LAPORAN TERBAIK

PRAKTIKUM KIMIA V

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE

Disusun Oleh :

1 Arif Nurdiansyah NIM. 24030110141024

2 Delvina Maris NIM. 24030110120010

3 Dinar F.Ramadhani NIM. 24030110141006

4 Nyken Herlyna NIM. 24030110140032

5 Resti Puteri Utami NIM. 24030110141018

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2012

ABSTRAK

Percobaan ‘Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan untuk memperoleh enzim

α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah

jagung manis yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase merupakan enzim yang

dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak

dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip dari percobaan ini

yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara

salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein

yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari

permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian

protein yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses

pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran). Hasil

yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah murni. Dimana semakin besar

penambahan amonium selfat maka semakin kecil endapan yang terbentuk, dengan kata lain

enzim semakin murni. Hasil uji kualitatif setelah penambahan amilum dan larutan iodin yaitu,

Fraksi I berwana ungu pudar, Fraksi II berwana ungu pudar, Fraksi III berwana ungu pudar, dan

Fraksi IV berwana ungu kecokelatan pudar.

Kata kunci: Enzim α-amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Jagung Manis

PERCOBAAN V

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE

I. TUJUAN

Memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui memurnikan tahap awal

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1.Enzim

Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Enzim

telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia

lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan

bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease.

Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim

dibandingkan katalis biasa adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi;

bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan

selektif terhadap subtrat tertentu.

        Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak tahan panas yaitu disebut

dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan protein adalah bagian yang aktif dan

diberi nama gugus prostetik, biasanya berupa logam seperti besi, tembaga , seng atau

suatu bahan senyawa organic yang mengandung logam. Apoenzim dan gugus prostetik

merupakan suatu kesatuan yang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang

apoenzim dan gugus prospetiknya tidak menyatu.

(Azmi, 2006)

II.2.Enzim α-amilase

Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau berfungsi

menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang

lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa

amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim

enzim alfa amilase bekerja optimum pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60oC. Jika suhu

ditingkatkan, pH optimum juga meningkat sampai sekitar 7. Jika α-amilase berasal dari

Bacillus licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan hasil utama maltoheksosa,

malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih tinggi (8 – 10%). enzim alfa amilase

mampu meningkatkan rasa manis pada ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa

amilase yang mampu menghidrolisis pati pada pisang menjadi gula lain yang lebih

sederhana.

(Darmajana and Agustina, 2008)

II.3.Komponen Enzim Substrat

Enzim merupakan senyawa organik berupa protein yang berfungsi sebagai katalis

dalam metabolisme tubuh, sehingga disebut juga biokatalisator.

Komponen penyusun enzim terdiri dari :

1. Apoenzim, yaitu bagian enzim aktif yang tersusun atas protein yang bersifat labil

(mudah berubah) terhadap faktor lingkungan, dan

2. Kofaktor,yaitu komponen non protein yang berupa :

a. Ion-ion anorganik (aktivator)

Berupa logam yang berikatan lemah dengan enzim, Fe, Ca, Mn, Zn, K, Co. Ion

klorida, ion kalsium merupakan contoh ion anorganik yang membantu enzim

amilase mencerna karbohidrat (amilum)

b. Gugus prostetik

Berupa senyawa organik yang berikatan kuat dengan enzim, FAD (Flavin Adenin

Dinucleotide), biotin, dan heme merupakan gugus prostetik yang mengandung zat

besi berperan memberi kekuatan ekstra pada enzim terutama katalase,

peroksidae,  sitokrom oksidase.

c. Koenzim

Berupa molekul organik non protein kompleks, seperti NAD (Nicotineamide

Adenine Dinucleotide), koenzim-A, ATP, dan vitamin yang berperan dalam

memindahkan gugus kimia, atom, atau elektron dari satu enzim ke enzim lain.

(Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, and Witarto, 2008)

II.4.Sifat-Sifat Enzim

1. Enzim adalah Protein

Sebagai protein enzim memiliki sifat seperti protein, yaitu sangat dipengaruhi oleh

kondisi lingkungan, seperti suhu, pH, konsentrasi substrat). Jika lingkungannya tidak

sesuai, maka enzim akan rusak atau tidak dapat bekerja dengan baik.

2. Bekerja secara khusus/spesifik

Setiap enzim memiliki sisi aktif yang sesuai hanya dengan satu jenis substrat, artinya

setiap enzim hanya dapat bekerja pada satu substrat yang cocok dengan sisi aktifnya.

3. Berfungsi sebagai katalis

Meningkatkan kecepatan reaksi kimia tanpa merubah produk yang diharapkan tanpa

ikut bereaksi dengan substratnya, dengan demikian energi yang dibutuhkan untuk

menguraikan suatu substrat menjadi lebih sedikit.

4. Diperlukan dalam jumlah sedikit

Reaksi enzimatis dalam metabolisme hanya membutuhkan sedikit sekali enzim untuk

setiap kali reaksi.

5. Bekerja bolak-balik

Enzim tidak mempengaruhi arah reaksi, sehingga dapat bekerja dua arah (bolak-balik).

Artinya enzim dapat menguraikan substrat menjadi senyawa sederhana, dan

sebaliknya enzim juga dapat menyusun senyawa-senyawa menjadi senyawa tertentu.

6. Enzim bersifat khusus terhadap suatu substrat tertentu yang dapat diikat dan jenis

reaksinya.

7. Kerja enzim dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi, dll.

(Deswita, 2006)

II.5.Cara kerja Enzim

Cara enzim bekerja adalah dengan membentuk senyawa enzim-substrat, kemudian

menghasilkan suatu produk tanpa merubah senyawa enzim itu sendiri, setelah produk

terbentuk maka enzim akan melepaskan diri untuk membentuk senyawa baru dengan

substrat yang lain.

Ada 2 (dua) cara kerja enzim :

1. Lock and key (gembok dan anak kunci)

Setiap enzim memiliki sisi aktif yang tersusun dari sejumlah asam amino. Bentuk sisi

aktif ini sangat spesifik, sehingga hanya molekul dengan bentuk tertentu yang dapat

menjadi substrat bagi enzim.

2. Induced fit (induksi pas)

Sisi aktif enzim merupakan bentuk yang tidak kaku (fleksibel). Ketika substrat

memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif berubah bentuk sesuai dengan bentuk

substrat kemudian terbentuk kompleks enzim-substrat. Pada saat produk sudah

terlepas dari kompleks, maka enzim lepas dan kembali bereaksi dengan substrat lain.

(Deswita, 2006)

II.6.Faktor – faktor yang mempengaruhi kerja enzim

a. Temperatur

Karena enzim tersusun dari protein, maka enzim sangat peka terhadap temperature.

Temperature yang terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein. Temperature

yang terlalu rendah dapat menghambat reaksi. Pada umumnya temperatur optimum

enzim adalah 30 – 400C. Kebanyakan enzim tidak menunjukkan reaksi jika suhu turun

sampai 00c , namun enzim tidak rusak, bila suhu normal maka enzim akan aktif

kembali . enzim tahan pada suhu rendah, namun rusak diatas suhu 500c.

b. Perubahan pH

Enzim juga sangat terpengaruh oleh pH. Perubahan pH dapat mempengaruhi

perubahan asam amino kunci pada sisi aktif enzim sehingga menghalangi sisi aktif

berkombinasi dengan substratnya. pH optimum yang diperlukan berbeda – beda

tergantung jenis enzimnya.

c. Konsentrasi enzim dan substrat

Agar reaksi berjalan optimum, maka perbandingan jumlah antara enzim dan substrat

harus sesuai. Jika enzim terlalu sedikit dan substrat terlalu banyak reaksi akan berjalan

lambat bahkan ada substrat yang tidak terkatalisasi. semakin banyak enzim, reaksi

akan semakin cepat.

d. Adanya activator

Aktivator adalah zat yang dapat mengaktifkan dan menggiatkan kerja enzim.

Contohnya ion klorida, yang dapat mengaktifkan enzim amilase.

e. Adanya inhibitor

Inhibitor adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Berdasarkan cara kerjanya,

inhibitor terbagi dua, inhibitor kompetitif, inhibitor nonkompetitif, inhibitor umpan

balik, inhibitor represor, inhibitor alosterik.

f. Adanya induktor

Induktor adalah suatu substrat yang dapat merangsang pembentukan enzim. Misal,

laktosa dapat menginduksi pembentukan enzim beta galaktosidase. Umumnya

pemberian nama enzim didasarkan atas nama substrat yang dikatalis atau daya

katalisnya dengan penambahan kata-ase. Misal proteinase adalah enzim yang dapat

mengkatalis pemecahan protein.

(Azmi, 2006)

II.7.Inhibitor Enzim

Seringkali enzim dihambat oleh suatu zat yang disebut inhibitor, ada dua jenis inhibitor

yaitu sebagai berikut:

a. Inhibitor kompetitif

Inhibitor kompetitif adalah inhibitor yang bersaing aktif dengan substrat untuk

mendapatkan situs aktif enzim. Inhibitor ini disebabkan oleh senyawa tertentu yang

mempunyai struktur mirip dengan substrat saat reaksi enzim akan terjadi. Misal, sianida

bersaing dengan oksigen dalam pengikatan Hb.

Pada penghambatan ini zat – zat penghambat mempunyai struktur yang mirip dengan

struktur substrat. Dengan demikian baik substrat maupun zat penghambat berkompetisi

atau bersaing untuk bersatu dengan sisi aktif enzim , jka zat penghambat lebih dulu

berikatan dengan sisi aktif enzim , maka substratnya tidak dapat lagi berikatan dengan

sisi aktif enzim.

b. Inhibitor nonkompetitif

Inhibitor nonkompetitif adalah inhibitor yang melekat pada sisi lain selain situs aktif

pada enzim, yang lama kelamaan dapat mengubah sisi aktif enzim. Inhibitor umpan

balik disebabkan oleh hasil akhir suatu rangkaian reaksi enzim yang menghambat kerja

enzim pada reaksi pertama. Pada penghambatan ini, substrat sudah tidak dapat berikatan

dengan kompleks enzim- inhibitor, karena sisi aktif enzim berubah.

(Bahagiawati,

2005)

II.8. Inhibitor α-amilase

Inhibitor α-amilase adalah protein yang menghambat enzim

amilase di dalam saluran pencernaan (midgut) serangga. Enzim

amilase diperlukan oleh serangga, terutama serangga yang makan biji-

bijian dan ubi yang kaya dengan pati. Pati ini harus hidrolisis menjadi

molekul karbohidrat yang lebih sederhana (kecil) seperti disakarida

dan monosakarida, agar dapat digunakan dalam sistem metabolisme

serangga. Dengan dihambatnya pemecahan pati oleh inhibitor α-

amilase maka serangga tidak mendapatkan kebutuhan karbohidratnya,

sehingga dapat berakibat fatal bagi serangga tersebut. Beberapa jenis

inhibitor α-amilase telah diisolasi dari berbagai biji tanaman, seperti

Phaseolus vulgaris dan Triticum aestivum. Inhibitor α-amilase dari P.

vulgaris menghambat aktivitas amilase pada ekstrak kasar dari midgut

serangga Lepidoptera, seperti Spodoptera littoralis, Agrotis ipsilon, dan

Plodia interpunctella (Gutierrez et al. 1993). Inhibitor ini juga

menghambat aktivitas amilase di midgut Callosobruchus maculatus

dan Tribolium confusum

(Bahagiawati,

2005)

II.9. Fraksinasi dalam Pemurnian kitin deasetilase

Pemurnian fraksi dilakukan dengan kromatografi pertukaran anion. Hasil

pemurnian dengan kromatografi pertukaran anion menunjukkan bahwa

kitin deasetilase memiliki 3 (tiga) buah fraksi a8ktif dengan aktivitas

tertinggi pada fraksi ke-76. Karakterisasi biokimiawi menunjukkan bahwa

kitin deasetilase mempunyai pH dan suhu optimum masing-masing 8 dan

55 oC, stabil terhadap panas selama 5 jam. Aktivitas enzim dihambat oleh

ion logam Mn, Ni dan Ca (1 mM), namun tidak dipengaruhi oleh EDTA. Ion

Mg dan Na-asetat dapat meningkatkan aktivitasnya. Hasil analisis SDS-

PAGE menunjukkan adanya dengan perkiraan berat molekul 15-67 kDa.

(Rochima,

2005)

II.10. Klasifikasi Enzim

2.10.1 Oksidoreduktase

Mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi, dan biasanya menggunakan koenzim

NAD+ dan NADP+. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial:

Dehidrogenase, Oksidase, dan Hidroksilase.

2.10.2 Transferase

Mengakatalisis pemindahan gugus tertentu, seperti gugus 1-

karbon, gugus aldehid, dan keton, gugus alkil, gugus glikosil,

gugus fosfat dan gugus yang mengandung S. Yang termasuk

enzim ini dengan nama trivial adalah: Amino, Transferase, Asil

Karnitin Transferase, Transkarboksilase

2.10.3 Hidrolase

Meningkatkan pemecahan ikatan antara karbon dan atom

lainnya dengan penambahan air. Yan gtermasuk enzim ini dengan

nama trivial: Esterase, Amidase, Peptidase.

2.10.4 Liase

Mengkatalisis pemecahan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan

karbon-nitrogen. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial:

Dekarboksilase, Aldolase, dan Sintase

2.10.5 Isomerase

Mengkatalisis rasemisasi optik atau isomer geometri dan

reaksi oksidasi-reduksi intra molekular tertentu. Yang termasuk

enzim ini dengan nama trivial: Epimerase, Mutase, dan Isomerase.

2.10.6 Ligase

Mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dengan

karbon, karbon dengan sulfur, karbon dengan nitrogen, dan karbon

dengan oksigen. Untuk pembentukan ikatan tersebut diperlukan

energi yang berasal dari ATP. Yang termasuk enzim ini dengan

nama trivial: Sintetase dan Karboksilase.

(Azmi, 2006)

II.11. Salting Out

Apabila campuran dalam larutan ditambahkan dengan garam,

dan konsentrasi garam yang ditambahkan terus ditingkatkan, maka

kelarutan protein dalam campuran tersebut menjadi berkurang

sampai pada konsentrasi tertentu protein akan mengendap dan

terpisahkan. Hal ini merupakan efek dari salting out.

(Scoper,

1998)

2.12 Taksonomi Jagung Manis

Jagung manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh karena

terdapatnya gen resesif. Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji

sebelum matang berwarna putih dan setelah masak berwarna kuning.

Taksonomi tanaman jagung manis (Zea Mays Saccharata) dalam

taksonomi tumbuh-tumbuhan dimasukkan dalam taksonomi sebagai

berikut:

Kingdong : Plantae (tumbuh-tumbuhan)

Division : Spermatophyta (tumbuhan berbiji)

Sub Divisio : Angiospermae (biji tertutup)

Classis : Monocotyledone (berkeping satu)

Familio : Poecease

Genus : Zea

Species : Zea Mays Saccharata

(Suprapto,

1998)

II.12. Analisa Bahan

II.12.1. Amilum

Sifat Fisik : Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan,

dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada

umbi, daun, batang, dan biji-bijian.

Sifat Kimia: Terdiri atas dua macam polisakarida yang keduanya

adalah polimer dari glukosa yaitu amilosa (20%-80%)

dan sisanya amilopektin

(Poedjiadi,

1994)

II.12.2. Aquades

Sifat Fisik : Cairan tak berwarna, titik leleh 00C, titik didih 1000C,

tidak berbau dan tidak berasa.

Sifat Kimia: Terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan H-OH

1050

(Daintith,

1994)

II.12.3. Jagung Manis

Sifat Fisik : Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji sebelum

matang berwarna putih dan setelah masak berwarna

kuning.

Sifat Kimia: manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh

karena terdapatnya gen resesif.

(Suprapto,

1998)

II.12.4. Buffer Phosfat

Sifat Fisik : Terdiri dari Larutan A = 0,2 M larutan Na-Phospat

monobasis (27,8 g dalam 1000 ml) dan Larutan B =

0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g)

Sifat Kimia:Bekerja aktif pada penambahan asam, konsentrasi

relatif rendah, kurang berperan dalam plasma, dalam

menghambat beberapa metabolik enzim termasuk

Karboksilase, Fumarase, dan Fosfoglukomutase

(Sudarmadji,

1997)

2.12.5 Ammonium Sulfat

Sifat Fisik : Kristal berwarna abu-abu sampai putih. Densitas 1,77

g/ml, titik leleh 513oC dengan penguraian

Sifat Kimia : Larut dalam air, tidak larut dalam aseton dan

alkohol, tidak mudah terbakar

(Daintith,

1994)

2.12.6 Iodine

Sifat Fisik : Berwarna ungu tua, titik didih 103,45oC, BM 253,8

g/mol, titik leleh 113,5oC

Sifat Kimia:Larut dalam etanol dan pelarut organik, dapat

bereaksi dengan amilum meunculkan warna biru tua

(Basri, 2003)

III. METODE PERCOBAAN

III.1. Alat dan Bahan

III.1.1. Alat

1. Tabung Reaksi

2. Sentrifuge

3. Pipet Tetes

4. Kain

5. Gelas ukur

6. Gelas beker

7. Penangas Es

8. Lemari Es

10. Blender

III.1.2. Bahan

1. Jagung Manis

2. Amilum

3. Aquades

4. Larutan Iodine

5. Buffer Fosfat

6. Ammonium Sulfat

III.2. Cara kerja

III.2.1. Isolasi enzim α-amilase

400 g jagung

blender

III.2.2. Pemurnian awal enzim α-amilase

residu filtrat

Ekstrak kasar

Pemblenderan selama 15 menit

Penyaringan dengan kain

Sentrifugasi pada 3000 rpm

selama 5 menit

Tabung Reaksi

hasil

Penambahan 1 mL buffer fosfat

Penambahan amilum 1% 3 tetes

Penambahan 3 tetes iodin

5 mL Ekstrak kasar

Gelas beker

Penambahan ammonium sulfat secara perlahan-lahan

50 mL Ekstrak kasar

IV. DATA PENAMATAN

No Perlakuan Hasil

residu

filtrat

filtrat

Pendiaman selama 1 jam

Pensentrifugasian pada 3000 rpm selama 5 menit

Pemisahan endapan dan filtrat

endapan

Gelas beker

hasil

Penambahan 1 mL buffer fosfat

Penambahan amilum 1% 3 tetes

Penambahan 3 tetes iodin

Endapan

1 Isolasi enzim α-amilase

- 400 g jagung manis di homogenisasi

dengan 200 ml akuades selama 15

menit

- penyaringan dengan kain

- Filtrat disentrifugasi pada 3000 rpm

selama 5 menit

- Ekstrak kasar diUji aktifitas α-amilase

(Kualitatif : dengan substrat amilum 1%

dan larutan iodin

Diperoleh ekstrak kasar yan berwarna

kuning yag setela ditambahkan

amilum warnanya menjadi ungu

2 Pemurnian awal enzim α-amilase

50 ml - Ekstrak kasar 50 ml + ammonium sulfat

- Pengadukan menggunakan magnetik

stirer

- Pendinginan

- Campuran disentrifugasi

- Endapan disuspensi

- Enzim diuji aktifitas α-amilase

(Kualitatif : dengan substrat amilum

1%)

Diperoleh ekstrak yang berupa larutan

berwarna kuning kental, lebih kental

daripada ekstrak kasarnya.

Setelah penambahan iodine warna

larutan menjadi:

Fraksi 1: ungu pudar

Fraksi 2: ungu pudar

Fraksi 3: ungu pudar

Fraksi 4: ungu kecokelatan pudar

V. HIPOTESA

Percobaan yang berjudul “Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan

memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Enzim α-

amilase adalah enzim yang dapat menguraikan amilum yang memutuskan ikatan enzim α-

1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul. Prinsip dari percobaan ini

yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara

salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian

protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan

molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi

(yaitu pemurnian yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap) dan sentrifugasi

(yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara

sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah

murni.

VI. PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme

melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah jagung manis yang

merupakan sumber karbohidrat.

Tabel 1. Kandungan Gizi dalam 100 g Jagung Manis

Komponen Kadar

Karbohidrat (g) 19Gula (g) 3,2Serat (g) 2,7Kalori (kkal) 90Protein (g) 3,2Lemak (g) 1,2Vitamin A, setara dg 10 g 1 %Folat (Vit. B9), 46 g 12%Vitamin C, 7 mg 12%Besi, 0,5 mg 4%Magnesium, 37 mg 10%Potasium, 270 mg 6%Air (g) 24

(Retno Arianingrum, M.Si, 2011)

Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan

memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik

pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah pemurnian protein tahap awal

yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out (penambahan ammonium

sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan

protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein).

Metode pada percobaan ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang didasarkan pada

pengendapan secara bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan

pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran.

6.1. Isolasi Enzim α-amilase

Dalam percobaan ini digunakan jagung manis. Jagung manis ini dihancurkan dengan

cara mekanik menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur sehingga semua

komponen yang terkandung dalam jagung manis dapat keluar termasuk enzim α-amilase.

Penghomogenesian dengan aquades dikarenakan enzim α-amilase larut dalam pelarut air

karena sifat keduanya yang sama-sama polar, struktur enzim α-amilase adalah:

Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yanng menyebabkan enzim α-amilase menjadi

bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen

Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim α-amilase akan terkandung didalam

filtrat setelah dilakukan penyaringan. Sebelum dilakukan penghomogenasian, jagung

manis tidak boleh diperas terlalu keras karena hal ini akan menyebabkan enzim α-amilase

yang terkandung dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh

filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas. Pelarutan

dengan pelarut organik lainnya sebenarnya dapat dilakukan, namun hal dapat mengganggu

karena adanya pedenaturasian dengan gugus-gugus tertentu, contoh pelarut seperti air,

yaitu alkohol, tetapi karena pH yang tidak sesuai yaitu < 7 maka enzim akan terdeaturasi.

Mekanisme pendenaturasian protein:

1. Denaturasi Protein karena Panas

Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar yang

menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini disebabkan suhu yang

tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga menyebabkan molekul penyusun protein

bergetar sangat cepat yang mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul

polipetida akan terbuka.

2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa

Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier protein. Hal ini

dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi produk bermuatan ionik.

Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi reaksi substitusi antara ion positif dan

negatif di dalam garam dengan ion positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa

yang ditambahkan.

3. Denaturasi Protein karena Logam Berat

Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan terbentuknya

protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi

dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam berat) diperlukan pH larutan di

atas pI karena protein bermuatan negative begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif

tersebut adalah : Ag+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cu2+ dan Pb2+. Sedangkan ion-ion negatif

meliputi : ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga

merusak ikatan disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk

menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein.

Filtrat disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dari residunya. Supernatan ini

merupakan ekstrak kasar. Sementara residu mempunyai komponen antara lain serat,

karbohidrat, lemak, kalsium (Ca) , fosfor (P), vitamin, dan senyawa lainnya. Setelah

didapatkan ekstrak kasar, kemudian dilakukan tahap pemurnian dengan metode fraksinasi

(4 fraksi).

6.2. Pemurnian Awal Enzim α-amilase

Proses pemurnian tahap awal enzim α-amilase dilakukan dengan fraksinasi dengan

menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim α-amilase yang dilakukan dengan

penambahan garam untuk mengendapkan protein. Prinsip dari fraksinasi ammonium sulfat

ini adalah proses pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein

dengan cara salting out. Penambahan (NH4)2SO4 terus menerus akan menyebabkan

kelarutan enzim α-amilase dalam air akan berkurang karena enzim dan (NH4)2SO4 akan

berkompetisi memperebutkan molekul air sehingga enzim lama kelamaan akan

mengendap. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan endapan protein dari larutannya.

Garam (NH4)2SO4 ini dapat mengendapkan protein dengan cara menyerap molekul

air. Garam ini bersifat larut dalam air, sehingga ketika ditambahkan garam ini akan

menarik atau mengikat molekul air yang melarutkan protein dalam campuran, sehingga

protein akan berkurang kelarutannya akibat pengikatan pelarut air oleh (NH4)2SO4. Dalam

hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini mempunyai beberapa keuntungan

antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi (533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan

pada umumnya tidak mempengaruhi struktur proein. Selain dengan (NH4)2SO4, proses

salting out dapat menggunakan garam-garam lain, tetapi dalam percobaan ini garam

divalen seperti MgCl2, MgSO4, lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl,

NH4Cl, dan KCl. Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim

didalam air.

Dalam hal ini, protein yang diendapkan akan lebih murni dibandingkan dengan yang

tidak difraksinasi, karena pengotor seperti air tidak terendapkan. Fungsi penambahan

buffer PO4 adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya tidak banyak berubah. Dimana

aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka digunakan buffer PO4 dengan pH

6,1 (buffer asam). Jika pH-nya di atas pH optimum maka enzim akan mengalami

deprotonasi atau perubahan pH baik di atas maupun di bawah pH optimum akan

menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim menurun. Reaksi enzimatisnya

adalah sebagai berikut:

E + S [ES] E + P

Enzim substrat enzim-substrat enzim produk

Pada reaksi enzimatis ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat

dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi yang terjadi:

Maltosa Glukosa

(Murray, 2009)

Campuran selanjutnya didinginkan, untuk mencegah denaturasi protein yang

mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin maka aktivitas enzim α-

amilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan dilakukan dalam waktu kurang

lebih satu jam.

Proses pengadukan dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses pelarutan.

Semakin banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka semakin sulit atau

semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan tersebut. Karena semakin

besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar konsentrasi enzim dan garam ammonium

sulfatnya. Sehingga dengan semakin besar konsentrasi enzim tersebut, maka protein akan

semakin murni/semakin cepat terhidrolisis. Dengan semakin murninya protein, maka

kemampuam amonium sulfat untuk mengendapkan proten semakin kecil, karena protein

tersebut sudah mengalami hidrolisis.

Hasil percobaan uji kualitatif (uji adanya protein/yang berarti adanya enzim) yang

dilakukan dengan penambahan amilum dan larutan iodine. Digunakan amilum sebagai

substrat karena enzim α-amilase dapat menghidrolisis amilum. Penggunaan iodin adalah

untuk menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim α-amilase. Hasil campuran ini berwarna

ungu yang lama-lama memudar, yang menunjukan adanya protein. Pada ekstrak kasar,

Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan

berwana ungu memudar, hal ini menunjukan didalam larutan tersebut terdapat protein.

Sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang lama-lama memudar, hal ini

menunjukan adanya enzim α-amilase yang telah menghidrolisis amilum menjadi glukosa.

VII. PENUTUP

7.1 KESIMPULAN

1. Enzim α-amilase dapat diperoleh dari jagung manis

2. Pemurnian enzim tahap awal dilakukan dengan menggunakan metode fraksinasi,

yaitu penambahan ammonium sulfat.

3. Pada hasil percobaan ekstrak kasar, Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah

dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu yang memudar

sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang memudar. Hal ini

menunjukan hasil positif adanya enzim α-amilase.

7.2 SARAN

1. Penghomogenisasian jagung manis dengan air harus dilakukan dengan

perbandingan volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu pekat

2. Pada saat memeras jagung manis untuk mendapatkan filtrat harus perlahan dan

hati-hati agar residu tidak terbawa dan agar enzim α-amilase yang terkandung

dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh filtrat/cairan hasil

perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas.

DAFTAR PUSTAKA

Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk Isolasi

Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka, Laboratorium Kimia Jurusan PMIPA

FKIP Universitas Riau, Pekanbaru

Bahagiawati, 2005, Isolasi Dan Purifikasi Inhibitor α-Amilase Dari Biji Kacang Phaseolus

Vulgaris, Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Bioteknologi, Bogor

Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.

Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase Terhadap Sifat

Fisik Dan Organoleptik Filtrat Bubur Buah Pisang, Balai Besar Teknologi Tepat Guna –

Lipi, Subang

Deswita, 2006, Fungsi Enzim Dalam Metabolisme, SMAN 2 Batusangkar, Batusangkar

Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, And Witarto, 2008, Biodegradasi Substrat Gergajian

Kayu Sengon Oleh Jamur, Dept Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB, Bogor

Rochima, 2005, Pemurnian Dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil Dari Bacillus

Papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan

Universitas Padjadjaran Jatinangor, Bandung

VII. LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 06 Desember 2012

Praktikan,

Arif Nurdiansyah

24030110141024

Delvina Maris Dinar Fitriana Ramadhani

24030110120010 24030110141006

Resti Puteri Utami Nyken Herlyna

24030110141018 24030110141032

Mengetahui,

Asisten

Octafsari Kristiana S.

J2C 009 023

LAMPIRAN

Perhitungan Fraksi Amonium Sulfat

1. Fraksi 0-25 = 25

1000 L x 144 gram/L = 3,6 gram

2. Fraksi 25-50 = 25

1000 L x 158 gram/L = 3,95 gram

3. Fraksi 50-75 = 25

1000 L x 176 gram/L = 4,4 gram

4. Fraksi 75-100 = 25

1000 L x 198 gram/L = 4,94 gram