3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · PDF file O 49 enzimática. Nestes ensaios foi...

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    3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

    De seguida, são apresentados os resultados obtidos nos ensaios

    realizados com a enzima β-galactosidase (E.C. 3.2.1.23) proveniente do

    microrganismo Kluyveromyces lactis. Será feita uma apreciação dos valores

    obtidos assim como uma comparação desses mesmos valores com estudos

    semelhantes anteriormente realizados.

    3.1. Ensaios com a Enzima Sóluvel Lactozym® 2600L

    A enzima utilizada nestes ensaios foi a Lactozym® 2600L sob a forma de

    solução. A β-galactosidase apresentou uma actividade de 2600 U por grama

    de preparação enzimática. Esta preparação enzimática apresenta uma

    densidade de 1,15 g/mL .

    É também conhecida sob as denominações de β-galactosidase, Hydrolact,

    Lactase ou Maxilact.

    Todos os ensaios realizados com esta enzima foram efectuados a pH 6,8

    pois é o pH reportado como o óptimo para esta enzima (43, 44, 45).

    Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

    enzima a Lactozym® 2600L na hidrólise do substrato padrão, o o-nitrofenol-β-

    ᴅ-galactosideo (o-npg), nas várias condições experimentais.

    Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrólise deste

    substrato são a galactose e o-nitrofenol (o-np) que é um composto de cor

    amarela.

    3.1.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima

    Os resultados que seguidamente são apresentados pretendem demostrar de

    que modo a variação de concentração de enzima influencia a actividade

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    enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão,

    o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.

    Através da análise do gráfico 4., é possível observar que a formação de o-np

    depende da concentração de enzima. A concentração de enzima mais elevada,

    2,3 mg/mL, origina uma concentração de o-np também mais elevada e atinge

    um pico máximo aos 45 min, decrescendo consideravelmente dos 60 aos 90

    min.

    Gráfico 4. Efeito da variação da concentração de enzima livre ao longo do tempo

    O facto da concentração inicial de enzima ser elevada de enzima faz com que

    o substrato seja rapidamente convertido, por um lado, e levando ao

    aparecimento de galactose, por outro, pois é um produto da hidrólise

    enzimática do substrato. A galactose é um inibidor competitivo da enzima

    diminuído a sua actividade (27,43,46).

    A concentração inicial de enzima de 0,920 mg/mL foi a que demonstrou

    melhores resultados. De facto formou-se o-np durante um maior período de

    tempo, tendo sido registado o seu pico de concentração aos 90 minutos de

    ensaio.

    0,00

    200,00

    400,00

    600,00

    800,00

    1000,00

    1200,00

    1400,00

    1600,00

    1800,00

    0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

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    o -n

    p (

    u M

    )

    Tempo (min)

    1,150 mg/mL

    2,300 mg/mL

    0,920 mg/mL

    0,575 mg/mL

    0,460 mg/mL

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    As concentrações de 0,575 e de 0,460 mg/mL apesar de terem registado

    valores de actividade iniciais bastante aceitáveis, a partir dos 60 minutos de

    ensaios originaram um patamar na conversão do o-npg (Gráfico 4.).

    A concentração enzimática de 1,150 mg/mL, sendo a segunda mais elevada

    só demonstrou actividade significativa nos primeiros 30 minutos de reacção,

    atingindo o o-np um valor de concentração semelhante aos 90 minutos de

    ensaio.

    Na avaliação dos resultados no estudo do efeito da concentração de enzima

    livre foi escolhida uma abordagem alternativa que recorre à equação clássica de

    Henri-Michaelis–Menten, empregue por alguns autores e que sugere que a

    velocidade inicial de hidrólise, vo pode ser expressa como função da

    concentração inicial de enzima ([Eo]), ou seja: vo = (Vemax x [Eo])/(Ke + [Eo]).

    A relação entre a velocidade inicial aumenta com o aumento de concentração

    enzimática no entanto esse aumento não é linear, tendendo para estabilizar

    aquando do emprego de soluções enzimáticas mais concentradas, devido à

    saturação da superfície do substrato.

    O modelo escolhido permite calcular o valor das duas constantes Vemax e Ke,

    respectivamente 20,3 mM/min e 51 g/mL, e que correspondem à velocidade

    máxima quando a concentração enzimática tende para infinito e à concentração

    de enzima correspondente a metade da saturação.

    Gráfico 5. Efeito da variação da concentração de enzima livre na actividade enzimática

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

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    ad e

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    át ic

    a (0

    -n p

     M

    /m in

    )

    Concentração Enzima Livre (mg/mL)

    Exp

    Modelo

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    3.1.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato

    Os resultados seguintes pretendem avaliar o efeito da concentração de

    substrato na actividade enzimática e foram obtidos em ensaios à temperatura

    de 37 °C e com uma concentração de enzima livre de 0,920 mg/mL.

    Os valores representados no gráfico 5 sugerem um aumento da actividade

    enzimática com o aumento da concentração inicial de substrato.

    Gráfico 6. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima livre

    No entanto, e a partir dos 60 minutos de ensaio, a reacção progride mais

    lentamente pois é a partir deste ponto que o substrato disponível no meio

    reaccional para hidrólise diminui consideravelmente, havendo já, neste ponto

    da reacção de hidrólise com a enzima livre, muito produto formado. O produto

    formado pela hidrólise do o-npg é, como já foi referido, o-np e galactose. Alguns

    trabalhos (45) referem que a galactose disponível no meio funciona como

    inibidor competitivo da enzima β-galactosidase, fazendo com que deste modo a

    reacção seja mais lenta e a enzima demonstre menor actividade enzimática.

    A teoria de inibição da actividade da β-galactosidase pela galactose foi antes

    confirmada em vários estudos (22,46,49), principalmente na investigação da

    0,00

    200,00

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    800,00

    1000,00

    1200,00

    0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

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    p (

    u M

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    Tempo (min)

    2,5 mM

    5 mM

    7,5 mM

    10 mM

    12,5 mM

    15 mM

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    produção de galacto-oligossacáridos através da utilização da actividade

    transglicolítica desta enzima.

    Gráfico 7. Actividade enzimática da enzima livre às diferentes concentrações de substrato

    A influência da concentração de o-npg na actividade hidrolítica da β-

    galactosidase nas condições referidas anteriormente foi avaliada com

    determinação dos parâmetros cinéticos. Neste trabalho verificou-se que a

    actividade da β-galactosidase é favorecida com o aumento da concentração de

    substrato de 0,25 até 12,5 mM (Gráfico 6).

    O modelo de Michaelis-Menten {vo = (Vmax x [S])/(KM + [S])}, ajustado por

    regressão não linear, aos pontos experimentais obtidos nos ensaios de

    bioconversão (Gráfico 6) permitiu a estimativa dos parâmetros cinéticos:

    velocidade máxima, Vmáx, de 30,20 mM.min -1, constante de Michaelis-Menten

    (constante de afinidade pelo substrato), KM, de 5,27 mM e uma constante

    catalítica (kcat) de 32,83 M/min.mg. A constante catalítica corresponde ao

    número máximo de moléculas de substrato, que são convertidas em produto,

    por unidade de tempo, por sítio catalítico, quando a enzima se encontra

    saturada com o substrato.

    A eficiência cinética de uma enzima, relativamente a um substrato, é avaliada

    pela constante de especificidade (kcat/KM), que dá uma medida da rapidez, com

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    0 5 10 15 20

    A ct

    iv id

    ad e

    E n

    zi m

    át ic

    a

    ( µ

    M o

    -n p

    /m in

    )

    Concentração de Substrato Inicial (mM)

    Exp

    Model

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    que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentrações. Esta

    constante foi de 0,00623 min-1.mg-1, valor ao qual a enzima atingiu