α-synukleiini Parkinsonin taudin mallintamisessa jyrsijöillä

Sauli Pätsi

Helsingin yliopisto

Farmasian tiedekunta

Farmakologian ja toksikologian osasto

Maaliskuu 2013

Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty

Farmasia/Farmakologia ja toksikologia

Laitos/Institution– Department

Tekijä/Författare – Author

Sauli Pätsi Työn nimi/Arbetets titel – Title

α-synukleiini Parkinsonin taudin mallintamisessa jyrsijöillä

Oppiaine/Läroämne – Subject

Farmakologia

Työn laji/Arbetets art – Level

Pro Gradu

Aika/Datum – Month and year

Maaliskuu 2013

Sivumäärä/Sidoantal – Number of pages

60 Tiivistelmä/Referat – Abstract

Parkinsonin tauti on rappeuttava hermosairaus, jolle on tunnusomaista mustatumakkeen dopamiinia

tuottavien hermosolujen vähittäinen tuhoutuminen sekä solunsisäisten Lewyn kappaleiden

muodostuminen. α-synukleiinin on havaittu olevan olennainen osa Lewyn kappaleita, minkä lisäksi

mutaatioiden α-synukleiinigeenissä on havaittu altistavan harvinaisille suvuittain esiintyville

Parkinsonin taudin muodoille.

Parkinsonin taudin eläinmallien luomisessa käytetään hermomyrkkyjä, sairauteen liittyvien geenien

suhteen siirtogeenisiä eläimiä sekä virusvektoreita. Siirtogeeniset eläin- ja virusvektorimallit

näyttävät ilmentävän perinteisiä hermomyrkkymalleja paremmin Parkinsonin taudin aiheuttamia

hermostomuutoksia. Siirtogeeni sekä geenin ilmentämisessä käytetty promoottori määräävät,

minkälaisia hermostomuutoksia sekä liikehäiriöitä siirtogeenisessä eläinmallissa esiintyy.

Erikoistyössä tutkittiin adenoassosioidun virusvektorin (AAV1-vektori) kykyä siirtää aivojuovioon

tai mustatumakkeeseen WT- tai A53T-α-synukleiinigeeniä, sekä näiden yli-ilmentymisen vaikutusta

hiirten liikkumiseen ja aivojuovion dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden pitoisuuksiin.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin myös prolyyliendopeptidaasientsyymin (PREP) estäjän vaikutuksia

A53T-α-synukleiinin yli-ilmentymiseen hiiren nigrostriataaliradalla, koska PREP:n on havaittu

nopeuttavan α-synukleiinin aggregoitumista ja siten ehkä lisäävän α-synukleiinin hermosoluille

haitallisia vaikutuksia.

Hiirten liikkumista mittaavissa kokeissa (liikeaktiivisuus, pyörivä sauva, tasapainorima) ei havaittu

tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä. Vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) värjäyksen

perusteella nähtiin GFP:n vähäinen ilmentyminen aivojuoviossa, minkä perusteella virusvektorit

levisivät aivoissa heikosti ja ilmensivät siirtogeeniä huonosti. Tämä voi selittää myös sen, miksi α-

synukleiinin yli-ilmentymistä ei havaittu. Dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden

pitoisuuksissa oli vain pieniä eroja. Tutkimuksen II lopuksi tehdyssä PREP-aktiivisuuden

mittauksessa havaittiin, että PREP-estäjähoito (KYP-2047) oli alentanut PREP:n aktiivisuutta

huonosti.

Erikoistyössä virusvektorit eivät aiheuttaneet α-synukleiinin yli-ilmentymistä, mutta aiemmin

ainakin AAV2- ja AAV6-vektorit ovat toimineet jyrsijöissä. Useimmissa näytteissä havaittu korkea

PREP-aktiivisuus johtunee KYP-liuoksen annostelussa käytetyn minipumpun asennuksen

epäonnistumisesta. Vaikka erikoistyössä virusvektoreilla ei saatu luotua Parkinsonin taudin

eläinmallia, ne ovat tulevaisuudessa tärkeä menetelmä Parkinsonin taudin mallintamisessa.

Avainsanat – Nyckelord – Keywords

α-synukleiini, Parkinsonin tauti, eläinmalli, virusvektori Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited

Farmasian tiedekunta, Farmakologian ja toksikologian osasto Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information

Ohjaajat: Mari Savolainen, Timo Myöhänen

Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty

Pharmacy/Pharmacology and Toxicology

Laitos/Institution– Department

Tekijä/Författare – Author

Sauli Pätsi Työn nimi / Arbetets titel – Title

α-synuclein-based murine models of Parkinson’s disease

Oppiaine/Läroämne – Subject

Pharmacology

Työn laji/Arbetets art – Level

Master’s Thesis

Aika/Datum – Month and year

March 2013

Sivumäärä/Sidoantal – Number of pages

60 Tiivistelmä/Referat – Abstract

Parkinson's disease is a neurodegenerative disease which is characterized by progressive loss of

dopaminergic neurons in the substantia nigra and formation of intracellular Lewy bodies. α-

synuclein is an essential part of Lewy bodies. In addition, mutations in the α-synuclein gene have

been found to cause rare familial forms of Parkinson's disease.

Animal models of Parkinson's disease are created by neurotoxins, transgenic animals and viral

vectors. Transgenic animal models and viral vector models seem to reflect the pathology of

Parkinson’s disease better than the traditional neurotoxin models. In the transgenic animal models,

the transgene and the promoter used in the expression of the transgene guide the pathology and

motor dysfunctions that the animal model exhibits. In the viral vector models, it is important to use

a suitable animal strain and a correct viral serotype in order to express the transgene sufficiently

enough in the laboratory animals.

The aim of the study was to investigate the ability of adeno-associated viral vector (AAV1-vector)

to transfect WT- or A53T-α-synuclein gene into the striatum or the substantia nigra, and the effects

of their overexpression on motor functions and concentrations of striatal dopamine and its

metabolites in mice. In addition, the effect of a prolyl endopeptidase (PREP) inhibitor on the

overexpression of A53T-α-synuclein in the mouse nigrostriatal pathway was studied, as PREP has

been found to stimulate the aggregation of α-synuclein and therefore perhaps to increase

neurotoxicity of α-synuclein.

There were no statistically significant differences between the groups in the motor function tests

(locomotor activity, rotarod and balance beam walk). Green fluorescent protein immunostaining

showed that the GFP gene was weakly transfected into the striatum by the AAV1-vector, and no

overexpression was observed. There were only minor differences in the striatal concentrations of

dopamine and its metabolites. Finally, PREP-activity measurements showed that PREP-inhibitor

(KYP-2047) treatment had poorly reduced PREP-activity.

In this study, the viral vectors did not induce the overexpression of α-synuclein, although previously

AAV2- and AAV6-vectors have been efficient in mice and rats. High PREP-activities that were

found in most of the samples probably resulted from failed installations of mini-pumps that

delivered the PREP-inhibitor. While in this study the viral vectors were not a successful attempt in

the creation of an animal model of Parkinson's disease, they are an important method to model

Parkinson’s disease in the future.

Avainsanat – Nyckelord – Keywords

α-synuclein, Parkinson’s disease, animal model, viral vector Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited

Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacology and Toxicology Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information

Supervisors: Mari Savolainen, Timo Myöhänen

KÄYTETYT LYHENTEET JA TERMIT

5-HT 5-hydroksi-tryptamiini

5-HIAA 5-hydroksi-indolietikkahappo

6-OHDA 6-hydroksidopamiini

AAV adenoassosioitu virus

ANOVA varianssianalyysi

aSyn α-synukleiini

CaMKIIα kalsium/kalmoduliini-riippuvainen proteiinikinaasi IIα

CBA kanan β-aktiini

CMV sytomegalovirus

DA dopamiini

DBS aivojen syvien osien stimulointi

DNS aasin normaaliseerumi

DOPAC 3,4-dihydroksifenyylietikkahappo

GFP vihreä fluoresoiva proteiini

GDNF gliasoluperäinen hermokasvutekijä

GNS vuohen normaaliseerumi

HPLC korkean erotuskyvyn nestekromatografia

HVA homovanilliinihappo

mPr hiiren prioniproteiini

MPTP 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiini

NAC N-asetyylikysteiini

NAP mikrotubuluksiin liittyvä peptidi NAPVSIPQ

PB fosfaattipuskuri

PBA 4-fenyylibutyyrihappo

PBS 0,9 % natriumkloridi fosfaattipuskurissa

PDGF- β ihmisen verihiutalekasvutekijä-β

PITX3 aivolisäkkeen homeobox-geeni-3

S1 synapsiini-1

s.c. ihonalaisesti

SEM keskiarvon keskivirhe

SNCA α-synukleiinigeeni

Str aivojuovio

SN mustatumake

TH tyrosiinihydroksylaasi

Thy-1 tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1

tTa tetrasykliinikontrolloitu transaktivaattori

VMAT2 vesikulaarinen monoamiinien kuljetusproteiini-2

WPRE metsämurmelin hepatiittiviruksen transkription jälkeinen

säätelyosa

WT villityyppi

aivojuovio striatum

aivoturso hippocampus

mustatumake substantia nigra

sinertävä aivotäplä locus caeruleus

SISÄLLYSLUETTELO

I KIRJALLINEN OSA: α-SYNUKLEIINIIN PERUSTUVAT PARKINSONIN

TAUDIN JYRSIJÄMALLIT

1 JOHDANTO ............................................................................................................. 1

2 α-SYNUKLEIINI ..................................................................................................... 4

3 α-SYNUKLEIININ SUHTEEN SIIRTOGEENISET HIIRET ................................ 7

3.1 Villityypin α-synukleiinia ilmentävät hiiret ............................................ 8

3.2 A53T-α-synukleiinia ilmentävät hiiret .................................................. 11

3.3 A30P-α-synukleiinia ilmentävät hiiret .................................................. 14

3.4 Muita siirtogeenisiä malleja .................................................................. 16

4 α-SYNUKLEIININ VIRUSVEKTORIMALLIT ................................................... 18

4.1 Virusvektorit rotissa .............................................................................. 19

4.2 Virusvektorit hiirissä ............................................................................. 21

5 YHTEENVETO ...................................................................................................... 22

II KOKEELLINEN OSA: VILLITYYPIN TAI A53T-α-SYNUKLEIININ YLI-

ILMENTÄMISEN JA YHDISTETYN PREP-ESTÄJÄHOIDON VAIKUTUKSET

HIIRTEN LIIKKUMISEEN JA NIGROSTRIATAALISIIN

DOPAMIINIHERMOSOLUIHIN

1 JOHDANTO ........................................................................................................... 25

2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................... 28

2.1 Eläimet .................................................................................................. 28

2.2 Käytetyt kemikaalit ja lääkeaineet ........................................................ 28

2.3 Stereotaktinen leikkaus ......................................................................... 30

2.4 Liikkumista mittaavat käyttäytymiskokeet ........................................... 30

2.5 Kudosnäytteiden valmistus ja immunohistokemialliset värjäykset ...... 32

2.6 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia eli HPLC ............................ 34

2.7 PREP-aktiivisuuden mittaus .................................................................. 35

2.8 Tulosten käsittely ja tilastolliset testit ................................................... 36

3 TULOKSET ............................................................................................................ 37

3.1 Koesarja I .............................................................................................. 37

3.1.1 Immunohistokemialliset värjäykset ............................................ 37

3.1.2 Liikeaktiivisuus ........................................................................... 38

3.1.3 Pyörivä sauva .............................................................................. 39

3.1.4 Tasapainorima ............................................................................. 40

3.1.5 Monoamiinimääritykset .............................................................. 41

3.2 Koesarja II ............................................................................................. 41

3.2.1 Liikeaktiivisuus ........................................................................... 42

3.2.2 Pyörivä sauva .............................................................................. 43

3.2.3 Tasapainorima ............................................................................. 43

3.2.4 Monoamiinimääritykset .............................................................. 44

3.2.5 PREP-eston voimakkuus ............................................................. 45

4 TULOSTEN TARKASTELU JA POHDINTA ...................................................... 46

5 YHTEENVETO ...................................................................................................... 51

6 KIRJALLISUUSLUETTELO ................................................................................ 52

1

1 JOHDANTO

Parkinsonin tauti on Alzheimerin taudin jälkeen toiseksi yleisin rappeuttava

hermosairaus, jota sairastaa 1-2 prosenttia 60 vuotta täyttäneistä ihmisistä (de Lau ja

Breteler 2006). Parkinsonin taudin yleisimmät oireet ovat lepovapina, jäykkyys,

liikkeiden hitaus ja asentojen epävakaus, mutta siihen liittyy myös muita kuin

liikkumiseen liittyviä oireita, kuten autonomisen hermoston toimintahäiriöitä, hajuaistin

häiriöitä, mielialan muutoksia ja dementiaa (Olanow ym. 2009; Shulman ym. 2011).

Parkinsonin taudille on tunnusomaista mustatumakkeen dopamiinia tuottavien

hermosolujen vähittäinen tuhoutuminen sekä solunsisäisten, runsaasti proteiinia

sisältävien Lewyn kappaleiden muodostuminen. Lewyn kappaleita esiintyy

hermosolujen runko-osassa lähes kaikkialla potilaiden aivoissa (Spillantini ja Goedert

2000). Muissa hermosolujen osissa sijaitsevia vastaavia kertymiä kutsutaan Lewyn

neuriiteiksi. α-synukleiiniaggregaattien eli liukenemattomien kasautumien on havaittu

olevan olennainen osa Lewyn kappaleita (Spillantini ym. 1998).

Dopamiinihermosolujen tuhoutuminen johtaa kyseisen välittäjäaineen puutokseen

hermojen päätealueella, aivojuoviossa (Shulman ym. 2011). Liikehäiriöitä alkaa ilmetä,

kun 60 % mustatumakkeen dopamiinihermosoluista on tuhoutunut ja aivojuovion

dopamiini vähentynyt 80 %. Parkinsonin taudin tyypillisiä löydöksiä ovat myös

muutokset ääreishermostossa, kolinergisissa hermosoluissa, sinertävän aivotäplän

noradrenaliinia erittävissä hermosoluissa, limbisen järjestelmän mantelitumakkeessa ja

aivotursossa, noradrenergisissa hermosoluissa, serotonergisissa hermosoluissa sekä

hermosoluissa aivokuorella ja selkäytimessä. Dopamiinihermosolujen tuhoa

edeltävätkin muutokset erityisesti selänpuoleisessa liikehermostossa ja hajukäämissä.

Parkinsonin taudin aiheuttajaa ei tunneta, mutta nykytiedon perusteella se on seurausta

ympäristön ja geenien monimutkaisista yhteisvaikutuksista. Riskiä sairastua tautiin

lisäävät esimerkiksi korkea ikä, miessukupuoli, eurooppalainen syntyperä sekä

altistuminen tuholaismyrkyille ja raskasmetalleille.

Parkinsonin taudin hoidossa käytettäviä lääkkeitä ovat levodopa, dopamiiniagonistit,

monoamiinioksidaasi-B:n estäjät, katekoli-O-metyylitransferaasin estäjät, antikolinergit

ja amantadiini (Olanow ym. 2009). Mikäli lääkkeillä on merkittäviä haittavaikutuksia,

2

voidaan kokeilla aivojen syvien osien stimulointia eli DBS-hoitoa. Nykyisin käytettävät

lääkkeet auttavat sairauteen liittyviin liikehäiriöihin, mutta muihin oireisiin niiden teho

on heikko. Lisäksi mikään nykyhoidoista ei pysäytä etenevää dopamiinihermosolujen

tuhoa eikä siten vaikuta sairauden ennusteeseen (Chesselet ja Richter 2011).

Oireenmukaisella hoidolla voidaan kuitenkin parantaa potilaiden elämänlaatua.

Parkinsonin taudin tutkimuksessa on tavoitteena löytää lääke, joka suojaa hermosoluja

tuhoutumiselta tai korjaa jo vaurioituneita hermosoluja (Chesselet 2008; Olanow ym.

2009; Beal 2010). Ennen kuin uutta lääkekandidaattia voidaan testata ihmisillä

kliinisissä kokeissa, vaaditaan tehosta todisteita prekliinisissä kokeissa, joihin kuuluvat

muun muassa eläinkokeet. Perinteiset Parkinsonin taudin eläinmallit perustuvat

mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoamiseen erilaisilla hermomyrkyillä, joista

käytetyimmät ovat 6-hydroksidopamiini (6-OHDA) ja 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-

tetrahydropyridiini (MPTP). Mediaaliseen etuaivokimppuun injisoitu 6-OHDA

aiheuttaa totaalileesion eli hermosolujen täydellisen tuhoutumisen ja aivojuovioon

injisoitu 6-OHDA osittaisleesion (Decressac ym. 2012a). Toksiinimallit ilmentävät

yleensä hyvin sairauteen liittyviä liikehäiriöitä, mutta taudin aiheuttamia hermosoluihin

kohdistuvia muutoksia ne ilmentävät huonosti. Solutuho on äkillistä eikä ajan mittaan

etenevää, kuten Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla. Muun muassa tämän vuoksi

mielenkiinto on siirtynyt sairautta mahdollisesti paremmin ilmentäviä geneettisiä

eläinmalleja ja virusvektorimalleja kohtaan.

Sairauden syntyperä ja oireita aiheuttavat muutokset täytyy tuntea hyvin ennen kuin

uusia hoitomuotoja voidaan alkaa kehittää. Eläinmalleja käytetään sairauksien syiden

selvittämiseen sekä uusien hoitojen testaukseen ennen ihmisillä tehtäviä kliinisiä

tutkimuksia. Yleisesti eläinmallien laatua voidaan arvioida tarkastelemalla sen

ominaisuuksia. Täydellinen malli perustuu sairauden varmistettuun syyhyn, se ilmentää

sairauden oireita ja siinä nähdään sama hoitovaste kuin oikeissa potilaissa (Chesselet ja

Richter 2011). Harvoin kuitenkaan löytyy tällaista mallia, vaan joudutaan tyytymään

malleihin, jotka ilmentävät vain jotain sairauden ominaisuutta. Täydelliselle

Parkinsonin taudin eläinmallille on useita vaatimuksia. Yli 50 %

dopamiinihermosoluista pitäisi tuhoutua vähitellen aikuisiässä (Beal 2010). Mallin tulisi

3

sisältää Parkinsonin taudin tyypillisimmät liikehäiriöoireet. Lisäksi mallin pitäisi

ilmentää Lewyn kappaleita tai α-synukleiinin kertymätuotteita. Taloudellisista syistä

tärkeää olisi myös sairauden kokonaisetenemisen suhteellisen lyhyt kesto. Parkinsonin

taudin tutkimuksessa eläinmallien avulla voidaan ennustaa mahdollisen hoidon tehoa,

mutta vasta oikeilla potilailla tehtyjen tutkimusten tuloksista voidaan päätellä, miten

hyvin eläinmalli soveltuu kliinisen tehon ennustamiseen (Chesselet ja Richter 2011).

Sen lisäksi, että α-synukleiini on Lewyn kappaleiden olennainen rakenneosa, α-

synukleiinigeenin mutaatioiden on havaittu altistavan harvinaisille suvuittain

esiintyville Parkinsonin taudin muodoille (Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998;

Singleton ym. 2003; Zarranz ym. 2004; Chartier-Harlin ym. 2004). α-synukleiini on siis

mielenkiintoinen Parkinsonin taudin tutkimuskohde. Tähän kirjallisuuskatsaukseen on

koottu erilaisia α-synukleiiniin perustuvia jyrsijämalleja, joita käytetään Parkinsonin

taudin tutkimuksessa. Siirtogeenisten eläinlinjojen lisäksi käsitellään virusvektoreilla

aiheutettua α-synukleiinin yli-ilmentymistä.

4

2 α-SYNUKLEIINI

α-synukleiini on 140 aminohaposta koostuva pääasiassa aivoissa oleva proteiini, jonka

molekyylimassa on 14,46 kDa (Jakes ym. 1994). Ihmisen α-synukleiinigeeni (SNCA)

sijaitsee kromosomissa 4q21 (Chen ym. 1995; Spillantini ym. 1995). Vaihtoehtoisen

silmukoinnin seurauksena kokonaisen α-synukleiini-140:n lisäksi on olemassa ainakin

kaksi muuta isoformia: α-synukleiini-126 ja α-synukleiini-112 (Uversky 2007). α-

synukleiini koostuu kolmesta osasta: N-terminaali- (aminohappotähteet 1-60), keskus-

(aminohappotähteet 61-95) ja C-terminaalialueesta (aminohappotähteet 96-140). Vaikka

0,5-1 % aivojen soluliman proteiineista on α-synukleiinia, sen toimintaa ei ole vielä

tarkalleen selvitetty (Iwai ym. 1995; Surguchov 2008). Tutkimusten perusteella α-

synukleiinia on runsaasti sitoutuneena hermopäätteiden vesikkeleihin eli kalvon

muodostamiin rakkuloihin, joten se ilmeisesti säätelee keskushermostossa

välittäjäaineiden vapautumista (Uversky 2007; Surguchov 2008). Lisäksi α-synukleiini

säätelee solukalvojen lipidiosien järjestystä, fosfolipaasi D:n ja kinaasien toimintaa sekä

saattaa suojata normaaleina pitoisuuksina hermosoluja. Koska α-synukleiini ei ole

rakenteeltaan tarkasti laskostunut, sillä on paljon yhteisvaikutuksia eri proteiinien ja

ionien kanssa. α-synukleiinin rakenne on herkkä ympäristöolosuhteiden vaikutuksille ja

siitä tunnetaan ainakin seitsemän eri konformaatiomuotoa.

Vaikka Lewyn kappaleiden on tiedetty pitkään olevan Parkinsonin taudin, Lewyn

kappale-dementian sekä multippelisysteemiatrofian tunnusmerkki, pysyi niiden

koostumus tuntemattomana, kunnes liukenemattomien α-synukleiiniaggregaattien

havaittiin olevan niiden merkittävä rakenneosa (Spillantini ym. 1998; Spillantini ja

Goedert 2000). Jopa 90 % Lewyn kappaleiden sisältämästä α-synukleiinista on

fosforyloitunut proteiinin 129. aminohapon, seriinin kohdalta (Fujiwara ym. 2002).

Fosforyloituminen saattaa siis olla tärkeä syy α-synukleiinin aiheuttamille haitallisille

vaikutuksille, sillä koeputkiolosuhteissa fosforyloituminen lisää α-synukleiinin

säikeistymistä. Liukenemattomat α-synukleiiniaggregaatit sisältävät sekä epämääräisen

muotoisia osia että säikeitä (Uversky 2007; Surguchov 2008). α-synukleiinin herkkyys

aggregoitua voi selittyä sen rakenteellisella monimuotoisuudella sekä lukuisilla

yhteisvaikutuksilla. Aggregaattien muodostumista edeltää α-synukleiinin osittainen

5

laskostuminen (Kuva 1). Laskostumattoman ja osittain laskostuneiden muotojen välillä

vallitsee normaalisti tasapaino, mutta esimerkiksi tuholaismyrkyt, korkea α-

synukleiinipitoisuus, pistemutaatiot, matalan pH:n tavoin vaikuttavat kationit ja

oksidatiiviset vauriot voivat siirtää tasapainoa osittain laskostuneen muodon suuntaan.

Tasapainon siirtyminen osittain laskostuneiden muotojen suuntaan siis edesauttaa

aggregaattien muodostumista. α-synukleiiniaggregaattien tiedetään aiheuttavan

hermosolujen tuhoutumista, tulehdusreaktioita ja sen epäillään aiheuttavan lysosomien

toimintahäiriöitä (Surguchov 2008). Erityisesti α-synukleiinista koostuvat pienet

oligomeerit saattavat olla tärkeitä α-synukleiinin haitallisuuden kannalta (Surguchov

2008). Lysosomijärjestelmän on puolestaan havaittu pilkkovan autofagisesti α-

synukleiinia ja α-synukleiiniaggregaatteja, joten α-synukleiini itse saattaa edesauttaa

aggregaattien muodostumista (Schneider ja Zhang 2010). Lysosomien lisäksi α-

synukleiini pilkkoutuu proteasomien sekä useiden entsyymien (esim.

metalloproteinaasit ja kallikreiini-6) kautta (Surguchov 2008).

Kuva 1 Normaalisti monomeerinen α-synukleiini on järjestäytymätön. Tietyissä

olosuhteissa α-synukleiini alkaa laskostua ja siitä muodostuu oligomeereja. Osa

oligomeereistä muodostaa säikeitä, jotka puolestaan ovat merkittävä osa Lewyn

kappaleita. α-synukleiinin haitallisuuden syy ei ole täysin selvillä. Hermosoluille

toksisia saattavat olla tietyt oligomeerit tai esisäikeet, vaikka Lewyn kappaleet ovat

tyypillisin löydös (mukaillen Waxman ja Giasson 2009).

monomeerinen

aSyn

β-laskostumat

rengasmaiset

oligomeerit

säikeistymättömät oligomeerit

oligomeerit

oligomeerit

esisäikeet

Lewyn kappale aSyn-säikeet

6

Suurin osa Parkinsonin tautitapauksista on satunnaisia, mutta kolmen α-

synukleiinigeenin eri pistemutaation (A53T, A30P tai E46K) tai geenin kaksin- tai

kolminkertaistumisen on havaittu aiheuttavan harvinaisia perinnöllisiä taudin muotoja

(Taulukko 1) (Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998; Singleton ym. 2003;

Zarranz ym. 2004; Chartier-Harlin ym. 2004). A53T-mutaatiossa α-synukleiinin 53.

aminohappo alaniini on vaihtunut treoniiniin, koska geenin 209. emäs guaniini on

vaihtunut adeniiniin (G209A) (Polymeropoulos ym. 1997). A30P-mutaation aiheuttaa

α-synukleiinigeenin 88. emäksen guaniinin vaihtuminen sytosiiniin (G88C), josta seuraa

proteiinin 30. aminohapon alaniinin vaihtuminen proliiniin (Krüger ym. 1998). E46K-

mutaatio on seurausta 46-glutamiinihapon vaihtumisesta lysiiniin, mikä johtuu 188.

emäksen guaniinin vaihtumisesta adeniiniin (G188A) (Zarranz ym. 2004).

Pistemutaatiot nopeuttavat α-synukleiinin β-laskostumista ja liukenemattomien

säikeiden muodostumista, mistä seuraa yleensä varhain alkava Parkinsonin tauti (Narhi

ym. 1999; Waxman ja Giasson 2009). α-synukleiinigeenin kolminkertaistuminen

altistaa myös varhain alkavalle Parkinsonin taudille, mutta kaksinkertaistumisesta

johtuva Parkinsonin tauti muistuttaa taudin idiopaattista muotoa (Singleton ym. 2003;

Chartier-Harlin ym. 2004). Idiopaattinen eli ilman tunnettua syytä kehittyvä Parkinsonin

tauti alkaa siis vanhemmalla iällä ja etenee hitaasti. Lisäksi dementia ja muut

älykkyyteen liittyvät oireet ovat tavallisessa Parkinsonin taudin muodossa

harvinaisempia kuin pistemutaatioiden tai geenin kolminkertaistumisesta johtuvissa

tautimuodoissa. Kaikki mutaatiot on löydetty tutkittaessa sellaisia sukuja, joissa on

esiintynyt normaalia runsaammin Parkinsonin tautia. Osassa mutaatioista tiedot

perustuvat vain muutamiin potilaisiin.

7

Taulukko 1. Parkinsonin tautia aiheuttavien α-synukleiinigeenin mutaatioiden

ominaisuudet. Kaikki pistemutaatiot periytyvät autosomaalisesti (mutaatio ei sijaitse

sukusolussa) ja ovat dominoivia (kantaja ilmentäjää geeniä). aSyn = α-synukleiini, 2 x

SNCA = α-synukleiinigeenin kaksinkertaistuminen, 3 x SNCA = α-synukleiinigeenin

kolminkertaistuminen, ↑ = lievä lisäys, ↑↑ = runsas lisäys.

Mutaatio Taudin muoto Vaikutukset aSyn:iin Lähde

A53T Varhain alkava,

nopeasti etenevä, 85 %

kantajista sairastuu

Kertyminen ↑↑, β-

laskostuminen ↑ ja

säikeiden muodostuminen

(Polymeropoulos

ym. 1997; Waxman

ja Giasson 2009)

A30P Varhain alkava, melko

nopeasti etenevä

Kertyminen ↑, β-

laskostuminen ↑ ja

säikeiden muodostuminen ↑

(Krüger ym. 1998;

Narhi ym. 1999)

E46K Varhain alkava, melko

nopeasti etenevä

Säikeiden muodostuminen ↑ (Zarranz ym. 2004;

Waxman ja Giasson

2009)

2 x SNCA Muistuttaa tavallista Proteiinin muodostuminen ↑ (Chartier-Harlin ym.

2004; Waxman ja

Giasson 2009)

3 x SNCA Varhain alkava,

nopeasti etenevä,

dementia ↑

Proteiinin muodostuminen

↑↑

(Singleton ym.

2003; Waxman ja

Giasson 2009)

3 α-SYNUKLEIININ SUHTEEN SIIRTOGEENISET HIIRET

Viimeisen reilun kymmenen vuoden aikana on kehitetty useita α-synukleiinia yli-

ilmentäviä hiirikantoja (Masliah ym. 2000; Fleming ym. 2004; Rockenstein ym. 2005)

(Taulukko 2). Siirtogeenisen kannan tuottamisen jälkeen hiirten käyttö on helppoa,

kunhan mutaatio ei häiritse liikaa lisääntymistä eikä elinvoimaisuutta (Chesselet 2008).

Eniten on käytetty ihmisen villityypin (WT) α-synukleiinigeeniä sekä geenin

pistemutaatioita A53T ja A30P.

Geenin siirrossa promoottori määrää, millä alueilla geeni ilmenee (Crabtree ja Zhang

2012). Mallin elimistöön aiheuttamien muutosten pitäisi muistuttaa mahdollisimman

hyvin potilaiden tilaa. Tällöin ei siis periaatteessa pitäisi käyttää promoottoria, joka

ilmentää geeniä esimerkiksi vain katekoliamiineja sisältävissä hermosoluissa.

Promoottoreina on käytetty esimerkiksi hiiren prioniproteiinin (mPr-), ihmisen

verihiutalekasvutekijä-β:n (PDGF-β-), tyrosiinihydroksylaasin (TH) ja tymosyyttien

8

erilaistumisantigeeni-1:n (Thy-1) geenien promoottoreita. Näistä TH-promoottori

ilmentää geeniä ainoastaan TH:a sisältävissä hermosoluissa ja muut promoottorit

kaikissa hermosoluissa. Mielenkiintoinen tapa tutkia α-synukleiinin merkitystä

Parkinsonin taudin kehittymisessä on luoda konditionaalisia hiirimalleja, joissa α-

synukleiinigeeni voidaan halutessa hiljentää tai kytkeä päälle (Nuber ym. 2008; Lim

ym. 2010; Lin ym. 2012).

Taulukko 2. Siirtogeenisiä eläinmalleja, joita kuvataan tarkemmin myöhemmin

tekstissä. aggr. = aggregoituminen, aSyn = α-synukleiini, DA = dopamiini, hThy-1 =

hamsterin tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1, mPr = hiiren prioni, mThy-1 = hiiren

tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1, Prom. = promoottori SN = mustatumake, SNCA =

α-synukleiinigeeni, Str = aivojuovio, TH = tyrosiinihydroksylaasi, WT = villityyppi, + =

ilmenee mallissa, - = ei ilmene mallissa, ↓ = heikkenee/vähenee, ↑ = lisääntyy.

Geeni

(SNCA) Prom.

aSyn

aggr.

DAergiset

vaikutukset

Liike-

häiriöt Muuta Viitteet

WT mThy-1 SN + Str DA ↓ + Hajuaisti ↓

(Rockenstein ym.

2002; Fleming ym.

2004; Fleming ym.

2008)

A53T mPr - - +

Mitokondrio-

häiriöt,

liike-

hermosolut ↓

(Giasson ym. 2002;

Lee ym. 2002; Martin

ym. 2006)

A30P mThy-1 - - + Kognitio ↓ (Kahle ym. 2001;

Neumann ym. 2002;

Freichel ym. 2007)

A30P +

A53T hThy-1 SN +

Str DA ↓,

SN TH ↓ + - (Ono ym. 2009)

Y39C mThy-1 + - + - (Zhou ym. 2008)

aSyn

1-120/

1-130

TH +

Str DA ↓,

SN TH ↓

(1-130)

+ -

(Tofaris ym. 2006;

Wakamatsu ym. 2008;

Shelkovnikova ym.

2011)

A53T aSyn - - + Suolisto-

oireet ↑ (Kuo ym. 2010)

3.1 Villityypin α-synukleiinia ilmentävät hiiret

WT-α-synukleiinigeenin ilmentämisessä on käytetty useita eri promoottoreita.

Promoottorin vaikutus näyttää merkittävältä sen kannalta, minkälaisia

hermostomuutoksia ja oireita WT-α-synukleiinigeenin ilmentymisestä seuraa.

Esimerkiksi käytettäessä Thy-1-promoottoria hiirille kehittyi ajan mittaan pahenevia

9

liikehäiriöitä (Fleming ym. 2004). Kun käytettiin mPr-promoottoria, mitään merkitseviä

käyttäytymis- tai hermostomuutoksia ei syntynyt (Lee ym. 2002; Unger ym. 2006).

Yhdessä ensimmäisistä tutkimuksista käytettiin PDGF-β-promoottoria (Masliah ym.

2000). Kahdessa kuukaudessa siirtogeenisille hiirille muodostui α-synukleiinia ja

ubikitiiniä sisältäviä inkluusioita eli solunsisäisiä kappaleita aivokuorelle, aivotursoon ja

mustatumakkeeseen. Tätä seurasi myös dopamiinihermopäätteiden tuhoutuminen

aivojuoviossa. Samalla kehittyi liikehäiriöitä ja eniten α-synukleiinia ilmentävät hiiret

suoriutuivat merkitsevästi heikommin pyörivällä sauvalla, joka mittaa hiirten

liikkumiskykyä, tasapainoa ja kestävyyttä. Inkluusiokappaleet sijaitsivat sekä

solulimassa että tumassa. Tämä eroaa Parkinsonin tautia sairastavista potilaista, joilla

inkluusiot ovat lähes pelkästään solulimassa. Siirtogeenisillä hiirillä TH:n pitoisuudet

sekä entsymaattinen aktiivisuus olivat merkitsevästi vähentyneet. Toisessa

tutkimuksessa samalle hiirikannalle annosteltiin stereotaktisena injektiona lysosomien

autofagian säätelijää (bekliini 1), joka vähensi α-synukleiinin aggregoitumista ja

hermopäätteiden tuhoutumista (Spencer ym. 2009). Eräässä tutkimuksessa pitkäaikainen

suun kautta annosteltu N-asetyylikysteiini (NAC) suojasi TH:a sisältäviä hermopäätteitä

tuhoutumiselta (Clark ym. 2010). NAC-hoidetuilla hiirillä oli myös merkitsevästi

vähemmän α-synukleiinia aivokuorella ja aivojuoviossa. Näiden lisäksi passiivinen

immunisaatio α-synukleiinin vasta-aineella (9E4) on tehokkaasti vähentänyt α-

synukleiinin aggregoitumista ja liikehäiriöiden kehittymistä (Masliah ym. 2011).

Kun promoottorina käytettiin Thy-1:tä, hiirille kehittyi muutamassa kuukaudessa

havaittavia ja ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä (Fleming ym. 2004). α-synukleiinia

aggregoitui sekä aivokuorelle että mustatumakkeeseen (Rockenstein ym. 2002; Fleming

ym. 2004). Näillä hiirillä havaittiin myös hajuaistin heikentymistä, mikä on yleinen

prekliininen Parkinsonin taudin oire (Fleming ym. 2008). Lisäksi korkeat α-

synukleiinipitoisuudet heikentävät aivokuorelta aivojuovioon kulkevia

hermosoluyhteyksiä vähentämällä välittäjäaineiden vapautumista ennen kuin

dopamiinihermosolut alkavat tuhoutua (Wu ym. 2010). Thy-1 saattaa siis olla hyvä

promoottori tutkittaessa Parkinsonin taudin varhaisia hermostoon kohdistuvia

muutoksia. Samalla hiirikannalla on havaittu, että nuorilla hiirillä (enintään 6 kk)

10

aivojuovion solunulkoisen dopamiinin määrä oli huomattavasti kohonnut (Lam ym.

2011). Myös hiirten liikeaktiivisuus avokenttätestissä oli kasvanut. Samoilla hiirillä

aivojuovion dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet olivat selvästi

laskeneet 14 kuukauden iässä. Eräässä tutkimuksessa hermosoluja oksidatiiviselta

stressiltä sekä dopamiinin haitallisilta vaikutuksilta suojaava mikrotubuluksiin liittyvä

peptidi NAPVSIPQ (NAP) paransi hiirten liikkumiskykyä ja vähensi α-synukleiini-

inkluusiokappaleiden muodostumista (Fleming ym. 2011). Myös kolesterolin

muodostumista estävän lääkeaineen, lovastatiinin vaikutuksia α-synukleiinin

kertymiseen on tutkittu, koska kolesterolin hajoamistuotteen 27-hydroksikolesterolin on

epäilty nopeuttavan α-synukleiiniaggregaattien muodostumista (Koob ym. 2010). WT

α-synukleiinia ilmennettiin hiirissä hiiren Thy1.2- ja PDGF-β-promoottorilla ja α-

synukleiini kertyi laajasti molemmissa ryhmissä. Lovastatiinihoito vähensi

merkitsevästi α-synukleiinin kertymistä siirtogeenisissä hiirissä, mutta se ei vaikuttanut

merkitsevästi kontrollihiirten α-synukleiinipitoisuuksiin.

Rotan TH-promoottori ilmensi WT-α-synukleiinia voimakkaasti mustatumakkeessa,

mutta liikehäiriöitä tai hermostomuutoksia nigrostriataaliradalla ei havaittu (Richfield

ym. 2002). Siirtogeenisillä hiirillä dopamiinin kuljettajaproteiinin pitoisuus oli

kohonnut, mutta dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden tasoissa ei havaittu

muutoksia. Sen sijaan toisessa (TH)WT-α-synukleiinimallissa hiirten liikeaktiivisuus

laski ajan mittaan ollen lopulta 22 kuukauden ikäisillä hiirillä 78 % kontrollihiirten

aktiivisuudesta (Thiruchelvam ym. 2004). Mustatumakkeen TH:a sisältävien

hermopäätteiden määrä oli laskenut 19 kuukaudessa 19 %.

Konditionaalisessa poistogeenisessä hiirimallissa havaittiin, että korkeat α-

synukleiinipitoisuudet vähentävät uusien hermosolujen muodostumista ja aiheuttavat

hermosolujen tuhoutumista aivotursossa (Nuber ym. 2008). Lisäksi hiirille kehittyi

pyörivällä sauvalla havaittavia liikehäiriöitä. Mallissa käytettiin hamsterin

prioniproteiinin promoottoria sekä kalsium/kalmoduliini-riippuvaista proteiinikinaasi IIα –

promoottoria (CaMKIIα-promoottori). Promoottoreihin oli liitetty tetrasykliinikontrolloitu

transaktivaattori (tTa), jolloin α-synukleiinigeeni voidaan halutessa hiljentää

doksisykliinillä. Geenin hiljentämisen jälkeen α-synukleiinin yli-ilmentyminen ja

11

hermosolujen tuhoutuminen loppuivat, mutta oireet eivät hävinneet. Näin ollen α-

synukleiinin määrää pitäisi pystyä rajoittaa mahdollisimman varhaisissa sairauden

vaiheissa. Toisessa vastaavanlaisessa mallissa havaittiin, että juuri kypsyvät hermosolut

ovat herkimpiä α-synukleiinin yli-ilmentymisen haitallisille vaikutuksille (Lim ym.

2010).

3.2 A53T-α-synukleiinia ilmentävät hiiret

Myös A53T-α-synukleiinin ilmentämiseen on käytetty eri promoottoreita, mutta

promoottorista riippumatta se vaikuttaa aiheuttavan voimakkaimmat hermostoon

kohdistuvat muutokset sekä oireet verrattuna WT- ja A30P-α-synukleiiniin.

Promoottoreista käyttökelpoisin lienee mPr-promoottori, joka näyttää muutamissa

tutkimuksissa ilmentävän Parkinsonin tautia eniten oikeita potilaita muistuttavalla

tavalla (Giasson ym. 2002).

Hiiren Thy-1-promoottoria käytettäessä A53T-α-synukleiini on aiheuttanut hiirille

selkäytimeen ja hermo-lihasliitoksiin merkittäviä muutoksia, joista seurasi varhain

havaittavia liikehäiriöitä (van der Putten ym. 2000). Mustatumakkeen

dopamiinihermosoluissa ei kuitenkaan havaittu muutoksia. Kun käytettiin mPr-

promoottoria, hiiret olivat terveitä ja oireettomia kahdeksan kuukauden ikään asti, jonka

jälkeen hiirten sukiminen vähentyi, paino laski ja niille ilmaantui ajoittaisia raajojen

halvauksia (Giasson ym. 2002). Oireet alkoivat myöhään, mutta etenivät nopeasti ja

hiiret olivat täysin toimintakyvyttömiä kolmen viikon kuluessa ensimmäisten oireiden

alkamisesta. Hiirten aivoista ja selkäytimistä löytyi paljon liukenemattomia α-

synukleiiniaggregaatteja. Myös kahdessa muussa samalla promoottorilla tehdyssä

tutkimuksessa A53T-α-synukleiini aiheutti vakavat oireet (Lee ym. 2002; Martin ym.

2006). Ikääntyville hiirille kehittyi liikehäiriöitä, jotka johtivat nopeaan kuolemaan.

Aivoihin kertyi sekä α-synukleiinia että ubikitiiniä. Siirtogeenisten hiirten

mitokondriaalisessa DNA:ssa havaittiin häiriöitä, ja lisäksi mitokondrioihin kertyi α-

synukleiini-inkluusiokappaleita (Martin ym. 2006). Lisäksi näiden hiirten

liikehermosolujen lukumäärä oli vähentynyt selvästi (75 %). Yllättäen myöskään Leen

12

tutkimuksessa WT- tai A30P-α-synukleiinia ilmentävillä hiirillä ei havaittu merkittäviä

hermostomuutoksia tai oireita, vaikka proteiinia muodostui paljon (Lee ym. 2002).

Näiden tulosten perusteella A53T-α-synukleiini on kaikkein haitallisin hermosolujen

normaalille toiminnalle.

(mPrP)A53T-α-synukleiinia ilmentäville hiirille on kehittynyt liikehäiriöitä myös

silloin, kun α-synukleiini ei ole aggregoitunut (Gispert ym. 2003). Hiirten

suoriutuminen heikentyi merkitsevästi useissa testeissä (askelpituus, avokenttä,

etutassujen puristusvoima ja pyörivä sauva) joko ensimmäisen tai vasta toisen

elinvuoden aikana α-synukleiinitasosta riippuen. (mPrP)A53T-α-synukleiinin yli-

ilmentymisen on toisaalta havaittu aiheuttavan myös yliaktiivisuutta, vaikka yleensä

siitä seuraa ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä ja liikeaktiivisuuden laskua.

Siirtogeeniset hiiret olivat liikeaktiivisuudeltaan normaaleja viiden kuukauden ikäisinä,

mutta seitsemän kuukauden iässä hiirten havaittiin olevan merkitsevästi yliaktiivisia

liikeaktiivisuustestissä (Unger ym. 2006). Hiiret olivat 19 kuukauden ikäisinä yhä

yliaktiivisia, mutta 15 % hiiristä sai vanhemmalla iällä liikehäiriöitä ja nämä hiiret

kuolivat 2-3 viikossa. Yliaktiivisilla hiirillä havaittiin dopamiinin D1-reseptorin

lukumäärän nousseen mustatumakkeessa ja yliaktiivisuus kumoutuikin D1-reseptorin

estäjällä (SCH 23390). Dopamiinin kuljettajaproteiinin lukumäärän ja dopamiinin

takaisinoton havaittiin laskeneen aivojuoviossa. Tämä tutkimus eroaa siis huomattavasti

aiemmin käsitellyistä tutkimuksista, jossa (mPrP)A53T-α-synukleiinin aiheuttamat

oireet muistuttivat hyvin Parkinsonin tautipotilaiden oireita. Erot selittynevät A53T-α-

synukleiinigeenin ilmentymisvoimakkuuden eroilla, koska aiemmissa tutkimuksissa α-

synukleiini kertyi ilmeisesti voimakkaammin. Tutkijat arvelivat, että A53T-α-

synukleiinipitoisuuksien noustessa korkeiksi oireet muuttuvat yliaktiivisuudesta

monenlaisiin liikehäiriöihin (Unger ym. 2006). Tämä johtunee siitä, että vasta korkeat

α-synukleiinipitoisuudet aiheuttavat liikehermosolujen tuhoutumista erityisesti

selkäytimessä. Uudemmassa (mPrP)A53T-α-synukleiinitutkimuksessa mitattiin

aivojuovion dopamiinipitoisuuksia ennen kuin hermosolujen odotettiin tuhoutuvan

(Kurz ym. 2010). Nuorten hiirten aivojuovion dopamiinitasojen havaittiin olevan

suoraan verrannollisia α-synukleiinin pitoisuuksiin, mikä on tyypillistä Parkinsonin

taudin varhaisessa vaiheessa. Yllättäen dopamiinitasot pysyivät korkeina myös

13

vanhoilla hiirillä. Vanhoilla hiirillä ei myöskään havaittu selvää hermosolujen

tuhoutumista, α-synukleiiniaggregaatteja eikä TH-tasojen laskua. Dopamiinipitoisuuden

nousun lisäksi havaittiin dopamiinia pilkkovan entsyymin (katekoli-O-

metyylitransferaasi) määrän vähentyneen sekä dopamiinireseptoreiden määrän

nousseen. Nämä löydökset saattavat kuvastaa aivojen pyrkimystä korjata dopamiinin

vähentyneen vapautumisen seurauksia.

Lisäksi (mPrP)A53T-hiirillä on havaittu muutoksia noradrenaliinin pitoisuuksissa

(Sotiriou ym. 2010). 15 kuukauden ikäisillä siirtogeenisillä hiirillä noradrenaliinin

pitoisuus oli merkitsevästi laskenut aivojuoviossa, mustatumakkeessa sekä

hajukäämissä. TH:n määrä oli laskenut selkäytimessä ja hajukäämissä, mutta

dopamiinipitoisuus ei ollut vähentynyt. Tämä viittaa juuri noradrenaliinia erittävien

hermopäätteiden tuhoutumiseen. Hiirten noradrenaliinia erittävät hermosolut saattavat

siis olla vielä dopamiinihermosolujakin herkempiä α-synukleiinin haitallisille

vaikutuksille. Rotan TH-promoottori ilmensi A53T-α-synukleiinia pelkästään

nigrostriataalijärjestelmän hermosolujen solukeskuksissa, hermosolujen

viejähaarakkeissa sekä hermopäätteissä (Richfield ym. 2002). Näille hiirille kehittyi iän

myötä liikehäiriöitä samalla, kun dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden

pitoisuudet laskivat. Dopamiinihermosolujen tuhoutumista ei kuitenkaan havaittu.

Konditionaalisessa poistogeenisessä hiirimallissa CaMKIIα-promoottorilla ilmennetty

A53T-α-synukleiini kertyi erityisesti limbiseen järjestelmään saaden aikaan

hermotukisolujen liiallista aktivaatiota ja jakautumista, minkä lisäksi hiirille kehittyi

muistihäiriöitä (Lim ym. 2011). Nämä muutokset kumoutuivat osittain, kun geeni

hiljennettiin doksisykliinillä. Toisessa konditionaalisessa hiirimallissa doksisykliiniä

sisältävää ruokaa annosteltiin emoille tiineysajan alusta alkaen, jolloin poikasilla alkaa

muodostua A53T-α-synukleenia vasta doksisykliinin annostelun loppumisen jälkeen

(Lin ym. 2012). Geenin ilmentämisessä käytettiin aivolisäkkeen homeobox-geeni-3:n

(PITX3) promoottoria, johon oli liitetty tTa. PITX3-promoottori ilmentää geeniä

lähinnä keskiaivojen dopamiinihermosoluissa, joiden havaittiin tuhoutuvan etenevästi.

α-synukleiini kertyi keskiaivojen dopamiinihermosoluihin ja aggregoitui hermosolujen

viejähaarakkeisiin. Lisäksi α-synukleiinin havaittiin aiheuttavan dopamiinihermosolujen

14

normaalin toiminnan kannalta tärkeän transkriptiotekijä Nurr1:n tuhoutumista. Hiirten

suoriutuminen avokenttä-, pyörivä sauva- sekä askelpituustestissä heikentyi 1-2

kuukaudessa.

Siirtogeeni saadaan ilmentymään vain α-synukleiinia sisältävissä soluissa, kun

käytetään α-synukleiinigeenin luonnollista promoottoria (Kuo ym. 2010). (aSyn)A53T-

hiirille kehittyi ajan mittaan pahenevia suoliston toimintahäiriöitä, jotka havaittiin jo 3

kuukauden iässä, ennen esimerkiksi hajuaistin häiriöitä. Suoliston toimintahäiriöt ovat

mielenkiintoinen tutkimuskohde, koska ne saattavat alkaa jo vuosikymmeniä ennen

Parkinsonin taudin varsinaista puhkeamista. Siirtogeenisille hiirille kehittyi myös

liikehäiriöitä (avokenttätesti ja pyörivä sauva), vaikka keskushermostossa ei havaittu α-

synukleiiniaggregaatteja, hermosolujen tuhoutumista tai muutoksia aivojuovion

dopamiinitasoissa.

3.3 A30P-α-synukleiinia ilmentävät hiiret

A30P-α-synukleiinin ilmentämisessä promoottorin valinta näyttää yhtä tärkeältä kuin

WT-α-synukleiinin kohdalla. Ainakin Thy-1-promoottori vaikuttaa käyttökelpoiselta

Parkinsonin taudin mallintamisessa, sillä yli-ilmentymisen aiheuttamat

hermostomuutokset ja oireet alkavat varsin myöhään. A53T-α-synukleiinin verrattuna

A30P-α-synukleiinin yli-ilmentyminen on kuitenkin vähemmän haitallista (Lee ym.

2002; Unger ym. 2006). mPr-promoottorilla A30P-α-synukleiini ilmentyi voimakkaasti,

mutta hiirille ei kehittynyt selviä oireita tai haitallisia aivoihin kohdistuvia muutoksia 24

kuukaudessa (Lee ym. 2002). α-synukleiinia kertyi hiirten aivoihin, mutta siitä ei

muodostunut samanlaisia liukenemattomia aggregaatteja kuin A53T-α-synukleiinia

ilmentävillä hiirillä. Myöskään toisessa samalla promoottorilla tehdyssä tutkimuksessa

ei havaittu liikehäiriöitä tai liikeaktiivisuuden muutoksia, vaikka A30P-α-synukleiinia

muodostui paljon (Unger ym. 2006). Koeputkikokeissa on havaittu, että A53T-α-

synukleiini muodostaa A30P-α-synukleiinia herkemmin liukenemattomia aggregaatteja

(Conway ym. 1998). Tämä voi osittain selittää erot hiirten oireiden välillä. On myös

tutkimuksia, joissa (mPrP)A30P-α-synukleiini on aiheuttanut hiirille liikeaktiivisuuden

15

laskun sekä heikentyneen suoriutumisen pyörivällä sauvalla, vaikka

dopamiinihermosolujen tuhoutumista ei näissäkään ole havaittu (Yavich ym. 2005;

Piltonen ym. 2013). Kuitenkin tällä hiirikannalla dopamiinin vapautuminen

aivojuoviossa on vähentynyt voimakkaassa stimulaatiossa (Yavich ym. 2005). Lisäksi

α-synukleiinia kertyi aivojuovioon, aivotursoon ja aivokuorelle (Yavich ym. 2005;

Piltonen ym. 2013). Hamsterin Pr-promoottorilla α-synukleiini ilmentyi myös laajasti ja

hiirille kehittyi vakavia liikehäiriöitä iän myötä (Gomez-Isla ym. 2003).

Keskushermostossa havaittiin gliasolujen määrän ja aktiivisuuden nousseen, mutta

dopamiinihermosolujen määrässä tai dopamiinin pitoisuuksissa ei tapahtunut

muutoksia.

Thy-1 promoottoria käytettäessä A30P-α-synukleiini ilmentyi hiirten vanhetessa joka

puolella aivoja, mutta mustatumakkeessa ei havaittu α-synukleiinin aggregoitumista

(Kahle ym. 2001; Neumann ym. 2002; Freichel ym. 2007). Ilmeisesti Thy-1-

promoottori ei ilmennä α-synukleiinigeeniä tarpeeksi paljon mustatumakkeessa. α-

synukleiini laskostui ja fosforyloitui epänormaalisti, mikä voi aiheuttaa häiriöitä aivojen

normaalin toimintaan. Erityisesti aivorungossa sekä selkäytimessä havaittiin

normaalista poikkeavia muutoksia ja hiirille kehittyikin ensimmäisen elinvuoden aikana

liikehäiriöitä (Neumann ym. 2002). Neljän kuukauden ikäisillä Thy-1-A30P-hiirillä ei

havaittu käytösmuutoksia eikä α-synukleiinin aiheuttamia muutoksia hermosoluissa,

mutta 12 kuukauden iässä nämä hiiret suoriutuivat merkitsevästi kontrollihiiriä

heikommin kognitiota eli älyllistä suorituskykyä mittaavista testeistä (Morrisin

vesisokkelo ja pelkoehdollistumiskoe) ja samalla myös α-synukleiinin aiheuttamia

muutoksia aivoissa oli havaittavissa (Freichel ym. 2007). Nuorten siirtogeenisten hiirten

tulokset liikeaktiivisuustestissä ja pyörivällä sauvalla eivät eronneet kontrolleista, mutta

12 kuukauden ikäisinä hiiret olivat yliaktiivisia. Toisen elinvuoden aikana hiirten

liikeaktiivisuus alkoi kuitenkin heikentyä merkitsevästi ja hiiret saivat jopa kuolemaan

johtavia oireita.

16

3.4 Muita siirtogeenisiä malleja

Villityypin ja yksittäisten pistemutatoituneiden proteiinien ilmentämisen lisäksi

Parkinsonin tautia on mallinnettu hiirissä esimerkiksi käyttämällä poistogeenisiä hiiriä,

fuusioproteiineja sekä mutaatioiden yhdistelmiä. WT-α-synukleiinin ja vihreän

fluoresoivan proteiinin (GFP) fuusioproteiinia on ilmennetty PDGF-β-promoottorilla,

joka aiheutti α-synukleiinin kertymistä aivokuorelle ja muihin aivojen osiin

(Rockenstein ym. 2005). Lysosomijärjestelmässä oli havaittavissa toimintahäiriöitä ja

lysosomeissa α-synukleiini-GFP-proteiinin kertymistä. Näitä tuloksia on tulkittava

varoen, koska GFP:n liittäminen α-synukleiinin rakenteeseen saattaa edistää α-

synukleiinin aggregoitumista.

A30P- ja A53T-kaksoismutatoituneen α-synukleiinin yli-ilmentyminen (hamsterin Thy-

1-promoottori) aiheutti hiirille ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä, jotka alkoivat 2,5

kuukauden iässä (Ono ym. 2009). Hiiret suoriutuivat heikommin pyörivällä sauvalla

sekä pystysuoralla rimalla laskeutumisessa. Kun hiiriä hoidettiin proteiinien

oikeinlaskostumista tehostavalla ja aggregoitumista estävällä 4-fenyylibutyyrihapolla

(PBA), liikehäiriöt lieventyivät. Suun kautta annostellun PBA:n havaittiin vähentävän

mustatumakkeen TH:a sisältävien hermosolujen tuhoutumista sekä pysäyttävän

fosforyloituneen α-synukleiinin kertymisen. Näiden seurauksena aivojuovion

dopamiinipitoisuus ei enää laskenut. PBA ei laskenut α-synukleiinia sisältävien

hermosolujen lukumäärää, jonka perusteella PBA ei ole hermosoluille myrkyllinen

yhdiste. Toisessa A30P/A53T-mallissa rotan TH-promoottori aiheutti myös ajan mittaan

pahenevia liikehäiriöitä, mutta kahden kuukauden iässä hiirten liikeaktiivisuus oli vielä

ennallaan (Thiruchelvam ym. 2004). Kahdeksan kuukauden kohdalla tehdyssä

mittauksessa liikeaktiivisuus oli laskenut ja lopulta 22 kuukauden iässä aktiivisuus oli

60 % kontrollihiirten aktiivisuudesta. 19 kuukaudessa mustatumakkeen TH:a sisältävien

hermopäätteiden määrä oli vähentynyt 55 %.

Parkinsonin taudin mallintamisessa on käytetty myös laboratoriossa luotua Y39C-

pistemutaatiota, jossa tyrosiini on vaihtunut kysteiiniin (Zhou ja Freed 2004). Y39C-

mutaation on havaittu lisäävän α-synukleiinin aggregoitumista soluviljelmissä. (Thy-

17

1)Y39C-hiirillä α-synukleiini yli-ilmentyi laajasti aivoissa ja 9-12 kuukauden iässä

hiirille kehittyi pyörivällä sauvalla havaittavia liikehäiriöitä (Zhou ym. 2008). 15-18

kuukauden iässä α-synukleiini alkoi muodostaa oligomeerejä liikehäiriöiden yhä

pahentuessa. α-synukleiini oli aggregoitunut voimakkaasti hiirten ollessa 21-24

kuukauden ikäisiä, jolloin havaittiin myös Lewyn kappaleiden kaltaisia α-synukleiinia

ja ubikitiiniä sisältäviä inkluusioita sekä solukuolemaa. α-synukleiini oli usein

fosforyloitunut 129-seriinin kohdalta. Hiirten muisti heikentyi iän myötä, mikä

havaittiin selvästi Morrisin vesisokkelossa. Tämän tutkimuksen perusteella (Thy-

1)Y39C vaikuttaa mallintavan melko hyvin Parkinsonin taudin oireita, sillä liikehäiriöt

alkavat hitaasti ja pahenevat ajan mittaan. Lisäksi α-synukleiinin aggregoitumista ja

Lewyn kaltaisten kappaleiden muodostumista edelsi α-synukleiinin

oligomerisoituminen, mikä on harvinaista siirtogeenisissä eläinmalleissa. Tässäkään

tutkimuksessa ei kuitenkaan havaittu mustatumakkeen merkitsevää

dopamiinihermosolujen tuhoutumista.

α-synukleiinia on ilmennetty hiirissä käyttämällä luonnollisesta α-synukleiinista

lyhyempiä osia, jolloin voidaan selvittää eri terminaalialuiden merkitystä proteiinin

aggregoitumiseen ja haitallisten hermostomuutosten syntymiseen. Kun C-

terminaalialueesta katkaistua α-synukleiinia (aminohapot 1-120) ilmennettiin rotan TH-

promoottorilla, hiirille muodostui α-synukleiini-inkluusioita mustatumakkeeseen sekä

hajukäämiin (Tofaris ym. 2006; Shelkovnikova ym. 2011). Siirtogeenisillä hiirillä

aivojuovion dopamiinipitoisuus oli laskenut merkitsevästi jo kolmen kuukauden

ikäisinä ja hiirten luonnollinen liikeaktiivisuus oli vähentynyt merkitsevästi 18

kuukauden iässä kontrolleihin verrattuna (Tofaris ym. 2006). Toisessa tutkimuksessa

siirtogeenisten hiirten suoriutuminen pyörivällä sauvalla oli merkitsevästi heikentynyt

14 kuukauden iässä (Shelkovnikova ym. 2011). Antihistamiini dimeboliinin on havaittu

hidastavan Alzheimerin taudin oireiden ilmentymistä, mutta tässä tutkimuksessa sen

jatkuva annostelu ei parantanut hiirten suorituskykyä eikä estänyt aivojuovion

dopamiinipitoisuuden laskua tai α-synukleiinin kertymistä. Mustatumakkeen

dopamiinihermosolut eivät tuhoutuneet (Tofaris ym. 2006; Shelkovnikova ym. 2011).

Käyttämällä lyhennettyä α-synukleiinia (aminohapot 1-130, rotan TH-promoottori) on

saatu luotua siirtogeenimalli, jossa havaitaan selvää mustatumakkeen

18

dopamiinihermosolujen tuhoutumista (Wakamatsu ym. 2008). Tuhoutuminen kuitenkin

tapahtui alkionkehityksen aikana geenin ilmentymisen alkamisen jälkeen eikä siis ollut

asteittaista kuten oikeissa potilaissa. Siirtogeenisten hiirten luonnollinen liikeaktiivisuus

oli laskenut luultavasti aivojuovion dopamiinipitoisuuden vähentymisen seurauksena.

Muita liikehäiriöitä ei havaittu ja myös liikeaktiivisuuden lasku palautui levodopalla.

α-synukleiinipoistogeenisillä hiirillä havaittiin muutoksia nigrostriataalisella

dopamiiniradalla, mutta ei vakavia oireita (Abeliovich ym. 2000). Dopamiinin

vapautuminen lisääntyi sähköstimulaation tai Ca2+

-ionien vapautumisen seurauksena,

mutta aivojuovion dopamiinin pitoisuus laski. α-synukleiinin puuttuminen aiheuttaa

häiriöitä dopamiinijärjestelmään viitaten rooliin tärkeänä dopamiinin vapautumisen

presynaptisenä säätelijänä.

4 α-SYNUKLEIININ VIRUSVEKTORIMALLIT

Virusvektorit ovat perinteisiä hermomyrkkymalleja ja siirtogeenisiä eläimiä uudempi

menetelmä mallintaa sairauksia eläimissä. Koska Parkinsonin taudille on tyypillistä

mustatumakkeen dopamiinihermosolujen rappeutuminen, suora geeninsiirto näihin

hermosoluihin on mielenkiintoinen tapa tutkia sairauden oireita, syitä ja hoitoa

eläimissä (Korecka ym. 2001). Virusvektorimalleissa tapahtuu dopamiinihermosolujen

asteittaista tuhoutumista. Tämä Parkinsonin taudin tärkeä löydös puuttuu yleensä

siirtogeenisistä eläinmalleista. Yleisimmin käytetyt vektorit geeninsiirroissa ovat

lentivirusvektorit ja adenoassosioidut virusvektorit (AAV-vektorit). α-synukleiinigeenin

siirtämisessä käytetään tavallisesti AAV-vektoreita, koska niitä pidetään tehokkaampina

ja turvallisempina keskushermostoon kohdistuvissa geeninsiirroissa (Korecka ym.

2001). Virukset luokitellaan eri serotyyppeihin pinta-antigeeniensä perusteella. AAV-

vektorin avulla tehdyissä geeninsiirroissa on käytetty ainakin serotyyppejä 2 ja 6 sekä

serotyyppien risteytystä AAV1/2.

19

4.1 Virusvektorit rotissa

Vaikka virusvektoreiden avulla α-synukleiinia on ilmennetty rotissa jo 10 vuotta sitten,

julkaistuja tutkimuksia on varsin vähän (Taulukko 3). Niissä on käytetty sekä WT- että

A53T-α-synukleiinia. Ilmeisesti ensimmäisessä, vuonna 2002 julkaistussa

tutkimuksessa AAV-vektoreissa injisoitiin joko WT- tai A53T-α-synukleiinigeeniä

rottien mustatumakkeen yläpuolelle (Kirik ym. 2002). α-synukleiini ilmentyi

tehokkaasti kolmessa viikossa ja nigrostriataaliset dopamiinihermosolut tuhoutuivat

etenevästi. Dopamiinihermosolujen määrä vähentyi 30-80 % ja aivojuovion dopamiinin

määrä laski 40-50 %. Tutkimuksessa havaittiin, että rottien liikkumiskyky heikkeni

merkitsevästi, jos dopamiinihermosoluja tuhoutui yli 50-60 %. Tulosten perusteella

juuri dopamiinihermosolut ovat herkkiä korkeille α-synukleiinipitoisuuksille, koska

haitallisia muutoksia ei havaittu muissa kuin dopamiinihermosoluissa.

Toisessa virusvektorimallissa siirrettiin A53T-α-synukleiinigeeni AAV1/2-vektorissa

rottien mustatumakkeeseen (Koprich ym. 2010). Myös tässä tutkimuksessa α-

synukleiini ilmentyi voimakkaasti kolmessa viikossa ja liukenemattomia α-

synukleiiniaggregaatteja havaittiin mustatumakkeen dopamiinihermosoluissa, joiden

määrä vähentyi 52 %. Yllättäen myös eräänä kontrollina käytetty AAV1/2-GFP-

proteiini aiheutti mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoutumista (24 %), mutta

tyhjä AAV1/2-vektori ei tuhonnut hermosoluja. Tämän perusteella ei siis voida tehdä

johtopäätöstä, että dopamiinihermosolut olisivat herkkiä pelkästään korkeille α-

synukleiinipitoisuuksille. Aivojuoviossa A53T-α-synukleiini-injektiosta seurasi TH:a

sisältävien hermosolujen määrän vähentyminen (53 %), mutta GFP-ryhmässä vastaavaa

ei havaittu.

AAV6-vektorissa rotille mustatumakkeen yläpuolelle injisoitu WT-α-synukleiini

ilmentyi voimakkaasti nigrostriataaliradalla jo kolme viikkoa injektion jälkeen

(Decressac ym. 2012a). Kahdeksan viikon jälkeen rotat suoriutuivat merkitsevästi

heikommin liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa. Tutkimuksessa α-synukleiinimalli

ilmensi 6-OHDA:aan verrattuna paremmin Parkinsonin taudin hermostomuutoksia.

Virusvektorimallin aiheuttamat muutokset muistuttivat enemmän hermomyrkyillä

20

aiheutettua osittais- kuin totaalileesioita, mutta liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa

virusvektorit aiheuttivat enemmän totaalileesiota muistuttavat tulokset. Suurimmat erot

hermomyrkky- ja virusvektorimallin välillä olivat siinä, miten hermostoon kohdistuvat

muutokset ja oireet kehittyivät. Tutkimusryhmän mukaan virusvektorit aiheuttavat

asteittain etenevän solutuhon ja hitaammin kehittyvät käytösmuutokset verrattuna

hermomyrkkyjen aiheuttamiin äkillisiin muutoksiin. Saman mallin avulla on myös

pyritty selvittämään, miksi hermomyrkkymalleissa dopamiinihermosoluja

tuhoutumiselta tehokkaasti suojannut gliasoluperäinen hermokasvutekijä (GDNF) ei ole

ollut tehokas kliinisissä kokeissa (Decressac ym. 2012b). Tulosten perusteella α-

synukleiinin yli-ilmentyminen soluissa johtaa transkriptiotekijä Nurr1:n ilmentymisen

vähentymiseen. Nurr1 säätelee GDNF:n reseptorin Ret:n ilmentymistä. Tästä seuraa siis

solujen Ret-reseptoreiden väheneminen, jolloin solut eivät reagoi GDNF:ään ja

GDNF:n hermosoluja suojaavat vaikutukset jäävät heikoiksi. Nurr1:n yli-ilmentymisen

(AAV6-vektorilla) havaittiin puolestaan suojaavaan hermosoluja α-synukleiinin

haitallisilta vaikutuksilta, joten Nurr1 on mahdollinen hermosoluja suojaava

lääkekandidaatti.

Taulukko 3. α-synukleiiniin perustuvien virusvektoritutkimusten virusten serotyypit,

tiitterit, promoottorit sekä geenin ilmentymisen voimistajat (transkription jälkeiset

säätelyosat). A53T = A53T-α-synukleiini, CBA = kanan β-aktiini, CMV = sytomegalovirus,

eCMV = sytomegaloviruspromoottorin voimistajat, S1G = synapsiini-1-geeni, WPRE =

metsämurmelin hepatiittiviruksen transkription jälkeinen säätelyosa, WT = villityypin α-

synukleiini, gc/ml = genomikopiota millilitrassa, gp/ml = genomipartikkelia millilitrassa, IU/ml

= infektoivaa yksikköä millilitrassa, vg/ml = virusgenomia millilitrassa.

Viite Vektori Tiitteri Promoottori Voimistaja

(Kirik ym.

2002)

ei

ilmoitettu

WT: 8,2 x 1011 IU/ml

A53T: 1,4 x 1012

IU/ml CBA eCMV

(Koprich ym.

2010) AAV1/2 A53T: 5,1 x 10

12 gp/ml CBA WPRE

(Decressac

ym. 2012a) AAV6 WT: 3,7 x 10

12 gc/ml S1G WPRE

(Decressac

ym. 2012b) AAV6 WT: 2,5 x 10

13 gc/ml S1G WPRE

(St Martin ym.

2007) AAV2 WT: 8,9 x 10

10 vg/ml CMV WPRE

(Cao ym.

2010) AAV2 WT: 6,0 x 10

10 vg/ml ei ilmoitettu ei ilmoitettu

(Ulusoy ym.

2012) AAV6

WT: 0,7 x 1012

, 1,5 x 1012

,

3,0 x 1012

gc/ml S1G WPRE

21

4.2 Virusvektorit hiirissä

Myös hiirillä tehtyjä tutkimuksia on julkaistu vasta vähän. Hiirissä virusvektorit

näyttävät aiheuttavan hieman lievemmät oireet ja hermostoon kohdistuvat muutokset

kuin rotissa. Ensimmäinen hiirillä tehty tutkimus, jossa käytettiin virusvektoria α-

synukleiinin yli-ilmentämisessä, julkaistiin vuonna 2007 (St Martin ym. 2007). AAV2-

vektoreissa mustatumakkeeseen siirretty α-synukleiinigeeni yli-ilmentyi 4, 12 ja 24

viikkoa injektion jälkeen. Dopamiinihermosolujen määrä oli ennallaan neljän viikon

kuluttua injektiosta, 12 viikon jälkeen oli havaittavissa hyvin lievää määrän alentumista

ja 24 viikon jälkeen solumäärä oli vähentynyt 25 %. Tutkimuksessa mitattiin myös

solun stressistä kertovien proteiinien tasoa. Niistä havaittiin positiivinen korrelaatio α-

synukleiinin ilmentymisen ja solujen stressistä ja mitokondrioiden toimintahäiriöistä

kertovien lämpösokkiproteiinien (Hsp27, Hsp40, Hsp70) sekä kaspaasi 9:n välillä.

Toisessa AAV2-vektoriin perustuvassa tutkimuksessa α-synukleiini yli-ilmentyi jo

kaksi viikkoa injektion jälkeen ja TH:a sisältävien hermosolujen määrä oli vähentynyt

27 % 24 viikkoa injektion jälkeen (Cao ym. 2010). Tutkijat arvelivat, että α-

synukleiinin yli-ilmentyminen lisää IgG-vasta-aineiden muodostumista, mikä aktivoi

mikrogliasoluja tuottamaan tulehdusvälittäjäaineita. Pitkäkestoinen tulehdusreaktio

aiheuttaa hermosolukuolemaa, joten dopamiinihermosolujen tuhoutuminen voi olla

tämän ketjureaktion seuraus.

Uusimmassa julkaistussa tutkimuksessa tutkittiin dopamiinitasojen ja α-synukleiinin

yhteisvaikutuksen merkitystä dopamiinihermosolujen toimintaan (Ulusoy ym. 2012).

WT-α-synukleiinigeenin siirrossa käytettiin AAV6-vektoria, jolla saatiin aikaan α-

synukleiinin yli-ilmentyminen hiiren nigrostriataaliradalla. Tutkimuksessa verrattiin

myös serotyyppejä 2, 5 ja 6 GFP:n geenin siirrossa. Näistä tarkimmin geeniä

nigrostriataaliradalla ilmensi serotyyppi 6, joten tämän perusteella Parkinsonin taudin

mallintamisessa AAV6 saattaa olla käyttökelpoisin. Tutkimuksessa käytettiin

villityypin hiiriä ja hiiriä, joilla oli mutaatio VMAT2-geenissä (vesikulaarinen

monoamiinien kuljetusproteiini-2), josta seuraa heikentynyt dopamiinin varastointi ja

käsittely. Tuloksista havaittiin dopamiinihermosolujen tuhoutuvan enemmän

viimeiseksi mainituilla hiirillä, joilla solunsisäisen dopamiinin määrä oli koholla.

22

Häiriöt dopamiinin säätelyssä saattavat siis voimistaa α-synukleiinin kertymisen

haitallisia vaikutuksia.

5 YHTEENVETO

Erilaiset eläinmallit ovat tärkeä osa Parkinsonin taudin tutkimusta (Beal 2010).

Aiemmin dopamiinihermosolujen tuhoamisessa käytettiin hermomyrkkyjä, jotka

mallintavat melko hyvin Parkinsonin tautipotilaiden liikkumiseen liittyviä oireita.

Tulevaisuudessa käytetään enemmän α-synukleiiniin perustuvia siirtogeenisiä eläin- ja

virusvektorimalleja, sillä ne näyttävät mallintavan hermomyrkkyjä paremmin myös

Parkinsonin taudin aiheuttamia hermostomuutoksia (Giasson ym. 2002; Decressac ym.

2012a). Siirtogeenisiä eläimiä käytettäessä promoottorin valinta näyttää määräävään,

minkälaisia hermostomuutoksia ja oireita α-synukleiinista seuraa. Pistemutaatioista

A53T-α-synukleiinin yli-ilmentyminen aiheuttaa yleensä voimakkaimmat

keskushermostoon kohdistuvat muutokset ja oireet, jotka johtavat jopa kuolemaan (Lee

ym. 2002; Unger ym. 2006). WT- ja A30P-α-synukleiinin osalta tulokset ovat

vaihtelevampia. Joissain tutkimuksessa varsinkin villityypin α-synukleiini aiheuttaa

voimakkaita hermostomuutoksia ja oireita, mutta osassa tutkimuksista kumpikaan näistä

ei aiheuta merkittäviä muutoksia (Rockenstein ym. 2002; Lee ym. 2002; Fleming ym.

2004; Unger ym. 2006). Yleisesti ottaen siirtogeenisten hiirimallien suurin heikkous on

mustatumakkeen dopamiinihermosolujen asteittaisen tuhoutumisen puuttuminen

useimmissa eläinmalleissa, jolloin eläinmallilla on mahdoton testata mahdollista

hermosoluja tuhoutumiselta suojaavaa hoitoa. Yhdessä uudessa konditionaalisessa

hiirimallissa on kuitenkin saatu aikaan keskiaivojen dopamiinihermosolujen etenevää

tuhoutumista (Lin ym. 2012).

Muutamien tutkimusten perusteella virusvektorit vaikuttavat siirtogeenisiä eläinmalleja

paremmalta keinolta mallintaa Parkinsonin tautia jyrsijöissä, koska niissä tapahtuu

asteittaista mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoutumista (Kirik ym. 2002;

Decressac ym. 2012a). Lisäksi oireet ja hermostomuutokset ilmenevät nopeammin.

23

Erityisesti rotissa virusvektorit ilmentävät Parkinsonin taudin oireita ja

hermostomuutoksia hyvin. Useat julkaistut tutkimukset ovat kuitenkin saman

tutkimusryhmän tekemiä, joten tulevaisuudessa tarvitaan vielä uusia eri laboratorioissa

tehtyjä tutkimuksia, jotta virusvektoreiden laatu Parkinsonin taudin mallintamisessa

voidaan varmasti osoittaa.

24

II KOKEELLINEN OSA: VILLITYYPIN TAI A53T-α-SYNUKLEIININ YLI-

ILMENTÄMISEN JA YHDISTETYN PREP-ESTÄJÄHOIDON VAIKUTUKSET

HIIRTEN LIIKKUMISKYKYYN JA NIGROSTRIATAALISIIN

DOPAMIINIHERMOSOLUIHIN

25

1 JOHDANTO

α-synukleiini on 140 aminohaposta koostuva proteiini ja aivoissa sitä on noin 1 %

kaikista soluliman proteiineista (Jakes ym. 1994). Viime vuosien aikana α-synukleiini

on yhdistetty rappeuttaviin hermosairauksiin, sillä α-synukleiiniaggregaattien on

havaittu olevan merkittävä osa Lewyn kappaleita, jotka ovat muun muassa Parkinsonin

taudin tyypillinen löydös. Sen lisäksi α-synukleiinigeenin mutaatioiden on havaittu

altistavan harvinaisille suvuittain esiintyville Parkinsonin taudin muodoille

(Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998; Singleton ym. 2003; Zarranz ym. 2004;

Chartier-Harlin ym. 2004). Näiden lisäksi α-synukleiinin yli-ilmentymisen on havaittu

aiheuttavan liikehäiriöitä esimerkiksi rotissa (Kirik ym. 2002).

Parkinsonin taudin eläinmallien luomisessa on perinteisesti käytetty hermomyrkkyjä tai

siirtogeenisiä jyrsijäkantoja (Chesselet 2008). Myöhemmin on otettu käyttöön

virusvektoreita, joista käytetään erityisesti lentiviruksia ja adenoassosioituja viruksia

(AAV). Virusvektorimallin on havaittu ilmentävän hermomyrkkymalleja paremmin

Parkinsonin taudin hermostoon kohdistuvia muutoksia ja joissakin koeasetelmissa

virusvektorilla aiheutettu α-synukleiinin yli-ilmentyminen on saanut aikaan

nigrostriataalisten hermosolujen rappeutumisen (Decressac ym. 2012a). Lisäksi

virusvektoreilla tehdyt tutkimukset voivat olla lyhytkestoisempia ja siten edullisempia

kuin perinteisillä eläinmalleilla.

PREP eli prolyyliendopeptidaasi on seriiniproteaaseihin kuuluva entsyymi, joka pilkkoo

ensisijaisesti enintään 30 aminohapon mittaisia peptidejä proliinin

karboksyylihappopäästä (Cunningham ja O'Connor 1997). Näin ollen se ei pilko α-

synukleiinia. Sen sijaan PREP:n on havaittu nopeuttavan α-synukleiinin

aggregoitumista ja siten Lewyn kappaleiden kaltaisten proteiinikertymien

muodostumista (Brandt ym. 2008). PREP:n toiminnan estäminen puolestaan vähentää

α-synukleiiniaggregaattien määrää ja niiden muodostumista soluviljelmissä sekä

kahdessa α-synukleiinia ilmentävässä hiirikannassa (Myöhänen ym. 2012). 4-

fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-syanopyrrolidiini (KYP-2047) on veri-aivoesteen

hyvin läpäisevä PREP-estäjä, jonka vaikutus on tehokas ja pitkäaikainen (Jalkanen ym.

26

2011). Tämän vuoksi se on kiinnostava molekyyli rappeuttavien hermosairauksien

tutkimuksessa.

Tämän työn kokeellinen osa koostui kahdesta eri tutkimuksesta (Taulukko 4).

Ensimmäisessä tutkittiin AAV1-vektorin kykyä siirtää aivojuovioon ihmisen villityypin

(WT) ja A53T-pistemutatoituneen α-synukleiinin geenejä, sekä näiden yli-ilmentymisen

vaikutusta hiirten liikkumiskykyyn ja aivojuovion monoamiinien pitoisuuksiin.

Kirjallisuudessa ei ole aiemmin kuvattu koejärjestelyä, jossa α-synukleiinipatologiaa

pyrittäisiin ilmentämään aivojuovion kautta nigrostriataaliradalla. Toisessa

tutkimuksessa selvitettiin KYP-2047:n vaikutuksia A53T-α-synukleiinin yli-

ilmentymiseen hiiren nigrostriataaliradalla. Virusvektorit injisoitiin jälkimmäisessä

tutkimuksessa mustatumakkeeseen viikko ennen KYP-2047:n tai vehikkelin

aivokammioihin kohdennetun minipumppuannostelun aloitusta. Molemmissa

tutkimuksissa hiirten liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan. Tasapainon ja

liikkumiskyvyn mittauksessa käytettiin pyörivää sauvaa ja tasapainorimaa. Kokeiden

lopuksi otetuista aivonäytteistä värjättiin immunohistokemiallisesti α-synukleiini,

tyrosiinihydroksylaasi (TH) ja vihreä fluoresoiva proteiini (GFP). Molempien

tutkimusten hiirten aivonäytteistä mitattiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla

(HPLC) dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden 3,4-dihydroksifenyylietikkahapon

(DOPAC) ja homovanilliinihapon (HVA), sekä 5-hydroksitryptamiinin (5-HT) ja sen

aineenvaihduntatuotteen 5-hydroksi-indolietikkahapon (5-HIAA) pitoisuudet. Näillä

mittauksilla pyrittiin selvittämään, oliko α-synukleiinin ilmentäminen aiheuttanut

hermosolujen katoon tai toiminnan häiriöön viittaavia muutoksia monoamiinien

pitoisuuksissa. Tutkimuksessa II lopuksi mitattiin PREP-eston voimakkuus

aivonäytteistä, mikä varmistaisi osmoottisten minipumppujen toimivuuden.

27

Taulukko 4. Kokeellinen osa koostui kahdesta eri tutkimuksesta, joissa molemmissa oli

neljä ryhmää. A53T aSyn = A53T-α-synukleiini, GFP = vihreä fluoresoiva proteiini,

KYP = 4-fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-syanopyrrolidiini, Sham = fysiologinen

keittosuolaliuos, STR = aivojuovio, SN = mustatumake, Veh = vehikkeli, WT aSyn =

villityypin α-synukleiini.

Tutkimus I II

Ryhmä 1 2 3 4 5 6 7 8

n 8 8 8 8 6 6 6 6

Injektiopaikka STR STR STR STR SN SN SN SN

Injektoitu aine Sham GFP WT

aSyn

A53T

aSyn Sham Sham

A53T

aSyn

A53T

aSyn

Minipumppu - - - - Veh KYP Veh KYP

Tutkimuksen

kesto 9 viikkoa injektion jälkeen

4 viikkoa minipumpun

asennuksen jälkeen

Avokenttätesti 0, 4, 8 viikkoa injektiosta 0, 2, 4 viikkoa (minipumppujen

asennuksen jälkeen)

Pyörivä sauva,

tasapainorima 0, 3, 6, 9 viikkoa injektiosta

0, 2, 4 viikkoa (minipumppujen

asennuksen jälkeen)

28

2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1 Eläimet

Kokeissa käytettiin yhteensä 60 C57BL/6JRccHsd-uroshiirtä, jotka hankittiin

kahdeksan viikon iässä (Harlan Laboratories, Alankomaat). Hiirten paino oli

tutkimusten aikana 25-35 grammaa. Hiiriä pidettiin 4-6 hiiren ryhmissä, mutta osa niistä

piti erottaa yksittäin tutkimuksen aikana. Lisäksi leikkausten jälkeen hiiret toipuivat

muutaman päivän omissa laatikoissa ja tutkimuksen II hiiret olivat minipumppujen

asennusten jälkeen yksin. Eläimiä säilytettiin sekä Scantainer-kaapissa että sen

ulkopuolella, ja ruokaa ja vettä oli tarjolla jatkuvasti. Vesi vaihdettiin kaksi kertaa

viikossa ja laatikot vaihdettiin yhden tai kahden viikon välein riippuen hiirten

lukumäärästä. Hiirihuoneen valot olivat päällä 06.00-18.00.

2.2 Käytetyt kemikaalit ja lääkeaineet

3,4-dihydroksifenyylietikkahappo

(DOPAC) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

4-fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-

syanopyrrolidiini (KYP-2047) Kuopion Yliopisto, Kuopio, Suomi

5-hydroksi-indolietikkahapon (5-HIAA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

5-hydroksitryptamiini (5-HT) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

7-amino-4-metyylikumariini-

standardiliuos (AMC) 10 mM Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

Aasin normaaliseerumi (DNS) Vector Laboratories, Burlingame CA, USA

ABC-pakkaus Vector Elite Kit PK-6100. Vector Laboratories Inc.,

Burlingame CA, USA

Adenoassosioidut virusvektorit

(ilman voimistajia)

AAV1 SYN-A53T #5-11-10, tiitteri 1,4 x 1012

genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA

AAV1 SYN-wt #5-11-10, tiitteri 8,0 x 1012

genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA

dsAAV1GWeGFP #10-21-08, tiitteri 2,9 x 1013

genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA

Albumiinistandardiliuos 2 mg/ml (BSA) Pierce Biotechnology, USA

BCA reagenssi A ja B Pierce Biotechnology, USA

Buprenorfiinihydrokloridi Temgesic 0,3 mg/ml. Reckitt Benckiser

Pharmaceuticals, Richmond, USA

Depex-peittausaine VWR International, Leuven, Belgia

29

Diaminobentsidiinihydrokloridi (DAB) Sigma Chemical CO, St. Louis, USA

Dimetyylisulfoksidi (DMSO) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Dinatriumvetyfosfaatti (Na2HPO4) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Dopamiini (DA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

Etanoli 96,5 % (ETAX A) Altia Corporation, Rajamäki, Suomi

Etanoli 99 % (ETAX AA) Altia Corporation, Rajamäki, Suomi

Etikkahappo (CH3COOH) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Etyleenidiamiinitetraetikkahapon

dinatriumsuola (EDTA) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Fosforihappo Mallinckrodt Baker B.V., Denvender, Hollanti

Gelatiini VWR International, Leuven, Belgia

Homovanilliinihappo (HVA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

Hydroksipropyyli-β-syklodekstriini Acros Organics, New Jersey, USA

Isofluraani Baxter, Vantaa, Suomi

Kaliumdivetyfosfaatti (KH2PO4) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Kaliumkloridi (KCl) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Ksyleeni Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Kysteiini Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Lidokaiini-adrenaliiniliuos 10 mg/ml Orion Pharma, Espoo, Suomi

Metanoli Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Natriumasetaatti (CH3COONa) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Natriumdivetyfosfaatti (NaH2PO4) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Natriumhydroksidi VWR International, Leuven, Belgia

Natriumkloridi Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa

Natriumkloridiliuos 9 mg/ml Fresenius Kabi Norge As, Oslo, Norja

Oksaalihappo Mallinckrodt Baker B.V., Denvender, Hollanti

Paraformaldehydi VWR International, Leuven, Belgia

Pentobarbitaali Mebunat Vet 60 mg/ml, Orion Pharma, Espoo,

Suomi

Perkloorihappo Yliopiston Apteekki, Helsinki, Suomi

Sakkaroosi Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Suc-Gly-Pro-AMC-substraattikantaliuos

10 mM Bachem AG, Budendorf, Sveitsi

Suolahappo Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Tislattu vesi Helsingin Yliopisto, Farmakologian ja toksikologian

osasto, Helsinki, Suomi

Tissue-Tek Sakura, Alphen aan den Rijn, Alankomaat

Triton-X Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Vasta-aineet

- Lampaan anti-aSyn: ab6162, Abcam, Cambridge,

Iso-Britannia

- Kanin anti-GFP: Millipore, Bedford MA, USA

- Kanin anti-TH: AB152, Millipore, Bedford MA,

USA

- Aasin anti-lammas HRP-konjugoitu: ab97125,

Abcam, Cambridge, Iso-Britannia

- Vuohen anti-kani HRP-konjugoitu: Vector

Laboratories, Burlingame CA, USA

- Vuohen anti-kani, biotiinikonjugoitu: BA1000,

Vector Laboratories, Burlingame CA, USA

Vetyperoksidi (H2O2) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa

Vuohen normaaliseerumi (GNS) Vector Laboratories, Burlingame CA, USA

30

2.3 Stereotaktinen leikkaus

Virusvektorit injisoitiin hiirten molemmille aivopuoliskoille stereotaktisessa

leikkauksessa (stereotaktinen laite: Stoelting Stereotaxic, Stoelting Co., USA, muut

leikkaukseen tarvittavat osat: AgnTho’s AB, Ruotsi, mikroinjektiolaite: The Stoelting

Quintessential Injector No 53311, Stoelting Co., USA, injektioruisku ja -neula: Nanofil

Syringe and 33 G Blunt Needle: World Precision Instruments Inc., Sarasota, USA).

Hiirten anestesiassa käytettiin isofluraania, jonka pitoisuus aloituksessa oli 4,0 %

(virtausnopeus 200-250 ml/min) ja ylläpidossa 1,0-2,5 %. Paikallispuudutteena

käytettiin 10 mg/ml lidokaiini-adrenaliiniliuosta. Injektiopaikkojen koordinaatit

laskettiin luusaumojen risteymäkohdan eli bregman perusteella ja syvyyskoordinaatti

aivon pinnasta (aivojuovio: A/P: +0,7 mm, M/L: +/-1,8 mm, D/V: -2,7 mm;

mustatumake A/P: -3,10 mm, M/L: +/- 1,1 mm, D/V: -4,1 mm) (Franklin ja Paxinos

1997). Oikea syvyyskoordinaatti mustatumakeinfuusiota varten katsottiin erillisillä

harjoituseläimillä (n = 2), joilla kokeiltiin kahta eri syvyyttä. Virusvektoreita injisoitiin

aivojuovioon 2 μl ja mustatumakkeeseen 1 μl nopeudella oli 0,5 μl/min, minkä jälkeen

neulaa pidettiin paikallaan vielä kahden minuutin ajan. Kipulääkkeenä käytettiin

buprenorfiinia annoksella 0,1 mg/kg. Stereotaktisessa leikkauksessa laitettiin myös

niskanahan alle implantoitavat minipumput (Micro-Osmotic Pump Model 1004, Alzet,

USA), joihin oli kiinnitetty noin yhden senttimetrin pituisella letkulla aivoihin

asennettava kanyyli (Brain Infusion Kit 3, Alzet, USA). Kanyylin koordinaatit laskettiin

bregman perusteella (A/P: -0,3 mm, M/L: +1,0 mm, D/V: -2,5 mm). Minipumppu

annosteli 16 mM KYP-2047-liuosta (1,5 % hydroksipropyyli-β-syklodekstriini + 0,2 %

DMSO suolaliuoksessa) tai vehikkeliä sivukammioon 28 päivän ajan nopeudella 0,11

μl/h. Minipumppu täytettiin kaksi vuorokautta ennen sen asentamista. Käytetyn KYP-

2047-liuoksen pitoisuus laskettiin aiemman julkaisun perusteella (Jalkanen ym. 2011).

2.4 Liikkumista mittaavat käyttäytymiskokeet

Koska α-synukleiinin ilmentäminen liikkeitä säätelevien hermoratojen alueella saattaa

heikentää koe-eläinten liikkumiskykyä ja motorista koordinaatiota, hiirten

31

toimintakykyä seurattiin useilla liikkumista mittaavilla käyttäytymiskokeilla (Brooks ja

Dunnett 2009; Chesselet ja Richter 2011). Hiirten normaalia liikeaktiivisuutta ja sen

vuorokausirytmiä mitattiin läpinäkyvässä mittauslaatikossa, joka oli neliönmuotoinen ja

sivun pituus oli 24 cm ja korkeus 15 cm (Activity Test Chamber ENV-515, Med

Associates Inc., USA). Mitattavat parametrit olivat hiirten kulkema kokonaismatka

senttimetreinä, kuljettu matka aikapisteiden (15 minuuttia) välillä, ylösnousujen

kokonaismäärä sekä ylösnousujen määrä aikapisteiden (15 minuuttia) välillä. Mittaukset

aloitettiin klo 12 ja mittauksen kesto oli 20 tuntia. Liikeaktiivisuustestissä hiirten

liikkumasta matkasta ja takatassuille nousujen lukumäärästä laskettiin ryhmien

keskiarvo ja keskiarvon keskivirhe (SEM) 15 minuutin jaksoissa. Lisäksi laskettiin koko

20 tunnin mittauksen aikana hiirten liikkuman matkan ja takatassuille nousujen

keskiarvo ± SEM. Hiirten lähtötaso mitattiin ennen injektioita ja ensimmäisessä

tutkimuksessa 4 ja 8 viikkoa injektion jälkeen, tutkimuksessa II mittaukset tehtiin 2 ja 4

viikkoa minipumppujen asennuksen jälkeen.

Pyörivä sauva-testissä mitattiin aikaa, jonka hiiri pysyi pyörivän sauvan päällä (Mouse

Rota Rod 47600, Ugo Basile, Italia). Testi mittaa hiirten kestävyyttä, tasapainoa sekä

motorista koordinaatiokykyä (Brooks ja Dunnett 2009). Mittauksen enimmäiskesto oli

300 sekuntia ja se tehtiin kiihtyvällä nopeudella 4-40 kierrosta minuutissa. Putoamiseksi

laskettiin myös se, mikäli hiiri tarttui sauvaan kiinni ja pyöri sen mukana vähintään

kolme kierrosta. Pyörivän sauvan tuloksista laskettiin ryhmien sauvallapysymisaikojen

keskiarvo ± SEM. Tutkimuksessa I mittaukset tehtiin perustason lisäksi 3, 6 ja 9 viikkoa

injektion jälkeen ja tutkimuksessa II perustason lisäksi mittaukset suoritettiin 2 ja 4

minipumppujen asennuksen jälkeen.

Myös tasapainorimatesti mittaa hiirten tasapainoa ja liikkeiden koordinaatiokykyä

(Brooks ja Dunnett 2009). Testissä käytettiin käytettiin ohuita 47 cm korkeudella

pöytätasosta olevia puurimoja, joita pitkin hiiret juoksivat riman toisessa päässä olevaan

mustaan 20 x 17 x 12 cm laatikkoon. Mitattavat parametrit olivat riman ylitysaika

(enintään 60 sekuntia), rimalta putoamiset tai ylösalaisin pyörähtämiset sekä

takatassujen lipsumiset. Ennen varsinaista mittausta hiiriä totutettiin mittaukseen

edellisenä päivänä ja mittausaamuna. Harjoituksissa hiiri laitettiin ylittämään

32

halkaisijaltaan 21 mm rima neljä kertaa. Varsinaiset mittaukset suoritettiin kahdella

ohuemmalla rimalla, joiden halkaisijat olivat 12 ja 8 mm. Ennen mittauksia hiiret

harjoittelivat kerran myös ohuemmilla rimoilla. Tasapainorimatestin tuloksista laskettiin

ryhmien keskiarvot ± SEM riman ylitysajalle, takatassujen lipeämisten ja hiirten

tippumisten määrälle. Tutkimuksessa I mittaukset tehtiin perustason lisäksi 3, 6 ja 9

viikkoa injektion jälkeen ja tutkimuksessa II perustason lisäksi mittaukset suoritettiin 2

ja 4 viikkoa minipumppujen asennuksen jälkeen.

2.5 Kudosnäytteiden valmistus ja immunohistokemialliset värjäykset

Tutkimuksessa I kolme hiirtä jokaisesta ryhmästä nukutettiin pentobarbitaalilla, jonka

jälkeen rintakehä avattiin ja hiirtä perfusoitiin eli huuhdeltiin sydämen kautta ensin

minuutti 0,9 % NaCl-liuoksella PB:ssä (PBS) ja sitten 3 minuuttia 4 %

paraformaldehydillä PB:ssä (PFA). Tätä varten oli valmistettu 0,1 M fosfaattipuskuri eli

PB-liuos (2 litraa 0,1 M Na2HPO4 · 2 H2O, johon lisättiin 0,1 M NaH2PO4 · H2O,

kunnes liuoksen pH oli 7,4.) Tämän jälkeen hiirten päät irrotettiin dekapitoimalla ja

aivot kerättiin talteen kudosleikkeiden tekoa varten. Loput tutkimuksen I hiiristä

dekapitoitiin ilman edeltävää perfuusiota ja aivoista tehtiin metallisen matriisin avulla 2

mm paksuisia leikkeitä, joista eristettiin aivojuovio, mustatumake sekä aivojen loppuosa

-80oC syväjäähän aivojen dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden

pitoisuusmittauksia varten. Tutkimuksessa II kaikki hiiret perfusoitiin PBS:llä minuutin

ajan, jonka jälkeen aivot irrotettiin ja puolitettiin pituussuunnassa. Oikean puolen

aivojuovio, mustatumake ja aivojen loppuosa laitettiin -80oC syväjäähän

monoamiinimittausta sekä PREP-aktiivisuuden mittausta varten. Vasen aivopuolisko

kiinnitettiin yön yli huoneenlämmössä 4 % PFA-liuoksessa, siirrettiin seuraavana

päivänä jääkaappiin 10 % sakkaroosiliuokseen (PB:ssa) ja sitä seuraavana päivänä 30 %

sakkaroosiliuokseen säilytykseen, jotta ne kestäisivät pakastusta. Tutkimuksen I

perfusoiduille aivoille tehtiin myös sama suojakäsittely.

40 mikrometrin paksuiset aivoleikkeet immunohistokemiallisia värjäyksiä varten tehtiin

Leica CM3050-kryostaatilla. Kudosnäytteistä värjättiin immunohistokemiallisesti α-

33

synukleiini (joka 3. aivoleike) sen ilmentymisen voimakkuuden mittaamiseksi, TH (joka

6. aivoleike) dopamiinihermosolujen määrän arvioimiseksi ja GFP (joka 6. aivoleike)

virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn selvittämiseksi (Taulukko 5).

Immunohistokemiallisten värjäysten menetelmät on kuvattu aiemmin

alkuperäisjulkaisuissa (Mijatovic ym. 2007; Myöhänen ym. 2008). α-synukleiinin ja

GFP:n värjäyksiin menetelmää on muokattu vaihtamalla erikoistyöhön sopivat vasta-

aineet, joita käytettiin aiemmin hyviksi havaituilla pitoisuuksilla. Kaikki menetelmät

ovat epäsuoria immunohistokemiallisia värjäyksiä, jossa luontaisen

peroksidaasiaktiivisuuden sammutuksen sekä normaaliseerumi-inkubaation jälkeen

haluttu proteiini tunnistetaan ensin primaarisella vasta-aineella. Menetelmätarkkuus

paranee, kun primaarinen vasta-aine tunnistetaan vielä sekundaarisella vasta-aineella ja

TH-värjäyksessä signaalia vahvistetaan ABC-reaktiolla ennen DAB-värireaktiota.

Objektilaseille siirretyt leikkeet kuivattiin ja peitattiin seuraavana päivänä. Värjätyistä

leikkeistä otettiin kuvat mikroskoopilla ja jokaisesta ryhmästä valittiin kolme leikettä

Image-Pro-ohjelmalla (versio 6.3) tehtävää optisen tiheyden mittausta varten. Kuvat

muutettiin mustavalkoisiksi ja mittaus tehtiin ohjelman viivatyökalulla piirtämällä viiva

aivojuovion halki.

Taulukko 5. Immunohistokemiallisen värjäyksen vaiheet ja käytetyt liuokset.

Leikkeiden pesuun ja liuoksien laimennoksiin on käytetty 0,5 % Triton-X-100:a

PBS:ssa, jos muuta ei ole mainittu. aSyn = α-synukleiini, DAB =

diaminobentsidiinihydrokloridi, DNS = aasin normaaliseerumi, GFP = vihreä

fluoresoiva proteiini, GNS = vuohen normaaliseerumi, PBS = 0,9 % natriumkloridi

fosfaattipuskurissa, TH = tyrosiinihydroksylaasi.

Vaihe Liuos

Leikkeiden pesu 4 x 30 min PBS:ssa

Sammutus 10 min 10 % metanoli + 3 % H2O2 PBS:ssa

Leikkeiden pesu 1-2 x 15 min

Epäspesifisen

sitoutumisen esto

aSyn: 10 % DNS PBS:ssa

GFP: 10 % GNS

TH: 10 % GNS

Primaarinen vasta-

aineinkubaatio

aSyn: 1 % DNS, lampaan anti-aSyn, laimennos 1/500

GFP: 1 % GNS, kanin anti-GFP, laimennos 1/1000

TH: 1 % GNS, kanin anti-TH, laimennos 1/1000

Leikkeiden pesu aSyn-värjäys: 3 x 20 min,

GFP: 3 x 20 min

34

TH: 3 x 15 min PBS:ssa

Sekundaarinen vasta-

aineinkubaatio

aSyn: 1 % DNS, aasin anti lammas HRP-konjugoitu, laimennos 1/500

GFP: 1 % GNS, vuohen anti kani HRP-konjugoitu, laimennos 1/500

TH: 1 % GNS, vuohen anti kani biotiini-konjugoitu, laimennos 1/500

Leikkeiden pesu

aSyn: 3 x 20 min

GFP: 3 x 20 min PBS:ssa

TH: 3 x 15 min PBS:ssa

ABC-reaktio 2 tippaa liuoksia A ja B + 10 ml PBS, vain TH-värjäyksessä

Leikkeiden pesu 2 x 15 min PBS:ssa, vain TH-värjäyksessä

DAB-värireaktio 0,05 % DAB-liuos: 0,05 % DAB-kantaliuos + 0,3 % H2O2 PBS:ssa

Inkubointiajat: aSyn: 30-60 s, GFP: 4 min, TH: 20 s

Leikkeiden pesu

aSyn: 3 x 20 min, PBS

GFP: 3 x 20 min, PBS

TH: 3 x 15 min, PBS

Leikkeiden kuivaus 1 x 3 min H2O, 2 x 5 min 70 % EtOH, 2 x 5 min 95 % EtOH, 2 x 5

min 99 % EtOH, 1-2 x 5 min ksyleeni

2.6 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia eli HPLC

Molempien tutkimusten aivojuovionäytteistä tehtiin HPLC-mittausta varten

homogenaatit. Aivojuoviot punnittiin ja niihin lisättiin 500 μl homogenisointiliuosta (24

ml 0,2 M HClO4 + 4 ml antioksidanttiliuos, joka sisälsi 25,3 mg oksaalihappoa + 72,7

mg kysteiiniä + 1,15 ml jääetikkahappoa ad 200,0 ml H2O) ja näytteet homogenisoitiin

ultraäänihomogenisaattorilla (Rinco Ultrasonics AG, Sveitsi). Tämän jälkeen näytteet

sentrifugoitiin (14 000 rpm, 35 min, 4oC, Eppendorf Centrifuge), liukoinen osa eli

supernatantti siirrettiin suodattimellisiin näyteputkiin (Amicon Ultra – 0,5 ml 30 K,

Centrifugals Filters, Carrigtwohill, Irlanti) ja sentrifugoitiin uudelleen (9 000 rpm, 35

min, 4oC). Lopuksi siirrettiin 120 μl näytettä HPLC-näyteputkiin. Näytteet analysoitiin

CoulArray 5600A-kromatografilla ja tulosten käsittelyssä käytettiin CoulArray-

ohjelmaa (versio 1.02). Airavaara ryhmineen on kuvannut menetelmän ja laitteiston

aiemmin, mutta pumppu (Shimadzu SIL-20AC Prominence Autosampler, Shimadzu

Corporation, Japani) sekä kolonni (Phenomenex D4601-E0 c18-kolonni, jossa 5 μm

partikkelikoko, pituus 10 cm, Phenomenex Inc., USA) ovat vaihtuneet (Airavaara ym.

2006).

35

2.7 PREP-aktiivisuuden mittaus

Tutkimuksen II PREP-aktiivisuuden mittauksessa käytetty menetelmä on kuvattu

aiemmissa julkaisuissa (Toide ym. 1995; Venäläinen ym. 2002). Menetelmä perustuu

siihen, että PREP pilkkoo määrityksessä käytetyn substraattiliuoksen proliinin ja

AMC:n välisen sidoksen. Tällöin AMC vapautuu ja fluoresenssin voimakkuus korreloi

suoraan PREP:n aktiivisuuteen. Mittausta varten valmistettiin homogenaatit oikean

aivopuoliskon osista lukuun ottamatta aivojuoviota ja mustatumaketta. Aivoista

punnittiin pieni näyte ja niihin lisättiin 10-kertainen tilavuus inkubointipuskuria. Sen

jälkeen kudokset homogenisoitiin ultraäänihomogenisaattorilla ja sentrifugoitiin

Eppendorf Centrifuge-laitteella. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit otettiin talteen ja

pakastettiin -80oC.

Aiempien menetelmäkuvausten mukaisesti 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 ja 5 nmol AMC-

standardiliuokset valmistettiin suoraan kuoppalevylle. Näytekuoppiin pipetoitiin 75 μl

0,1M Na-K-fosfaattipuskuria eli inkubointipuskuria (500,0 ml 0,1 M Na2HPO4 · 2 H2O,

johon lisättiin 0,1 M KH2PO4, kunnes liuoksen pH oli 7,00) ja 10 μl näytettä, minkä

jälkeen inkuboitiin 30 minuuttia, +30 oC. Standardeja ja näytteitä pipetoitiin kahteen

rinnakkaiseen kuoppaan. Inkuboinnin jälkeen näytekuoppiin lisättiin 25 μl 4 mM

substraattiliuosta (Suc-Gly-Pro-AMC-liuos inkubointipuskurissa) ja inkuboitiin 60

minuuttia, +30 oC. Lopuksi näytekuoppiin pipetoitiin reaktion pysäyttämiseksi 100 μl 1

M Na-asetaattipuskuria (500,0 ml 1 M CH3COOH, johon lisättiin 1 M CH3COONa,

kunnes liuoksen pH oli 4,2) ja levy luettiin Victor2-laitteella (eksitaatio- ja

emissioaallonpituudet olivat 355 ja 460 nm).

PREP-aktiivisuuden suhteuttamiseksi proteiinimäärään mitattiin myös näytteiden

proteiinipitoisuus Bradfordin menetelmällä käyttäen Piercen BCA-

proteiinimäärityspakkausta (BCA Protein Assay Kit, Pierce, USA) (Bradford 1976).

Menetelmä perustuu indikaattoriliuokseen, jonka väri muuttuu proteiinipitoisuuden

mukaan. Sitä varten valmistettiin naudan seerumin albumiinista (BSA) standardiliuokset

(0.00 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.20 mg/ml, 0.28 mg/ml, 0.40 mg/ml, 0.48

mg/ml ja 0.60 mg/ml). Indikaattorina oli proteiininmääritysreagenssi (BCA), jossa oli

36

reagensseja A ja B suhteessa 50:1. Kudosnäytteistä tehtiin laimennokset 1:20

inkubointipuskuriin ja laimennoksista pipetoitiin 10 μl mikrotiitterilevylle. Standardi- ja

näyteliuoksista oli kaksi rinnakkaista näytettä. Lopuksi kuoppaan pipetoitiin 200 μl

indikaattoriliuosta, minkä jälkeen folioon käärittyä levyä inkuboitiin 30 minuuttia, +37

oC. Lopuksi kaikista kuopista mitattiin absorbanssi aallonpituudella 595 nm.

Tutkimuksessa käytetty KYP-2047 testattiin samaa menetelmää käyttäen heti

valmistuksen sekä yhden ja kahden viikon säilytyksen jälkeen (+37 oC). Näytekuoppiin

laitettiin 10 μl 20 μM KYP-2047-liuosta ja inkubointipuskurin määrää vähennettiin 10

μl, joten liuoksen loppuvahvuus oli 1 μM. Näytteenä käytettiin puhdasta PREP:a.

2.8 Tulosten käsittely ja tilastolliset testit

Graafiset esitykset tehtiin GraphPad Prism-ohjelmalla (versio 5). Yksittäisen hiiren

mittaustulos on hylätty, jos arvo poikkeaa selkeästi muista tuloksista (keskiarvo ± 2 x

keskihajonta). Lisäksi kesken tutkimuksen menehtyneet kaksi hiirtä on poistettu kaikista

mittauksista. Tilastollisissa testeissä käytetty ohjelma oli IBM SPSS Statistics (versio

20). Liikkumista mittaavista kokeista tehtiin toistettujen mittausten varianssianalyysi

(ANOVA), HPLC:n tuloksista kaksisuuntainen ANOVA ja PREP-inhibition tuloksista

yksisuuntainen ANOVA. Yksisuuntaisen ANOVA:n jatkotestinä oli Tukey HSD.

37

3 TULOKSET

3.1 Koesarja I

3.1.1 Immunohistokemialliset värjäykset

α-synukleiini värjäytyi immonuhistokemiallisesti tasaisesti kaikista leikkeistä, mutta

merkitsevää yli-ilmentymistä ei havaittu (Kuva 2). TH-värjäyksen voimakkuudessa ei

havaittu eroja ryhmien välillä (Kuva 3). GFP:n havaittiin värjäytyvän injektiokanavan

reunoilla, mutta ei kauempana aivojuoviossa (Kuva 4). Tutkimuksen I α-synukleiini- ja

TH-värjäysten optisten tiheyden tuloksille tehty yksisuuntainen varianssianalyysi ei

löytänyt tilastollisesti merkitseviä eroja (tulokset eivät näkyvillä).

Kuva 2. Koesarjan I aivojuovioiden α-synukleiinivärjäykset. A = Sham, B = A53T

aSyn, C = GFP, D = WT aSyn.

Kuva 3. Koesarjan I aivojuovioiden TH-värjäykset. GFP-ryhmästä ei värjätty TH:a,

vaan saliiniryhmä oli ainoa kontrolli. A = Sham, B = A53T aSyn, C = WT aSyn.

38

Kuva 4. Koesarjan I GFP-värjäykset. A53T ja WT aSyn-ryhmistä ei värjätty GFP:a. A =

Sham, B = GFP.

3.1.2 Liikeaktiivisuus

Liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan (Kuva 5, Kuva 6). Kuvista nähdään, että

tuloksissa oli vaihtelua ja selkeitä ryhmien välisiä muutoksia ei havaita.

Liikeaktiivisuusmittauksessa oli vain enintään 6 hiirtä/ryhmä. Yksittäisten mittausten

yksityiskohtaiset tulokset eivät ole näkyvillä.

0 4 80

100

200

300

400

500Sham

WT aSyn

GFP

A53T aSyn

Aika (vko)

Ku

ljett

u m

atk

a (

m)

Kuva 5. Tutkimuksen I liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa. Mittauksen

kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten kulkemien

kokonaismatkojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei

saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

39

0 4 80

500

1000

1500Sham

A53T aSyn

GFP

WT aSyn

Aika (vko)

Pysty

yn

no

usu

jen

luku

määrä

Kuva 6. Tutkimuksen I liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa. Mittauksen

kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten pystyynnousujen

kokonaismäärien keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei

saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

3.1.3 Pyörivä sauva

Pyörivän sauvan tuloksista nähdään, että ryhmien tulokset yleensä paranivat

mittauksesta toiseen (Kuva 7).

0 3 6 90

100

200

300Sham

GFP

A53T aSyn

WT aSyn

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 7. Pyörivän sauvan tulokset tutkimuksen I hiirille. Kuvassa näkyy

sauvallapysymisajan keskiarvo + SEM, n = 7-8. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei

saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

40

3.1.4 Tasapainorima

Tasapainoriman tuloksista ovat esillä ainoastaan rimojen ylitysajat (Kuva 8, Kuva 9).

Tassujen lipsumista ja rimalta tipahtamista ei ole kuvattu, koska mittauksissa oli

teknisiä ongelmia ja tulokset eivät olleet käyttökelpoisia. Tuloksissa oli suurta vaihtelua

varsinkin ohuempaa rimaa käytettäessä.

0 3 6 90

5

10

15

20Sham

GFP

A53T aSyn

WT aSyn

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 8. Tasapainoriman 12 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen I hiirille.

Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen

mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

0 3 6 90

10

20

30

40

50Sham

A53T aSyn

GFP

WT aSyn

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 9. Tasapainoriman 8 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen I hiirille.

Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen

mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

41

3.1.5 Monoamiinimääritykset

HPLC:llä mitattiin hiirten aivojuovioiden dopamiinin ja 5-HT:n sekä niiden

aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet (Kuva 10). Kuvasta nähdään, että DOPAC:n

määrissä on selkeät erot Sham- ja GFP-ryhmän sekä Sham- ja WT aSyn-ryhmän välillä,

mutta esimerkiksi dopamiinin määrissä nämä erot ovat suhteessa selvästi pienemmät.

DA DOPAC HVA 5-HT 5-HIAA0

1000

2000

3000

4000

500010000150002000025000

Sham

A53T aSyn

GFP

WT aSyn

*#

Mitattu analyytti

Pit

ois

uu

s (

ng

/g)

Kuva 10. DA, DOPAC, HVA, 5-HT ja 5-HIAA pitoisuudet aivojuoviossa tutkimuksen I

hiirillä. n = 7-8. Tuloksille tehtiin yksisuuntainen ANOVA. Tilastollisesti merkitsevät

erot ovat DOPAC:n määrässä (* p = 0.006 GFP vs. Sham, # p = 0.003 WT aSyn vs.

Sham).

3.2 Koesarja II

Immunohistokemiaan tarkoitettujen leikkeiden teossa ilmenneiden teknisten ongelmien

vuoksi näytteet eivät olleet edustavia, eikä värjäys onnistunut tyydyttävästi. Värjäyksen

tarkempaa analyysia ei voitu suorittaa eikä tuloksia esitetä tässä yhteydessä.

42

3.2.1 Liikeaktiivisuus

Liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan (Kuva 11 ja Kuva 12). Selkeitä ryhmien

välisiä eroja ei ole. Yksittäisten mittausten yksityiskohtaiset tulokset eivät ole näkyvillä.

0 2 40

500

1000

1500

Sham/KYP

Sham/veh

A53T/veh

A53T/KYP

Aika (vko)

Mit

att

u m

atk

a (

m)

Kuva 11. Tutkimuksen II liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa.

Mittauksen kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten kulkemien

kokonaismatkojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei

saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

0 2 40

500

1000

1500

2000

Sham/KYP

A53T/veh

Sham/veh

A53T/KYP

Aika (vko)

Pysty

yn

nn

ou

su

jen

luku

määrä

Kuva 12. Tutkimuksen II liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa.

Mittauksen kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten

pystyynnousujen kokonaismäärien keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten

ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

43

3.2.2 Pyörivä sauva

Pyörivän sauvan tuloksissa oli vaihtelua mittausten välillä eikä niissä havaittu

samanlaista kehitystä kuin koesarjassa I (Kuva 13).

0 2 40

100

200

300

Sham/KYP

Sham/veh

A53T aSyn/KYP

A53T aSyn/veh

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 13. Pyörivän sauvan tulokset tutkimuksen II hiirille. Kuvassa näkyy

sauvallapysymisajan keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei

saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

3.2.3 Tasapainorima

Tasapainoriman tuloksista ovat esillä ainoastaan rimojen ylitysajat (Kuva 14 ja Kuva

15). Tassujen lipsumista ja rimalta tipahtamista ei ole kuvattu, koska mittauksissa oli

teknisiä ongelmia ja tulokset eivät olleet käyttökelpoisia.

44

.

0 2 40

5

10

15

20

Sham/KYP

Sham/veh

A53T/KYP

A53T/veh

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 14. Tasapainoriman 12 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen II hiirille.

Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen

mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

0 2 40

20

40

60

Sham/KYP

Sham/veh

A53T/KYP

A53T/veh

Aika (vko)

Aik

a (

s)

Kuva 15. Tasapainoriman 8 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen II hiirille.

Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen

mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.

3.2.4 Monoamiinimääritykset

HPLC:llä mitattiin hiirten aivojuovioiden dopamiinin ja 5-HT:n sekä niiden

aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet (Kuva 16).

45

DA DOPAC HVA 5-HT 5-HIAA0

1000

2000

3000

4000

10000

20000

30000

Sham/KYP

Sham/veh

A53T/KYP

A53T/veh

p = 0.02

p = 0.03

p = 0.03

p = 0.04

Mitattu analyytti

Pit

ois

uu

s (

ng

/g)

Kuva 16. DA-, DOPAC-, HVA-, 5-HT- ja 5-HIAA-pitoisuudet aivojuoviossa

tutkimuksen II hiirillä. n = 5-6. Tuloksille tehtiin kaksisuuntainen ANOVA.

Virusinjektion saaneissa ryhmissä analyyttien (paitsi 5-HT:n) pitoisuudet olivat

tilastollisesti merkitsevästi korkeampia sham-injektion saaneisiin ryhmiin verrattuna (p-

arvot näkyvillä kuvaajassa).

3.2.5 PREP-eston voimakkuus

Tutkimuksen II lopuksi hiirten aivonäytteistä mitattiin PREP-estäjä KYP-2047:n

aiheuttaman PREP-eston voimakkuus (Kuva 17). Ainoastaan ryhmässä A53T/KYP

näkyy heikko (ei tilastollisesti merkitsevä) esto, koska tämän ryhmän kahdella hiirellä

PREP-aktiivisuus oli hieman laskenut. Lopuksi testattiin myös käytetyn KYP-2047:n

toimivuus. Se vaimensi PREP-aktiivisuuden täysin heti valmistuksen jälkeen sekä

säilytti tehonsa myös yhden ja kahden viikon säilytyksen jälkeen (+37 oC, tulokset ei

näkyvillä).

46

0

50

100

150Sham/veh

A53T/KYP

A53T/veh

Sham/KYP

Ryhmä%:a

Sh

am

/ve

h-k

on

tro

llir

yhm

ästä

(%

)

Kuva 17. KYP-2047:n aiheuttama PREP-aktiivisuuden muutos tutkimuksen II hiirillä.

Kuvassa on hiirten keskimääräinen PREP-aktiivisuus + SEM prosentteina verrattuna

Sham/veh-kontrolliryhmään (jonka keskiarvo = 3,1 nmol AMC), n = 5-6. Tuloksille

tehtiin yksisuuntainen ANOVA, jonka jatkotestinä oli Tukey HSD.

4 TULOSTEN TARKASTELU JA POHDINTA

Tutkimuksessa I immunohistokemiallisesti värjäämällä ei havaittu villityypin α-

synukleiinin tai A53T-α-synukleiinin vektorin aiheuttaneen α-synukleiinin yli-

ilmentymistä hiirten aivojuovioissa. Yhdelle ryhmälle annosteltiin GFP:n geeniä

virusvektorilla, jotta virusvektoreiden toimivuutta voitiin arvioida. Värjäämällä GFP

havaittiin, että GFP:a ilmeni ainoastaan injektiokanavan reunoilla. Myöskään

fluoresenssimikroskoopilla ei havaittu GFP:a laajemmalla alueella. Virusvektorit eivät

siis siirtäneet GFP:n geeniä laajasti. α-synukleiinin ei havaittu lisääntyneen edes

injektiokanavassa, mutta tämä voi johtua siitä, että aivoissa on luonnollisesti paljon α-

synukleiinia, joten geeninsiirtymisen olisi pitänyt olla paljon voimakkaampaa, jotta se

olisi voitu värjäämällä havaita. α-synukleiinivärjättyjä leikkeitä tarkasteltiin myös

valomikroskoopin voimakkaasti suurentavilla objektiiveilla pienien erojen

havaitsemiseksi, mutta niitä ei ollut. Koska GFP ilmentyi heikosti, sen perusteella oli

odotettavissa, että α-synukleiinin yli-ilmentymisestä ei ollut merkkejä ja optisen

tiheyden mittauksessa ei voitu löytää eroja ryhmien välille. Toisaalta α-synukleiinin on

havaittu siirtyvän tehokkaasti endosytoosin avulla solujen välillä, joten vaikka

47

geeninsiirto olisi vain paikallinen, niin α-synukleiinin määrä olisi voinut kasvaa

laajemmalla alueella (Desplats ym. 2009; Kordower ym. 2011). GFP ei siirry yhtä

tehokkaasti kuin α-synukleiini, joten GFP:n perusteella ei pysty suoraan päättelemään

α-synukleiinin ilmentymistä. Optisen tiheyden muutoksien havaitsemiksi vaaditaan

varsin suuria eroja proteiinin määrissä, joten tuloksen tarkistamisessa olisi ollut hyvä

käyttää Western Blotting -menetelmää, tähän ei kuitenkaan ollut aikaa

erikoistyöprojektin keston puitteissa. Myöskään tutkimuksessa II A53T-α-synukleiini ei

aiheuttanut α-synukleiinin yli-ilmentymistä hiirten mustatumakkeeseen. Suolaliuos oli

ainoa kontrolli, joten toisin kuin tutkimuksessa I, GFP:a ei voitu värjätä

virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn havaitsemiseksi. Immunohistokemialliset värjäykset

tehtiin kirjallisuudesta löytyvien yleisesti käytettyjen menetelmien mukaisesti

(Mijatovic ym. 2007; Myöhänen ym. 2008). Lisäksi menetelmien onnistumisen

varmistamiseksi värjättiin aivoleikkeitä, joissa tiedettiin α-synukleiinin yli-ilmentyneen.

Erikoistyössä virusvektorit injisoitiin molemmille aivopuoliskoille, koska pyrittiin

luomaan eläinmalli, jota on helppo verrata esimerkiksi siirtogeenisiin eläinmalleihin.

Tulevaisuudessa kannattaa harkita toispuolisten injektioiden käyttöä, koska tällöin

virusvektoreiden toimivuutta on helpompi arvioida toisen aivopuoliskon toimiessa

kontrollina.

α-synukleiinin odotettiin yli-ilmentyvän, koska AAV-vektoreiden α-synukleiinigeenin

siirtokyky on osoitettu hyväksi ja nopeaksi (Kirik ym. 2002; Koprich ym. 2010;

Decressac ym. 2012a). Decressacin vuonna 2012 julkaistussa tutkimuksessa rotille

mustatumakkeen yläpuolelle injisoitu α-synukleiinigeeni ilmentyi voimakkaasti

nigrostriataaliradalla jo 3 viikkoa AAV6-injektion jälkeen (Decressac ym. 2012a).

Kahdeksan viikkoa injektion jälkeen rotat suoriutuivat merkitsevästi heikommin

liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa. Tutkimuksessa α-synukleiinimalli ilmensi 6-

OHDA:aan verrattuna paremmin Parkinsonin taudin syitä. Tutkimusryhmän mukaan

virusvektorit aiheuttavat asteittain etenevän solutuhon ja hitaammin kehittyvät

käytösmuutokset verrattuna hermomyrkkyjen aiheuttamiin äkillisiin muutoksiin. Suurin

osa tutkimuksista on tehty rotilla kenties siitä syystä, että hiirillä on havaittu olevan

paljon neutraloivia vasta-aineita AAV-vektoreita kohtaan toisin kuin rotilla (Rapti ym.

2012). Hiirilläkin AAV-vektorit ovat kuitenkin toimineet, joskaan eivät yhtä

48

voimakkaasti ja nopeasti kuin rotilla (St Martin ym. 2007). St Martinin tutkimuksessa

AAV2-vektoreissa mustatumakkeeseen siirretty α-synukleiinigeeni yli-ilmentyi 4, 12 ja

24 viikkoa injektion jälkeen. Dopaminergisten hermosolujen määrä oli ennallaan 4

viikon kuluttua injektiosta, 12 viikon jälkeen oli havaittavissa hyvin lievää määrän

alentumista ja 24 viikon jälkeen solumäärä oli vähentynyt 25 %. Rotilla

dopaminergisten hermosolujen on havaittu vähentyneen 30-80% jo 8 viikkoa injektion

jälkeen (Kirik ym. 2002).

AAV-vektoreista on useita eri serotyyppejä, jonka merkitys saattaa olla suuri

geeninsiirtokyvyn kannalta. Virukset voidaan jakaa pintarakenteessa olevien

antigeenien perusteella eri serotyyppeihin. Yleisimmin käytetyt serotyypit ovat AAV2

ja AAV6 tai kahdesta serotyypistä koostuvat vektorit, kuten esimerkiksi AAV1/2

(Koprich ym. 2010; Decressac ym. 2012a). Ulusoyn vuonna 2012 julkaistussa

tutkimuksessa käytettiin serotyyppejä AAV2, AAV5 ja AAV6, joilla kaikilla saatiin

aikaan α-synukleiinin yli-ilmentyminen hiiren nigrostriataaliradalla (Ulusoy ym. 2012).

Kaikissa edellä mainituissa tutkimuksissa virusvektoreihin on lisätty geenin

ilmentymisen promoottoreita tai transkription jälkeisiä säätelyelementtejä, jotka lisäävät

siirtogeenin ilmentymisen määrää ja kestoa. Esimerkiksi transkription jälkeinen WPRE-

säätelyosa on yleinen ja se vaikuttaisi tärkeältä kunnollisen geenin ilmentymisen

aikaansaamiseksi. Tässä erikoistyössä käytettiin siis AAV-vektorin serotyyppiä 1 eli

AAV1 ilman säätelyelementtejä, joiden puute siis saattoi olla ratkaisevaa

virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn kannalta. Lisäksi hiirten seerumissa on todettu

olevan neutraloivia vasta-aineita juuri tässä erikoistyössä käytettyä AAV1-vektoria

kohtaan (Rapti ym. 2012). Sellaisia tutkimuksia, joissa olisi käytetty tätä samaa

virusvektoria α-synukleiinin yli-ilmentämiseen hiirissä, ei löytynyt. AAV1-vektoria

kuitenkin on käytetty hiirillä geeninsiirrossa sydämeen ja lihaksiin ja sen on havaittu

olevan tehokas molemmissa tapauksissa (Xiao ym. 1999; Su ym. 2006). AAV-

vektoreiden toimivuus hiirissä riippuu todennäköisesti siis vektorin serotyypistä, onko

virusvektoriin lisätty sopivat säätelyosat ja onko hiirikannalla neutraloivia vasta-aineita

käytettävää virusvektoria vastaan.

49

Kaikissa liikeaktiivisuutta ja liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa tuloksissa oli suurta

hajontaa ja vaikka yksittäisissä mittauksissa ryhmien välillä oli eroja, niin selviä

muutoksia ei voida havaita, koska tulokset vaihtelivat paljon mittausten välillä. Syitä

suurille variansseille ja yhdenmukaisten muutosten puutteelle voivat olla muun muassa

liikkumista mittaavissa menetelmissä havaitut ongelmat, virusvektoreiden heikoksi

havaittu geeninsiirtokyky ja tutkimuksessa II minipumppujen asennusleikkauksen

vaikutukset hiirten terveydentilaan. Käytetty hiirikanta osoittautui myös liikkumista

mittaavien kokeiden kannalta ongelmalliseksi. Hiiret olivat aggressiivisia toisia kohtaan

ja tappelut aiheuttivat useille hiirille hännänkatkeamisia ja haavoja, millä saattoi olla

vaikutusta liikkumista mittaavien kokeiden tuloksiin.

Liikeaktiivisuuden mittauksessa käytetty laitteisto oli vanha ja toimi epäluotettavasti.

Muutamia tuloksia jouduttiin hylkäämään, koska merkittävästi muista poikkeaville

mittaustulokselle syynä oli todennäköisesti laitteistovika. Kumulatiivisten arvojen

lisäksi mittauksissa laskettiin hiirten kulkeman matkan ja pystyynnousujen määrä 15

minuutin jaksoissa. Näistä ei ole tuloksia näkyvillä, mutta kaikki mittaukset noudattivat

samaa tapahtumasarjaa. Alussa hiiret olivat aktiivisia tutustuessaan uuteen ympäristöön,

jonka jälkeen seurasi vaihe, jolloin hiiret pysyttelivät enimmäkseen paikoillaan. Kun

mittaushuoneen valot sammuivat, hiiret jälleen aktivoituivat. Pyörivällä sauvalla hiiret

pystyivät kääntymään väärinpäin, mistä seurasi suurin osa putoamisista hiiren yrittäessä

juosta taaksepäin. Hiiriä olisi kannattanut totuttaa ennen ensimmäistä mittausta

laitteeseen, sillä tutkimuksen I tuloksissa on havaittavissa oppimista. Tutkimuksessa II

hiirten tulokset eivät parantuneet perustasoon verrattuna, mutta tämä johtunee

minipumppujen aiheuttamasta suorituskyvyn laskusta.

Tasapainorimatestissä kaikkia hiiriä opetettiin yhtä paljon testimenetelmään, mutta osa

hiiristä ei siltikään halunnut liikkua rimalla. Puiselta pyöreältä rimalta hiiret eivät putoa

helposti, vaan ne jäävät roikkumaan siihen. Lisäksi tutkija vaikuttaa hiirten

lähtöasentoon, koska hiiri piti asettaa mittauksen alussa aina riman toisen päähän.

Tutkimuksessa I paksumman 12 mm riman kaikkien ryhmien tulokset ovat samaa tasoa

mittauksesta toiseen lukuun ottamatta perustasomittauksen kahden ryhmän tuloksia.

Näiden ryhmien hiiret olivat saaneet vammoja tappeluissa, mikä näytti vaikuttavan

50

ensimmäisiin tuloksiin. Kahdeksan mm rimaa käytettäessä tulokset vaihtelevat paljon ja

selvää oppimistakaan ei ole havaittavissa. Eniten näihin tuloksin vaikutti se, kuinka

hyvän lähtöasennon hiiri sai. Tasapainon menetys alussa johti yleensä siihen, että hiiren

tassut lipsahtivat rimalta ja hiiri ryömi riman yli. Tästä seurasi myös se, että hiirten

takatassujen lipsumisia ei voitu laskea. Myöskään hiirten putoamisten määrää ei voinut

järkevästi verrata, koska ryömivä hiiri ei tipahda rimalta, kun taas nopeammin juokseva

hiiri saattaa lipsahtaa rimalta maahan. Menetelmää tulisi kehittää siten, että hiiri on

aluksi tasaisella alustalla, josta se pitäisi saada itse siirtymään rimalle.

PREP-eston määrityksissä havaittiin, että vain kahdella hiirellä KYP-2047 oli

aiheuttanut PREP-aktiivisuuden laskua. KYP-2047 on kuitenkin todettu aiemmin hyvin

tehokkaaksi PREP-estäjäksi ja lisäksi myös tutkimuksessa käytetty KYP-2047-erä

testattiin tutkimuksen lopuksi ja se oli toimivaa (Jalkanen ym. 2011). Ilmeinen syy

PREP-eston puuttumiselle on minipumppujen asennuksen epäonnistuminen useilla

hiirillä, koska käytetty syanoakrylaattiliima kiinnittyi huonosti kalloon, jos se oli

vähänkin kostea. Näin ollen minipumppu saattoi jäädä koholle tai väärään asentoon ja

pumppu siis annosteli KYP-2047:n tai suolaliuoksen muualle kuin aivokammioihin. On

myös mahdollista, että liima tukki infuusiokanyylin. Minipumput asennettiin viikko

virusvektoreiden injektoinnin jälkeen, joten edellinen leikkaushaava ei ollut vielä täysin

parantunut ja minipumppuleikkauksen haavaa on vaikea tikata uudelleen kiinni. Lisäksi

minipumpun asentamisen jälkeen useat hiiret vaikuttivat muutaman päivän ajan

heikkokuntoisilta, mikä näkyi vielä seuraavissa liikkumista mittaavissa kokeissa.

Koesarjojen välillä havaitut erot monoamiinien pitoisuuksissa voivat johtua

injektiopaikan erosta. Hiiren aivojuoviossa mekaaninen vaurio saattaa saada aikaan

TH:n lisääntymisen, ja sitä kautta dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden

pitoisuuksien kohoamisen (Howells ym. 1996). Tutkimuksen I TH:n määrissä ei

havaittu värjäysten perusteella eroja, mutta menetelmä ei ole herkkä pienten erojen

havaitsemiseksi. Lisäksi tutkimuksessa I DOPAC:n määrä väheni, joten ylimääräinen

dopamiini on ehkä varastoitunut eikä siitä muodostunut DOPAC:a. Yleensä α-

synukleiinin yli-ilmentyminen laskee aivojen dopamiinipitoisuuksia, mutta Parkinsonin

51

taudin varhaisessa vaiheessa dopamiinipitoisuudet voivat olla kuitenkin koholla ja sama

ilmiö on havaittu myös siirtogeenisessä eläinmallissa (Kurz ym. 2010).

5 YHTEENVETO

Erikoistyössä tutkittiin AAV-vektorin käyttöä α-synukleiiniin yli-ilmentämiseen hiiren

nigrostriataaliradalla ja yli-ilmentymisen aiheuttamia muutoksia hiirten liikkumisessa ja

dopamiinihermosoluissa. Yli-ilmentymisen seurauksia ei päästy tutkimaan, koska

siirtogeeni ilmentyi huonosti. Ainakin virusvektorin serotyyppi, virusvektorissa olevat

geenin ilmentymisen säätelyosat ja käytetty eläinkanta vaikuttavat siihen, ilmeneekö

siirtogeeni riittävän hyvin. Erikoistyön tulosten perusteella AAV1-vektorin käyttö ilman

WPRE-säätelyosaa ei aiheuta riittävää α-synukleiinin yli-ilmentymistä hiirissä.

Parhaiten AAV-vektoreista ovat toimineet serotyypit 2 ja 6, joita tulevaisuudessa

kannattanee käyttää. Lisäksi α-synukleiinin aiheuttamat hermostomuutokset ja oireet

ovat olleet voimakkaampia rotissa kuin hiirissä, mikä voi johtua erityisesti hiirissä

olevista neutraloivista vasta-aineista.

52

6 KIRJALLISUUSLUETTELO

Abeliovich A, Schmitz Y, Fariñas I, Choi-Lundberg D, Ho WH, Castillo PE, Shinsky

N, Verdugo JM, Armanini M, Ryan A, Hynes M, Phillips H, Sulzer D, Rosenthal A:

Mice lacking alpha-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine

system. Neuron 25: 239-252, 2000

Airavaara M, Mijatovic J, Vihavainen T, Piepponen TP, Saarma M, Ahtee L: In

heterozygous GDNF knockout mice the response of striatal dopaminergic system to

acute morphine is altered. Synapse 59: 321-329, 2006

Beal MF: Parkinson's disease: a model dilemma. Nature 466: S8-10, 2010

Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:

248-254, 1976

Brandt I, Gérard M, Sergeant K, Devreese B, Baekelandt V, Augustyns K, Scharpé S,

Engelborghs Y, Lambeir AM: Prolyl oligopeptidase stimulates the aggregation of alpha-

synuclein. Peptides 29: 1472-1478, 2008

Brooks SP, Dunnett SB: Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat

Rev Neurosci 10: 519-529, 2009

Cao S, Theodore S, Standaert DG: Fcgamma receptors are required for NF-kappaB

signaling, microglial activation and dopaminergic neurodegeneration in an AAV-

synuclein mouse model of Parkinson's disease. Mol Neurodegener 5: 42, 2010

Chartier-Harlin MC, Kachergus J, Roumier C, Mouroux V, Douay X, Lincoln S,

Levecque C, Larvor L, Andrieux J, Hulihan M, Waucquier N, Defebvre L, Amouyel P,

Farrer M, Destée A: Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial

Parkinson's disease. Lancet 364: 1167-1169, 2004

Chen X, de Silva HA, Pettenati MJ, Rao PN, St George-Hyslop P, Roses AD, Xia Y,

Horsburgh K, Uéda K, Saitoh T: The human NACP/alpha-synuclein gene: chromosome

assignment to 4q21.3-q22 and TaqI RFLP analysis. Genomics 26: 425-427, 1995

Chesselet MF: In vivo alpha-synuclein overexpression in rodents: a useful model of

Parkinson's disease? Exp Neurol 209: 22-27, 2008

Chesselet MF, Richter F: Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol 10:

1108-1118, 2011

53

Clark J, Clore EL, Zheng K, Adame A, Masliah E, Simon DK: Oral N-acetyl-cysteine

attenuates loss of dopaminergic terminals in alpha-synuclein overexpressing mice.

PLoS One 5: e12333, 2010

Conway KA, Harper JD, Lansbury PT: Accelerated in vitro fibril formation by a mutant

alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease. Nat Med 4: 1318-1320, 1998

Crabtree DM, Zhang J: Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease.

Brain Res Bull 88: 13-32, 2012

Cunningham DF, O'Connor B: Proline specific peptidases. Biochim Biophys Acta 1343:

160-186, 1997

de Lau LM, Breteler MM: Epidemiology of Parkinson's disease. Lancet Neurol 5: 525-

535, 2006

Decressac M, Mattsson B, Björklund A: Comparison of the behavioural and histological

characteristics of the 6-OHDA and alpha-synuclein rat models of Parkinson's disease.

Exp Neurol 235: 306-315, 2012a

Decressac M, Kadkhodaei B, Mattsson B, Laguna A, Perlmann T, Björklund A: alpha-

Synuclein-Induced Down-Regulation of Nurr1 Disrupts GDNF Signaling in Nigral

Dopamine Neurons. Sci Transl Med 4: 163ra156, 2012b

Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spencer B, Masliah E,

Lee SJ: Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron

transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci USA 106: 13010-13015, 2009

Fleming SM, Tetreault NA, Mulligan CK, Hutson CB, Masliah E, Chesselet MF:

Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. Eur J

Neurosci 28: 247-256, 2008

Fleming SM, Salcedo J, Fernagut PO, Rockenstein E, Masliah E, Levine MS, Chesselet

MF: Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type

human alpha-synuclein. J Neurosci 24: 9434-9440, 2004

Fleming SM, Mulligan CK, Richter F, Mortazavi F, Lemesre V, Frias C, Zhu C, Stewart

A, Gozes I, Morimoto B, Chesselet MF: A pilot trial of the microtubule-interacting

peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor

function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol Cell Neurosci 46: 597-606,

2011

Franklin KBJ, Paxinos G: The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic

Press, San Diego 1997

54

Freichel C, Neumann M, Ballard T, Müller V, Woolley M, Ozmen L, Borroni E,

Kretzschmar HA, Haass C, Spooren W, Kahle PJ: Age-dependent cognitive decline and

amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging 28: 1421-

1435, 2007

Fujiwara H, Hasegawa M, Dohmae N, Kawashima A, Masliah E, Goldberg MS, Shen J,

Takio K, Iwatsubo T: alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.

Nat Cell Biol 4: 160-164, 2002

Giasson BI, Duda JE, Quinn SM, Zhang B, Trojanowski JQ, Lee VM: Neuronal alpha-

synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human

alpha-synuclein. Neuron 34: 521-533, 2002

Gispert S, Del Turco D, Garrett L, Chen A, Bernard DJ, Hamm-Clement J, Korf HW,

Deller T, Braak H, Auburger G, Nussbaum RL: Transgenic mice expressing mutant

A53T human alpha-synuclein show neuronal dysfunction in the absence of aggregate

formation. Mol Cell Neurosci 24: 419-429, 2003

Gomez-Isla T, Irizarry MC, Mariash A, Cheung B, Soto O, Schrump S, Sondel J,

Kotilinek L, Day J, Schwarzschild MA, Cha JH, Newell K, Miller DW, Uéda K, Young

AB, Hyman BT, Ashe KH: Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic

markers in human alpha-synuclein A30P transgenic mice. Neurobiol Aging 24: 245-

258, 2003

Howells DW, Liberatore GT, Wong JY, Donnan GA: Dopaminergic responses to

striatal damage. J Neurol Sci 139: 125-130, 1996

Iwai A, Masliah E, Yoshimoto M, Ge N, Flanagan L, de Silva HA, Kittel A, Saitoh T:

The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a

presynaptic protein of the central nervous system. Neuron 14: 467-475, 1995

Jakes R, Spillantini MG, Goedert M: Identification of two distinct synucleins from

human brain. FEBS Lett 345: 27-32, 1994

Jalkanen AJ, Hakkarainen JJ, Lehtonen M, Venäläinen T, Kääriäinen TM, Jarho E,

Suhonen M, Forsberg MM: Brain pharmacokinetics of two prolyl oligopeptidase

inhibitors, JTP-4819 and KYP-2047, in the rat. Basic Clin Pharmacol Toxicol 109: 443-

451, 2011

Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Müller V, Odoy S, Okamoto N, Jacobsen H,

Iwatsubo T, Trojanowski JQ, Takahashi H, Wakabayashi K, Bogdanovic N, Riederer P,

Kretzschmar HA, Haass C: Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy

body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol 159: 2215-

2225, 2001

55

Kirik D, Rosenblad C, Burger C, Lundberg C, Johansen TE, Muzyczka N, Mandel RJ,

Björklund A: Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of

alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci 22: 2780-2791, 2002

Koob AO, Ubhi K, Paulsson JF, Kelly J, Rockenstein E, Mante M, Adame A, Masliah

E: Lovastatin ameliorates alpha-synuclein accumulation and oxidation in transgenic

mouse models of alpha-synucleinopathies. Exp Neurol 221: 267-274, 2010

Koprich JB, Johnston TH, Reyes MG, Sun X, Brotchie JM: Expression of human A53T

alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a

rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and

nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.

Mol Neurodegener 5: 43, 2010

Kordower JH, Dodiya HB, Kordower AM, Terpstra B, Paumier K, Madhavan L,

Sortwell C, Steece-Collier K, Collier TJ: Transfer of host-derived alpha synuclein to

grafted dopaminergic neurons in rat. Neurobiol Dis 43: 552-557, 2011

Korecka J, Schouten M, Eggers R, Ulusoy A, Bossers K, Verhaagen J: Comparison of

AAV Serotypes for Gene Delivery to Dopaminergic Neurons in the Substantia Nigra.

Viral Gene Therapy 205-224, 2001

Krüger R, Kuhn W, Müller T, Woitalla D, Graeber M, Kösel S, Przuntek H, Epplen JT,

Schöls L, Riess O: Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in

Parkinson's disease. Nat Genet 18: 106-108, 1998

Kuo YM, Li Z, Jiao Y, Gaborit N, Pani AK, Orrison BM, Bruneau BG, Giasson BI,

Smeyne RJ, Gershon MD, Nussbaum RL: Extensive enteric nervous system

abnormalities in mice transgenic for artificial chromosomes containing Parkinson

disease-associated alpha-synuclein gene mutations precede central nervous system

changes. Hum Mol Genet 19: 1633-1650, 2010

Kurz A, Double KL, Lastres-Becker I, Tozzi A, Tantucci M, Bockhart V, Bonin M,

García-Arencibia M, Nuber S, Schlaudraff F, Liss B, Fernández-Ruiz J, Gerlach M,

Wüllner U, Lüddens H, Calabresi P, Auburger G, Gispert S: A53T-alpha-synuclein

overexpression impairs dopamine signaling and striatal synaptic plasticity in old mice.

PLoS One 5: e11464, 2010

Lam HA, Wu N, Cely I, Kelly RL, Hean S, Richter F, Magen I, Cepeda C, Ackerson

LC, Walwyn W, Masliah E, Chesselet MF, Levine MS, Maidment NT: Elevated tonic

extracellular dopamine concentration and altered dopamine modulation of synaptic

activity precede dopamine loss in the striatum of mice overexpressing human alpha-

synuclein. J Neurosci Res 89: 1091-1102, 2011

Lee MK, Stirling W, Xu Y, Xu X, Qui D, Mandir AS, Dawson TM, Copeland NG,

Jenkins NA, Price DL: Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-

56

linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein

aggregation in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8968-8973, 2002

Lim Y, Kehm VM, Li C, Trojanowski JQ, Lee VM: Forebrain overexpression of alpha-

synuclein leads to early postnatal hippocampal neuron loss and synaptic disruption. Exp

Neurol 221: 86-97, 2010

Lim Y, Kehm VM, Lee EB, Soper JH, Li C, Trojanowski JQ, Lee VM: alpha-Syn

suppression reverses synaptic and memory defects in a mouse model of dementia with

Lewy bodies. J Neurosci 31: 10076-10087, 2011

Lin X, Parisiadou L, Sgobio C, Liu G, Yu J, Sun L, Shim H, Gu XL, Luo J, Long CX,

Ding J, Mateo Y, Sullivan PH, Wu LG, Goldstein DS, Lovinger D, Cai H: Conditional

expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain

dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of

transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci 32: 9248-9264, 2012

Martin LJ, Pan Y, Price AC, Sterling W, Copeland NG, Jenkins NA, Price DL, Lee

MK: Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal

mitochondrial degeneration and cell death. J Neurosci 26: 41-50, 2006

Masliah E, Rockenstein E, Veinbergs I, Mallory M, Hashimoto M, Takeda A, Sagara Y,

Sisk A, Mucke L: Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein

mice: implications for neurodegenerative disorders. Science 287: 1265-1269, 2000

Masliah E, Rockenstein E, Mante M, Crews L, Spencer B, Adame A, Patrick C, Trejo

M, Ubhi K, Rohn TT, Mueller-Steiner S, Seubert P, Barbour R, McConlogue L, Buttini

M, Games D, Schenk D: Passive immunization reduces behavioral and

neuropathological deficits in an alpha-synuclein transgenic model of Lewy body

disease. PLoS One 6: e19338, 2011

Mijatovic J, Airavaara M, Planken A, Auvinen P, Raasmaja A, Piepponen TP,

Costantini F, Ahtee L, Saarma M: Constitutive Ret activity in knock-in multiple

endocrine neoplasia type B mice induces profound elevation of brain dopamine

concentration via enhanced synthesis and increases the number of TH-positive cells in

the substantia nigra. J Neurosci 27: 4799-4809, 2007

Myöhänen TT, Venäläinen JI, Garcia-Horsman JA, Piltonen M, Männistö PT: Cellular

and subcellular distribution of rat brain prolyl oligopeptidase and its association with

specific neuronal neurotransmitters. J Comp Neurol 507: 1694-1708, 2008

Myöhänen TT, Hannula MJ, Van Elzen R, Gerard M, Van Der Veken P, Garcia-

Horsman JA, Baekelandt V, Männistö PT, Lambeir AM: A prolyl oligopeptidase

inhibitor, KYP-2047, reduces alpha-synuclein protein levels and aggregates in cellular

and animal models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol 166: 1097-1113, 2012

57

Narhi L, Wood SJ, Steavenson S, Jiang Y, Wu GM, Anafi D, Kaufman SA, Martin F,

Sitney K, Denis P, Louis JC, Wypych J, Biere AL, Citron M: Both familial Parkinson's

disease mutations accelerate alpha-synuclein aggregation. J Biol Chem 274: 9843-9846,

1999

Neumann M, Kahle PJ, Giasson BI, Ozmen L, Borroni E, Spooren W, Müller V, Odoy

S, Fujiwara H, Hasegawa M, Iwatsubo T, Trojanowski JQ, Kretzschmar HA, Haass C:

Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged

transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. J

Clin Invest 110: 1429-1439, 2002

Nuber S, Petrasch-Parwez E, Winner B, Winkler J, von Hörsten S, Schmidt T, Boy J,

Kuhn M, Nguyen HP, Teismann P, Schulz JB, Neumann M, Pichler BJ, Reischl G,

Holzmann C, Schmitt I, Bornemann A, Kuhn W, Zimmermann F, Servadio A, Riess O:

Neurodegeneration and motor dysfunction in a conditional model of Parkinson's

disease. J Neurosci 28: 2471-2484, 2008

Olanow CW, Stern MB, Sethi K: The scientific and clinical basis for the treatment of

Parkinson disease (2009). Neurology 72: S1-136, 2009

Ono K, Ikemoto M, Kawarabayashi T, Ikeda M, Nishinakagawa T, Hosokawa M, Shoji

M, Takahashi M, Nakashima M: A chemical chaperone, sodium 4-phenylbutyric acid,

attenuates the pathogenic potency in human alpha-synuclein A30P + A53T transgenic

mice. Parkinsonism Relat Disord 15: 649-654, 2009

Piltonen M, Savolainen M, Patrikainen S, Baekelandt V, Myöhänen TT, Männistö PT:

Comparison of motor performance, brain biochemistry and histology of two A30P

alpha-synuclein transgenic mouse strains. Neuroscience 231: 157-168, 2013

Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H,

Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A,

Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI,

Nussbaum RL: Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with

Parkinson's disease. Science 276: 2045-2047, 1997

Rapti K, Louis-Jeune V, Kohlbrenner E, Ishikawa K, Ladage D, Zolotukhin S, Hajjar

RJ, Weber T: Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of

commonly used animal models. Mol Ther 20: 73-83, 2012

Richfield EK, Thiruchelvam MJ, Cory-Slechta DA, Wuertzer C, Gainetdinov RR,

Caron MG, Di Monte DA, Federoff HJ: Behavioral and neurochemical effects of wild-

type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp Neurol 175: 35-48,

2002

Rockenstein E, Mallory M, Hashimoto M, Song D, Shults CW, Lang I, Masliah E:

Differential neuropathological alterations in transgenic mice expressing alpha-synuclein

58

from the platelet-derived growth factor and Thy-1 promoters. J Neurosci Res 68: 568-

578, 2002

Rockenstein E, Schwach G, Ingolic E, Adame A, Crews L, Mante M, Pfragner R,

Schreiner E, Windisch M, Masliah E: Lysosomal pathology associated with alpha-

synuclein accumulation in transgenic models using an eGFP fusion protein. J Neurosci

Res 80: 247-259, 2005

Schneider L, Zhang J: Lysosomal function in macromolecular homeostasis and

bioenergetics in Parkinson's disease. Mol Neurodegener 5: 14-1326-5-14, 2010

Shelkovnikova TA, Ustyugov AA, Millership S, Peters O, Anichtchik O, Spillantini

MG, Buchman VL, Bachurin SO, Ninkina NN: Dimebon does not ameliorate

pathological changes caused by expression of truncated (1-120) human alpha-synuclein

in dopaminergic neurons of transgenic mice. Neurodegener Dis 8: 430-437, 2011

Shulman JM, De Jager PL, Feany MB: Parkinson's disease: genetics and pathogenesis.

Annu Rev Pathol 6: 193-222, 2011

Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J, Hulihan M,

Peuralinna T, Dutra A, Nussbaum R, Lincoln S, Crawley A, Hanson M, Maraganore D,

Adler C, Cookson MR, Muenter M, Baptista M, Miller D, Blancato J, Hardy J, Gwinn-

Hardy K: alpha-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science 302:

841, 2003

Sotiriou E, Vassilatis DK, Vila M, Stefanis L: Selective noradrenergic vulnerability in

alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging 31: 2103-2114, 2010

Spencer B, Potkar R, Trejo M, Rockenstein E, Patrick C, Gindi R, Adame A, Wyss-

Coray T, Masliah E: Beclin 1 gene transfer activates autophagy and ameliorates the

neurodegenerative pathology in alpha-synuclein models of Parkinson's and Lewy body

diseases. J Neurosci 29: 13578-13588, 2009

Spillantini MG, Goedert M: The alpha-synucleinopathies: Parkinson's disease, dementia

with Lewy bodies, and multiple system atrophy. Ann NY Acad Sci 920: 16-27, 2000

Spillantini MG, Divane A, Goedert M: Assignment of human alpha-synuclein (SNCA)

and beta-synuclein (SNCB) genes to chromosomes 4q21 and 5q35. Genomics 27: 379-

381, 1995

Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M: alpha-Synuclein in

filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with

lewy bodies. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6469-6473, 1998

St Martin JL, Klucken J, Outeiro TF, Nguyen P, Keller-McGandy C, Cantuti-Castelvetri

I, Grammatopoulos TN, Standaert DG, Hyman BT, McLean PJ: Dopaminergic neuron

59

loss and up-regulation of chaperone protein mRNA induced by targeted over-expression

of alpha-synuclein in mouse substantia nigra. J Neurochem 100: 1449-1457, 2007

Su H, Huang Y, Takagawa J, Barcena A, Arakawa-Hoyt J, Ye J, Grossman W, Kan

YW: AAV serotype-1 mediates early onset of gene expression in mouse hearts and

results in better therapeutic effect. Gene Ther 13: 1495-1502, 2006

Surguchov A: Molecular and cellular biology of synucleins. Int Rev Cell Mol Biol 270:

225-317, 2008

Thiruchelvam MJ, Powers JM, Cory-Slechta DA, Richfield EK: Risk factors for

dopaminergic neuron loss in human alpha-synuclein transgenic mice. Eur J Neurosci

19: 845-854, 2004

Tofaris GK, Garcia Reitböck P, Humby T, Lambourne SL, O'Connell M, Ghetti B,

Gossage H, Emson PC, Wilkinson LS, Goedert M, Spillantini MG: Pathological

changes in dopaminergic nerve cells of the substantia nigra and olfactory bulb in mice

transgenic for truncated human alpha-synuclein(1-120): implications for Lewy body

disorders. J Neurosci 26: 3942-3950, 2006

Toide K, Iwamoto Y, Fujiwara T, Abe H: JTP-4819: a novel prolyl endopeptidase

inhibitor with potential as a cognitive enhancer. J Pharmacol Exp Ther 274: 1370-1378,

1995

Ulusoy A, Björklund T, Buck K, Kirik D: Dysregulated dopamine storage increases the

vulnerability to alpha-synuclein in nigral neurons. Neurobiol Dis 47: 367-377, 2012

Unger EL, Eve DJ, Perez XA, Reichenbach DK, Xu Y, Lee MK, Andrews AM:

Locomotor hyperactivity and alterations in dopamine neurotransmission are associated

with overexpression of A53T mutant human alpha-synuclein in mice. Neurobiol Dis 21:

431-443, 2006

Uversky VN: Neuropathology, biochemistry, and biophysics of alpha-synuclein

aggregation. J Neurochem 103: 17-37, 2007

van der Putten H, Wiederhold KH, Probst A, Barbieri S, Mistl C, Danner S, Kauffmann

S, Hofele K, Spooren WP, Ruegg MA, Lin S, Caroni P, Sommer B, Tolnay M, Bilbe G:

Neuropathology in mice expressing human alpha-synuclein. J Neurosci 20: 6021-6029,

2000

Venäläinen JI, Juvonen RO, Forsberg MM, Garcia-Horsman A, Poso A, Wallen EA,

Gynther J, Männistö PT: Substrate-dependent, non-hyperbolic kinetics of pig brain

prolyl oligopeptidase and its tight binding inhibition by JTP-4819. Biochem Pharmacol

64: 463-471, 2002

60

Wakamatsu M, Ishii A, Iwata S, Sakagami J, Ukai Y, Ono M, Kanbe D, Muramatsu S,

Kobayashi K, Iwatsubo T, Yoshimoto M: Selective loss of nigral dopamine neurons

induced by overexpression of truncated human alpha-synuclein in mice. Neurobiol

Aging 29: 574-585, 2008

Waxman EA, Giasson BI: Molecular mechanisms of alpha-synuclein

neurodegeneration. Biochim Biophys Acta 1792: 616-624, 2009

Wu N, Joshi PR, Cepeda C, Masliah E, Levine MS: Alpha-synuclein overexpression in

mice alters synaptic communication in the corticostriatal pathway. J Neurosci Res 88:

1764-1776, 2010

Xiao W, Chirmule N, Berta SC, McCullough B, Gao G, Wilson JM: Gene therapy

vectors based on adeno-associated virus type 1. J Virol 73: 3994-4003, 1999

Yavich L, Oksman M, Tanila H, Kerokoski P, Hiltunen M, van Groen T, Puoliväli J,

Männistö PT, Garcia-Horsman A, MacDonald E, Beyreuther K, Hartmann T, Jäkälä P:

Locomotor activity and evoked dopamine release are reduced in mice overexpressing

A30P-mutated human alpha-synuclein. Neurobiol Dis 20: 303-313, 2005

Zarranz JJ, Alegre J, Gómez-Esteban JC, Lezcano E, Ros R, Ampuero I, Vidal L,

Hoenicka J, Rodriguez O, Atarés B, Llorens V, Gomez Tortosa E, del Ser T, Muñoz

DG, de Yebenes JG: The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and

Lewy body dementia. Ann Neurol 55: 164-173, 2004

Zhou W, Freed CR: Tyrosine-to-cysteine modification of human alpha-synuclein

enhances protein aggregation and cellular toxicity. J Biol Chem 279: 10128-10135,

2004

Zhou W, Milder JB, Freed CR: Transgenic mice overexpressing tyrosine-to-cysteine

mutant human alpha-synuclein: a progressive neurodegenerative model of diffuse Lewy

body disease. J Biol Chem 283: 9863-9870, 2008