LAPORAN TERBAIK
PRAKTIKUM KIMIA V
ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE
Disusun Oleh :
1 Arif Nurdiansyah NIM. 24030110141024
2 Delvina Maris NIM. 24030110120010
3 Dinar F.Ramadhani NIM. 24030110141006
4 Nyken Herlyna NIM. 24030110140032
5 Resti Puteri Utami NIM. 24030110141018
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2012
ABSTRAK
Percobaan ‘Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan untuk memperoleh enzim
α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah
jagung manis yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase merupakan enzim yang
dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak
dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip dari percobaan ini
yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara
salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein
yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari
permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian
protein yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran). Hasil
yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah murni. Dimana semakin besar
penambahan amonium selfat maka semakin kecil endapan yang terbentuk, dengan kata lain
enzim semakin murni. Hasil uji kualitatif setelah penambahan amilum dan larutan iodin yaitu,
Fraksi I berwana ungu pudar, Fraksi II berwana ungu pudar, Fraksi III berwana ungu pudar, dan
Fraksi IV berwana ungu kecokelatan pudar.
Kata kunci: Enzim α-amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Jagung Manis
PERCOBAAN V
ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL ENZIM α-AMILASE
I. TUJUAN
Memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui memurnikan tahap awal
II. TINJAUAN PUSTAKA
II.1.Enzim
Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Enzim
telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia
lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan
bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease.
Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim
dibandingkan katalis biasa adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi;
bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan
selektif terhadap subtrat tertentu.
Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak tahan panas yaitu disebut
dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan protein adalah bagian yang aktif dan
diberi nama gugus prostetik, biasanya berupa logam seperti besi, tembaga , seng atau
suatu bahan senyawa organic yang mengandung logam. Apoenzim dan gugus prostetik
merupakan suatu kesatuan yang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang
apoenzim dan gugus prospetiknya tidak menyatu.
(Azmi, 2006)
II.2.Enzim α-amilase
Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau berfungsi
menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang
lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa
amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim
enzim alfa amilase bekerja optimum pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60oC. Jika suhu
ditingkatkan, pH optimum juga meningkat sampai sekitar 7. Jika α-amilase berasal dari
Bacillus licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan hasil utama maltoheksosa,
malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih tinggi (8 – 10%). enzim alfa amilase
mampu meningkatkan rasa manis pada ekstrak sari buah karena aktivitas enzim alfa
amilase yang mampu menghidrolisis pati pada pisang menjadi gula lain yang lebih
sederhana.
(Darmajana and Agustina, 2008)
II.3.Komponen Enzim Substrat
Enzim merupakan senyawa organik berupa protein yang berfungsi sebagai katalis
dalam metabolisme tubuh, sehingga disebut juga biokatalisator.
Komponen penyusun enzim terdiri dari :
1. Apoenzim, yaitu bagian enzim aktif yang tersusun atas protein yang bersifat labil
(mudah berubah) terhadap faktor lingkungan, dan
2. Kofaktor,yaitu komponen non protein yang berupa :
a. Ion-ion anorganik (aktivator)
Berupa logam yang berikatan lemah dengan enzim, Fe, Ca, Mn, Zn, K, Co. Ion
klorida, ion kalsium merupakan contoh ion anorganik yang membantu enzim
amilase mencerna karbohidrat (amilum)
b. Gugus prostetik
Berupa senyawa organik yang berikatan kuat dengan enzim, FAD (Flavin Adenin
Dinucleotide), biotin, dan heme merupakan gugus prostetik yang mengandung zat
besi berperan memberi kekuatan ekstra pada enzim terutama katalase,
peroksidae, sitokrom oksidase.
c. Koenzim
Berupa molekul organik non protein kompleks, seperti NAD (Nicotineamide
Adenine Dinucleotide), koenzim-A, ATP, dan vitamin yang berperan dalam
memindahkan gugus kimia, atom, atau elektron dari satu enzim ke enzim lain.
(Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, and Witarto, 2008)
II.4.Sifat-Sifat Enzim
1. Enzim adalah Protein
Sebagai protein enzim memiliki sifat seperti protein, yaitu sangat dipengaruhi oleh
kondisi lingkungan, seperti suhu, pH, konsentrasi substrat). Jika lingkungannya tidak
sesuai, maka enzim akan rusak atau tidak dapat bekerja dengan baik.
2. Bekerja secara khusus/spesifik
Setiap enzim memiliki sisi aktif yang sesuai hanya dengan satu jenis substrat, artinya
setiap enzim hanya dapat bekerja pada satu substrat yang cocok dengan sisi aktifnya.
3. Berfungsi sebagai katalis
Meningkatkan kecepatan reaksi kimia tanpa merubah produk yang diharapkan tanpa
ikut bereaksi dengan substratnya, dengan demikian energi yang dibutuhkan untuk
menguraikan suatu substrat menjadi lebih sedikit.
4. Diperlukan dalam jumlah sedikit
Reaksi enzimatis dalam metabolisme hanya membutuhkan sedikit sekali enzim untuk
setiap kali reaksi.
5. Bekerja bolak-balik
Enzim tidak mempengaruhi arah reaksi, sehingga dapat bekerja dua arah (bolak-balik).
Artinya enzim dapat menguraikan substrat menjadi senyawa sederhana, dan
sebaliknya enzim juga dapat menyusun senyawa-senyawa menjadi senyawa tertentu.
6. Enzim bersifat khusus terhadap suatu substrat tertentu yang dapat diikat dan jenis
reaksinya.
7. Kerja enzim dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi, dll.
(Deswita, 2006)
II.5.Cara kerja Enzim
Cara enzim bekerja adalah dengan membentuk senyawa enzim-substrat, kemudian
menghasilkan suatu produk tanpa merubah senyawa enzim itu sendiri, setelah produk
terbentuk maka enzim akan melepaskan diri untuk membentuk senyawa baru dengan
substrat yang lain.
Ada 2 (dua) cara kerja enzim :
1. Lock and key (gembok dan anak kunci)
Setiap enzim memiliki sisi aktif yang tersusun dari sejumlah asam amino. Bentuk sisi
aktif ini sangat spesifik, sehingga hanya molekul dengan bentuk tertentu yang dapat
menjadi substrat bagi enzim.
2. Induced fit (induksi pas)
Sisi aktif enzim merupakan bentuk yang tidak kaku (fleksibel). Ketika substrat
memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif berubah bentuk sesuai dengan bentuk
substrat kemudian terbentuk kompleks enzim-substrat. Pada saat produk sudah
terlepas dari kompleks, maka enzim lepas dan kembali bereaksi dengan substrat lain.
(Deswita, 2006)
II.6.Faktor – faktor yang mempengaruhi kerja enzim
a. Temperatur
Karena enzim tersusun dari protein, maka enzim sangat peka terhadap temperature.
Temperature yang terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein. Temperature
yang terlalu rendah dapat menghambat reaksi. Pada umumnya temperatur optimum
enzim adalah 30 – 400C. Kebanyakan enzim tidak menunjukkan reaksi jika suhu turun
sampai 00c , namun enzim tidak rusak, bila suhu normal maka enzim akan aktif
kembali . enzim tahan pada suhu rendah, namun rusak diatas suhu 500c.
b. Perubahan pH
Enzim juga sangat terpengaruh oleh pH. Perubahan pH dapat mempengaruhi
perubahan asam amino kunci pada sisi aktif enzim sehingga menghalangi sisi aktif
berkombinasi dengan substratnya. pH optimum yang diperlukan berbeda – beda
tergantung jenis enzimnya.
c. Konsentrasi enzim dan substrat
Agar reaksi berjalan optimum, maka perbandingan jumlah antara enzim dan substrat
harus sesuai. Jika enzim terlalu sedikit dan substrat terlalu banyak reaksi akan berjalan
lambat bahkan ada substrat yang tidak terkatalisasi. semakin banyak enzim, reaksi
akan semakin cepat.
d. Adanya activator
Aktivator adalah zat yang dapat mengaktifkan dan menggiatkan kerja enzim.
Contohnya ion klorida, yang dapat mengaktifkan enzim amilase.
e. Adanya inhibitor
Inhibitor adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Berdasarkan cara kerjanya,
inhibitor terbagi dua, inhibitor kompetitif, inhibitor nonkompetitif, inhibitor umpan
balik, inhibitor represor, inhibitor alosterik.
f. Adanya induktor
Induktor adalah suatu substrat yang dapat merangsang pembentukan enzim. Misal,
laktosa dapat menginduksi pembentukan enzim beta galaktosidase. Umumnya
pemberian nama enzim didasarkan atas nama substrat yang dikatalis atau daya
katalisnya dengan penambahan kata-ase. Misal proteinase adalah enzim yang dapat
mengkatalis pemecahan protein.
(Azmi, 2006)
II.7.Inhibitor Enzim
Seringkali enzim dihambat oleh suatu zat yang disebut inhibitor, ada dua jenis inhibitor
yaitu sebagai berikut:
a. Inhibitor kompetitif
Inhibitor kompetitif adalah inhibitor yang bersaing aktif dengan substrat untuk
mendapatkan situs aktif enzim. Inhibitor ini disebabkan oleh senyawa tertentu yang
mempunyai struktur mirip dengan substrat saat reaksi enzim akan terjadi. Misal, sianida
bersaing dengan oksigen dalam pengikatan Hb.
Pada penghambatan ini zat – zat penghambat mempunyai struktur yang mirip dengan
struktur substrat. Dengan demikian baik substrat maupun zat penghambat berkompetisi
atau bersaing untuk bersatu dengan sisi aktif enzim , jka zat penghambat lebih dulu
berikatan dengan sisi aktif enzim , maka substratnya tidak dapat lagi berikatan dengan
sisi aktif enzim.
b. Inhibitor nonkompetitif
Inhibitor nonkompetitif adalah inhibitor yang melekat pada sisi lain selain situs aktif
pada enzim, yang lama kelamaan dapat mengubah sisi aktif enzim. Inhibitor umpan
balik disebabkan oleh hasil akhir suatu rangkaian reaksi enzim yang menghambat kerja
enzim pada reaksi pertama. Pada penghambatan ini, substrat sudah tidak dapat berikatan
dengan kompleks enzim- inhibitor, karena sisi aktif enzim berubah.
(Bahagiawati,
2005)
II.8. Inhibitor α-amilase
Inhibitor α-amilase adalah protein yang menghambat enzim
amilase di dalam saluran pencernaan (midgut) serangga. Enzim
amilase diperlukan oleh serangga, terutama serangga yang makan biji-
bijian dan ubi yang kaya dengan pati. Pati ini harus hidrolisis menjadi
molekul karbohidrat yang lebih sederhana (kecil) seperti disakarida
dan monosakarida, agar dapat digunakan dalam sistem metabolisme
serangga. Dengan dihambatnya pemecahan pati oleh inhibitor α-
amilase maka serangga tidak mendapatkan kebutuhan karbohidratnya,
sehingga dapat berakibat fatal bagi serangga tersebut. Beberapa jenis
inhibitor α-amilase telah diisolasi dari berbagai biji tanaman, seperti
Phaseolus vulgaris dan Triticum aestivum. Inhibitor α-amilase dari P.
vulgaris menghambat aktivitas amilase pada ekstrak kasar dari midgut
serangga Lepidoptera, seperti Spodoptera littoralis, Agrotis ipsilon, dan
Plodia interpunctella (Gutierrez et al. 1993). Inhibitor ini juga
menghambat aktivitas amilase di midgut Callosobruchus maculatus
dan Tribolium confusum
(Bahagiawati,
2005)
II.9. Fraksinasi dalam Pemurnian kitin deasetilase
Pemurnian fraksi dilakukan dengan kromatografi pertukaran anion. Hasil
pemurnian dengan kromatografi pertukaran anion menunjukkan bahwa
kitin deasetilase memiliki 3 (tiga) buah fraksi a8ktif dengan aktivitas
tertinggi pada fraksi ke-76. Karakterisasi biokimiawi menunjukkan bahwa
kitin deasetilase mempunyai pH dan suhu optimum masing-masing 8 dan
55 oC, stabil terhadap panas selama 5 jam. Aktivitas enzim dihambat oleh
ion logam Mn, Ni dan Ca (1 mM), namun tidak dipengaruhi oleh EDTA. Ion
Mg dan Na-asetat dapat meningkatkan aktivitasnya. Hasil analisis SDS-
PAGE menunjukkan adanya dengan perkiraan berat molekul 15-67 kDa.
(Rochima,
2005)
II.10. Klasifikasi Enzim
2.10.1 Oksidoreduktase
Mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi, dan biasanya menggunakan koenzim
NAD+ dan NADP+. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial:
Dehidrogenase, Oksidase, dan Hidroksilase.
2.10.2 Transferase
Mengakatalisis pemindahan gugus tertentu, seperti gugus 1-
karbon, gugus aldehid, dan keton, gugus alkil, gugus glikosil,
gugus fosfat dan gugus yang mengandung S. Yang termasuk
enzim ini dengan nama trivial adalah: Amino, Transferase, Asil
Karnitin Transferase, Transkarboksilase
2.10.3 Hidrolase
Meningkatkan pemecahan ikatan antara karbon dan atom
lainnya dengan penambahan air. Yan gtermasuk enzim ini dengan
nama trivial: Esterase, Amidase, Peptidase.
2.10.4 Liase
Mengkatalisis pemecahan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan
karbon-nitrogen. Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial:
Dekarboksilase, Aldolase, dan Sintase
2.10.5 Isomerase
Mengkatalisis rasemisasi optik atau isomer geometri dan
reaksi oksidasi-reduksi intra molekular tertentu. Yang termasuk
enzim ini dengan nama trivial: Epimerase, Mutase, dan Isomerase.
2.10.6 Ligase
Mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dengan
karbon, karbon dengan sulfur, karbon dengan nitrogen, dan karbon
dengan oksigen. Untuk pembentukan ikatan tersebut diperlukan
energi yang berasal dari ATP. Yang termasuk enzim ini dengan
nama trivial: Sintetase dan Karboksilase.
(Azmi, 2006)
II.11. Salting Out
Apabila campuran dalam larutan ditambahkan dengan garam,
dan konsentrasi garam yang ditambahkan terus ditingkatkan, maka
kelarutan protein dalam campuran tersebut menjadi berkurang
sampai pada konsentrasi tertentu protein akan mengendap dan
terpisahkan. Hal ini merupakan efek dari salting out.
(Scoper,
1998)
2.12 Taksonomi Jagung Manis
Jagung manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh karena
terdapatnya gen resesif. Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji
sebelum matang berwarna putih dan setelah masak berwarna kuning.
Taksonomi tanaman jagung manis (Zea Mays Saccharata) dalam
taksonomi tumbuh-tumbuhan dimasukkan dalam taksonomi sebagai
berikut:
Kingdong : Plantae (tumbuh-tumbuhan)
Division : Spermatophyta (tumbuhan berbiji)
Sub Divisio : Angiospermae (biji tertutup)
Classis : Monocotyledone (berkeping satu)
Familio : Poecease
Genus : Zea
Species : Zea Mays Saccharata
(Suprapto,
1998)
II.12. Analisa Bahan
II.12.1. Amilum
Sifat Fisik : Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan,
dalam bahasa sehari-hari disebut pati, terdapat pada
umbi, daun, batang, dan biji-bijian.
Sifat Kimia: Terdiri atas dua macam polisakarida yang keduanya
adalah polimer dari glukosa yaitu amilosa (20%-80%)
dan sisanya amilopektin
(Poedjiadi,
1994)
II.12.2. Aquades
Sifat Fisik : Cairan tak berwarna, titik leleh 00C, titik didih 1000C,
tidak berbau dan tidak berasa.
Sifat Kimia: Terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan H-OH
1050
(Daintith,
1994)
II.12.3. Jagung Manis
Sifat Fisik : Ciri-cirinya berambut putih, dengan biji sebelum
matang berwarna putih dan setelah masak berwarna
kuning.
Sifat Kimia: manis memiliki kandungan zat gula tinggi oleh
karena terdapatnya gen resesif.
(Suprapto,
1998)
II.12.4. Buffer Phosfat
Sifat Fisik : Terdiri dari Larutan A = 0,2 M larutan Na-Phospat
monobasis (27,8 g dalam 1000 ml) dan Larutan B =
0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g)
Sifat Kimia:Bekerja aktif pada penambahan asam, konsentrasi
relatif rendah, kurang berperan dalam plasma, dalam
menghambat beberapa metabolik enzim termasuk
Karboksilase, Fumarase, dan Fosfoglukomutase
(Sudarmadji,
1997)
2.12.5 Ammonium Sulfat
Sifat Fisik : Kristal berwarna abu-abu sampai putih. Densitas 1,77
g/ml, titik leleh 513oC dengan penguraian
Sifat Kimia : Larut dalam air, tidak larut dalam aseton dan
alkohol, tidak mudah terbakar
(Daintith,
1994)
2.12.6 Iodine
Sifat Fisik : Berwarna ungu tua, titik didih 103,45oC, BM 253,8
g/mol, titik leleh 113,5oC
Sifat Kimia:Larut dalam etanol dan pelarut organik, dapat
bereaksi dengan amilum meunculkan warna biru tua
(Basri, 2003)
III. METODE PERCOBAAN
III.1. Alat dan Bahan
III.1.1. Alat
1. Tabung Reaksi
2. Sentrifuge
3. Pipet Tetes
4. Kain
5. Gelas ukur
6. Gelas beker
7. Penangas Es
8. Lemari Es
10. Blender
III.1.2. Bahan
1. Jagung Manis
2. Amilum
3. Aquades
4. Larutan Iodine
5. Buffer Fosfat
6. Ammonium Sulfat
III.2. Cara kerja
III.2.1. Isolasi enzim α-amilase
400 g jagung
blender
III.2.2. Pemurnian awal enzim α-amilase
residu filtrat
Ekstrak kasar
Pemblenderan selama 15 menit
Penyaringan dengan kain
Sentrifugasi pada 3000 rpm
selama 5 menit
Tabung Reaksi
hasil
Penambahan 1 mL buffer fosfat
Penambahan amilum 1% 3 tetes
Penambahan 3 tetes iodin
5 mL Ekstrak kasar
Gelas beker
Penambahan ammonium sulfat secara perlahan-lahan
50 mL Ekstrak kasar
IV. DATA PENAMATAN
No Perlakuan Hasil
residu
filtrat
filtrat
Pendiaman selama 1 jam
Pensentrifugasian pada 3000 rpm selama 5 menit
Pemisahan endapan dan filtrat
endapan
Gelas beker
hasil
Penambahan 1 mL buffer fosfat
Penambahan amilum 1% 3 tetes
Penambahan 3 tetes iodin
Endapan
1 Isolasi enzim α-amilase
- 400 g jagung manis di homogenisasi
dengan 200 ml akuades selama 15
menit
- penyaringan dengan kain
- Filtrat disentrifugasi pada 3000 rpm
selama 5 menit
- Ekstrak kasar diUji aktifitas α-amilase
(Kualitatif : dengan substrat amilum 1%
dan larutan iodin
Diperoleh ekstrak kasar yan berwarna
kuning yag setela ditambahkan
amilum warnanya menjadi ungu
2 Pemurnian awal enzim α-amilase
50 ml - Ekstrak kasar 50 ml + ammonium sulfat
- Pengadukan menggunakan magnetik
stirer
- Pendinginan
- Campuran disentrifugasi
- Endapan disuspensi
- Enzim diuji aktifitas α-amilase
(Kualitatif : dengan substrat amilum
1%)
Diperoleh ekstrak yang berupa larutan
berwarna kuning kental, lebih kental
daripada ekstrak kasarnya.
Setelah penambahan iodine warna
larutan menjadi:
Fraksi 1: ungu pudar
Fraksi 2: ungu pudar
Fraksi 3: ungu pudar
Fraksi 4: ungu kecokelatan pudar
V. HIPOTESA
Percobaan yang berjudul “Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim α-amilase” bertujuan
memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal. Enzim α-
amilase adalah enzim yang dapat menguraikan amilum yang memutuskan ikatan enzim α-
1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul. Prinsip dari percobaan ini
yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara
salting-out (penambahan ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian
protein yang didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan
molekul air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi
(yaitu pemurnian yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap) dan sentrifugasi
(yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran). Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim α-amilase yang telah
murni.
VI. PEMBAHASAN
Percobaan ini bertujuan untuk memperoleh enzim α-amilase dari sumber organisme
melalui pemurnian awal enzim. Sampel yang digunakan adalah jagung manis yang
merupakan sumber karbohidrat.
Tabel 1. Kandungan Gizi dalam 100 g Jagung Manis
Komponen Kadar
Karbohidrat (g) 19Gula (g) 3,2Serat (g) 2,7Kalori (kkal) 90Protein (g) 3,2Lemak (g) 1,2Vitamin A, setara dg 10 g 1 %Folat (Vit. B9), 46 g 12%Vitamin C, 7 mg 12%Besi, 0,5 mg 4%Magnesium, 37 mg 10%Potasium, 270 mg 6%Air (g) 24
(Retno Arianingrum, M.Si, 2011)
Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan
memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul, baik
pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah pemurnian protein tahap awal
yang didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out (penambahan ammonium
sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan
protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul protein).
Metode pada percobaan ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang didasarkan pada
pengendapan secara bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses pemurnian protein yang didasarkan
pada pengendapan dengan cara sentrifugal/perputaran.
6.1. Isolasi Enzim α-amilase
Dalam percobaan ini digunakan jagung manis. Jagung manis ini dihancurkan dengan
cara mekanik menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur sehingga semua
komponen yang terkandung dalam jagung manis dapat keluar termasuk enzim α-amilase.
Penghomogenesian dengan aquades dikarenakan enzim α-amilase larut dalam pelarut air
karena sifat keduanya yang sama-sama polar, struktur enzim α-amilase adalah:
Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yanng menyebabkan enzim α-amilase menjadi
bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen
Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim α-amilase akan terkandung didalam
filtrat setelah dilakukan penyaringan. Sebelum dilakukan penghomogenasian, jagung
manis tidak boleh diperas terlalu keras karena hal ini akan menyebabkan enzim α-amilase
yang terkandung dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh
filtrat/cairan hasil perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas. Pelarutan
dengan pelarut organik lainnya sebenarnya dapat dilakukan, namun hal dapat mengganggu
karena adanya pedenaturasian dengan gugus-gugus tertentu, contoh pelarut seperti air,
yaitu alkohol, tetapi karena pH yang tidak sesuai yaitu < 7 maka enzim akan terdeaturasi.
Mekanisme pendenaturasian protein:
1. Denaturasi Protein karena Panas
Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar yang
menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini disebabkan suhu yang
tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga menyebabkan molekul penyusun protein
bergetar sangat cepat yang mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul
polipetida akan terbuka.
2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa
Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier protein. Hal ini
dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi produk bermuatan ionik.
Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi reaksi substitusi antara ion positif dan
negatif di dalam garam dengan ion positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa
yang ditambahkan.
3. Denaturasi Protein karena Logam Berat
Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan terbentuknya
protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami presipitasi bila bereaksi
dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam berat) diperlukan pH larutan di
atas pI karena protein bermuatan negative begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif
tersebut adalah : Ag+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cu2+ dan Pb2+. Sedangkan ion-ion negatif
meliputi : ion salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga
merusak ikatan disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya untuk
menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein.
Filtrat disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dari residunya. Supernatan ini
merupakan ekstrak kasar. Sementara residu mempunyai komponen antara lain serat,
karbohidrat, lemak, kalsium (Ca) , fosfor (P), vitamin, dan senyawa lainnya. Setelah
didapatkan ekstrak kasar, kemudian dilakukan tahap pemurnian dengan metode fraksinasi
(4 fraksi).
6.2. Pemurnian Awal Enzim α-amilase
Proses pemurnian tahap awal enzim α-amilase dilakukan dengan fraksinasi dengan
menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim α-amilase yang dilakukan dengan
penambahan garam untuk mengendapkan protein. Prinsip dari fraksinasi ammonium sulfat
ini adalah proses pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein
dengan cara salting out. Penambahan (NH4)2SO4 terus menerus akan menyebabkan
kelarutan enzim α-amilase dalam air akan berkurang karena enzim dan (NH4)2SO4 akan
berkompetisi memperebutkan molekul air sehingga enzim lama kelamaan akan
mengendap. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan endapan protein dari larutannya.
Garam (NH4)2SO4 ini dapat mengendapkan protein dengan cara menyerap molekul
air. Garam ini bersifat larut dalam air, sehingga ketika ditambahkan garam ini akan
menarik atau mengikat molekul air yang melarutkan protein dalam campuran, sehingga
protein akan berkurang kelarutannya akibat pengikatan pelarut air oleh (NH4)2SO4. Dalam
hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini mempunyai beberapa keuntungan
antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi (533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan
pada umumnya tidak mempengaruhi struktur proein. Selain dengan (NH4)2SO4, proses
salting out dapat menggunakan garam-garam lain, tetapi dalam percobaan ini garam
divalen seperti MgCl2, MgSO4, lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl,
NH4Cl, dan KCl. Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim
didalam air.
Dalam hal ini, protein yang diendapkan akan lebih murni dibandingkan dengan yang
tidak difraksinasi, karena pengotor seperti air tidak terendapkan. Fungsi penambahan
buffer PO4 adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya tidak banyak berubah. Dimana
aktivitas α-amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka digunakan buffer PO4 dengan pH
6,1 (buffer asam). Jika pH-nya di atas pH optimum maka enzim akan mengalami
deprotonasi atau perubahan pH baik di atas maupun di bawah pH optimum akan
menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim menurun. Reaksi enzimatisnya
adalah sebagai berikut:
E + S [ES] E + P
Enzim substrat enzim-substrat enzim produk
Pada reaksi enzimatis ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat
dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi yang terjadi:
Maltosa Glukosa
(Murray, 2009)
Campuran selanjutnya didinginkan, untuk mencegah denaturasi protein yang
mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin maka aktivitas enzim α-
amilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan dilakukan dalam waktu kurang
lebih satu jam.
Proses pengadukan dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses pelarutan.
Semakin banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka semakin sulit atau
semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan tersebut. Karena semakin
besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar konsentrasi enzim dan garam ammonium
sulfatnya. Sehingga dengan semakin besar konsentrasi enzim tersebut, maka protein akan
semakin murni/semakin cepat terhidrolisis. Dengan semakin murninya protein, maka
kemampuam amonium sulfat untuk mengendapkan proten semakin kecil, karena protein
tersebut sudah mengalami hidrolisis.
Hasil percobaan uji kualitatif (uji adanya protein/yang berarti adanya enzim) yang
dilakukan dengan penambahan amilum dan larutan iodine. Digunakan amilum sebagai
substrat karena enzim α-amilase dapat menghidrolisis amilum. Penggunaan iodin adalah
untuk menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim α-amilase. Hasil campuran ini berwarna
ungu yang lama-lama memudar, yang menunjukan adanya protein. Pada ekstrak kasar,
Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan
berwana ungu memudar, hal ini menunjukan didalam larutan tersebut terdapat protein.
Sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang lama-lama memudar, hal ini
menunjukan adanya enzim α-amilase yang telah menghidrolisis amilum menjadi glukosa.
VII. PENUTUP
7.1 KESIMPULAN
1. Enzim α-amilase dapat diperoleh dari jagung manis
2. Pemurnian enzim tahap awal dilakukan dengan menggunakan metode fraksinasi,
yaitu penambahan ammonium sulfat.
3. Pada hasil percobaan ekstrak kasar, Fraksi I, Fraksi II, dan Fraksi III setelah
dilakukan penambahan amilum dan iodin larutan berwana ungu yang memudar
sedangkan pada Fraksi IV berwana ungu kecoklatan yang memudar. Hal ini
menunjukan hasil positif adanya enzim α-amilase.
7.2 SARAN
1. Penghomogenisasian jagung manis dengan air harus dilakukan dengan
perbandingan volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu pekat
2. Pada saat memeras jagung manis untuk mendapatkan filtrat harus perlahan dan
hati-hati agar residu tidak terbawa dan agar enzim α-amilase yang terkandung
dalam jagung manis akan menjadi sedikit karena terbawa oleh filtrat/cairan hasil
perasan karena kadar air yang terlalu banyak ikut terperas.
DAFTAR PUSTAKA
Azmi, 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk Isolasi
Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka, Laboratorium Kimia Jurusan PMIPA
FKIP Universitas Riau, Pekanbaru
Bahagiawati, 2005, Isolasi Dan Purifikasi Inhibitor α-Amilase Dari Biji Kacang Phaseolus
Vulgaris, Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Bioteknologi, Bogor
Daintith, 1994, Kamus Lengkap Kimia, Erlangga, Jakarta.
Darmajana And Agustina, 2008, Pengaruh Konsentrasi Enzim α-Amilase Terhadap Sifat
Fisik Dan Organoleptik Filtrat Bubur Buah Pisang, Balai Besar Teknologi Tepat Guna –
Lipi, Subang
Deswita, 2006, Fungsi Enzim Dalam Metabolisme, SMAN 2 Batusangkar, Batusangkar
Herliyana, Nandika, Achmad, Lisdar I, And Witarto, 2008, Biodegradasi Substrat Gergajian
Kayu Sengon Oleh Jamur, Dept Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB, Bogor
Rochima, 2005, Pemurnian Dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil Dari Bacillus
Papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran Jatinangor, Bandung
VII. LEMBAR PENGESAHAN
Semarang, 06 Desember 2012
Praktikan,
Arif Nurdiansyah
24030110141024
Delvina Maris Dinar Fitriana Ramadhani
24030110120010 24030110141006
Resti Puteri Utami Nyken Herlyna
24030110141018 24030110141032
Mengetahui,
Asisten
Octafsari Kristiana S.
J2C 009 023
LAMPIRAN
Perhitungan Fraksi Amonium Sulfat
1. Fraksi 0-25 = 25
1000 L x 144 gram/L = 3,6 gram
2. Fraksi 25-50 = 25
1000 L x 158 gram/L = 3,95 gram
3. Fraksi 50-75 = 25
1000 L x 176 gram/L = 4,4 gram
4. Fraksi 75-100 = 25
1000 L x 198 gram/L = 4,94 gram
Top Related