UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · ISO/TR International Organization for...

i

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

INSTITUTO SUPERIOR DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas

de espectro extendido (BLEE) en granjas avícolas de reproductoras pesadas en las

provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la obtención del título de

Magíster en Producción y Sanidad Avícola

AUTOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila

TUTOR: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos Ph.D.

Quito, 2018

ii

© DERECHOS DEL AUTOR

Yo, RODRIGO DAVID EGAS DAVILA, en calidad de autor del trabajo de titulación

“Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas


provincias de Napo y Pastaza, Ecuador”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador

hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta

obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su

reglamento.

Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización

y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

En la ciudad de Quito a los 19 días del mes de Octubre de 2018.

_______________________________

Rodrigo David Egas Dávila

C.I. 1715810857

[email protected]

mailto:[email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, Christian Vinicio Vinueza Burgos, en calidad de tutor del trabajo de titulación,

modalidad proyecto de investigación, para la obtención del Título de Magister en

Producción y Sanidad avícola, elaborado por el estudiante RODRIGO DAVID EGAS

DAVILA, del programa de posgrado Maestría en Sanidad Avícola, de la facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, considero que

el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios para ser sometido a la evaluación por

parte del jurado examinador que se asigne, por lo que APRUEBO, a fin de que el trabajo

sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad

Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de Octubre de 2018.

_____________________________

Christian Vinicio Vinueza Burgos Ph.D.

C.I. 1713266227

iv

APROBACION DEL TRIBUNAL

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas


provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

El tribunal constituido por:

Marco Cisneros, Presidente; María Belén Cevallos, Vocal Principal; Freddy Proaño, Vocal

Suplente y Christian Vinueza, Tutor.

Luego de receptar el Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la

obtención del Título de Magíster en Producción y Sanidad Avícola, presentado por el Sr.

Rodrigo David Egas Dávila, MVZ con el título de “Aislamiento e identificación de

Salmonella y Escherichia coli productor de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)

en granjas avícolas de reproductoras pesadas en las provincias de Napo y Pastaza,

Ecuador”.

Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO

En la ciudad de Quito, a los cuatro días del mes de diciembre de 2018.

Para la constancia de lo actuado firman:

Dr. Marco Cisneros Presidente ___________________

Dra. María Belén Cevallos Vocal Principal ___________________

Dr. Freddy Proaño Vocal Suplente ___________________

Dr. Christian Vinueza Tutor ___________________

v

DEDICATORIA

A mis padres por ser mi ejemplo de esfuerzo, honestidad y profesionalismo

A la memoria de mi querida abuelita Zoily †

Dr. Rodrigo Egas Dávila

RED

vi

AGRADECIMIENTOS

Expreso mis más sinceros agradecimientos a:

Al Dr. Christian Vinueza, Ph.D. Director e Investigador de la Unidad de Investigación de

Enfermedades Transmitidas por Alimentos y Resistencia a los Antimicrobianos

(UNIETAR) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central

del Ecuador, por su acertada dirección en la realización de esta tesis.

A la empresa AVITALSA, en nombre de su gerente Dr. Manuel Acosta, por toda la ayuda

prestada para la realización de esta investigación.

Al Dr. Guillermo Tamayo y todo el personal técnico y operativo perteneciente a

ORIAVESA, por la colaboración entregada para esta tesis.

Al Sr. José Luis Medina, MVZ y la Srta. Sofía de Janón, MVZ, por su colaboración en el

área de laboratorio, así como a todas las personas que forman el equipo de trabajo de

UNIETAR.

vii

TABLA DE CONTENIDO

pág.

© DERECHOS DEL AUTOR ------------------------------------------------------------------------------ ii

APROBACIÓN DEL TUTOR ----------------------------------------------------------------------------- iii

DEDICATORIA ------------------------------------------------------------------------------------------------v

AGRADECIMIENTOS -------------------------------------------------------------------------------------- vi

APROBACION DEL TRIBUNAL ------------------------------------------------------------------------- iv

TABLA DE CONTENIDO --------------------------------------------------------------------------------- vii

LISTA DE TABLAS -------------------------------------------------------------------------------------------x

LISTA DE FIGURAS ---------------------------------------------------------------------------------------- xi

LISTA DE ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------- xii

LISTA DE ABREVIATURAS ---------------------------------------------------------------------------- xiii

RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------------------- xv

ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------- xvi

1. INTRODUCCION ----------------------------------------------------------------------------------------- 1

2. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------------------- 2

2.1 GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------- 2

2.2 ESPECIFICOS --------------------------------------------------------------------------------------- 2

3. MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 3

3.1 Salmonella --------------------------------------------------------------------------------------------- 3

3.1.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Salmonella ------------------------ 3

3.1.2 Características generales -------------------------------------------------------------------- 4

3.1.3 Epidemiología ----------------------------------------------------------------------------------- 5

3.1.4 Aspectos de Salud Pública ------------------------------------------------------------------ 5

3.1.5 Diagnóstico de laboratorio ------------------------------------------------------------------- 9

viii

3.1.6 Aislamiento e Identificación ------------------------------------------------------------------ 9

3.2 Escherichia coli -------------------------------------------------------------------------------------- 10

3.2.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Escherichia ---------------------- 10

3.2.2 Características generales ------------------------------------------------------------------- 10

3.2.3 Epidemiología ---------------------------------------------------------------------------------- 11

3.2.4 Aspectos de Salud Pública ----------------------------------------------------------------- 12

3.2.5 Diagnóstico de laboratorio ------------------------------------------------------------------ 13

3.2.6 Aislamiento e Identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC --------------------- 13

3.3 Resistencia a los antibióticos -------------------------------------------------------------------- 14

3.3.1 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos ------------------------------------ 15

3.3.2 β – lactamasas --------------------------------------------------------------------------------- 19

3.3.2.1 Clasificación β - lactamasas ----------------------------------------------------------- 20

3.3.2.2 Tipos de β – lactamasas de espectro extendido de mayor importancia --- 22

3.3.2.3 Enzimas AmpC --------------------------------------------------------------------------- 23

3.4 Pruebas de resistencia antimicrobiana ------------------------------------------------------- 24

4 MATERIALES Y METODOS -------------------------------------------------------------------------- 26

4.1 Descripción de la zona de estudio ------------------------------------------------------------- 26

4.2 Diseño de estudio----------------------------------------------------------------------------------- 26

4.3 Procedimientos de laboratorio ------------------------------------------------------------------ 27

4.3.1 Aislamiento e identificación de Salmonella --------------------------------------------- 27

4.3.2 Serotipificación para Salmonella ---------------------------------------------------------- 28

4.3.3 Antibiograma Salmonella -------------------------------------------------------------------- 28

4.3.4 Aislamiento e identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC --------------------- 30

4.3.5 PCR para detección de genes: blaCTX-M, blaSHV, blaTEM y blaCMY en Salmonella

y E. coli BLEE/AmpC --------------------------------------------------------------------------------- 31

ix

4.4 Técnicas de procesamiento y análisis de datos -------------------------------------------- 32

4.5 Análisis Estadístico --------------------------------------------------------------------------------- 32

5 RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------------------------- 33

5.1 Salmonella -------------------------------------------------------------------------------------------- 33

5.1.1 Resultados aislamiento Salmonella ------------------------------------------------------ 33

5.1.2 Serotipos del género Salmonella ---------------------------------------------------------- 33

5.2 Escherichia coli -------------------------------------------------------------------------------------- 37

5.2.1 Resultados aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC ------------------------------ 37

5.2.2 Resistencia genotípica cepas Escherichia coli BLEE/AmpC ---------------------- 38

6 DISCUSION ----------------------------------------------------------------------------------------------- 40

7 CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------------------------------------- 43

8 RECOMENDACIONES --------------------------------------------------------------------------------- 44

BIBLIOGRAFIA ---------------------------------------------------------------------------------------------- 45

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 60

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1: Clasificación taxonómica de Salmonella ........................................................... 3

Tabla 2: Clasificación de especies y subespecies de Salmonella ................................... 4

Tabla 3: Clasificación serogrupos y serotipos a investigar de Salmonella ...................... 4

Tabla 4: Clasificación taxonómica de Escherichia coli .................................................. 10

Tabla 5: Familias de antibióticos y mecanismo de acción ............................................ 15

Tabla 6: Esquemas clasificación β-lactamasas ............................................................ 22

Tabla 7: Lista de Antibióticos usados y tabla de interpretación..................................... 29

Tabla 8: Secuencias primers para prueba PCR genes de resistencia blaCTX-M, blaTEM,

blaSHV, blaCMY, temperatura hibridación, tamaño amplicón, controles positivos, fuente . 31

Tabla 9: Resultados del aislamiento Salmonella en granjas ......................................... 33

Tabla 10: Resultados serotipificación somática y flagelar aislados de Salmonella ....... 34

Tabla 11: Patrones de resistencia antibiótica y genes de resistencia en aislados de

Salmonella ..................................................................................................................... 35

Tabla 12: Aislados de Salmonella resistentes a cada antibiótico utilizado en la

investigación .................................................................................................................. 37

Tabla 13: Resultados muestras para aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC en

granjas ........................................................................................................................... 38

Tabla 14: Tasas y número de genes de los grupos blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY en

aislados de E. coli BLEE/AmpC, detectados mediante prueba de PCR ........................ 38

Tabla 15: Tasas de combinaciones de genes de resistencia encontradas en aislados de

E. coli BLEE/AmpC ........................................................................................................ 39

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismos de resistencia bacteriana .......................................................... 17

Figura 2: Mecanismos de difusión genética de resistencia bacteriana ......................... 19

Figura 3: Antibiograma cepa Salmonella ...................................................................... 29

Figura 4: Colonia E. coli BLEE/AmpC en agar Chromocult® ........................................ 30

Figura 5: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de Salmonella ................. 36

Figura 6: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de E. coli BLEE/AmpC .... 39

xii

LISTA DE ANEXOS

Anexo A: Método basado en Norma INEN NTE 1529-15:2009 para aislamiento

Salmonella ..................................................................................................................... 61

Anexo B: Esquema aislamiento Salmonella (Cepas móviles) ...................................... 65

Anexo C: Método para serotipificación de aislados de Salmonella .............................. 66

Anexo D: Flujograma de serotipificación somática (O) para S. Enteritidis, S.

Typhimurium y S. Infantis .............................................................................................. 71

Anexo E: Flujograma de serotipificación flagelar (H) S. Enteritidis, S. Typhimurium y S.

Infantis ........................................................................................................................... 72

Anexo F: Esquema aislamiento E. coli ......................................................................... 73

Anexo G: Hoja de registro de toma y envío de muestras en granja ............................. 75

Anexo H: Método PCR simple para detección de genes β – lactámicos ...................... 76

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

µg microgramos

ADN Acido Desoxirribonucleico

ATCC American Type Culture Collection

BLEE Beta Lactámicos de Espectro Extendido

BPW Buffered Peptone Water

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CLSI Clinical & Laboratory Standards Institute

CMI Concentración Mínima Inhibitoria

CONAVE Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador

ECDC European Centre for Disease Prevention and Control

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EFSA European Food Safety Authority

ESBL Extended Spectrum β - Lactamases

ESCMID European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases

ETA Enfermedades Transmitidas por Alimentos

ISO/TR International Organization for Standardization

LIA Lysine Iron Agar

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Light

MSP Ministerio de Salud Pública

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NTE INEN Norma Técnica Ecuatoriana Instituto Ecuatoriano de Normalización

xiv

OIE Organización Internacional de Epizootias

Pb Pares bases

PCR Polymerase Chain Reaction

RAM Resistencia a los Antimicrobianos

RPM Revoluciones por minuto

SNT Salmonella No Tifoidea

TBE Tris Borate EDTA

TSI Triple Sugar Iron

UE Unión Europea

UFC Unidades Formadoras de Colonias

UNIETAR Unidad de Investigación Enfermedades Transmitidas por Alimentos

XLD Xylose Lysine Deoxycholate

xv

Aislamiento e identificación de Salmonella y Escherichia coli productor de

β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en granjas avícolas de reproductoras

pesadas en las provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

AUTOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila


RESUMEN

El objetivo del presente trabajo de investigación fue el de aislar Escherichia coli BLEE/AmpC

y S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis en muestras obtenidas de granjas de reproductoras

pesadas. Para esto, se utilizaron hisopos de barrido en los galpones de crianza y producción.

También se estudió la resistencia fenotípica de los aislados de Salmonella y se identificó los

genes de resistencia a antibióticos beta lactámicos en las dos bacterias.

Salmonella se identificó en el 15,3% (n = 22/144) de las muestras. El único serotipo identificado

fue S. Infantis (n = 5). Los aislados de S. Infantis prestan resistencia fenotípica a 5 o más

antimicrobianos. Se identificaron genes de resistencia en el 40,9% (n = 9/22) de los aislados de

Salmonella. En todos los casos de S. Infantis se detectó el gen blaCTX-M. El gen blaCMY fue

identificado en los 4 productos de Salmonella del grupo B.

E. coli BLEE / AmpC se identificó en el 78,5% (n = 113/144) de las muestras. Se identificaron

genes de resistencia en el 97,1% (n = 33/34) de los aislados. Se detectó 1 solo gen en el 76,5%

(n = 26/34), 2 genes en el 17,6% (n = 6/34) y 3 genes en el 2,9% (n = 1/34) de las muestras. El

gen blaCMY estuvo en el 65,4% (n = 17/26), blaCTX-M en el 30,8% (n = 8/26), blaSHV en el 3,8% (n =

1/26) mientras que blaTEM no fue identificado.

En conclusión, este estudio demuestra que los patrones de resistencia a los antibióticos se

encuentran presentes en las bacterias de granjas avícolas de reproductoras pesadas. Futuras

investigaciones dilucidarán la importancia epidemiológica de estos hallazgos.

PALABRAS CLAVES: β-LACTAMASAS / BLEE / REPRODUCTORAS PESADAS / NAPO /

PASTAZA

xvi

Isolation and identification of Salmonella and Escherichia coli producer of

extended-spectrum β-lactamases (ESBL) in poultry farms of broiler breeders in the

provinces of Napo and Pastaza, Ecuador.

AUTHOR: Dr. Rodrigo David Egas Dávila


ABSTRACT

The objective of this research was to isolate Escherichia coli BLEE / AmpC and S. Enteritidis,

S. Typhimurium and S. Infantis in samples obtained from farms of broiler breeders. For this, boot

swabs were used in the breeding and production sheds. The phenotypic resistance of the

Salmonella isolates was also studied, and the beta-lactam antibiotic resistance genes were

identified in the two bacteria.

Salmonella was identified in 15.3% (n = 22/144) of the samples. The only serotype identified was

S. Infantis (n = 5). Isolates of S. Infantis had phenotypic resistance to 5 or more antimicrobials.

Resistance genes were identified in 40.9% (n = 9) of the Salmonella isolates. In all cases of S.

Infantis, the blaCTX-M gene was detected. The blaCMY gene was identified in the 4 Salmonella

products of group B.

E. coli ESBL / AmpC was identified in 78.5% (n = 113/144) of the samples. Resistance genes

were identified in 97.1% (n = 33/34) of the isolates. A single gene was detected in 76.5% (n =

26/34), 2 genes in 17.6% (n = 6/34) and 3 genes in 2.9% (n = 1/34) of isolates. The blaCMY gene

was identified in 65.4% (n = 17/26), blaCTX-M in 30.8% (n = 8/26), blaSHV in 3.8% (n = 1/26)

meanwhile blaTEM was not identified.

In conclusion, this study demonstrates that antibiotic resistance patterns are present in the

bacteria of poultry farms of broiler breeders. Future research will elucidate the epidemiological

importance of these findings

KEYWORDS: β-LACTAMASES / ESBL / BROILER BREEDERS / NAPO / PASTAZA

1

1. INTRODUCCION

Salmonella enterica no tifoidea y Escherichia coli son miembros de la familia Enterobacteriaceae

en su mayoría actúan como comensales en el tracto gastrointestinal de animales (Shahada et al.,

2013). La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por

microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori) (OIE, 2008).

La salmonelosis tiene distribución mundial y se considera un importante problema de salud

pública (Herrera & Jabib, 2015). Una proporción de serovares de Salmonella entérica consisten

en patógenos zoonóticos que causan enfermedades transmitidas por alimentos en humanos, a

pesar de que cepas de E. coli actúan como flora normal en el tracto intestinal de animales y

humanos, algunos son importantes patógenos intestinales y extra intestinales (Shahada et al.,

2013).

El género Salmonella especie enterica subespecie enterica presenta más de 2500 serovares

diferentes, algunos con una gran virulencia y resistencia a los antibióticos (Gómez Vega, 2013;

Gil-Setas et al., 2002; Widén et al., 2013).

La infección debida a serovariedades no tíficas de Salmonella representa un problema de salud

pública nacional e internacional, que se ha agudizado con la apertura económica y la

globalización, debido a que el consumo de carne de pollo, huevos y subproductos se ha

incrementado en todo el mundo y existe sustancialmente un mayor riesgo de infección (Uribe &

Suárez, 2006).

Las aves de corral son por mucho el vehículo principal de estos patógenos en la cadena

alimentaria (Vinueza-Burgos et al., 2016). Los productos avícolas son importantes vehículos en

la transmisión y han sido incriminados en varios brotes de Salmonella (Chuma et al., 2013).

En muchos países se ha encontrado una alta proporción de cepas de Salmonella con resistencia

múltiple a los antibióticos (Buitrago et al., 2006; Uribe & Suárez, 2006). Existen preocupaciones

acerca de Salmonella y su resistencia debido a información obtenida a través de diferentes

estudios, siendo S. Typhimurium la serovariedad más conocida como multiresistente aislada de

diferentes animales domésticos (Sonali Rivera Corona et al., 2012).

Las bacterias resistentes pueden causar enfermedades en humanos o transmitir sus genes de

resistencia a las bacterias patógenas (Vinueza-Burgos et al., 2016).

2

En Ecuador, los esfuerzos han estado enfocados en controlar S. Enteritidis y S. Typhimurium en

aves de corral debido a problemas de salud pública (Cushicóndor, 2017). El serovar Infantis fue

el más constante y frecuente a lo largo de la línea de crianza (Villagómez Estrada, 2015;

Villagómez Estrada, Logacho Pilataxi, & Vinueza Burgos, 2017).

En todo el mundo, el uso de antibióticos en las prácticas de crianza es una preocupación

importante ya que esto puede promover el desarrollo de bacterias resistentes a múltiples

fármacos. Los antibióticos en los sistemas de producción avícola son ampliamente utilizados para

prevenir, controlar y tratar las infecciones bacterianas, así como promotores del crecimiento

(Seiffert et al., 2013; Villagómez Estrada, 2015)

La información obtenida en este estudio será valiosa para mejorar los controles sanitarios

implementados contra E. coli y Salmonella, conocer sí existen los serotipos que se buscan y

poder tomar medidas concretas para controlarlos; así mismo permitirá una mejor vigilancia y uso

adecuado de las drogas para tratamientos antibióticos en las parvadas de reproductoras pesadas.

2. OBJETIVOS

2.1 GENERAL

Determinar la presencia de Salmonella y Escherichia coli BLEE/AmpC en granjas de

reproductoras pesadas en las provincias de Napo y Pastaza, Ecuador.

2.2 ESPECIFICOS

Aislar Salmonella, en granjas de aves reproductoras pesadas en las provincias de Napo y

Pastaza, Ecuador basándonos en el método de la norma INEN NTE 1529-15:2009.

Aislar Escherichia coli BLEE/AmpC en granjas de aves reproductoras pesadas en las provincias

de Napo y Pastaza, Ecuador basado en el método de la norma ISO 16649-1:2001.

Tipificar los fenotipos de Salmonella y Escherichia coli BLEE/AmpC resistentes a antibióticos,

mediante la técnica de difusión de disco Kirby Bauer y por medio de PCR para detección de genes

de resistencia.

3

3. MARCO TEORICO

3.1 Salmonella

3.1.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Salmonella

En el siglo XIX el agente causal de la fiebre tifoidea fue identificado y se lo llegó a conocer

eventualmente como Salmonella, la cual debe su nombre a David Elmer Salmon, médico

veterinario que dirigía los estudios que en 1884 llevaron a su descubrimiento (Delgado

Fernández, 2015). Salmon y Smith realizaron el primer aislamiento de Bacillus cholera-suis, ahora

llamada Salmonella enterica (S. enterica) subespecie enterica serovar choleraesuis de un cerdo

diagnosticado con cólera, mientras Smith fue el primero en identificar realmente al organismo, a

Salmon se le atribuyó su descubrimiento y terminó llevando su nombre (Cosby et al., 2015; Rivera

Calderón et al., 2012).

Tabla 1: Clasificación taxonómica de Salmonella

Dominio BACTERIA

Filo Proteobacteria

Clase Gammaproteobacteria

Orden Enterobacteriales

Familia Enterobacteriaceae

Género Salmonella

Fuente: OIE, 2008; Rivera Calderón et al., 2012;

Delgado Fernández, 2015

De acuerdo con la nomenclatura actual, que refleja avances recientes en la taxonomía, el género

Salmonella incluye solo 2 especies importantes: S. enterica y S. bongori. Un sistema de

clasificación taxonómica que divide a S. enterica en seis subespecies: I enterica, II salamae, IIIa

arizonae, IIIb diarizonae, IV houtenae, VI indica (Rivera Calderón et al., 2012). Se ha propuesto

una tercera especie S. subterranea, tras el aislamiento de una única cepa ambiental poco usual

(OIE, 2008; Delgado Fernández, 2015).

4

Tabla 2: Clasificación de especies y subespecies de Salmonella

Especie Subespecie

Salmonella enterica enterica (I)

salamae (II)

arizonae (IIIa)

diarizonae (IIIb)

houtenae (IV)

indica (IV)

Salmonella bongori

Salmonella subterranea

Fuente: Uribe & Suárez, 2006; OIE, 2008;

Delgado Fernández, 2015, Villagómez Estrada, 2015

3.1.2 Características generales

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae (Barreto et al., 2016). Son un

grupo diverso de bacterias Gram negativas, de 2-5µm de longitud y 0.7-1.5µm de diámetro,

aerobios y anaerobios facultativos, que pueden ser móviles o inmóviles, no forman esporas, con

flagelos perítricos, exceptuando Salmonella Gallinarum (Gómez Vega, 2013). En las cepas

móviles hay que tener en cuenta las implicaciones que poseen en salud pública (Mantilla et al.,

2010).

Reducen nitratos a nitritos, son negativos a pruebas de indol, ureasa y oxidasa, su temperatura

óptima de crecimiento es de 35°C - 40°C dependiendo del serotipo y la matriz usada para su

aislamiento; no se desarrolla bien a bajas temperaturas, el congelamiento no la destruye, resiste

la deshidratación. Los serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica, son

antigénicamente diferenciados por reacciones de aglutinación, el esquema de Kauffman-White

es usado para asignar el serotipo, los antígenos presentes en la superficie bacteriana incluyen

los somáticos (O), antígenos flagelares (H) y capsulares (Vi) (Cosby et al., 2015).

Tabla 3: Clasificación serogrupos y serotipos a investigar de Salmonella

Especie Subespecie Serogrupo Serotipo

Salmonella enterica enterica (I) B Typhimurium C Infantis D Enteritidis

Fuente: Difco, 2012

5

3.1.3 Epidemiología

La Salmonella habita en el tracto intestinal de los animales, mamíferos, aves y reptiles, incluso el

hombre (Herrera & Jabib, 2015). La capacidad de las cepas de Salmonella adaptadas al

hospedador para provocar una colonización o infección persistente es fundamental para la

transmisión, pues estos pacientes o animales actúan como reservorios de la bacteria (Seiffert et

al., 2013).

Alrededor del mundo, la producción y distribución a gran escala de alimentos disemina los

patógenos, esto sumado a la resistencia generada a las drogas antibióticas, provoca nuevos

desafíos para controlar y prevenir la infección por Salmonella (Majowicz et al., 2010).

Salmonella enterica como patógeno zoonótico, puede pasar rápidamente de animales a humanos

a través del consumo de carne contaminada, productos animales y otros productos alimenticios,

contaminados con material fecal animal, mismo que contamina agua y alimento por ende

contribuye a la diseminación de Salmonella en el ambiente (Cosby et al., 2015).

Cerca del 75% de los patógenos emergentes son zoonóticos. La principal estrategia para el

control de las enfermedades infecciosas zoonóticas debe incluir la limpieza de la cadena de

producción desde la parte superior en el caso de enfermedades de transmisión vertical como

salmonelosis, medidas de higiene en toda la cadena de producción, vacunación, tratamiento y

programas de educación y erradicación (Hafez, 2014).

En reproductoras pesadas los serovares de mayor importancia y para los cuales existen

programas de vigilancia dentro de la UE son: S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Virchow

y S. Hadar (EFSA & ECDC, 2017).

En el Ecuador, la carne de pollo es la mayor fuente de proteína animal para la población, con un

consumo promedio per cápita de 35 kg por habitante por año (CONAVE, 2013); mediante un

estudio llevado a cabo en broilers donde se muestrearon 388 lotes provenientes de 120 granjas

durante 1 año, se aisló Salmonella en el 16% de los lotes y el serotipo S. Infantis fue el

mayormente encontrado con un 84% (Vinueza & De Zutter, 2017).

3.1.4 Aspectos de Salud Pública

La salmonelosis es una de las ETA, que con más frecuencia se notifican a nivel mundial (Majowicz

et al, 2014; Sonali Rivera Corona et al., 2012). Es una de las dos enfermedades más importantes

6

y que con mayor periodicidad se transmiten de las aves a los seres humanos, rara vez causa

enfermedad en aves y en personas infectadas provoca cuadros de diarrea (Hafez, 2014).

Existen muchas especies animales que presentan este microorganismo en el intestino,

manifestando la enfermedad o manteniéndose como portadores sanos eliminando la bacteria a

través de las heces fecales, a estos patógenos se los denomina Salmonella no tifoidea, que

incluyen S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis (Guerrero Ibarra, 2017).

Las serovariedades no tifoideas de Salmonella enterica (Salmonella), son la causa principal de

ETA a nivel mundial (Chuma et al., 2013).

La cualidad de las especies de Salmonella para causar infección en los seres humanos está dada

por la capacidad de adherencia y colonización a las células epiteliales intestinales y a otras

especializadas que recubren las placas de Peyer (Cosby et al., 2015). Se trata de una potencial

infección zoonótica asociada a gastroenteritis, siendo un problema de salud pública en países

desarrollados y en vías de desarrollo (Majowicz et al., 2010; Trung et al., 2017).

El 99% de los serovares responsables por las infecciones en el hombre y animales de sangre

caliente son miembros de la subespecie enterica (I) (Sonali Rivera Corona et al., 2012). Una

proporción de los serovares de S. enterica consisten en patógenos zoonóticos que causan

enfermedad alimentaria en humanos (Shahada et al., 2013).

La salmonelosis está entre las zoonosis de mayor prevalencia en países desarrollados, en

Estados Unidos (USA), Canadá, Dinamarca, Inglaterra y Noruega, se han reportado brotes de

salmonelosis principalmente transmitida por alimentos; más del 64% de los casos por

S. Enteritidis en USA, se deben al consumo de huevos contaminados, con alrededor de 200.000

personas enfermas cada año (Rivera Calderón, 2012).

Salvo pocos países a nivel mundial, Salmonella se detecta en casi todas las etapas de la cadena

de producción de alimentos, de los más de 2600 serovares conocidos, solo el 10% se encuentran

en la industria avícola (carne y huevos). Los serovares S. Enteritidis y S. Typhimurium, son de

suma importancia para la salud humana y pueden colonizar el intestino de las aves sin que éstas

presenten síntomas (Velhner et al., 2017).

En USA se estiman 1.3 - 1.4 millones de casos de enfermedad alimentaria debido a salmonelosis

cada año siendo uno de los mayores patógenos causantes de ETA, causando 20.000

hospitalizaciones con un costo aproximado de 14.6 billones de dólares y ocasionando 500

muertes; S. Enteritidis y S. Typhimurium fueron los serotipos mayormente reportados en

7

enfermedad humana, Salmonella Kentucky fue el serotipo más aislado en programas de vigilancia

de carcasas de pollo (Parveen et al., 2007; Cosby et al., 2015).

El creciente aumento de casos de salmonelosis humana también ha sido asociado con frutas y

vegetales contaminados. Tradicionalmente la enfermedad ha sido unida al consumo de alimentos

contaminados de origen animal en especial aves y productos avícolas. La problemática de la

resistencia antimicrobiana y sobre todo la multirresistencia a los antibióticos se ha incrementado

entre numerosos serotipos de Salmonella recuperados de animales y humanos a nivel mundial

(Parveen et al., 2007).

Para el año 2016, los 28 países miembros de la Unión Europea (UE) reportaron 94.530 casos

confirmados de salmonelosis resultando en 128 muertes dando una incidencia de 20.4 casos por

cada 100.000 habitantes, siendo la segunda infección gastrointestinal zoonótica en la UE. Son 5

serovares los mayormente responsables de los casos de Salmonella en humanos: S. Enteritidis,

S. Typhimurium, S. Typhimurium monofásica, S. Infantis y S. Derby (EFSA & ECDC, 2017). Estos

serovares fueron designados por la Comisión Europea como “serovares de importancia para la

salud pública” (Parra et al., 2002; Carrique-Mas & Davies, 2008).

El impacto global en la salud humana por SNT es elevado, con 93.8 millones de casos, de éstos,

80 millones son transmitidos por alimentos y provocan 155.000 muertes cada año (Majowicz et

al., 2010; Ao et al., 2015; Widén et al., 2013; Vinueza-Burgos et al., 2016).

En Brasil, en el periodo 2000 - 2015, según datos del Ministerio de Salud, Salmonella fue

considerada con el mayor agente causal de ETA (Moura et al., 2018).

En el Ecuador se han reportado hasta la semana 35 del año 2018 un total de 1147 casos de

salmonelosis transmitida por agua y alimentos (MSP, 2018). Las aves de corral son el principal

vehículo de estos patógenos en la cadena alimentaria (Vinueza-Burgos et al., 2016)

La enfermedad por SNT es una de las principales causas de enfermedad diarreica a nivel mundial

(Ao et al., 2015), aunque provoca gastroenteritis auto limitada, puede terminar en infecciones

invasivas graves que necesitarán tratamiento adecuado con antibióticos (Moura et al., 2017).

De todas las serovares descritos, solamente un 10% han sido aisladas de aves de corral y de

éstas solo una pequeña proporción de serovariedades han sido encontradas en explotaciones

avícolas S. Enteritidis y S. Typhimurium tienen capacidad de invadir tejidos como el aparato

reproductor de gallina infectando los huevos en formación en el oviducto (Terzolo & Ríos, 2008).

8

La mayoría de casos de SNT en humanos se deben a infección alimentaria o por transmisión

entre personas, incluso por exposición ambiental y ocupacional con animales, incluidos los de

granja, lo cual es más común en naciones que buscan desarrollarse pues una gran cantidad de

habitantes están involucrados en la crianza de ganado y aves, generalmente en instalaciones

poco tecnificadas, con bajo nivel de bioseguridad y protección, lo cual incrementa el contacto

entre humanos y animales (Trung et al., 2017).

En los países miembros de la UE según la Directiva Europea 1003/2005, la ocurrencia de

S. Enteritidis y S. Typhimurium en lotes de reproductoras en edad adulta fue ≤ 1%; sin embargo,

también apuntaron a los serovares S. Hadar, S. Virchow y S. Infantis que son de significancia en

salud pública en la UE (Carrique-Mas & Davies, 2008; Velhner et al., 2017). En Europa el serovar

predominante es S. Enteritidis (59-62%), seguido de S. Typhimurium con el (13-17%) (Parra et

al., 2002; Carrique-Mas & Davies, 2008).

En USA, se reportan 9.4 millones de casos de ETA, así el Centro para el Control y Prevención de

Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés), estima anualmente que de estos casos 1,028

millones (11%), provocan 19.000 hospitalizaciones y 400 muertes por infección con serovares de

SNT; los serotipos de Salmonella mayormente aislados en los programas de vigilancia entre los

años 2007 - 2008 fueron: Salmonella Kentucky, Heidelberg, Typhimurium y Typhimurium (var 5).

Los animales para consumo humano son la fuente primaria de infección por salmonelosis, la

diseminación ocurre por el consumo de aves de corral, carne de res, cerdo, huevos y productos

frescos contaminados con Salmonella viable de las heces animales (Parra et al, 2002; Cosby et

al., 2015; Hsieh et al., 2016).

La proporción de casos de enfermedad humana en la UE debido a S. Infantis, el cuarto serovar

más común en humanos, ha permanecido estable. S. Infantis fue mayormente reportada en

broilers y pavos y ha sido capaz de difundirse masivamente en toda la cadena de producción de

broilers (EFSA & ECDC, 2017).

La UE en 2016 reporta prevalencias de Salmonella en lotes de reproductoras para los serotipos

principalmente obtenidos en programas de vigilancia así: S. Enteritidis (0,32%), S. Typhimurium

(0,16%) y S. Infantis (0,06%). (EFSA & ECDC, 2017).

En Ecuador un estudio en carcasas de pollo a edad de faenamiento, el serotipo con mayor

prevalencia fue Salmonella Infantis (83.9%), S. Enteritidis (14.5%) y S. Corvallis (1.6%) (Vinueza-

Burgos et al., 2016).

9

3.1.5 Diagnóstico de laboratorio

El diagnóstico de Salmonella se puede realizar a partir de muestras ambientales, alimento y

tomando en cuenta que producen septicemia en las aves, en especial en las debilitadas o para

descarte, es conveniente órganos internos, siendo de elección el hígado, vesícula biliar, bazo,

páncreas y contenido cecal; también se puede realizar cultivos de ambiente de granja con hisopos

de arrastre de material fecal de cama. En reproductoras pesadas se puede hacer un pool de

meconio de alrededor de 500 pollitos de diferentes cajas de transporte. (Terzolo & Ríos, 2008;

Widén et al, 2013).

La Comisión de Regulación de la UE en el año 2010, definió la estrategia de muestreo para

detectar Salmonella, en lotes de reproductoras adultas de Gallus gallus y para gallinas ponedoras

en el año 2011, el mismo se debe hacer mientras las aves se encuentren en las instalaciones

avícolas y también luego de la salida de estas. Entre los métodos más convenientes para realizar

dichos muestreos con el objetivo de ejecutar análisis bacteriológicos de instalaciones o galpones

avícolas encaminadas a encontrar Salmonella, está el muestreo con zapatones o el método de

hisopos de arrastre (Buhr et al., 2007; Velhner et al., 2017).

3.1.6 Aislamiento e Identificación

Los métodos de cultivo son los más usados por su alta selectividad y sensibilidad, luego se los

somete a ensayos bioquímicos y serológicos para su identificación definitiva. Las etapas

necesarias para aislamiento e identificación de Salmonella siguen una secuencia que comienza

con el pre enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo, mismo que se utiliza para viabilizar el

crecimiento de la bacteria en el inicio del aislamiento, seguido del enriquecimiento selectivo que

permite la multiplicación de Salmonella pues ésta compite con otras enterobacterias y las inhibe

en gran proporción aunque no totalmente siendo los medios más comunes son: selenite cisteína,

tetrationato, rappaport-vassiliadis, para la siembra o plaqueo los medios más comunes son

MacConkey (MC), Salmonella-Shigella (SS), Hektoen (HE), verde brillante (VB), xilosa lisina

desoxicolato (XLD) (Nascimento et al, 2000; Pérez et al, 2004; Widén et al, 2013).

El método de serotipificación bajo el esquema de Kauffmann White es un valioso complemento

de la identificación bioquímica y tiene una gran utilidad del lado epidemiológico para determinar

prevalencia, fuentes infección y vías transmisión de la enfermedad. Es uno de los métodos de

referencia para la clasificación actual de los serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica

(Wattiau et al., 2011; Villagómez Estrada, 2015; Melo Durán, 2015; Sánchez Chugchilán, 2016;

10

Quintero, 2016; Chumbi, 2017; Cushicóndor, 2017). La serotipificación es esencial para la

identificación de variantes de esta bacteria (Widén et al, 2013).

3.2 Escherichia coli

3.2.1 Historia, taxonomía y nomenclatura del género Escherichia

Un pediatra nacido en Alemania en 1857, Theodor Escherich, que tras estudios realizados en el

tracto gastrointestinal de infantes presentó sus conclusiones acerca de la morfología,

propiedades y efectos de las poblaciones bacterianas, entre ellas Bacterium coli commune (bacilo

del colon común, conocido como Escherichia coli) (Narváez Manosalvas, 2015; Pérez, 2015).

El género Escherichia comprende 5 especies; E. blattae; E. coli; E. fergusonii; E. hermanni y E.

vulneris. De las 5 especies solamente E. coli tiene relevancia clínica tanto en el hombre como en

los animales (Villagrán Ramírez, 2017).

Tabla 4: Clasificación taxonómica de Escherichia coli

Dominio Bacteria

Reino Bacteria

Filo Proteobacteria

Clase Gamma Proteobacteria

Orden Eubacteriales

Familia Enterobacteriaceae

Tribu Escherichiae

Género Escherichia

Especie coli

Fuente: Salmerón García, 2007; Pérez, 2015

3.2.2 Características generales

El género Escherichia, y, en concreto, la especie coli, es un bacilo gramnegativo de la familia

Enterobacteriaceae, puede medir entre 1-1.5µm x 2-6µm, estando solos o en pares (Pérez, 2015);

no esporulados, móviles con flagelos perítricos o inmóviles, es aerobia o anaerobia facultativa,

11

capaz de fermentar lactosa y glucosa, con la producción de gases y ácidos diversos (Salmerón

García, 2007; Villagrán Ramírez, 2017).

Esta bacteria crece en medios comunes por ser microorganismo con pocas exigencias nutritivas

(Janón González, 2016). E. coli está formada por cápsula, pared bacteriana, membrana externa,

pili o fimbrias y flagelos (Pérez, 2015).

Se considera que el hábitat “normal” de E. coli es el colon de organismos de sangre caliente (aves

y mamíferos). La mayoría de estos microorganismos son comensales en los seres humanos y

animales y están presentes en el medio ambiente. Algunas cepas de E. coli, son patógenas para

humanos y animales al producir factores de virulencia específicos (Salmerón García, 2007; Abreu

et al., 2013; Narváez Manosalvas, 2015; Janón González, 2016).

La bacteria puede causar enfermedad en animales como las aves, en las cuales se denomina

colibacilosis, cuyo tratamiento puede ser hecho con antibióticos (Farrokhnazar et al., 2016).

Se clasifican en más de 170 serogrupos, según su antígeno somático (O) por las características

antigénicas de su LPS (lipopolisacárido), y en serotipos por la combinación de antígenos O y H

(flagelares). Se han descrito seis patotipos de E. coli productora de diarrea: enterotoxigénica

(ETEC), enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC),

enteroagregativa (EAEC) y de adherencia difusa (ADEC) (Seiffert et al., 2013; Villagrán Ramírez,

2017).

3.2.3 Epidemiología

El principal reservorio de E. coli BLEE/AmpC en humanos es el tracto digestivo, su transmisión

se facilita por contacto a través de las manos así se ha sabido de transmisión plasmídica y

bacteriana de estas enzimas entre personas por contacto directo; ciertos alimentos de origen

animal en especial las aves de corral y en concreto los broilers son fuente de transmisión de

enzimas BLEE al hombre; se ha detectado E. coli BLEE/AmpC en las heces fecales de animales

tanto destinados al consumo, compañía y salvajes (Abreu et al., 2013).

La colibacilosis es una de las más frecuentes ETA, reportándose en todo el mundo y provocando

millones de casos anualmente (Muzo Suquillo, 2017).

La crianza de aves de traspatio que se promueve y consolida como fuente de ingresos

económicos y estrategia de suplementación nutricional en África, Asia y América Latina, facilita

12

el contacto entre humanos y aves transmitiendo así cepas de E. coli resistentes a los antibióticos

(Braykov et al., 2016).

En el 2009, la UE reportó una prevalencia media de aislados de E. coli resistentes a

cefalosporinas de espectro extendido que fue del 8.5% con un rango de 0% para Dinamarca al

26.4% en España, en Suiza en el 2011 la prevalencia fue del 25%. En Asia la prevalencia está

en un rango ente el 8 al 60% (Seiffert et al., 2013).

En seres humanos, diversos investigaciones como la realizada en Tailandia, revelaron la

presencia de E. coli BLEE en 52% (141) personas, no obstante en China y España las cifras son

del 7% y 6,7% respectivamente, en muestras fecales de individuos sanos. En Alemania, se

detectó (211/3344) personas colonizadas con E. coli BLEE (Aguilar-Zapata, 2016).

En México, un estudio realizado en un centro de salud en personas con proceso infeccioso de

vías urinarias concluyó que el 88% de los urocultivos fueron positivos a E. coli y de éstos el 30%

eran causados por cepas BLEE (Aguilar-Zapata, 2016). Otro estudio hospitalario entre los años

2008-2009, reveló que de un total de 1412 aislamientos realizados, 1184 (83.9%) corresponden

a E. coli BLEE (Paredes Gago, 2013).

En Ecuador, entre los años 2005-2009, según datos del departamento de microbiología del

Hospital Vozandes Quito, 35/56 aislamientos de cepas BLEE corresponden a E. coli,

representando un 62.5% (León Astudillo & Pacheco Quito, 2010).

En aves, las infecciones por E. coli, que provocan colibacilosis son transcendentes y lideran las

causas de las cuantiosas pérdidas económicas que se provocan por las elevadas tasas de

morbilidad y mortalidad a nivel mundial así como costos de tratamientos, retraso en crecimiento

de animales y disminución de ganancia de peso, decomisos en plantas de proceso y afectación

de la calidad de carne y huevos, siendo por tanto no aptos para el consumo humano (Ewers et

al., 2004; Giovanardi et al., 2005; Muzo Suquillo, 2017).

3.2.4 Aspectos de Salud Pública

E. coli es responsable de una variedad de infecciones intestinales y extraintestinales, provocando

diarrea, infecciones urinarias y abdominales en seres humanos (Seiffert et al., 2013).

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria en el 2011 reportó 1.93 casos de infección por

cada 100.000 habitantes, cifra que incrementó y que para el 2013 aumentó en un 159,4% con

4000 casos confirmados en relación con el 2011 (Muzo Suquillo, 2017).

13

La detección de E. coli BLEE/AmpC en animales destinados al consumo humano y productos

animales comestibles se ha convertido en una gran preocupación para los consumidores, esto

representa un gran desafío para médicos y veterinarios ya que estas cepas de E. coli BLEE/AmpC

pueden inactivar antibióticos β – lactámicos (Kar et al., 2014).

3.2.5 Diagnóstico de laboratorio

3.2.6 Aislamiento e Identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC

La enumeración de E. coli en alimentos y fuentes medioambientales ha sido extensamente

estudiada y en la última década ha incrementado el uso de sustratos cromogénicos en medios

de cultivo para la identificación de E. coli. El agar Chromocult® es un medio selectivo diferencial

que contiene dos sustratos cromogénicos para la detección de coliformes totales y E. coli, estos

son la β – glucoronidasa o X-GLUC, la cual es específica para el 96% de E. coli y la β -

galactosidasa o Salmon-GAL. E. coli es β – galactosidasa y β – glucoronidasa positiva y las

colonias desarrollan un color azul obscuro o violeta en el agar, además contiene tergitol que inhibe

el crecimiento de bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas (Turner et al., 2000;

González et al., 2003; Muzo Suquillo, 2017).

Existen otros métodos para identificación de microorganismos basados en la proteómica que

estudia y caracteriza las proteínas expresadas en el genoma (proteoma), las técnicas más usadas

se basan en electroforesis y espectrometría de masas, la segunda analiza con gran precisión la

composición de diferentes elementos químicos al permitir la medición de iones derivados de

moléculas categorizándolos en función de su relación masa/carga. La espectrometría de masas

MALDI-TOF, MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – desorción/ionización por láser

asistida por matriz) y TOF por el analizador (Time of flight – tiempo de vuelo), es de gran interés

en microbiología para la identificación bacteriana, su objetivo es determinar género y especie del

microorganismo, existen múltiples kits comerciales que usan sistema MALDI-TOF. Esta es una

prueba rápida, confiable, fiable, barata; pero requiere calibraciones y controles de calidad

frecuentes (Bou et al, 2011).

14

3.3 Resistencia a los antibióticos

Los antibióticos son sustancias fabricadas por diversas especies de microrganismos (bacterias,

hongos) o de forma sintética que inhiben la proliferación o replicación de otros gérmenes

provocando su destrucción (Pérez, 2015; Cruz Marruffo, 2016).

En el año 1929, Alexander Fleming aisló y cultivó el hongo Penicillium que producía una sustancia

que provocaba lisis de un cultivo de estafilococos la cual denominó Penicilina, que se podría

considerar con el primer antibiótico, desde ese tiempo los científicos han descubierto y

desarrollado numerosas clases de antimicrobianos ejerciendo efectos bacteriostáticos y

bactericidas (García Vázquez, 2011; Cosby et al., 2015; Villagrán Ramírez, 2017).

La introducción de los antibióticos en la práctica clínica representó una de las más importantes

intervenciones para el control de las enfermedades infecciosas (Alós, 2015).

Desde su descubrimiento en la llamada “era de los antibióticos” en los años 1950, las drogas

antimicrobianas han sido ampliamente utilizadas en producción animal por los siguientes motivos:

(a) tratamiento de animales enfermos: colibacilosis, cólera aviar e infecciones respiratorios

(b) profilaxis para prevención de infecciones en situaciones específicas de riesgo

(c) promotores de crecimiento para incrementar la tasa de ganancia diaria de peso o eficiencia

alimenticia y así mejorar la producción (Furtula et al., 2010; Seiffert et al., 2013).

El uso de antibióticos en dosis sub terapéuticas se ha incrementado por la alta demanda de

productos de origen animal a nivel mundial. En Asia debido a la bonanza económica que

experimenta; el consumo promedio mundial de antibióticos en animales para consumo humano

fue estimado en el 2010 en 63.151 toneladas; para las aves esto corresponde a un consumo de

antimicrobianos de 0.148 mg por cada kg de carne producida. Se espera un aumento de la

utilización de antibióticos en producción animal del 67% para el 2030. Los mayores consumidores

de antibióticos son Brasil, Rusia, India, China y Sudáfrica, debido a la crianza intensiva donde los

antimicrobianos se usan a dosis sub terapéuticas (Brower et al., 2017).

Los antibióticos β – lactámicos incluyen las penicilinas, cefalosporinas y carbapenems que son

los 3 mayores grupos representantes, los efectos de estas drogas son mediados por la habilidad

de interferir con un grupo de proteínas de enlace o unión a penicilina las cuales están involucradas

en la síntesis de peptidoglucano que compone la pared celular (Cosby et al., 2015).

15

En el año 2006, la UE, prohibió el uso de antibióticos promotores de crecimiento en el alimento

de animales en respuesta a la evidencia que sugiere que los éstos impulsaron el surgimiento y la

diseminación de la resistencia (Brower et al, 2017).

Tabla 5: Familias de antibióticos y mecanismo de acción

Mecanismo de acción Familias antibióticas

Inhibición síntesis de pared celular

Penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactams,

glicopéptidos

Inhibición síntesis de proteínas Tetracilinas, aminoglucósidos,

macrólidos, lincosamidas

Inhibición de síntesis de ADN Fluoroquinolonas

Inhibición competitiva de síntesis de ácido fólico

Sulfonamidas, trimethoprim

Fuente: Marshall, 2004

3.3.1 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos

Se entiende por resistencia a los antimicrobianos (RAM), el mecanismo mediante el cual la

bacteria puede disminuir la acción de los agentes antimicrobianos principalmente por el uso

indiscriminado de los mismos en humanos y producciones animales (Rivera Calderón, 2012);

Otros autores la definen como la capacidad natural o adquirida de las bacterias para evitar la

acción bactericida o bacteriostática de un agente antibacteriano o crecer en presencia de este a

dosis o concentraciones terapéuticas (García Vázquez et al., 2011; Alós, 2015; Janón González,

2016).

La multirresistencia es la capacidad adquirida por los gérmenes contra diferentes agentes

antimicrobianos (Villagrán Ramírez, 2017).

Algunos de los factores importantes para el desarrollo de RAM incluyen: presiones selectivas, la

proliferación de clones bacterianos con multiresistencia y la incapacidad para detectar fenotipos

emergentes. Las presiones selectivas pueden incluir el uso excesivo o incorrecto de los

antibióticos en el tratamiento de enfermedades humanas y animales, así como la supervivencia

16

de bacterias a los tratamientos con antimicrobianos generando cepas resistentes (Cosby et al.,

2015).

La RAM es un problema de salud pública en USA y a nivel mundial que se ha incrementado

dramáticamente y que afecta a diversos ámbitos, tanto en medicina humana, veterinaria,

seguridad alimentaria y ambiental (Abreu et al., 2013; Braykov et al., 2016; Hsieh et al., 2016;

Vergara et al., 2017).

La resistencia a múltiples drogas fue detectada por primera vez entre las enterobacterias (E. coli,

Salmonella) entre los años 1950 – 1960; por ende no es nueva, pero el número de organismos

resistentes, las zonas geográficos afectadas por la resistencia hacia los antibióticos y la amplitud

de resistencia en organismos simples no tienen precedentes. Enfermedades y agentes

etiológicos de las mismas que se pensaban controlados por los antibióticos han regresado con

nuevas categorías de resistencia a estos tratamientos (Marshall, 2004).

Muchos de estos patógenos han obtenido o están obteniendo material genético para

efectivamente bloquear la acción de los antibióticos y algunos de estos microorganismos han

llegado a ser resistentes a múltiples fármacos o tipos de drogas.

Existen 2 vías primarias que la bacteria utiliza para el desarrollo de resistencia antimicrobiana y

son:

a) La natural, intrínseca o espontánea en la cual mutaciones ocurren naturalmente mismas que

pueden ser sustituciones de bases, mutaciones de cambio de marco, delecciones de material

genético o inserciones de elementos de ADN, dando al microorganismo la habilidad de resistir

los efectos letales de un antibiótico.

b) La adquirida en la cual la bacteria capta material genético de otra bacteria (intercambio ADN),

ambas son formas de modificación genética de los microorganismos para sobrevivir.

Los factores de resistencia están en forma de plásmidos, transposones o integrones que se

mueven entre bacterias ya sea a través de conjugación, transformación o transducción (Cosby et

al., 2015) (Figura 1).

17

Figura 1: Mecanismos de resistencia bacteriana


Los bacteriófagos líticos o fagos, son virus que replican al interior de una bacteria y la lisan.

Poseen especificidad hacia cada bacteria, se unen a receptores de superficie, introducen su

genoma en la bacteria para producir muchas nuevas partículas virales que por acción enzimática,

se liberan matando a la bacteria y liberando gran número de fagos, amplificando así el efecto

antibacteriano (Borie et al., 2008). Los bacteriófagos pueden ser un componente natural, no

tóxico, factible y de bajo costo para el control de Salmonella en aves de corral (Fiorentin, Vieira,

& Barioni Jr, 2005).

En infecciones por Salmonella, múltiples investigaciones, demuestran que mediante la

administración de una mezcla de bacteriófagos se obtiene la reducción de la colonización de las

especies Enteritidis y Typhimurium a nivel intestinal en pollos broilers experimentalmente

infectados, disminuyendo con ello la posibilidad de contaminación de sus productos (Toro et al.,

2005; Borie et al., 2008; Ariza Suárez & Naranjo Espinosa, 2017).

18

La RAM en patógenos bacterianos en humanos no existía antes del uso de estas drogas por el

hombre y su prevalencia era baja; con su uso masivo se ha constatado a nivel mundial un

aumento importante en la prevalencia de la resistencia. Además la colonización intestinal de

personas sanas por enterobacterias productoras de BLEE, la mayoría del tipo CTX-M, ha

alcanzado niveles de pandemia, calculando 1753 millones de personas colonizadas a nivel

mundial, así hay una evolución de patógenos importantes a la resistencia y multirresistencia, lo

cual concuerda con el gran uso de antimicrobianos desde hacen 70 años (Alós, 2015).

Los animales son considerados como los reservorios de bacterias gram negativas RAM y su

impacto en la salud humana ha atraído la atención mundial. La masiva e indiscriminada aplicación

de diferentes tipos de drogas antibióticas en el contexto veterinario ha favorecido la selección y

difusión de bacterias gram negativas multirresistentes a los antibióticos, en particular cepas de E.

coli y Salmonella (Parveen et al., 2007; Seiffert et al., 2013; Vergara et al., 2017).

Numerosos estudios sugieren que el uso extendido de antimicrobianos contribuye a incrementar

la RAM y desde que estos son adicionados a las dietas animales las poblaciones bacterianas son

continuamente expuestas a dosis subterapéuticas, lo cual contribuye a la emergencia y difusión

de la resistencia a los antibióticos (Brower et al., 2017).

Se pueden describir algunos mecanismos de resistencia en bacterias:

(a) mutaciones de las dianas de los antibióticos hacia las proteínas de enlace

(b) reducción de la permeabilidad de la pared celular (interrupción de las proteínas - porinas)

c) sistemas o bombas eflujo (expulsión del antibiótico)

d) Inactivación enzimática por la producción de enzimas (cromosómicas y plasmídicas); este

último mecanismo es el más común en las bacterias de la familia Enterobacteriaceae (Drawz &

Bonomo, 2010; García Vázquez et al., 2011; Seiffert et al., 2013) (Figura 2).

19

Figura 2: Mecanismos de difusión genética de resistencia bacteriana


3.3.2 β – lactamasas

La primera β - lactamasa fue identificada en Bacillus (Escherichia coli) antes del uso clínico de la

penicilina, hace más de 70 años Abraham & Chain la describieron como B. coli “penicilinasa”, no

pensaron que ésta sería clínicamente importante desde que la penicilina fue la droga de elección

para el tratamiento contra infecciones por estafilococos y estreptococos, Abraham & Chain no

tuvieron éxito en aislar la enzima de estos organismos gram positivos; 4 años más tarde Kirby

extrajo exitosamente estos inactivadores de la penicilina del Staphylococcus aureus, lo que

auguró el nacimiento de un problema clínico considerable (Bradford, 2001; Salmerón García,

2007; Drawz & Bonomo, 2010).

Las bacterias usan diferentes estrategias para permanecer inmunes a los efectos de los

antibióticos, uno de los más importantes de estos mecanismos usados por las bacterias Gram

negativas contra los antibióticos β - lactámicos es la producción enzimas llamadas β - lactamasas

las cuales hidrolizan y disuelven el enlace amida del anillo β – lactámico característico de 4

miembros de antibióticos β - lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, monobactams y

carbapenems), dando como resultado la inactivación del antibiótico cuando su anillo es roto

20

(Paterson & Bonomo, 2005; Mosquito et al., 2011; Farrokhnazar et al., 2016; Bonomo, 2017;

Pathak et al., 2017).

La producción de β - lactamasas por bacterias gram positivas y negativas es una de las más

significantes amenazas a la eficacia de los antibióticos. La continua evolución de las bacterias

responde a la presión ejercida por el uso de nuevas drogas β – lactámicas; por ello los

microorganismos mutan y adquieren nuevos genes de resistencia (Drawz et al., 2014).

Las β - lactamasas ahora incluyen más de 2000 secuencias únicas de aminoácidos naturales,

siguen siendo la mayor amenaza para el uso de los antibióticos β – lactámicos. Las más

importantes clínicamente son las clases A, BLEE, AmpC y enzimas hidrolizantes de carbapenem

en grupos serina y metalo enzima (Barnaud et al., 1998; Bonomo, 2017).

Son el principal determinante de resistencia hacia antibióticos β – lactámicos y cefalosporinas de

amplio espectro como cefotaxima y ceftazidima y se encuentran en bacterias gram negativas

como los miembros de la familia Enterobacteriaceae (Salmonella y E. coli). Los tipos más

frecuentes son TEM, SHV y CTX-M (Barnaud et al., 1998; Philippon et al., 2002; Ripoll et al.,

2014; Bush, 2018). El incremento de la prevalencia de infecciones con microorganismos que

producen BLEE (en especial tipo CTX-M), las AmpC y carbapenemasas amenazan el futuro de

los antibióticos β – lactámicos (Rubin & Pitout, 2014).

3.3.2.1 Clasificación β - lactamasas

Son comúnmente clasificadas mediante 2 esquemas generales: el esquema de Ambler que

cataloga a las β – lactamasas en 4 grupos: A, B, C y D, basándose en la homología de la

secuencia de proteínas (similitud de aminoácidos). Las clases A, C y D (serin β – lactamasas)

incluyen enzimas que hidrolizan sus sustratos formando una enzima acilo a través de un sitio

activo de serina; mientras que la clase B (metalo β – lactamasas) son metalo enzimas que utilizan

al menos un sitio activo de ion Zn2+ (Zinc) o requiere iones divalentes de Zn2+ (Zinc) para facilitar

la hidrólisis de los β – lactámicos (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005; Bush & Jacoby,

2010; Ghafourian et al., 2014; Drawz et al., 2014; Farrokhnazar et al., 2016; Bush, 2018).

a) Clase A: llamadas serin penicilinasas, pertenecen a este grupo: TEM-1, TEM-2, SHV-1,

penicilinas de espectro extendido CTX-M, cefalosporinas de espectro extendido FEC y

carbapenemasas KPC, SME, NMC (Drawz & Bonomo, 2010; Bush & Jacoby, 2010).

21

b) Clase C: conocidas como cefalosporinasas incluyen enzimas CMY-2, AmpC, ACT, FOX, MIR

son resistentes a penicilinas, a combinaciones de β – lactámicos con inhibidores de β –

lactamasas como el clavulanato, cefalosporinas incluyendo cefoxitina, cefotetan, ceftriaxone y

cefotaxime (Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014).

c) Clase D: citadas como oxacilinasas pues hidrolizan la oxacilina, cloxacilina, metilcilina,

incluyen principalmente las enzimas OXA, son resistentes a penicilinas, cefalosporinas,

cefalosporinas de espectro extendido, carbapenems (Drawz & Bonomo, 2010).

d) Clase B: denominadas metalo β – lactamasas o carbapenemasas son enzimas Zn2+

dependientes, las enzimas representativas son IMP, VIM; son resistentes a penicilinas,

cefalosporinas, carbapenems, (Drawz & Bonomo, 2010).

El esquema de Bush, Jacoby & Medeiros, clasifica las β - lactamasas por sus similitudes

funcionales (perfiles de sustratos e inhibidores) basada en su estructura molecular así las β -

lactamasas son clasificadas en 4 grupos: 1, 2, 3 y 4 y múltiples subgrupos, este esquema tiene

una mayor relevancia para médicos y microbiólogos en el diagnóstico de laboratorio pues

considera los inhibidores y sustratos de β – lactamasas clínicamente importantes (Paterson &

Bonomo, 2005; Bush & Jacoby, 2010; Ghafourian et al., 2014; Drawz et al., 2014).

a) Grupo 1: de la clase C del esquema de Ambler (CMY, AmpC, FOX, ACT), son β – lactamasas

conocidas como AmpC.

b) Grupo 2: de la clase A del esquema de Ambler (TEM, SHV).

c) Grupo 3: de la clase B del esquema de Ambler (IMP, VIM), son las metalo enzimas capaces

de destruir carbapenems, son Zn2+ dependientes.

d) Grupo 4: de la clase D del esquema de Ambler (OXA), son β – lactamasas que contienen

inusuales penicilinasas no inhibidas por el ácido clavulánico, son enzimas que no encajan en

otros grupos (Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014).

22

Tabla 6: Esquemas clasificación β-lactamasas

Esquema

Ambler

Esquema

Bush

Jacoby

Medeiros

(1995)

Sustratos

preferidos

Enzimas

representativas

No.

Enzimas

A (serin penicilinasas) 2a Penicilinas PC1 23

2b Penicilinas, cefalosporinas

espectro estrecho

TEM-1, TEM-2,

SHV-1 16

2be

Penicilinas, cefalosporinas

espectro estrecho y

extendido

SHV-2 → SHV-6,

TEM-3 → TEM-26,

CTX-M

200

2br Penicilinas TEM-30, SHV-72 24

2c Penicilinas, carbenicilina PSE-1 19

2e cefalosporinas espectro

extendido FEC-1, CepA 20

2f

Penicilinas,

cefalosporinas,

carbapenems

KPC-2, SME-1,

NMC-A 4

B (metalo enzimas) 3 Mayoría β-lactámicos,

carbapenems

IMP-1, VIM-1,

Ccra, BcII, cPHa,

L1

24

C (cefalosporinasas) 1 Cefalosporinas AmpC, CMY-2,

ACT-1 51

D (oxacilinasas) 2d Penicilinas, cloxacilina OXA-1, OXA-10 31

No clasificadas 4 9

Fuente: Bush & Jacoby, 2010; Drawz & Bonomo, 2010; Ghafourian et al., 2014.

3.3.2.2 Tipos de β – lactamasas de espectro extendido de mayor importancia

a) Enzimas blaTEM

La enzima TEM-1 es la más común β – lactamasa en bacterias gram negativas, es capaz de

hidrolizar penicilinas y cefalosporinas. Fue reportada en 1965 de un aislado de E. coli en Grecia

de una paciente llamada Temoniera de allí su nombre TEM. Se han reportado más de 100 tipos

de TEM β – lactamasas (Paterson & Bonomo, 2005; Ghafourian et al., 2014).

Así TEM-3 reportada en 1989 fue la primera β – lactamasa tipo TEM que mostró fenotipo BLEE.

Las TEM BLEE se encuentran en E. coli, K. pneumoniae, y también en otras enterobacterias

como Salmonella, Proteus y Enterobacter (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005).

23

b) Enzimas blaSHV

El tipo SHV BLEE es la enzima mayormente encontrada. SHV se refiere a variable de sulfidrilo.

Han sido reportadas en un amplio rango enterobacterias, más de 100 tipos de SHV se conocen

al momento a nivel mundial. La mayoría de las variantes de SHV que poseen fenotipo BLEE se

caracterizan por la sustitución de la serina por la glicina en la posición 238. (Bradford, 2001;

Paterson & Bonomo, 2005; Ghafourian et al., 2014).

c) Enzimas blaCTX-M

Fue descrita por primera vez por Tzouvelekis en el 2000. Estas enzimas son recientes, y el

nombre CTX refleja la potente actividad hidrolítica de esta β – lactamasa contra la cefotaxima. Se

han encontrado en bacterias como Salmonella enterica serovar Typhimurium, E. coli y otras

enterobacterias. Existen más de 128 tipos de enzimas CTX-M. No están estrechamente

relacionadas con TEM y SHV, pues solo comparten un 40% de identidad con ellas; CTX-M BLEE

es la más frecuente a nivel mundial (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005; Girlich et al.,

2007; Salmerón García, 2007; Dallenne et al., 2010; Ghafourian et al., 2014; Yavuz et al., 2015).

Las CTX-M confieren resistencia hacia cefalosporinas de espectro extendido de tercera y cuarta

generación como cefotaxima, ceftazidima y cefepime (Girlich et al., 2007; Mosquito et al., 2011).

En cepas de E. coli su prevalencia se encontró que era del 96.2% (Yavuz et al., 2015).

CTX-M BLEE está llegando a ser uno de los grupos más grandes de β – lactamasas con un gran

incremento en el número de variantes llegando a 147 en los últimos años (Ripoll et al., 2014).

3.3.2.3 Enzimas AmpC

La primera enzima bacteriana que destruye la penicilina fue la AmpC β – lactamasa de

Escherichia coli. En la clasificación de Ambler las enzimas AmpC pertenecen a la clase C,

mientras que, en el esquema de Bush, están asignadas al grupo 1. La secuencia del gen AmpC

para E. coli fue reportada en 1981 (Jacoby, 2009).

Las AmpC hidrolizan de preferencia las cefalosporinas por eso se denominan cefalosporinasas y

cefamicinas y resisten la inhibición por clavulanato, sulbactam y tazobactam. El gen blaCMY-2 es el

tipo AmpC más común. Los genes AmpC fueron nombrados contradictoriamente basados en el

producto de su resistencia: cefamicinas (cephamycins) (CMY), cefoxitina (FOX), moxalactam

(MOX). Las más frecuentes AmpC encontradas son de las familias CMY, FOX y DHA, éstas

24

enzimas han sido encontradas en bacterias como Salmonella y E. coli. (Jacoby, 2009; Thomson,

2010; Farrokhnazar et al., 2016). En enterobacterias el principal mecanismo de resistencia hacia

las cefalosporinas de espectro extendido es la producción de BLEE y β – lactamasas tipo AmpC

o ambas, codificadas en su mayoría por plásmidos; se han descubierto cada vez más genes

AmpC β – lactamasas en plásmidos que se difunden fácilmente entre enterobacterias (Salmonella

y E. coli) (Sieffert et al., 2013; Shahada et al., 2013).

3.4 Pruebas de resistencia antimicrobiana

El objetivo del método Kirby-Bauer de difusión de disco determina la sensibilidad o resistencia de

patógenos aerobios o anaeróbicos facultativos hacia varios compuestos antimicrobianos, bajo

condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas (Hudzicki, 2009; Villagrán Ramírez,

2017; CLSI, 2017).

Esta técnica basada en el ensayo de Kirby Bauer es uno de los métodos que el National

Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, por sus siglas en ingles), recomienda para

la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos, entonces un disco impregnado

con antibiótico es colocado sobre un manto del cultivo bacteriano de prueba que se encuentra en

una suspensión a una medida de 0.5 en la escala de McFarland (aproximadamente 108 UFC/ml),

misma que se difunde por inundación o mediante un hisopo todo esto sobre una capa de agar

Mueller - Hinton (Difco, USA) con un espesor de 4 milímetros; el agente antimicrobiano se difunde

radialmente desde el disco hacia el medio; se deja reposar unos 15 minutos a temperatura

ambiente y después se somete a periodo de incubación por 16 – 24 horas a 35°C ±2°C.

Posteriormente se examina la caja petri en busca de áreas sin crecimiento alrededor del disco,

las cepas sensibles serán inhibidas a cierta distancia del disco mientras las cepas resistentes se

desarrollaron al filo del disco. El tamaño de la zona inhibitoria está en función de la velocidad de

difusión del antibiótico, el espesor del medio de cultivo, la concentración del antibiótico en los

discos y la sensibilidad del organismo a los mismos; lo que hace necesario la estandarización del

método para aplicar los criterios interpretativos (Reller et al., 2009; Prescott & Dowling, 2013;

Panta et al., 2013; Villagrán Ramírez, 2017; CLSI, 2017).

Las ventajas del método de difusión de disco son: a) simplicidad y practicidad pues no requiere

equipamiento especial; b) facilidad de interpretación de resultados; c) flexibilidad en selección de

25

discos con antibióticos, d) costo bajo. La desventaja es la falta de automatización o mecanización

de la prueba (Reller et al., 2009).

El método de concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la concentración más baja

de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo bajo condiciones

definidas después de una noche de incubación. CMI es considerada como la prueba “gold

standard” para determinar la susceptibilidad de microorganismos hacia antimicrobianos (CLSI,

2017).

En cuanto a la interpretación de la CMI, siendo un procedimiento semi cuantitativo que

proporciona una aproximación a la menor concentración de un antimicrobiano para prevenir el

crecimiento microbiológico, los resultados solo pueden ser leídos cuando existe suficiente

crecimiento del microorganismo analizado evidenciado por un botón o turbidez en el control

positivo y el no crecimiento ni turbidez en el control negativo, la cantidad de crecimiento en cada

tubo o pocillo es comparada con el control positivo y el resultado de CMI se anota como la más

baja concentración del agente antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento (Lambert

& Pearson, 2000; Andrews, 2001; (ESCMID, 2003); Wiegand et al., 2008; CLSI, 2017).

26

4 MATERIALES Y METODOS

4.1 Descripción de la zona de estudio

El estudio se llevó a cabo en las provincias de Napo y Pastaza en la región Amazónica de nuestro

país. La provincia de Napo que posee una superficie de 13271 km2, su capital es Tena, tiene una

altitud máxima de 5758 msnm y una mínima de 200 msnm; la temperatura oscila entre -10°C

(mínima) y 35°C (máxima); está dividida en 5 cantones: Archidona, Carlos Julio Arosemena Tola,

El Chaco, Quijos y Tena. La provincia de Pastaza posee una superficie de 29520 km2, una altitud

máxima de 2000 msnm y una altitud mínima de 70 msnm; una temperatura que oscila entre 10°C

(mínima) y 40°C (máxima); está dividida en 4 cantones: Arajuno, Mera, Pastaza y Santa Clara.

4.2 Diseño de estudio

Se realizó un estudio observacional transversal. El muestreo se ejecutó entre el 06 de enero al

28 de febrero del 2018, en un sistema de crianza y producción de reproductoras pesadas,

4 granjas de 3 galpones en período de levante (entre 1 a 24 semanas de edad), y 4 granjas de 6

galpones en período de producción (entre las 26 a 65 semanas de edad). Se recolectaron un total

de 144 muestras; 48 procedentes de las granjas de crianza y 96 de granjas de producción. Las

muestras se tomaron usando zapatones estériles, caminando a lo largo del galpón, dividiendo el

mismo en 4 secciones. Se tomaron 4 muestras por cada galpón.

Los zapatones se guardaron en fundas plásticas estériles y fueron etiquetados (nombre granja,

número galpón, zona del galpón, edad aves, fecha de muestreo), para lo cual se realizó una hoja

de registro de toma y envío de muestras. (Anexo G). Las muestras fueron almacenadas dentro

de un recipiente térmico en condiciones similares a refrigeración y llevadas al Laboratorio de

Patología Aviar de la empresa AVICOLA VITALOA “AVITALSA”. Las muestras se procesaron

máximo entre 24-36 horas posteriores a su recolección.

27

4.3 Procedimientos de laboratorio

4.3.1 Aislamiento e identificación de Salmonella

El aislamiento de Salmonella, se realizó basándonos en el protocolo de la norma NTE INEN 1529-

15:2009, el método se detallada en (Anexo A) y un esquema en (Anexo B). Los zapatones con

material fecal fueron pesados hasta obtener 25 gramos y luego colocados en una funda estéril a

la cual se añadió 225ml de agua de peptona buferada (BPW, Difco, USA), para obtener una

dilución 1:10, se homogenizó mediante un agitador stomacher a 250 RPM (revoluciones por

minuto) por un tiempo de 2 minutos, luego se incubó la muestra a 37°C por 18 – 24 horas, esto

como etapa de pre-enriquecimiento. Al día siguiente se tomó 10 ml de la muestra pre enriquecida

y se colocó en 100 ml de cada uno de los 2 caldos de enriquecimiento selectivo utilizados, el

caldo selenite cisteína (Difco, USA) y caldo tetrationato (Difco, USA), se homogenizaron

manualmente y fueron incubados a 37°C para el caldo selenite cisteína y a 42°C para el caldo

tetrationato por un tiempo de 18-24 horas, esto como etapa de enriquecimiento selectivo;

posterior se tomó una asada de cada uno de los caldos de enriquecimiento selectivo y se sembró

mediante estriación sobre agar verde brillante (Difco, USA) y en agar XLD (Difco, USA), se

procedió a incubar a 37°C por 18-24 horas. Las colonias ligeramente transparentes, redondas,

pequeñas y con un medio alcalino a su alrededor esto evidenciado por el viraje del indicador rojo

de fenol de agar verde brillante, se identificaron como Salmonella. Las colonias rojas con centro

de color negro se identificaron como Salmonella en agar XLD. La identidad de las colonias de

Salmonella, aisladas se confirmaron fenotípicamente mediante sus propiedades bioquímicas en

agares diferenciales, como el Triple sugar iron - TSI (Difco, USA), Lysine iron agar - LIA (Difco,

USA), agar sulfuro indol movilidad – SIM (Difco, USA) y caldo urea (Difco, USA), se incubó a 37°C

por 18-24 horas. Las colonias positivas a Salmonella en TSI se observaron con una reacción

alcalina (K -color rosa) en la superficie inclinada del tubo, una reacción ácida en el fondo del tubo

(A -color amarillo) y con producción de SH2 (color negro) y gas (G) en cantidad mínima. La colonia

positiva en agar LIA se observó con una reacción positiva a descarboxilación de lisina con color

morado o violeta, fondo de tubo de color morado y ennegrecimiento por producción de SH2;

negatividad a la prueba de urea lo cual se observó un color rosa pálido del caldo y en medio SIM

se observó una difusión del inoculo hacia los lados con alguna producción de ácido sulfhídrico

(SH2), así fueron consideradas como colonias sospechosas de Salmonella, para ser confirmadas

mediante serotipificación (Parra et al., 2002; INEN, 2009).

28

4.3.2 Serotipificación para Salmonella

Se realizó la serotipificación las cepas de Salmonella en base a un método internacional, ISO/TR

6579-3 (ISO, 2002b), siguiendo un protocolo estandarizado en el laboratorio de UNIETAR (Anexo

C) y un flujograma de serotipificación somática y flagelar (Anexo D y E) para las siguientes

especies: S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis.

Las cepas de control positivo utilizadas para esta técnica fueron S. Enteritidis ATCC 13076, S.

Typhimurium ATCC 14028, S. Infantis ATCC 51741, como control negativo se utilizó la cepa de

E. coli ATCC 25922.

4.3.3 Antibiograma Salmonella

Se realizó el procedimiento de difusión de disco (Kirby Bauer) basándonos en los lineamientos

establecidos en el CLSI, 2017; para lo cual algunas colonias bacterianas son diluidas en caldo

triptosa (Difco, USA) hasta obtener una densidad de 0.5 en la escala de McFarland (108 UFC/ml)

para su medición usamos un densitómetro, el cultivo se empapa o humedece sobre una capa de

agar Mueller Hinton (Difco, USA) de 4-6 mm de espesor, luego se colocan los discos de papel

filtro impregnados con cierta cantidad de antibióticos, cuando el disco toma contacto con el medio

absorbe agua del mismo e inmediatamente el antimicrobiano se difunde en forma radial, después

de un periodo de incubación de 18-24 horas a 37oC en las zonas donde la concentración del

antibiótico alcance un valor suficiente la bacteria no se desarrollara y aparecerá un halo de

inhibición alrededor de los discos (CLSI, 2017).

Para la interpretación se miden los halos de inhibición en milímetros por medio de un calibrador

como se muestra en la Figura 3. El diámetro del halo de inhibición se relaciona con el grado de

sensibilidad del microrganismo al antibiótico utilizado, los puntos de corte de los halos de

inhibición establecidos en milímetros están basados en el manual de CLSI, 2017 y se muestran

en la Tabla 7.

29

Figura 3: Antibiograma cepa Salmonella

Fuente: Investigación directa

Tabla 7: Lista de Antibióticos usados y tabla de interpretación

Antibiótico Abreviatura Concentración

Estándar

Interpretativo (mm)

µg R I S

Ciprofloxacina P 5 20 21-30 31

Cefotaxima X 30 22 23-25 26

Tetraciclina T 30 11 12-14 15

Estreptomicina E 10 11 12-14 15

Florfenicol N 30 12 13-17 18

Sulfametoxazol-Trimethoprim S 25 10 11-15 16

Fosfomicina F 200 12 13-15 16

Nota: “R” = Resistente, “I” = Intermedio, “S” = Sensible, “mm” = milímetros, µg=microgramos

Fuente: CLSI, 2017

30

4.3.4 Aislamiento e identificación de Escherichia coli BLEE/AmpC

Se realizó el aislamiento de E. coli BLEE/AmpC por medio de un protocolo estandarizado en

UNIETAR, basado en la norma ISO 16649-1:2001 (Anexo F). De la dilución madre realizada

1:10 (25 gramos zapatones con material fecal + 225ml de agua peptona buferada), después del

período de incubación a 37°C por 18-24 horas, se tomó una asada para sembrarla por la técnica

de estriación en agar Chromocult® (Merck, Alemania), al cual se le adicionó Cefotaxima (3mg/lt).

Posteriormente se incubó estas placas a 37°C por 18-24 horas. En caso de existir crecimiento de

colonias azul obscuro o azul violáceo (Figura 4), se realizó la prueba confirmatoria en agar Triple

Sugar Iron - TSI (Difco, USA), una reacción A/A (ácida/ácida) con presencia de gas (G).

Finalmente se tomaron 2 colonias de E. coli en TSI y se cultivaron en 300µl de caldo triptosa, se

incubaron a 37°C por 24 horas, posteriormente se agregó 600µl de glicerol para su congelación

y conservación a -80°C en tubos Eppendorf® y se almacenaron en el cepario de UNIETAR.

Figura 4: Colonia E. coli BLEE/AmpC en agar Chromocult®

31

4.3.5 PCR para detección de genes: blaCTX-M, blaSHV, blaTEM y blaCMY en Salmonella

y E. coli BLEE/AmpC

Para la determinación genotípica de resistencias hacia antibióticos β – lactámicos en E. coli

BLEE/AmpC se tomó de cada galpón positivo al aislamiento una sola muestra lo cual se enseña

en la (Tabla 13); mientras tanto para Salmonella se analizaron todas las muestras positivas como

se evidencia en la (Tabla 9).

En los aislados de Salmonella y E. coli BLEE/AmpC con fenotipos resistentes a cefotaxima, se

realizó la prueba de PCR para identificar los genes de resistencia pertenecientes a los grupos

blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY, para ello se utilizaron los primers descritos en la (Tabla 8).

Tabla 8: Secuencias primers para prueba PCR genes de resistencia blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY, temperatura

hibridación, tamaño amplicón, controles positivos, fuente

Temperatura Tamaño

amplicón

Controles

Fuente Gen Secuencias de Primers (5' a 3') hibridación Positivos

(pb)

blaCTX-M F ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC

62°C 600 TIAC 809 CTXM-25 Hasman et al.,

2005 R TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYSAGCGG TIAC 809A

blaTEM F GCGGAACCCCTATTTG

53°C 963 CTXM-2 TEM Olesen et al.,

2004 R ACCAATGCTTAATCAGTGAG CTXM-2 TEM A

blaSHV F TTATCTCCCTGTTAGCCACC

62°C 790 TIAC 361A Arlet et al.,

1997 R GATTTGCTGATTTCGCTCGG TIAC 361B

blaCMY F ATGATGAAAAAATCGTTATGCTGC

63°C 1138 TIAC 811A Kruger et al.,

2004 R GCTTTTCAAGAATGCGCCAGG TIAC 811B

Nota: “F” = forward primer; “R” = reverse primer; “pb” = pares bases; “A” = adenina; “G” = guanina;

“C” =citosina; “T” = timina

Los productos de la PCR o amplicones se analizaron mediante en la cámara de electroforesis

LABNET en gel de agarosa 1% (peso/volumen) que contiene SYBR SAFE® (1µl/10ml) en tampón

Tris-Borato EDTA (TBE). Se utilizó un marcador de tamaño molecular de ADN de 100pb (pares

bases).

32

Las bandas de ADN fueron observadas irradiando el gel de agarosa con un transiluminador de

luz UV (ENDUROTM, Labnet) a 302nm de longitud de onda. Las imágenes mostradas en el gel de

agarosa se guardaron mediante fotografías digitales, considerándose como positivo cuando el

tamaño de la banda del gen a diagnosticar fue similar al control positivo.

Los métodos de PCR simple para detección de los genes β – lactámicos: blaCTX-M, blaSHV, blaTEM

y blaCMY, así como los procedimientos de extracción de ADN, preparación de master mix y técnica

de electroforesis, se encuentran descritos por completo en el (Anexo H).

4.4 Técnicas de procesamiento y análisis de datos

Los datos y resultados derivados de la serotipificación de Salmonella, resistencia fenotípica hacia

los antibióticos probados y resistencia genotípica (genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY) y para

E. coli BLEE/AmpC los datos y resultados de resistencia genotípica (genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV,

blaCMY) y combinaciones de genes de resistencia obtenidos en las aves reproductoras pesadas

de las provincias de Napo y Pastaza, se ingresaron en una hoja de cálculo de Microsoft Excel

que facilitó la realización de las tablas dinámicas de datos para su análisis.

4.5 Análisis Estadístico

Se realizó una estadística básica descriptiva para determinar en Salmonella tasas (%) de:

aislamiento, serotipos, patrones de resistencia antibiótica, genes de resistencia y combinaciones

de genes de resistencia.

Para E. coli BLEE/AmpC se determinaron tasas (%) de: aislamiento, genes de resistencia y

combinaciones de genes de resistencia hacia antibióticos.

33

5 RESULTADOS

5.1 Salmonella

5.1.1 Resultados aislamiento Salmonella

Del total de 144 muestras tomadas en 8 granjas de reproductoras pesadas en las provincias de

Napo y Pastaza durante esta investigación, el 15,3% (n=22) resultaron positivas al aislamiento

de Salmonella. Entre las granjas el 62,5% (n=5) fueron positivas a Salmonella. (Tabla 9)

Tabla 9: Resultados del aislamiento Salmonella en granjas

GRANJAS MUESTRAS

CRIANZA GALPONES

1 2 3 4 5 6

A + - - - - - - - - - - - N/A N/A N/A

B + - - - - - + - - - - - N/A N/A N/A

C - - - - - - + + + - - - N/A N/A N/A

D + + + + + + + + - - + - N/A N/A N/A

PRODUCCION 1 2 3 4 5 6

E - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

F - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

H - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + - + + +

Nota: “+” = muestra positiva; “-” = muestra negativa; “N/A” = no aplica

5.1.2 Serotipos del género Salmonella

De las 22 muestras positivas a Salmonella, 22,7% (n=5) pertenecen al serotipo S. Infantis, el 0%

(n=0) a S. Typhimurium y el 0% (n=0) a S. Enteritidis, el resto de aislados no pudieron ser

identificados con la batería de antisueros disponibles (Tabla 10)

34

Tabla 10: Resultados serotipificación somática y flagelar aislados de Salmonella

ANTISUEROS SOMATICOS (O) ANTISUEROS FLAGELARES (H)

Código

Muestra

Poly

Poly A

A, B,

D, E1,

E4, L

Poly B

C1, C2,

F, G ,H

Grupo B Grupo C1 Grupo D1 S. Typhimurium S. Enteritidis S. Infantis SEROTIPO

A-I & Vi

Factor Factor Factor Factor Factor i

G

Complex m

Factor Factor r

1, 4, 5, 12 6, 7 1, 9, 12 1 2 1 5

A1 + - - - - - N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A



A31 + + - + N/A - - - - N/A N/A N/A N/A N/A N/A

A32 + + - - N/A + N/A N/A N/A - - N/A N/A N/A N/A






A41 + - + N/A + N/A N/A N/A N/A N/A N/A + + + S. Infantis












Nota: “+” = positivo; “-” = negativo; “N/A” = no aplica

35

5.1.3 Resistencia a los antimicrobianos de Salmonella

Del total de 22 aislados de Salmonella aisladas el 72,7% (n=16) presentan resistencia fenotípica

hacia alguna de las drogas antimicrobianas utilizadas en el estudio (Tabla 11).

Tabla 11: Patrones de resistencia antibiótica y genes de resistencia en aislados de Salmonella

No.

PATRON

PATRON

RESISTENCIA

No.

Antibióticos

Salmonella

Infantis

Salmonella

Grupo B

Salmonella

Grupo D

Salmonella

Grupos

A-I

Gen

No. aislados

1 TFEXSN 6 1 blaCTX-M (1)

2 TEXSN 5 4 blaCTX-M (4)

3 EX 2 4 blaCMY (4)

4 E 1 1 1 5

5 Ninguno 0 6

TOTAL 5 5 1 11

Nota: Ciprofloxacina (P), Tetraciclina (T), Fosfomicina (F), Estreptomicina (E), Cefotaxima (X),

Sulfamethoxazole Trimethoprim (S), Florfenicol (N)

Fenotípicamente del 100% (n=16) aislados de Salmonella que mostraron resistencia, 56,3% (n=9)

revelan resistencia a 2 o más antibióticos, es decir, tienen característica de multirresistencia. El

100% (n=5) de aislados de S. Infantis muestran resistencia a 2 o más antibióticos, así el 20%

(n=1) presenta resistencia al patrón de 6 antibióticos TFEXSN (tetraciclina, fosfomicina,

estreptomicina, cefotaxima, sulfamethoxazole trimethoprim, florfenicol) y el 80% (n=4) presentan

resistencia al patrón de 5 antibióticos TEXSN (tetraciclina, estreptomicina, cefotaxima,

sulfamethoxazole trimethoprim, florfenicol). De los 5 aislados de Salmonella grupo B, el 80% (n=4)

presenta resistencia al patrón EX (estreptomicina y cefotaxima) y el 20% (n=1) presenta

resistencia al patrón E (estreptomicina), el único aislado de Salmonella grupo D, 100% (n=1)

presenta resistencia al patrón E (estreptomicina). De los 11 aislados de Salmonella grupos A-I, el

45,5% (n=5) exhiben el patrón de resistencia E (estreptomicina) y el 63.6% (n=6) no muestran

resistencia a los patrones de antibióticos utilizados (Tabla 11).

36

Genotípicamente en el 100% (n=5) de aislados de S. Infantis, se identificó el gen blaCTX-M (Figura

5) y en el 80% (n=4) de aislados de Salmonella grupo B se mostró el gen blaCMY. Ninguno de los

aislados fue positivo por PCR hacia los genes blaTEM y blaSHV. No se mostraron combinaciones de

genes de resistencia en los aislados de Salmonella sometidos a PCR para identificación de genes

de resistencia (Tabla 11).

Figura 5: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de Salmonella

Nota: “pb” = pares de bases. Fragmento amplificado de 600 pares de bases

en gel de agarosa al 1%; MM = marcador molecular de ADN (100pb); muestras

42s, 43s, 44s = ADN cepas Salmonella; 38s, 39s, 40s = muestras negativas;

TIAC 809CTX-M-25 y TIAC 809A = controles positivos gen blaCTX-M;

NEG = control negativo.

Entre los aislados de S. Infantis, 100% (n=5) presentan resistencia hacia la tetraciclina,

estreptomicina, cefotaxima, sulfamethoxazole trimethoprim, florfenicol y el 20% (n=1) es

resistente a la fosfomicina; todos los aislados de S. Infantis 100% (n=5) muestran sensibilidad

hacia la ciprofloxacina. De los aislados de Salmonella grupo B, el 100% (n=5), presentan

resistencia a estreptomicina y 80% (n=4) es resistente a la cefotaxima. El único aislado de

Salmonella grupo B es resistente a la estreptomicina. Entre los 11 aislados de Salmonella grupos

A-I, 45,5% (n=5) presentan resistencia a la estreptomicina (Tabla 12).

MM

M

600pb 500pb

37

Tabla 12: Aislados de Salmonella resistentes a cada antibiótico utilizado en la

investigación

Número (%) de aislados resistentes

ANTIBIOTICO Salmonella

Infantis

Salmonella

Grupo B

Salmonella

Grupo D

Salmonella

Grupos

A-I

Ciprofloxacina

Tetraciclina 5 (100,0%)

Fosfomicina 1 (20,0%)

Estreptomicina 5 (100,0%) 5 (100,0%) 1 (100,0%) 5 (45,5%)

Cefotaxima 5 (100,0%) 4 (80,0%)

Sulfamethoxazole

Trimethoprim 5 (100,0%)

Florfenicol 5 (100,0%)

5.2 Escherichia coli

5.2.1 Resultados aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC

Del total de 144 muestras tomadas en 8 granjas de reproductoras pesadas en las provincias de

Napo y Pastaza durante esta investigación, el 78,5% (n=113) resultaron positivas para E. coli

BLEE/AmpC (Tabla 13)

38

Tabla 13: Resultados muestras para aislamiento Escherichia coli BLEE/AmpC en granjas

GRANJAS MUESTRAS

CRIANZA GALPONES

1 2 3 4 5 6

A + + + + + + + + + + + + N/A N/A N/A

B + + + + + + + + + + + + N/A N/A N/A

C + + + + + + + + + + + + N/A N/A N/A

D + + + + + + + + + + + + N/A N/A N/A

PRODUCCION 1 2 3 4 5 6

E + + - + - - + + + + + + - + - - - - - - - - + +

F - - - - + + + + + - - + + - - - - - - + + - - +

G + + - + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + +

H + + + + + + + + + + + + + + - - + + - + + + + +

Nota: “+” = muestra positiva; “-” = muestra negativa; “N/A” = no aplica.

5.2.2 Resistencia genotípica cepas Escherichia coli BLEE/AmpC

Se sometieron a la prueba de PCR a 34 aislados de E. coli BLEE/AmpC, para determinar la

presencia de genes de resistencia de los grupos: blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaCMY. Así, se identificó

genes de resistencia en el 97,1% (n=33) de los aislados (Tabla 14, 15 y Figura 6).

Tabla 14: Tasas y número de genes de los grupos blaCTX-M, blaTEM, blaSHV,

blaCMY en aislados de E. coli BLEE/AmpC, detectados mediante prueba de

PCR

AISLADOS No.

cepas

Gen

blaCTX-M

Gen

blaSHV

Gen

blaTEM

Gen

blaCMY

E. coli 26 8/26

(30,8%)

1/26

(3,8%)

0/26

(0%)

17/26

(65,4%)

39

Figura 6: Amplificación por PCR gen blaCTX-M en 6 aislados de E. coli BLEE/AmpC

Nota: “pb” = pares de bases. Fragmento amplificado de 600 pares de

bases en gel de agarosa al 1%; MM = marcador molecular de ADN (100pb);

muestras 1eb, 5eb = ADN cepas E. coli BLEE/AmpC; 2eb, 3eb, 4eb,

6eb = muestras negativas; TIAC 809CTX-M-25 = control positivo gen

blaCTX-M; NEG = control negativo.

Tabla 15: Tasas de combinaciones de genes de resistencia encontradas

en aislados de E. coli BLEE/AmpC

AISLADOS No.

cepas

blaCTX-M +

blaTEM

blaTEM +

blaSHV

blaTEM +

blaCMY

blaCTX-M

+

blaTEM

+

blaCMY

E. coli 7 3/7

(42,6%)

2/7

(28,6%)

1/7

(14,3%)

1/7

(14,3%)

MM

MM

MM

jkjkl

jlkjl

kjlkj

kljkl

jlkjl

kjlk

500pb 600pb

40

6 DISCUSION

Esta investigación es la primera realizada en aves reproductoras pesadas enfocadas al

aislamiento y serotipificación de Salmonella y para la detección de E. coli BLEE/AmpC, y la

identificación de genes de resistencia BLEE/AmpC en estas bacterias en Ecuador.

Los resultados indican que 15,3% de las muestras de cama provenientes de granjas de

reproductoras pesadas en las provincias de Napo y Pastaza son positivas a Salmonella. Esto

difiere con lo reportado por los 25 países miembros de la UE y 3 no miembros mediante los

programas nacionales de control de Salmonella. Así, se obtuvo en 2015 una prevalencia de 1,4%

y de 1,5% en 2016 para lotes de reproductoras positivos a Salmonella (EFSA & ECDC, 2017).

Esta diferencia podría explicarse por los exigentes programas de control y vigilancia del patógeno

a nivel de la UE. Adicionalmente, hay que tomar en cuenta que nuestro estudio solo abarcó 2

provincias en nuestro país. No obstante, este índice concuerda con lo reportado en granjas de

pollos broiler en Ecuador por Vinueza-Burgos et al. (2016). Dicho estudio encontró 15,9% de lotes

positivos a Salmonella. También coinciden con investigaciones en Brasil hechas por Gelinski et

al. (2014); Giombelli y Abreu (2014) quienes reportaron 27,0% (n=77) y 26,6% (n=200) de

muestras positivas a Salmonella respectivamente.

Sin embargo, otros estudios realizados en integraciones avícolas en Ecuador por Haro, (2016);

Villagómez et al., (2017) han reportado prevalencias superiores. Esta diferencia podría deberse

al bajo número de muestras tomadas en estas dos últimas investigaciones.

También hay que mencionar que en esta investigación la cantidad de granjas que tuvieron por lo

menos una muestra positiva fue del 62,5%. Para confirmar esta tendencia en las granjas de

reproductoras en Ecuador, debería realizarse estudios complementarios.

S. Infantis fue el único serovar identificado con el 3,5%. Esto difiere de los datos reportados por

la UE en 2016 para lotes de reproductoras, siendo el serovar más encontrado S. Enteritidis con

una prevalencia de 0,3%, seguido de S. Typhimurium con 0,12% (EFSA & ECDC, 2017). En este

reporte la prevalencia de S. Infantis es del 0.1% (EFSA & ECDC, 2017). Es importante mencionar

que S. Infantis es el serotipo más reportado en el sector avícola en otras investigaciones en

Ecuador (Villagómez Estrada, 2015; Vinueza-Burgos et al., 2016; Haro, 2016; Villagómez Estrada

et al., 2016). Estas observaciones también se han reportado fuera de Ecuador continental en un

41

estudio en el que se identificó que el 71,4% de los aislados de Salmonella correspondieron al

serovar Infantis en las islas Galápagos (Cushicóndor, 2017). Todo esto nos hace tener en cuenta

que S. Infantis está ampliamente distribuida en nuestro país.

En esta investigación también se constató que los aislados de Salmonella tuvieron importantes

perfiles de resistencia a los antimicrobianos. Así, S. Infantis presentó perfiles de multiresistencia

hacia antibióticos comúnmente utilizados en la industria avícola. Esto coincide en gran parte con

el estudio realizado en broilers por Vinueza-Burgos et al., (2016) quienes reportaron resistencia

en cepas de S. Infantis hacia sulfamethoxazole el 98,1% (n=51), tetraciclina el 94,2% (n=49),

trimethoprim el 90,4% (n=47), estreptomicina el 90,4% (n=47), cefotaxima el 80,8% (n=42) y

florfenicol el 76,9% (n=40). En otro reporte Guerrero Ibarra (2017), indica multiresistencia en el

100% (n=6) cepas de S. Infantis de origen aviar.

Fenotipos de multiresistencia hacia los antibióticos en Salmonella también han sido reportados

en América Latina. Así, en Perú, Cruz Marruffo (2016) los identificó en aislados de S. Infantis de

origen aviar. En Colombia, se reportaron altos grados de resistencia a múltiples fármacos en

aislados de Salmonella (Donado-Godoy et al., 2015). Estas observaciones también se han

alcanzado en otros continentes en investigaciones que han reportado pormenorizadamente las

bases genéticas de estas resistencias (Tate et al., 2017; Franco et al., 2015). Así, en Serbia se

obtuvo multiresistencia en el 69% (n=20) aislados aviares de S. Infantis (Kalaba et al., 2017).

Los genes identificados en cepas de Salmonella aisladas de reproductoras pesadas fueron:

blaCTX-M en el 100% (n=5) en aislados de S. Infantis, mientras que y el gen blaCMY estuvo presente

en el 100% (n=4) de aislados Salmonella grupo B. Esto coincide con lo investigado en Ecuador

por Vinueza-Burgos et al (2016) quien identificó en broilers el gen blaCTX-M en 33 cepas de S.

Infantis. En Brasil, Fitch et al (2016) identificó en broilers múltiples genes de resistencia hacia β

– lactámicos en aislados de Salmonella incluyendo blaCTX-M, blaCMY y blaTEM. En USA, Wittum et al

(2012) identificó en pavos el gen blaCTX-M, el cual fue el primer reporte de presencia de genes de

resistencia en ese país. En Holanda, Hasman et al (2005) reportó en broilers al gen blaTEM, como

el más frecuente después del gen blaCTX-M.

En S. Infantis predomina el gen blaCTX-M, estudios realizados en USA y Europa han demostrado

que uno de los genes de esta familia en S. Infantis es blaCTX-M-65 (Tate et al., 2017; Franco et al.,

2015). El carácter epidemiológico de esta familia de genes es de gran importancia por lo cual se

debería tipificar los genes de esta familia como próximos pasos de esta investigación.

42

Adicionalmente 4 aislados de Salmonella fueron positivos al gen blaCMY, que también fue

identificado de forma especialmente prevalente en aislados de E. coli BLEE/AmpC en esta

investigación. Estos hallazgos son similares a los reportados por Castellanos et al (2017) en

Colombia, pero difieren de observaciones hechas en pollos broiler de Ecuador (Vinueza-Burgos

et al., 2017). La epidemiologia del gen blaCMY en granjas de reproductoras pesadas debe der

esclarecida con muestreos en mayor número de granjas y empresas, con el fin de encontrar una

posible correlación epidemiológica con los datos reportados en pollos broilers.

La alta prevalencia de E. coli BLEE/AmpC (78,5%) en este estudio concuerda con estudios

anteriores (Vinueza y De Zutter, 2017; Janón González, 2016; Vásconez, 2014). Altas

prevalencias de estos fenotipos también han sido reportadas en otros países de Europa, y

América (Castellanos et al., 2017; Blaak et al., 2015; Huijbers et al., 2014;; Dierikx et al., 2012;

Costa et al., 2009; Girlich et al., 2007). Estos reportes reafirman las observaciones que evidencias

que estas resistencias son especialmente altas en pollos broilers

Al analizar los datos de genotipificación de genes de resistencia también se pudieron observar

varias combinaciones de genes que podrían determinar la característica fenotípica de resistencia

a los antibióticos beta lactámicos. Estas características también se han observado en otros

estudios realizados en Ecuador (Vinueza y De Zutter, 2017; Narváez Manosalvas, 2015). La

identificación específica de estos genes permitirá establecer la epidemiología de estas

características en las bacterias estudiadas.

Es de importancia resaltar que los antibióticos hacia los cuales se encontró resistencia en las

bacterias estudiadas están incluidos en la lista de antimicrobianos críticos para uso humano

categorizados como de máxima prioridad (OMS, 2017). Por lo tanto, se requiere más

investigaciones para identificar la epidemiologia de las resistencias en granjas de reproductoras

pesadas en un concepto de una sola salud. Por otro lado, hay antimicrobianos que no se utilizan

en la industria avícola para los que se han reportado resistencias en este estudio. El origen de

estas resistencias podría estar ligado a factores medioambientales que deberían ser estudiados

a profundidad en el futuro.

43

7 CONCLUSIONES

Esta investigación proporciona el primer reporte de la presencia de Salmonella y E. coli

BLEE/AmpC obtenidas en las granjas de reproductoras pesadas en Ecuador.

La prevalencia de Salmonella y E. coli BLEE/ AmpC encontrada en aves reproductoras pesadas

fue menor a las reportadas en broilers.

Se comprobó en todos los aislados de S. Infantis tienen altos fenotipos de resistencia a los

antibióticos.

El gen de resistencia blaCTX-M, fue el mayormente identificado en aislados de Salmonella, mientras

que en E. coli BLEE/ AmpC el gen más prevalente fue blaCMY.

La mayoría de los aislados de E. coli BLEE/AmpC presentan varios genes de resistencia hacia

antibióticos β – lactámicos.

44

8 RECOMENDACIONES

Valorar los riesgos hallados en esta investigación para evaluar una posible transmisión vertical

de S. Infantis.

Serotipificar los aislados de Salmonella que fueron halladas en este estudio como pertenecientes

a los grupos B y D.

Identificar los patrones fenotípicos de resistencia de los aislados de E. coli BLEE/AmpC de este

estudio e identificar los genes específicos dentro de las familias de genes de resistencia

encontradas.

.

45

BIBLIOGRAFIA

(ESCMID), E. C. for A. S. T. (EUCAST) of the E. S. of C. M. and I. D. (2003). Determination of

minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth dilution. Clinical

Microbiology and Infection, 9(8), ix-xv. https://doi.org/10.1046/j.1469-0691.2003.00790.x

Abreu, R., Castro-Hernández, B., Madueño, A., Espigares-Rodríguez, E., Moreno-Roldán, E.,

Moreno, P., … Arias, A. (2013). Prevalencia de cepas de Escherichia coli productoras de

betalactamasas de espectro extendido (BLEE) aislada s en pollos de granjas avícolas de la isla

de Tenerife (España). Higiene y Sanidad Ambiental, 13(4), 1091-1096. Recuperado de

http://www.salud-

publica.es/secciones/revista/revistaspdf/bc51e2d02dc4c01_Hig.Sanid.Ambient.13.(4).1091-

1096.(2013).pdf

Aguilar-Zapata, D. (2016). E. coli BLEE, la enterobacteria que ha atravesado barreras. Médica

Sur, 22(2), 57-63. Recuperado de http://www.medigraphic.com/pdfs/medsur/ms-

2015/ms152b.pdf

Alós, J. I. (2015). Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis global. Enfermedades

Infecciosas y Microbiologia Clinica, 33(10), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1016/j.eimc.2014.10.004

Andrews, J. M. (2001). Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of

antimicrobial Chemotherapy, 48(suppl_1), 5-16. https://doi.org/10.1093/jac/48.suppl_1.5

Ao, T. T., Feasey, N. A., Gordon, M. A., Keddy, K. H., Angulo, F. J., & Crump, J. A. (2015). Global

burden of invasive nontyphoidal Salmonella disease, 2010(1). Emerging infectious diseases,

21(6). https://doi.org/10.3201/eid2106.140999

Ariza Suárez, R. A., & Naranjo Espinosa, A. B. (2017). Evaluación de patogenicidad y uso de

bacteriófagos líticos como biocontrol de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis

en aves de corral. Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE. Carrera de Ingeniería en

Biotecnología. Recuperado de http://repositorio.espe.edu.ec/handle/21000/12927

Arlet, G., Barrett, T. J., Butaye, P., Cloeckaert, A., Mulvey, M. R., & White, D. G. (2006).

Salmonella resistant to extended-spectrum cephalosporins: prevalence and epidemiology.

Microbes and Infection, 8(7), 1945-1954. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2005.12.029

https://doi.org/10.1046/j.1469-0691.2003.00790.x

http://www.salud-publica.es/secciones/revista/revistaspdf/bc51e2d02dc4c01_Hig.Sanid.Ambient.13.(4).1091-1096.(2013).pdf



http://www.medigraphic.com/pdfs/medsur/ms-2015/ms152b.pdf

http://www.medigraphic.com/pdfs/medsur/ms-2015/ms152b.pdf

https://doi.org/10.1016/j.eimc.2014.10.004

https://doi.org/10.1093/jac/48.suppl_1.5

https://doi.org/10.3201/eid2106.140999

http://repositorio.espe.edu.ec/handle/21000/12927

https://doi.org/10.1016/j.micinf.2005.12.029

46

Barnaud, G., Arlet, G., Verdet, C., Gaillot, O., Lagrange, P. H., & Philippon, A. (1998). Salmonella

enteritidis: AmpC Plasmid-Mediated Inducible β-Lactamase (DHA-1) with anampR Gene from

Morganella morganii. American Society for Microbiology, 42(9), 2352-2358.

https://doi.org/10.1128/AAC.42.9.2352

Barreto, M., Castillo-Ruiz, M., & Retamal, P. (2016). Salmonella enterica: una revisión de la trilogía

agente, hospedero y ambiente, y su trascendencia en Chile. Revista chilena de infectología.

scielocl. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182016000500010

Blaak, H., van Hoek, A. H. A. M., Hamidjaja, R. A., van der Plaats, R. Q. J., Kerkhof-de Heer, L.,

de Roda Husman, A. M., & Schets, F. M. (2015). Distribution, numbers, and diversity of ESBL-

producing E. coli in the poultry farm environment. PLoS One, 10(8), e0135402. Recuperado de

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135402

Bonomo, R. A. (2017). β-Lactamases: a focus on current challenges. Cold Spring Harbor

perspectives in medicine, 7(1), a025239. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a025239

Borie, C., Zurita, P., Sánchez, M. L., Rojas, V., Santander, J., & Robeson, J. (2008). Prevención

de la infección por Salmonella enterica subespecie enterica serotipo Enteritidis (Salmonella

Enteritidis) en pollos mediante un bacteriófago. Archivos de medicina veterinaria, 40(2), 197-201.

https://doi.org/http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X2008000200013

Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate, S. (2011). Métodos de

identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica, 29(8), 601-608. https://doi.org/doi:10.1016/j.eimc.2011.03.012

Bradford, P. (2001). Extended spectrum betalactamase in the 21 century: characterization,

epidemiology, and detection of this important resistant threat. Clinical Microbiol Rev, 14(4), Webb,

H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,. https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.933

Braykov, N. P., Eisenberg, J. N. S., Grossman, M., Zhang, L., Vasco, K., Cevallos, W., … Levy,

K. (2016). Antibiotic Resistance in Animal and Environmental Samples Associated with Small-

Scale Poultry Farming in Northwestern Ecuador. mSphere, 1(1).

https://doi.org/10.1128/mSphere.00021-15

https://doi.org/10.1128/AAC.42.9.2352

https://doi.org/http:/dx.doi.org/10.4067/S0716-10182016000500010


https://doi.org/10.1101/cshperspect.a025239

https://doi.org/http:/dx.doi.org/10.4067/S0301-732X2008000200013

https://doi.org/doi:10.1016/j.eimc.2011.03.012

https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.933

https://doi.org/10.1128/mSphere.00021-15

47

Brower, C. H., Mandal, S., Hayer, S., Sran, M., Zehra, A., Patel, S. J., … Das, B. R. (2017). The

prevalence of extended-spectrum beta-lactamase-producing multidrug-resistant Escherichia coli

in poultry chickens and variation according to farming practices in Punjab, India. Environmental

health perspectives, 125(7). https://doi.org/https://dx.doi.org/10.1289%2FEHP292

Buhr, R. J., Richardson, L. J., Cason, J. A., Cox, N. A., & Fairchild, B. D. (2007). Comparison of

four sampling methods for the detection of Salmonella in broiler litter. Poultry science, 86(1), 21-

25. https://doi.org/https://doi.org/10.1093/ps/86.1.21

Buitrago, J. D. R., Suárez, M. C., & Uribe, C. (2006). Susceptibilidad antimicrobiana in vitro de

cepas de Salmonella spp. en granjas de ponedoras comerciales del departamento de Antioquia.

Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 19(3), 297-305.

Bush, K. (2018). Past and Present Perspectives on β-Lactamases. Antimicrobial agents and

chemotherapy, AAC-01076. https://doi.org/10.1128/AAC.01076-18

Bush, K., & Jacoby, G. A. (2010). Updated functional classification of β-lactamasas. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, 54(3), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1128/AAC.01009-09

Castellanos, L. R., Donado-Godoy, P., León, M., Clavijo, V., Arevalo, A., Bernal, J. F., … Hordijk,

J. (2017). High heterogeneity of Escherichia coli sequence types harbouring ESBL/AmpC genes

on IncI1 plasmids in the Colombian poultry chain. PloS One, 12(1), e0170777. Retrieved from


Carrique-Mas, JJ, & Davies, RH. (2008). Salmonella Enteritidis in commercial layer flocks in

Europe: legislative background, on-farm sampling and main challenges. Brazilian Journal of

Poultry Science, 10(1), 1-9. https://dx.doi.org/10.1590/S1516-635X2008000100001

Chiou, C. S., Huang, J. F., Tsai, L. H., Hsu, K. M., Liao, C. S., & Chang, H. L. (2006). A simple

and low-cost paper-bridged method for Salmonella phase reversal. Diagnostic Microbiology and

Infectious Disease, 54(4), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2005.10.009

Chuma, T., Miyasako, D., Dahshan, H., Takayama, T., Nakamoto, Y., Shahada, F., … Okamoto,

K. (2013). Chronological change of resistance to β-lactams in Salmonella enterica serovar Infantis

isolated from broilers in Japan. Frontiers in Microbiology, 4(MAY), Webb, H. E., Granier, S. A.,

Mrult, M., Millemann,. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00113

https://doi.org/https:/dx.doi.org/10.1289%2FEHP292

https://doi.org/https:/doi.org/10.1093/ps/86.1.21

https://doi.org/10.1128/AAC.01076-18

https://doi.org/10.1128/AAC.01009-09


https://dx.doi.org/10.1590/S1516-635X2008000100001

https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2005.10.009

https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00113

48

Chumbi Zumba, C. A. (2017). Determinación de la presencia de Salmonella spp. en huevos de

gallina de traspatio comercializados en la ciudad de Loja. Loja: Universidad Nacional de Loja.

Recuperado de http://dspace.unl.edu.ec/jspui/handle/123456789/18470

CLSI, (2014). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, Clinical and

Laboratory Standard Institute. CLSI document, Wayne, PA, pp. M100–S124.

CLSI, (2017). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, Clinical and

Laboratory Standard Institute, 27 Edition.

CONAVE, (2013). Estadísticas avícolas.

http://www.conave.org/upload/informacion/Estadisticas%20avicolas.pdf

Cosby, D. E., Cox, N. A., Harrison, M. A., Wilson, J. L., Buhr, R. J., & Fedorka-Cray, P. J. (2015).

Salmonella and antimicrobial resistance in broilers: a review. Journal of Applied Poultry Research,

24(3), 408-426. http://dx.doi.org/10.3382/japr/pfv038

Costa, D., Vinué, L., Poeta, P., Coelho, A. C., Matos, M., Sáenz, Y., … Torres, C. (2009).

Prevalence of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli isolates in faecal

samples of broilers. Veterinary Microbiology, 138(3–4), 339–344. Retrieved from

https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.03.029

Cruz Marruffo, C. G. (2016). Sensibilidad antimicrobiana en cepas de Salmonella sp. de

importancia en salud pública. Recuperado de http://repositorio.urp.edu.pe/handle/urp/905

Cushicóndor D. (2017). Análisis de similitud genética y resistencia a los antibióticos β-lactámicos

y colistina en serotipos del género Salmonella procedentes de granjas de pollos de engorde en

Galápagos, Ecuador.

https://docs.wixstatic.com/ugd/b341b6_1bebed5870c34ff9bb701d48690d5a2c.pdf

Dallenne, C., Da Costa, A., Decré, D., Favier, C., & Arlet, G. (2010). Development of a set of

multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important β-lactamases in

Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65(3), 490-495.

https://doi.org/10.1093/jac/dkp498

Delgado Fernández, R. (2015). Peculiaridad de la clasificación taxonómica y nomenclatura del

género Salmonella. Acta del Centro Médico, 9(4), 73-75. Recuperado de

http://www.revactamedicacentro.sld.cu/

http://dspace.unl.edu.ec/jspui/handle/123456789/18470

http://www.conave.org/upload/informacion/Estadisticas%20avicolas.pdf

http://dx.doi.org/10.3382/japr/pfv038


http://repositorio.urp.edu.pe/handle/urp/905





https://doi.org/10.1093/jac/dkp498

http://www.revactamedicacentro.sld.cu/

49

Dierikx, C., van der Goot, J., Fabri, T., van Essen-Zandbergen, A., Smith, H., & Mevius, D. (2012).

Extended-spectrum-β-lactamase and AmpC-β-lactamase producing Escherichia coli in Dutch

broilers and broiler farmers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 68(1), 60-67. Recuperado de

https://doi.org/10.1093/jac/dks349

Drawz, S. M., & Bonomo, R. A. (2010). Three decades of β-lactamase inhibitors. Clinical

microbiology reviews, 23(1), 160-201. https://doi.org/10.1128/CMR.00037-09

Drawz, S. M., Papp-Wallace, K. M., & Bonomo, R. A. (2014). New β-lactamase inhibitors: a

therapeutic renaissance in an MDR world. Antimicrobial agents and chemotherapy, 58(4), 1835-

1846. https://doi.org/10.1128/AAC.00826-13

Donado-Godoy, P., Byrne, B. A., León, M., Castellanos, R., Vanegas, C., Coral, A., … Smith, W.

A. (2015). Prevalence, resistance patterns, and risk factors for antimicrobial resistance in bacteria

from retail chicken meat in Colombia. Journal of Food Protection, 78(4), Webb, H. E., Granier, S.

A., Mrult, M., Millemann,. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-14-349

EFSA, (European Food Safety Authorty), & ECDC, (European Centre for Disease Prevention and

Control). (2017). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses,

zoonotic agents and food‐borne outbreaks in 2016. EFSA Journal (Vol. 15). Wiley Online Library.

https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.5077

EUCAST, (European Committee on Antimicrobial Susceptibilty Testing). (2017). Data from the

EUCAST MIC distribution website. Obtenido de

https://mic.eucast.org/Eucast2/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=

0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=-1&Specium=16

Ewers, C., Janßen, T., Kießling, S., Philipp, H. C., & Wieler, L. H. (2004). Molecular epidemiology

of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from colisepticemia in poultry. Veterinary

microbiology, 104(1-2), 91-101. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2004.09.008

Farrokhnazar, E., Bidhendi, S. M., & Karimi, S. (2016). Prevalence of AmpC type extended

spectrum beta lactamases genes in clinical Samples of E. coli Isolated from Poultry and Humans.

International Journal of Medical Research and Health Sciences, 5(7), 83-93. Recuperado de

https://www.ijmrhs.com/medical-research/prevalence-of-ampc-type-extended-spectrum-beta-

lactamases-genes-in-clinical-samples-of-ecoli-isolated-from-poultry-and-h.pdf

https://doi.org/10.1093/jac/dks349

https://doi.org/10.1128/CMR.00037-09

https://doi.org/10.1128/AAC.00826-13

https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-14-349

https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.5077

https://mic.eucast.org/Eucast2/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=-1&Specium=16

https://mic.eucast.org/Eucast2/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=-1&Specium=16


https://www.ijmrhs.com/medical-research/prevalence-of-ampc-type-extended-spectrum-beta-lactamases-genes-in-clinical-samples-of-ecoli-isolated-from-poultry-and-h.pdf

https://www.ijmrhs.com/medical-research/prevalence-of-ampc-type-extended-spectrum-beta-lactamases-genes-in-clinical-samples-of-ecoli-isolated-from-poultry-and-h.pdf

50

Fiorentin, L., Vieira, N. D., & Barioni Jr, W. (2005). Oral treatment with bacteriophages reduces

the concentration of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contents of broilers. Avian pathology,

34(3), 258-263. https://doi.org/https://doi.org/10.1080/01445340500112157

Franco, A., Leekitcharoenphon, P., Feltrin, F., Alba, P., Cordaro, G., Iurescia, M., … Battisti, A.

(2015). Emergence of a Clonal Lineage of Multidrug-Resistant ESBL-Producing Salmonella

Infantis Transmitted from Broilers and Broiler Meat to Humans in Italy between 2011 and 2014.

PLoS ONE, 10(12), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.


Fitch, F. M., Carmo-Rodrigues, M. S., Oliveira, V. G. S., Gaspari, M. V., dos Santos, A., de Freitas,

J. B., & Pignatari, A. C. C. (2016). β-Lactam resistance genes: characterization, epidemiology,

and first detection of bla CTX-M-1 and bla CTX-M-14 in Salmonella spp. Isolated from Poultry in

Brazil—Brazil Ministry of Agriculture’s Pathogen Reduction Program. Microbial drug resistance,

22(2), 164-171. Recuperado de https://doi.org/10.1089/mdr.2015.0143

Furtula, V., Farrell, E. G., Diarrassouba, F., Rempel, H., Pritchard, J., & Diarra, M. S. (2010).

Veterinary pharmaceuticals and antibiotic resistance of Escherichia coli isolates in poultry litter

from commercial farms and controlled feeding trials. Poultry Science, 89(1), 180-188.

https://doi.org/10.3382/ps.2009-00198

García-Hernández, A. M., García-Vázquez, E., Hernández-Torres, A., Ruiz, J., Yagüe, G.,

Herrero, J. A., & Gómez, J. (2011). Bacteriemias por Escherichia coli productor de betalactamasas

de espectro extendido (BLEE): significación clínica y perspectivas actuales. Revista española de

quimioterapia, 24(2). Recuperado de http://www.seq.es/seq/0214-3429/24/2/garcia.pdf

Gelinski, J., Bombassaro, A., Baratto, C., & Vicente, V. (2014). Resistance to Extended-Spectrum

β-Lactamases in Salmonella from a Broiler Supply Chain. International Journal of Environmental

Research and Public Health, 11(11), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.3390/ijerph111111718

Ghafourian, S., 1, 2, Sadeghifard, N., 1, Soheili, S., 2, & Sekawi*, Z. (2015). Extended Spectrum

Beta-lactamases: Definition, Classification and Epidemiology.

https://doi.org/http://dx.doi.org/10.21775/cimb.017.011

https://doi.org/https:/doi.org/10.1080/01445340500112157


https://doi.org/10.1089/mdr.2015.0143

https://doi.org/10.3382/ps.2009-00198

http://www.seq.es/seq/0214-3429/24/2/garcia.pdf

https://doi.org/10.3390/ijerph111111718

https://doi.org/http:/dx.doi.org/10.21775/cimb.017.011

51

Gil-Setas, A., Mazón Ramos, A., Martín Salas, C., Urtiaga Domínguez, M., & Inza Elia, M. (2002).

Salmonelosis no tifoidea en un área de salud de Navarra, España. Revista española de salud

pública, 76(1), 49-56. Recuperado de

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1135-

57272002000100006&lng=es&tlng=es.

Giombelli, A., & Abreu, M. B. (2014). Prevalence of Salmonella and Campylobacter on Broiler

Chickens from Farm to Slaughter and Efficiency of Methods To Remove Visible Fecal

Contamination. Journal of Food Protection, 77(11), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M.,

Millemann,. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-14-200

Giovanardi, D., Campagnari, E., Ruffoni, L. S., Pesente, P., Ortali, G., & Furlattini, V. (2005). Avian

pathogenic Escherichia coli transmission from broiler breeders to their progeny in an integrated

poultry production chain. Avian Pathology, 34(4), 313-318.

https://doi.org/10.1080/03079450500179046

Girlich, D., Poirel, L., Carattoli, A., Kempf, I., Lartigue, M.-F., Bertini, A., & Nordmann, P. (2007).

Extended-spectrum β-lactamase CTX-M-1 in Escherichia coli isolates from healthy poultry in

France. Applied and environmental microbiology, 73(14), 4681-4685.

https://doi.org/10.1128/AEM.02491-06

Gómez Vega, E. (2013). Identificación de cepas de Salmonella spp resistentes a antimicrobianos,

y factores de riesgo para su circulación, en aves y cerdos mantenidos en sistemas productivos

de traspatio de la región del libertador general Bernardo O’Higgins, Chile. Santiago: Universidad

de Chile. Recuperado de http://repositorio.educacionsuperior.gob.ec/handle/28000/1445

González, R. ., Tamagnini, L. ., Olmos, P. ., & de Sousa, G. . (2003). Evaluation of a chromogenic

medium for total coliforms and Escherichia coli determination in ready-to-eat foods. Food

Microbiology, 20(5), 601-604. https://doi.org/10.1016/S0740-0020(02)00178-8

Guerrero Ibarra, D. G. (2017). Salmonella Infantis, resistencia a quinolonas y su relación clonal

entre aislamientos de humanos y aves de corral en el periodo 2014-2016. Quito: UCE.

Recuperado de http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/12811

Hafez, H. M. (2014). Zoonotic Diseases of Poultry: Never ending story. BİLDİRİLER KİTABI, 3.

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-017-9457-2_4

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1135-57272002000100006&lng=es&tlng=es

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1135-57272002000100006&lng=es&tlng=es

https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-14-200

https://doi.org/10.1080/03079450500179046

https://doi.org/10.1128/AEM.02491-06

http://repositorio.educacionsuperior.gob.ec/handle/28000/1445

https://doi.org/10.1016/S0740-0020(02)00178-8

http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/12811

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-017-9457-2_4

52

Hasman, H., Mevius, D., Veldman, K., Olesen, I., & Aarestrup, F. M. (2005). β-Lactamases among

extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-resistant Salmonella from poultry, poultry products and

human patients in The Netherlands. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 56(1), Webb, H. E.,

Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,. https://doi.org/10.1093/jac/dki190

Haro, M. (2016). AISLAMIENTO Y SEROTIPIFICACIÓN DE Salmonella Enteritidis, Typhimurium

e Infantis, EN UN SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE POLLOS DE ENGORDE.

HERRERA, B. Y., & JABIB, R. L. (2015). Salmonelosis, zoonosis de las aves y una patogenia

muy particular. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria, 16(1), 1-19. Recuperado de

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010115/%0A011504.pdf

Hsieh, Y.-C., Poole, T. L., Runyon, M., Hume, M., & Herrman, T. J. (2016). Prevalence of

Nontyphoidal Salmonella and Salmonella Strains with Conjugative Antimicrobial-Resistant

Serovars Contaminating Animal Feed in Texas. Journal of food protection, 79(2), 194-204.

https://doi.org/https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-15-163

Hudzicki, J. (2009). Kirby-Bauer disk diffusion susceptibility test protocol. American Society for

Microbiology. Recuperado de

http://www.asmscience.org/docserver/fulltext/education/protocol/protocol.3189.pdf?expires=153

7905582&id=id&accname=guest&checksum=7DC0EC2741100C14E82FCA92F74E2ED9

Huijbers, P. M. C., Graat, E. A. M., Haenen, A. P. J., van Santen, M. G., van Essen-Zandbergen,

A., Mevius, D. J., … van Hoek, A. H. A. M. (2014). Extended-spectrum and AmpC β-lactamase-

producing Escherichia coli in broilers and people living and/or working on broiler farms:

prevalence, risk factors and molecular characteristics. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,

69(10), 2669-2675. Recuperado de http://dx.doi.org/10.1093/jac/dku178

INEN, (2009). Control Microbiológico de los alimentos. Salmonella. Método de detección. Norma

técnica ecuatoriana, NTE INEN 1529-15:2009, primera edición.

https://ia801903.us.archive.org/21/items/ec.nte.1529.15.1996/ec.nte.1529.15.1996.pdf

Jacoby, G. A. (2009). AmpC β-lactamases. Clinical microbiology reviews, 22(1), 161-182.

https://doi.org/10.1128/CMR.00036-08

Janon González, D. S. (2016). Determinación fenotípica de cepas de Escherichia coli resistente

a betalactámicos, por la técnica de doble disco, en pollos faenados en seis camales industriales

de la provincia de Pichincha. Quito: UCE. Recuperado de


https://doi.org/10.1093/jac/dki190

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010115/%0A011504.pdf

https://doi.org/https:/doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-15-163

http://www.asmscience.org/docserver/fulltext/education/protocol/protocol.3189.pdf?expires=1537905582&id=id&accname=guest&checksum=7DC0EC2741100C14E82FCA92F74E2ED9

http://www.asmscience.org/docserver/fulltext/education/protocol/protocol.3189.pdf?expires=1537905582&id=id&accname=guest&checksum=7DC0EC2741100C14E82FCA92F74E2ED9

http://dx.doi.org/10.1093/jac/dku178

https://ia801903.us.archive.org/21/items/ec.nte.1529.15.1996/ec.nte.1529.15.1996.pdf

https://doi.org/10.1128/CMR.00036-08


53

Kalaba, V., Golić, B., Sladojević, Ž., & Kalaba, D. (2017). Incidence of Salmonella Infantis in

poultry meat and products and the resistance of isolates to antimicrobials. IOP Conference Series:

Earth and Environmental Science, 85(1), 1-9. https://doi.org/10.1088/1755-1315/85/1/012082

Kar, D., Bandyopadhyay, S., Bhattacharyya, D., Samanta, I., Mahanti, A., Nanda, P. K., … Dutta,

T. K. (2015). Molecular and phylogenetic characterization of multidrug resistant extended

spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli isolated from poultry and cattle in Odisha,

India. Infection, Genetics and Evolution, 29, 82-90.

https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.11.003

Kruger, T., Szabo, D., Keddy, K. H., Deeley, K., Marsh, J. W., Hujer, A. M., … Paterson, D. L.

(2004). Infections with Nontyphoidal Salmonella Species Producing TEM-63 or a Novel TEM

Enzyme, TEM-131, in South Africa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(11), 4263-4270.

https://doi.org/10.1128/AAC.48.11.4263-4270.2004

Lambert, R. J. W., & Pearson, J. (2000). Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum

inhibitory concentration (MIC) and non‐inhibitory concentration (NIC) values. Journal of applied

microbiology, 88(5), 784-790. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x

León Astudillo, C. E., & Pacheco Quito, M. A. (2010). Epidemiología de las infecciones por

microorganismos productores de BLEE en el Hospital Vozandes Quito entre los años 2005 y

2009. Universidad del Azuay. Recuperado de http://dspace.uazuay.edu.ec/handle/datos/40

Majowicz, S. E., Musto, J., Scallan, E., Angulo, F. J., Kirk, M., O’Brien, S. J., … Studies, for the I.

C. on E. D. “Burden of I. (2010). The Global Burden of Nontyphoidal Salmonella Gastroenteritis.

Clinical Infectious Diseases, 50(6), 882-889. Recuperado de http://dx.doi.org/10.1086/650733

Majowicz, S. E., Scallan, E., Jones-Bitton, A., Sargeant, J. M., Stapleton, J., Angulo, F. J., … Kirk,

M. D. (2014). Global incidence of human Shiga toxin–producing Escherichia coli infections and

deaths: a systematic review and knowledge synthesis. Foodborne pathogens and disease, 11(6),

447-455. https://doi.org/https://doi.org/10.1089/fpd.2013.1704

Mantilla, J., Pulido, M., & Jaime, J. (2010). Prueba de sensibilidad antimicrobiana de cepas de

Salmonella grupo D (móviles e inmóviles) aisladas de ponedoras comerciales en Colombia.

Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 57(III), 168-177. Recuperado de

http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=407639225003

https://doi.org/10.1088/1755-1315/85/1/012082

https://doi.org/https:/doi.org/10.1016/j.meegid.2014.11.003

https://doi.org/10.1128/AAC.48.11.4263-4270.2004

https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x

http://dspace.uazuay.edu.ec/handle/datos/40

http://dx.doi.org/10.1086/650733

https://doi.org/https:/doi.org/10.1089/fpd.2013.1704


54

Marshall, S. B. L. & B. (2004). Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and

responses. NATURE MEDICINE SUPPLEMENT, 10. https://doi.org/10.1038/nm1145

Melo Durán, D. A. (2015). Identificación de Salmonella enterica de interés zoonótico

serovariedades Enteritidis, Typhimurium e Infantis en pollo bebe de un día de edad en un sistema

productivo de pollo de engorde en la provincia de pichincha (Bachelor's thesis, Quito: UCE).

http://www.dspace.uce.edu.ec:8080/bitstream/25000/6912/1/T-UCE-0014-048.pdf

MERCK. Chromocult® Coliform Agar acc. ISO 9308-1. Technical Data Sheet.

www.merckmillipore.com/biomonitoring

MSP, (Ministerio de Salud Pública). (2018). Gaceta Epidemiológica Semanal No.35. Recuperado

de https://www.salud.gob.ec/wp-content/uploads/2013/02/Gaceta-General-SE-35-1.pdf

Mosquito, S., Ruiz, J., Bauer, J. L., & Ochoa, T. J. (2011). Mecanismos moleculares de resistencia

antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea. Revista Peruana de Medicina Experimental y

Salud Pública, 28, 648-656. https://doi.org/10.1590/S1726-46342011000400013

Muzo Suquillo, S. L. (2017). Aislamiento y fenotipificaciòn de cepas Blee y Ampc de Escherichia

coli procedentes de pollos broiler en la isla Santa Cruz provincia de Galápagos. Recuperado de


Narváez Manosalvas, C. A. (2015). Identificación de genes de resistencia a antibióticos β-

Lactámicos en cepas BLEE y AmpC de Escherichia coli de origen aviar. Quito: UCE. Recuperado

de http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/10220

Nascimento, MS, Berchieri Jr, A, Barbosa, MD, Zancan, FT, & Almeida, WAF. (2000).

Comparação de Meios de Enriquecimento e de Plaqueamento Utilizados na Pesquisa de

Salmonella em Carcaças de Frango e Fezes de Aves. Brazilian Journal of Poultry Science, 2(1),

85-91. https://dx.doi.org/10.1590/S1516-635X2000000100012

OIE. (2008). Salmonelosis. Manual De La Oie Sobre Animales Terrestres, Webb, H. E., Granier,

S. A., Mrult, M., Millemann,. Recuperado de

http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.09.09. Salmonelosis.pdf

Olesen, I., Hasman, H., & Aarestrup, F. M. (2004). Prevalence of B-lactamases among ampicillin-

resistant Escherichia coli and Salmonella isolated from food animals in Denmark. Microbial drug

resistance, 10(4), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1089/mdr.2004.10.334

https://doi.org/10.1038/nm1145

http://www.dspace.uce.edu.ec:8080/bitstream/25000/6912/1/T-UCE-0014-048.pdf

http://www.merckmillipore.com/biomonitoring

https://www.salud.gob.ec/wp-content/uploads/2013/02/Gaceta-General-SE-35-1.pdf

https://doi.org/10.1590/S1726-46342011000400013



https://dx.doi.org/10.1590/S1516-635X2000000100012

http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.09.09.%20Salmonelosis.pdf

https://doi.org/10.1089/mdr.2004.10.334

55

OMS, (Organización Mundial de la Salud). (2017). Lista OMS de Antimicrobianos de Importancia

Crítica para la Medicina Humana (Lista OMS de AIC). Retrieved from

http://who.int/foodsafety/publications/antimicrobials-fifth/en/

Paredes Gago, R. (2013). Prevalencia de enterobacteriáceas productoras de betalactamasas de

espectro extendido (Blee) en la clínica Good Hope durante el periodo marzo–agosto del 2012.

Recuperado de http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/3497

Parra, M., Durango, J., & Máttar, S. (2002). Microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y

diagnóstico de las infecciones producidas por Salmonella. Revista MVZ Córdoba, 7(2), 187-200.

Parveen, S., Taabodi, M., Schwarz, J. G., Oscar, T. P., Harter-Dennis, J., & White, D. G. (2007).

Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella recovered from processed poultry. Journal

of food protection, 70(11), 2466-2472. https://doi.org/https://doi.org/10.4315/0362-028X-

70.11.2466

Paterson, D. L., & Bonomo, R. A. (2005). Extended-Spectrum beta-Lactamases : a Clinical

Update. Clinical Microbiology Reviews, 18(4), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1128/CMR.18.4.657

Pathak, P., Jaishi, N., Yadav, B. K., & Shah, P. K. (2017). Prevalence of Extended Spectrum Beta

Lactamases (ESBL) and Metallo Beta Lactamases (MBL) Mediated Resistance inGram Negative

Bacterial Pathogens. MICROBIOLOGYTRIBHUV, 4(1), 49. Recuperado de

www.microbiotu.edu.np

Pérez, E. (2015). CUANTIFICACIÓN DE Escherichia coli PRODUCTOR DE β - LACTAMASAS

DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) EN PUNTOS CRÍTICOS DE CONTROL EN CAMALES

INDUSTRIALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA. Recuperado de


Pérez, C., Rivera, S., de Vera, A. P., Rincón, H., Mavárez, Y., & Román, R. (2004). Aislamiento

de Salmonella en canales de aves y evaluación de la efectividad de diferentes medios de

enriquecimiento y selectivos. Revista Científica, 14(2).


Philippon, A., Arlet, G., & Jacoby, G. A. (2002). Plasmid-Determined AmpC-Type β-Lactamases.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46(1), 1 LP-11. Recuperado de

http://aac.asm.org/content/46/1/1.abstract

http://who.int/foodsafety/publications/antimicrobials-fifth/en/

http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/3497

https://doi.org/https:/doi.org/10.4315/0362-028X-70.11.2466

https://doi.org/https:/doi.org/10.4315/0362-028X-70.11.2466

https://doi.org/10.1128/CMR.18.4.657

http://www.microbiotu.edu.np/



http://aac.asm.org/content/46/1/1.abstract

56

Prescott, J. F., & Dowling, P. M. (2013). Antimicrobial therapy in veterinary medicine. John Wiley

& Sons.

Quintero, Y. C. (2016). Métodos de tipificación basados en PCR para diferenciación de aislados

de Salmonella. ECUADOR ES CALIDAD-Revista Científica Ecuatoriana, 2(2).

Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., & Ferraro, M. J. (2009). Antimicrobial susceptibility

testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical infectious diseases,

49(11), 1749-1755. Recuperado de https://doi.org/10.1086/647952

Ripoll, A., Galán, J.-C., Rodríguez, C., Tormo, N., Gimeno, C., Baquero, F., … Group, S. Q. C. S.

(2014). Detection of resistance to beta-lactamase inhibitors in strains with CTX-M beta-

lactamases: a multicenter external proficiency study using a well-defined collection of Escherichia

coli strains. Journal of clinical microbiology, 52(1), 122-129. https://doi.org/10.1128/JCM.02340-

13

Rivera Calderón, L. G., Motta Delgado, P. A., Cerón Urbano, M. F., & Chimonja Coy, F. A. (2012).

Resistencia de la Salmonella a los antimicrobianos convencionales para su tratamiento . CES

Medicina Veterinaria y Zootecnia . scieloco .

Rubin, J. E., & Pitout, J. D. D. (2014). Extended-spectrum β-lactamase, carbapenemase and

AmpC producing Enterobacteriaceae in companion animals. Veterinary microbiology, 170(1-2),

10-18. Recuperado de https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.01.017

Salmerón García, A. (2007). Patrones de sensibilidad a antibióticos en aislados clínicos de

Escherichia coli productores de beta lactamasas de espectro extendido y su relación con la

expresión de porinas. https://hera.ugr.es/tesisugr/16887773.pdf

Sánchez Chugchilán, X. M. (2016). Identificación molecular de Salmonella spp, en un sistema

integrado de producción de pollos en engorde. Quito: UCE. Recuperado de


Seiffert, S. N., Hilty, M., Perreten, V., & Endimiani, A. (2013). Extended-spectrum cephalosporin-

resistant gram-negative organisms in livestock: An emerging problem for human health? Drug

Resistance Updates, 16(1-2), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1016/j.drup.2012.12.001

https://doi.org/10.1086/647952

https://doi.org/10.1128/JCM.02340-13

https://doi.org/10.1128/JCM.02340-13


https://hera.ugr.es/tesisugr/16887773.pdf


https://doi.org/10.1016/j.drup.2012.12.001

57

Shahada, F., Chuma, T., Kosugi, G., Kusumoto, M., Iwata, T., & Akiba, M. (2013). Distribution of

extended-spectrum cephalosporin resistance determinants in Salmonella enterica and

Escherichia coli isolated from broilers in southern Japan. Poultry Science, 92(6), 1641-1649.

Recuperado de http://dx.doi.org/10.3382/ps.2012-02934

Sonali Rivera Corona, M., Granda, A. E., Felipe, L., & Bonachea, H. (2012). Resistencia

antimicrobiana en cepas de Salmonella enterica subsp. enterica aisladas en carnes de aves

importadas. Revista de Salud Animal. scielocu. Recuperado de

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-

570X2012000200010&lng=es&nrm=iso&tlng=es

Tate, H., Folster, J. P., Hsu, C. H., Chen, J., Hoffmann, M., Li, C., … Zhao, S. (2017). Comparative

Analysis of Extended Spectrum Beta-Lactamase CTX-M-65-Producing Salmonella Infantis

Isolates from Humans, Food Animals, and Retail Chickens in the United States. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, (8 May), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.

https://doi.org/10.1128/AAC.00488-17

Terzolo, H. R., & Ríos, A. E. (2008). Estrategias en Salmonelosis de las aves: Dónde estamos y

hacia dónde deberíamos ir.

Thomson, K. S. (2010). Extended-spectrum-β-lactamase, AmpC, and carbapenemase issues.

Journal of clinical microbiology, 48(4), 1019-1025. https://doi.org/10.1128/JCM.00219-10

Toro, H., Price, S. B., McKee, S., Hoerr, F. J., Krehling, J., Perdue, M., & Bauermeister, L. (2005).

Use of bacteriophages in combination with competitive exclusion to reduce Salmonella from

infected chickens. Avian diseases, 49(1), 118-124. https://doi.org/https://doi.org/10.1637/7286-

100404R

Trung, N. V, Carrique‐Mas, J. J., Nghia, N. H., Tu, L. T. P., Mai, H. H., Tuyen, H. T., … Schultsz,

C. (2017). Non‐Typhoidal Salmonella Colonization in Chickens and Humans in the Mekong Delta

of Vietnam. Zoonoses and Public Health, 64(2), 94-99. https://doi.org/10.1111/zph.12270

UNIETAR. (2016). Aislamiento de: Escherichia coli 28.0130137.0921. http://bit.ly/UNIETAR

Urdahl, M., Johannesen, H. S., Vestby, L. K., Nesse, A. L. L., Sekse, C., Berg, K., & Karianne, C.

S. (2014). Potentially Pathogenic Escherichia coli Can. https://doi.org/10.1128/AEM.03331-13

Uribe, C., & Suárez, M. C. (2006). Salmonelosis no tifoidea y su transmisión a través de alimentos

de origen aviar. Colombia médica, 37(2), 151-158. http://www.redalyc.org/html/283/28337211/

http://dx.doi.org/10.3382/ps.2012-02934

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-570X2012000200010&lng=es&nrm=iso&tlng=es

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-570X2012000200010&lng=es&nrm=iso&tlng=es

https://doi.org/10.1128/AAC.00488-17

https://doi.org/10.1128/JCM.00219-10

https://doi.org/https:/doi.org/10.1637/7286-100404R

https://doi.org/https:/doi.org/10.1637/7286-100404R

https://doi.org/10.1111/zph.12270

http://bit.ly/UNIETAR

https://doi.org/10.1128/AEM.03331-13

http://www.redalyc.org/html/283/28337211/

58

Vásconez, D. (2014). AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli RESISTENTE

BLEE EN CIEGOS DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA

DE PICHINCHA. Recuperado de

http://docs.wixstatic.com/ugd/b341b6_48fda80811d5457688b200da7629c594.pdf

Velhner, M., Milanov, D., & Kozoderović, G. (2017). Salmonella spp. in poultry: a constant

challenge and new insights. Journal of the Hellenic Veterinary Medical Society, 69(2), 899-910.

http://dx.doi.org/10.12681/jhvms.18012

Vergara, A., Pitart, C., Montalvo, T., Roca, I., Sabaté, S., Hurtado, J. C., … Peracho, V. (2017).

Prevalence of extended-spectrum-β-lactamase-and/or carbapenemase-producing Escherichia

coli isolated from yellow-legged gulls from Barcelona, Spain. Antimicrobial agents and

chemotherapy, 61(2), e02071-16. https://doi.org/10.1128/AAC.02071-16

Villagómez Estrada, S. D. (2015). Aislamiento y serotipificación de Salmonella Enteritidis,

Typhimurium e Infantis en carcasas de pollo destinadas para consumo humano en un camal

industrializado de la Provincia de Pichincha. Quito: UCE. Recuperado de


Villagran Ramirez, S. (2017). Prevalencia de la resistencia a antibióticos a través de la

susceptibilidad de Escherichia coli en aves de combate en el norte del Estado de México.

Universidad Autónoma del Estado de México. Recuperado de

http://hdl.handle.net/20.500.11799/68303

Villagómez-Estrada, S., Logacho Pilataxi, M., & Vinueza Burgos, C. (2017). Presencia y

Resistencia a los Antimicrobianos de serovariedades de Salmonella enterica aisladas en una

empresa avícola integrada del Ecuador. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas,

38(1), 11-24. Recuperado de https://doi.org/10.26807/remcb.v38i1.17

Vinueza-Burgos, C., Cevallos Almeida, M. B., Ron-Garrido, L., Bertrand, S., & Zutter, L. de.

(2016). Prevalence and diversity of Salmonella serotypes in ecuadorian broilers at slaughter age.

Plos One, 1-12. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159567

Vinueza Burgos, C. V. (2017). Salmonella and Campylobacter in broilers at slaughter age: a

possible source for carcasses contamination in Ecuador (Master's thesis, Gent/Universidad de

Gante). http://repositorio.educacionsuperior.gob.ec/handle/28000/4311

http://docs.wixstatic.com/ugd/b341b6_48fda80811d5457688b200da7629c594.pdf

http://dx.doi.org/10.12681/jhvms.18012

https://doi.org/10.1128/AAC.02071-16


http://hdl.handle.net/20.500.11799/68303

https://doi.org/10.26807/remcb.v38i1.17


http://repositorio.educacionsuperior.gob.ec/handle/28000/4311

59

Vinueza-Burgos, C., Cevallos, M., Ron-Garrido, L., Bertrand, S., & De Zutter, L. (2016).

Prevalence and Diversity of Salmonella Serotypes in Ecuadorian Broilers at Slaughter Age. Plos

One, 11(7), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,.


Vinueza, C., & De Zutter, L. (2017). Important foodborne bacteria and their antimicrobial

resistances in Ecuadorian poultry. Recuperado de


Vinueza-Burgos, C., Narváez Manosalvas, C., Barba, P., Ortega-Paredes, D., & Zurita, J. (2017).

Intensive poultry production: an important hot-spot of multi-resistant Escherichia coli in Ecuador.

https://doi.org/10.13140/RG.2.2.19518.08004

Wattiau, P., Boland, C., & Bertrand, S. (2011). Methodologies for Salmonella enterica subsp.

enterica Subtyping: Gold Standards and Alternatives. Applied and Environmental Microbiology,

77(22), Webb, H. E., Granier, S. A., Mrult, M., Millemann,. https://doi.org/10.1128/AEM.05527-11

Widén, F., Leijon, M., Engvall, E. O., Muradrasoli, S., Munir, M., & Belák, S. (2013). Development

of improved analytical methods for use in animal health and in foodborne disease surveillance for

source attribution. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz, 32(2), 549-558.

Wiegand, I., Hilpert, K., & Hancock, R. E. W. (2008). Agar and broth dilution methods to determine

the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols, 3, 163.

Recuperado de http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2007.521

Yavuz, B., Ozer, B., Inci, M., & Duran, N. (2015). Determination of CTX-M beta-lactamase in

Escherichia coli strains isolated from clinical samples. Le infezioni in medicina: rivista periodica di

eziologia, epidemiologia, diagnostica, clinica e terapia delle patologie infettive, 23(1), 23-30.



https://doi.org/10.13140/RG.2.2.19518.08004

https://doi.org/10.1128/AEM.05527-11

http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2007.521

60

ANEXOS

61

Anexo A: Método basado en Norma INEN NTE 1529-15:2009 para aislamiento Salmonella

MATERIALES

Equipos y materiales

Asa de nicromo de argolla y punta o

asas desechables

Incubador bacteriológico 42°C

Autoclave

Frascos vidrio 100ml

Agitador Stomacher

Cajas Petri plásticas desechables

estériles

Incubador bacteriológico 37°C

Pipetas graduadas vidrio 10ml

Puntas plásticas 1000µl

Tubos bacteriológicos 16x125mm

Tubos bacteriológicos 13x100mm

Zapatones

Fundas plásticas herméticas

Micropipeta de 100-1000µl

Gradillas

Auxiliar de macropipeteado

Reactivos, soluciones y medios de cultivo

Agua peptona buferada (BPW)

Caldo selenite cisteína

Caldo tetrationato

Agar verde brillante (VB)

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Agar Lisina Hierro (LIA)

Agar Triple Sugar Iron (TSI)

Agar sulfuro indol movilidad (SIM)

Caldo urea

Caldo triptosa (CT)

PROTOCOLO

Preparación de la muestra

Identificar la muestra.

Sacar los zapatones colectados con material fecal y pesar 25 gramos de estos, colocarlos

en una funda estéril para su posterior procesamiento.

Enriquecimiento no selectivo

Precalentar el agua de peptona buferada (BPW) a temperatura ambiente antes de su uso.

Añadir a la funda estéril que contiene los 25 gramos de zapatones con material fecal la

cantidad de 225ml de agua de peptona buferada para lograr una dilución 1:10,

62

homogenizar la muestra en agitador stomacher por 250gpm por 2 minutos y someter a

incubación a 37°C por 18-24 horas.

Enriquecimiento selectivo

Preparar los caldos selenite cisteína y tetrationato y dejarlos que tomen temperatura

ambiente.

Colocar en un frasco de vidrio estéril 100ml de caldo selenite cisteína más 10 ml de la

muestra sometida previamente a enriquecimiento no selectivo y someter a incubación a

37°C por 18-24 horas.

Colocar en un frasco de vidrio estéril 100ml de caldo tetrationato más 10 ml de la muestra

sometida previamente a enriquecimiento no selectivo y someter a incubación a 42°C por

18-24 horas.

Siembra en agar selectivo

Preparar las placas con agar XLD y verde brillante. Sembrar por técnica de estriación en

cada caja de agar (verde brillante y XLD) de cada uno de los caldos previamente utilizados

(selenite cisteína y tetrationato)

Incubar las cajas de agar de forma invertida a 37°C por 18-24 horas.

Las colonias de Salmonella en agar verde brillante crecen de tamaño pequeño, redondas

y translucidas, rodeadas de una zona de color rojizo.

Las colonias de Salmonella en agar XLD crecen de tamaño pequeño con un halo rojizo y

con centro negro debido a la producción de sulfuro de hidrogeno.

Pruebas Bioquímicas

Seleccionar una colonia típica de Salmonella spp. para realizar la confirmación

bioquímica.

Inocular la colonia en los agares diferenciales de triple azúcar y hierro (TSI) en fondo y

superficie inclinada; agar lisina hierro (LIA) en fondo y superficie inclinada, agar sulfuro,

indol y movilidad (SIM) por medio de una picadura y en caldo urea.

Incubar todos los medios a 37°C por 18-24 horas.

63

Interpretación pruebas bioquímicas

TSI: colonias de Salmonella dan una reacción alcalina en la superficie inclinada la cual

se representa por la letra K y produce un color rojizo, en el fondo se da una reacción acida

que se representa por la letra A y produce un color amarillo, si hay color negro en el fondo

es por la formación de sulfuro de hidrogeno que algunas cepas de Salmonella spp. lo

producen en diferente cantidad.

LIA: la prueba se da como positiva para Salmonella cuando hay descarboxilación de la

lisina, el medio toma un color violeta tanto en la superficie inclinada como en el fondo,

hay presencia de color negro en fondo por producción de sulfuro de hidrogeno.

SIM: las cepas móviles de Salmonella producen turbidez del medio que se extiende a los

lados de la línea de siembra, puede haber color negro del medio por producción de sulfuro

de hidrogeno, la producción de Indol se evidencia al agregar el reactivo de Kovac’s

formándose un anillo de color rojizo.

Urea: la degradación de la urea se da cuando el caldo toma una coloración violeta o rosa

fuerte, para el caso de Salmonella esta bacteria es urea negativa porque no tiene la

enzima ureasa para degradar el sustrato y el color del caldo permanece rosa pálido.

64

Colonias de Salmonella en agar verde brillante

Reacción cepa Salmonella en agar TSI, LIA y urea

Nota: 1 = TSI (K → alcalino)/A → ácido); SH2, = producción

sulfuro hidrogeno), G = producción gas); 2 = LIA (K)

descarboxilación lisina; 3 = UREA (negativo)

1 2 3

65

Anexo B: Esquema aislamiento Salmonella (Cepas móviles)

Pesar 25gr de zapatones con material fecal de cada galpón

Agregar 225ml de Agua de peptona buferada (BPW) y homogenizar en stomacher

Incubar a 37°C x 18-24 horas


Transferir 10ml a 100ml de

Caldo tetrationato

Transferir 10ml a 100ml de

Caldo selenite cisteína


Sembrar en Agar verde brillante (VB) y Agar XLD


PRUEBAS BIOQUIMICAS

Colonia Salmonella spp. en agar VB pequeña, redonda, translúcida

Colonia Salmonella spp. en agar XLD pequeña, rojas con centro negro

TSI (+)

K/A gas SH2

LIA (+) color morado

descarboxilación lisina

UREA (-)

rosa pálido

SIM (+) turbidez, ennegrecimiento (+)

Indol (+), movilidad (+)

Tomar asada de TSI, colocar en tubo Eppendorf® con 300µl caldo triptosa

Incubación 37°C x 24 horas

Adicionar 600µl Glicerol y almacenar a -80°C

Zapatones con material fecal

66

Anexo C: Método para serotipificación de aislados de Salmonella

MATERIALES

Equipos y materiales

Asas desechables de 2µl

Hoja de bisturí

Baño maría a 50°C

Incubador bacteriológico de 37°C

Autoclave

Frascos vidrio 100ml

Gradillas

Mechero bunsen

Cajas Petri plásticas desechables

Papel filtro

Palillos de madera

Placas porta objetos

Tubos bacteriológicos 13 x 100mm

Tubos de 10ml

Medios de cultivo y reactivos

Agar triptosa

Antisueros somáticos y flagelares (O,

H)

Solución cloruro de sodio 0.85%

Solución salina formalinizada al 6%

Caldo triptosa

Cepas controles positivos y negativos

Las cepas de control positivo utilizadas fueron S. Enteritidis ATCC 13076, S. Typhimurium ATCC

14028, S. Infantis ATCC 51741, como control negativo se utilizó la cepa de E. coli ATCC 25922.

PROTOCOLO

Sembrar cepas de Salmonella a analizar en agar triptosa e incubar a 37°C por 24 horas.

Dejar que todos los reactivos tomen temperatura ambiente antes de utilizarse.

Reconstituir los antisueros añadiendo 3ml de solución de NaCl al 0.85%.

Análisis de la cepa para determinar auto aglutinación

a) A partir del cultivo, transferir un asa llena de cultivo bacteriano a una gota de solución de

NaCl al 0.85% en una placa porta objetos y mezclarlos.

b) Girar suavemente la placa porta objetos durante 1 minuto y observar para determinar si

hay auto aglutinación.

c) Si hay aglutinación el cultivo está en fase rugosa y no se podrá analizar. Volver a sembrar

la cepa en agar triptosa, incubar y volver a analizar el cultivo siguiendo los pasos a y b.

d) Si no hay presencia de auto aglutinación se procede a analizar el cultivo

67

Serotipificación somática en placa

Mezclar una suspensión bacteriana con una gota de antisuero O Poly A-I & Vi esto en

una placa porta objetos

Agitar la placa por 1 minuto y observar si se presenta aglutinación, la presencia de

gránulos indica una reacción positiva.

Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium

Mezclar una gota de antisuero grupo O, Poly A (grupos somáticos A, B, D, E1, E4, L) con

una suspensión bacteriana en una placa portaobjetos.

Agitar la placa por 1 minuto y observar aglutinación. Una reacción positiva presenta

gránulos, posiblemente de grupo D (posible S. Enteritidis) o al grupo somático B (posible

S. Typhimurium).

Mezclar una gota de antisuero factor O, grupo D1 factores 1, 9, 12 con la suspensión

bacteriana en una placa portaobjetos.

Agitar la placa por 1 minuto y observar aglutinación. Una reacción positiva presenta

gránulos. (posible S. Enteritidis)

En caso de ser negativa

Mezclar una gota de antisuero factor O, antisuero grupo B (factores 1, 4, 5, 12) con una

suspensión bacteriana en una placa porta objetos.

Agitar la placa por 1 minuto y observar aglutinación. La presencia de gránulos indica

reacción positiva a factores 1, 4, 5, 12 (posible S. Typhimurium)

Salmonella Infantis

Mezclar una gota de antisuero de grupo O, antisuero Poly B (grupos somáticos C1, C2,

F, G, H) con la suspensión bacteriana en una placa portaobjetos.

Agitar la placa por 1 minuto y observar aglutinación. Una reacción positiva se evidencia

por presencia de gránulos, posiblemente del grupo somático C1 (posible S. Infantis)

Mezclar una gota de antisuero de factor O, antisuero grupo C1 (factores 6, 7, 14) con una

suspensión bacteriana en una placa porta objetos.

Agitar la placa por 1 minuto y observar aglutinación. Una reacción positiva se evidencia

por presencia de gránulos reacciona a los factores 6, 7, 14 (posible S. Infantis)

68

Después de la aglutinación con los antisueros O, se tiene que realizar la aglutinación con

antisuero H. Salmonella a menudo posee 2 tipos de antígenos H (fase 1 y fase 2). Si una fase H

es negativa para las cepas bifásicas, debe usarse un método de inversión de fase. La fase H

dominante se reprime con un método de inversión de fase. Al reprimir la fase H dominante, la

segunda fase H puede ser expresada e identificada.

Utilizar el método de puente de papel para la inversión de fase según Chiou.

Inversión de fase

Preparar agar triptosa

Retirar una tira del agar triptosa (1cm ancho) para hacer un canal a través del centro de

la placa

Colocar las tiras de papel filtro (3mm x 3cm) a través del canal

Preparar una dilución 1:10 del antisuero de inversión de fase flagelar deseada con

solución NaCl 0.85%

Depositar una gota de suero de inversión de fase en la mitad del papel filtro

Inocular las cepas de Salmonella (S. Infantis o S. Typhimurium) en el extremo izquierdo

de las tiras

Incubar la placa a 37°C por 18-24 horas

Después del tiempo de incubación, las variantes de fase que expresan antígeno flagelar

alternativo desde el centro de la tira migran hacia el extremo derecho de la tira.

Observar el crecimiento bacteriano alrededor del borde del extremo derecho de la tira

Transferir el cultivo a un tubo con caldo triptosa (CT) e incubar a 37°C por 24 horas

Preparar una suspensión del organismo de prueba utilizando volúmenes iguales de

cultivo de caldo triptosa y solución salina formalinizada al 0.6%, a una densidad de 3 en

la escala de McFarland.

Serotipificación flagelar en tubo (aglutinación)

Sembrar las posibles cepas de S. Infantis, S. Infantis y/o S. Typhimurium en 5ml de caldo

triptosa (CT) e incubar a 37°C por 24 horas.

Realizar la inversión de fase para S. Infantis y S. Typhimurium.

69

Para la mayoría de los antisueros H para Salmonella preparar una dilución de 1:125

añadiendo 0.1 ml de antisuero reconstituido (factores H para identificar los diferentes

serotipos) a12.5ml de solución NaCl al 0.85%

Mezclar en un tubo de ensayo de 13x10mm cantidades iguales (0.5ml) de antisuero

diluido y la suspensión del organismo de prueba, la dilución final es 1:500.

Incubar tubos en baño maría a 50°C por 1 hora

Realizar la lectura para determinar la presencia de aglutinación.

4 ++++ 100% aglutinación (fondo transparente a ligeramente lechoso)

3 +++ 75% aglutinación (fondo ligeramente turbio)

2 ++ 50% aglutinación (fondo moderadamente turbio)

1 + 25% aglutinación (fondo turbio)

- No existe aglutinación

Un valor de aglutinación de 3 o mayor indica un resultado positivo (+)

Una aglutinación menor a 3 o retardada se considera negativa (-)

La presencia de floculación indica una reacción positiva con antisueros factor H, y para asignarle

un nombre de serotipo y su fórmula correspondiente utilizar el esquema de Kauffmann-White.

70

Serotipificación somática cepa Salmonella Infantis

Nota: Antisuero somático O Poly B (grupos C1, C2, F, G, H) →

Aglutinación positiva (+) Antisuero somático O grupo C1,

Factores 6, 7 → aglutinación positiva (+)

Inversión de fase cepa sospechosa S. Typhimurium

Nota: 1,2 = antígeno H fase II; i = antígeno H fase I;

(-) = control negativo

71

Anexo D: Flujograma de serotipificación somática (O) para S. Enteritidis, S. Typhimurium y S.

Infantis

Cepas con características bioquímicas de Salmonella spp.

Antes de serotipificar, comprobar que no sea una cepa que auto aglutina con solución salina al 0.85%

Subcultivo en Agar Mueller Hinton

Sembrar cepas Salmonella spp. en Agar nutritivo

Positivo

Cepa rugosa

Negativo

Serotipificación somática en placa

Aglutinación con Antisuero Polivalente somático Poly A-I & Vi

Positivo Negativo Podría ser Salmonella detectable mediante

uso de Antisueros Poly C, D, E, F o G

Aglutinación con antisuero grupo O Antisuero Poly B

Grupos somáticos C1, C2, F, G, H

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Antisuero Poly A

Grupos somáticos A, B, D, E1, E4, L

Puede ser Salmonella detectable mediante uso antisueros

Poly C, D, E, F, G

S. Enteritidis (Grupo D)

S. Typhimurium (Grupo B)

S. Infantis (Grupo C1)

Aglutinación con antisuero

de factores O

Aglutinación con antisueros Factor O

Antisuero Grupo C1 factores 6, 7

Antisueros Factor 14

S. Infantis

Antisueros Grupo D1

Factores 1, 9, 12

Serotipificación flagelar en tubo

S. Enteritidis

Antisueros Grupo B

Factores 1, 4, 5, 12

S. Typhimurium

72

Anexo E: Flujograma de serotipificación flagelar (H) S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis

Sembrar cepa de Salmonella en caldo triptosa (CT) Incubar a 37°C x 24 horas

S. Enteritidis

Aglutinación con

antisueros factor H

Preparar dilución 1:250

agregando 0.1ml de

antisuero en 12.4ml de

solución de NaCl 0.85%

S. Typhimurium S. Infantis

Mezclar volúmenes iguales de

Salmonella en CT + solución

salina formalinizada al 6%

(Turbidez 3 escala McFarland)

Inversión de fase

Técnica puente de papel

Agar triptosa se retira

banda de 1cm ancho

para hacer espacio en el

centro de la placa

Colocar tirilla papel estéril (3mm x 3cm)

a través de espacio en agar

Colocar una gota de antisuero de fase

contraria en el centro del papel filtro

Inocular la cepa de Salmonella en

extremo izquierdo de la tirilla de papel


Transferir crecimiento

bacteriano en 5ml de CT e

incubar a 37°C x 24 horas

Mezclar 0.5ml de antisuero diluido

+ 0.5ml de aislado de prueba

Positivo

Formación de flóculo

Negativo

Puede ser Salmonella

detectable mediante

uso de otros

antisueros factores H

Fórmula Esquema

Kauffmann White

S. Enteritidis S. Typhimurium S. Infantis

O: 1, 4, 5, 12 H: i 1, 2

O: 6, 7, 14 H: i: 1, 5

O: 1, 9, 12 H: g, m

Baño María 50°C x 1 hora

73

Anexo F: Esquema aislamiento E. coli

Zapatones con material fecal

Pesar 25gr de zapatones con material fecal de cada galpón

Agregar 225ml de Agua de peptona buferada (BPW) y homogenizar en stomacher

Tomar una asada y sembrar en agar Chromocult



Crecimiento colonias azules

características Escherichia coli

TSI (+)

A/A gas

Tomar asada de TSI, colocar en tubo Eppendorf ® con 300µl caldo triptosa

Incubación 37°C x 24 horas

Adicionar 600µl Glicerol y almacenar a -80°C

74

Escherichia coli en agar Chromocult® y TSI

Nota: A = reacción ácida; G = producción gas

Superficie inclinada

ácido (A)

Producción de gas (G)

Fondo ácido (A)

75

Anexo G: Hoja de registro de toma y envío de muestras en granja

HOJA REGISTRO DE TOMA

Y ENVIO DE MUESTRAS

FECHA MUESTREO

GRANJA

NUMERO DE GALPON

EDAD AVES

TIPO MUESTRA

RESPONSABLE

OBSERVACIONES

76

Anexo H: Método PCR simple para detección de genes β – lactámicos

MATERIALES

Tubos eppendorf® 1,5ml y 2ml

Asas plásticas 1µl

Gradillas para tubos eppendorf®

tips plásticas micropipetas con filtro

Guantes nitrilo

Cajas almacenaje criotubos

Probeta graduada 100ml

Frasco vidrio con tapa rosca

Molde para gel de agarosa

Microtubos 200µl y 2ml

Gradillas para microtubos 200ul y 2ml

Marcadores tinta permanente

EQUIPOS

Centrífuga HETTICH

Baño maría BIOBASE

Termociclador applied biosystems

Balanza 0.001g SARTORIUS

Cámara electroforesis

Micropipetas varios volúmenes BOECO

Cámara de flujo laminar BIOBASE

Vórtex BOECO

Cámara fotos CANON

Microondas

Refrigeradora

Ultracongelador WILD

Transiluminador LABNET

REACTIVOS

Agarosa

Cloruro de magnesio (MgCL2)

Agua ultrapura libre ADNasa

Buffer de carga

TAE 0.5X

TE 10X

EDTA, 0.5M

Enzima ADN polimerasa (Taq)

dNTPs mix

Marcador molecular 100pb

Primer TEM

Primer CMY

Primer SHV

Primer CTX-M 25

Hipoclorito de sodio

Buffer green

Syber safe®

77

PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN

Con el aza de 1 µl tomar una colonia típica del cultivo bacteriano teniendo en cuenta que el

material retirado debe llenar el orificio del aza.

Suspender y homogenizar el material tomado, en un microtubo con 300 µl de buffer TE 1X.

Colocar el microtubo por 20 minutos en el baño maría a temperatura de 90°C.

Centrifugar por 3 minutos a 13300 rpm en la microcentrífuga.

Recuperar el sobrenadante en otro microtubo cuidando de no topar el pellet que se forma en

el fondo del envase con la punta de la micropipeta.

Almacenar a -20°C.

Preparación master mix

La mezcla para una reacción de PCR debe incluir:

Agua ultrapura

Primers forward y reverse para cada uno de los 4 genes, se detallan a continuación:

Tamaño

amplicón

Controles

Gen Secuencias de Primers (5' a 3') Positivos

(pb)

blaCTX-M F ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC

600 TIAC 809 CTXM-25

R TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYSAGCGG TIAC 809A

blaTEM F GCGGAACCCCTATTTG

963 CTXM-2 TEM

R ACCAATGCTTAATCAGTGAG CTXM-2 TEM A

blaSHV F TTATCTCCCTGTTAGCCACC

790 TIAC 361A

R GATTTGCTGATTTCGCTCGG TIAC 361B

blaCMY F ATGATGAAAAAATCGTTATGCTGC

1138 TIAC 811A

R GCTTTTCAAGAATGCGCCAGG TIAC 811B

Nota: pb “pares de bases”

78

Amplificación por PCR de los diferentes genes de resistencia antimicrobiana

Número de reacciones: el volumen del master mix se calculó para 15 reacciones, en todas las

amplificaciones para los 4 genes a investigar.

Primer CTX-M (gen blaCTX-M)

Fragmento por amplificar: 600 pb (pares de bases)

Realizar la master mix en un microtubo de 2ml sobre la gradilla fría y repartir la mezcla en

microtubos de 200µl para un volumen final de reacción de 15µl, los reactivos y cantidades se

muestran a continuación:

C. inicial = concentración inicial de los reactivos, C. final = concentración a la que se desea

llegar dentro del mix; VF = volumen final

Dispensar 14ul del mix en microtubos de 200ul a la cual se añadió 1ul de la muestra

proveniente de la extracción, para el control positivo se colocó 1ul (TIAC 809 CTXM-25 y

TIAC 809 A)

Los parámetros introducidos en el termociclador para el primer CTX-M, en la identificación

del gen blaCTX-M

Reactivo C. inicial C. final

Volumen para una reacción

VF Mastermix

Cantidad Unidad Cantidad Unidad Cantidad

(µl) Unidad

(µl)

Agua - - 9,125 136,9

Template 1 15

Buffer 5 x 1 x 3 45

dNTP Mix 10 mM 0,2 mM 0,3 4,5

MgCl2 25 mM 2 mM 1,2 18

CTXM-f 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

CTXM-r 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

Taq 5 U/µl 0,025 U/µl 0,075 1,1

Total 15 225

79

Preparar el gel de agarosa al 1% (100ml de TBE 0.5X + 1g de agarosa) y por cada 10ml

de buffer TBE 0.5X colocar 1ul de Sybr safe

verter el gel preparado en el molde para gel de agarosa

colocar 3ul de la muestra en los pocillos con 2ul de loader buffer

agregar 2.5ul de ladder

electroforesis por 30 minutos, 100 milivoltios y 500 miliamperios.

una vez terminada la electroforesis, retirar el gel y observar con el transiluminador UV, en

el gel de agarosa las bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los

marcadores de peso molecular

tomar una foto del gel para el registro de imágenes y poder determinar si existe alguna

banda con peso molecular igual al control positivo.

Etapa Temperatura

°C Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial del ADN 94 5 min 1

Desnaturalización del ADN 94 30 seg

35 Hibridación de los primers 62 30 seg

Extensión de la cadena 72 45 seg

Elongación final 72 7 min 1

Conservación de los amplicones 10 ∞ 1

80

Primer SHV (gen blaSHV)





proveniente de la extracción, para el control positivo se colocó 1ul (TIAC 361A y TIAC 361B)



VF Mastermix


(µl) Unidad

(µl)

Agua - - 9,125 136,9

Template 1 15

Buffer 5 x 1 x 3 45

dNTP Mix 10 mM 0,2 mM 0,3 4,5

MgCl2 25 mM 2 mM 1,2 18

SHV1 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

SHV2 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

Taq 5 U/µl 0,025 U/µl 0,075 1,1

Total 15 225

Etapa Temperatura

°C Tiempo Ciclos


Desnaturalización del ADN 94 1 min

35 Hibridación de los primers 62 1 min

Extensión de la cadena 72 1 min



81

Primer TEM (gen blaTEM)





proveniente de la extracción, para el control positivo se colocó 1ul (CTXM-2 TEM y CTXM-2

TEM A)



VF Mastermix


(µl) Unidad

(µl)

Agua - - 9,125 136,9

Template 1 15

Buffer 5 x 1 x 3 45

dNTP Mix 10 mM 0,2 mM 0,3 4,5

MgCl2 25 mM 2 mM 1,2 18

TEM1 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

TEM2 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

Taq 5 U/µl 0,025 U/µl 0,075 1,1

Total 15 225

Etapa Temperatura

°C Tiempo Ciclos







82

Primer CMY (gen blaCMY)





proveniente de la extracción, para el control positivo se colocó 1ul (TIAC 811A y TIAC 811B)



VF Mastermix


(µl) Unidad

(µl)

Agua - - 9,125 136,9

Template 1 15

Buffer 5 x 1 x 3 45

dNTP Mix 10 mM 0,2 mM 0,3 4,5

MgCl2 25 mM 2 mM 1,2 18

CMY1 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

CMY2 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,15 2,3

Taq 5 U/µl 0,025 U/µl 0,075 1,1

Total 15 225

Etapa Temperatura

°C Tiempo Ciclos







UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · ISO/TR International Organization for...

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · ISO/TR International Organization for...