Técnicas laboratorio enzimología

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2011 Sussane Ayed Jose Luis Pérez Memoria prácticas ENZIMOLOGÍA

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2011

Sussane Ayed

Jose Luis Pérez

Memoria prácticas ENZIMOLOGÍA

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Práctica 1

Estudios cinéticos en estadio preestacionarioActividad de la α-Quimiotripsina con acetato de p-nitrofenilo

Introducción

La α-quimiotripsina cata liza la hidrólisis del acetato de p-nitrofenilo a través de un intermediario acil-enzima, según el siguiente mecanismo:

Dónde B, se refiere al p-nitrofenol. Si la concentracione de AB es saturante, el primer equilibrio será rápido alcanzándose antes de que se alcance el estado preestacionario.

Esto se puede conseguir trabajando a condiciones no óptimas para el enzima, en este caso se modifica el pH a 5, lejos del pH óptimo 8, de forma que se enlentece el proceso y se puede seguir la cinética por mecanismos espectroscópicos simples, que se centra en la medida de la absorbancia del producto p-nitrofenol.

La ecuación cinética explícita para el mecanismo de una enzima hidrólitica es:

Objetivo

Determinar si la hidrólisis del p-nitrofenilo catalizado por la αQuimiotripsina responde al mecanismo indicado anteriormente, calculando las constantes de velocidad de las etapas individuales, así como de la concentración absoluta de Enzima. Por otro lado los ensayos con distinta concentración de enzima permiten determinar el número de centros activos.

EAB E · AB EA EAK 1, K−1 K 2 , B K 3

[B ]=[Eo]{k 2 k3 t /k 2k3k 2/k 2k32[1−e k 2k3 t ]}

Si el tiempo es suficientemente largo ,la ecuación se aproxima auna recta :

[B]=[Eo]{k 2 k3 t /k 2k3k 2/k 2k32}

Dónde la pendiente será velocidad enestado estacionario ,Vmáx ,y la ordenada enel origen una componente llamada Π

Vmáx=m=[Eo]k 2 k3 /k 2k 3Π=[Eo] k 2/k 2k 3

2

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1.1 Determinación de las concentraciones de p-nitrofenilo y α-quimiotripsina

Ya que ambos reactivos se preparan en el momento de realizar la práctica, una vez realizadas las diluciones de trabajo, las valoramos para comprobar su concentración exacta para trabajar con las cantidades correctas.

Para ello se realiza un espectro de Absorción entre 340 y 230 nm en cubetas de cuarzo y utilizando la ley de Lambert-Beer-Bouguer podemos obtener la concentración exacta de cada sustancia con la que trabajaremos más adelante.

p-nitrofenilo α-quimiotripsinaAmax

271 = 0,378 u.a Amax280 = 0,505 u.a

ε271 = 8145 M-1 cm-1 ε280 46000 M-1 cm-1

Mr = 181 Mr = 25000Dilución 1:800 Dilución 1/500L =1 L = 1

C= AE=0,378

8145=4,64 ·10−5 M

4,64 ·10−5·800 ·1000=37,12 mMComo la queremos a 2 mM, la diluimos:

1mL ·2mM=V 2·37,12 mMV 2=18,56 mL

Queríamos una disolución de 120uL a 150mg/mL

5,43 mM ·1,2 ·10−3 mL· 25000=163,5 mg /mLNo fue necesario modificarla.

C= AE= 0,505

46000=1,09·10−5 M

1,09 ·10−5 M · 500 ·1000=5,45mM

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Resultados experimentales. Cinéticas.

0 50 100 150 200 250 3000,00E+000

2,00E-005

4,00E-005

6,00E-005

8,00E-005

1,00E-004

1,20E-004

Cinetica estado Pre-estacionarioDilucion 1/50; aQuimiotripsina = 30uL

Tiempo (s)

[p-n

itrof

enilo

] (M

)

0 50 100 150 200 250 3000000000000

Cinetica Pre-estacionariaDilución 1/75; aQuimiotripsina 20uL

Tiempo (s)

[p-n

itrof

enilo

] (M

)

0 50 100 150 200 250 3000

0

0

0

0

0

Cinetica Pre-estacionariaDilución 1/150; aQuimiotripsina 10 uL

Tiempo (s)

[p-n

itrof

enilo

] (M

)

f(x) = 1,39E-07x + 5,19E-05R² = 4,35E-01

f(x) = 3,22E-08x + 3,07E-05R² = 9,92E-01

Π (M)D1/50 1,09E-004 7,99E-005 6,91E-008D1/75 7,26E-005 5,19E-005 1,39E-007D1/150 3,63E-005 3,07E-005 3,22E-008

Eo (M) m (M)

f(x) = 6,91E-08x + 7,99E-05R² = 9,78E-01

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Con lo que despejando de las ecuaciones llegamos a:

Ajuste Iterativo:

Los datos de laboratorio se analizaron con el programa Graffit, y realizó un ajuste iterativo a a la ecuación teórica, de forma que se obtuvieron los valores de Eo, K2 y K3 ajustados, de forma que podemos compararlos con los nuestros.

Como vemos los valores varían mucho entre ambos métodos. Esto pude deberse al error de medida experimental o a problemas de disolución de la Enzima. En cualquier caso, tampoco debemos fiarnos mucho de los datos obtenidos en el ajuste dado que tienen mucho error.

D1/50 D1/75 D1/1508,00E-005 7,00E-005 3,00E-0051,01E-001 9,06E-002 8,37E-0028,30E-004 7,60E-004 9,80E-004

Eo (M)K2 (s-1)K3 (s-1)

D1/50 D1/75 D1/150Eo (M) 1,09E-004 7,26E-005 3,63E-005K2 (s-1) 7,99E-005 1,39E-007 3,22E-008K3 (s-1) 6,04E-013 6,26E-013 9,66E-004

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Calculo de centros activos

Dado que K3<<K3 podemos despreciar el valor de K3, de forma que:

Haciendo la media de las aproximaciones podemos concluir que la aQuimiotripsina tiene un Centro Activo. Ademas esto concuerda con la realidad ya que sabemos que la enzima tiene un centro activo en el que se localiza un residuo de Serina 195, que es el responsable de la formación del complejo enzima sustrato.

Cuestiones

a. Explicar cómo y por qué se han determinado las concentraciones exactas de los distintos reactivos utilizados.

Primero se realizaron los cálculos teóricos y se realizo una primera disolución tanto del p-nitrofenilo, como de la enzima. Luego se midio la absorbancia de las disolución, y con el máximo de absorbancia y a través de la ley de Lambert-Beer, se obtiene la concentración exacta de la disolución. Los resultados entre las dos medidas pueden variar debido al error experimental, por esto es necesario realizar este paso, para conocer exactamente con que concentraciones estamos trabajando.

b. ¿Para que es conveniente obtener el espectro de Absorción del sustrato y del Enzima?

De igual modo, es conveniente para conocer las concentraciones de ambos reactivos, y asegurarnos de que trabajamos correctamente.

c. ¿Cuál es la concentración de enzima inicial utilizada en las distintas muestras?

−EoD1 /50=30 · 10−6 L ·5,45·10−3 M

1500·10−6 L=1,09 ·10−9 M

−EoD1 /70=20 · 10−6 L·5,45 ·10−3 M

1500·10−6 L=7,26·10−5 M

−EoD1 /150=10 · 10−6 L ·5,45 ·10−3 M

1500 ·10−6 L=3,63·10−5 M

Π=EoK 2

K2K32 ; K 3≈0 ; Π

Eo=Centros Activos

−D1/50=7,99 ·10−51,09 ·10−4

=0,73

−D1/75=5,19 ·10−57,26 ·10−5

=0,71

−D1/150=3,63· 10−53,07· 10−5

=1,18

0,730,711,183

=0,87≈1

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d. De acuerdo con las estimaciones de k2 y k3, ¿Se puede decir que la hidrólisis del p-nitrofenilo por al αQuimiotripsina sigue un mecanismo como el descrito en la introducción? ¿La reacción enzimática transcurriría siguiendo este mecanismo para cualquier valor de las constantes cinéticas?¿Se utilizaría el mismo procedimiento para estimarlas?

A la vista de los resultados podemos ver como la aparición de producto es marcadamente bi-fásica. Una primera fase de aparición explosiva, y una siguiente en la que se estabiliza. Por tanto podemos ver claramente, el estado pre-estacionario y el estado estacionario.

Se debe cumplir que las constantes sean positivas ya que si no la reacción tal como la hemos planteado no tendría lugar. También es necesario que K2>>K3, para que se forme y acumule p-nitrofenol.

No, habría que buscar otros procedimientos, ya que si por ejemplo K3>>K2 no se acumularía el intermediario que hemos medido.

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Practica 2Estudios Cineticos en estado Estacionario

Resultados Experimentales:

1,1 Determinación de la actividad de la ADH

La pendiente de la recta tangente en el origen nos da la velocidad inicial de la reacción (Vo).

Vo = 0,00303 u.a/s

NADH E340nm=6220 M −1 cm−1

Dilución 1/150Volumen Dilución 8· 10−5 LVolumen Cubeta1,2 ·10−3 L

Vo=3,03 · 10−3 ua /s6220 M−1 cm−1 =4,871 · 10−7 M / s

4,871 ·10−7 M / s · 150 · 1,2· 10−3 L8· 10−5 L

=1,0959 ·10−3 mol NADH /s · L de Enzima

1,0959 ·10−3 mol NADH / s · L de Enzima /1000mL=1,0959 ·10−6 mol NADH / s · mL de Enzima1,0959 · 10−6 mol NADH / s · mL de Enzima · 60 s=6,57585 ·10−5 mol NADH /min · mL de Enzima

La actividad original será de 6,57585· 10−5 mol NADH /min · mL de Enzima

0 50 100 150 200 250 300 350 4000,00E+00

2,00E-05

4,00E-05

6,00E-05

8,00E-05

1,00E-04

1,20E-04

1,40E-04

1,60E-04Actividad ADH

Tiempo (s)

A340

f(x) = 3,30E-03x + 1,26E-01R² = 9,89E-01

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1,2 Determinación de la constante de equilibrio de la reacción

Del ultimo valor de Absorbancia:

La concentraciónde protones vendrá determinada por el pH del medio , pH=8Luego H '=8·10−8 M

Contodos estos datos podemos abordar el cálculo de la Keq

Keq=[Acetaldehído ]· [NADH ] ·[H ' ][EtOH ] ·[NAD ' ]

Keq=[2,141 ·10−4 M ] ·[2,141 ·10−4 M ] ·[8·10−8 M ][1,12 M ] ·[3,3·10−4 M ]

Keq=9,92 ·10−12M

0 50 100 150 200 250 3000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Determinación Keq

Tiempo (s)

A340

A=E ·C · l1,332=6220M−1 cm−1·C ·1cm

[NADH ]=2,141 ·10−4 M

Dado que la reacción es :

Etanol+ NAD−Acetaldehído+ NADH+ H

[NADH ]=[Acetaldehído]=2,141 ·10−4 M

Para el NAD+ :Ci=5 ·10−3 MVi=8 ·10−5 L8 · 10−5 L · 5· 10−3 M

1,2 ·10−3L =3,3 · 10−4 MPara el Etanol :d =0,805 g /mlR=96Mr=46 Da

0,805 g ·0,96=0,7728 g de EtOH puro0,7728 g de EtOH puro /46Da=0,168mol EtOH /10−3 L=16,88 MComohemos utilizado80uL en la cubeta de1200uL :

8 ·10−6 L ·16,88 M1,2 ·10−3 L

=[EtOH ]=1,12 M

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2,3 Reversibilidad de la reacción

De igual manera que en el apartado anterior pero utilizando el ultimo dato de Absorbancia:

0,374=6220M−1 cm−1 · C ·1cm[NADH ]=6,012 · 10−5 M

La [Acetaldehído] será la incial más la añadida

50ul a 50mM que son una final de 2mM ;por tanto :

[Ac]=2,141 ·10−4 M + 2 · 10−3 M[ Acetaldehído]=2,2141 ·10−3 M

Para el resto de los reactivos tendremos encuenta que hemos modificado el Volumen finalasi :

[EtOH ]=8·10−5 L·16,8 M1,25·10−3 L

=1,0752 M

[NAD ' ]=8 ·10−5 L ·3,3·10−4 M1,25 ·10−3 L

=2,112·10−5 M

Keq=[Acetaldehído] ·[NADH ]· [H ' ][EtOH ] ·[NAD ' ] =

[2,2141 ·10−3 M ]· [6,012 · 10−5 M ] ·[8·10−8 M ][1,0752 M ] ·[2,112 · 10−5 M ]

Keq=4,68· 10−10

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

0,20,40,60,8

11,21,4

Reversibilidad de la reacción

Tiempo (s)

A340

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2,4 Determinación de los parámetros cinéticos

En este apartado se mantiene constante la concentración de enzima (D 1/150) y de NAD+

(5mM) y se varía la concentración de EtOH entre 5 y 150mM. Esto permitirá determinar la concentración de esto EtOH a la que se satura la enzima, así como los parametros cinéticos: Km, Vmax, kcat, kcat/Km; mediante el análisis gráfico de los resultados de la Vo.

T ie m p o (s )A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M)

5 m M 1 0 m M 2 5 m M 7 5 m M 1 5 0 m M15 0,029 0,023 0,080 0,056 0,18430 0,055 0,042 0,118 0,116 0,31645 0,082 0,059 0,154 0,171 0,42960 0,104 0,077 0,183 0,212 0,49175 0,127 0,090 0,210 0,253 0,55090 0,148 0,106 0,234 0,286 0,598

105 0,168 0,120 0,254 0,315 0,636120 0,184 0,130 0,273 0,340 0,662

0 20 40 60 80 100 120 1400,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

f(x) = 4,37E-03x + 1,88E-01R² = 9,35E-01

f(x) = 2,67E-03x + 3,81E-02R² = 9,79E-01

f(x) = 1,82E-03x + 6,51E-02R² = 9,85E-01

f(x) = 1,03E-03x + 1,16E-02R² = 9,94E-01

f(x) = 1,48E-03x + 1,19E-02R² = 9,95E-01

Ensayos a distintas [EtOH]

Determinación de Vo5 mMRegresión lineal para 5 mM10 mMRegresión lineal para 10 mM25 mMRegresión lineal para 25 mM75 mMRegresión lineal para 75 mM150 mM Regresión lineal para 150 mM

Tiempo (s)

Abs

340

nm

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NADH E340nm=6220M −1cm−1

Dilución 1/150Volumen Dilución 8 ·10−5 LVolumen Cubeta1,2 ·10−3 L[E ] ;331u /mg ;500u /mL ;1,5105mg /148000Da=1,0206 ·10−5 mol E

1,0206 ·10−5 mol /10−3 L=0,01020 M

Vo=1,48 ·10−3 ua / s6220 M −1 cm−1=2,3794 ·10−7 M / s

2,3794 ·10−7 M / s ·150 · 1,2 ·10−3 L8 ·10−5 L

=5,3536 ·10−4 mol NADH / s · L de Enzima

5,3536 ·10−4 mol NADH / s · L de Enzima/1000mL=5,3536 ·10−7 mol NADH /s ·mL de Enzima5,3536 ·10−7 mol NADH /s ·mL de Enzima ·60 s=3,2122 ·10−5 mol NADH /min·mL de Enzima

3,2122 ·10−5 mol NADH /min ·mL de Enzima /1,0206·10−5 mol de E¿3,1473 mol NADH /min ·mol de Enzima

Así con el resto de concentraciones:

2.5 Inhibición de la ADH por Metanol

El metanol puede ser oxidado por la ADH, lo cual puede provocar la inhibición de la actividad enzimatica. Para abordar el estudio de este proceso se ensaya la actividad variando la [EtOH] y manteniendo fija la [Metanol] a 50uL

[E tO H] (mM) Pendiente (ua/s) Vo (molNAD H/min·mL E ) Vo (molNAD H/min·molE )5 1,48E-03 3,21E-05 3,147

10 1,03E -03 2,24E-05 2,19025 1,82E -03 3,95E-05 3,87075 2,67E -03 5,79E-05 5,678

150 4,37E -03 9,48E-05 9,293

T ie m p o (s )A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M) + 5 0 u L Me t a n o l

5 m M 1 0 m M 2 5 m M 7 5 m M 1 5 0 m M15 0,002 0,011 0,025 0,091 0,11230 0,009 0,018 0,033 0,149 0,19245 0,014 0,025 0,044 0,195 0,27660 0,021 0,032 0,052 0,235 0,34675 0,027 0,039 0,062 0,272 0,40090 0,033 0,046 0,070 0,309 0,455

105 0,040 0,053 0,080 0,335 0,500120 0,046 0,059 0,088 0,362 0,543

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De igual manera que en el apartado anterior:

2.6 Cálculos y representaciones gráficas de

0 20 40 60 80 100 120 1400,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

f(x) = 4,09E-03x + 7,72E-02R² = 9,84E-01

f(x) = 2,54E-03x + 7,18E-02R² = 9,85E-01

f(x) = 6,06E-04x + 1,58E-02R² = 9,99E-01f(x) = 4,61E-04x + 4,25E-03R² = 1,00E+00

f(x) = 4,17E-04x - 4,18E-03R² = 9,99E-01

Estudio de la Inhibición por Metanol

Determinación de Vo5 mM

Regresión lineal para 5 mM10 mM

Regresión lineal para 10 mM25 mM

Regresión lineal para 25 mM75 mM

Regresión lineal para 75 mM150 mM

Regresión lineal para 150 mM

Tiempo (s)

Abs

340

[E tO H] (mM) Pendiente (ua/s) Vo (molNAD H/min·mL E ) Vo (molNAD H/min·molE )5 4,17E-04 9,05E-06 0,887

10 4,61E -04 1,00E-05 0,98025 6,06E -04 1,32E-05 1,28875 2,54E -03 5,51E-05 5,401

150 4,09E -03 8,88E-05 8,696

[E tanol] (mM) Vo (molNAD H/min·molE ) Vo + I (molNAD H/min·molE )5 3,147 0,887

10 2,190 0,98025 3,870 1,28875 5,678 5,401

150 9,293 8,696

1/[E tanol] (1/mM) 1/Vo (min·molE /molNAD H) 1/Vo+ I (min·molE /molNAD H)0,200 0,318 1,1280,100 0,457 1,0200,040 0,258 0,7760,013 0,176 0,1850,007 0,108 0,115

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De la representación, y sabiendo que:

– (-1/Km) corresponde al punto de corte en el eje Y– 1/Vmax corresponde al punto de corte con el eje X– Kcat conociento la Vmax y Eo; ya que: Vmax = Kcar · Eo. En este caso la Vmax será

igual que Kcat

Ya que:

– Km < Km (+I)– Vmax < Vmax (+I)

A la vista de los resultados no podemos concluir nada claro. Esperabamos una inhibición de tipo competitivo, con Km<Km(ap), pero no esperabamos que la velocidad máxima se mantuviese igual, y no es el caso, si no que aumenta.

Seguramente se debe a que los ajustes no son muy buenos y se no nos muestran una tendencia representativa.

K m (m M) V m a x (m o lN A D H /m in ·m o lE ) K c a t (1 /m in ) K c a t/K m (1 /m M·m in )S in Metanol 0,931 5,376 5,38 5,77C on Metanol 6,803 43,478 43,48 6,39

-0,800 -0,300 0,200 0,700 1,200 1,700

-0,100

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

f(x) = 0,147x - 0,023R² = 0,735

f(x) = 1,074x + 0,186R² = 0,414

Representación de Dobles inversos

1/Vo

1/[E

tOH

] (m

M)

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Cuestiones

a. Compara el valor de Km de ADH de levadura con el correspondiente al higado de caballo cuyo valor de Km es 5,5e-4 M. ¿Qué puedes concluir?

Nuestra Km es de 9,31e-4, lo que se mantiene en el mismo orden de magnitud que la de caballo.

La ADH de caballo esta formada por un dímero de 83300 Da y la de levadura por un tetrámero de 148000 Da, con 4 sitios de unión, por lo que debería tener mayor finidad por el sustrato que la de caballo, aunque nuestros resultados no lo muestren.

b. Diseña un protocolo experimental par determianr la Km para el NAD+, sabiendo que es alrededor de 74 um para la ADH de la levadura.

Procederiamos igual que para el Etanol.. Asegurandonos de que las concentraciones de etanol fuese limintante y la velocidad solo dependiese de la afinidad de la enzima por el NAD+.

Dado que la km para la ADH de levadura es de 74uM partiriamos de una concentración e iriamos incrementando la concentración de NAD+ en los siguientes tubos. Obtendriamos de esta forma la Vo de cada tubo, y con esto calcular la Km.

c. Sabiendo que el hígado humano si que puede oxidar el metanol ¿Como se podría determinar la inhibición ejercida?

Tanto la oxidación de metanol, como la de etanol, producen NADH, que es el producto que hemos ido siguiendo para determinar la cinetica. Así que en este caso no podriamos, ya que no estariamos seguros de si proviene del etanol o del metanol.

Para solucionarlo, podriamos acoplar una reacción a de forma que reaccionase el acetaldehido producido, y medir el producto. Luego seguiriamos el mismo procedimiento de la practica para determinar los parámetros cinéticos.

Etanol + NAD+ <-------ADH-------> Acetaldehído + NADHMetanol + NAD+ <---ADH------>Formaldehido + NADH

d. El procedimiento utilizado en la práctica, ¿sería adecuado para determinar el contenido de alcohol de las bebidas alcohólicas?

No, no sería adecuado, porque solo determinamos el NADH, pero solo hasta que se alcanza el equilibrio. Aunque si que podríamos desplazando la reacción completamente hacia los productos, haciendo reaccionar alguno de ellos. En este caso el NAD+, no debería ser un factor limitante.

Page 17: Técnicas laboratorio enzimología

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA α-AMILASA SALIVAR

Resumen

En esta experiencia estudiaremos la variación de la actividad α-amilasa con el pH. A partir de

este estudio se pretende determinar qué residuos están implicados en la actividad de esta enzima. Se realizara la estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad y

también un estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.

La enzima α-amilasa está presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces α(1-4) que unen las

glucosas en los polisacáridos. El procedimiento para ensayar la actividad de la α-amilasa, es el denominado método CNPG3. Y finalmente determinaremos si la curva de actividad frente al

pH de la enzima presenta forma acampanada.

Palabras clave: actividad α-amilasa, método CNPG3, pH, pK, tampón, cloruro, concentración

de enzima, velocidad inicial.

Introducción

La curva de actividad frente al pH de una enzima tiene con frecuencia una forma en campana.

La interpretación es que el resultado de la composición de dos curvas de titulación están solapadas, una correspondiente a un grupo que debe estar protonado para que la enzima tenga la

actividad máxima, y otra correspondiente a un segundo grupo, que debe estar desprotonado.

Las curvas de titulación dependerán del medio en el que se encuentran los grupos ionizables,

de forma que la presencia en sus proximidades de grupos cargados positiva o negativamente influye en su ionización, conduciendo a cambios significativos en los valores de pK

correspondientes.

La α-amilasa está presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces α(1-4) que unen las glucosas en los polisacáridos. También en análisis clínicos bioquímicos sirve para determinar el

diagnóstico de pancreatitis aguda. Donde la enzima se encuentra aumentada.

EL procedimiento que hemos realizado para determinar la actividad de la enzima en suero es el CNPG3. Donde a tasa de formación de CNP, medida a 405 nm, es directamente proporcional a

la actividad de la α-amilasa.

La reacción consiste en:

10 CNPG3 9 CNP + 1 CNPG2 + 9G3 + G

CNPG3: 2-cloro-4-nitrofenil malto triósido CNP: 2-Cloro-4-nitrofenol

G3: Maltotriosa

G: Glucosa

Page 18: Técnicas laboratorio enzimología

Materiales y métodos

1. Estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad

La disolución stock de α-amilasa (la 1/1000 en tampón tris-maleato 5 mM, pH 7.0), preparamos

disoluciones 1/5000, 1/10000, 1/20000 y 1/40000 (3 mL en tampón tris-maleato 100 mM, pH 7.0) y realizamos los ensayos de actividad.

La reacción se lleva a cabo en una cubeta del espectrofotómetro en la que se añaden 600μL de la disolución de α-amilasa y 200 μL de tampón de reacción R1 (acetato cálcico 5 mM, tiocianato

potásico 1.5M, MES 10 mM, pH 6.0). Agitamos bien con una pipeta Pasteur y ajustamos a cero

el espectrofotómetro. La reacción se inicia añadiendo 200 μL del sustrato CNPG3 (Preparado en

disolución R2) y se mide la variación de la absorbancia a 405 nm, cada 10 seg, durante 2 minutos. Repetimos los ensayos con las diferentes disoluciones de enzima en las mismas

condiciones.

También analizaremos también el efecto del cloruro en la actividad de la enzima, el

procedimiento es idéntico al anterior pero añadiéndole 50 μL de NaCl 4M, antes de añadir el

CNPG3

Eligimos la dilución de enzima cuya variación de A405 sea de entre 0.5 y 1 unidad de absorbancia en los dos minutos. La dilución de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto

para la presencia y ausencia de cloruro.

2. Estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.

Estimamos la variación de la actividad de la enzima en función del pH, llevamos acabo

experimentos como los descritos en el apartado anterior, preparando la enzima a la dilución

1/5000, pero utilizando en cada caso el tampón correspondiente al pH a ensayar. Los pHs que se van a estudiar son los siguientes: 4.0, 4.5 ,5.0 ,6.0,7.0 ,7.5 y 8.0

A partir de los datos obtenidos en este apartado y en el anterior, discutiremos qué residuos parecen estar implicados en la actividad de la enzima.

Resultados y discusión

1. Estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad

La dilución de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto para la presencia y ausencia de

cloruro.

Page 19: Técnicas laboratorio enzimología

Tabla 1. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada

dilución, en presencia y ausencia de cloruro.

dilucion 1/5000 pH 7

dilucion 1/10000 pH 7

dilucion 1/20000 pH 7

dilución 1/40000 pH 7

t A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl)

0 0.768 0.123 0.593 0.102 0.052 0.085 0.113 0.046

10 0.830 0.195 0.630 0.153 0.068 0.096 0.122 0.063

20 0.910 0.273 0.666 0.169 0.086 0.131 0.072

30 0.984 0.353 0.702 0.207 0.102 0.138

40 1.056 0.447 0.739 0.247 0.12 0.135 0.15

50 1.128 0.524 0.776 0.286 0.138 0.176 0.158 0.093

60 1.202 0.605 0.811 0.329 0.157 0.197 0.167 0.102

70 1.270 0.691 0.850 0.37 0.173 0.218 0.173

80 1.331 0.763 0.884 0.406 0.192 0.239 0.18

90 1.396 0.845 0.921 0.446 0.21 0.258 0.188

100 1.458 0.918 0.960 0.488 0.229 0.28 0.196

110 1.522 0.995 0.993 0.529 0.248 0.301 0.206

120 1.577 1.066 1.029 0.569 0.265 0.322 0.216

incr. A 120-0

0.809 0.943 0.436 0.467 0.213 0.237 0.103

incr. A 30-10

0.154 0.158 0.072 0.054 0.034 0.016

2. Estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.

Para cada uno de los ensayos se representará la A405 frente al tiempo y se determinará la

velocidad inicial de la reacción enzimática.

Tabla 2. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada dilución, en presencia y ausencia de cloruro

pH 4 pH 4.5 pH 5 pH 6

t A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl)

0 0.024 0.030 0.038 0.035 0.150 0.063 0.249 0.023

10 0.025 0.033 0.052 0.047 0.176 0.146 0.450 0.285

20 0.029 0.039 0.071 0.061 0.217 0.223 0.668 0.459

30 0.032 0.045 0.085 0.076 0.255 0.299 0.840 0.624

40 0.035 0.052 0.107 0.092 0.302 0.38 1.065 0.775

Page 20: Técnicas laboratorio enzimología

50 0.038 0.059 0.129 0.104 0.344 0.452 1.251 0.925

60 0.041 0.066 0.149 0.119 0.382 0.527 1.443 1.070

70 0.044 0.074 0.170 0.134 0.433 0.600 1.642 1.201

80 0.047 0.080 0.192 0.146 0.466 0.672 1.752 1.330

90 0.049 0.087 0.209 0.16 0.505 0.742 1.888 1.442

100 0.052 0.093 0.232 0.176 0.547 0.807 2.031 1.551

110 0.056 0.102 0.255 0.16 0.586 0.885 2.121 1.652

120 0.059 0.109 0.276 0.203 0.626 0.938 2.207 1.731

pH 7 pH 7.5 pH 8.0 A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) t

0.768 0.123 0.103 0.074 0.068 0.037 0

0.830 0.195 0.146 0.126 0.087 0.066 10

0.910 0.273 0.200 0.181 0.112 0.084 20

0.984 0.353 0.256 0.238 0.130 0.1 30

1.056 0.447 0.318 0.291 0.148 0.119 40

1.128 0.524 0.369 0.346 0.170 0.136 50

1.202 0.605 0.420 0.401 0.192 0.154 60

1.270 0.691 0.480 0.457 0.215 0.172 70

1.331 0.763 0.531 0.511 0.235 0.189 80

1.396 0.845 0.585 0.564 0.259 0.207 90

1.458 0.918 0.637 0.616 0.279 0.225 100

1.522 0.995 0.690 0.666 0.301 0.243 110

1.577 1.066 0.750 0.728 0.324 0.261 120

Figura 1. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 en ausencia

de cloruro.

y = 0,0003x + 0,0231 R² = 0,9979

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0 20 40 60 80 100 120 140

A4

05

t (s)

Vo a pH 4

Page 21: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 2. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 con

presencia de cloruro.

Figura 3. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 en

ausencia de cloruro.

Figura 4. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 con

presencia de cloruro.

y = 0,0007x + 0,0262 R² = 0,9969

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0 20 40 60 80 100 120 140

Títu

lo d

el e

je

Título del eje

Vo a pH 4 (NaCl)

y = 0,002x + 0,0308 R² = 0,9977

0

0,1

0,2

0,3

0 20 40 60 80 100 120

A40

5

t(s)

Vo a pH 4,5

y = 0,0014x + 0,0343 R² = 0,9993

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140

A4

05

t (s)

Vo a pH 4.5 (NaCl)

Page 22: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 5. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 en ausencia

de cloruro.

Figura 6. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 con

presencia de cloruro.

Figura 7. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 en ausencia

de cloruro.

y = 0,0041x + 0,14 R² = 0,9991

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t (s)

Vo a pH 5

y = 0,0014x + 0,0343 R² = 0,9993

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a pH5 (NaCl)

y = 0,0167x + 0,3501 R² = 0,9852

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

A4

05

t(s)

Vo a pH 6

Page 23: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 8. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 con

presencia de cloruro.

Figura 9. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 en ausencia de cloruro.

Figura 10. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 con

presencia de cloruro,

y = 0,0139x + 0,1715 R² = 0,9849

0

0,5

1

1,5

2

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a pH 6 (NaCl)

y = 0,0068x + 0,7772 R² = 0,9983

0

0,5

1

1,5

2

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a Ph 7

y = 0,008x + 0,1214 R² = 0,9995

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a pH 7 (NaCl)

Page 24: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 11. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 en

ausencia de cloruro.

Figura 12. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 con

presencia de cloruro,

Figura 13. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8 en ausencia de cloruro

y = 0,0054x + 0,0964 R² = 0,9997

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a pH 7.5

y = 0,0054x + 0,0738 R² = 0,9999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t(s)

Vo a pH 7.5 (NaCl)

y = 0,0021x + 0,0659 R² = 0,9995

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 20 40 60 80 100 120 140

A4

05

t(s)

Vo a pH 8

Page 25: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 14. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8con presencia de cloruro,

Tabla 3. Valores de Vo.

pH Vo Vo(NaCl)

4 0.0003 0.0007

4.5 0.002 0.0013

5 0.0041 0.0073

6 0.0167 0.0139

7 0.0068 0.008

7.5 0.0054 0.0054

8 0.0021 0.0018

Representaremos de velocidad frente a pH, a partir de la cual se debe estimar el pH óptimo de

la enzima.

Figura 15. Ausencia de cloruro, velocidad frente a pH

y = 0,0018x + 0,0448 R² = 0,9985

0

0,1

0,2

0,3

0 20 40 60 80 100 120 140

A40

5

t (s)

Vo a pH 8 (NaCl)

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0 2 4 6 8 10

velo

cid

ad

pH

Page 26: Técnicas laboratorio enzimología

Figura 16. Presencia de cloruro, velocidad frente a pH

Tabla 4. Valores de pKa en ausencia de cloruro.

Valor Std. Err.

pKa 1 5.5691 0.1126

pKa2 6.7377 0.1108

Tabla 4. Valores de pKa en presencia de cloruro

Valor Std. Err.

pKa 1 6.1589 0.175

pKa2 6.9952 0.1754

Los resultados obtenidos del tratamiento de datos experimentales nos indican que la enzima α-

amilasa posee una actividad máxima óptima a pH 6.1, en ausencia de cloruro y a ph 6.75 en

presencia de cloruro. Como la mayoría de los enzimas son muy sensibles a cambios de pH, se

puede observar como variaciones de pocas decimas por encima o por debajo del pH óptimo varia drásticamente la actividad. Esta campana es en realidad dos curvas de titulación, donde el

punto de inflexión nos indica los valores de pKa, a partir de los cuales vamos a poder deducir

que grupos ionizables están implicados en la actividad dde la enzima. Si observamos los alores de actividad máxima, vemos que es mayor en presencia de cloruro, por lo que podemos deducir

que el cloruro es un activador de la α-amilasa. El efecto que eerce este ión sobre la actividad

reside en su interacción con un residuo de lisisna cargado positivamente presente en el centro activo, lo cual debe generar un cambio de pKa en el entorno químico que rodea a los aparticos

implicados en la reacción, ocasionando una modificación del pH optimo del enzima que

aumenta acercándose al ph neutro, lo cual en condiciones biológicas favorecerá la reacción y la

velocidad de la misma ejerciendo por ello como activador.

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0 2 4 6 8 10

Ve

loci

dad

pH

Page 27: Técnicas laboratorio enzimología

Los aminoácidos suelen tener grupos ionizables en función de cuál sea el aminoácido.

En nuestra experiencia, observando la figura 15, hemos obtenido que los valores de pKa, en ausencia de cloruro , son aproximadamente 5.3 y 7.1. En presencia de cloruro los valores de pka

son de 5.6 y 7.4, aproximadamente. A partir de estos valores podemos deducir(aunque bastante

subjetivamente) que los grupos implicados podrán ser el grupo amino N-terminal (pKa=7.5), y el grupo imidazol de una histidina. Sin embargo, el hecho de que los pk estén próximos entre

ellos pueden provocar que exista una interferencia entre ellos, y que verdaderamente no sean los

valores reales.

Para acercarnos más al valor real de la pK, recurriremos al análisis de datos mediante

ordenador. Los valores obtenidos mediante ajuste interactivo son: pKa=5.6 y pKa=6.7 en

ausencia de cloruro, y pKa=6.2 pKa=7 en presencia de este ión. Estos valores podrían corresponder como hemos indicado antes al grupo amino N-terminal(pKa=7.5) y el grupo

imidazol de una histidina(pka=6.3).

Si observamos el articulo de Buoisson et al., sobre la estructura tridimensional de la amilasa

pancreática de porcino, descubrimos que los residuos responsables de la actividad catalítica son

2 residuos de aspartico. Este hecho nos deja entrever que puede ser que nuestros resultados pK

obtenidos estén influenciados por el entorno aminoácido que a ocasionado una variación significativa de los pK de los residuos determinados. Además como hemos citado antes, la

proximidad de los valores de pK corroborado por la existencia de 2 asparticos responsables de

actividad catalítica según estos autores puede ocasionar interferencias en los valores de pK obtenidos. Sin embargo, podemos pensar también que según Buisson et al., hay residuos de

histidina que intervienen en la unión del enzima al sustrato, y que por lo tanto, la distinta

ionización de este residuo también puede causar la variación de la actividad de la amilasa.

Page 28: Técnicas laboratorio enzimología

Cuestiones

1- Los grupos ionizables de los que depende la actividad de la enzima, ¿se encuentran necesariamente en el centro activo de la enzima? Justifica tu respuesta.

No. Una proteína adquiere su estructura nativa activa al obtener un determinado plegado o estructura tridimensional, sin la cual su función no tendría lugar. En esta estructura queda

determinada además un ambiente aminoacidico característico. Si esta estructura o conformación

nativa e la proteína queda alterada o modificada de algún modo, este hecho quedaría reflejado

en una disminución de la actividad. Un ejemplo de ello es la presencia de grupos ionizables, que según su estado de protonación-desprotonación puede conllevar a un cambio en el entorno

aminoacidico, así como una alteración de determinadas interacciones entre diferentes partes de

la cadena polipeptidica como las cadenas laterales. Esta alteración de la actividad de la proteína tendría su punto más sensible en los cambios de ionización en aminoácidos de superficie o

interior proteico, más bien cercanos al centro activo que ocasione cambios en la conformación

nativa o el ambiente aminoacidico, que conllevan una variación en la actividad enzimática.

2- Las curvas de titulación obtenidas se utilizarán para determinar los valores de pK de los

grupos implicados en la actividad de la enzima ¿Permiten estos valores una indudable

identificación de los aminoácidos implicados? ¿Pueden presentarse variaciones

significativas en estos valores de pK? ¿En qué condiciones?

No, no podemos identificar de manera indudable los grupos implicados en la actividad ya que no es lo mismo que el aminoácido se encuentre libre o formando part de la proteína. El entorno

varia y como consecuencia los valores de pk también. Los valores de pk determinados en la

práctica se dan por tanto de manera aproximada pudiendo deducir que grupos podrán estar

implicados en la actividad, aunque no de manera indudable, los valores de pk por tanto, varían conforme cambian las condiciones del entorno. Por ejemplo , un aminoácido como un grupo

carboxilo en su cadena lateral que está cercano a un grupo amino cargado positivamente (NH3+),

tiende a tener todas sus formas en estado desprotonado cargado negativamente (-COO-), debido

a la interacción de sus cargas. Este hecho ocasiona que el pk de este grupo carboxilo disminuya,

necesitando un ph más bajo para que se produzca su protonacion. Lo mismo ocurriría, pero de

manera contraria a un grupo amino (NH3+) cercano a un carboxilo cargado negativamente, el

cual necesitaría un ph más alto para desprotonarse. Así pues ante determinadas condiciones de

pH, y en consecuencia del entorno aminoacidico (aminoácidos en determinados estados

iónicos), se puede provocar variaciones bastante significativas del pk.

3- ¿Los grupos que has determinado con las curvas de titulación, serían los únicos grupos

ionizables localizados en el centro activo de la enzima? ¿Por qué?

No. Se destacan contentamente 2 grupos ionizables. En primer lugar el grupo ionizable que

ocasiona la actividad repentina del enzima (primer punto de inflexión a pH aproximadamente

5,3 figura 15), pero para que esto tenga lugar se ha tenido que producir la modificación previa (desprotonación) de determinados grupos ionizables que ocasionen en conjunto el estado activo

de la proteína. En la práctica también detectamos el grupo ionizable que ocasiona la bajada

brusca de la actividad ( segundo punto de inflexión aproximadamente a ph 7.2) pero para que

esto ocurra se tiene que dar también la modificación (desprotonación) de otros residuos que ocasionan el cese de la actividad enzimática a valores mayores de pk.

4- ¿Qué otros tipos de curvas de variación de actividad enzimática frente al pH pueden

encontrarse? Relaciona cada uno de ellos con el requerimiento de grupos ionizables para

la actividad de la enzima.

Podríamos obtener variaciones de la actividad con respecto al ph aproximadamente de este tipo:

Page 29: Técnicas laboratorio enzimología

Actividad en función del pH

Vo

pH

Este tipo de variación implica un aumento del ph provoque una disminución en la actividad

enzimática. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables protonados para que se de la actividad enzimática, ya que cuando el pH es inferior al pK

tenemos la actividad optima (grupos protonados), y cuando el pH es inferior al pK tenemos la

actividad óptima (grupos protonados) y cuando el pH es superior al pK se da el cese de la actividad enzimática (grupos desprotonados).

El otro tipo de variación de la actividad en función del pH sería aproximadamente el siguiente:

Actividad en función del pH

Vo

pH

Este tipo de variación implica que un aumento del ph provoque u aumento de la actividad

enzimática. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables en estado desprotonado, ya que cuando el ph es inferior al pk no se da actividad enzimática (grupos

protonados), y cuando el ph es superior al pK tenemos el óptimo de la actividad enzimática

(grupos desprotonados).

Bibliografía

Threee dimensionan estructure of porcine pancratic a-amilasa at 2.9 A resolution.Role of

calcium in structure an activity. G.Buisson et al.

Cuadernillo prácticas

Page 30: Técnicas laboratorio enzimología

TITULACIÓN DE GRUPOS TIOL DEL CENTRO ACTIVO DE LA ALDOLASA Y

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA RESIDUAL.

Resumen

Procederemos a estudiar la accesibilidad del los grupos tiol de la aldolasa al reactivo Ellman´s,

[5,5-ditio-bis(2 nitrobenzoato)] ó DTNB, cuando la proteína se encuentra en distintos niveles de

plegamiento por la presencia o no de urea, y la cuantificación de la actividad enzimática residual

tras la titulación parcial de los grupos tiol. Realizaremos una medida de la actividad del los grupos tiol en la aldolasa donde estudiaremos la accesibilidad de los residuos de cisteína a la

modificación química cuando se desnaturaliza la aldolasa en presencia de urea. También

analizaremos la cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual, donde se cuantificara la actividad de la aldolasa tras la valoración parcial de los grupos tiol, bajo

condiciones suaves de reacción.

Palabras clave: aldolasa, reactivo Ellman´s, DTNB, grupos tiol ,residuos de Cys, urea, centro

activo.

Introducción

La reacción de con reactivos capaces de reacción químicamente residuos específicos en las

proteínas, tiene cierta dificultad. La principal es conseguir que los reactivos sean capaces de

actuar en condiciones de reacción suaves y que, en condiciones ideales, reaccionen específicamente con un único tipo de residuo. Estos reactivos pueden ser utilizados para analizar

la accesibilidad de los residuos en una proteína y poder correlacionar, por ejemplo en una

enzima, cómo dicho residuo afecta a su actividad. Es decir, si esos residuos pueden encontrarse en el centro activo o ser al menos necesarios para la catálisis enzimática.

Utilizararemsos la aldolasa de músculo de conejo que cataliza la reacción: D-fructosa-1,6-bisfosfato ↔D-gliceraldehido-3-fosfato + dihidroxiacetona fosfato

La aldolasa tiene una masa molecular relativa de 160000 y está formada por 4 cadenas

polipeptídicas idénticas. Para medir la actividad aldolasa, la reacción se puede acoplar a dos reacciones adicionales añadiendo a la mezcla de reacción dos enzimas suplementarios. Por una

parte, la enzima triosafosfato isomerasa, interconvierte las dos triosas fosfato producidas en la

reacción de la aldolasa. Puesto que la cetona predomina en el equilibrio (96:4), la enzima está transformando el gliceraldehido-3-fosfato en dihidroxiacetona fosfato. La segunda enzima

accesoria, la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, reduce el grupo oxo generado a grupo alcohol

produciendo glicerol-3- fosfato.

La reacción global de los tres enzimas será por tanto:

fructosa-1,6-bisfosfato + 2NADH + 2H+ 2 glicerol-3-fosfato + 2NAD+

Si se añade suficiente cantidad de las enzimas accesorios, la velocidad de la reacción de la

aldolasa estará determinada por la velocidad de oxidación del NADH. El NADH absorbe fuertemente a 340 nm mientras el NAD+ no absorbe a esta longitud de onda, por tanto, la

actividad de la aldolasa se puede medir cuantificando la disminución de la absorbancia a 340

nm en la reacción global.

Page 31: Técnicas laboratorio enzimología

Métodos y materiales

1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa

Para ello se ponen en la cubeta del espectrofotómetro 800μL de agua, 15 μL de tampón tris-HCl

1M pH 8.4 y 150 μL de DTNB 1 mM. Se ajusta a cero la A412, se añaden 35 μL de la disolución de aldolasa y se mide la variación de A412 cada 10s durante 4 min.

Repetimos el experimento poniendo la disolución de 8M de urea en lugar de agua. Para

transformar la A412 a unidades de concentración de grupos tiol valorados, se asume que el coeficiente de extinción molar del producto de la reacción es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm,

independientemente de la concentración de urea.

Preparamos la dilución con reactivo de Ellma’s: DTNB 1mM (0,4 mg/ml) más tampo tris-HCL

1M ph 8,4.

Dilución aldolasa:

4mg/ml en tampón Tris-HCL 5 mM ph=7.5

Volumen total 600μl

V1·C1= V2·C2 V1=

, enrasamos hasta 1.2 ml.

Concentración enzima aldolasa

Mr=160000 nº moles= 0.14·10

-3gr /160000 = 8.75·10

-10 M Volumen Total= 1 ml

[aldolasa]M=nº/V= 8.75·10

-10/1·10

-3= 8.75·10

-7 M

2. Cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual

En este apartado hacemos una valoración parcial de grupos tiol en condiciones suaves (urea 4M) y una cuantificación simultanea de la actividad residual de la aldolasa mediante el acople de dos

reacciones a la reacción que queremos estudiar.

1) Para valorar los grupos tiol con el reactivo DTNB, se prepara un tubo con 740 μL de urea 4M, 40 μL de tampón tris-HCl 1M pH 8.4 y 160 μL de aldolasa, se trasfiere a la cubeta de

electroforesis,y se ajusta a cero la A412. A continuación se añaden 60 μL de reactivo DTNB 1

mM para iniciar la cinética de valoración de los grupos tiol y se mide la variación de absorbancia cada 15s durante 5 min.

2) Por otra parte, para cuantificar la actividad aldolasa residual tras la valoración de los grupos tiol, se preparan 6 tubos con 74 μL urea 4M, 4 μL de tampón tris-HCl 1M pH 8.4 y 16 μL de

aldolasa. Las soluciones preparadas son equivalentes (con 1/10 del volumen de aquel) al tubo

con el que se han valorado los grupos tiol. La cinética de valoración de tioles se lleva a cabo

añadiendo a cada tubo 6 μL de DTNB 1mM, con lo que se inicia la cinética, y parando la

Page 32: Técnicas laboratorio enzimología

reacción por adición de 500μL de tris-HCl 0.1M pH 7.0, EDTA 1 mM a los tiempos 0s (tubo1,

control), 15s (tubo2), 30s (tubo 3), 1 min (tubo 4), 2 min (tubo 5) y 5 min (tubo 6) de inicio de

reacción. Debemos de homogenizar la mezcla de la reacción, agitando inmediatamente después de añadir

cada reactivo.

Para valorar la actividad aldolasa presente en estas disoluciones se prepara una mezcla stock de

reacción que contiene y debemso ajustar volumétricamente.

4 mL de tampón tris-HCl 0.3M pH 7.5

5 mL de fructosa-1,6-bisfosfato 5 mM

10μ L de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (24 mg/mL)

V1·C1= V2·C2 V2=

5μ L de triosa fosfato isomerasa (7 mg/mL)

V1·C1= V2·C2 V2=

A continuación se coloca en el colorímetro 1 mL de la mezcla stock de reacción, se ajusta a cero

la A340, se añaden 250 μL de NADH 1mM, 200 μL de la disolución de aldolasa tratada con DTNB (t= 0s) y se mide la A340 cada 15s durante 2 min. El proceso se repite con los tubos de

la aldolasa tratada con DTNB durante 15s, 30s, 1 min, 2 min y 5 min.

La concentración del enzima será la siguiente:

[E]=((4 mg/ml)/160000g/mol)·160/1000=4·10-6

M

Resultados y discusión

1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa

El coeficiente de extinción molar del producto de la reacción es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm.

Page 33: Técnicas laboratorio enzimología

Determinación Sin urea:

tiempo (s) A412 [Cys modificada] nºCys/molécula

0 0.015 1.10294E-06 1.2605042

10 0.032 2.35294E-06 2.68907563

20 0.039 2.86765E-06 3.27731092

30 0.043 3.16176E-06 3.61344538

40 0.045 3.30882E-06 3.78151261

50 0.047 3.45588E-06 3.94957983

60 0.049 3.60294E-06 4.11764706

70 0.051 0.00000375 4.28571429

80 0.053 3.89706E-06 4.45378151

90 0.055 4.04412E-06 4.62184874

100 0.057 4.19118E-06 4.78991597

110 0.058 4.26471E-06 4.87394958

120 0.06 4.41176E-06 5.04201681

130 0.062 4.55882E-06 5.21008403

140 0.063 4.63235E-06 5.29411765

150 0.065 4.77941E-06 5.46218487

160 0.066 4.85294E-06 5.54621849

170 0.069 5.07353E-06 5.79831933

180 0.07 5.14706E-06 5.88235294

190 0.071 5.22059E-06 5.96638655

200 0.072 5.29412E-06 6.05042017

210 0.073 5.36765E-06 6.13445378

220 0.074 5.44118E-06 6.21848739

230 0.076 5.58824E-06 6.38655462

240 0.077 5.66176E-06 6.47058824

0

1

2

3

4

5

6

7

Cysteinas accesibles en estado nativo

Tiempo en 10 segundos

Tiempo en 4 minutos

Page 34: Técnicas laboratorio enzimología

Determinación con urea:

tiempo (s) A412 [cys modificada] nº cys/molecula

0 0.233 1.71324E-05 19.5798319

10 0.237 1.74265E-05 19.9159664

20 0.241 1.77206E-05 20.2521008

30 0.236 1.73529E-05 19.8319328

40 0.236 1.73529E-05 19.8319328

50 0.236 1.73529E-05 19.8319328

60 0.236 1.73529E-05 19.8319328

70 0.236 1.73529E-05 19.8319328

80 0.235 1.72794E-05 19.7478992

90 0.235 1.72794E-05 19.7478992

100 0.234 1.72059E-05 19.6638655

110 0.234 1.72059E-05 19.6638655

120 0.233 1.71324E-05 19.5798319

130 0.233 1.71324E-05 19.5798319

140 0.233 1.71324E-05 19.5798319

150 0.233 1.71324E-05 19.5798319

160 0.233 1.71324E-05 19.5798319

170 0.233 1.71324E-05 19.5798319

180 0.233 1.71324E-05 19.5798319

190 0.234 1.72059E-05 19.6638655

200 0.234 1.72059E-05 19.6638655

210 0.234 1.72059E-05 19.6638655

220 0.233 1.71324E-05 19.5798319

230 0.234 1.72059E-05 19.6638655

240 0.233 1.71324E-05 19.5798319

0

5

10

15

20

25

Cysteinas accesibles en estado desnaturalizado

Tiempo10 segundos

Tiempo en 4 minutos

Page 35: Técnicas laboratorio enzimología

En la determinación sin urea estamos obteniendo las cisteínas accesibles en condiciones nativas,

que son las de la superficie y las del centro activo. Sin embargo cuando añadimos urea 8 M

estamos desnaturalizando la enzima con lo que se puede valorar los grupos tiol del interior más los valorados antes, es decir los que hay en la proteína.

Si observamos los datos podemos ver como en la primera valoración se modifican los grupos tiol poco a poco con el tiempo, primero los del centro activo y luego los de la superficie, ya que

tienen distintas constantes de modificación debido a su distinto entorno. Por el contrario en la

valoración con urea los grupos se modifican mas rápidamente y al mismo tiempo ya que todos

están igual de accesibles al estar la proteína desnaturalizada.

2. Cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual

2. 1. Valoración los grupos tiol con el reactivo DTNB

Tiempo (s) A412 [Cys modificada] nº cys/molecula

0 0.344 2.52941E-05 6.32352941

15 0.425 0.00003125 7.8125

30 0.468 3.44118E-05 8.60294118

45 0.505 3.71324E-05 9.28308824

60 0.540 3.97059E-05 9.92647059

75 0.572 4.20588E-05 10.5147059

90 0.601 4.41912E-05 11.0477941

105 0.628 4.61765E-05 11.5441176

120 0.652 4.79412E-05 11.9852941

135 0.674 4.95588E-05 12.3897059

150 0.694 5.10294E-05 12.7573529

165 0.711 5.22794E-05 13.0698529

180 0.728 5.35294E-05 13.3823529

195 0.742 5.45588E-05 13.6397059

210 0.754 5.54412E-05 13.8602941

225 0.784 5.76471E-05 14.4117647

270 0.792 5.82353E-05 14.5588235

285 0.800 5.88235E-05 14.7058824

300 0.807 5.93382E-05 14.8345588

Los datos obtenidos se expresan como un porcentaje de actividad aldolasa respecto al control no

tratado con DTNB que será el 100 % de actividad.

2.2 Cuantificación la actividad aldolasa residual tras la valoración de los grupos tiol.

Tiempo 0 seg tiempo (s) Tubo 1

0 0,360

15 0,101

30 0,084

45 0,083

60 0,083

75 0,083

90 0,083

105 0,082

120 0,082

y = -0,0173x + 0,36 R² = 1

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0 2 4 6 8 10 12 14 16

A4

12

t(s)

Tiempo 0

Page 36: Técnicas laboratorio enzimología

Tiempo 15 seg tiempo (s) Tubo 2

0 0,459

15 0,406

30 0,345

45 0,281

60 0,218

75 0,158

90 0,106

105 0,086

120 0,084

Tiempo 30 seg tiempo (s) Tubo 3

0 0,397

15 0,373

30 0,344

45 0,313

60 0,281

75 0,252

90 0,221

105 0,191

120 0,162

Tiempo 1 min tiempo (s) Tubo 4

0 0,477

15 0,465

30 0,452

45 0,438

60 0,426

75 0,414

90 0,402

105 0,391

120 0,379

y = -0,004x + 0,4621 R² = 0,9992

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0 20 40 60 80 100 A

412

t(s)

Tiempo 15 s

y = -0,002x + 0,4011 R² = 0,9994

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0 20 40 60 80 100 120 140

A41

2

t(s)

Tiempo 30 seg

y = -0,0008x + 0,4766 R² = 0,9991

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 20 40 60 80 100 120

A41

2

t(s)

Tiempo 1 min

Page 37: Técnicas laboratorio enzimología

Tiempo 2 min tiempo (s) Tubo 5

0 0,438

15 0,428

30 0,417

45 0,407

60 0,395

75 0,385

90 0,374

105 0,362

120 0,352

Tiempo 5 min tiempo (s) Tubo 6

0 0,460

15 0,445

30 0,427

45 0,409

60 0,389

75 0,370

90 0,351

105 0,332

120 0,313

Tiempo (s) nº cys/molecula Actividad Actividad %

0 6.323 -0.0173 100

15 7.8125 -0.0040 23.12

30 8.6029 -0.0020 11.56

60 9.9264 -0.0008 4.62

120 11.9852 -0.0007 4.05

300 14.8348 -0.0012 6.94

y = -0,0007x + 0,4387 R² = 0,9997

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0,500

0 20 40 60 80 100 120 140 A

412

t(s)

Tiempo 2 min

y = -0,0012x + 0,463 R² = 0,9992

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0 20 40 60 80 100 120 140

A41

2

t(s)

Tiempo 5 min

Page 38: Técnicas laboratorio enzimología

Según el artículo de Heyduk et al., la aldolasa de musculo de conejo se compone por 4

subunidades aproximadamente idénticas que forman un tetrámero de 160000 Da. En cada una

de las subunidades destacan 4 grupos sulfhídricos (cisteínas) expuestos y potros cuatro enterraos

en el interior de la proteína. Por tanto en el tetrámero encontramos un total de 32 residuos de

cisteína entre los cuales 16 estarían en el interior hidrofóbico y 16 en la región expuesta de la

proteína. Heyduk et al. Hablan de una gran flexibilidad conformacional de la aldolasa, en la que

la modificación e interacción entre los diferentes grupos sulfhídricos afectan de manera

importante a la actividad de la proteína.

Entre estos residuos destacan el residuo Cys239

y el Cys289

localizados fuera dl centro activo, los

cuales ejercen un gran efecto sobre la actividad de la proteína. El objetivo principal de Hayduk

et al. En su experimento fue el de demostrar que la modificación de residuos que no formaban

parte del centro activo de la proteína podían afectar al plegamiento y actividad de dicha enzima,

0,0000

2,0000

4,0000

6,0000

8,0000

10,0000

12,0000

14,0000

16,0000

0 100 200 300 400

% A

ctiv

idad

Tiempo (s)

nº Cys modif

300; 6,94 0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 100 200 300 400

% A

ctiv

idad

Tiempo (s)

% Actividad

Page 39: Técnicas laboratorio enzimología

es decir, no son únicamente los residuos situados en el centro activo los principales responsables

de la actividad del enzima.

Nosotros conseguimos valorar 19 casi 20 de los 32 residuos de cisteína en la proteína

desnaturalizada. De estos residuos 14 (casi 15) están accesibles en la proteína y casi 7 en el

interior hidrofóbico, esto se deduce a partir de la desnaturalización con urea 8 M en la que

encontramos 20 residuos frente a la desnaturalización gradual con urea 4M, en la que solo

conseguimos valorar 15, y de aquí sabemos que hay 7 no accesibles. De los 14 que se

encuentran accesibles, podemos suponer que la mayor parte se encuentran en el centro activo,

pero no afirmarlo categóricamente puesto que como se nos indica el autor del artículo, pueden

existir residuos que no estén en el centro activo, y sin embargo sean tan accesibles como estos y

modifican la actividad del enzima. En nuestros resultados observamos que para que se origine

prácticamente el cese de la actividad enzimática, se tiene que dar la modificación de

aproximadamente 8 residuos de cisteína. Estos 8 residuos corresponderían con las 8 cisteinas

esenciales, dentro de las cuales se encontrarían las Cys mencionadas anteriormente. La

diferencia entre el numero de cisteínas que hemos conseguido valorar (aproximadamente 20), y

el expuesto en el artículo (concretamente 32) puede ser causada por la mala exposición de todos

los residuos conseguida al desnaturalizar la proteína, causando la no interacción del DTNB con

estos.

La diferencia en cuanta a numero de residuos de cisteína expuestos en la superficie, obtenidos

en la práctica (aproximadamente 6) y el encontrado por Heyduk et al. (16 residos), puede ser

debida nuevamente a la no interacción del DTB con estos, o que las condiciones de ensayo no

fueran las mejores, causando cierta modificación de la conformación tridimensional, ocasionada

por su gran flexibilidad, ocasionando el error de la estimación del numero de residuos de

cisteína expuestos en la superficie de la proteína.

Page 40: Técnicas laboratorio enzimología

Cuestiones

1.- ¿Cuántos residuos tiol se han podido valorar en la proteína? ¿Cuántos grupos tiol es

necesario valorar para que la actividad residual aldolasa sea prácticamente cero? Si el

número de grupos tiol en ambos casos es diferente, ¿Cuál puede ser la causa de esa

diferencia?

En la proteína se ha podido valorar casi 20 residuos (19,60), en el experimento con urea 8M ya

que en este caso es cuando valoramos todos los grupos tiol de la proteína teóricamente, al ser un agente desnaturalizante fuerte.

La disminución brusca en la actividad residual aldolasa se produce cuando el número de

cisteínas modificadas por molécula es aproximadamente ocho, que ha de ser una aproximación a las cisteínas presentes en el centro activo del enzima y cuya modificación afecta a su actividad.

El número de grupos tiol es distinto debido a que además de los grupos que afectan a la

actividad , que se encuentran en el centro activo, tenemos otras cisteínas en diversos sitios de la proteína tales como cisteínas superficiales que también se modifican en diversos sitios de la

proteína tales como cisteínas superficiales que también modifican en estado nativo aunque más

tarde que las del centro activo, y otras no accesibles al DNTB por encontrarse en zonas internas de la proteína, las cuales no permiten el paso del modificador tanto por restricciones de tamaño

como por impedimentos de tipo estérico o por efectos de carga, por lo que solo con la proteína

completamente desnaturalizada es posible que el DNTB acceda a ellas, lo que supondrá un

aumento de las cisteínas que detectamos.

2.- ¿Por qué se necesitan condiciones suaves de reacción con el DTNB para valorar los

grupos tiol que determinan la pérdida de la actividad aldolasa

Porque el objetico que buscamos es observar cambios graduales en la cinética de valoración del

enzima a la que se le modifican determinados grupos o residuos puntuales, y ver la pérdida gradual de actividad para conocer así los residuos del centro activo o que son importantes para

que el enzima sea activo. Por ello, como vemos en el caso de urea 8M, en condiciones fuertes la

proteína se desnaturaliza completamente y no sabemos que residuos afectan al centro activo ya

que se modifican todos, mientras que en el caso de de no poner urea solo veremos aquellos residuos a los que el DTNB pueda acceder, que no tienen por qué ser todos los implicados en la

actividad del enzima, además de no apreciar la perdida completa de actividad por no poder

valorar algunos residuos. Por todo ello, unas condiciones suaves ayudan a ver como se pierde la actividad progresivamente y a valorar por tanto la relación entre residuos modificaos y a

funcionales y la pérdida de actividad pudiendo de esta forma determinar cuántos residuos son

necesarios para que el enzima sea funcional.

Bibliografía

Long-range Effects and Conformational Flexibility of Aldolase. Tomasz Heyduk, Ryszard

Michalczykg, and Marian Kochman.

Cuadernillo de prácticas