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    3. RESULTADOS E DISCUSSO

    De seguida, so apresentados os resultados obtidos nos ensaios

    realizados com a enzima -galactosidase (E.C. 3.2.1.23) proveniente do

    microrganismo Kluyveromyces lactis. Ser feita uma apreciao dos valores

    obtidos assim como uma comparao desses mesmos valores com estudos

    semelhantes anteriormente realizados.

    3.1. Ensaios com a Enzima Sluvel Lactozym 2600L

    A enzima utilizada nestes ensaios foi a Lactozym 2600L sob a forma de

    soluo. A -galactosidase apresentou uma actividade de 2600 U por grama

    de preparao enzimtica. Esta preparao enzimtica apresenta uma

    densidade de 1,15 g/mL .

    tambm conhecida sob as denominaes de -galactosidase, Hydrolact,

    Lactase ou Maxilact.

    Todos os ensaios realizados com esta enzima foram efectuados a pH 6,8

    pois o pH reportado como o ptimo para esta enzima (43, 44, 45).

    Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

    enzima a Lactozym 2600L na hidrlise do substrato padro, o o-nitrofenol--

    -galactosideo (o-npg), nas vrias condies experimentais.

    Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrlise deste

    substrato so a galactose e o-nitrofenol (o-np) que um composto de cor

    amarela.

    3.1.1. Estudo do Efeito da Variao da Concentrao de Enzima

    Os resultados que seguidamente so apresentados pretendem demostrar de

    que modo a variao de concentrao de enzima influencia a actividade

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    enzimtica. Nestes ensaios foi utilizada uma concentrao de substrato padro,

    o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 C.

    Atravs da anlise do grfico 4., possvel observar que a formao de o-np

    depende da concentrao de enzima. A concentrao de enzima mais elevada,

    2,3 mg/mL, origina uma concentrao de o-np tambm mais elevada e atinge

    um pico mximo aos 45 min, decrescendo consideravelmente dos 60 aos 90

    min.

    Grfico 4. Efeito da variao da concentrao de enzima livre ao longo do tempo

    O facto da concentrao inicial de enzima ser elevada de enzima faz com que

    o substrato seja rapidamente convertido, por um lado, e levando ao

    aparecimento de galactose, por outro, pois um produto da hidrlise

    enzimtica do substrato. A galactose um inibidor competitivo da enzima

    diminudo a sua actividade (27,43,46).

    A concentrao inicial de enzima de 0,920 mg/mL foi a que demonstrou

    melhores resultados. De facto formou-se o-np durante um maior perodo de

    tempo, tendo sido registado o seu pico de concentrao aos 90 minutos de

    ensaio.

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    1200,00

    1400,00

    1600,00

    1800,00

    0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

    Co

    nce

    ntr

    ao

    de

    o-n

    p (

    uM

    )

    Tempo (min)

    1,150 mg/mL

    2,300 mg/mL

    0,920 mg/mL

    0,575 mg/mL

    0,460 mg/mL

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    As concentraes de 0,575 e de 0,460 mg/mL apesar de terem registado

    valores de actividade iniciais bastante aceitveis, a partir dos 60 minutos de

    ensaios originaram um patamar na converso do o-npg (Grfico 4.).

    A concentrao enzimtica de 1,150 mg/mL, sendo a segunda mais elevada

    s demonstrou actividade significativa nos primeiros 30 minutos de reaco,

    atingindo o o-np um valor de concentrao semelhante aos 90 minutos de

    ensaio.

    Na avaliao dos resultados no estudo do efeito da concentrao de enzima

    livre foi escolhida uma abordagem alternativa que recorre equao clssica de

    Henri-MichaelisMenten, empregue por alguns autores e que sugere que a

    velocidade inicial de hidrlise, vo pode ser expressa como funo da

    concentrao inicial de enzima ([Eo]), ou seja: vo = (Vemax x [Eo])/(Ke + [Eo]).

    A relao entre a velocidade inicial aumenta com o aumento de concentrao

    enzimtica no entanto esse aumento no linear, tendendo para estabilizar

    aquando do emprego de solues enzimticas mais concentradas, devido

    saturao da superfcie do substrato.

    O modelo escolhido permite calcular o valor das duas constantes Vemax e Ke,

    respectivamente 20,3 mM/min e 51 g/mL, e que correspondem velocidade

    mxima quando a concentrao enzimtica tende para infinito e concentrao

    de enzima correspondente a metade da saturao.

    Grfico 5. Efeito da variao da concentrao de enzima livre na actividade enzimtica

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

    Act

    ivid

    ade

    en

    zim

    tic

    a (0

    -np

    M

    /min

    )

    Concentrao Enzima Livre (mg/mL)

    Exp

    Modelo

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    3.1.2. Estudo do Efeito da Variao da Concentrao de Substrato

    Os resultados seguintes pretendem avaliar o efeito da concentrao de

    substrato na actividade enzimtica e foram obtidos em ensaios temperatura

    de 37 C e com uma concentrao de enzima livre de 0,920 mg/mL.

    Os valores representados no grfico 5 sugerem um aumento da actividade

    enzimtica com o aumento da concentrao inicial de substrato.

    Grfico 6. Efeito da Variao da Concentrao de Substrato na enzima livre

    No entanto, e a partir dos 60 minutos de ensaio, a reaco progride mais

    lentamente pois a partir deste ponto que o substrato disponvel no meio

    reaccional para hidrlise diminui consideravelmente, havendo j, neste ponto

    da reaco de hidrlise com a enzima livre, muito produto formado. O produto

    formado pela hidrlise do o-npg , como j foi referido, o-np e galactose. Alguns

    trabalhos (45) referem que a galactose disponvel no meio funciona como

    inibidor competitivo da enzima -galactosidase, fazendo com que deste modo a

    reaco seja mais lenta e a enzima demonstre menor actividade enzimtica.

    A teoria de inibio da actividade da -galactosidase pela galactose foi antes

    confirmada em vrios estudos (22,46,49), principalmente na investigao da

    0,00

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    600,00

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    1200,00

    0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

    Co

    nce

    ntr

    ao

    de

    o-n

    p (

    uM

    )

    Tempo (min)

    2,5 mM

    5 mM

    7,5 mM

    10 mM

    12,5 mM

    15 mM

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    produo de galacto-oligossacridos atravs da utilizao da actividade

    transglicoltica desta enzima.

    Grfico 7. Actividade enzimtica da enzima livre s diferentes concentraes de substrato

    A influncia da concentrao de o-npg na actividade hidroltica da -

    galactosidase nas condies referidas anteriormente foi avaliada com

    determinao dos parmetros cinticos. Neste trabalho verificou-se que a

    actividade da -galactosidase favorecida com o aumento da concentrao de

    substrato de 0,25 at 12,5 mM (Grfico 6).

    O modelo de Michaelis-Menten {vo = (Vmax x [S])/(KM + [S])}, ajustado por

    regresso no linear, aos pontos experimentais obtidos nos ensaios de

    bioconverso (Grfico 6) permitiu a estimativa dos parmetros cinticos:

    velocidade mxima, Vmx, de 30,20 mM.min-1, constante de Michaelis-Menten

    (constante de afinidade pelo substrato), KM, de 5,27 mM e uma constante

    cataltica (kcat) de 32,83 M/min.mg. A constante cataltica corresponde ao

    nmero mximo de molculas de substrato, que so convertidas em produto,

    por unidade de tempo, por stio cataltico, quando a enzima se encontra

    saturada com o substrato.

    A eficincia cintica de uma enzima, relativamente a um substrato, avaliada

    pela constante de especificidade (kcat/KM), que d uma medida da rapidez, com

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    0 5 10 15 20

    Act

    ivid

    ade

    En

    zim

    tic

    a

    (

    M o

    -np

    /min

    )

    Concentrao de Substrato Inicial (mM)

    Exp

    Model

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    que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentraes. Esta

    constante foi de 0,00623 min-1.mg-1, valor ao qual a enzima atingiu o seu

    mximo de eficincia.

    Realizando uma anlise comparativa com estudos anteriores, nota-se que, a

    com mesma enzima mas proveniente de Kluyveromices fragilis, sob condies

    experimentais de pH e temperatura semelhantes, se obteve um KM de 1,7 mM

    (43), inferior ao valor de KM de 5,27 aqui obtido. J noutro estudo, de 2012, o

    valor de KM obtido nos ensaios com a enzima livre foi de 4,77 mM, tendo sido

    neste estudo utilizada exactamente a enzima proveniente tambm de

    Kluyveromyces lactis (30).

    Um estudo publicado em 2011 (45), realizado com -galactosidase de

    Aspergilus oryzae e sob condies experimentais favorveis a esta enzima,

    demonstra que a actividade enzimtica favorecida com as concentraes

    elevadas de substrato. Este estudo confirma os resultados aqui obtidos.

    3.1.3. Estudo do Efeito da Variao da Temperatura

    Os ensaios que culminaram na obteno destes resultados foram

    realizados com uma concentrao de substrato de 15mM e com uma

    concentrao de enzima livre de 0,920 mg/mL. Avaliando o efeito da variao

    da temperatura na actividade enzimtica,