Técnicas laboratorio enzimología
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2011
Sussane Ayed
Jose Luis Pérez
Memoria prácticas ENZIMOLOGÍA
Práctica 1
Estudios cinéticos en estadio preestacionarioActividad de la α-Quimiotripsina con acetato de p-nitrofenilo
Introducción
La α-quimiotripsina cata liza la hidrólisis del acetato de p-nitrofenilo a través de un intermediario acil-enzima, según el siguiente mecanismo:
Dónde B, se refiere al p-nitrofenol. Si la concentracione de AB es saturante, el primer equilibrio será rápido alcanzándose antes de que se alcance el estado preestacionario.
Esto se puede conseguir trabajando a condiciones no óptimas para el enzima, en este caso se modifica el pH a 5, lejos del pH óptimo 8, de forma que se enlentece el proceso y se puede seguir la cinética por mecanismos espectroscópicos simples, que se centra en la medida de la absorbancia del producto p-nitrofenol.
La ecuación cinética explícita para el mecanismo de una enzima hidrólitica es:
Objetivo
Determinar si la hidrólisis del p-nitrofenilo catalizado por la αQuimiotripsina responde al mecanismo indicado anteriormente, calculando las constantes de velocidad de las etapas individuales, así como de la concentración absoluta de Enzima. Por otro lado los ensayos con distinta concentración de enzima permiten determinar el número de centros activos.
EAB E · AB EA EAK 1, K−1 K 2 , B K 3
[B ]=[Eo]{k 2 k3 t /k 2k3k 2/k 2k32[1−e k 2k3 t ]}
Si el tiempo es suficientemente largo ,la ecuación se aproxima auna recta :
[B]=[Eo]{k 2 k3 t /k 2k3k 2/k 2k32}
Dónde la pendiente será velocidad enestado estacionario ,Vmáx ,y la ordenada enel origen una componente llamada Π
Vmáx=m=[Eo]k 2 k3 /k 2k 3Π=[Eo] k 2/k 2k 3
2
1.1 Determinación de las concentraciones de p-nitrofenilo y α-quimiotripsina
Ya que ambos reactivos se preparan en el momento de realizar la práctica, una vez realizadas las diluciones de trabajo, las valoramos para comprobar su concentración exacta para trabajar con las cantidades correctas.
Para ello se realiza un espectro de Absorción entre 340 y 230 nm en cubetas de cuarzo y utilizando la ley de Lambert-Beer-Bouguer podemos obtener la concentración exacta de cada sustancia con la que trabajaremos más adelante.
p-nitrofenilo α-quimiotripsinaAmax
271 = 0,378 u.a Amax280 = 0,505 u.a
ε271 = 8145 M-1 cm-1 ε280 46000 M-1 cm-1
Mr = 181 Mr = 25000Dilución 1:800 Dilución 1/500L =1 L = 1
C= AE=0,378
8145=4,64 ·10−5 M
4,64 ·10−5·800 ·1000=37,12 mMComo la queremos a 2 mM, la diluimos:
1mL ·2mM=V 2·37,12 mMV 2=18,56 mL
Queríamos una disolución de 120uL a 150mg/mL
5,43 mM ·1,2 ·10−3 mL· 25000=163,5 mg /mLNo fue necesario modificarla.
C= AE= 0,505
46000=1,09·10−5 M
1,09 ·10−5 M · 500 ·1000=5,45mM
Resultados experimentales. Cinéticas.
0 50 100 150 200 250 3000,00E+000
2,00E-005
4,00E-005
6,00E-005
8,00E-005
1,00E-004
1,20E-004
Cinetica estado Pre-estacionarioDilucion 1/50; aQuimiotripsina = 30uL
Tiempo (s)
[p-n
itrof
enilo
] (M
)
0 50 100 150 200 250 3000000000000
Cinetica Pre-estacionariaDilución 1/75; aQuimiotripsina 20uL
Tiempo (s)
[p-n
itrof
enilo
] (M
)
0 50 100 150 200 250 3000
0
0
0
0
0
Cinetica Pre-estacionariaDilución 1/150; aQuimiotripsina 10 uL
Tiempo (s)
[p-n
itrof
enilo
] (M
)
f(x) = 1,39E-07x + 5,19E-05R² = 4,35E-01
f(x) = 3,22E-08x + 3,07E-05R² = 9,92E-01
Π (M)D1/50 1,09E-004 7,99E-005 6,91E-008D1/75 7,26E-005 5,19E-005 1,39E-007D1/150 3,63E-005 3,07E-005 3,22E-008
Eo (M) m (M)
f(x) = 6,91E-08x + 7,99E-05R² = 9,78E-01
Con lo que despejando de las ecuaciones llegamos a:
Ajuste Iterativo:
Los datos de laboratorio se analizaron con el programa Graffit, y realizó un ajuste iterativo a a la ecuación teórica, de forma que se obtuvieron los valores de Eo, K2 y K3 ajustados, de forma que podemos compararlos con los nuestros.
Como vemos los valores varían mucho entre ambos métodos. Esto pude deberse al error de medida experimental o a problemas de disolución de la Enzima. En cualquier caso, tampoco debemos fiarnos mucho de los datos obtenidos en el ajuste dado que tienen mucho error.
D1/50 D1/75 D1/1508,00E-005 7,00E-005 3,00E-0051,01E-001 9,06E-002 8,37E-0028,30E-004 7,60E-004 9,80E-004
Eo (M)K2 (s-1)K3 (s-1)
D1/50 D1/75 D1/150Eo (M) 1,09E-004 7,26E-005 3,63E-005K2 (s-1) 7,99E-005 1,39E-007 3,22E-008K3 (s-1) 6,04E-013 6,26E-013 9,66E-004
Calculo de centros activos
Dado que K3<<K3 podemos despreciar el valor de K3, de forma que:
Haciendo la media de las aproximaciones podemos concluir que la aQuimiotripsina tiene un Centro Activo. Ademas esto concuerda con la realidad ya que sabemos que la enzima tiene un centro activo en el que se localiza un residuo de Serina 195, que es el responsable de la formación del complejo enzima sustrato.
Cuestiones
a. Explicar cómo y por qué se han determinado las concentraciones exactas de los distintos reactivos utilizados.
Primero se realizaron los cálculos teóricos y se realizo una primera disolución tanto del p-nitrofenilo, como de la enzima. Luego se midio la absorbancia de las disolución, y con el máximo de absorbancia y a través de la ley de Lambert-Beer, se obtiene la concentración exacta de la disolución. Los resultados entre las dos medidas pueden variar debido al error experimental, por esto es necesario realizar este paso, para conocer exactamente con que concentraciones estamos trabajando.
b. ¿Para que es conveniente obtener el espectro de Absorción del sustrato y del Enzima?
De igual modo, es conveniente para conocer las concentraciones de ambos reactivos, y asegurarnos de que trabajamos correctamente.
c. ¿Cuál es la concentración de enzima inicial utilizada en las distintas muestras?
−EoD1 /50=30 · 10−6 L ·5,45·10−3 M
1500·10−6 L=1,09 ·10−9 M
−EoD1 /70=20 · 10−6 L·5,45 ·10−3 M
1500·10−6 L=7,26·10−5 M
−EoD1 /150=10 · 10−6 L ·5,45 ·10−3 M
1500 ·10−6 L=3,63·10−5 M
Π=EoK 2
K2K32 ; K 3≈0 ; Π
Eo=Centros Activos
−D1/50=7,99 ·10−51,09 ·10−4
=0,73
−D1/75=5,19 ·10−57,26 ·10−5
=0,71
−D1/150=3,63· 10−53,07· 10−5
=1,18
0,730,711,183
=0,87≈1
d. De acuerdo con las estimaciones de k2 y k3, ¿Se puede decir que la hidrólisis del p-nitrofenilo por al αQuimiotripsina sigue un mecanismo como el descrito en la introducción? ¿La reacción enzimática transcurriría siguiendo este mecanismo para cualquier valor de las constantes cinéticas?¿Se utilizaría el mismo procedimiento para estimarlas?
A la vista de los resultados podemos ver como la aparición de producto es marcadamente bi-fásica. Una primera fase de aparición explosiva, y una siguiente en la que se estabiliza. Por tanto podemos ver claramente, el estado pre-estacionario y el estado estacionario.
Se debe cumplir que las constantes sean positivas ya que si no la reacción tal como la hemos planteado no tendría lugar. También es necesario que K2>>K3, para que se forme y acumule p-nitrofenol.
No, habría que buscar otros procedimientos, ya que si por ejemplo K3>>K2 no se acumularía el intermediario que hemos medido.
Practica 2Estudios Cineticos en estado Estacionario
Resultados Experimentales:
1,1 Determinación de la actividad de la ADH
La pendiente de la recta tangente en el origen nos da la velocidad inicial de la reacción (Vo).
Vo = 0,00303 u.a/s
NADH E340nm=6220 M −1 cm−1
Dilución 1/150Volumen Dilución 8· 10−5 LVolumen Cubeta1,2 ·10−3 L
Vo=3,03 · 10−3 ua /s6220 M−1 cm−1 =4,871 · 10−7 M / s
4,871 ·10−7 M / s · 150 · 1,2· 10−3 L8· 10−5 L
=1,0959 ·10−3 mol NADH /s · L de Enzima
1,0959 ·10−3 mol NADH / s · L de Enzima /1000mL=1,0959 ·10−6 mol NADH / s · mL de Enzima1,0959 · 10−6 mol NADH / s · mL de Enzima · 60 s=6,57585 ·10−5 mol NADH /min · mL de Enzima
La actividad original será de 6,57585· 10−5 mol NADH /min · mL de Enzima
0 50 100 150 200 250 300 350 4000,00E+00
2,00E-05
4,00E-05
6,00E-05
8,00E-05
1,00E-04
1,20E-04
1,40E-04
1,60E-04Actividad ADH
Tiempo (s)
A340
f(x) = 3,30E-03x + 1,26E-01R² = 9,89E-01
1,2 Determinación de la constante de equilibrio de la reacción
Del ultimo valor de Absorbancia:
La concentraciónde protones vendrá determinada por el pH del medio , pH=8Luego H '=8·10−8 M
Contodos estos datos podemos abordar el cálculo de la Keq
Keq=[Acetaldehído ]· [NADH ] ·[H ' ][EtOH ] ·[NAD ' ]
Keq=[2,141 ·10−4 M ] ·[2,141 ·10−4 M ] ·[8·10−8 M ][1,12 M ] ·[3,3·10−4 M ]
Keq=9,92 ·10−12M
0 50 100 150 200 250 3000
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Determinación Keq
Tiempo (s)
A340
A=E ·C · l1,332=6220M−1 cm−1·C ·1cm
[NADH ]=2,141 ·10−4 M
Dado que la reacción es :
Etanol+ NAD−Acetaldehído+ NADH+ H
[NADH ]=[Acetaldehído]=2,141 ·10−4 M
Para el NAD+ :Ci=5 ·10−3 MVi=8 ·10−5 L8 · 10−5 L · 5· 10−3 M
1,2 ·10−3L =3,3 · 10−4 MPara el Etanol :d =0,805 g /mlR=96Mr=46 Da
0,805 g ·0,96=0,7728 g de EtOH puro0,7728 g de EtOH puro /46Da=0,168mol EtOH /10−3 L=16,88 MComohemos utilizado80uL en la cubeta de1200uL :
8 ·10−6 L ·16,88 M1,2 ·10−3 L
=[EtOH ]=1,12 M
2,3 Reversibilidad de la reacción
De igual manera que en el apartado anterior pero utilizando el ultimo dato de Absorbancia:
0,374=6220M−1 cm−1 · C ·1cm[NADH ]=6,012 · 10−5 M
La [Acetaldehído] será la incial más la añadida
50ul a 50mM que son una final de 2mM ;por tanto :
[Ac]=2,141 ·10−4 M + 2 · 10−3 M[ Acetaldehído]=2,2141 ·10−3 M
Para el resto de los reactivos tendremos encuenta que hemos modificado el Volumen finalasi :
[EtOH ]=8·10−5 L·16,8 M1,25·10−3 L
=1,0752 M
[NAD ' ]=8 ·10−5 L ·3,3·10−4 M1,25 ·10−3 L
=2,112·10−5 M
Keq=[Acetaldehído] ·[NADH ]· [H ' ][EtOH ] ·[NAD ' ] =
[2,2141 ·10−3 M ]· [6,012 · 10−5 M ] ·[8·10−8 M ][1,0752 M ] ·[2,112 · 10−5 M ]
Keq=4,68· 10−10
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
0,20,40,60,8
11,21,4
Reversibilidad de la reacción
Tiempo (s)
A340
2,4 Determinación de los parámetros cinéticos
En este apartado se mantiene constante la concentración de enzima (D 1/150) y de NAD+
(5mM) y se varía la concentración de EtOH entre 5 y 150mM. Esto permitirá determinar la concentración de esto EtOH a la que se satura la enzima, así como los parametros cinéticos: Km, Vmax, kcat, kcat/Km; mediante el análisis gráfico de los resultados de la Vo.
T ie m p o (s )A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M)
5 m M 1 0 m M 2 5 m M 7 5 m M 1 5 0 m M15 0,029 0,023 0,080 0,056 0,18430 0,055 0,042 0,118 0,116 0,31645 0,082 0,059 0,154 0,171 0,42960 0,104 0,077 0,183 0,212 0,49175 0,127 0,090 0,210 0,253 0,55090 0,148 0,106 0,234 0,286 0,598
105 0,168 0,120 0,254 0,315 0,636120 0,184 0,130 0,273 0,340 0,662
0 20 40 60 80 100 120 1400,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
f(x) = 4,37E-03x + 1,88E-01R² = 9,35E-01
f(x) = 2,67E-03x + 3,81E-02R² = 9,79E-01
f(x) = 1,82E-03x + 6,51E-02R² = 9,85E-01
f(x) = 1,03E-03x + 1,16E-02R² = 9,94E-01
f(x) = 1,48E-03x + 1,19E-02R² = 9,95E-01
Ensayos a distintas [EtOH]
Determinación de Vo5 mMRegresión lineal para 5 mM10 mMRegresión lineal para 10 mM25 mMRegresión lineal para 25 mM75 mMRegresión lineal para 75 mM150 mM Regresión lineal para 150 mM
Tiempo (s)
Abs
340
nm
NADH E340nm=6220M −1cm−1
Dilución 1/150Volumen Dilución 8 ·10−5 LVolumen Cubeta1,2 ·10−3 L[E ] ;331u /mg ;500u /mL ;1,5105mg /148000Da=1,0206 ·10−5 mol E
1,0206 ·10−5 mol /10−3 L=0,01020 M
Vo=1,48 ·10−3 ua / s6220 M −1 cm−1=2,3794 ·10−7 M / s
2,3794 ·10−7 M / s ·150 · 1,2 ·10−3 L8 ·10−5 L
=5,3536 ·10−4 mol NADH / s · L de Enzima
5,3536 ·10−4 mol NADH / s · L de Enzima/1000mL=5,3536 ·10−7 mol NADH /s ·mL de Enzima5,3536 ·10−7 mol NADH /s ·mL de Enzima ·60 s=3,2122 ·10−5 mol NADH /min·mL de Enzima
3,2122 ·10−5 mol NADH /min ·mL de Enzima /1,0206·10−5 mol de E¿3,1473 mol NADH /min ·mol de Enzima
Así con el resto de concentraciones:
2.5 Inhibición de la ADH por Metanol
El metanol puede ser oxidado por la ADH, lo cual puede provocar la inhibición de la actividad enzimatica. Para abordar el estudio de este proceso se ensaya la actividad variando la [EtOH] y manteniendo fija la [Metanol] a 50uL
[E tO H] (mM) Pendiente (ua/s) Vo (molNAD H/min·mL E ) Vo (molNAD H/min·molE )5 1,48E-03 3,21E-05 3,147
10 1,03E -03 2,24E-05 2,19025 1,82E -03 3,95E-05 3,87075 2,67E -03 5,79E-05 5,678
150 4,37E -03 9,48E-05 9,293
T ie m p o (s )A b s 3 4 0 n m a d is t in t a s [E t a n o l] (m M) + 5 0 u L Me t a n o l
5 m M 1 0 m M 2 5 m M 7 5 m M 1 5 0 m M15 0,002 0,011 0,025 0,091 0,11230 0,009 0,018 0,033 0,149 0,19245 0,014 0,025 0,044 0,195 0,27660 0,021 0,032 0,052 0,235 0,34675 0,027 0,039 0,062 0,272 0,40090 0,033 0,046 0,070 0,309 0,455
105 0,040 0,053 0,080 0,335 0,500120 0,046 0,059 0,088 0,362 0,543
De igual manera que en el apartado anterior:
2.6 Cálculos y representaciones gráficas de
0 20 40 60 80 100 120 1400,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
f(x) = 4,09E-03x + 7,72E-02R² = 9,84E-01
f(x) = 2,54E-03x + 7,18E-02R² = 9,85E-01
f(x) = 6,06E-04x + 1,58E-02R² = 9,99E-01f(x) = 4,61E-04x + 4,25E-03R² = 1,00E+00
f(x) = 4,17E-04x - 4,18E-03R² = 9,99E-01
Estudio de la Inhibición por Metanol
Determinación de Vo5 mM
Regresión lineal para 5 mM10 mM
Regresión lineal para 10 mM25 mM
Regresión lineal para 25 mM75 mM
Regresión lineal para 75 mM150 mM
Regresión lineal para 150 mM
Tiempo (s)
Abs
340
[E tO H] (mM) Pendiente (ua/s) Vo (molNAD H/min·mL E ) Vo (molNAD H/min·molE )5 4,17E-04 9,05E-06 0,887
10 4,61E -04 1,00E-05 0,98025 6,06E -04 1,32E-05 1,28875 2,54E -03 5,51E-05 5,401
150 4,09E -03 8,88E-05 8,696
[E tanol] (mM) Vo (molNAD H/min·molE ) Vo + I (molNAD H/min·molE )5 3,147 0,887
10 2,190 0,98025 3,870 1,28875 5,678 5,401
150 9,293 8,696
1/[E tanol] (1/mM) 1/Vo (min·molE /molNAD H) 1/Vo+ I (min·molE /molNAD H)0,200 0,318 1,1280,100 0,457 1,0200,040 0,258 0,7760,013 0,176 0,1850,007 0,108 0,115
De la representación, y sabiendo que:
– (-1/Km) corresponde al punto de corte en el eje Y– 1/Vmax corresponde al punto de corte con el eje X– Kcat conociento la Vmax y Eo; ya que: Vmax = Kcar · Eo. En este caso la Vmax será
igual que Kcat
Ya que:
– Km < Km (+I)– Vmax < Vmax (+I)
A la vista de los resultados no podemos concluir nada claro. Esperabamos una inhibición de tipo competitivo, con Km<Km(ap), pero no esperabamos que la velocidad máxima se mantuviese igual, y no es el caso, si no que aumenta.
Seguramente se debe a que los ajustes no son muy buenos y se no nos muestran una tendencia representativa.
K m (m M) V m a x (m o lN A D H /m in ·m o lE ) K c a t (1 /m in ) K c a t/K m (1 /m M·m in )S in Metanol 0,931 5,376 5,38 5,77C on Metanol 6,803 43,478 43,48 6,39
-0,800 -0,300 0,200 0,700 1,200 1,700
-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
f(x) = 0,147x - 0,023R² = 0,735
f(x) = 1,074x + 0,186R² = 0,414
Representación de Dobles inversos
1/Vo
1/[E
tOH
] (m
M)
Cuestiones
a. Compara el valor de Km de ADH de levadura con el correspondiente al higado de caballo cuyo valor de Km es 5,5e-4 M. ¿Qué puedes concluir?
Nuestra Km es de 9,31e-4, lo que se mantiene en el mismo orden de magnitud que la de caballo.
La ADH de caballo esta formada por un dímero de 83300 Da y la de levadura por un tetrámero de 148000 Da, con 4 sitios de unión, por lo que debería tener mayor finidad por el sustrato que la de caballo, aunque nuestros resultados no lo muestren.
b. Diseña un protocolo experimental par determianr la Km para el NAD+, sabiendo que es alrededor de 74 um para la ADH de la levadura.
Procederiamos igual que para el Etanol.. Asegurandonos de que las concentraciones de etanol fuese limintante y la velocidad solo dependiese de la afinidad de la enzima por el NAD+.
Dado que la km para la ADH de levadura es de 74uM partiriamos de una concentración e iriamos incrementando la concentración de NAD+ en los siguientes tubos. Obtendriamos de esta forma la Vo de cada tubo, y con esto calcular la Km.
c. Sabiendo que el hígado humano si que puede oxidar el metanol ¿Como se podría determinar la inhibición ejercida?
Tanto la oxidación de metanol, como la de etanol, producen NADH, que es el producto que hemos ido siguiendo para determinar la cinetica. Así que en este caso no podriamos, ya que no estariamos seguros de si proviene del etanol o del metanol.
Para solucionarlo, podriamos acoplar una reacción a de forma que reaccionase el acetaldehido producido, y medir el producto. Luego seguiriamos el mismo procedimiento de la practica para determinar los parámetros cinéticos.
Etanol + NAD+ <-------ADH-------> Acetaldehído + NADHMetanol + NAD+ <---ADH------>Formaldehido + NADH
d. El procedimiento utilizado en la práctica, ¿sería adecuado para determinar el contenido de alcohol de las bebidas alcohólicas?
No, no sería adecuado, porque solo determinamos el NADH, pero solo hasta que se alcanza el equilibrio. Aunque si que podríamos desplazando la reacción completamente hacia los productos, haciendo reaccionar alguno de ellos. En este caso el NAD+, no debería ser un factor limitante.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA α-AMILASA SALIVAR
Resumen
En esta experiencia estudiaremos la variación de la actividad α-amilasa con el pH. A partir de
este estudio se pretende determinar qué residuos están implicados en la actividad de esta enzima. Se realizara la estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad y
también un estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.
La enzima α-amilasa está presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces α(1-4) que unen las
glucosas en los polisacáridos. El procedimiento para ensayar la actividad de la α-amilasa, es el denominado método CNPG3. Y finalmente determinaremos si la curva de actividad frente al
pH de la enzima presenta forma acampanada.
Palabras clave: actividad α-amilasa, método CNPG3, pH, pK, tampón, cloruro, concentración
de enzima, velocidad inicial.
Introducción
La curva de actividad frente al pH de una enzima tiene con frecuencia una forma en campana.
La interpretación es que el resultado de la composición de dos curvas de titulación están solapadas, una correspondiente a un grupo que debe estar protonado para que la enzima tenga la
actividad máxima, y otra correspondiente a un segundo grupo, que debe estar desprotonado.
Las curvas de titulación dependerán del medio en el que se encuentran los grupos ionizables,
de forma que la presencia en sus proximidades de grupos cargados positiva o negativamente influye en su ionización, conduciendo a cambios significativos en los valores de pK
correspondientes.
La α-amilasa está presente en la saliva, donde hidroliza los enlaces α(1-4) que unen las glucosas en los polisacáridos. También en análisis clínicos bioquímicos sirve para determinar el
diagnóstico de pancreatitis aguda. Donde la enzima se encuentra aumentada.
EL procedimiento que hemos realizado para determinar la actividad de la enzima en suero es el CNPG3. Donde a tasa de formación de CNP, medida a 405 nm, es directamente proporcional a
la actividad de la α-amilasa.
La reacción consiste en:
10 CNPG3 9 CNP + 1 CNPG2 + 9G3 + G
CNPG3: 2-cloro-4-nitrofenil malto triósido CNP: 2-Cloro-4-nitrofenol
G3: Maltotriosa
G: Glucosa
Materiales y métodos
1. Estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad
La disolución stock de α-amilasa (la 1/1000 en tampón tris-maleato 5 mM, pH 7.0), preparamos
disoluciones 1/5000, 1/10000, 1/20000 y 1/40000 (3 mL en tampón tris-maleato 100 mM, pH 7.0) y realizamos los ensayos de actividad.
La reacción se lleva a cabo en una cubeta del espectrofotómetro en la que se añaden 600μL de la disolución de α-amilasa y 200 μL de tampón de reacción R1 (acetato cálcico 5 mM, tiocianato
potásico 1.5M, MES 10 mM, pH 6.0). Agitamos bien con una pipeta Pasteur y ajustamos a cero
el espectrofotómetro. La reacción se inicia añadiendo 200 μL del sustrato CNPG3 (Preparado en
disolución R2) y se mide la variación de la absorbancia a 405 nm, cada 10 seg, durante 2 minutos. Repetimos los ensayos con las diferentes disoluciones de enzima en las mismas
condiciones.
También analizaremos también el efecto del cloruro en la actividad de la enzima, el
procedimiento es idéntico al anterior pero añadiéndole 50 μL de NaCl 4M, antes de añadir el
CNPG3
Eligimos la dilución de enzima cuya variación de A405 sea de entre 0.5 y 1 unidad de absorbancia en los dos minutos. La dilución de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto
para la presencia y ausencia de cloruro.
2. Estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.
Estimamos la variación de la actividad de la enzima en función del pH, llevamos acabo
experimentos como los descritos en el apartado anterior, preparando la enzima a la dilución
1/5000, pero utilizando en cada caso el tampón correspondiente al pH a ensayar. Los pHs que se van a estudiar son los siguientes: 4.0, 4.5 ,5.0 ,6.0,7.0 ,7.5 y 8.0
A partir de los datos obtenidos en este apartado y en el anterior, discutiremos qué residuos parecen estar implicados en la actividad de la enzima.
Resultados y discusión
1. Estimación de la concentración de enzima en los ensayos de actividad
La dilución de enzima que seleccionamos es la 1/5000 tanto para la presencia y ausencia de
cloruro.
Tabla 1. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada
dilución, en presencia y ausencia de cloruro.
dilucion 1/5000 pH 7
dilucion 1/10000 pH 7
dilucion 1/20000 pH 7
dilución 1/40000 pH 7
t A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl)
0 0.768 0.123 0.593 0.102 0.052 0.085 0.113 0.046
10 0.830 0.195 0.630 0.153 0.068 0.096 0.122 0.063
20 0.910 0.273 0.666 0.169 0.086 0.131 0.072
30 0.984 0.353 0.702 0.207 0.102 0.138
40 1.056 0.447 0.739 0.247 0.12 0.135 0.15
50 1.128 0.524 0.776 0.286 0.138 0.176 0.158 0.093
60 1.202 0.605 0.811 0.329 0.157 0.197 0.167 0.102
70 1.270 0.691 0.850 0.37 0.173 0.218 0.173
80 1.331 0.763 0.884 0.406 0.192 0.239 0.18
90 1.396 0.845 0.921 0.446 0.21 0.258 0.188
100 1.458 0.918 0.960 0.488 0.229 0.28 0.196
110 1.522 0.995 0.993 0.529 0.248 0.301 0.206
120 1.577 1.066 1.029 0.569 0.265 0.322 0.216
incr. A 120-0
0.809 0.943 0.436 0.467 0.213 0.237 0.103
incr. A 30-10
0.154 0.158 0.072 0.054 0.034 0.016
2. Estudio de la actividad α-amilasa en función del pH.
Para cada uno de los ensayos se representará la A405 frente al tiempo y se determinará la
velocidad inicial de la reacción enzimática.
Tabla 2. Medidas de absorbancia a 405 nm cada 10 segundos durante 2 minutos, para cada dilución, en presencia y ausencia de cloruro
pH 4 pH 4.5 pH 5 pH 6
t A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl)
0 0.024 0.030 0.038 0.035 0.150 0.063 0.249 0.023
10 0.025 0.033 0.052 0.047 0.176 0.146 0.450 0.285
20 0.029 0.039 0.071 0.061 0.217 0.223 0.668 0.459
30 0.032 0.045 0.085 0.076 0.255 0.299 0.840 0.624
40 0.035 0.052 0.107 0.092 0.302 0.38 1.065 0.775
50 0.038 0.059 0.129 0.104 0.344 0.452 1.251 0.925
60 0.041 0.066 0.149 0.119 0.382 0.527 1.443 1.070
70 0.044 0.074 0.170 0.134 0.433 0.600 1.642 1.201
80 0.047 0.080 0.192 0.146 0.466 0.672 1.752 1.330
90 0.049 0.087 0.209 0.16 0.505 0.742 1.888 1.442
100 0.052 0.093 0.232 0.176 0.547 0.807 2.031 1.551
110 0.056 0.102 0.255 0.16 0.586 0.885 2.121 1.652
120 0.059 0.109 0.276 0.203 0.626 0.938 2.207 1.731
pH 7 pH 7.5 pH 8.0 A A(NaCl) A A(NaCl) A A(NaCl) t
0.768 0.123 0.103 0.074 0.068 0.037 0
0.830 0.195 0.146 0.126 0.087 0.066 10
0.910 0.273 0.200 0.181 0.112 0.084 20
0.984 0.353 0.256 0.238 0.130 0.1 30
1.056 0.447 0.318 0.291 0.148 0.119 40
1.128 0.524 0.369 0.346 0.170 0.136 50
1.202 0.605 0.420 0.401 0.192 0.154 60
1.270 0.691 0.480 0.457 0.215 0.172 70
1.331 0.763 0.531 0.511 0.235 0.189 80
1.396 0.845 0.585 0.564 0.259 0.207 90
1.458 0.918 0.637 0.616 0.279 0.225 100
1.522 0.995 0.690 0.666 0.301 0.243 110
1.577 1.066 0.750 0.728 0.324 0.261 120
Figura 1. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 en ausencia
de cloruro.
y = 0,0003x + 0,0231 R² = 0,9979
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0 20 40 60 80 100 120 140
A4
05
t (s)
Vo a pH 4
Figura 2. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4 con
presencia de cloruro.
Figura 3. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 en
ausencia de cloruro.
Figura 4. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 4.5 con
presencia de cloruro.
y = 0,0007x + 0,0262 R² = 0,9969
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0 20 40 60 80 100 120 140
Títu
lo d
el e
je
Título del eje
Vo a pH 4 (NaCl)
y = 0,002x + 0,0308 R² = 0,9977
0
0,1
0,2
0,3
0 20 40 60 80 100 120
A40
5
t(s)
Vo a pH 4,5
y = 0,0014x + 0,0343 R² = 0,9993
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
A4
05
t (s)
Vo a pH 4.5 (NaCl)
Figura 5. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 en ausencia
de cloruro.
Figura 6. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 5 con
presencia de cloruro.
Figura 7. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 en ausencia
de cloruro.
y = 0,0041x + 0,14 R² = 0,9991
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t (s)
Vo a pH 5
y = 0,0014x + 0,0343 R² = 0,9993
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a pH5 (NaCl)
y = 0,0167x + 0,3501 R² = 0,9852
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100 120 140
A4
05
t(s)
Vo a pH 6
Figura 8. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 6 con
presencia de cloruro.
Figura 9. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 en ausencia de cloruro.
Figura 10. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7 con
presencia de cloruro,
y = 0,0139x + 0,1715 R² = 0,9849
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a pH 6 (NaCl)
y = 0,0068x + 0,7772 R² = 0,9983
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a Ph 7
y = 0,008x + 0,1214 R² = 0,9995
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a pH 7 (NaCl)
Figura 11. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 en
ausencia de cloruro.
Figura 12. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 7.5 con
presencia de cloruro,
Figura 13. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8 en ausencia de cloruro
y = 0,0054x + 0,0964 R² = 0,9997
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a pH 7.5
y = 0,0054x + 0,0738 R² = 0,9999
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t(s)
Vo a pH 7.5 (NaCl)
y = 0,0021x + 0,0659 R² = 0,9995
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 20 40 60 80 100 120 140
A4
05
t(s)
Vo a pH 8
Figura 14. Representación de la absorbancia a 405 nm con respecto al tiempo a pH 8con presencia de cloruro,
Tabla 3. Valores de Vo.
pH Vo Vo(NaCl)
4 0.0003 0.0007
4.5 0.002 0.0013
5 0.0041 0.0073
6 0.0167 0.0139
7 0.0068 0.008
7.5 0.0054 0.0054
8 0.0021 0.0018
Representaremos de velocidad frente a pH, a partir de la cual se debe estimar el pH óptimo de
la enzima.
Figura 15. Ausencia de cloruro, velocidad frente a pH
y = 0,0018x + 0,0448 R² = 0,9985
0
0,1
0,2
0,3
0 20 40 60 80 100 120 140
A40
5
t (s)
Vo a pH 8 (NaCl)
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0 2 4 6 8 10
velo
cid
ad
pH
Figura 16. Presencia de cloruro, velocidad frente a pH
Tabla 4. Valores de pKa en ausencia de cloruro.
Valor Std. Err.
pKa 1 5.5691 0.1126
pKa2 6.7377 0.1108
Tabla 4. Valores de pKa en presencia de cloruro
Valor Std. Err.
pKa 1 6.1589 0.175
pKa2 6.9952 0.1754
Los resultados obtenidos del tratamiento de datos experimentales nos indican que la enzima α-
amilasa posee una actividad máxima óptima a pH 6.1, en ausencia de cloruro y a ph 6.75 en
presencia de cloruro. Como la mayoría de los enzimas son muy sensibles a cambios de pH, se
puede observar como variaciones de pocas decimas por encima o por debajo del pH óptimo varia drásticamente la actividad. Esta campana es en realidad dos curvas de titulación, donde el
punto de inflexión nos indica los valores de pKa, a partir de los cuales vamos a poder deducir
que grupos ionizables están implicados en la actividad dde la enzima. Si observamos los alores de actividad máxima, vemos que es mayor en presencia de cloruro, por lo que podemos deducir
que el cloruro es un activador de la α-amilasa. El efecto que eerce este ión sobre la actividad
reside en su interacción con un residuo de lisisna cargado positivamente presente en el centro activo, lo cual debe generar un cambio de pKa en el entorno químico que rodea a los aparticos
implicados en la reacción, ocasionando una modificación del pH optimo del enzima que
aumenta acercándose al ph neutro, lo cual en condiciones biológicas favorecerá la reacción y la
velocidad de la misma ejerciendo por ello como activador.
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0 2 4 6 8 10
Ve
loci
dad
pH
Los aminoácidos suelen tener grupos ionizables en función de cuál sea el aminoácido.
En nuestra experiencia, observando la figura 15, hemos obtenido que los valores de pKa, en ausencia de cloruro , son aproximadamente 5.3 y 7.1. En presencia de cloruro los valores de pka
son de 5.6 y 7.4, aproximadamente. A partir de estos valores podemos deducir(aunque bastante
subjetivamente) que los grupos implicados podrán ser el grupo amino N-terminal (pKa=7.5), y el grupo imidazol de una histidina. Sin embargo, el hecho de que los pk estén próximos entre
ellos pueden provocar que exista una interferencia entre ellos, y que verdaderamente no sean los
valores reales.
Para acercarnos más al valor real de la pK, recurriremos al análisis de datos mediante
ordenador. Los valores obtenidos mediante ajuste interactivo son: pKa=5.6 y pKa=6.7 en
ausencia de cloruro, y pKa=6.2 pKa=7 en presencia de este ión. Estos valores podrían corresponder como hemos indicado antes al grupo amino N-terminal(pKa=7.5) y el grupo
imidazol de una histidina(pka=6.3).
Si observamos el articulo de Buoisson et al., sobre la estructura tridimensional de la amilasa
pancreática de porcino, descubrimos que los residuos responsables de la actividad catalítica son
2 residuos de aspartico. Este hecho nos deja entrever que puede ser que nuestros resultados pK
obtenidos estén influenciados por el entorno aminoácido que a ocasionado una variación significativa de los pK de los residuos determinados. Además como hemos citado antes, la
proximidad de los valores de pK corroborado por la existencia de 2 asparticos responsables de
actividad catalítica según estos autores puede ocasionar interferencias en los valores de pK obtenidos. Sin embargo, podemos pensar también que según Buisson et al., hay residuos de
histidina que intervienen en la unión del enzima al sustrato, y que por lo tanto, la distinta
ionización de este residuo también puede causar la variación de la actividad de la amilasa.
Cuestiones
1- Los grupos ionizables de los que depende la actividad de la enzima, ¿se encuentran necesariamente en el centro activo de la enzima? Justifica tu respuesta.
No. Una proteína adquiere su estructura nativa activa al obtener un determinado plegado o estructura tridimensional, sin la cual su función no tendría lugar. En esta estructura queda
determinada además un ambiente aminoacidico característico. Si esta estructura o conformación
nativa e la proteína queda alterada o modificada de algún modo, este hecho quedaría reflejado
en una disminución de la actividad. Un ejemplo de ello es la presencia de grupos ionizables, que según su estado de protonación-desprotonación puede conllevar a un cambio en el entorno
aminoacidico, así como una alteración de determinadas interacciones entre diferentes partes de
la cadena polipeptidica como las cadenas laterales. Esta alteración de la actividad de la proteína tendría su punto más sensible en los cambios de ionización en aminoácidos de superficie o
interior proteico, más bien cercanos al centro activo que ocasione cambios en la conformación
nativa o el ambiente aminoacidico, que conllevan una variación en la actividad enzimática.
2- Las curvas de titulación obtenidas se utilizarán para determinar los valores de pK de los
grupos implicados en la actividad de la enzima ¿Permiten estos valores una indudable
identificación de los aminoácidos implicados? ¿Pueden presentarse variaciones
significativas en estos valores de pK? ¿En qué condiciones?
No, no podemos identificar de manera indudable los grupos implicados en la actividad ya que no es lo mismo que el aminoácido se encuentre libre o formando part de la proteína. El entorno
varia y como consecuencia los valores de pk también. Los valores de pk determinados en la
práctica se dan por tanto de manera aproximada pudiendo deducir que grupos podrán estar
implicados en la actividad, aunque no de manera indudable, los valores de pk por tanto, varían conforme cambian las condiciones del entorno. Por ejemplo , un aminoácido como un grupo
carboxilo en su cadena lateral que está cercano a un grupo amino cargado positivamente (NH3+),
tiende a tener todas sus formas en estado desprotonado cargado negativamente (-COO-), debido
a la interacción de sus cargas. Este hecho ocasiona que el pk de este grupo carboxilo disminuya,
necesitando un ph más bajo para que se produzca su protonacion. Lo mismo ocurriría, pero de
manera contraria a un grupo amino (NH3+) cercano a un carboxilo cargado negativamente, el
cual necesitaría un ph más alto para desprotonarse. Así pues ante determinadas condiciones de
pH, y en consecuencia del entorno aminoacidico (aminoácidos en determinados estados
iónicos), se puede provocar variaciones bastante significativas del pk.
3- ¿Los grupos que has determinado con las curvas de titulación, serían los únicos grupos
ionizables localizados en el centro activo de la enzima? ¿Por qué?
No. Se destacan contentamente 2 grupos ionizables. En primer lugar el grupo ionizable que
ocasiona la actividad repentina del enzima (primer punto de inflexión a pH aproximadamente
5,3 figura 15), pero para que esto tenga lugar se ha tenido que producir la modificación previa (desprotonación) de determinados grupos ionizables que ocasionen en conjunto el estado activo
de la proteína. En la práctica también detectamos el grupo ionizable que ocasiona la bajada
brusca de la actividad ( segundo punto de inflexión aproximadamente a ph 7.2) pero para que
esto ocurra se tiene que dar también la modificación (desprotonación) de otros residuos que ocasionan el cese de la actividad enzimática a valores mayores de pk.
4- ¿Qué otros tipos de curvas de variación de actividad enzimática frente al pH pueden
encontrarse? Relaciona cada uno de ellos con el requerimiento de grupos ionizables para
la actividad de la enzima.
Podríamos obtener variaciones de la actividad con respecto al ph aproximadamente de este tipo:
Actividad en función del pH
Vo
pH
Este tipo de variación implica un aumento del ph provoque una disminución en la actividad
enzimática. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables protonados para que se de la actividad enzimática, ya que cuando el pH es inferior al pK
tenemos la actividad optima (grupos protonados), y cuando el pH es inferior al pK tenemos la
actividad óptima (grupos protonados) y cuando el pH es superior al pK se da el cese de la actividad enzimática (grupos desprotonados).
El otro tipo de variación de la actividad en función del pH sería aproximadamente el siguiente:
Actividad en función del pH
Vo
pH
Este tipo de variación implica que un aumento del ph provoque u aumento de la actividad
enzimática. Este hecho nos deja entrever que se requieren determinados grupos ionizables en estado desprotonado, ya que cuando el ph es inferior al pk no se da actividad enzimática (grupos
protonados), y cuando el ph es superior al pK tenemos el óptimo de la actividad enzimática
(grupos desprotonados).
Bibliografía
Threee dimensionan estructure of porcine pancratic a-amilasa at 2.9 A resolution.Role of
calcium in structure an activity. G.Buisson et al.
Cuadernillo prácticas
TITULACIÓN DE GRUPOS TIOL DEL CENTRO ACTIVO DE LA ALDOLASA Y
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA RESIDUAL.
Resumen
Procederemos a estudiar la accesibilidad del los grupos tiol de la aldolasa al reactivo Ellman´s,
[5,5-ditio-bis(2 nitrobenzoato)] ó DTNB, cuando la proteína se encuentra en distintos niveles de
plegamiento por la presencia o no de urea, y la cuantificación de la actividad enzimática residual
tras la titulación parcial de los grupos tiol. Realizaremos una medida de la actividad del los grupos tiol en la aldolasa donde estudiaremos la accesibilidad de los residuos de cisteína a la
modificación química cuando se desnaturaliza la aldolasa en presencia de urea. También
analizaremos la cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual, donde se cuantificara la actividad de la aldolasa tras la valoración parcial de los grupos tiol, bajo
condiciones suaves de reacción.
Palabras clave: aldolasa, reactivo Ellman´s, DTNB, grupos tiol ,residuos de Cys, urea, centro
activo.
Introducción
La reacción de con reactivos capaces de reacción químicamente residuos específicos en las
proteínas, tiene cierta dificultad. La principal es conseguir que los reactivos sean capaces de
actuar en condiciones de reacción suaves y que, en condiciones ideales, reaccionen específicamente con un único tipo de residuo. Estos reactivos pueden ser utilizados para analizar
la accesibilidad de los residuos en una proteína y poder correlacionar, por ejemplo en una
enzima, cómo dicho residuo afecta a su actividad. Es decir, si esos residuos pueden encontrarse en el centro activo o ser al menos necesarios para la catálisis enzimática.
Utilizararemsos la aldolasa de músculo de conejo que cataliza la reacción: D-fructosa-1,6-bisfosfato ↔D-gliceraldehido-3-fosfato + dihidroxiacetona fosfato
La aldolasa tiene una masa molecular relativa de 160000 y está formada por 4 cadenas
polipeptídicas idénticas. Para medir la actividad aldolasa, la reacción se puede acoplar a dos reacciones adicionales añadiendo a la mezcla de reacción dos enzimas suplementarios. Por una
parte, la enzima triosafosfato isomerasa, interconvierte las dos triosas fosfato producidas en la
reacción de la aldolasa. Puesto que la cetona predomina en el equilibrio (96:4), la enzima está transformando el gliceraldehido-3-fosfato en dihidroxiacetona fosfato. La segunda enzima
accesoria, la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, reduce el grupo oxo generado a grupo alcohol
produciendo glicerol-3- fosfato.
La reacción global de los tres enzimas será por tanto:
fructosa-1,6-bisfosfato + 2NADH + 2H+ 2 glicerol-3-fosfato + 2NAD+
Si se añade suficiente cantidad de las enzimas accesorios, la velocidad de la reacción de la
aldolasa estará determinada por la velocidad de oxidación del NADH. El NADH absorbe fuertemente a 340 nm mientras el NAD+ no absorbe a esta longitud de onda, por tanto, la
actividad de la aldolasa se puede medir cuantificando la disminución de la absorbancia a 340
nm en la reacción global.
Métodos y materiales
1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa
Para ello se ponen en la cubeta del espectrofotómetro 800μL de agua, 15 μL de tampón tris-HCl
1M pH 8.4 y 150 μL de DTNB 1 mM. Se ajusta a cero la A412, se añaden 35 μL de la disolución de aldolasa y se mide la variación de A412 cada 10s durante 4 min.
Repetimos el experimento poniendo la disolución de 8M de urea en lugar de agua. Para
transformar la A412 a unidades de concentración de grupos tiol valorados, se asume que el coeficiente de extinción molar del producto de la reacción es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm,
independientemente de la concentración de urea.
Preparamos la dilución con reactivo de Ellma’s: DTNB 1mM (0,4 mg/ml) más tampo tris-HCL
1M ph 8,4.
Dilución aldolasa:
4mg/ml en tampón Tris-HCL 5 mM ph=7.5
Volumen total 600μl
V1·C1= V2·C2 V1=
, enrasamos hasta 1.2 ml.
Concentración enzima aldolasa
Mr=160000 nº moles= 0.14·10
-3gr /160000 = 8.75·10
-10 M Volumen Total= 1 ml
[aldolasa]M=nº/V= 8.75·10
-10/1·10
-3= 8.75·10
-7 M
2. Cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual
En este apartado hacemos una valoración parcial de grupos tiol en condiciones suaves (urea 4M) y una cuantificación simultanea de la actividad residual de la aldolasa mediante el acople de dos
reacciones a la reacción que queremos estudiar.
1) Para valorar los grupos tiol con el reactivo DTNB, se prepara un tubo con 740 μL de urea 4M, 40 μL de tampón tris-HCl 1M pH 8.4 y 160 μL de aldolasa, se trasfiere a la cubeta de
electroforesis,y se ajusta a cero la A412. A continuación se añaden 60 μL de reactivo DTNB 1
mM para iniciar la cinética de valoración de los grupos tiol y se mide la variación de absorbancia cada 15s durante 5 min.
2) Por otra parte, para cuantificar la actividad aldolasa residual tras la valoración de los grupos tiol, se preparan 6 tubos con 74 μL urea 4M, 4 μL de tampón tris-HCl 1M pH 8.4 y 16 μL de
aldolasa. Las soluciones preparadas son equivalentes (con 1/10 del volumen de aquel) al tubo
con el que se han valorado los grupos tiol. La cinética de valoración de tioles se lleva a cabo
añadiendo a cada tubo 6 μL de DTNB 1mM, con lo que se inicia la cinética, y parando la
reacción por adición de 500μL de tris-HCl 0.1M pH 7.0, EDTA 1 mM a los tiempos 0s (tubo1,
control), 15s (tubo2), 30s (tubo 3), 1 min (tubo 4), 2 min (tubo 5) y 5 min (tubo 6) de inicio de
reacción. Debemos de homogenizar la mezcla de la reacción, agitando inmediatamente después de añadir
cada reactivo.
Para valorar la actividad aldolasa presente en estas disoluciones se prepara una mezcla stock de
reacción que contiene y debemso ajustar volumétricamente.
4 mL de tampón tris-HCl 0.3M pH 7.5
5 mL de fructosa-1,6-bisfosfato 5 mM
10μ L de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (24 mg/mL)
V1·C1= V2·C2 V2=
5μ L de triosa fosfato isomerasa (7 mg/mL)
V1·C1= V2·C2 V2=
A continuación se coloca en el colorímetro 1 mL de la mezcla stock de reacción, se ajusta a cero
la A340, se añaden 250 μL de NADH 1mM, 200 μL de la disolución de aldolasa tratada con DTNB (t= 0s) y se mide la A340 cada 15s durante 2 min. El proceso se repite con los tubos de
la aldolasa tratada con DTNB durante 15s, 30s, 1 min, 2 min y 5 min.
La concentración del enzima será la siguiente:
[E]=((4 mg/ml)/160000g/mol)·160/1000=4·10-6
M
Resultados y discusión
1. Medida de la reactividad de grupos tiol en la aldolasa
El coeficiente de extinción molar del producto de la reacción es de 13600 M-1cm-1 a 412 nm.
Determinación Sin urea:
tiempo (s) A412 [Cys modificada] nºCys/molécula
0 0.015 1.10294E-06 1.2605042
10 0.032 2.35294E-06 2.68907563
20 0.039 2.86765E-06 3.27731092
30 0.043 3.16176E-06 3.61344538
40 0.045 3.30882E-06 3.78151261
50 0.047 3.45588E-06 3.94957983
60 0.049 3.60294E-06 4.11764706
70 0.051 0.00000375 4.28571429
80 0.053 3.89706E-06 4.45378151
90 0.055 4.04412E-06 4.62184874
100 0.057 4.19118E-06 4.78991597
110 0.058 4.26471E-06 4.87394958
120 0.06 4.41176E-06 5.04201681
130 0.062 4.55882E-06 5.21008403
140 0.063 4.63235E-06 5.29411765
150 0.065 4.77941E-06 5.46218487
160 0.066 4.85294E-06 5.54621849
170 0.069 5.07353E-06 5.79831933
180 0.07 5.14706E-06 5.88235294
190 0.071 5.22059E-06 5.96638655
200 0.072 5.29412E-06 6.05042017
210 0.073 5.36765E-06 6.13445378
220 0.074 5.44118E-06 6.21848739
230 0.076 5.58824E-06 6.38655462
240 0.077 5.66176E-06 6.47058824
0
1
2
3
4
5
6
7
Cysteinas accesibles en estado nativo
Tiempo en 10 segundos
Tiempo en 4 minutos
Determinación con urea:
tiempo (s) A412 [cys modificada] nº cys/molecula
0 0.233 1.71324E-05 19.5798319
10 0.237 1.74265E-05 19.9159664
20 0.241 1.77206E-05 20.2521008
30 0.236 1.73529E-05 19.8319328
40 0.236 1.73529E-05 19.8319328
50 0.236 1.73529E-05 19.8319328
60 0.236 1.73529E-05 19.8319328
70 0.236 1.73529E-05 19.8319328
80 0.235 1.72794E-05 19.7478992
90 0.235 1.72794E-05 19.7478992
100 0.234 1.72059E-05 19.6638655
110 0.234 1.72059E-05 19.6638655
120 0.233 1.71324E-05 19.5798319
130 0.233 1.71324E-05 19.5798319
140 0.233 1.71324E-05 19.5798319
150 0.233 1.71324E-05 19.5798319
160 0.233 1.71324E-05 19.5798319
170 0.233 1.71324E-05 19.5798319
180 0.233 1.71324E-05 19.5798319
190 0.234 1.72059E-05 19.6638655
200 0.234 1.72059E-05 19.6638655
210 0.234 1.72059E-05 19.6638655
220 0.233 1.71324E-05 19.5798319
230 0.234 1.72059E-05 19.6638655
240 0.233 1.71324E-05 19.5798319
0
5
10
15
20
25
Cysteinas accesibles en estado desnaturalizado
Tiempo10 segundos
Tiempo en 4 minutos
En la determinación sin urea estamos obteniendo las cisteínas accesibles en condiciones nativas,
que son las de la superficie y las del centro activo. Sin embargo cuando añadimos urea 8 M
estamos desnaturalizando la enzima con lo que se puede valorar los grupos tiol del interior más los valorados antes, es decir los que hay en la proteína.
Si observamos los datos podemos ver como en la primera valoración se modifican los grupos tiol poco a poco con el tiempo, primero los del centro activo y luego los de la superficie, ya que
tienen distintas constantes de modificación debido a su distinto entorno. Por el contrario en la
valoración con urea los grupos se modifican mas rápidamente y al mismo tiempo ya que todos
están igual de accesibles al estar la proteína desnaturalizada.
2. Cinética de valoración de grupos tiol y actividad aldolasa residual
2. 1. Valoración los grupos tiol con el reactivo DTNB
Tiempo (s) A412 [Cys modificada] nº cys/molecula
0 0.344 2.52941E-05 6.32352941
15 0.425 0.00003125 7.8125
30 0.468 3.44118E-05 8.60294118
45 0.505 3.71324E-05 9.28308824
60 0.540 3.97059E-05 9.92647059
75 0.572 4.20588E-05 10.5147059
90 0.601 4.41912E-05 11.0477941
105 0.628 4.61765E-05 11.5441176
120 0.652 4.79412E-05 11.9852941
135 0.674 4.95588E-05 12.3897059
150 0.694 5.10294E-05 12.7573529
165 0.711 5.22794E-05 13.0698529
180 0.728 5.35294E-05 13.3823529
195 0.742 5.45588E-05 13.6397059
210 0.754 5.54412E-05 13.8602941
225 0.784 5.76471E-05 14.4117647
270 0.792 5.82353E-05 14.5588235
285 0.800 5.88235E-05 14.7058824
300 0.807 5.93382E-05 14.8345588
Los datos obtenidos se expresan como un porcentaje de actividad aldolasa respecto al control no
tratado con DTNB que será el 100 % de actividad.
2.2 Cuantificación la actividad aldolasa residual tras la valoración de los grupos tiol.
Tiempo 0 seg tiempo (s) Tubo 1
0 0,360
15 0,101
30 0,084
45 0,083
60 0,083
75 0,083
90 0,083
105 0,082
120 0,082
y = -0,0173x + 0,36 R² = 1
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0 2 4 6 8 10 12 14 16
A4
12
t(s)
Tiempo 0
Tiempo 15 seg tiempo (s) Tubo 2
0 0,459
15 0,406
30 0,345
45 0,281
60 0,218
75 0,158
90 0,106
105 0,086
120 0,084
Tiempo 30 seg tiempo (s) Tubo 3
0 0,397
15 0,373
30 0,344
45 0,313
60 0,281
75 0,252
90 0,221
105 0,191
120 0,162
Tiempo 1 min tiempo (s) Tubo 4
0 0,477
15 0,465
30 0,452
45 0,438
60 0,426
75 0,414
90 0,402
105 0,391
120 0,379
y = -0,004x + 0,4621 R² = 0,9992
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 20 40 60 80 100 A
412
t(s)
Tiempo 15 s
y = -0,002x + 0,4011 R² = 0,9994
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0 20 40 60 80 100 120 140
A41
2
t(s)
Tiempo 30 seg
y = -0,0008x + 0,4766 R² = 0,9991
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 20 40 60 80 100 120
A41
2
t(s)
Tiempo 1 min
Tiempo 2 min tiempo (s) Tubo 5
0 0,438
15 0,428
30 0,417
45 0,407
60 0,395
75 0,385
90 0,374
105 0,362
120 0,352
Tiempo 5 min tiempo (s) Tubo 6
0 0,460
15 0,445
30 0,427
45 0,409
60 0,389
75 0,370
90 0,351
105 0,332
120 0,313
Tiempo (s) nº cys/molecula Actividad Actividad %
0 6.323 -0.0173 100
15 7.8125 -0.0040 23.12
30 8.6029 -0.0020 11.56
60 9.9264 -0.0008 4.62
120 11.9852 -0.0007 4.05
300 14.8348 -0.0012 6.94
y = -0,0007x + 0,4387 R² = 0,9997
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0 20 40 60 80 100 120 140 A
412
t(s)
Tiempo 2 min
y = -0,0012x + 0,463 R² = 0,9992
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 20 40 60 80 100 120 140
A41
2
t(s)
Tiempo 5 min
Según el artículo de Heyduk et al., la aldolasa de musculo de conejo se compone por 4
subunidades aproximadamente idénticas que forman un tetrámero de 160000 Da. En cada una
de las subunidades destacan 4 grupos sulfhídricos (cisteínas) expuestos y potros cuatro enterraos
en el interior de la proteína. Por tanto en el tetrámero encontramos un total de 32 residuos de
cisteína entre los cuales 16 estarían en el interior hidrofóbico y 16 en la región expuesta de la
proteína. Heyduk et al. Hablan de una gran flexibilidad conformacional de la aldolasa, en la que
la modificación e interacción entre los diferentes grupos sulfhídricos afectan de manera
importante a la actividad de la proteína.
Entre estos residuos destacan el residuo Cys239
y el Cys289
localizados fuera dl centro activo, los
cuales ejercen un gran efecto sobre la actividad de la proteína. El objetivo principal de Hayduk
et al. En su experimento fue el de demostrar que la modificación de residuos que no formaban
parte del centro activo de la proteína podían afectar al plegamiento y actividad de dicha enzima,
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000
12,0000
14,0000
16,0000
0 100 200 300 400
% A
ctiv
idad
Tiempo (s)
nº Cys modif
300; 6,94 0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 100 200 300 400
% A
ctiv
idad
Tiempo (s)
% Actividad
es decir, no son únicamente los residuos situados en el centro activo los principales responsables
de la actividad del enzima.
Nosotros conseguimos valorar 19 casi 20 de los 32 residuos de cisteína en la proteína
desnaturalizada. De estos residuos 14 (casi 15) están accesibles en la proteína y casi 7 en el
interior hidrofóbico, esto se deduce a partir de la desnaturalización con urea 8 M en la que
encontramos 20 residuos frente a la desnaturalización gradual con urea 4M, en la que solo
conseguimos valorar 15, y de aquí sabemos que hay 7 no accesibles. De los 14 que se
encuentran accesibles, podemos suponer que la mayor parte se encuentran en el centro activo,
pero no afirmarlo categóricamente puesto que como se nos indica el autor del artículo, pueden
existir residuos que no estén en el centro activo, y sin embargo sean tan accesibles como estos y
modifican la actividad del enzima. En nuestros resultados observamos que para que se origine
prácticamente el cese de la actividad enzimática, se tiene que dar la modificación de
aproximadamente 8 residuos de cisteína. Estos 8 residuos corresponderían con las 8 cisteinas
esenciales, dentro de las cuales se encontrarían las Cys mencionadas anteriormente. La
diferencia entre el numero de cisteínas que hemos conseguido valorar (aproximadamente 20), y
el expuesto en el artículo (concretamente 32) puede ser causada por la mala exposición de todos
los residuos conseguida al desnaturalizar la proteína, causando la no interacción del DTNB con
estos.
La diferencia en cuanta a numero de residuos de cisteína expuestos en la superficie, obtenidos
en la práctica (aproximadamente 6) y el encontrado por Heyduk et al. (16 residos), puede ser
debida nuevamente a la no interacción del DTB con estos, o que las condiciones de ensayo no
fueran las mejores, causando cierta modificación de la conformación tridimensional, ocasionada
por su gran flexibilidad, ocasionando el error de la estimación del numero de residuos de
cisteína expuestos en la superficie de la proteína.
Cuestiones
1.- ¿Cuántos residuos tiol se han podido valorar en la proteína? ¿Cuántos grupos tiol es
necesario valorar para que la actividad residual aldolasa sea prácticamente cero? Si el
número de grupos tiol en ambos casos es diferente, ¿Cuál puede ser la causa de esa
diferencia?
En la proteína se ha podido valorar casi 20 residuos (19,60), en el experimento con urea 8M ya
que en este caso es cuando valoramos todos los grupos tiol de la proteína teóricamente, al ser un agente desnaturalizante fuerte.
La disminución brusca en la actividad residual aldolasa se produce cuando el número de
cisteínas modificadas por molécula es aproximadamente ocho, que ha de ser una aproximación a las cisteínas presentes en el centro activo del enzima y cuya modificación afecta a su actividad.
El número de grupos tiol es distinto debido a que además de los grupos que afectan a la
actividad , que se encuentran en el centro activo, tenemos otras cisteínas en diversos sitios de la proteína tales como cisteínas superficiales que también se modifican en diversos sitios de la
proteína tales como cisteínas superficiales que también modifican en estado nativo aunque más
tarde que las del centro activo, y otras no accesibles al DNTB por encontrarse en zonas internas de la proteína, las cuales no permiten el paso del modificador tanto por restricciones de tamaño
como por impedimentos de tipo estérico o por efectos de carga, por lo que solo con la proteína
completamente desnaturalizada es posible que el DNTB acceda a ellas, lo que supondrá un
aumento de las cisteínas que detectamos.
2.- ¿Por qué se necesitan condiciones suaves de reacción con el DTNB para valorar los
grupos tiol que determinan la pérdida de la actividad aldolasa
Porque el objetico que buscamos es observar cambios graduales en la cinética de valoración del
enzima a la que se le modifican determinados grupos o residuos puntuales, y ver la pérdida gradual de actividad para conocer así los residuos del centro activo o que son importantes para
que el enzima sea activo. Por ello, como vemos en el caso de urea 8M, en condiciones fuertes la
proteína se desnaturaliza completamente y no sabemos que residuos afectan al centro activo ya
que se modifican todos, mientras que en el caso de de no poner urea solo veremos aquellos residuos a los que el DTNB pueda acceder, que no tienen por qué ser todos los implicados en la
actividad del enzima, además de no apreciar la perdida completa de actividad por no poder
valorar algunos residuos. Por todo ello, unas condiciones suaves ayudan a ver como se pierde la actividad progresivamente y a valorar por tanto la relación entre residuos modificaos y a
funcionales y la pérdida de actividad pudiendo de esta forma determinar cuántos residuos son
necesarios para que el enzima sea funcional.
Bibliografía
Long-range Effects and Conformational Flexibility of Aldolase. Tomasz Heyduk, Ryszard
Michalczykg, and Marian Kochman.
Cuadernillo de prácticas