecciones por estafilococos y estreptococos, Abraham & Chain no

tuvieron éxito en aislar la enzima de estos organismos gram positivos; 4 años más tarde Kirby

extrajo exitosamente estos inactivadores de la penicilina del Staphylococcus aureus, lo que

auguró el nacimiento de un problema clínico considerable (Bradford, 2001; Salmerón García,

2007; Drawz & Bonomo, 2010).

Las bacterias usan diferentes estrategias para permanecer inmunes a los efectos de los

antibióticos, uno de los más importantes de estos mecanismos usados por las bacterias Gram

negativas contra los antibióticos β - lactámicos es la producción enzimas llamadas β - lactamasas

las cuales hidrolizan y disuelven el enlace amida del anillo β – lactámico característico de 4

miembros de antibióticos β - lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, monobactams y

carbapenems), dando como resultado la inactivación del antibiótico cuando su anillo es roto

20

(Paterson & Bonomo, 2005; Mosquito et al., 2011; Farrokhnazar et al., 2016; Bonomo, 2017;

Pathak et al., 2017).

La producción de β - lactamasas por bacterias gram positivas y negativas es una de las más

significantes amenazas a la eficacia de los antibióticos. La continua evolución de las bacterias

responde a la presión ejercida por el uso de nuevas drogas β – lactámicas; por ello los

microorganismos mutan y adquieren nuevos genes de resistencia (Drawz et al., 2014).

Las β - lactamasas ahora incluyen más de 2000 secuencias únicas de aminoácidos naturales,

siguen siendo la mayor amenaza para el uso de los antibióticos β – lactámicos. Las más

importantes clínicamente son las clases A, BLEE, AmpC y enzimas hidrolizantes de carbapenem

en grupos serina y metalo enzima (Barnaud et al., 1998; Bonomo, 2017).

Son el principal determinante de resistencia hacia antibióticos β – lactámicos y cefalosporinas de

amplio espectro como cefotaxima y ceftazidima y se encuentran en bacterias gram negativas

como los miembros de la familia Enterobacteriaceae (Salmonella y E. coli). Los tipos más

frecuentes son TEM, SHV y CTX-M (Barnaud et al., 1998; Philippon et al., 2002; Ripoll et al.,

2014; Bush, 2018). El incremento de la prevalencia de infecciones con microorganismos que

producen BLEE (en especial tipo CTX-M), las AmpC y carbapenemasas amenazan el futuro de

los antibióticos β – lactámicos (Rubin & Pitout, 2014).

3.3.2.1 Clasificación β - lactamasas

Son comúnmente clasificadas mediante 2 esquemas generales: el esquema de Ambler que

cataloga a las β – lactamasas en 4 grupos: A, B, C y D, basándose en la homología de la

secuencia de proteínas (similitud de aminoácidos). Las clases A, C y D (serin β – lactamasas)

incluyen enzimas que hidrolizan sus sustratos formando una enzima acilo a través de un sitio

activo de serina; mientras que la clase B (metalo β – lactamasas) son metalo enzimas que utilizan

al menos un sitio activo de ion Zn2+ (Zinc) o requiere iones divalentes de Zn2+ (Zinc) para facilitar

la hidrólisis de los β – lactámicos (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005; Bush & Jacoby,

2010; Ghafourian et al., 2014; Drawz et al., 2014; Farrokhnazar et al., 2016; Bush, 2018).

a) Clase A: llamadas serin penicilinasas, pertenecen a este grupo: TEM-1, TEM-2, SHV-1,

penicilinas de espectro extendido CTX-M, cefalosporinas de espectro extendido FEC y

carbapenemasas KPC, SME, NMC (Drawz & Bonomo, 2010; Bush & Jacoby, 2010).

21

b) Clase C: conocidas como cefalosporinasas incluyen enzimas CMY-2, AmpC, ACT, FOX, MIR

son resistentes a penicilinas, a combinaciones de β – lactámicos con inhibidores de β –

lactamasas como el clavulanato, cefalosporinas incluyendo cefoxitina, cefotetan, ceftriaxone y

cefotaxime (Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014).

c) Clase D: citadas como oxacilinasas pues hidrolizan la oxacilina, cloxacilina, metilcilina,

incluyen principalmente las enzimas OXA, son resistentes a penicilinas, cefalosporinas,

cefalosporinas de espectro extendido, carbapenems (Drawz & Bonomo, 2010).

d) Clase B: denominadas metalo β – lactamasas o carbapenemasas son enzimas Zn2+

dependientes, las enzimas representativas son IMP, VIM; son resistentes a penicilinas,

cefalosporinas, carbapenems, (Drawz & Bonomo, 2010).

El esquema de Bush, Jacoby & Medeiros, clasifica las β - lactamasas por sus similitudes

funcionales (perfiles de sustratos e inhibidores) basada en su estructura molecular así las β -

lactamasas son clasificadas en 4 grupos: 1, 2, 3 y 4 y múltiples subgrupos, este esquema tiene

una mayor relevancia para médicos y microbiólogos en el diagnóstico de laboratorio pues

considera los inhibidores y sustratos de β – lactamasas clínicamente importantes (Paterson &

Bonomo, 2005; Bush & Jacoby, 2010; Ghafourian et al., 2014; Drawz et al., 2014).

a) Grupo 1: de la clase C del esquema de Ambler (CMY, AmpC, FOX, ACT), son β – lactamasas

conocidas como AmpC.

b) Grupo 2: de la clase A del esquema de Ambler (TEM, SHV).

c) Grupo 3: de la clase B del esquema de Ambler (IMP, VIM), son las metalo enzimas capaces

de destruir carbapenems, son Zn2+ dependientes.

d) Grupo 4: de la clase D del esquema de Ambler (OXA), son β – lactamasas que contienen

inusuales penicilinasas no inhibidas por el ácido clavulánico, son enzimas que no encajan en

otros grupos (Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014).

22

Tabla 6: Esquemas clasificación β-lactamasas

Esquema

Ambler

Esquema

Bush

Jacoby

Medeiros

(1995)

Sustratos

preferidos

Enzimas

representativas

No.

Enzimas

A (serin penicilinasas) 2a Penicilinas PC1 23

2b Penicilinas, cefalosporinas

espectro estrecho

TEM-1, TEM-2,

SHV-1 16

2be

Penicilinas, cefalosporinas

espectro estrecho y

extendido

SHV-2 → SHV-6,

TEM-3 → TEM-26,

CTX-M

200

2br Penicilinas TEM-30, SHV-72 24

2c Penicilinas, carbenicilina PSE-1 19

2e cefalosporinas espectro

extendido FEC-1, CepA 20

2f

Penicilinas,

cefalosporinas,

carbapenems

KPC-2, SME-1,

NMC-A 4

B (metalo enzimas) 3 Mayoría β-lactámicos,

carbapenems

IMP-1, VIM-1,

Ccra, BcII, cPHa,

L1

24

C (cefalosporinasas) 1 Cefalosporinas AmpC, CMY-2,

ACT-1 51

D (oxacilinasas) 2d Penicilinas, cloxacilina OXA-1, OXA-10 31

No clasificadas 4 9

Fuente: Bush & Jacoby, 2010; Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014.

3.3.2.2 Tipos de β – lactamasas de espectro extendido de mayor importancia

a) Enzimas blaTEM

La enzima TEM-1 es la más común β – lactamasa en bacterias gram negativas, es capaz de

hidrolizar penicilinas y cefalosporinas. Fue reportada en 1965 de un aislado de E. coli en Grecia

de una paciente llamada Temoniera de allí su nombre TEM. Se han reportado más de 100 tipos

de TEM β – lactamasas (Paterson & Bonomo, 2005; Ghafourian et al., 2014).

Así TEM-3 reportada en 1989 fue la primera β – lactamasa tipo TEM que mostró fenotipo BLEE.

Las TEM BLEE se encuentran en E. coli, K. pneumoniae, y también en otras enterobacterias

como Salmonella, Proteus y Enterobacter (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005).

23

b) Enzimas blaSHV

El tipo SHV BLEE es la enzima mayormente encontrada. SHV se refiere a variable de sulfidrilo.

Han sido reportadas en un amplio rango enterobacterias, más de 100 tipos de SHV se conocen

al momento a nivel mundial. La mayoría de las variantes de SHV que poseen fenotipo BLEE se

caracterizan por la sustitución de la serina por la glicina en la posición 238. (Bradford, 2001;

Paterson & Bonomo, 2005; Ghafourian et al., 2014).

c) Enzimas blaCTX-M

Fue descrita por primera vez por Tzouvelekis en el 2000. Estas enzimas son recientes, y el

nombre CTX refleja la potente actividad hidrolítica de esta β – lactamasa contra la cefotaxima. Se

han encontrado en bacterias como Salmonella enterica serovar Typhimurium, E. coli y otras

enterobacterias. Existen más de 128 tipos de enzimas CTX-M. No están estrechamente

relacionadas con TEM y SHV, pues solo comparten un 40% de identidad con ellas; CTX-M BLEE

es la más frecuente a nivel mundial (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005; Girlich et al.,

2007; Salmerón García, 2007; Dallenne et al., 2010; Ghafourian et al., 2014; Yavuz et al., 2015).

Las CTX-M confieren resistencia hacia cefalosporinas de espectro extendido de tercera y cuarta

generación como cefotaxima, ceftazidima y cefepime (Girlich et al., 2007; Mosquito et al., 2011).

En cepas de E. coli su prevalencia se encontró que era del 96.2% (Yavuz et al., 2015).

CTX-M BLEE está llegando a ser uno de los grupos más grandes de β – lactamasas con un gran

incremento en el número de variantes llegando a 147 en los últimos años (Ripoll et al., 2014).

3.3.2.3 Enzimas AmpC

La primera enzima bacteriana que destruye la penicilina fue la AmpC β – lactamasa de

Escherichia coli. En la clasificación de Ambler las enzimas AmpC pertenecen a la clase C,

mientras que, en el esquema de Bush, están asignadas al grupo 1. La secuencia del gen AmpC

para E. coli fue reportada en 1981 (Jacoby, 2009).

Las AmpC hidrolizan de preferencia las cefalosporinas por eso se denominan cefalosporinasas y

cefamicinas y resisten la inhibición por clavulanato, sulbactam y tazobactam. El gen blaCMY-2 es el

tipo AmpC más común. Los genes AmpC fueron nombrados contradictoriamente basados en el

producto de su resistencia: cefamicinas (cephamycins) (CMY), cefoxitina (FOX), moxalactam

(MOX). Las más frecuentes AmpC encontradas son de las familias CMY, FOX y DHA, éstas

24

enzimas han sido encontradas en bacterias como Salmonella y E. coli. (Jacoby, 2009; Thomson,

2010; Farrokhnazar et al., 2016). En enterobacterias el principal mecanismo de resistencia hacia

las cefalosporinas de espectro extendido es la producción de BLEE y β – lactamasas tipo AmpC

o ambas, codificadas en su mayoría por plásmidos; se han descubierto cada vez más genes

AmpC β – lactamasas en plásmidos que se difunden fácilmente entre enterobacterias (Salmonella

y E. coli) (Sieffert et al., 2013; Shahada et al., 2013).

3.4 Pruebas de resistencia antimicrobiana

El objetivo del método Kirby-Bauer de difusión de disco determina la sensibilidad o resistencia de

patógenos aerobios o anaeróbicos facultativos hacia varios compuestos antimicrobianos, bajo

condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas (Hudzicki, 2009; Villagrán Ramírez,

2017; CLSI, 2017).

Esta técnica basada en el ensayo de Kirby Bauer es uno de los métodos que el National

Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, por sus siglas en ingles), recomienda para

la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos, entonces un disco impregnado

con antibiótico es colocado sobre un manto del cultivo bacteriano de prueba que se encuentra en

una suspensión a una medida de 0.5 en la escala de McFarland (aproximadamente 108 UFC/ml),

misma que se difunde por inundación o mediante un hisopo todo esto sobre una capa de agar

Mueller - Hinton (Difco, USA) con un espesor de 4 milímetros; el agente antimicrobiano se difunde

radialmente desde el disco hacia el medio; se deja reposar unos 15 minutos a temperatura

ambiente y después se somete a periodo de incubación por 16 – 24 horas a 35°C ±2°C.

Posteriormente se examina la caja petri en busca de áreas sin crecimiento alrededor del disco,

las cepas sensibles serán inhibidas a cierta distancia del disco mientras las cepas resistentes se

desarrollaron al filo del disco. El tamaño de la zona inhibitoria está en función de la velocidad de

difusión del antibiótico, el espesor del medio de cultivo, la concentración del antibiótico en los

discos y la sensibilidad del organismo a los mismos; lo que hace necesario la estandarización del

método para aplicar los criterios interpretativos (Reller et al., 2009; Prescott & Dowling, 2013;

Panta et al., 2013; Villagrán Ramírez, 2017; CLSI, 2017).

Las ventajas del método de difusión de disco son: a) simplicidad y practicidad pues no requiere

equipamiento especial; b) facilidad de interpretación de resultados; c) flexibilidad en selección de

25

discos con antibióticos, d) costo bajo. La desventaja es la falta de automatización o mecanización

de la prueba (Reller et al., 2009).

El método de concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la concentración más baja

de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo bajo condiciones

definidas después de una noche de incubación. CMI es considerada como la prueba “gold

standard” para determinar la susceptibilidad de microorganismos hacia antimicrobianos (CLSI,

2017).

En cuanto a la interpretación de la CMI, siendo un procedimiento semi cuantitativo que

proporciona una aproximación a la menor concentración de un antimicrobiano para prevenir el

crecimiento microbiológico, los resultados solo pueden ser leídos cuando existe suficiente

crecimiento del microorganismo analizado evidenciado por un botón o turbidez en el control

positivo y el no crecimiento ni turbidez en el control negativo, la cantidad de crecimiento en cada

tubo o pocillo es comparada con el control positivo y el resultado de CMI se anota como la más

baja concentración del agente antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento (Lambert

& Pearson, 2000; Andrews, 2001; (ESCMID, 2003); Wiegand et al., 2008; CLSI, 2017).

26

4 MATERIALES Y METODOS

4.1 Descripción de la zona de estudio

El estudio se llevó a cabo en las provincias de Napo y Pastaza en la región Amazónica de nuestro

país. La provincia de Napo que posee una superficie de 13271 km2, su capital es Tena, tiene una

altitud máxima de 5758 msnm y una mínima de 200 msnm; la temperatura oscila entre -10°C

(mínima) y 35°C (máxima); está dividida en 5 cantones: Archidona, Carlos Julio Arosemena Tola,

El Chaco, Quijos y Tena. La provincia de Pastaza posee una superficie de 29520 km2, una altitud

máxima de 2000 msnm y una altitud mínima de 70 msnm; una temperatura que oscila entre 10°C

(mínima) y 40°C (máxima); está dividida en 4 cantones: Arajuno, Mera, Pastaza y Santa Clara.

4.2 Diseño de estudio

Se realizó un estudio observacional transversal. El muestreo se ejecutó entre el 06 de enero al

28 de febrero del 2018, en un sistema de crianza y producción de reproductoras pesadas,

4 granjas de 3 galpones en período de levante (entre 1 a 24 semanas de edad), y 4 granjas de 6

galpones en período de producción (entre las 26 a 65 semanas de edad). Se recolectaron un total

de 144 muestras; 48 procedentes de las granjas de crianza y 96 de granjas de producción. Las

muestras se tomaron usando zapatones estériles, caminando a lo largo del galpón, dividiendo el

mismo en 4 secciones. Se tomaron 4 muestras por cada galpón.

Los zapatones se guardaron en fundas plásticas estériles y fueron etiquetados (nombre granja,

número galpón, zona del galpón, edad aves, fecha de muestreo), para lo cual se realizó una hoja

de registro de toma y envío de muestras. (Anexo G). Las muestras fueron almacenadas dentro

de un recipiente térmico en condiciones similares a refrigeración y llevadas al Laboratorio de

Patología Aviar de la empresa AVICOLA VITALOA “AVITALSA”. Las muestras se procesaron

máximo entre 24-36 horas posteriores a su recolección.

27

4.3 Procedimientos de laboratorio

4.3.1 Aislamiento e identificación de Salmonella

El aislamiento de Salmonella, se realizó basándonos en el protocolo de la norma NTE INEN 1529-

15:2009, el método se detallada en (Anexo A) y un esquema en (Anexo B). Los zapatones con

material fecal fueron pesados hasta obtener 25 gramos y luego colocados en una funda estéril a

la cual se añadió 225ml de agua de peptona buferada (BPW, Difco, USA), para obtener una

dilución 1:10, se homogenizó mediante un agitador stomacher a 250 RPM (revoluciones por

minuto) por un tiempo de 2 minutos, luego se incubó la muestra a 37°C por 18 – 24 horas, esto

como etapa de pre-enriquecimiento. Al día siguiente se tomó 10 ml de la muestra pre enriquecida

y se colocó en 100 ml de cada uno de los 2 caldos de enriquecimiento selectivo utilizados, el

caldo selenite cisteína (Difco, USA) y caldo tetrationato (Difco, USA), se homogenizaron

manualmente y fueron incubados a 37°C para el caldo selenite cisteína y a 42°C para el caldo

tetrationato por un tiempo de 18-24 horas, esto como etapa de enriquecimiento selectivo;

posterior se tomó una asada de cada uno de los caldos de enriquecimiento selectivo y se sembró

mediante estriación sobre agar verde brillante (Difco, USA) y en agar XLD (Difco, USA), se

procedió a incubar a 37°C por 18-24 horas. Las colonias ligeramente transparentes, redondas,

pequeñas y con un medio alcalino a su alrededor esto evidenciado por el viraje del indicador rojo

de fenol de agar verde brillante, se identificaron como Salmonella. Las colonias rojas con centro

de color negro se identificaron como Salmonella en agar XLD. La identidad de las colonias de

Salmonella, aisladas se confirmaron fenotípicamente mediante sus propiedades bioquímicas en

agares diferenciales, como el Triple sugar iron - TSI (Difco, USA), Lysine iron agar - LIA (Difco,

USA), agar sulfuro indol movilidad – SIM (Difco, USA) y caldo urea (Difco, USA), se incubó a 37°C

por 18-24 horas. Las colonias positivas a Salmonella en TSI se observaron con una reacción

alcalina (K -color rosa) en la superficie inclinada del tubo, una reacción ácida en el fondo del tubo

(A -color amarillo) y con producción de SH2 (color negro) y gas (G) en cantidad mínima. La colonia

positiva en agar LIA se observó con una reacción positiva a descarboxilación de lisina con color

morado o violeta, fondo de tubo de color morado y ennegrecimiento por producción de SH2;

negatividad a la prueba de urea lo cual se observó un color rosa pálido del caldo y en medio SIM

se observó una difusión del inoculo hacia los lados con alguna producción de ácido sulfhídrico

(SH2), así fueron consideradas como colonias sospechosas de Salmonella, para ser confirmadas

mediante serotipificación (Parra et al., 2002; INEN, 2009).

28

4.3.2 Serotipificación para Salmonella

Se realizó la serotipificación las cepas de Salmonella en base a un método internacional, ISO/TR

6579-3 (ISO, 2002b), siguiendo un protocolo estandarizado en el laboratorio de UNIETAR (Anexo

C) y un flujograma de serotipificación somática y flagelar (Anexo D y E) para las siguientes

especies: S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis.

Las cepas de control positivo utilizadas para esta técnica fueron S. Enteritidis ATCC 13076, S.

Typhimurium ATCC 14028, S. Infantis ATCC 51741, como control negativo se utilizó la cepa de

E. coli ATCC 25922.

4.3.3 Antibiograma Salmonella

Se realizó el procedimiento de difusión de disco (Kirby Bauer) basándonos en los lineamientos

establecidos en el CLSI, 2017; para lo cual algunas colonias bacterianas son diluidas en caldo

triptosa (Difco, USA) hasta obtener una densidad de 0.5 en la escala de McFarland (108 UFC/ml)

para su medición usamos un densitómetro, el cultivo se empapa o humedece sobre una capa de

agar Mueller Hinton (Difco, USA) de 4-6 mm de espesor, luego se colocan los discos de papel

filtro impregnados con cierta cantidad de antibióticos, cuando el disco toma contacto con el medio

absorbe agua del mismo e inmediatamente el antimicrobiano se difunde en forma radial, después

de un periodo de incubación de 18-24 horas a 37oC en las zonas donde la concentración del

antibiótico alcance un valor suficiente la bacteria no se desarrollara y aparecerá un halo de

inhibición alrededor de los discos (CLSI, 2017).

Para la interpretación se miden los halos de inhibición en milímetros por medio de un calibrador

como se muestra en la Figura 3. El diámetro del halo de inhibición se relaciona con el grado de

sensibilidad del microrganismo al antibiótico utilizado, los puntos de corte de los halos de

inhibición establecidos en milímetros están basados en el manual de CLSI, 2017 y se muestran

en la Tabla 7.

29

Figura 3: Antibiograma cepa Salmonella

Fuente: Investigación directa

Tabla 7: Lista de Antibióticos usados y tabla de interpretación

Antibiótico Abreviatura Concentración

Estándar

Interpretativo (mm)

µg R I S

Ciprofloxacina P 5 20 21-30 31

Cefotaxima X 30 22 23-25 26

Tetraciclina T 30 11 12-14 15

Estreptomicina E 10 11 12-14 15

Florfenicol N 30 12 13-17 18

Sulfametoxazol-Trimethoprim S 25 10 11-15 16

Fosfomicina F 200 12 13-15 16

Nota: “R” = Resistente, “I” = Intermedio, “S” = Sensible, “mm” = milímetros, µg=microgramos

Fuente: CLSI, 2017

30

4.3.4 Aislamiento e identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC

Se realizó el aislamiento de E. coli BLEE/AmpC por medio de un protocolo estandarizado en

UNIETAR, basado en la norma ISO 16649-1:2001 (Anexo F). De la dilución madre realizada

1:10 (25 gramos zapatones con material fecal + 225ml de agua peptona buferada), después del

período de incubación a 37°C por 18-24 horas, se tomó una asada para sembrarla por la técnica

de estriación en agar Chromocult® (Merck, Alemania), al cual se le adicionó Cefotaxima (3mg/lt).

Posteriormente se incubó estas placas a 37°C por 18-24 horas. En caso de existir crecimiento de

colonias azul obscuro o azul viol�

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