Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e ... · PDF...

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  • Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e

    Bioqumicos

    PRODUO DE -GLUCOSIDASE EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

    RECOMBINANTE E AVALIAO DE SEU EMPREGO NO PROCESSO DE

    HIDRLISE ENZIMTICA SIMULTNEA FERMENTAO PARA A

    PRODUO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAO

    Vernica Ferreira

    Tese apresentada ao Curso de Ps-

    Graduao em Tecnologia de

    Processos Qumicos e Bioqumicos

    para Obteno do Ttulo de Doutor

    em Cincias (DSc)

    Orientador: Prof. Nei Pereira Jr, PhD

    Escola de Qumica

    2010

  • ii

    Produo de -glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliao de seu emprego no processo de hidrlise

    enzimtica simultnea fermentao para a produo de etanol de

    segunda gerao

    Vernica Ferreira

    Tese apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de

    Processos Qumicos e Bioqumicos para Obteno do Ttulo de Doutor

    em Cincias (DSc)

    Escola de Qumica

    Universidade Federal do Rio de Janeiro

    2010

  • iii

    Produo de -glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliao de seu emprego no processo de hidrlise

    enzimtica simultnea fermentao para a produo de etanol de

    segunda gerao

    Vernica Ferreira

    Tese submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de

    Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade

    Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno

    do grau de Doutora em Cincias, sob orientao do Prof. Nei Pereira Jr.

    Aprovada por:

    ________________________________ Prof. Nei Pereira Junior, PhD

    (Orientador-Presidente da Banca)

    ________________________________ Prof. Eliana Moss Alhadeff, DSc - UFRJ

    ________________________________ Prof. Fernando Araripe Gonalves Torres, PhD - UNB

    ________________________________

    Maria Antonieta Ferrara, DSc - FioCruz

    ________________________________ Prof. Maria Antonieta P. G. Couto, DSc - UFRJ

    ________________________________ Ldia Maria Melo Santa Anna, DSc PETROBRS

    EQ/UFRJ 2010

  • iv

    FICHA CATALOGRFICA

    Ferreira, Vernica. Produo de -glucosidase em Saccharomyces cerevisiae recombinante e avaliao de seu emprego no processo de hidrlise enzimtica simultnea fermentao para a produo de etanol de segunda gerao / Vernica Ferreira Rio de Janeiro, 2010.

    xx, 132 f, 29,7 cm. Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de

    Janeiro - UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, 2010.

    Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.

    1. -glucosidase 2. Expresso heterloga 3. Saccharomyces cerevisiae 4. SSF 5. Bioetanol

    I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Qumica. Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos.

  • v

    Agradecimento Especial...

    Ao querido e estimado Prof. Nei, pela orientao,

    constante estmulo, crdito, amparo e confiana.

  • vi

    Mas preciso ter manha

    preciso ter graa

    preciso ter sonho sempre

    Quem traz na pele essa marca

    Possui a estranha mania

    De ter f na vida...

    Milton Nascimento

  • vii

    AGRADECIMENTOS

    A Deus por me dar a vida e me permitir todas os momentos e conquistas;

    Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr., pela excelncia e

    singularidade no desempenho de suas competncias que, somadas, elevam

    a estrutura e qualidade de seu grupo e de nossa Universidade;

    Ao Walber, meu amado marido, por todo companheirismo, pacincia e

    compreenso;

    Ao Antnio, meu filho querido, melhor presente de Deus, responsvel por

    meu mais novo e mais completo conceito de felicidade;

    A minha famlia, por toda certeza, amparo, constante confiana e presena,

    e principalmente, pelo amor incondicional;

    Ao Luizo, amigo de todas as horas, pelo fundamental apoio estrutural e

    pela indispensvel atuao administrativa. Alm do apoio, amizade e

    confiana constante;

    Ao amigo Gabriel Betancur, meu anjo da guarda, que mais uma vez

    exercitou sua pacincia e capacidade de ajudar;

    As queridssimas alunas de iniciao cientfica, Mariana de Oliveira Faber,

    Sabrina da Silva Mesquita e Ludmylla pelo companheirismo e amizade

    sincera solidificada durante os longos e maravilhosos momentos

    experimentais;

    Ao querido amigo Roberto Maeda, carinhosamente chamado de Maedo,

    por toda pacincia, ajuda e constante presena;

    Aos colegas e amigos do laboratrio 121 pelo companheirismo e por

    tornarem o laboratrio 121 um local extremamente agradvel e alegre;

    Ao amigo Maurlio Mesquita por todo auxlio, amizade e confiana;

    Ao professor Fernando Araripe Gonalves Torres, a professora Lidia Maria

    Pepe de Moraes e aos seus orientandos que me acolheram em seus

    laboratrios com toda dedicao, carinho e pacincia para compartilhar

    seus conhecimentos de biologia molecular;

  • viii

    As professoras Andra Salgado, Maria Antonieta, Eliana Alhadeff e Eliana

    Flvia pela amizade e por todos os ensinamentos e momentos didticos

    compartilhados;

    A todos os professores do Departamento de Engenharia Bioqumica que

    contriburam para o meu crescimento acadmico e profissional;

    Ao amigo Absai por todo auxilio analtico;

    Ao CENPES/Petrobras pela oportunidade e apoio financeiro e estrutural;

    Aos funcionrios da secretria de Ps-graduao da Escola de Qumica que

    estiveram presentes durante a realizao deste trabalho;

    Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e

    Bioqumicos da Escola de Qumica da UFRJ pela oportunidade;

    CAPES, pela bolsa e auxlio financeiro.

  • ix

    R E S U M O Produo de -glucosidase em Saccharomyces cerevisiae

    recombinante e avaliao de seu emprego no processo de hidrlise enzimtica simultnea fermentao para a produo de etanol de

    segunda gerao

    Vernica Ferreira

    Orientador: Prof. Nei Pereira Jr., PhD.

    Atualmente, o grande desafio das grandes potenciais mundiais a reduo dos custos envolvidos nos processos de produo do etanol de segunda gerao. Uma forma que pode levar a reduo de parte desses custos a utilizao de uma linhagem capaz de suplementar o preparado enzimtico empregado na produo de etanol de segunda gerao em sistemas de fermentao e sacarificao simultneas (SSF). O presente trabalho objetivou a produo em biorreator de -glucosidase 4 de Humicola grisea var. thermoidea em Saccharomyces cerevisiae recombinante e sua utilizao na obteno de bioetanol a partir de celulignina pr-tratada de bagao de cana-de-acar. Inicialmente, selecionou-se o melhor clone produtor de -glucosidase, a maioria dos clones apresentou crescimento e produo enzimtica em meio contendo apenas glicose e tambm em meio contendo glicose e celobiose. A quantidade mxima de atividade -glucosidsica apresentada foi 6 U L-1 e 43 U L-1 em meio de glicose e celobiose e em meio de glicose, respectivamente. Adicionalmente, avaliou-se a melhor fonte de nitrognio e a melhor relao C/N a ser empregada na produo da enzima em biorreator. O meio suplementado com extrato de levedura como fonte de nitrognio, e glicose como fonte de carbono, com a relao C/N de 13 forneceu os maiores valores de atividade -glucosidsica (800 U L-1). Posteriormente, foi avaliada a produo de -glucosidase em biorreator conduzido em batelada simples e batelada alimentada atravs de alimentao de glicose ou glicose e extrato de levedura por pulsos e contnua. A linhagem utilizada apresentou produo enzimtica associada ao crescimento celular e apresentou atividade enzimtica extracelular na presena de glicose residual. Em cultivos conduzidos em regime de batelada alimentada por pulsos de glicose e extrato de levedura obteve-se 3000 U L-1, correspondendo a uma produtividade volumtrica de atividade enzimtica total de 63 U L-1 g-1 em 48 horas de processo. Finalmente, foi avaliada a utilizao da levedura recombinante na produo de etanol de diferentes fontes celulsicas, CMC, AVICEL e celulignina de bagao de cana-de-acar pr-tratado. Celulignina de bagao de cana-de-acar pr-tratado forneceu a maior concentrao de etanol 52,69 g L-1, representando uma eficincia de fermentao de 69% e produtividade volumtrica de 1,18 g L-1 h-1. Concluindo, a levedura utilizada no presente trabalho uma linhagem recombinante capaz de produzir elevadas concentraes de enzima -glucosidase intracelular e extracelular e apresenta grande robustez para ser utilizada como agente cataltico em processo de sacarificao e fermentao simultneas. Logo, neste trabalho foi possvel produzir a enzima -glucosidase para posterior suplementao em consrcios enzimticos, bem como, suplementar o processo de obteno de bioetanol de lignocelulsico via fermentao e sacarificao simultneas.

  • x

    ABSTRACT Production of -glucosidase in recombinant Saccharomyces cerevisiae and evaluation of its use in the enzymatic hydrolysis simultaneous to

    fermentation for second-generation ethanol production

    Vernica Ferreira

    Advisor: Nei Pereira Jr., PhD In these days, the great challenge of the world powers is the reduction of involved costs in the production processes of second-generation ethanol. The use of a strain capable of supplementing the enzymatic blend used in the second-generation ethanol production in Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) systems is a way that could lead to a reduction in part of these costs. This work aimed to produce -glucosidase 4 from Humicola grisea var. thermoidea in recombinant Saccharomyces cerevisiae and its further use in