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    01-Dec-2018
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  • Visite o website Fungitell.com para obter as instrues de utilizao no seu idioma.

    APLICAOO ensaio Fungitell um ensaio colorimtrico base de zimognio de protease para a deteo qualitativa de (13)--D-glucano no soro de doentes com sintomas de infeo fngica invasiva ou com condies clnicas que predisponham os doentes a tal infeo. A concentrao srica de (13)--D-glucano, um importante componente da parede celular de vrios fungos importantes do ponto de vista mdico1, pode ser utilizada como auxiliar no diagnstico de micoses profundas e de fungemias2. Um resultado positivo no indica o gnero do fungo que pode estar a causar a infeo.

    As titulaes de (13)--D-glucano devem ser utilizadas em conjunto com outros procedimentos de diagnstico, como cultura microbiolgica, exame histolgico de amostras de biopsia e exame radiolgico.

    IMPORTANTE Fornea estas informaes ao mdico que solicita o teste: Alguns fungos, como os pertencentes ao gnero Cryptococcus, produzem nveis de (13)--D-glucano muito baixos que podero no produzir um nvel de (13)--D-glucano srico suficientemente elevado para ser detetado pelo ensaio3,4. Tambm se observou que infees por fungos da ordem Mucorales, como Absidia, Mucor e Rhizopus1,4, paras os quais no se conhece atividade de produo de (13)--D-glucano, produzem titulaes de (13)--D-glucano sricas muito baixas. Alm disso, a fase de levedura de Blastomyces dermatitidis produz pouco (13)--D-glucano e poder no ser detetada pelo ensaio5.

    Inclua esta declarao ao apresentar os resultados de teste do ensaio Fungitell.

    RESUMO E EXPLICAOExiste uma incidncia crescente de infees fngicas por agentes patognicos oportunistas, sobretudo em doentes imunocomprometidos6,7,8. As doenas fngicas invasivas, como infees oportunistas, so frequentes em tumores malignos hematolgicos e em doentes com SIDA e correspondem a um nmero crescente de infees nosocomiais, sobretudo em doentes transplantados e outros doentes medicados com tratamentos imunossupressores9,10. Muitas doenas fngicas so adquiridas por inalao dos esporos fngicos do solo, detritos de plantas, sistemas de gesto do ar e/ou superfcies expostas. Alguns fungos oportunistas esto presentes no interior da pele ou sua superfcie, no trato intestinal e nas membranas mucosas11,12. O diagnstico de micoses e fungemias invasivas baseia-se normalmente em tcnicas de diagnstico ou radiolgicas no especficas. Recentemente, foram adicionados marcadores biolgicos de infeo fngica a mtodos de diagnstico disponveis2.

    Os agentes patognicos fngicos oportunistas incluem Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Exserohilum rostratum e Pneumocystis jirovecii. O (13)--D-glucano produzido por estes e por outros organismos pode ser detetado pelo ensaio Fungitell1,8,13,14.

    PRINCPIO DO PROCEDIMENTOO ensaio Fungitell mede o (13)--D-glucano. O ensaio baseia-se numa modificao da via do lisado de amebcitos de Limulus (LAL)15,16,17,18, Figura 1. O reagente Fungitell modificado para eliminar a reatividade de endotoxinas bacterianas e reagir apenas ao (13)--D-glucano atravs do lado da via mediado pelo fator G. O (13)--D-glucano ativa o fator G, um zimognio da serina protease. O fator G ativado converte a enzima de pr-coagulao inativa na enzima de coagulao ativa, que, por sua vez, cliva a paranitroanilida (pNA) a partir do substrato peptdico cromognico, Boc-Leu-Gli-Arg-pNA, criando um cromforo, a paranitroanilina, com absoro a 405 nm. O ensaio cintico Fungitell, descrito abaixo, baseia-se na determinao do aumento da taxa de densidade tica produzida por uma amostra. Esta taxa interpretada por comparao com uma curva padro de modo a produzir estimativas da concentrao de (13)--D-glucano na amostra.

    MATERIAIS FORNECIDOS COM O KIT FUNGITELL

    O kit Fungitell destina-se utilizao em diagnstico in vitro. Os seguintes materiais fornecidos com cada kit so suficientes para ensaios em 110 micropoos em duas placas de microtitulao (55 micropoos cada):

    1. reagente Fungitell, um LAL especfico do (13)--D-glucano liofilizado (dois frascos);

    2. tampo de reconstituio Pyrosol (dois frascos). Frascos adicionais de tampo de reconstituio Pyrosol (nmero de catlogo BC051) podem ser adquiridos em separado;

    3. padro do glucano, com o teor em (13)--D-glucano indicado no rtulo (dois frascos);

    4. gua grau de reagente (dois frascos);

    5. soluo de pr-tratamento alcalina (dois frascos).

    Todos os anteriores, com exceo do padro, no contm nveis interferentes de (13)--D-glucano.

    MATERIAIS NECESSRIOS MAS NO FORNECIDOSNenhum material pode conter glucano interferente. Os utenslios de vidro tm de ser despirogenados por calor seco durante pelo menos 7 horas a uma temperatura mnima de 235 C (ou um equivalente validado) para serem considerados adequados para a utilizao.

    1. pontas de pipetas* (250 l - n. ref. PPT25, 1000 l - n. ref. PPT10);

    2. pipetas com capacidade para administrao de volumes de 5 l-25 l e 100 l-1000 l;

    3. pipeta de repetio com pontas de seringa com 100 l de capacidade;

    4. tubos de ensaio* para a preparao da srie de padres (curva de calibrao) e combinao de reagentes de tratamento de soro. (12 mm x 75 mm - n. ref. TB240 ou 13 mm x 100 mm - n. ref. TB013);

    5. leitor de placa de incubao (37 C) com capacidade de leitura a 405 nm (de preferncia capaz de monitorizar dois comprimentos de onda, a 405 nm e a 490 nm) com um intervalo dinmico de, pelo menos, 2,0 unidades de absorvncia, juntamente com software de ensaio cintico informatizado adequado;

    6. tubos de conservao com tampa de rosca, estreis e sem glucano para distribuio de alquotas das amostras (a maioria dos tubos que so certificados como no contendo RNAse, DNAse e sendo apirognicos no contm nveis interferentes de (13)--D-glucano);

    7. Parafilm;

    8. microplacas com 96 micropoos.*

    * Estes produtos, fornecidos pela Associates of Cape Cod, Inc. (ACC), so certificados como no contendo nveis de glucanos interferentes.

    Cuidado as pipetas de vidro com tampes de algodo e as pontas de micropipetas com filtros de celulose so potenciais fontes de contaminao com glucano.

    ADVERTNCIAS E PRECAUESEste produto destina-se UTILIZAO EM DIAGNSTICO IN VITRO.

    O ensaio Fungitell exige uma ateno rigorosa tcnica e ao ambiente de teste. A formao completa do tcnico no mtodo de ensaio e em formas de evitar a contaminao so fundamentais para a eficcia do ensaio.

    1. Certas espcies fngicas produzem nveis muito baixos de (13)--D-glucano e no so habitualmente detetadas pelo ensaio Fungitell. Incluem o gnero Cryptococcus3,4 e tambm fungos da ordem Mucorales, como Absidia, Mucor e Rhizopus1,4. Alm disso, o Blastomyces dermatitidis, na sua forma de levedura, produz baixos nveis de (13)--D-glucano, pelo que no normalmente detetado pelo ensaio Fungitell5.

    2. No pipete qualquer material com a boca. No fume, no coma nem beba nas reas de manuseamento de espcimes ou reagentes do kit. Cumpra os regulamentos de segurana da empresa e locais.

    3. Prepare um ambiente limpo onde realizar o ensaio. Utilize materiais e reagentes que tenham certificao como no contendo nveis de fundo de (13)--D-glucano detetveis. Tenha em ateno que o glucano, bem como a contaminao fngica do corpo humano, vesturio, recipientes, gua e poeiras areas podem interferir com o ensaio Fungitell. Os materiais de celulose, como gaze, toalhetes e carto, podem contribuir com (13)--D-glucano para o ambiente onde o ensaio vai ser realizado.

    4. No utilize reagentes aps o fim do prazo de validade.

    5. Amostras descoradas ou turvas, tais como amostras muito hemolisadas ou lipmicas ou com bilirrubina excessiva podem originar interferncia tica com o ensaio. Caso tais amostras sejam testadas, os resultados dos testes devem ser examinados para evidncias de interferncia tica e/ou padres cinticos invulgares.

    6. Use vesturio protetor adequado e luvas sem p quando manusear os espcimes do doente.

    7. O soro de doentes sujeitos a hemodilise pode conter nveis elevados de (13)--D-glucano quando so utilizadas determinadas membranas de dilise em celulose19,20,38. A hemodilise com membranas de triacetato de celulose, de polissulfona ou de polimetilmetacrilato no parecem interferir com o ensaio.

    8. Gazes e compressas cirrgicas podem eliminar nveis elevados de (13)--D-glucano que podem contribuir para um resultado positivo transitrio no ensaio Fungitell, causado por contaminao, tal como foi observado em doentes ps-cirrgicos21,22.

    9. Produtos de fracionamento do sangue, como imunoglobulina e albumina intravenosas, tambm podem conter (13)--D-glucano que, se injetado ou perfundido, aumentar as titulaes sricas de (13)--D-glucano durante vrios dias23.

    10. No utilizar os kits com contedo danificado.

    11. Os materiais expostos a fluidos potencialmente contaminados (contendo agentes patognicos) tm de ser eliminados de forma consistente com os regulamentos locais.

    CONSERVAO DOS REAGENTESConserve todos os reagentes, tal como fornecidos, a uma temperatura de 2 C-8 C ao abrigo da luz. O reagente Fungitell reconstitudo deve ser conservado a uma temperatura de 2 C-8 C e utilizado dentro de 2 horas. Em alternativa, o reagente Fungitell reconstitudo pode ser congelado a -20 C durante at 20 dias, descongelado uma vez e utilizado.

    MANUSEAMENTO DE ESPCIMES1. Colheita de espcimes: As amostras de sangue podem ser colhidas em tubos de preparao de soro

    ou em tubos de separao de soro estreis para a preparao do soro.

    2. Conservao dos espcimes: As amostras de soro podem ser conservadas temporariamente a 2 C-8 C antes do ensaio ou congeladas a uma temperatura inferior ou igual a -20 C em caso de conservao prolongada.

    3. Identificao dos espcimes: Os espcimes devem ser identificados de forma clara de acordo com prtica