Proteína recombinante

β-Lactamasa

Procedimiento• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con

vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL)• Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD600 0.6-0.8• Apartar 1 mL (T0, Control negativo) e inducir el resto de

cultivo con IPTG 0.5 ó 1 mM (final)• Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30

min por 2 h.• Tomar 50 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar

(10 min a 95 ͦC). Cargar 25 µL y correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la construcción:

• En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas:

• 1) β-lactamasa• 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la

membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) • Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-

lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis• Pero… al parecer esto sólo es teoría…

RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….

2h 1.5 h 1h 0

Después de la inducción

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

cDNA

Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original.

Proteínas recombinantes

Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria.....Estructura terciaria y cuaternariamodificaciones post-traduccionalesIncompatibilidad de codones.... depende de la complejidad de la proteína

Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias:

fácil de cultivarfácil de modificar genéticamentetrabajo rápidoalto rendimiento (80%)ahorro de $$$$$

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Clonación de DNADecisiones a tomar…

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped •(E. coli)

Ajuste de condiciones

Vector híbrido o recombinante

Clonación/Síntesis de Genes

Optimización

OPERON LAC

Vector de clonación pET-24a(+)

Selección de bacterias transformadas

Leaking o Goteo

• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características en su genoma:

Cromosoma de E. coli

Análogos de lactosa

Diferencias entre DH5alfa y BL21(DE3)

• DH5 alfa: tiene al gen recA mutado, no puede realizarrecombinación heteróloga (asegura la estabilidad delinserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo ladigestión del plásmido. Esta cepa es competente para laselección de colonias azules y blancas.

• BL21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos alas proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasaT7 (cepa DE3) que se induce con IPTG.

Problemas…

BL21

Inducción

Purificación de la proteína recombinante

Proteína GFP

Purificación de la proteína recombinante

https://www.youtube.com/watch?v=r2P1S_U3_pA

Clonación tradicional

Gateway cloning