R ES

U LT

A D

O S

E D

IS C

U SS

à O

48

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

De seguida, são apresentados os resultados obtidos nos ensaios

realizados com a enzima β-galactosidase (E.C. 3.2.1.23) proveniente do

microrganismo Kluyveromyces lactis. Será feita uma apreciação dos valores

obtidos assim como uma comparação desses mesmos valores com estudos

semelhantes anteriormente realizados.

3.1. Ensaios com a Enzima Sóluvel Lactozym® 2600L

A enzima utilizada nestes ensaios foi a Lactozym® 2600L sob a forma de

solução. A β-galactosidase apresentou uma actividade de 2600 U por grama

de preparação enzimática. Esta preparação enzimática apresenta uma

densidade de 1,15 g/mL .

É também conhecida sob as denominações de β-galactosidase, Hydrolact,

Lactase ou Maxilact.

Todos os ensaios realizados com esta enzima foram efectuados a pH 6,8

pois é o pH reportado como o óptimo para esta enzima (43, 44, 45).

Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

enzima a Lactozym® 2600L na hidrólise do substrato padrão, o o-nitrofenol-β-

ᴅ-galactosideo (o-npg), nas várias condições experimentais.

Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrólise deste

substrato são a galactose e o-nitrofenol (o-np) que é um composto de cor

amarela.

3.1.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima

Os resultados que seguidamente são apresentados pretendem demostrar de

que modo a variação de concentração de enzima influencia a actividade

R ES

U LT

A D

O S

E D

IS C

U SS

à O

49

enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão,

o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.

Através da análise do gráfico 4., é possível observar que a formação de o-np

depende da concentração de enzima. A concentração de enzima mais elevada,

2,3 mg/mL, origina uma concentração de o-np também mais elevada e atinge

um pico máximo aos 45 min, decrescendo consideravelmente dos 60 aos 90

min.

Gráfico 4. Efeito da variação da concentração de enzima livre ao longo do tempo

O facto da concentração inicial de enzima ser elevada de enzima faz com que

o substrato seja rapidamente convertido, por um lado, e levando ao

aparecimento de galactose, por outro, pois é um produto da hidrólise

enzimática do substrato. A galactose é um inibidor competitivo da enzima

diminuído a sua actividade (27,43,46).

A concentração inicial de enzima de 0,920 mg/mL foi a que demonstrou

melhores resultados. De facto formou-se o-np durante um maior período de

tempo, tendo sido registado o seu pico de concentração aos 90 minutos de

ensaio.

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

C o

n ce

n tr

aç ão

d e

o -n

p (

u M

)

Tempo (min)

1,150 mg/mL

2,300 mg/mL

0,920 mg/mL

0,575 mg/mL

0,460 mg/mL

R ES

U LT

A D

O S

E D

IS C

U SS

à O

50

As concentrações de 0,575 e de 0,460 mg/mL apesar de terem registado

valores de actividade iniciais bastante aceitáveis, a partir dos 60 minutos de

ensaios originaram um patamar na conversão do o-npg (Gráfico 4.).

A concentração enzimática de 1,150 mg/mL, sendo a segunda mais elevada

só demonstrou actividade significativa nos primeiros 30 minutos de reacção,

atingindo o o-np um valor de concentração semelhante aos 90 minutos de

ensaio.

Na avaliação dos resultados no estudo do efeito da concentração de enzima

livre foi escolhida uma abordagem alternativa que recorre à equação clássica de

Henri-Michaelis–Menten, empregue por alguns autores e que sugere que a

velocidade inicial de hidrólise, vo pode ser expressa como função da

concentração inicial de enzima ([Eo]), ou seja: vo = (Vemax x [Eo])/(Ke + [Eo]).

A relação entre a velocidade inicial aumenta com o aumento de concentração

enzimática no entanto esse aumento não é linear, tendendo para estabilizar

aquando do emprego de soluções enzimáticas mais concentradas, devido à

saturação da superfície do substrato.

O modelo escolhido permite calcular o valor das duas constantes Vemax e Ke,

respectivamente 20,3 mM/min e 51 g/mL, e que correspondem à velocidade

máxima quando a concentração enzimática tende para infinito e à concentração

de enzima correspondente a metade da saturação.

Gráfico 5. Efeito da variação da concentração de enzima livre na actividade enzimática

0

5

10

15

20

25

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

A ct

iv id

ad e

e n

zi m

át ic

a (0

-n p

 M

/m in

)

Concentração Enzima Livre (mg/mL)

Exp

Modelo

R ES

U LT

A D

O S

E D

IS C

U SS

à O

51

3.1.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato

Os resultados seguintes pretendem avaliar o efeito da concentração de

substrato na actividade enzimática e foram obtidos em ensaios à temperatura

de 37 °C e com uma concentração de enzima livre de 0,920 mg/mL.

Os valores representados no gráfico 5 sugerem um aumento da actividade

enzimática com o aumento da concentração inicial de substrato.

Gráfico 6. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima livre

No entanto, e a partir dos 60 minutos de ensaio, a reacção progride mais

lentamente pois é a partir deste ponto que o substrato disponível no meio

reaccional para hidrólise diminui consideravelmente, havendo já, neste ponto

da reacção de hidrólise com a enzima livre, muito produto formado. O produto

formado pela hidrólise do o-npg é, como já foi referido, o-np e galactose. Alguns

trabalhos (45) referem que a galactose disponível no meio funciona como

inibidor competitivo da enzima β-galactosidase, fazendo com que deste modo a

reacção seja mais lenta e a enzima demonstre menor actividade enzimática.

A teoria de inibição da actividade da β-galactosidase pela galactose foi antes

confirmada em vários estudos (22,46,49), principalmente na investigação da

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

C o

n ce

n tr

aç ão

d e

o -n

p (

u M

)

Tempo (min)

2,5 mM

5 mM

7,5 mM

10 mM

12,5 mM

15 mM

R ES

U LT

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O S

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à O

52

produção de galacto-oligossacáridos através da utilização da actividade

transglicolítica desta enzima.

Gráfico 7. Actividade enzimática da enzima livre às diferentes concentrações de substrato

A influência da concentração de o-npg na actividade hidrolítica da β-

galactosidase nas condições referidas anteriormente foi avaliada com

determinação dos parâmetros cinéticos. Neste trabalho verificou-se que a

actividade da β-galactosidase é favorecida com o aumento da concentração de

substrato de 0,25 até 12,5 mM (Gráfico 6).

O modelo de Michaelis-Menten {vo = (Vmax x [S])/(KM + [S])}, ajustado por

regressão não linear, aos pontos experimentais obtidos nos ensaios de

bioconversão (Gráfico 6) permitiu a estimativa dos parâmetros cinéticos:

velocidade máxima, Vmáx, de 30,20 mM.min -1, constante de Michaelis-Menten

(constante de afinidade pelo substrato), KM, de 5,27 mM e uma constante

catalítica (kcat) de 32,83 M/min.mg. A constante catalítica corresponde ao

número máximo de moléculas de substrato, que são convertidas em produto,

por unidade de tempo, por sítio catalítico, quando a enzima se encontra

saturada com o substrato.

A eficiência cinética de uma enzima, relativamente a um substrato, é avaliada

pela constante de especificidade (kcat/KM), que dá uma medida da rapidez, com

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

A ct

iv id

ad e

E n

zi m

át ic

a

( µ

M o

-n p

/m in

)

Concentração de Substrato Inicial (mM)

Exp

Model

R ES

U LT

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O S

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à O

53

que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentrações. Esta

constante foi de 0,00623 min-1.mg-1, valor ao qual a enzima atingiu