PERCOBAANIIKINETIKAREAKSIENZIM

PENDAHULUAN Enzim adalah protein yang mengkatalisis reaksi-reaksi biologi. Sebagai katalis, enzimmempengaruhi laju pada saat kesetimbangan dicapai, tetapi tidak mempengaruhikesetimbangantotalsuatureaksi.Enzimmembantuterjadinyareaksidenganmenurunkanenergiaktivasipembentukankeadaantransisisubstratmenjadiprodukdibandingkanprosesyangtidakdikatalisis. Laju awal (Vo) dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnyakonsentrasi substrat hingga dicapai keadaan di mana penambahan substrat tidak lagimeningkatkan laju awal reaksi. Keadaandimana laju awalmaksimum (Vmax) dicapai padakondisisubstratjenuh,diilustrasikandenganGambar1.Pengamatanini,sepertiyangterjadipada reaksi enzimatis atau hidrolisis substrat tunggal, telah dijelaskan dengan postulatreaksiberikut,dimanaEadalahenzim,Sadalahsubstrat,danPadalahproduk:

E+S ES E+P

Jadi, reaksi berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). BilasemuaenzimadalahdalamkeadaanES(sistemdijenuhkanolehsubstrat),makalajureaksiakanmencapainilaimaksimal(Vmax).

Gambar2.1.Hubungankonsentrasisubstratdanlajuawaldalamreaksienzimatis MichaelisdanMenten,dankemudianBriggsdanHaldane,menggunakanskemareaksidi atasuntukmenurunkanpersamaanmatematik yangmenggambarkanhubunganantaralajuawaldankonsentrasisubstrat.PersamaanMichaelis-Mententersebutadalah

[ ][ ]SKSV

M

max0 +=ν

k3 k1

k2

Konsentrasi substrat [S]

½ Vmax

v0

Vmax

k4

KM

Dalampersamaan ini, Vmax danV0 adalah lajumaksimumdan laju awal reaksi, [S] adalahkonsentrasi substrat, danKM adalah konstantaMichaelis yangnilainya samadengan (k2 +k3)/k1.PERCOBAANAlat:Stopwatch Tabungreaksi PengadukkecilInkubatorair50oC Pipetukur1mL,5mL,10mL Pipetseukuran1mLSentrifugaklinik Tabungsentrifuga KertassaringKuvet Spektrofotometer Gelaskimia50mLBahan:- LarutanTCA20% -LarutanTripsin

- Larutankasein2%(b/v) -LarutanNaOH0,5M- Buferfosfat0,1M(pH8,0) -ReagenFolinCiocalteuPERHATIAN!!!Hati-hatibekerjadenganTCAkarenabersifatkorosif,hindarikontak langsungdengankulitdanmata. Bila terjadi kontak dengan kulit ataumata, cuci sesegeramungkin dengan airyangbanyak.Prosedur:

No. Tabung Kasein(mL) BuferFosfat(mL) Tripsin(µL)

I t=0t=15

0,10,1

2,92,9

250250

II t=0t=15

0,20,2

2,82,8

250250

III t=0t=15

0,40,4

2,62,6

250250

IV t=0t=15

0,50,5

2,52,5

250250

V t=0t=15

1,01,0

2,02,0

250250

Waktuinkubasit=15menit§ Inkubasi masing-masing tabung yang berisi kasein dan buffer fosfat beserta

pengaduknya selama 5 menit pada inkubator 35 oC. Sambil diaduk perlahan-lahan

(jangansampaiberbusa),selanjutnyatambahkanlarutantripsin(sesuaidengantabeldiatas).

§ Inkubasi tepat 15 menit dalam inkubator 35 oC dihitung mulai tripsin ditambahkan,reaksi diberhentikan dengan penambahan 1,5 mL TCA 20% ke dalammasing-masingtabung disertai pengadukan yang kuat. Diamkan selama 30 menit dalam air es agarpengendapanberlangsungsempurna.

§ Selanjutnyasentrifugaselama10menitkemudiansaringmelaluikertassaring.§ FiltratdikerjakanmenurutcaraANSON(lihatdibawah).

Waktut=0menit§ Dalamtabungreaksiyangberisipengaduk,masukkanlarutanbuferdanlarutantripsin,

tambahkanmasing-masing1,5mLlarutanTCA20%inkubasi30menitdalampenangas35 oC. Terakhir tambahkan larutan kasein (semua pengukuran sesuai tabel). Diamkanselama30menitdalamaires,selanjutnyasentrifuga10menit,kemudiansaringmelaluikertassaring.FiltratdikerjakanmelaluicaraANSON(lihatdibawah).

MetodeANSON§ Campurkan 1 mL TCA-Filtrat (dari percobaan di atas) dengan 2 mL NaOH 0,5 M.

Tambahkan0,5mLreagenFolin-Ciocalteu,aduk.Diamkan10menit,kemudiantetapkanserapannyapada650nm.

TugasdanPertanyaan:1. Buatgrafikyangmenggambarkanhubunganantara1/vterhadap1/S.2. DarigrafiktentukannilaiVmaxdanKM.3. Apa yang harus diperbuat seandainya warna larutan yang hendak diukur dengan

spektrofotormeterituterlalugelap?TUGASPENDAHULUAN1. Faktorapasajayangmempengaruhilajureaksienzim?Jelaskan!2. Turunkan persamaan kinetika enzim Michaelis-Menten dengan pendekatan teori

keadaantunak(steadystate)yangdikemukakanolehBriggsdanHaldane?3. BuktikanbahwanilaiKMsamadengankonsentrasisubstratpadasaatVo=½VMAX4. Apapengertianistilah-istilahberikut:

a. Unitaktivitasb. Aktivitasspesifikc. Aktivitastotal

PUSTAKA:Clark,J.M.andSwitzer,R.L.(1976).ExperimentalBiochemistry,2nded.,W.HFreemanandCompany,SanFransisco,USA