Scientia Amazonia, v. 6, n.3, 107-118,...

Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017

Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910

107

Expressatildeo e caracterizaccedilatildeo de α-amilase de Bacillus licheniformis DSM13

em levedura Pichia pastoris

Helber Abellini Astolpho1 Edson Juacutenior do Carmo2 Spartaco Astolfi-Filho3

Submetido 19062017 ndash Aceito 27072017 ndash Publicado on-line 30072017

Resumo

A manipulaccedilatildeo geneacutetica de micro-organismos permite a produccedilatildeo de enzimas com alto valor

biotecnoloacutegico com aplicaccedilatildeo em vaacuterios processos industriais A enzima α-amilase de Bacillus

licheniformis eacute amplamente utilizada nas induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar cerveja e panificaccedilatildeo para a

hidroacutelise do amido inicial clivando as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14) Deste modo sistemas de

expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas tem sido utilizado com sucesso sendo um exemplo o sistema da

levedura metilotroacutefica Pichia pastoris O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar o gene que

codifica a α-amilase de B licheniformis DSM13 na levedura metilotroacutefica P pastoris e apoacutes analisar a

proteiacutena recombinante secretada Desta forma o gene foi inserido no genoma da levedura utilizando o

vetor pPIC9 e a enzima foi entatildeo produzida e secretada A atividade enzimaacutetica maacutexima foi observada

no sobrenadante do clone B8 (3454 UmL) Houve variaccedilatildeo quanto ao peso molecular da enzima

entre os clones analisados por gel SDS-PAGE A enzima apresentou temperatura oacutetima de atividade

de 70 ordmC consideraacutevel estabilidade na presenccedila de caacutelcio pH oacutetimo de 70 e tambeacutem se manteve

estaacutevel por um periacuteodo de dois meses quando incubada a 4 ordmC Os valores de Km e Vmaacutex aparentes

calculado para o extrato bruto do clone A7 foram de 1074 mgmL e 41666 UmL respectivamente

Palavras-Chave Expressatildeo heteroacuteloga enzima recombinante caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica etanol

Expression and characterization of α-amylase from Bacillus licheniformis DSM13 in

yeast Pichia pastoris Genetic manipulation of microorganisms allows the production of enzymes

with high biotechnological value with application in various industrial processes The enzyme α-

amylase from Bacillus licheniformis is widely used in industries to produce alcohol sugar and beer

and its activity involves hydrolysis of starch cleaving the glycosidic bonds α-(14) Thus heterologous

protein expression systems have been used successfully one example being the methylotrophic yeast

Pichia pastoris The porpouse of this study was to clone and to express the gene encoding α-amylase

from B licheniformis DSM13 in the methylotrophic yeast P pastoris and also to analyze the

recombinant protein secreted In this way the gene was inserted into the yeast genome using the

pPIC9 vector and the enzyme was then produced and secreted The maximum enzyme activity was

observed in the supernatant of the clone B8 (3454 UmL) Variations in molecular weight of the

enzymes among the clones were detected by SDS-PAGE gel analysis The enzyme showed optimum

activity at 70 ordmC pH optimum of 70 and its activity remained stable for a period of two months when

maintained at 4 degC The Km and Vmaacutex apparent values calculated for the crude extract clone A7 were

1074 mgmL and 41666 UmL respectively

Keywords Heterologous expression recombinant enzyme enzyme characterization ethanol

1 Bioacutelogo Doutor em Biotecnologia Programa Multi-Institucional de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biotecnologia

Departamento Centro de Apoio Multidisciplinar - Av General Rodrigo Octaacutevio Jordatildeo Ramos 3000 Coroado

II Manaus Amazonas Brasil correspondecircncia hastolphogmailcom 2 Professor Adjunto Departamento de Ciecircncias FisioloacutegicasICB Universidade Federal do Amazonas Manaus

AM Brasil E-mail edsonjuniorbioyahoocombr 3 Professor Titular de Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas Diretor do Centro de Apoio

Multidisciplinar Universidade Federal do Amazonas Manaus AM Brasil E-mail spartacobiotecgmailcom



108

1 Introduccedilatildeo Amilases satildeo enzimas responsaacuteveis pela

degradaccedilatildeo da moleacutecula de amido e estatildeo

amplamente distribuiacutedas na natureza Elas

apresentam grande importacircncia industrial

correspondendo a aproximadamente 25 da

produccedilatildeo de enzimas do mundo (YAN e WU

2017 LI et al 2012) A hidroacutelise do amido

gera diversos produtos incluindo dextrinas e

poliacutemeros menores compostos por unidades de

glicose Trecircs domiacutenios distintos caracterizam a

estrutura geral dessas enzimas que satildeo

divididas em grupos de acordo com suas

respectivas atividades cataliacuteticas (LI et al

2016 ASGHARI et al 2004) As α-amilases

clivam as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14)

presentes nas cadeias de amilose ou

amilopectina da moleacutecula de amido Estas

apresentam vasta aplicaccedilatildeo nas induacutestrias de

alimentos farmacecircuticas tecircxtil panificaccedilatildeo

bem como em processos envolvidos na

liquefaccedilatildeo do amido para a produccedilatildeo de

xaropes de frutose e na produccedilatildeo de etanol

combustiacutevel (MAGALHAtildeES e SOUZA 2010

ZHU et al 2017) Ao longo das uacuteltimas

deacutecadas pesquisas tecircm sido desenvolvidas

com α-amilases produzidas por uma grande

variedade de microrganismos (fungos

leveduras bacteacuterias e actinomicetos) A

principal vantagem eacute a capacidade de produccedilatildeo

econocircmica em massa e a faacutecil manipulaccedilatildeo

para obtenccedilatildeo de enzimas com caracteriacutesticas

desejaacuteveis (PANDEY et al 2000 SINDHU et

al 2017)

A α-amilase da bacteacuteria Bacillus

licheniformis eacute amplamente utilizada nas

induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar e cerveja para a

hidroacutelise do amido Sua estrutura possui trecircs

domiacutenios o domiacutenio A eacute formado por uma

tiacutepica estrutura em barril (βα)8 o domiacutenio B

se estabelece como uma protrusatildeo a partir do

domiacutenio A e o domiacutenio C-terminal possui o

siacutetio ativo da enzima e conservados siacutetios de

ligaccedilatildeo para o caacutelcio (NAZMI et al 2006)

Devido muitos microrganismos secretar

quantidades limitadas de enzimas ou outras

proteiacutenas e peptiacutedeos a expressatildeo heteroacuteloga

em outras ceacutelulas hospedeiras tem sido

empregada para potencializar a obtenccedilatildeo

desses produtos de interesse biotecnoloacutegico

Neste sentido a levedura metilotroacutefica Pichia

pastoris eacute um modelo de sucesso para a

expressatildeo de produtos heteroacutelogos A produccedilatildeo

de proteiacutenas heteroacutelogas em altos niacuteveis as

modificaccedilotildees poacutes-traducionais como

glicosilaccedilatildeo formaccedilatildeo de pontes de dissulfeto

o processamento proteoliacutetico e a viabilidade do

sistema de expressatildeo como Kit comercialmente

disponiacutevel contribuiacuteram para o sucesso dessa

levedura como sistema de expressatildeo

(CEREGHINO e CREGG 2000 HUANG et

al 2017) Neste estudo expressamos o gene

que codifica a enzima α-amilase de B

licheniformis (linhagem DSM13) em P

pastoris e analisamos o produto recombinante

secretado

2 Material e Meacutetodos

21 Linhagens de micro-organismos e

vetores moleculares utilizados Microorganismos Escherichia coli

DH10Btrade (Invitrogen) genoacutetipo F- mcrA

Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15

ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara

leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG

Escherichia coli TOP10trade (Invitrogen)

genoacutetipo Fndash mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)

Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139

Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1

nupG Pichia pastoris GS115 (Invitrogenreg)

genoacutetipo his4 Vetores moleculares pPIC9

(InvitrogenTM) pCRreg21-TOPO

(InvitrogenTM)

22 Estrateacutegias de clonagem e

subclonagem O DNA genocircmico de B licheniformis

(DSM13) foi cedido pelo Instituto de Geneacutetica

da Universidade de Bayreuth-Alemanha O

gene correspondente a α-amilase foi

amplificado por PCR utilizando-se o par de

oligonucleotiacutedeos iniciadores Ramy e Famy

(Ramy 5rsquoCGGCGGCCGCCTATCTTTGAAC

ATAAATTGAAAC3rsquoFamy5rsquoCGGAATTCA

ATCTTAAAGGGACGCTGATG 3rsquo) Nas

extremidades 5rsquo destes foram inseridos as

sequencias correspondentes agraves enzimas de

restriccedilatildeo NotI e EcoRI (New England Biolabs)

respectivamente A termociclagem consistiu de

um ciclo de desnaturaccedilatildeo inicial a 94ordmC por 2

minutos seguido de 35 ciclos de 94ordmC por 35

segundos 60ordmC por 40 segundos e 58ordmC por

15 minutos A extensatildeo final foi de 58ordmC por

5 minutos O produto da PCR (amplicon) foi



109

clonado no vetor pCRreg21-TOPOreg e inserido

por transformaccedilatildeo quiacutemica nas ceacutelulas

TOP10trade (Invitrogen) conforme

recomendaccedilotildees do fabricante A construccedilatildeo do

vetor de clonagem TOPO-amy foi confirmada

por PCR utilizando-se DNA plasmidial

extraiacutedo

Para a expressatildeo da enzima α-amilase na

levedura Pichia pastoris foi utilizado o vetor

pPIC9 (InvitrogenTM) 100 ng de DNA dos

vetores TOPO-amy e pPIC9 foram digeridos

com 1Uμg das enzimas EcoRI e NotI Apoacutes a

digestatildeo o inserto liberado e o vetor de

expressatildeo linearizado foram purificados em gel

de agarose (Illustra GFX PCR DNA and Gel

Band Purification - GE Healthcare) A reaccedilatildeo

de ligaccedilatildeo ocorreu em volume reacional final

de 15 μL contendo 260 ngμL de Inserto 500

ngμL do vetor T4 DNA ligase 400 Uμg

(New England Biolabs) e 15 uL de tampatildeo

10X O vetor de expressatildeo construiacutedo (pPIC-

amy) foi precipitado com acetato de amocircnia

75M 110 vv e etanol absoluto gelado 25 vv

sendo em seguida inserido em ceacutelulas

DH10Btrade (Invitrogen) por transformaccedilatildeo

eletrocompetente A construccedilatildeo do plasmiacutedeo

recombinante foi confirmada por anaacutelise de

restriccedilatildeo

23 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes A recombinaccedilatildeo homoacuteloga para

integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo no genoma

da hospedeira pode ocorrer no locus his4 ou no

locus AOX1 por eventos de crossing over entre

regiotildees do vetor e genoma Para que esse

processo ocorra eacute necessaacuterio a linearizaccedilatildeo do

plasmiacutedeo recombinante Deste modo o

plasmiacutedeo pPIC-amy foi linearizado utilizando

a endonuclease de restriccedilatildeo BglII (New

England Biolabs) O plasmiacutedeo precipitado

com acetato de amocircnia 75M 110 vv e etanol

100 gelado 25 vv foi inserido nas

leveduras GS115 por eletroporaccedilatildeo (1500 V)

As ceacutelulas transformadas foram semeadas no

meio de cultivo MD e incubadas a 30ordmC

durante trecircs dias Os clones recombinantes

foram selecionados no meio miacutenimo MD por

meio de seleccedilatildeo auxotroacutefica anti-histidina

24 Seleccedilatildeo dos clones produtores de α-

amilase A primeira etapa de seleccedilatildeo consistiu na

transferecircncia de 96 clones recombinantes do

meio de cultivo MD para o meio de cultivo

BMG-Y Esses clones foram incubados por

dois dias a 30 ordmC para o aumento do

crescimento celular Apoacutes essa etapa os clones

foram transferidos para o meio de cultivo

indutor BMM-Y Estes foram incubados por

mais trecircs dias na mesma temperatura Para

induzir a expressatildeo da enzima foi adicionado

metanol (concentraccedilatildeo de 05) nas tampas

das placas por trecircs dias a cada 24 horas A

uacuteltima etapa consistiu na seleccedilatildeo dos clones

produtores por meio da coloraccedilatildeo de vapor de

iodo Esta coloraccedilatildeo permite visualizar halos

transluacutecidos ao redor das colocircnias que tiveram

a α-amilase expressa Apoacutes a seleccedilatildeo foi

calculado o iacutendice de amiloacutelise (Ia) Este iacutendice

eacute o resultado da relaccedilatildeo entre o diacircmetro do

halo e o diacircmetro da colocircnia e foi calculado

pela foacutermula Ia = (dh2dc2) (dh = diacircmetro do

halo e dc = diacircmetro da colocircnia)

25 Produccedilatildeo de α-amilase em meio

liacutequido Nove clones recombinantes foram

selecionados para a produccedilatildeo da enzima α-

amilase em meio liacutequido Estes clones foram

transferidos para o meio BMG-Y (30 mL) e

incubados a 30 degC sob agitaccedilatildeo (200 rpmmin)

ateacute atingir uma transmitacircncia de λ600 de 06

medido em espectrofotocircmetro Em seguida os

meios foram centrifugados por 15 minutos a 4

ordmC (4000 rpm) O pellet de cada cultura foi

ressuspendido em 150 mL do meio indutor

BMM-Y em frascos de 1L A induccedilatildeo da

expressatildeo enzimaacutetica teve o iniacutecio com a

adiccedilatildeo de metanol 05 vv O tempo de

produccedilatildeo da enzima teve duraccedilatildeo de 120 horas

sendo adicionado metanol a cada 24 horas

Aliacutequotas de 1 mL foram retiradas em

triplicata nos tempos de 0 24 48 72 e 120

horas e armazenadas em microtubos de 15

mL Todas as aliacutequotas retiradas foram

centrifugadas a 12000 rpm a 4 degC e os

sobrenadantes foram recuperados e estocados a

-20 degC Estas aliacutequotas foram utilizadas para a

realizaccedilatildeo dos ensaios enzimaacuteticos anaacutelise da

expressatildeo proteica e para a construccedilatildeo da

curva de crescimento dos clones induzidos O



110

crescimento celular obtido foi convertido para

gL utilizando a foacutermula (gL)=022 x DO

600 ηm (Nakano et al 2006)

A anaacutelise da proteiacutena recombinante

secretada pela levedura foi feita por meio de

eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida (SDS-PAGE) conforme descrito

por Sambrook et al (1989) e as amostras

foram coradas com a soluccedilatildeo de Azul

Brilhante de Coomassie G250

26 Determinaccedilatildeo da atividade

enzimaacutetica A quantificaccedilatildeo das dextrinas liberadas

pela enzima α- amilase foi determinada de

acordo como descrito por Fuwa (1954) Os

nove clones tiveram sua atividade enzimaacutetica

dosada Para o caacutelculo dos valores da atividade

enzimaacutetica construiu-se a curva padratildeo de

amido A leitura das absorbacircncias das

diferentes concentraccedilotildees de amido (0025 a

1) gerou uma equaccedilatildeo da reta (R = 0993)

utilizada para fazer os caacutelculos da atividade

enzimaacutetica Uma unidade de atividade

dextrinizante foi definida como a quantidade

de enzima necessaacuteria para hidrolisar 01 mg de

amido por minuto

27 Ensaios enzimaacuteticos Os ensaios enzimaacuteticos para determinar

o pH oacutetimo temperatura oacutetima estabilidade

teacutermica e estabilidade em relaccedilatildeo ao tempo de

estocagem da enzima tambeacutem foram

realizados de acordo com o meacutetodo de Fuwa

(1954) Todos os ensaios foram realizados com

os extratos enzimaacuteticos dos clones A5 B8 e

D14 Para determinar o pH oacutetimo da enzima

foi preparada uma soluccedilatildeo de glicina 50 mM

aacutecido aceacutetico 50 mM e fosfato de soacutedio

dibaacutesico 50 mM que permitiu variar o pH entre

as faixas de 20 a 120 Para definir a

temperatura oacutetima os extratos enzimaacuteticos

foram analisados em diferentes temperaturas

(40 a 100 degC) Para avaliar a estabilidade

teacutermica da enzima em relaccedilatildeo agrave temperatura o

extrato do clone B8 foi preacute-incubado por 60

minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC no

pH oacutetimo preacute-estabelecido A cada 15 minutos

foram coletados uma aliacutequota para proceder agrave

dosagem da atividade enzimaacutetica Foram

acrescidos na reaccedilatildeo CaCl2 (5 mM) conforme

descrito por Hmidet et al 2008 A estabilidade

da enzima em relaccedilatildeo ao tempo de estocagem

tambeacutem foi medida A enzima foi estocada por

um periacuteodo de 60 dias a 4 ordmC e sua atividade

enzimaacutetica foi avaliada a cada 10 dias durante

este periacuteodo Os paracircmetros cineacuteticos aparentes

do extrato enzimaacutetico foram determinados nas

condiccedilotildees preacute-estabelecidas de pH e

temperatura oacutetima Para avaliar esses

paracircmetros o extrato foi incubado em

diferentes concentraccedilotildees de amido (5 a 90

mgmL) Os dados obtidos foram utilizados

para construir um graacutefico com os valores reais

de Km e Vmaacutex da enzima

3 Resultados

31 Construccedilatildeo dos vetores de clonagem

e expressatildeo O amplicon do gene α-amilase gerado

apoacutes a PCR foi de aproximadamente 1500

pares de bases Apoacutes a amplificaccedilatildeo foi

realizado a ligaccedilatildeo do gene no vetor de

clonagem pCRreg21-TOPOreg (39 kb) O vetor

construiacutedo (TOPO-amy) foi digerido com as

endonucleases EcoRI e NotI e o fragmento

liberado foi purificado do gel de agarose

(Figura 1)

Figura 1 - Figura-A perfil dos plasmiacutedeos

recombinantes TOPO-amy apoacutes restriccedilatildeo com

EcoRI e NotI Figura-B Perfil do gene α-amilase

purificado M ndash marcador de peso molecular 1 Kb

(Fermentas)

Na Figura 2 visualizamos a construccedilatildeo

do vetor de expressatildeo pPIC-amy A ligaccedilatildeo do

fragmento gecircnico foi realizada apoacutes a

sequecircncia promotora do gene AOX1 A

subclonagem foi confirmada por anaacutelise de

restriccedilatildeo



111

Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de

expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase

Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA

ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de

expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador

de peso molecular 1Kb (Fermentas)

32 Expressatildeo de α-amilase em meio

soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P

pastoris (GS115) noventa e seis

transformantes foram previamente

selecionados 802 dos clones foram

considerados produtores Os 96 clones foram

divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de

induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da

expressatildeo proteica Na figura 3 observamos

uma placa de Petri contendo clones

considerados produtores de α-amilase

recombinante clones natildeo produtores e o

controle positivo de expressatildeo de α-amilase de

Bacillus subtilis

Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones

produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo

dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P

pastoris

Foram escolhidos nove clones que

apresentaram os maiores iacutendices de amilolise

para a expressatildeo da enzima recombinante em

meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove

clones selecionados estatildeo apresentados na

Tabela 1

Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones

utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e

produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido

Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)

A5 1075

A7 1004

B8 1267

B20 1198

C13 1079

C22 1007

D10 1036

D14 1174

D17 1181

Observamos que o maior iacutendice

apresentado foi correspondente ao clone B8

enquanto que o menor Ia foi aferido do clone

A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os

nove clones selecionados foram entatildeo

utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante

em meio liacutequido


liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo

Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os

nove clones produtores da enzima recombinante

Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da

enzima podem ser observados na Figura 4

Observamos um aumento progressivo da

atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de

induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase

recombinante apresentou maior atividade

enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo

poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade

nos sobrenadantes dos clones testados De

acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o



112

que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre

os sobrenadantes testados (3454 UmL)

enquanto que o clone A7 obteve o menor valor

de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura

4)

34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da

enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas

correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-

A) O perfil de bandas dos clones analisados

no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao

peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74

kDa aproximadamente Os resultados da

cineacutetica de expressatildeo com o clone B8

mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase

recombinante no tempo de 120 horas de

induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle

negativo da expressatildeo (clone GS115)

apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves

proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris

Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones

recombinantes que passam a ter sua

maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo

da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)

Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones

Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B

Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle

negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)

35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica

Os dados mostram que a enzima

secretada apresentou melhor funcionalidade

em pH neutro mantendo alta atividade relativa

na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo

de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3

clones analisados (Figura 6)

A temperatura oacutetima em que a

enzima obteacutem a maacutexima atividade

hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto

podemos observar que na temperatura de

80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua

atividade relativa para os clones A5 e D14

e 8974 para o clone B8 Na temperatura

de 90 ordmC sua atividade foi aferida em

aproximadamente 75 para os clones B8 e

D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-

A)

Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-

amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14

A B



113

Os testes de termoestabilidade com o

clone B8 demonstraram que na temperatura de

60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a

enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes

uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70

ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos

que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve

474 de sua atividade enquanto que na

presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua

atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a

presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua

atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de

incubaccedilatildeo (Figura 7-B)

Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-

amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio

A anaacutelise dos dados quanto a

estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC

demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de

estocagem a enzima teve apenas 5 de perda

da sua atividade cataliacutetica Essa perda se

iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A

atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo

dia de incubaccedilatildeo foi de 9583

36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima

recombinante (Km and Vmax)

Os valores de Km e Vmaacutex aparentes

foram calculados a partir da construccedilatildeo de um

graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-

Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da

relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos

velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do

substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex

na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de

1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]

permitindo determinar com mais precisatildeo a

Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km

aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex

igual a 41666 UmL

4 Discussatildeo

O tamanho do amplicon gerado eacute

consistente com o apresentado por Ivanova e

colaboradores (1993) indicando que o gene da

α-amilase foi totalmente amplificado

A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo

permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da

levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo

escolhido referente agrave enzima BglII permitiu

uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou

substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou

duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e

do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de

dois fenoacutetipos diferentes da levedura P

pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand

e colaboradores (2017) a levedura

metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo

apresenta em seu material geneacutetico vetores

epissomais Com isso para que ocorra a

expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute

fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico

no seu genoma De acordo com Daly e Hearn

(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo

ocorre em locus especiacuteficos no genoma da

AB



114

levedura o que gera transformantes

geneticamente estaacuteveis

De acordo com Astolfi-Filho e

colaboradores (1986) a α-amilase produzida

tem a capacidade de clivar o amido que ao ser

corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo

de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em

meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes

dos clones que natildeo produzem a enzima coram-

se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho

dos halos apresentados na figura 3 pode estar

relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de

coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o

gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no

cromossomo da levedura o que gera tambeacutem

diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram

apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)

Os resultados da atividade enzimaacutetica

dextrinizante obtido com o clone B8 (3454

UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos

demonstrados por autores que utilizaram

outros micro-organismos para a expressatildeo da

enzima α-amilase utilizando cultura em

frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores

(2001) expressaram α-amilase em

Saccharomyces cerevisiae utilizando o

promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima

obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118

UmL Outros trabalhos tambeacutem

contextualizam a menor atividade obtida em

relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet

et al (2008) clonaram expressaram e

purificaram a enzima α-amilase de Bacillus

licheniformis na hospederia Ecoli obtendo

uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua

purificaccedilatildeo

Em outros estudos tambeacutem podemos

observar agrave anaacutelise das atividades relativas e

especiacuteficas da enzima recombinante A

atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus

expressa em Ecoli teve sua atividade

especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC

(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores

(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de

Bacillus stearothermophilus em Ecoli

transformada com o vetor pHI301A Segundo

esses autores a maior atividade enzimaacutetica

obtida foi de 82 UmL em 13 horas de

induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi

(2003) analisaram a atividade da α-amilase de

Bacillus licheniformis transformando E coli

BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320

Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma

atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1

de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1

mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular

A variaccedilatildeo no perfil da atividade

enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove

clones do presente estudo pode ser explicada

por diversos fatores que estatildeo relacionados

com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de

expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples

composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e

viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes

tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute

responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso

(PAIFER et al 1994)

O peso molecular da enzima

recombinante de B licheniformis observado no

presente estudo difere de trabalhos reportados

com a mesma enzima Kim e colaboradores

(1992) isolaram e clonaram o gene

correspondente a mesma enzima no vetor

pBR322 e expressaram em E coli eles

reportaram que o peso molecular da α-amilase

foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)

tambeacutem expressaram o gene que codifica para

enzima α-amilase de B licheniformis linhagem

NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles

reportaram um peso molecular de 58 kDa da

enzima purificada No presente estudo a

diferenccedila observada nos pesos moleculares das

bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)

pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada

pela levedura durante o amadurecimento

proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a

modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que

precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no

luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura

P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos

de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e

HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)



115

A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade

relativa da enzima α-amilase de B

licheniformis tem sido citado na literatura

Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-

amilase termoestaacutevel da cepa de B

Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a

sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100

tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e

colaboradores (2008) ralataram que a α-

amilase do mesmo microrganismo expressa em

E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65

Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo

da α-amilase de duas linhagens de B

Licheniformis sendo uma mutante e outra

selvagem revelaram um pH oacutetimo para a

atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al

2006) No presente estudo a enzima tambeacutem

mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs

clones analisados retendo cerca de mais de

80 de sua atividade nos pHs 90 e 100

(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por

exemplo a de dertergentes α-amilases com

atividade em pHs alcalinos satildeo muito

utilizadas (GUPTA 2003)

Alguns trabalhos relatados na literatura

mostram diferentes temperaturas em que a

enzima α-amilase de B licheniformis age no

substrato sendo que algumas destas satildeo

caracterizadas como termoresistentes Tomazic

e Klibanov (1988) demonstram que uma α-

amilase caracterizada teve sua temperatura

oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores

(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC

para enzima Morgan e Priest (1981) relataram

que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a

maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC

assim como a temperatura descrita no presente

trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)

Satildeo reportados tambeacutem trabalhos

relacionados com a termoestabilidade da

enzima α-amilase Ivanova e colaboradores

(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10

mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os

autores os dados para a atividade residual apoacutes

a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees

contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2

mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da

enzima Como se observa nos resultados do

presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da

atividade relativa em diferentes temperaturas

ou a estabilidade teacutermica da enzima

recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a

presenccedila do iacuteon Ca2+

O valor da constante de Michaelis-

Menten (Km) eacute muito importante na

caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica

indicando a quantidade necessaacuteria de substrato

para saturar a enzima Muumlller (2008)

caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis

produzida em P pastoris observou diferentes

valores de Km para enzima quando presente no

sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2

os valores de Km foi de 102 mgmL e a

velocidade maacutexima foi de 5263 UmL

Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um

Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL

para a enzima alfa-amilase de B licheniformis

5 Conclusotildees

Os experimentos demonstraram que o

fragmento codificante da α- amilase de B

licheniformis foi isolado e clonado

eficientemente nos vetores de clonagem e

expressatildeo e os clones recombinantes de P

pastoris foram capazes de expressar e secretar

a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior

produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de

induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em

pH neutro A enzima recombinante apresentou

consideraacutevel estabilidade em sua temperatura

oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila

do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve

estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4

ordmC

Os resultados obtidos com a cineacutetica

enzimaacutetica neste estudo indicam que o

sobrenadante do extrato bruto se apresenta

como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na

hidroacutelise do amido reduzindo os custos de

produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas

condiccedilotildees de uso para determinados processos



116

industriais Aleacutem disto estudos como este

proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais

de caraacuteter biotecnoloacutegico

Agradecimentos

A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho

ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos

ao Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao

Centro de Apoio Multidisciplinar da

Universidade Federal do Amazonas por toda

estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial

Divulgaccedilatildeo

Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores

natildeo relataram qualquer conflito de interesse

durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista

Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais

tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para

divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico

Referecircncias

ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F

RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and

microbial Technology v 35 p 51-57

2004 doiorg101016jenzmictec200403006

ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast

transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic

cdna Nature Biotechnology v4 p311-

315 1986 doi101038nbt0486-311

CEREGHINO GPL CREGG JM

Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS

Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000

doiorg101111j1574-69762000tb00532x

CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC

Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology

v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905

DALY R HEARN MTW Expression of

heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering

and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005

doi 101002jmr687

DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and

Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and

Biochemical Characterization of the

Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p

3569ndash3576 1997

FUWA HA A new method for

microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of

Biochemistry v41 p 583-603 1954

GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-

amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616

2003

HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical

characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide

sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43

p 499ndash510 2008

doi101016jprocbio200801017

HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y

CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable

raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia

pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-

1701-y

VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA

EI Purification and characterization of a

thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v

28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N

KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and

characterization of mouse salivary a-amylase

secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001

doi101002yea714



117

KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic

properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p

22108ndash22114 1992

LEE S ONEDA H MINODA M et al

Comparison of Starch Hydrolysis Activity and

Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-

Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005

2006 doi 101093jbmvj113

LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application

Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal

2e201209017 2012 doi105936csbj201209017

LI Z DUAN X WU J Improving the

thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-

amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016

doi 101016jjbiotec201602013

MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review

Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-

83822010000400004

MORGAN FJ PRIEST FG Characterization

of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981

doi 101111j1365-26721981tb00875x

MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da

α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na

levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do

Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp

NAKANO A LEE CY YOSHIDA A

MATSUMOTO T et al Effects of methanol

feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006

doi101263jbb101227

NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-

binding to Bacillus licheniformis α-amylase

(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006

doiorg101016jabb200604004

PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et

al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994

doi101002yea320101104

PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases

Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073

ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-

ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one

yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion

on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi

1010801354377620171339789

SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual

2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989

1659pp

SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene

from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative

signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254

2003 doi101046j1365-2672200302082x

SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during

fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field

Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36

2007 doi 101016jelstat200503093

SINDHU R BINOD P MADHAVAN A

BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular

improvements in microbial α-amylases for

enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40

2017 doi101016jbiortech201704098

TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One

Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another

The journal of Biological Chemistry v7

n263 p 3092-3096 1988

YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-

amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell



118

Factories v 16 p 124-132 2017 doi

101186s12934-017-0738-1

ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P

Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from

recombinant Saccharomyces cerevisiae using a

SUC2 promoter Biotechnology Letters

v23 p 259ndash262 2001

doi101023A1005641926474

ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A

hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC

Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3



108

1 Introduccedilatildeo Amilases satildeo enzimas responsaacuteveis pela

degradaccedilatildeo da moleacutecula de amido e estatildeo

amplamente distribuiacutedas na natureza Elas

apresentam grande importacircncia industrial

correspondendo a aproximadamente 25 da

produccedilatildeo de enzimas do mundo (YAN e WU

2017 LI et al 2012) A hidroacutelise do amido

gera diversos produtos incluindo dextrinas e

poliacutemeros menores compostos por unidades de

glicose Trecircs domiacutenios distintos caracterizam a

estrutura geral dessas enzimas que satildeo

divididas em grupos de acordo com suas

respectivas atividades cataliacuteticas (LI et al

2016 ASGHARI et al 2004) As α-amilases

clivam as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14)

presentes nas cadeias de amilose ou

amilopectina da moleacutecula de amido Estas

apresentam vasta aplicaccedilatildeo nas induacutestrias de

alimentos farmacecircuticas tecircxtil panificaccedilatildeo

bem como em processos envolvidos na

liquefaccedilatildeo do amido para a produccedilatildeo de

xaropes de frutose e na produccedilatildeo de etanol

combustiacutevel (MAGALHAtildeES e SOUZA 2010

ZHU et al 2017) Ao longo das uacuteltimas

deacutecadas pesquisas tecircm sido desenvolvidas

com α-amilases produzidas por uma grande

variedade de microrganismos (fungos

leveduras bacteacuterias e actinomicetos) A

principal vantagem eacute a capacidade de produccedilatildeo

econocircmica em massa e a faacutecil manipulaccedilatildeo

para obtenccedilatildeo de enzimas com caracteriacutesticas

desejaacuteveis (PANDEY et al 2000 SINDHU et

al 2017)

A α-amilase da bacteacuteria Bacillus

licheniformis eacute amplamente utilizada nas

induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar e cerveja para a

hidroacutelise do amido Sua estrutura possui trecircs

domiacutenios o domiacutenio A eacute formado por uma

tiacutepica estrutura em barril (βα)8 o domiacutenio B

se estabelece como uma protrusatildeo a partir do

domiacutenio A e o domiacutenio C-terminal possui o

siacutetio ativo da enzima e conservados siacutetios de

ligaccedilatildeo para o caacutelcio (NAZMI et al 2006)

Devido muitos microrganismos secretar

quantidades limitadas de enzimas ou outras

proteiacutenas e peptiacutedeos a expressatildeo heteroacuteloga

em outras ceacutelulas hospedeiras tem sido

empregada para potencializar a obtenccedilatildeo

desses produtos de interesse biotecnoloacutegico

Neste sentido a levedura metilotroacutefica Pichia

pastoris eacute um modelo de sucesso para a

expressatildeo de produtos heteroacutelogos A produccedilatildeo

de proteiacutenas heteroacutelogas em altos niacuteveis as

modificaccedilotildees poacutes-traducionais como

glicosilaccedilatildeo formaccedilatildeo de pontes de dissulfeto

o processamento proteoliacutetico e a viabilidade do

sistema de expressatildeo como Kit comercialmente

disponiacutevel contribuiacuteram para o sucesso dessa

levedura como sistema de expressatildeo

(CEREGHINO e CREGG 2000 HUANG et

al 2017) Neste estudo expressamos o gene

que codifica a enzima α-amilase de B

licheniformis (linhagem DSM13) em P

pastoris e analisamos o produto recombinante

secretado

2 Material e Meacutetodos

21 Linhagens de micro-organismos e

vetores moleculares utilizados Microorganismos Escherichia coli

DH10Btrade (Invitrogen) genoacutetipo F- mcrA

Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15

ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara

leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG

Escherichia coli TOP10trade (Invitrogen)

genoacutetipo Fndash mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)

Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139

Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1

nupG Pichia pastoris GS115 (Invitrogenreg)

genoacutetipo his4 Vetores moleculares pPIC9

(InvitrogenTM) pCRreg21-TOPO

(InvitrogenTM)

22 Estrateacutegias de clonagem e

subclonagem O DNA genocircmico de B licheniformis

(DSM13) foi cedido pelo Instituto de Geneacutetica

da Universidade de Bayreuth-Alemanha O

gene correspondente a α-amilase foi

amplificado por PCR utilizando-se o par de

oligonucleotiacutedeos iniciadores Ramy e Famy

(Ramy 5rsquoCGGCGGCCGCCTATCTTTGAAC

ATAAATTGAAAC3rsquoFamy5rsquoCGGAATTCA

ATCTTAAAGGGACGCTGATG 3rsquo) Nas

extremidades 5rsquo destes foram inseridos as

sequencias correspondentes agraves enzimas de

restriccedilatildeo NotI e EcoRI (New England Biolabs)

respectivamente A termociclagem consistiu de

um ciclo de desnaturaccedilatildeo inicial a 94ordmC por 2

minutos seguido de 35 ciclos de 94ordmC por 35

segundos 60ordmC por 40 segundos e 58ordmC por

15 minutos A extensatildeo final foi de 58ordmC por

5 minutos O produto da PCR (amplicon) foi



109







extraiacutedo





















restriccedilatildeo






































































110

























amido por minuto





































3 Resultados










(Figura 1)





(Fermentas)






restriccedilatildeo



111




















Bacillus subtilis




pastoris






Tabela 1





A5 1075

A7 1004

B8 1267

B20 1198

C13 1079

C22 1007

D10 1036

D14 1174

D17 1181
























112





4)








































A)



A B



113






































igual a 41666 UmL

4 Discussatildeo
























AB



114



































































(PAIFER et al 1994)




























115




































































5 Conclusotildees















ordmC










116




Agradecimentos















Referecircncias








315 1986 doi101038nbt0486-311




doiorg101111j1574-69762000tb00532x



v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905




doi 101002jmr687





3569ndash3576 1997






2003




p 499ndash510 2008






1701-y




28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N




doi101002yea714



117



22108ndash22114 1992





2006 doi 101093jbmvj113



2e201209017 2012 doi105936csbj201209017







83822010000400004



doi 101111j1365-26721981tb00875x








doi101263jbb101227







doi101002yea320101104







1010801354377620171339789



1659pp




2003 doi101046j1365-2672200302082x




2007 doi 101016jelstat200503093





2017 doi101016jbiortech201704098




n263 p 3092-3096 1988





118


101186s12934-017-0738-1





v23 p 259ndash262 2001

doi101023A1005641926474






109







extraiacutedo





















restriccedilatildeo






































































110

























amido por minuto





































3 Resultados










(Figura 1)





(Fermentas)






restriccedilatildeo



111




















Bacillus subtilis




pastoris






Tabela 1





A5 1075

A7 1004

B8 1267

B20 1198

C13 1079

C22 1007

D10 1036

D14 1174

D17 1181
























112





4)








































A)



A B



113






































igual a 41666 UmL

4 Discussatildeo
























AB



114



































































(PAIFER et al 1994)




























115




































































5 Conclusotildees















ordmC










116




Agradecimentos















Referecircncias








315 1986 doi101038nbt0486-311




doiorg101111j1574-69762000tb00532x



v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905




doi 101002jmr687





3569ndash3576 1997






2003




p 499ndash510 2008






1701-y




28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N




doi101002yea714



117



22108ndash22114 1992





2006 doi 101093jbmvj113



2e201209017 2012 doi105936csbj201209017







83822010000400004



doi 101111j1365-26721981tb00875x








doi101263jbb101227







doi101002yea320101104







1010801354377620171339789



1659pp




2003 doi101046j1365-2672200302082x




2007 doi 101016jelstat200503093





2017 doi101016jbiortech201704098




n263 p 3092-3096 1988





118


101186s12934-017-0738-1





v23 p 259ndash262 2001

doi101023A1005641926474






110

























amido por minuto





































3 Resultados










(Figura 1)





(Fermentas)






restriccedilatildeo



111




















Bacillus subtilis




pastoris






Tabela 1





A5 1075

A7 1004

B8 1267

B20 1198

C13 1079

C22 1007

D10 1036

D14 1174

D17 1181
























112





4)








































A)



A B



113






































igual a 41666 UmL

4 Discussatildeo
























AB



114



































































(PAIFER et al 1994)




























115




































































5 Conclusotildees















ordmC










116




Agradecimentos















Referecircncias








315 1986 doi101038nbt0486-311




doiorg101111j1574-69762000tb00532x



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2003




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1659pp




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Bacillus subtilis




pastoris






Tabela 1





A5 1075

A7 1004

B8 1267

B20 1198

C13 1079

C22 1007

D10 1036

D14 1174

D17 1181
























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4)








































A)



A B



113






































igual a 41666 UmL

4 Discussatildeo
























AB



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(PAIFER et al 1994)




























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5 Conclusotildees















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Agradecimentos















Referecircncias








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A)



A B



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4 Discussatildeo
























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Agradecimentos















Referecircncias








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4 Discussatildeo
























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Agradecimentos















Referecircncias








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Scientia Amazonia, v. 6, n.3, 107-118,...

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