Λαμπίρης Ηλίας-Αλέξανδρος 1113201500047 Παπαδοπούλου Ελευθερία 1113201500077 

 Thermophilic Proteins as Versatile Scaffolds for Protein Engineering   Anthony J. Finch and Jin Ryoun Kim  

1.Εισαγωγή Ο βασικός στόχος της πρωτεϊνικής μηχανικής είναι να δημιουργήσει ή/και να                     

βελτιστοποιήσει την λειτουργία μιας πρωτεΐνης. Κάθε πρωτεΐνη έχει μία συγκεκριμένη                   λειτουργία που επιβάλλεται από την αμινοξική της ακολουθία και την τριτοταγής δομή της                         (δίπλωμα). Οι επιστήμονες που ασχολούνται με την πρωτεϊνική μηχανική τροποποιούν την                     πρωτεΐνη εισάγωντας μεταλλάξεις που επηρεάζουν την δομή και την λειτουργία της και είτε                         βελτιώνουν είτε εισάγουν μία νέα λειτουργία. Συχνά όμως υπάρχουν προβλήματα όσον                     αφορά στην σταθερότητα της πρωτεΐνης. Συνεπώς, οι επιστήμονες έχουν να                   αντιμετωπίσουν την πρόκληση της διατήρησης της σταθερότητας εις βάρος της επιθυμητής                     λειτουργίας. 

Εδώ και μία δεκαετία, έχει γίνει αρκετή έρευνα για την κατανόηση αυτού του                         φαινομένου της αποσταθεροποίησης. Η κυρίαρχη εξήγηση είναι ότι τα αμινοξέα που                     προάγουν την λειτουργία είναι συνήθως αποσταθεροποιητικά, είτε ενδογενώς είτε λόγω της                     τοποθεσίας τους στην διπλωμένη πρωτεΐνη. Είναι γνωστό ότι η λειτουργία των πρωτεϊνών                       εξαρτάται αρκετά από την παρουσία ενός πολικού ή υδρόφοβου αμινοξέος στο ενεργό                       κέντρο. Εφόσον το ενεργό κέντρο είναι συνήθως θαμμένο μέσα στην τρισδιάστατη δομή της                         πρωτεΐνης, η λειτουργία της εξαρτάται από την ενσωμάτωση των υψηλά αντιδραστικών                     καταλοίπων στο εσωτερικό της πρωτεΐνης. Στην πραγματικότητα, η λειτουργία μιας                   πρωτεΐνης έχει αποδειχθεί ότι εξαρτάται απευθείας από την ευελιξία του ενεργού κέντρου                       παρά από την σταθερότητα του, το οποίο δείχνει ότι ένα ευκινητο ενεργό κέντρο                         προσελκύει ένα υπόστρωμα ώστε να μειωθεί η ελεύθερη ενέργεια του. Ενώ η ευελιξία και η                             ευκινησία στο ενεργό κέντρο μπορεί να βελτιώσει την λειτουργία, μπορεί να παίξει ρόλο και                           ως ένας αποσταθεροποιητικός παράγοντας για την τεταρτοταγή δομή. 

Για να μπορέσουν να ξεπεράσουν το εμπόδιο της αρνητικής συσχέτισης μεταξύ                     λειτουργικότητας και σταθερότητας, οι επιστήμονες προσπαθούν να παραποιούν πολύ                 σταθερές πρωτεΐνες που μπορούν να ανεχτούν τις μεταλλάξεις που προσφέρουν την νέα                       λειτουργία. Αυτές οι πρωτεΐνες εμφανίζουν “μεταλλακτική ανθεκτικότητα” δηλαδή μπορούν                 να ανεχτούν καλύτερα σημειακές μεταλλαγές απ’ότι οι μη ανθεκτικές. Αυτή η ανθεκτικότητα                       μπορεί να αξιολογηθεί εισάγωντας μία σημειακή μεταλλαγή στην πρωτεΐνη και αξιολογώντας                     το ∆∆Gfolding μεταξύ της μη μεταλλαγμένης και της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Το                     ∆∆Gfolding ορίζεται ως η αλλαγή της ελεύθερης ενέργειας Gibbs κατά το δίπλωμα μιας                         πρωτεΐνης μεταξύ της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης και της αρχικής (ή αγρίου τύπου)                     πρωτεΐνης : ∆∆Gfolding = ∆Gfolding(mutant) − ∆Gfolding(wild type). Οι τιμές του ∆∆Gfolding είναι άμεση                           μέτρηση της πρωτεϊνικής θερμοδυναμικής σταθερότητας: όταν εισαχθεί μια μετάλλαξη, όσο                   υψηλότερη (ή πιο θετική) είναι η ∆∆Gfolding τόσο λιγότερο σταθερή είναι η “νέα” πρωτεΐνη. Οι                             περισσότερες μεταλλάξεις που προκαλούν αλλαγή στην λειτουργία αυξάνουν την ∆Gfolding                   μιας πρωτείνης, δηλαδή η ∆∆Gfolding είναι θετική. Μετά την εισαγωγή μιας λειτουργικής                       

1 

 

μετάλλαξης οι πιο ανθεκτικές πρωτεΐνες θα έχουν ένα ∆∆Gfolding μικρότερο από τις λιγότερο                          ανθεκτικές πρωτεΐνες. 

Ακόμα είναι γνωστό ότι η ανθεκτικότητα και η θερμοδυναμική σταθερότητα μιας                     πρωτεΐνης μπορεί να συσχετιστεί θετικά με την εξελιξιμότητα της, δηλαδή την ικανότητα της                         πρωτεΐνης να υποστηρίξει τις μεταλλάξεις που της απονέμουν την νέα λειτουργία. Έχει                       βρεθεί ότι οι πρωτεΐνες με υψηλή θερμοσταθερότητα, την ικανότητα δηλαδή να αντιστέκεται                       μη αναστρέψιμες αλλαγές στην δομή και στην χημική τους σύσταση, είναι πιο εξελιξιμες από                           ότι οι λιγότερο θερμοσταθερές. Γι’άυτο οι επιστήμονες θεωρούν ότι οι θερμόφιλες                     πρωτεΐνες μπορούν να αποτελέσουν ικριώματα για νέες πρωτεΐνες και εισάγουν                   μεταλλάξεις σε αυτές.  

 

2.Ανταλλαγή μεταξύ πρωτεϊνικής ενεργότητας και σταθερότητας   

Όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω αυτή η αρνητική συσχέτιση μεταξύ πρωτεϊνικής                     ενεργότητας και σταθερότητας έχει απασχολήσει αρκετά τους επιστήμονες που                 ασχολούνται με την πρωτεϊνική μηχανική. Παρακάτω παρατίθενται κάποιες από τις πιο                     σημαντικές εργασίες που έχουν ασχοληθεί με την μεταβολή στην σταθερότητα μιας                     πρωτεΐνης όταν εισαχθεί σε αυτή μία μετάλλαξη.  

Μία από αυτές τις έρευνες είναι αυτή των Wang et al. οι οποίοι μελέτησαν την                             εξέλιξη του ενζύμου Temoniera-1 (TEM-1) β-lactamase, το οποίο είναι υπεύθυνο για την                       βακτηριακή ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Για αυτή την μελέτη, μετάλλαξαν το ένζυμο                     TEM-1 β-lactamase και παρατήρησαν τις αλλαγές στην ενεργότητα και την σταθερότητά                     του. Συγκεκριμένα, από τα στελέχη που μελετήθηκαν τα 7 έδειξαν αυξημένη ενεργότητα της                         β-λακταμάσης ιδιαίτερα ενάντια στις κεφαλοσπορίνες, αλλά έχασαν τόσο την                 θερμοδυναμική σταθερότητα όσο και την ενεργότητά τους ενάντια στον προηγούμενο στόχο                     τους που ήταν η πενικιλλίνη. Η ενεργότητα αυτή μειώθηκε από 0.3 kcal/mol εώς 4.2                           kcal/mol σε σχέση με την αγρίου τύπου πρωτεΐνη. Με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ στα                         στελέχη αυτά βρέθηκε ότι οι μεταλλάξεις αυτές μεγάλωσαν την κοιλότητα του ενεργού                       κέντρου της πρωτεΐνης - μία αλλαγή η οποία αποσταθεροποιεί ολόκληρη την τρισδιάστατη                       δομή. Ακόμη οι Wang et al. βρήκαν ότι τα στελέχη που μπόρεσαν να επιβιώσουν αυτής της                               αλλαγής είχαν επίσης δευτερεύουσες μεταλλαγές οι οποίες αντιστάθμισαν την αστάθεια που                     έφεραν οι μεταλλαγές που πρόσθεσαν την νέα λειτουργία. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η                           αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ενεργότητας και της σταθερότητας όντως υπάρχει. 

Έπειτα οι Bloom et al. υπολόγισαν τις αποσταθεροποιητικές επιπτώσεις των                   λειτουργικών μεταλλάξεων στην δομή της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, οι συγγραφείς                 προσομοίωσαν την εξέλιξη των πρωτεϊνών για την επίτευξη υψηλότερης συγγένειας                   πρόσδεσης στο σύμπλοκο εισάγοντας μεταλλάξεις σε 20 lattice πρωτεΐνες. Αυτού του                     είδους οι πρωτεΐνες είναι απλοποιημένα μοντέλα πρωτεϊνών που μπορούν να                   χρησιμοποιηθούν για προσομοίωση του πρωτεϊνικού διπλώματος και την παρατήρηση της                   εξελιξιμότητα της πρωτεΐνης. Οι συγγραφείς βρήκαν ότι ανάμεσα σε όλες τις μεταλλαγμένες                       μεσόφιλες πρωτεΐνες μόνο το 35% διπλώθηκε στην μητρική του τρισδιάστατη δομή και ότι                         το μέσο ∆Gfolding

γι’αυτές τις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ήταν υψηλότερο από αυτό που                       παρατηρήθηκε στην άγριου τύπου πρωτεΐνη. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες                       που μεταλλάσσονται και εξελίσσονται αποκτώντας μία νέα λειτουργία συνήθως                 αποσταθεροποιούνται με τις αλλαγές που φέρνει αυτή η νέα επιθυμητή λειτουργία. Πολλές                       

2 

 

από αυτές τις πρωτεΐνες χάνουν την ικανότητα τους να διπλώνουν στην μητρική τους δομή                           και σε αυτές που συντηρούν αυτό το χαρακτηριστικό το μέσο ∆Gfolding είναι λιγότερο                         αρνητικό από ότι είναι στην αρχική πρωτεΐνη. 

Οι Liang et al. μελέτησαν την συσχέτιση μεταξύ της ενεργότητα των πρωτεΐνων και                         της σταθερότητα σε 2 συγγενείς μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMP), τις MMP-3 και MMP-12. Οι                       συγγραφείς εκτίμησαν την ενεργότητα αυτών των ενζύμων και βρήκαν ότι η MMP-12 έχει                         υψηλότερη σταθερά kcat/Km (second order rate constant) στην κατάλυση απ’ότι η MMP-3.                       Αντιθέτως, βρέθηκε ότι η MMP-3 έχει καταλυτικό domain κατά 2.8 kcal/mol πιο σταθερό                         απ’ότι η MMP-12. Οι επιστήμονες αξιολόγησαν τις δομές των δύο πρωτεασικών domain και                         βρήκαν ότι η MMP-3 περιείχε μεγαλύτερο αριθμό από κατάλοιπα προλίνης στις “exposed                       turns” ( ή σε μέρη της πρωτεΐνης όπου η κεντρική αλυσίδα της πρωτεΐνης αναδιπλώνεται                           στο εξωτερικό της τεταρτοταγής δομής); αυτό το χαρακτηριστικό υπολογίστηκε ως 0.7                     kcal/mol της επιπλέον σταθερότητας της MMP-3. Το υπόλοιπο 2.1 kcal/mol της επιπλέον                       σταθερότητας αποδόθηκε στα ίδια δομικά χαρακτηριστικά που μελέτησαν οι Wang et al. : η                           αυξημένη συγκέντρωση θαμμένων ενεργών καταλοίπων στην περιοχή του ενεργού κέντρου                   αποσταθεροποιούσε την τεταρτοταγή δομή. Οι Liang et al. σύγκριναν τα ευρήματα τους με                         μία παλιά έρευνα που έγινε πάνω στην MMP-13 (collagenase 3) και MMP-1 (collagenase 1)                           στην οποία παρομοίως σημειώθηκε αύξηση στην ενεργότητα αλλα μείωση στην                   σταθερότητα της MMP-13 αναφορικά με την MMP-1. Και οι δύο έρευνες επιβεβαιώνουν την                         συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης ενεργότητας και της μειωμένης σταθερότητας. 

Οι παραπάνω έρευνες έδειξαν ότι οι μεταλλάξεις που βελτιώνουν την λειτουργία                       μειώνουν την σταθερότητα, όμως καμία από αυτές δεν δείχνει ότι αυτές οι “λειτουργικές”                         μεταλλάξεις αποσταθεροποιούν περισσότερο την πρωτεΐνη απ’ότι οι τυχαίες “ουδέτερες”                 μεταλλάξεις. Αυτό το έδειξαν οι Tokuriki et al. οι οποίοι εκτέλεσαν την ανάλυση τους                           υπολογιστικά χρησιμοποιώντας τον προσομοιωτή διπλώματος FoldX για να αναλύσουν τις                   τιμές του ∆∆Gfolding για 22 μεταλλαγμένες πρωτεΐνες αναφορικά με τις μητρικές πρωτεΐνες.                       Οι πρωτεΐνες που επιλέχθηκαν για αυτή την έρευνα είχαν την ικανότητα να διπλώνονται στο                           μητρικό τους δίπλωμα ακόμα και όταν εισήχθηκαν ουδέτερες ή λειτουργικές πρωτεΐνες.                     Περιέργως, η ανάλυση των πρωτεϊνών που υποβλήθηκαν σε λειτουργικές μεταλλάξεις και                     έπειτα διπλώθηκαν στο μητρικό τους δίπλωμα έδειξαν ότι ανέπτυξαν άλλες δευτερεύουσες                     μεταλλάξεις σε συνδυασμό με τις λειτουργικές. Μία πιο αναλυτική έρευνα σε αυτές τις                         δευτερεύουσες μεταλλάξεις έδειξε ότι σταθεροποιούσαν το μόριο (σταθεροποιητικές               μεταλλάξεις) και εντοπίζονται στην εξωτερική επιφάνεια της πρωτεΐνης. Είναι σημαντικό να                     σημειωθεί ότι οι πρωτεΐνες που είχαν υποστεί ουδέτερες μεταλλάξεις είχαν πολύ λιγότερες                       από αυτές τις σταθεροποιητικές μεταλλάξεις από ότι αυτές που είχαν υποστεί λειτουργικές                       μεταλλάξεις. Αυτή η ασυμφωνία δείχνει ότι οι λειτουργικές μεταλλάξεις, οι πιο πολλές από                         τις οποίες ήταν υποκαταστάσεις πολικών αμινοξέων στο εσωτερικό της πρωτεΐνης είτε                     κόντα είτε μέσα στο ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης, αποσταθεροποιούσαν ενδογενώς την                     πρωτεΐνη. Στην προσπάθεια αυτών των πρωτεϊνών να επανακτήσουν την σταθερότητά τους                     πρόσθεσαν κι άλλες μεταλλάξεις που θα αντιστάθμιζαν την αποσταθεροποιητική επίδρασή                   αυτών των υποκατεστημένων καταλοίπων.     

3 

 

3. Η σταθερότητα προάγει την εξελιξιμότητα  

Είναι γνωστό ότι οι βιολογικές διαδικασίες προσαρμόζονται για να λειτουργούν με                     τον μέγιστο δυνατό τρόπο στο περιβάλλον στο οποίο είναι ο οργανισμός. Αυτή η                         προσαρμογή των βιολογικών διεργασιών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό στην εξέλιξη των                     πρωτεϊνών, που ρυθμίζουν αυτές τις διεργασίες. Γι’αυτό και τις τελευταίες δύο δεκαετίες οι                         επιστήμονες μελετούν πως οι πρωτεΐνες εξελίσσονται και πως η εξέλιξη τους αυτή επιδρά                         στις βιολογικές διεργασίες που καταλύουν και ρυθμίζουν. Για να εξελιχθεί μία πρωτεΐνη                       πρέπει να αποκτήσει μία νέα λειτουργία κυρίως μέσω κάποιας μετάλλαξης. Ωστόσο, όπως                       έχει ήδη αναφερθεί η εισαγωγή μιας μεταλλαγής σε μία πρωτεΐνη οδηγεί πιθανόν στην                         αποδιάταξη της. Μια πρωτεΐνη που έχει την δυνατότητα να της εισάγουμε μία λειτουργική                         μεταλλαγή και να παραμείνει σταθερή θεωρούμε ότι έχει υψηλή εξελιξιμότητα. Παρακάτω θα                       αναφερθούν τρεις έρευνες που αποδεικνύουν ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ σταθερότητας                   και εξελιξιμότητας. 

Το πρώτο από αυτές τις δημοσιεύσεις ήταν μία ανασκόπηση που γράφτηκε από                       τους Camps et al. οι οποίοι κατέληξαν με την βοήθεια παλιών ερευνών στα τρία βασικά                             χαρακτηριστικά μιας πρωτεΐνης τα οποία σχετίζονται με την αύξηση της εξελιξιμότητας της.                       Το πρώτο αυτών είναι η “ανηθικότητα” (promiscuity) το οποίο ορίζεται ως η ικανότητα μιας                           πρωτεΐνης να αναγνωρίζει διαφορετικά υποστρώματα ή καταλύτες ή διαφορετικές χημικές                   αντιδράσεις. Οι Camps et al. εξήγησαν ότι μία “ανήθικη” πρωτεΐνη θα είναι πιο εξελίξιμη                           απ’ότι άλλες πρωτεΐνες γιατί αυτές οι πρωτεΐνες χρειάζονται λιγότερες υποκαταστάσεις                   αμινοξέων για να αναπτυχθεί μία νέα λειτουργία. Είναι λογικό ότι μια πρωτεΐνη που                         χρειάζεται αντικατάσταση έξι αμινοξέων για να αναπτύξει μία νέα λειτουργια θα είναι πιο                         εξελίξιμη από μια άλλη που χρειάζεται σαράντα. Το δεύτερο χαρακτηριστικό που σχετίζεται                       με την εξελιξιμότητα είναι το “modularity”, δηλαδή την ύπαρξη λειτουργικών αυτόνομων                     μοτίβων. Οι Camps et al. ανέφεραν ότι μια πρωτεΐνη που περιέχει πολλά μοναδικά και                           αυτόνομα subdomains μπορεί να αναπτύξει μια λειτουργικότητα σε ένα από αυτα τα                       domain η οποία δεν σχετίζεται με κάποια ήδη υπάρχουσα, όπως μία ενεργότητα ενζύμου.                         Υποστήριξαν επίσης ότι ένα subdomain ενός ενζύμου το οποίο δεν έχει κάποιο ενεργό                         κέντρο συνήθως χρειάζεται να υπομείνει λιγότερες αποσταθεροποιητικές μεταλλάξεις για να                   αναπτύξει ένα ενεργό κέντρο για ένα νέο υπόστρωμα .  

Το τρίτο και πιο βασικό χαρακτηριστικό είναι η ανθεκτικότητα στις μεταλλάξεις. Οι                       Camps et al. πρότειναν δύο τύπων μεταλλακτική ανθεκτικότητα : την εξωγενή και την                         ενδογενή. Η εξωγενής ανθεκτικότητα προσφέρεται σε μία πρωτεΐνη από τις                   πρωτεΐνες-συνοδούς (chaperone proteins) ή από την αλληλεπίδραση με άλλες κοντινές                   πρωτεΐνες. Η ενδογενής ανθεκτικότητα προσδίδεται από συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της                 ίδιας της πρωτεΐνης τα οποία της επιτρέπουν να αντιστέκεται σε πιθανές                     αποσταθεροποιητικές επιδράσεις τις οποίες οι Tokuriki et al. ονόμασαν λειτουργικές                   μεταλλάξεις. Επομένως οι ενδογενής ανθεκτικότητα είναι μια λειτουργία της έμφυτης                   σταθερότητας μιας πρωτεΐνης, όποτε συμπεραίνουμε ότι η εξελιξιμότητα είναι άμεσα                   συνδεόμενη με την σταθερότητα μιας πρωτεΐνης. 

Αυτή η συσχέτιση μπορεί ακόμα να υποστηριχθεί από τα δεδομένα πολλών ακόμη                       ερευνών που επιβεβαίωσαν ότι η ανθεκτικότητα και η σταθερότητα μιας πρωτεΐνης σε                       μεταλλάξεις αυξάνουν την εξελιξημότητα. Οι Caetano-Anolles et al. χρησιμοποίησαν μια                   ενδιαφέρουσα πειραματική μέθοδο για να αξιολογήσουν την επίδραση της σταθερότητας                   μιας πρωτεΐνης στην εξελιξιμότητα. Οι συγγραφείς εισήγαγαν μία δοκιμαστική πρωτεΐνη (test                     

4 

 

protein) στην αμινοξική ακολουθία πολλών β-λακταμάσων, οι οποίες μετά εκφράστηκαν                   στην Escherichia coli. Βρέθηκε ότι τα βακτήρια που εξέφρασαν πιο σταθερές β-λακταμάσες                       (για παράδειγμα με χαμηλότερες τιμές ΔΔGfolding κατα την εισαγωγή της δοκιμαστικής                     πρωτεΐνης) ήταν πιο ανθεκτικές σε ένα ευρύ φάσμα παραγώγων της πενικιλλίνης. Αυτό το                         αποτέλεσμα υποστηρίζει την άποψη ότι οι πιο σταθερές πρωτεΐνες μπορούν καλύτερα να                       φιλοξενήσουν λειτουργικές μεταλλάξεις. 

Μια άλλη έρευνα που επιβεβαιώνει την ύπαρξη μιας θετικής συσχέτισης μεταξύ της                       σταθερότητας μιας πρωτεΐνης και της εξελιξιμότητας έγινα από τους Philip et al. οι οποίοι                           πειραματικά παραποίησαν την λειτουργία της photoactive yellow protein (PYP)- ενός                   φωτοϋποδοχέα 125 καταλοίπων που ανήκει στην PER-ARNT-SIM (PAS) υπεροικογένεια. Οι                   PAS πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι είναι ποικίλες - υπάρχουν πάνω από 20000 διαφορετικά                         PAS domains τα οποία χαρακτηρίστηκαν από χιλιάδες σηματοδοτικές πρωτεΐνες σε ένα                     μεγάλο εύρος οργανισμών από βακτήρια εώς τον άνθρωπο. Οι επιστήμονες εξερεύνησαν                     την ποικιλότητα αυτής της τάξης των πρωτεϊνών για να καθορίσουν ποιο δομικό στοιχείο                         είναι υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα στις μεταλλάξεις. Συστηματικά άλλαξαν κάθε ένα από                       τα 125 κατάλοιπα αυτής της πρωτεΐνης ένα προς ένα, αλλάζοντας όλα τα non-Ala                         κατάλοιπα με Ala, και όλα τα Ala κατάλοιπα με Gly, και εισηγαγαν αυτές τις μεταλλαγμένες                             πρωτεΐνες σε 125 στελέχη E.coli. Εφόσον η PYP είναι ένας φωτοϋποδοχέας, οι επιστήμονες                         μπόρεσαν επιτυχώς να μετρήσουν τις διαφορές στην πρωτεϊνική λειτουργία βασιζόμενοι σε                     μεταβολές σε τέσσερα κριτήρια: την οπτική μέγιστη απορρόφηση (visible absorbance                   maximum), το pKa, το fluorescence quantum yield και τον χρόνο ζωής της ασταθής                         κατάστασης “pB”—ή κατάσταση όπου έχουμε blue-shifted absorbance. Αυτές οι μεταβολές                   μελετήθηκαν μαζί με άλλα δύο μεγέθη της πρωτεϊνικής σταθερότητας: την μεταβολή στις                       τιμές του ΔGU (ένα μέτρο της θερμοδυναμικής σταθερότητας ενάντια στο ξεδίπλωμα) και το                         επίπεδο παραγωγής πρωτεΐνης. Οι ερευνητές βρήκαν ότι πολλές από τις υποκαταστάσεις                     που εισήγαγαν προκάλεσαν σημαντικές αλλαγές στις μετρήσεις για την λειτουργικότητα,                   επιβεβαιώνοντας ότι υπάρχει υψηλή μεταλακτική δυναμική για την PYP. Επίσης βρήκαν ότι                       οι αλλαγές σε πολλά από τα 23 κατάλοιπα που γνωρίζουμε ότι είναι υψηλά συντηρημένα                           στα PAS domains (τα περισσότερα βρίσκονται μακριά από το ενεργό κέντρο) είτε μείωσαν                         σημαντικά το ΔGu της PYP πρωτεΐνης ή μείωσαν γενικά την παραγωγή πρωτεΐνης. Από αυτό                           συμπέρανα ότι η υψηλή ανθεκτικότητα σε μεταλλάξεις των PAS domain προέρχεται από το                         ότι οι μεταλλαξεις σε πολλά από τα κατάλοιπα αλλάζει την λειτουργία την πρωτεΐνης και ότι                             μία μικρή ομάδα κλειδί από υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα προσφέρει την κατάλληλη                     σταθερότητα για να υποστηριχτούν αυτές οι μεταλλάξεις   

4. Θερμόφιλες πρωτεΐνες και θερμική σταθερότητα Λόγω της αντιστρόφως ανάλογης σχέσης που φαίνεται να συνδέει την σταθερότητα με τη                         λειτουργικότητα/ενεργότητα των πρωτεϊνών, καθίσταται δύσκολο να εισαχθούν μεταλλαγές               που θα προάγουν μια νέα λειτουργία σε μια πρωτεΐνη, χωρίς ταυτόχρονα να                       αποσταθεροποιούν σε κρίσιμο βαθμό τη δομή της. Αυτό το δεδομένο αποτελεί εμπόδιο                       στην ανάπτυξη της λειτουργικής εξέλιξης των πρωτεϊνών μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής, το                     οποίο θα μπορούσε να ξεπερασθεί με τη χρήση πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλη                       

5 

 

μεταλλακτική ανθεκτικότητα – άρα είναι, επομένως, περισσότερο εξελίξιμες, όπως                 αναλύθηκε – και υψηλή δομική σταθερότητα. Τα χαρακτηριστικά αυτά φαίνονται ότι                     συγκεντρώνονται στις θερμόφιλες και τις υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες, δηλαδή τις πρωτεΐνες                   που απομονώνονται από θερμόφιλους (βέλτιστη ανάπτυξη στους 45-80 °C) και                   υπερθερμόφιλους (βέλτιστη ανάπτυξη σε θερμοκρασίες άνω των 80°C) μικροοργανισμούς.                   Σε αντιπαραβολή προς αυτές, οι μεσόφιλες πρωτεΐνες αποτελούνται από αυτές που                     απομονώνονται από οργανισμούς με βέλτιστη ανάπτυξη στους 15-45 °C. Πολλαπλές μελέτες της τελευταίας δεκαετίας έχουν δείξει ότι οι θερμόφιλες πρωτεΐνες                     παρουσιάζουν αυξημένη δομική σταθερότητα που χαρακτηρίζεται από την ιδιότητά τους να                     ανθίστανται περισσότερο στη μετουσίωση επαγώμενη από διάφορους παράγοντες, ενώ έχει                   δειχθεί ότι μετά από μετουσίωση ορισμένες δύνανται να επαναδιπλωθούν σε τριτοταγείς                     δομές κοντά στην αρχική. Στις ιδιαίτερες ιδιότητες αυτές που εμφανίζουν οι θερμόφιλες                       πρωτεΐνες αποδίδεται μια πολυπαραγοντική εξήγηση. Οι θερμόφιλες πρωτεΐνες, σε                 σύγκριση με τις ανάλογες μεσόφιλες, φαίνεται ότι έχουν: 

l Αυξημένο αριθμό ιοντικών αλληλεπιδράσεων l Μεγαλύτερη μέση υδροφοβικότητα των κρυμμένων πλευρικών αλυσίδων l Πιο συμπαγή τριτοταγή δομή πρωτεϊνικού πυρήνα l Περισσότερους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ κρυμμένων και εκτεθειμένων              

καταλοίπων   

Ιοντικές αλληλεπιδράσεις 

Οι Szilagyi και Zavodszky μελέτησαν θερμόφιλες και υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες και                   κατέληξαν σε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της θερμικής σταθερότητας και του                     αριθμού των ιοντικών δεσμών της πρωτεϊνικής δομής. Επίσης, παρατήρησαν ότι οι                     υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από αυξημένη ισχύ ιοντικών δεσμών               (υπολογιζόμενη σε απόσταση ατόμων σε Å), σε σύγκριση με τις αντίστοιχες                     μεσόφιλες. Οι Gromiha et al. επιβεβαίωσαν τα παραπάνω, υπολογίζοντας ότι το                     68% των θερμόφιλων πρωτεϊνών παρουσιάζουν περισσότερους ισχυρούς ιοντικούς               δεσμούς σε βαθμό στατιστικά σημαντικό σε σχέση με τις ανάλογες μεσόφιλες                     πρωτεΐνες.   

Μέση υδροφοβικότητα κρυμμένων πλευρικών αλυσίδων 

Οι Gromiha et al. κατέληξαν επίσης στο ότι η έντονη υδροφοβικότητα του                       εσωτερικού των θερμόφιλων πρωτεϊνών αποτελεί το σημαντικότερο δομικό στοιχείο                 που συντελεί στη θερμική τους σταθερότητα, σημειώνοντας ότι το 80% των                     θερμόφιλων πρωτεϊνών που εξετάσθηκαν χαρακτηρίζονται από υψηλότερη μέση               υδροφοβικότητα των εσωτερικών καταλοίπων (18,5 kcal/mol) σε σχέση με τις                   αντίστοιχες μεσόφιλες (17,7 kcal/mol). Απ’ εναντίας, σε ό,τι αφορά τα εξωτερικά                     κατάλοιπα, δε βρέθηκε σημαντική διαφορά στη μέση υδροφοβικότητα ανάμεσα στις                   δύο ομάδες πρωτεϊνών. Οι Takano et al. παρατήρησαν ότι μεταλλάγματα εστερασών απομονωμένα από                   θερμόφιλα και υπερθερμόφιλα αρχαία ήταν σε θέση να διατηρήσουν ενζυμική                   ενεργότητα σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες από ότι μεταλλάγματα εστερασών               

6 

 

μεσόφιλων βακτηρίων. Αξιοσημείωτο κρίνεται επίσης ότι ορισμένα μεταλλάγματα               των ενζύμων των υπερθερμόφιλων οργανισμών παρουσίασαν μεγαλύτερη σχετική               ενζυμική ενεργότητα (μέχρι και 1,8 φορές), σε σύγκριση με το ένζυμο αγρίου τύπου,                         κάτι που δεν παρατηρήθηκε για κανένα από τα μεταλλάγματα των ενζύμων των                       μεσόφιλων βακτηρίων. Βρέθηκε ότι τα θερμόφιλα ένζυμα διέθεταν κρυμμένα                 αμινοξικά κατάλοιπα με σημαντικά μεγαλύτερη μέση υδροφοβικότητα σε σχέση με τα                     αντίστοιχα των μεσόφιλων ενζύμων. Τέλος, ένα ακόμη σημαντικό εύρημα από αυτή                     τη μελέτη αποτελεί το γεγονός ότι το 90% των μεταλλαγμάτων των θερμόφιλων                       ενζύμων που τελικά ήταν θερμικά ασταθή είχαν υποστεί αντικατάσταση κάποιου                   εσωτερικού αμινοξέος, ενώ μόνο το 30% των μεταλλαγμάτων που διατήρησαν τη                     θερμική τους σταθερότητα είχαν υποστεί τέτοια αντικατάσταση. Συνολικά, τα αποτελέσματα των δύο αυτών μελετών καταδεικνύουν την εσωτερική                   υδροφοβικότητα της πρωτεΐνης ως κύριο χαρακτηριστικό που συνδράμει στη                 διαμόρφωση μιας θερμικά σταθερής δομής. Μια πιθανή εξήγηση για αυτή την                     ιδιότητα θα μπορούσε να είναι ότι τα πιο υδρόφοβα κατάλοιπα, τοποθετημένα προς                       το εσωτερικό του πρωτεϊνικού μορίου έχουν τη δυνατότητα να προσκολλώνται                   σφικτότερα και αποτελεσματικά το ένα με το άλλο, με αποτέλεσμα να ανθίστανται                       στην επίδραση του εκάστοτε αποδιατακτικού παράγοντα. 

  

Συμπαγής τριτοταγής δομή πρωτεϊνικού πυρήνα 

Οι Meruelo et al. διαπίστωσαν ότι οι θερμόφιλες πρωτεΐνες περιέχουν υψηλότερη                     ποσότητα μικρών αμινοξικών καταλοίπων, όπως Gly, Ala, Ser, Val, και μικρότερη                     ποσότητα μεγάλων και/ή πολικών αμινοξικών καταλοίπων όπως Cys, Asp, Glu, Gln,                     Arg. Σημειώνουν ότι ο μικρότερος αριθμός ογκώδων και υψηλά δραστικών                   καταλοίπων επιτρέπει στην πρωτεΐνη να λάβει μια σφιχτότερη, πιο συγκρατημένη                   εσωτερικά τριτοταγή δομή, που ανθίσταται στην αποδιάταξη και τη συσσωμάτωση.                   Αντίστοιχα αποτελέσματα προέκυψαν και από τη μελέτη των Glyakina et al., βάσει                       των οποίων οι θερμόφιλες πρωτεΐνες που μελετήθηκαν ήταν πιο συμπαγώς                   πακεταρισμένες από τις αντίστοιχες μεσόφιλες. Με το ίδιο σκεπτικό, οι Tompa et al. έδειξαν ότι ακόμη και στις θερμόφιλες                           πρωτεΐνες που περιέχουν πολλά κατάλοιπα με μακριές, υδρόφοβες πλευρικές                 αλυσίδες, αυτά βρίσκονται πακεταρισμένα στον πυρήνα της τριτοταγούς δομής με                   τέτοια διάταξη ώστε να μεγιστοποιείται η μεταξύ τους αλληλεπίδραση και κατά αυτό                       τον τρόπο καθιστούν τον πυρήνα μια συμπαγή, σταθερή δομή. Τέλος, περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι οι υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες διαθέτουν                 σημαντικά περισσότερους δισουλφιδικούς δεσμούς, τόσο σε σύγκριση με τις                 θερμόφιλες, όσο και με τις μεσόφιλες πρωτεΐνες, χαρακτηριστικό που μεγιστοποιεί                   τη συνδεσιμότητα μεταξύ των καταλοίπων του πυρήνα και τη σταθερότητα της                     τριτοταγούς δομής. Συνολικά, μπορούμε να θεωρήσουμε ότι, βάσει αυτών μελετών, η διάταξη των                     καταλοίπων σε συμπαγείς δομικούς πυρήνες συνεισφέρει στην αποτελεσματικότερη               μεταξύ τους αλληλεπίδραση και, κατ’ επέκταση, στη δομική και θερμική                   σταθερότητα μιας πρωτεΐνης. 

  

7 

 

    

Δεσμοί υδρογόνου μεταξύ κρυμμένων και εκτεθειμένων καταλοίπων 

Ο αριθμός και η κατανομή των υδρογονικών δεσμών στο μόριο της πρωτεΐνης                       φαίνεται ότι είναι το τέταρτο καθοριστικό στοιχείο για τη δημιουργία μιας θερμικά                       σταθερής δομής. Οι Tompa et al. έδειξαν ότι υπάρει διαφορά σε αυτά τα                         χαρακτηριστικά ανάμεσα στις θερμόφιλες και τις μεσόφιλες πρωτεΐνες. Πιο                 συγκεκριμένα, υπολόγισαν ότι το 49% των υδρογονικών δεσμών στις θερμόφιλες                   πρωτεΐνες αναπτύσσονται μεταξύ καταλοίπων του πυρήνα και καταλοίπων του                 εξωτερικού της πρωτεΐνης, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τις μεσόφιλες είναι μόλις                       42%. Επιπροσθέτως, καταγράφηκε ότι το 49% των υδρογονικών δεσμών των                   θερμόφιλων πρωτεϊνών αναπτύσσονται μεταξύ ατόμων της κεντρικής πρωτεϊνικής               αλυσίδας και των πλευρικών αλυσίδων των καταλοίπων, ενώ το ίδιο ισχύει μόνο για                         το 39% των δεσμών των μεσόφιλων πρωτεϊνών. Οι ερευνητές πρότειναν δύο βασικούς λόγους στους οποίους πιθανώς οφείλεται η                     επίδραση των υδρογονικών δεσμών στη θερμική σταθερότητα των πρωτεϊνών: 

1. Ο αυξημένος αριθμός υδρογονικών δεσμών ανάμεσα σε κρυμμένα και                  εκτεθειμένα κατάλοιπα συνεπάγεται μια ισχυρότερη σύνδεση του             ευάλωτου εξωτερικού τμήματος της πρωτεΐνης με τον προστατευμένο και                 σταθερό της πυρήνα, επομένως και μια συνολική ανθεκτικότητα στη                 διατάραξη της αναδίπλωσής της 

2. Ο αυξημένος αριθμός υδρογονικών δεσμών ανάμεσα στην κεντρική                πρωτεϊνική αλυσίδα και στις πλευρικές βάσεις των καταλοίπων               αντικατοπτρίζει μια εκτενή διασύνδεση όλων των δομών της τριτοταγούς                 δομής, η οποία προσδίδει μια συνολική συνοχή στην πρωτεΐνη και την                     καθιστά λιγότερο ευάλωτη στη μετουσίωση. 

 Συνολικά, λοιπόν, η θερμική σταθερότητα των θερμόφιλων πρωτεϊνών φαίνεται ότι μπορεί                     να αποδοθεί στα τέσσερα αυτά χαρακτηριστικά τους. Σημαντικό κρίνεται να τονισθεί το                       γεγονός ότι ενώ ο υψηλότερος αριθμός ιοντικών αλληλεπιδράσεων σε πρώτη ανάλυση                     μπορεί να θεωρηθεί ασύμβατος με την αυξημένη μέση υδροφοβικότητα των αμινοξικών                     καταλοίπων, στην περίπτωση των θερμόφιλων πρωτεϊνών δεν είναι: οι περισσότεροι ιοντικοί                     δεσμοί είναι εμφανείς, ενώ παράλληλα τα μη ιοντικά κατάλοιπα παρουσιάζουν σημαντικά                     μεγαλύτερη υδροφοβικότητα, σε σύγκριση με τις μεσόφιλες πρωτεΐνες. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές ουσιαστικά αυξάνουν την ακαμψία της τριτοταγούς δομής,                   καθιστώντας τη πιο σταθερή, καθώς η ακαμψία και η θερμική σταθερότητα των πρωτεϊνικών                         δομών φαίνεται ότι έχουν σχέση ευθέως ανάλογη. Σε ό,τι αφορά τη δυσκολία που μπορεί να                             παρουσιάζει σε επίπεδο λειτουργικότητας μια δύσκαμπτη πρωτεΐνη, γίνεται κατανοητό ότι                   οι θερμόφιλες και υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες δε συναντούν αυτό το εμπόδιο στο                     περιβάλλον στο οποίο παράγονται, καθώς οι υψηλές θερμοκρασίες σε αυτό επιφέρουν                     υψηλή μοριακή κινητικότητα, με αποτέλεσμα την ευκολότερη αλληλεπίδραση ενεργού                 κέντρου και υποστρώματος. Με αυτό το σκεπτικό, ενδιαφέρον παρουσιάζει και η μελέτη                       των ψυχρόφιλων πρωτεϊνών, οι οποίες φαίνεται ότι χαρακτηρίζονται από τις ακριβώς                     αντίθετες ιδιότητες: διαθέτοντας εύκαμπτες τριτοταγείς δομές, μπορούν να υποστηρίξουν                 

8 

 

μοριακές αλληλεπιδράσεις με τα υποστρώματά τους ακόμη και στις πολύ χαμηλές                     θερμοκαρσίες στις οποίες παράγονται. Ως προς την πρωτεϊνική μηχανική, όμως, οι                     πρωτεΐνες που θα μπορέσουν να έχουν τη μεγαλύτερη χρησιμότητα είναι αυτές που θα είναι                           σε θέση να υποστούν πολλαπλές, συχνά αποσταθεροποιητικές μεταλλαγές, και παράλληλα                   να διατηρήσουν τη λειτουργικότητά τους, οι οποίες φαίνεται να είναι οι πιο άκαμπτες,                         θερμικά σταθερότερες θερμόφιλες και υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες.     

5.Οι θερμόφιλες πρωτεΐνες ως ικριώματα λειτουργικής εξέλιξης  Όπως εξηγήθηκε παραπάνω, εκτενείς έρευνες έχουν υποδείξει ότι οι θερμόφιλες και οι                       υπερθερμόφιλες πρωτεΐνες πασρουσιάζουν υψηλότερη ανθεκτικότητα σε μεταλλάξεις, σε               σύγκριση με τις αντίστοιχες μεσόφιλες. Το χαρακτηριστικό αυτό τις καθιστά κατάλληλα                     μόρια-ικριώματα για μελέτες πρωτεϊνικής εξελικτικής μηχανικής και κατ’ επέκταση για την                     ανάπτυξη αποτελεσματικότερων και νέων πρωτεϊνικών λειτουργιών με ευρείες εφαρμογές.                 Σ τις μελέτες που παρουσιάζονται παρακάτω συγκρίνεται η εξελιξιμότητα θερμόφιλων και                     μεσόφιλων πρωτεϊνών, και συνεπώς η δυνατότητά τους να χρησιμοποιηθούν ως μελλοντικά                     εργαλεία πρωτεϊνικής μηχανικής. 

Κυτόχρωμα P450 – TEM-1 β-λακταμάση 

Τα κυτοχρώματα P450 αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια ενζύμων τα οποία διαθέτουν                     προσθετική ομάδα αίμης στο ενεργό τους κέντρο. Οι Bloom et al. επέλεξαν δύο μορφές του                             κυτοχρώματος P450 BM3: τη μεσόφιλη 21B3 και τη θερμόφιλη 5H6, οι οποίες έχουν                         χαρακτηριστική διαφορά στην T50 τους, δηλαδή στη θερμοκρασία όπου παρουσιάζουν 50%                     απώλεια της λειτουργικότητάς τους (47oC και 62oC αντίστοιχα). Οι ερευνητές υπέβαλαν τις                       πρωτεΐνες σε διαδικασίες μεταλλαξογένεσης και εξέτασαν εάν οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες                   που προέκυψαν ήταν λειτουργικές, και κατά πόσο είχαν αναπτύξει νέες ενεργότητες.                     Δεδομένου ότι τα κυτοχρώματα P450 διαθέτουν ενεργότητες εξουδετέρωσης αντιβιοτικών,                 οι ενεργότητες που εξετάσθηκαν αφορούσαν την υδροξυλίωση τέτοιων μορίων.                 Παρατηρήθηκε ότι τα μεταλλάγματα της θερμόφιλης μορφής 5H6 μπορούσαν να                   παρουσιάσουν αναδίπλωση στο χώρο σε σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό (61%) σε σχέση με                       τα μεταλλάγματα της μεσόφιλης 21B3 (34%), επιβεβαιώνοντας την ιδέα της υψηλότερης                     ανθεκτικότητας σε μεταλλάξεις των θερμόφιλων πρωτεΐνών. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε               ότι τα θερμόφιλα μεταλλάγματα παρουσίασαν σε μεγαλύτερο ποσοστό και νέες                   λειτουργικότητες. Οι Bershtein et al. εργάστηκαν με μια θερμόφιλη μορφή της TEM-1 β-λακταμάσης, ένα                         ακόμη ένζυμο με δραστικότητα αποικοδόμησης αντιβιοτικών (β-λακταμικών αντιβιοτικών),               και εξέτασαν τη δυνατότητα ανάπτυξης νέων λειτουργίων του ενζύμου μέσω εισαγωγής                     μεταλλάξεων στο γονίδιό του. Οι μεταλλάξεις εισήχθησαν με μέθοδο ουδέτερης                   παρέκκλισης, με τη χρήση επιρρεπούς σε λάθη PCR (error-prone Polymerase Chain                     Reaction). Από τα μεταλλάγματα που προέκυψαν επιλέχθηκαν αυτά που παρουσιάζαν                   υψηλότερες τιμές T50 και ελέγχθηκε η εμφάνιση νέων ενεργοτήτων σε αυτά. Εντοπίσθηκε                       

9 

 

νέα ενεργότητα ενάντια σε αντιβιοτικά κεφαλοσπορίνης σε ορισμένα μεταλλάγματα, και                   μάλιστα σε υψηλή δραστικότητα. Και τα δύο παραπάνω παραδείγματα καταδεικνύουν τη σημαντικά μεγαλύτερη δυνατότητα                   των θερμόφιλων πρωτεϊνών να παρουσιάσουν νέες λειτουργικότητες, και επομένως να                   λειτουργήσουν ως εργαλεία για την ευκολότερη ανάπτυξη λειτουργικής εξέλιξης. 

Μοριακές συνοδοί θερμικού σοκ 

Σε μια άλλη μελέτη, οι Tokuriki και Tawfik υπέβαλαν τα ένζυμα GAPDH (αφυδρογονάση της                           3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης) και CA II (καρβονική ανυδράση II) στη διαδικασία της                     επιρρεπούς σε λάθη PCR, παρουσία και απουσία GroEL/GroES μοριακών συνοδών                   θερμικού σοκ. Παρατηρήθηκε ότι παρουσία των μοριακών συνοδών η ανθεκτικότητα των                     ενζύμων στις μεταλλαγές ήταν σημαντικά αυξημένη, δηλαδή τα ένζυμα που εξελίχθηκαν                     παρουσία μοριακών συνοδών ήταν σε θέση να ενσωματώσουν μεταλλαγές που                   προκαλούσαν μεγαλύτερη αύξηση της ενέργειας αναδίπλωσης ΔΔGfolding (μέχρι και 3,5                   kcal/mol) σε σχέση με αυτά που εξελίχθηκαν απουσία μοριακών συνοδών (μέχρι και 1,0                         kcal/mol). Και σε αυτή την περίπτωση, τα μεταλλάγματα που δημιουργήθηκαν παρουσία                     μοριακών συνοδών παρουσίασαν νέες λειτουργικότητες, και χαρακτηρίσθηκαν ως               «προσαρμοστικώς λειτουργικές» μορφές των ενζύμων. 

Κυτόχρωμα b και Κυκλοοξυγενάση I – Η ανάστροφη προσέγγιση 

Ενδιαφέρον παρουσιάζει η μελέτη των Aledo et al., καθώς σε αυτή επιλέχθηκαν δύο                         ανάλογες πρωτεΐνες των οποίων είναι γνωστή η εξελιξιμότητα, και εξετάσθηκε η σχετική                       μεταξύ τους θερμοανθεκτικότητα, προκειμένου να διευκρινισθεί η συσχέτιση των δύο                   ιδιοτήτων. Πιο συγκεκριμένα, βάσει εκτενούς προϋπάρχουσας βιβλιογραφίας, το κυτόχρωμα                 b θεωρείται ότι παρουσίαζει υψηλή εξελιξιμότητα, σε αντίθεση με την κυκλοοξυγενάση I. Οι                         ερευνητές εκτέλεσαν εικονικές μεταλλάξεις στις δύο πρωτεϊνικές αλληλουχίες, εκτέλεσαν                 στοίχιση με την πλατφόρμα βιοπληροφορικής ClustalX και υπολόγισαν την                 αποσταθεροποιητική επίδραση των μεταλλαγών μέσω του λογισμικού FoldX, σε τιμές                   ΔΔGfolding. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέση επίδραση των μεταλλαγών στο κυτόχρωμα b                         (~1 kcal/mol) ήταν πολύ χαμηλότερη από αυτή στην κυκλοοξυγενάση I (1,5-1,9 kcal/mol).                       Επιπροσθέτως, οι αντίστοιχες τιμές ΔΔGfolding του κυτοχρώματος βρίσκονταν εντός των                   ορίων αποσταθεροποιητικής επίδρασης μεταλλαγών σε θερμόφιλες πρωτεΐνες, ενώ οι τιμές                   για την κυκλοοξυγενάση I ήταν παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται σε μεσόφιλες                       πρωτεΐνες. Επομένως, η μελέτη αυτή καταδεικνύει τη σχέση εξελιξιμότητας και θερμικής                     σταθερότητας κατά τον ανάστροφο τρόπο, καθώς τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι οι                     πιο εξελίξιμες πρωτεΐνες παρουσιάζουν ανοχή σε αποσταθεροποιητικές μεταλλάξεις               παρόμοια με αυτή που παρουσιάζουν και οι πρωτεΐνες με υψηλή θερμική σταθερότητα.   

Τμηματοποίηση πρωτεϊνών και συνεργιστική λειτουργία 

Μια ιδιαιτέρως ενδιαφέρουσα προσέγγιση αποτελεί η κοπή μιας αρχικής πρωτεΐνης σε                     τμήματά της και ο εν συνεχεία έλεγχος της πιθανής ικανότητας αυτών να αλληλεπιδράσουν,                         να αναδιπλωθούν δίνοντας μια παρόμοια τριτοταγή δομή με αυτή της αρχικής πρωτεΐνης                       και να παρουσιάσουν ενεργότητα. Οι Nguyen et al. εργάστηκαν με κομμένες αδενυλικές                       

10 

 

κινάσες απομονωμένες από το υπερθερμόφιλο βακτήριο Thermotoga neapolitana, και από                   το μεσόφιλο βακτήριο Bacillus subtilis. Σε αυτή τη μελέτη δείχθηκε ότι οι θερμόφιλες                         αδενυλικές κινάσες ήταν σε θέση να αλληλεπιδράσουν λειτουργικά και να υποστηρίξουν την                       ανάπτυξη καλλιέργειας E. coli μετά από επώαση στους 40oC, σε αντίθεση με της μεσόφιλες                           αδενυλικές κινάσες. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η δυνατότητα συνεργιστικής λειτουργίας των                   τμημάτων των αρχικών πρωτεϊνών ήταν ευθέως ανάλογη προς την τιμή Tm (θερμοκρασία                       στην οποία επέρχεται μετουσίωση) των αρχικών πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα αυτά                   αποδόθηκαν στην ιδιότητα των τμημάτων των υπερθερμόφιλων ενζύμων να διατηρήσουν                   μια τριτοταγή δομή κοντινότερη σε αυτή που θα διέθεταν ως μέρος της αρχικής πρωτεΐνης,                           σε σύγκριση με τα τμήματα των μεσόφιλων ενζύμων. Σε ακόλουθη μελέτη των Segall-Shapiro et al., τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 44% των                         τμημάτων υπερθερμόφιλων αδενυλικών κινασών μπόρεσαν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη                 E. coli, σε αντιπαραβολή με το μόλις 6% των τμημάτων των μεσόφιλων ενζύμων που ήταν                             σε θέση να κάνουν το ίδιο. 

Εισδοχή πρωτεϊνικής επικράτειας 

Μια μέθοδος που εφαρμόζεται σε μελέτες πρωτεϊνικής μηχανικής είναι η εισδοχή μιας                       επικράτειας μιας πρωτεΐνης σε μια άλλη. Κατά τη διαδικασία αυτή δημιουργούνται                     πρωτεϊνικά σύμπλοκα πολλαπλών επικρατειών με συνδυαστικές λειτουργικότητες.             Σημαντικό μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι η εισδοχή αυτή προκαλεί σημαντική                     διαταραχή της σταθερότητας της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης-αποδέκτη, με                 αποτέλεσμα η τελική πρωτεΐνη να μην είναι λειτουργική ή να είναι ασταθής. Οι Kim et al. χρησιμοποίησαν τη θερμόφιλη πρωτεΐνη δέσμευσης της μαλτοδεξτρίνης του                       Pyrococcus furiosus ως πρωτεΐνη-αποδέκτη στην οποία εισήγαγαν επικράτειες από                 διάφορα ένζυμα. Τα αποτελέσματά τους έδειξαν ότι εάν η πρωτεΐνη που δέχεται την ξένη                           επικράτεια είναι θερμικά ανθεκτική, είναι πιθανότερο η επικράτεια που εισάγεται να είναι                       σταθερότερη στη χιμαιρική πρωτεΐνη από ότι στο αρχικό ένζυμο από το οποίο αποσπάται.                         Το αντίθετο αποτέλεσμα φάνηκε να δίνει η μεσόφιλη πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτοδεξτρίνης                     του E. coli, αφού η εισερχόμενη πρωτεϊνική επικράτεια παρουσίασε χαμηλότερη θερμική                     σταθερότητα στη χιμαιρική πρωτεΐνη από ότι στο αρχικό ένζυμο. Καθίσταται καταφανές,                     επομένως, ότι μια θερμόφιλη πρωτεΐνη-δέκτης μπορεί να λειτουργήσει ως σταθερό                   πρωτεϊνικό ικρίωμα για την εισαγωγή μεταλλαγών απόκτησης νέας λειτουργίας                 (gain-of-function mutations) σε πολλαπλές δυνητικά εισαχθείσες πρωτεΐνες, για τη δομή των                     οποίων οι μεταλλαγές αυτές θα ήταν καταστροφικές υπό άλλες συνθήκες.  

 6. Επίλογος  

Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, το πεδίο της πρωτεϊνικής μηχανικής προσπαθεί να                     εισάγει νέες λειτουργίες στα πρωτεϊνικά domain, το οποίο όμως εμποδίζετε λόγω της                       αποσταθεροποίησης του μορίου κατά την εισαγωγή των λειτουργικών μεταλλάξεων, δηλαδή                   των μεταλλάξεων που προσδίδουν τις νέες λειτουργίες. Για την αντιμετώπιση αυτού του                       προβλήματος οι ερευνητές ανακάλυψαν ότι όσο πιο σταθερές και εξελισσομενες είναι οι                       πρωτεΐνες τόσο πιο εύκολα μπορεί να εισαχθεί μία λειτουργική μετάλλαξη σε αυτές χωρις να                           αποσταθεροποιηθούν. 

11 

 

Οι θερμόφιλες πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένες σημαντικές δομικές               διαφορές από τις μεσόφιλες πρωτεΐνες και συνοδεύονται συνήθως από                 πρωτεΐνες-συνοδούς (chaperone proteins) οι οποίες βοηθούν την θερμόφιλη πρωτεΐνη να                   διατηρήσει την τρισδιάστατη δομή της σε υψηλές θερμοκρασίες. Ακόμη έχει βρεθεί ότι οι                         θερμόφιλες πρωτεΐνες είναι πιο εξελίξιμες και πιο ανθεκτικές σε μεταλλαγές που εισάγονται                       για να ενισχύσουν ή να αλλάξουν την λειτουργία. Αυτό καθιστά τις θερμόφιλες πρωτεΐνες ως                           ανώτερης ποιότητας ικριώματα στην πρωτεϊνική μηχανική.  

Συνεπώς οι θερμόφιλες πρωτεΐνες αποτελούν μία αποτελεσματική λύση για το                   εμπόδιο της σταθερότητας μιας πρωτεΐνης όταν μεταποιείτε η λειτουργία της. Η                     λειτουργικότητα και η σταθερότητα όντως έχουν μία αρνητική συσχέτιση, η σταθερότητα                     όντως προάγει την εξελισιμότητα και η αυξημένη σταθερότητα των θερμόφιλων πρωτεϊνών                     όντως τις καθιστά ένα αποτελεσματικό ικρίωμα για την εξέλιξη της πρωτεϊνικής                     λειτουργικότητας.    

12