PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek...

75
PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK Lumbricus rubellus TERHADAP EKSPRESI GEN TNF-α PADA MENCIT SWISS YANG DIINFEKSI Plasmoodium berghei ANKA SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran DEWI WULANDARI G0006069 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

Transcript of PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek...

Page 1: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK

Lumbricus rubellus TERHADAP EKSPRESI GEN TNF-α PADA MENCIT

SWISS YANG DIINFEKSI Plasmoodium berghei ANKA

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

DEWI WULANDARI

G0006069

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2010

Page 2: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

PERNYATAAN

Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Juli 2010

Dewi Wulandari NIM. G0006069

Page 3: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

ABSTRAK

DEWI WULANDARI, G0006069, 2010. Pengaruh Terapi Lumbricus rubellus terhadap Ekspresi Gen TNF-α pada Mencit Swiss yang Diinfeksi Plasmodium berghei ANKA. Malaria masih merupakan masalah kesehatan terutama di negara-negara tropis. Penelitian membuktikkan komplikasi fatal pada malaria disebabkan tingginya sitokin inflamasi, terutama TNF-α. Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh terapi kombinasi klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus terhadap ekspresi gen TNF-α pada mencit swiss yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA. Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorik. Hewan uji yang digunakan adalah mencit swiss jantan berumur 3 bulan dengan berat badan 20-30 gram. Mencit dibagi ke dalam 5 kelompok. Kelompok I adalah kelompok mencit yang tidak diberi perlakuan apapun. Kelompok II adalah kelompok mencit yang hanya diinfeksi Plasmodium berghei ANKA. Kelompok III adalah kelompok mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dan diberikan terapi klorokuin. Kelompok IV adalah kelompok mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dan diberikan terapi klorokuin serta serbuk Lumbricus rubellus. Kelompok V adalah kelompok mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dan diberikan terapi serbuk Lumbricus rubellus. Organ hati mencit diambil untuk dilakukan isolasi RNA, RT-PCR dan elektroforesis untuk melihat ekspresi gen TNF-α. Hasil penelitian menunjukkan kelompok III, IV, dan V mempunyai ekspresi gen yang lebih rendah dibanding kelompok I dan II, dengan kelompok IV menunjukkan ekspresi gen TNF-α yang paling rendah. Hasil uji Kruskal Wallis masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan yang signifikan (p < 0,05). Uji post hoc Mann-Whitney menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan dengan nilai p < 0,05 pada seluruh kelompok perlakuan. Terapi kombinasi klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus pada mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan terapi hanya dengan menggunakan klorokuin atau Lumbricus rubellus saja. Kata kunci : malaria, klorokuin, Lumbricus rubellus, TNF-α

Page 4: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

ABSTRACT

DEWI WULANDARI, G0006069, 2010. The Effect of Combination Therapy of Chloroquin and Lumbricus rubellus to The TNF-α Gene Expression in Swiss Mice that Infected by Plasmodium berghei ANKA. Now, malaria is still a major problem in the tropical countries. Research has proven that fatal complication in malaria is caused by pro-inflammatory cytokines especially TNF-α. Lumbricus rubellus that has fibrinolitic activity, is already used in cure many inflammation diseases. This research is aimed to know the effect of combination therapy of chloroquin and Lumbricus rubellus to the TNF-α gene expression in swiss mice that are infected by Plasmodium berghei ANKA. The method of this research is laboratoric experiment. The mice that were used in this research were male, the age was 3 months with weight about 20-30 g. Mice were divided into 5 groups. First group was given no treatment. Second group was only infected by Plasmodium berghei ANKA. Third group was infected by Plasmodium berghei ANKA and given chloroquin as therapy. Fourth group was infected by Plasmodium berghei ANKA and given combination therapy both chloroquin and Lumbricus rubellus. Fifth group was infected by Plasmodium berghei ANKA and given Lumbricus rubellus as therapy. The liver of the mice was taken, then the isolation of RNA, RT-PCR and electrophoresis was done to measure the TNF-α gene expression. The analyzing result shows that group III, IV, and V have the TNF-α expression lower than group I and II with group IV is the lowest TNF-α expression. The Kruskal Wallis test shows that there is difference significantly in the every group (p < 0.05). The Post Hoc Mann-Whitney test shows that there is difference significantly between all of the group (p < 0.05). Combination therapy of chloroquin and Lumbricus rubellus in malaria mice show better result than therapy only with chloroquin or Lumbricus rubellus. Keywords : malaria, chloroquin, Lumbricus rubellus, TNF-α

Page 5: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis bisa menyelesaikan penyusunan skripsi yang berjudul Pengaruh Pemberian Terapi Kombinasi Klorokuin dan Serbuk Lumbricus rubellus terhadap Ekspresi Gen TNF-α pada Mencit Swiss yang Diinfeksi Plasmodium berghei ANKA.

Dalam pelaksanaan menyusun skripsi ini penulis tidak terlepas dari berbagai hambatan dan kesulitan. Namun berkat bimbingan dan bantuan berbagai pihak, penulis dapat menyelesaikannya. Untuk itu penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Prof. Dr. A.A. Subijanto, dr., MS., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Sri Wahjono, dr., M.Kes., selaku Ketua Tim Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Paramasari Dirgahayu, dr., Ph.D., selaku Pembimbing Utama yang dengan penuh kesabaran meluangkan waktunya; memberikan bimbingan, saran, koreksi, dan nasehat kepada penulis.

4. Mujosemedi, Drs., Msc., selaku Pembimbing Pendamping yang telah memberikan koreksi kepada penulis.

5. Dr. FX Bambang Sukilarso Sakiman, MS., selaku Penguji Utama yang telah berkenan menguji sekaligus memberikan saran dan juga koreksi bagi penulis.

6. Sigit Setyawan, dr., selaku Penguji Pendamping yang telah berkenan menguji dan memberikan saran yang berarti bagi penulisan skripsi ini.

7. Segenap staf skripsi, staf Laboratorium Parasitologi FK UNS atas segala bantuan dan kerjasamanya dalam penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh

karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu kedokteran pada khususnya dan masyarakat pada umumnya.

Surakarta, Juli 2010

Penulis

Page 6: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR……………………………………………………………………………v

DAFTAR ISI…………………………………………………………………………………….vi

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………………..………ix

DAFTAR TABEL……………………………………………………………..………………….x

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………………………………..xi

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah………………………………………..…………………1

B. Perumusan Masalah……………………………………………………………….3

C. Tujuan Penelitian……………………………………………….…………………3

D. Manfaat Penelitian…………………………………..…………………..……….4

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka…………………………………..………………………..……5

1. Malaria……………………………………………………...……………5

2. Siklus hidup Plasmodium Malaria………………...…………………….6

3. Patogenesis Malaria……………………………………………….……..7

4. Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)………………………… …..………11

5. Lumbricus rubellus………………………………………………………15

a. Taksonomi………………………………………..………………15

b. Kandungan……………………………………….………………16

c. Karakteristik Lumbrokinase……………………...………………17

6. Plasmodium berghei ANKA………………………….…………………18

a. Taksonomi…………………………..……………………………18

Page 7: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

b. Siklus Hidup……………………………………..………………19

7. Mencit Swiss………………………..…………………...………………21

8. Klorokuin……………………………………………..…………………22

B. Kerangka Pemikiran………………………………………………..……………24

C. Hipotesis…………………………………………………………………………24

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian………………………………………………..…………………26

B. Lokasi Penelitian………………………………………….……………..………26

C. Subyek Penelitian……………………………………………………..…………26

D. Teknik Sampling……………………………………………………...…………26

E. Identifikasi Variabel Penelitian………………………….………………………27

F. Definisi Operasional………………………………………………..……………27

G. Alur Penelitian……………………………………………………...……………30

H. Alat dan Bahan……………………………...……………………………………31

1. Alat……………………………………………….………………..……31

2. Bahan………………………………………………..…………..………32

I. Cara Kerja………………………………………………………….……………33

1. Kultur Plasmodium berghei in vivo (perbanyakan parasit)………….….33

2. Perlakuan terhadap mencit……………………………...………….……34

3. Penentuan Parasitemia………………………….…………………….…35

4. Pengambilan Sampel Hati……………………………………………….35

5. Pemeriksaan Ekspresi Gen TNF-α dan β-actin………….………………36

a. Ekstraksi RNA…………………………………..………………36

Page 8: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

b. RT-PCR……………………………………….…………………38

c. Elektroforesis………………………………….…………………42

d. Analisis ekspresi gen……….…………………………………….44

J. Analisis Data………………………….……………………………………….…44

BAB IV HASIL PENELITIAN

A. Derajat Parasitemia………………………………………………………………46

B. Ekspresi Gen TNF-α………………………………………………….…………48

BAB V PEMBAHASAN…………………………………………………….………………….53

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan…………………………………………………………………………58

B. Saran………………………………………………………..……………………58

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………………..…….59

LAMPIRAN

Page 9: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Siklus Hidup Plasmodium……………………………………...…………………6

Gambar 2. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Patogenesis Malaria………..……………….8

Gambar 3. Cytoadherence dan Rosetting………….……………………………..…………10

Gambar 4. Hubungan antara Pro-Inflamasi Sitokin dengan Timbulnya Komplikasi pada

Malaria…………………………………………………………...………………13

Gambar 5. Lumbricus rubellus…………………………………………………...………….16

Gambar 6. Mencit Swiss……………………………………………………………………..22

Gambar 7. Infeksi Plasmodium berghei ANKA pada eritrosit………………….………….47

Gambar 8. Grafik rata-rata derajat parasitemia setiap kelompok perlakuan………..………48

Gambar 9. Grafik rata-rata % Ekspresi Gen TNF-α pada setiap kelompok perlakuan….….49

Gambar 10. Gambaran Elektroforesis Ekspresi Gen TNF-α pada Organ Hati dan

Limpa….........................................................................................................52

Page 10: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Nama Parasit (protein) dan Reseptornya pada Host…………….………………………9

Tabel 2. Karakteristik Plasmodium berghei…………………………………………..…………20

Tabel 3. Rata-rata Derajat Parasitemia untuk Setiap Kelompok Perlakuan……………………..47

Tabel 4. Rata-rata % Ekspresi Gen TNF-α pada Setiap Kelompok Perlakuan………...………..49

Tabel 5. Hasil Uji Normalitas…..……………………………………………….………………50

Tabel 6. Hasil Uji Kruskal Wallis………………………………………...……………………..50

Tabel 7. Hasil Uji Mann Whitney………………………...…...………………………………...51

Page 11: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

DAFTAR LAMPIRAN

LAMPIRAN 1. Tabel Konversi Dosis Manusia dan Hewan

LAMPIRAN 2. TRIzol® RNA Isolation Protocol

LAMPIRAN 3. Invitrogen (TRIzol® Reagent)

LAMPIRAN 4. SuperScript TM III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA

Polymerase

LAMPIRAN 5. Hasil Penghitungan Densitometri Ekspresi Gen TNF-α dengan INH Imager

LAMPIRAN 6. Uji Normalitas Data

LAMPIRAN 7. Hasil Uji Kruskal-Wallis

LAMPIRAN 8. Hasil Uji Mann-Whitney

LAMPIRAN 9. Foto-foto Penelitian

LAMPIRAN 10. Ethical Clearance

Page 12: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Malaria masih merupakan masalah kesehatan terutama di negara-negara tropis

dengan mortalitas satu juta kematian per tahunnya (WHO cited CDC, 2004). Lebih dari 45%

penduduk dunia pernah mengalami malaria. Di Indonesia malaria telah menyebar ke seluruh

kepulauan terutama di bagian timur (Afandi et al., 2008). Terdapat 15 juta kasus dan 42 ribu

kematian akibat malaria tiap tahunnya (Depkes, 2003). Upaya pemberantasan malaria di

Indonesia masih mengalami beberapa kendala antara lain timbulnya resistensi vektor

terhadap pestisida, timbulnya resistensi Plasmodium terhadap obat antimalaria, pengetahuan

masyarakat terhadap malaria rendah, dll (Zein, 2005). Berbagai hal tersebut diatas

menyebabkan mortalitas dan morbiditas malaria tetap tinggi. Hal ini ditandai salah satunya

dengan re-emerging dari malaria pada tahun 2007 (Eurosurveillance, 2007).

Mortalitas pada malaria terutama disebabkan oleh komplikasi fatal yang sering

terjadi. Pada malaria falciparum, misalnya terjadi blackwater fever, anemia berat, serebral

malaria, dll. Hasil penelitian membuktikkan dasar patogenesis dari komplikasi fatal ini

adalah tingginya sitokin pro-inflamasi seperti TNF-α, IL-1, NO, COX-2. Dilaporkan

progresivitas dari serebral malaria terkait dengan tingginya konsentrasi dari TNF-α di serum

(Grau et al., 1987; Clark et al., 1990; Neill & Hunt., 1995). Tingginya TNF-α mengakibatkan

sel-sel endotel pembuluh darah mengekspresikan reseptor yang dapat berikatan dengan

eritrosit terinfeksi atau Parasite-Red Blood Cell (P-RBC), proses ini disebut cytoadherence

Page 13: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

atau sekuestrasi, selain itu TNF-α juga menyebabkan P-RBC berikatan dengan P-RBC lain

atau P-RBC dengan RBC, fenomena ini disebut rosetting. Cytoadherence dan rosetting

merupakan dasar patogenesis utama terjadinya komplikasi fatal pada malaria (Miller et al.,

2002).

Teori bahwa TNF-α yang jumlahnya berlebihan sebagai dasar patogenesis komplikasi

malaria juga didukung oleh hasil studi yang menunjukkan pasien dengan komplikasi serebral

malaria mempunyai nilai TNF-α (75 pg/ml) yang lebih tinggi dibanding pasien malaria tanpa

komplikasi (36,1 pg/ml) (Badan Litbang Kesehatan, 2006).

Berdasarkan fakta-fakta tersebut di atas, para peneliti berusaha untuk

mengembangkan strategi pencegahan komplikasi malaria dengan menggunakan obat-obatan

yang dapat menurunkan atau menghambat produksi TNF-α, seperti anti TNF-α Monoklonal

Ab, Pentoxyfilline, N-acetyl cysteine, dll. Akan tetapi, penggunaan obat-obat tersebut di

klinik masih kontradiktif diantara peneliti (Mohanty et al., 2006), bahkan dilaporkan

pengobatan dengan anti-TNFα Monoklonal Ab pada anak-anak tidak berhasil mengatasi

serebral malaria (Hermsen et al., 1997). Sehingga, alternatif terapi yang efisien dan aman

dalam upaya pencegahan komplikasi malaria masih dibutuhkan.

Lumbricus rubellus telah digunakan sejak dulu dalam pengobatan berbagai penyakit

(Mihara et al., 1991), dan hingga kini masih digunakan terutama dalam pengobatan penyakit-

penyakit inflamasi seperti rheumatoid arthritis, infeksi bakteri, Lyme disease (Allergy

Research Group, 2008). Lumbricus rubellus memiliki enzim-enzim seperti Lumbrokinase

yang bekerja sebagai fibrinolitik dengan cara meningkatkan aktivitas t-PA (tissue-

Plasminogen Activator). Kandungan lainnya adalah Lumbrofebrin yang telah terbukti

Page 14: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

sebagai antipiretik antiinflamasi, dan Lumbricin I sebagai antimikroba yang bekerja dengan

cara merusak biofilm yang dihasilkan bakteri.

Berdasarkan fakta di atas, peneliti berasumsi bahwa Lumbricus rubellus yang telah

terbukti sebagai antiinflamasi dapat digunakan untuk menurunkan kadar TNF-α pada

malaria, sehingga pencegahan kearah komplikasi malaria dapat diminimalisir.

Penelitian sebelumnya membuktikkan bahwa Lumbricus rubellus tidak mempunyai

efek antiprotozoa, sehingga apabila penelitian ini berhasil, ke depannya Lumbricus rubellus

akan menjadi terapi pendukung (adjuvant therapy) pada pengobatan malaria (Wardhani,

2008).

B. PERUMUSAN MASALAH

Bagaimanakah pengaruh terapi kombinasi klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus

terhadap ekspresi gen TNF-α pada mencit swiss yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA?

C. TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh terapi kombinasi

klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus terhadap ekspresi gen TNF-α pada mencit swiss

yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA?

Page 15: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

D. MANFAAT PENELITIAN

1. Aspek Teoritis

a. Memberikan bukti-bukti empiris tentang pengaruh terapi kombinasi klorokuin dan

serbuk Lumbricus rubellus terhadap ekspresi gen TNF-α pada mencit swiss yang

diinfeksi Plasmodium berghei ANKA?

b. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan rujukan untuk penelitian, baik

mengenai Lumbricus rubellus maupun malaria lebih lanjut.

2. Aspek Aplikatif

Memberikan informasi ilmiah tentang manfaat terapi kombinasi klorokuin dan serbuk

Lumbricus rubellus yang mungkin berpotensi digunakan sebagai terapi pendukung

(adjuvant therapy) pada malaria falciparum.

Page 16: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

BAB II

LANDASAN TEORI

A. TINJAUAN PUSTAKA

1. Malaria

Malaria, yang telah dikenal lebih dari 4000 tahun lalu, merupakan penyakit

infeksi parasit, yaitu Plasmodium yang ditularkan lewat gigitan nyamuk Anopheles

betina. Penyakit ini menyerang eritrosit dan ditandai dengan ditemukannya bentuk

aseksual di dalam darah (CDC, 2004; Zein, 2005; Harijanto, 2007).

Enam puluh persen kasus malaria terjadi di seluruh dunia dan sedikitnya setiap

tahun terjadi satu juta kematian akibat malaria (World Malaria Report cited CDC, 2004).

Indonesia merupakan daerah endemis malaria. Sejak tahun 1959, Indonesia telah

melakukan program pelaksanaan dan pemberantasan penyakit malaria, namun hingga

saat ini angka morbiditas dan mortalitas masih tinggi (Zein, 2005).

Malaria pada manusia disebabkan empat spesies Plasmodium, yaitu falciparum,

malariae, vivax, dan ovale dimana infeksi Plasmodium falciparum merupakan penyebab

kesakitan dan kematian tertinggi di antara jenis malaria lain (CDC, 2004).

Komplikasi terberat dari malaria yang diduga sebagai penyebab utama kematian

dan kesakitan adalah anemia berat dan serebral malaria. Penelitian membuktikkan bahwa

respon sistem imun tubuh terhadap malaria juga berkontribusi pada patofisiologi malaria

pada manusia (Perlmann & Blomberg., 2002).

Page 17: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

2. Siklus hidup Plasmodium malaria

Siklus hidup Plasmodium (perhatikan Gambar 1) dapat dibagi dalam fase seksual

eksogen (sporogoni) yang berada di dalam badan nyamuk Anopheles dan fase aseksual

(skizogoni) di dalam badan hospes vertebrata. Fase aseksual (skizogoni) dapat dibagi

menjadi daur eritrosit dalam darah (skizogoni eritrosit) dan daur dalam sel parenkim hati

(skizogoni eksoeritrosit) (Gandahusada et al., 1998).

Gambar 1. Siklus hidup Plasmodium (Rosenthal, 2008)

Nyamuk Anopheles memasukkan Plasmodium (sporozoit) ke hospes lewat

gigitan, dan dengan cepat sporozoit ini akan beredar di jaringan subkutan, ke pembuluh

darah dan akhirnya sampai di hati dalam waktu 45 menit. Plasmodium (sporozoit)

mempunyai reseptor TRAP (Thrombospondin-related adhesive protein) yang

memungkinkan sporozoit dapat berikatan dengan heparin sulfat proteoglikan pada sel-sel

Page 18: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

hepatosit di hati. Di sel-sel hepatosit dimulailah reproduksi aseksual untuk membentuk

skizon intrasel. Skizon-skizon ini apabila matur akan mengandung ribuan merozoit.

Merozoit-merozoit ini akan beredar di aliran darah dan dengan cepat akan menyerang

eritrosit untuk memulai siklus eritrositik. Merozoit dapat menempel pada eritrosit melalui

reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan eritrosit.

Di dalam eritrosit, merozoit akan berkembang menjadi tropozoit lalu skizogoni

(skizon). Ketika skizon matang, eritrosit ruptur (pecah) dan melepaskan merozoit yang

akan menyerang eritrosit lainnya. Beberapa eritrosit akan berkembang ke bentuk seksual

(gametosit) yang apabila darah manusia dihisap oleh nyamuk, gametosit ini akan

mengalami perkembangan di dalam gut (usus) nyamuk. Perkembangan ini akan

membentuk zigot kemudian ookinet dan kemudian menjadi ookista pada dinding gut

nyamuk. Ookista yang ruptur akan melepaskan sporozoit yang akan bermigrasi ke

kelenjar saliva nyamuk dan siap untuk diinjeksikan ke manusia (Ho & White., 1999).

3. Patogenesis malaria

Secara umum, patogenesis malaria dipengaruhi oleh beberapa faktor (perhatikan

Gambar 2) seperti parasit, host (inang), serta geografis dan sosial.

Setelah melalui jaringan hati, Plasmodium akan melepaskan merozoit ke dalam

sirkulasi. Beberapa merozoit akan menginvasi sel darah merah. Siklus ini disebut siklus

aseksual dalam eritrosit. Keadaan inilah yang bertanggungjawab pada patogenesis

malaria pada manusia.

Parasite factors Host factors Geographic and Social factors

Drug resistance Multiplication rate Invasion pathways Cytoadherence Rosetting Antigenic polymorphism Antigenic variation (PfEMP1) Malaria toxin

Immunity Inflammatory cytokines Genetics (sickle cell trait, thalassaemia,

ovalocytosis, Gorbich RBC, CD36, TNF-α, ICAM-1, CR1, MHC locus)

Age (no cerebral malaria in infants) Pregnancy

Access to treatment Cultural and economic factors Political stability Transmission intensity (Anopheles spp.

Seasonality of transmission, infectious per year, epidemics)

Page 19: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Gambar 2. Faktor-faktor yang mempengaruhi patogenesis malaria (Miller et al., 2002).

Invasi ke dalam sel darah merah dapat dimungkinkan dengan terdapatnya

reseptor-reseptor antara parasit dan sel darah merah. Pada tabel 1 diberikan nama reseptor

pada parasit (protein) dan sel darah merah yang memfasilitasi terjadinya invasi parasit ke

dalam sel darah merah.

Baik Plasmodium falciparum maupun Plasmodium vivax dapat menyebabkan

anemia berat, tetapi hanya Plasmodium falciparum yang dapat menyebabkan banyak

komplikasi seperti serebral malaria, hipoglikemia, asidosis metabolik, respiratory

distress. Perbedaan itu disebabkan beberapa hal : (1) Plasmodium falciparum menyerang

sejumlah besar sel darah merah sedangkan Plasmodium vivax hanya menyerang

retikulosit. (2) Plasmodium vivax hanya menyerang Duffy Blood Group dan Retikulosit

(tabel 1), sedangkan Plasmodium falciparum punya banyak cara untuk menyerang sel

darah merah.

Tabel 1. Nama Parasit (protein) dan Host Receptors (Miller et al., 2002).

Page 20: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Perbedaan penting antara Plasmodium falciparum dengan jenis Plasmodium

lainnya adalah kemampuannya memodifikasi permukaan sel darah merah sehingga P-

RBC dapat berikatan dengan endotelium dan plasenta. Pada permukaan P-RBC banyak

terdapat knob-knob yang disinyalir merupakan alat perlekatan ke sel-sel host serta

merupakan alat penghindar parasit dari sistem imun dan klirens limpa. Perlekatan antara

P-RBC dengan sel-sel host inilah merupakan penyebab utama patogenesis malaria.

Perlekatan antara P-RBC dengan sel-sel host disebut sekuestrasi yang dapat terjadi pada

banyak organ seperti jantung, paru-paru, otak, hati, ginjal, jaringan subkutan, dan

plasenta.

Faktor-faktor patogenesis malaria falciparum antara lain cytoadherence,

sekuestrasi, rosetting. Cytoadherence merupakan perlekatan antara P-RBC pada

permukaan endotel vaskular. Cytoadherence terjadi dengan cara molekul adhesif yang

ada di permukaan P-RBC melekat dengan molekul adhesif yang ada di permukaan

endotel. Molekul adhesif pada permukaan P-RBC antara lain, P. falciparum erythrocyte

membrane protein-1 (PfEMP-1). Sedangkan, molekul adhesif pada permukaan endotel

Parasit (protein) Host Receptors

P. vivax Duffy blood group

P.falciparum (EBA-175) Glycophorin A

P.falciparum (MAEBL) Unknown

P.falciparum (PfEMP1) CD36, ICAM-1, CSA, etc

P.vivax (RBL1) Retyculocytes

P.falciparum (RBL1) Trypsin-resistant and neuraminidase-sensitive on red cells

P.vivax (RBL2) Retyculocytes

P.falciparum (RBL2) Unknown

Page 21: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

adalah CD36, trombospondin, Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell

adhesion molecule (VCAM), endothel leucocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1),

glycosaminoglycan chondroitin sulfate A.

Gambar 3. Cytoadherence (kiri) dan Rosetting (kanan) (Ho & White, N.J. 1999;

Miller et al., 2002).

Cytoadherence menyebabkan P-RBC matur tidak beredar kembali dalam

sirkulasi. P-RBC matur yang tinggal dalam jaringan mikrovaskular mengalami

sekuestrasi. Hanya Plasmodium falciparum yang mengalami sekuestrasi. Sekuestrasi ini

terjadi pada organ-organ vital dan hampir semua jaringan dalam tubuh. Sekuestrasi

tertinggi terjadi di otak. Sekuestrasi ini juga diduga memegang peranan utama dalam

patofisiologi malaria berat. Selain itu terjadi juga rosetting dimana P-RBC dengan

eritrosit saling menempel. Plasmodium yang dapat melakukan cytoadherence juga dapat

melakukan rosetting. Rosetting menyebabkan obstruksi pembuluh darah yang

memudahkan terjadinya cytoadherence.

Patogenesis malaria salah satunya juga akibat adanya sitokin pro-inflamasi.

Sitokin ini terekspresi di sel endotel, monosit, dan makrofag yang mendapat stimulasi

Page 22: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

dari malaria toksin (LPS, GPI). Sitokin-sitokin ini antara lain Tumor Necrosis Factor-α

(TNF-α), interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-3 (IL-3), lymphotoxin

(LT), dan interferon-γ (IFN-γ) (Miller et al., 2002; Harijanto, 2007).

4. Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)

TNF-α adalah mediator dari inflamasi akut dan bertanggung jawab atas

komplikasi sistemik pada infeksi berat. Sumber-sumber TNF-α adalah sel-sel fagosit

mononuklear yang teraktivasi, pengeluaran TNF-α dari makrofag terutama dirangsang

oleh lipopolisakarida (LPS). TNF-α berukuran 17 kD; 51-kD homotrimer.

TNF-α yang terekspresi di sel-sel endotel akan merangsang aktivasi sitokin-

sitokin pro-inflamasi lain, yang menyebabkan terjadi inflamasi dan koagulasi. TNF-α

akan merangsang aktivasi neutrofil. Di hipotalamus, TNF-α akan menyebabkan demam.

Pada hati, TNF-α akan menyebabkan sintesis protein pada fase akut. Pada sel-sel otot dan

lemak, TNF-α akan menyebabkan katabolisme, dan pada sebagian sel akan menyebabkan

apoptosis.

Aksi biologi TNF-α pada prinsipnya adalah menstimulasi pengambilan neutrofil

dan monosit pada tempat infeksi, untuk kemudian mengaktivasinya untuk membunuh

bakteri. Aksi biologi dari TNF-α antara lain: (1) TNF-α di sel-sel endotel vaskular akan

menyebabkan ekspresi molekul adhesi pada permukaan endotel, ekspresi ini yang

membuat permukaan endotel dapat berikatan dengan leukosit, neutrofil, monosit, dan

limfosit. (2) TNF-α menstimulasi sel-sel endotel dan makrofag untuk menyekresikan

kemokin, sekresi kemokin ini menyebabkan kemotaksis dan pengambilan leukosit yang

lebih banyak. TNF-α juga merangsang sel-sel fagosit mononuklear untuk

Page 23: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

mengekspresikan IL-1, dimana IL-1 fungsinya mirip dengan TNF-α. (3) TNF-α

menginduksi apoptosis beberapa tipe sel, tapi mekanisme apoptosis ini belum jelas.

Pada infeksi berat, TNF-α diproduksi dalam jumlah besar dan dapat menyebabkan

keadaan patologis. Mekanisme dimungkinkan oleh hal-hal berikut : (1) TNF-α dapat

meningkatkan prostaglandin lewat cytokine-stimulated hypothalamus cells. Hal inilah

yang membuat TNF-α dapat menyebabkan demam dengan merangsang hipotalamus. (2)

TNF-α dapat bekerja di sel-sel hepatosit yang merangsang sintesis beberapa protein

serum seperti serum amyloid A protein dan fibrinogen. (3) Produksi TNF-α yang lama

dan berlebih dapat menyebabkan wasting sel-sel otot dan lemak yang berakibat kakeksia.

Hal ini disebabkan TNF-α dapat menekan nafsu makan dan menurunkan sintesis

lipoprotein lipase, enzim yang membantu supaya asam lemak dapat digunakan di

jaringan. (4) Ketika sejumlah besar TNF-α diproduksi dan produksinya mencapai 10-7 M

atau lebih, akan terjadi kontraksi miokardial dan sel-sel otot polos pada pembuluh darah.

(5) TNF-α membuat trombosis intravaskuler yang disebabkan terutama karena hilangnya

zat-zat antikoagulan. TNF-α dapat menghambat ekspresi trombomodulin, yaitu zat

penghambat koagulasi. (6) TNF-α yang banyak beredar di pembuluh darah dapat

menyebabkan hipoglikemia akibat penggunaan glukosa yang berlebih oleh otot dan

kegagalan hati untuk memproduksi glukosa kembali (Abbas & Lichtman, 2000).

Dalam hubungannya dengan malaria, TNF-α merupakan salah satu sitokin pro-

inflamasi yang dipercaya memegang peranan besar terjadinya komplikasi pada malaria

(Kumar et al., 2003). Sejumlah penelitian mendukung dugaan bahwa banyak keadaan

patologis pada malaria diakibatkan TNF-α (Clark., 1990). Studi menunjukkan, tikus di

laboratorium dapat dicegah dari serebral malaria dengan memberikan antibodi spesifik

Page 24: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

terhadap TNF-α (Bate et al., 1988). Lebih lanjut, sel-sel ginjal tikus yang terinfeksi

dengan letal dan non-letal parasit mendapat aktivitas sitotoksik yang diperantarai TNF-α

(Taverne et al., 1989).

Gambar 4. Hubungan antara sitokin pro-inflamasi dengan timbulnya komplikasi pada malaria (Clark et al, 2006).

Produksi TNF-α pada malaria salah satunya diakibatkan eritrosit rusak, dan

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) yang terdapat pada merozoit diduga merupakan

molekul utama yang menginduksi pengeluaran TNF-α (Bate & Kwiatkowski., 1994).

Bagaimana sitokin pro-inflamasi (terutama TNF-α) dapat menyebabkan berbagai

komplikasi pada malaria dijelaskan dalam Gambar 4.

Di sini dapat dijelaskan bahwa sitokin pro-inflamasi mempunyai pengaruh pada

banyak organ melalui proses anemia dan vasooklusi dimana terjadinya proses-proses ini

akan menyebabkan suplai oksigen ke mitokondria menurun yang apabila terjadi terus

P.falciparum

Sel Host

Pro-inflammatory cytokines (TNF-α,

dll))

Langsung berpengaruh pada mitokondria

Tulang diseritropoeisis anemia

Jantung insufisiensi

Vasooklusi

Eritrosit deformabilitas

Aktivasi endothelial sekuestrasi

Kemampuan menggunakan O2

Disfungsi

mitokondria (encephalopathy, hiperlaktataemia,

asidosis metabolik)

Suplai O2 ke mitokondria

· Adherensi monosit · Adherensi platelet · mikropartikel

Page 25: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

menerus akan menyebabkan disfungsi dari mitokondria. Menurut Clark et al (2006) hal

ini disebabkan oleh :

a. Sitokin pro-inflamasi mengurangi kemampuan mitokondria menggunakan oksigen.

Ini terjadi dalam beberapa cara :

1) Sitokin pro-inflamasi menghilangkan oxidative phosphorylation di dalam

mitokondria sehingga mengakibatkan hiperlaktataemia.

2) Sitokin pro-inflamasi dapat menghentikan glikolisis aerob menyebabkan glikolisis

meningkat kemudian produksi laktat akan meningkat, mengakibatkan asidosis

metabolik yang akhirnya menyebabkan penipisan energi selular.

3) Sitokin pro-inflamasi membentuk peroxynitrate (OONO), yaitu sebuah produk

dari NO yang mana OONO ini dapat mengurangi simpanan NAD di sel, dan

usaha untuk membentuk kembali NAD akan mengurangi jumlah ATP.

b. Mitokondria kekurangan oksigen.

Keadaan-keadaan itulah yang akhirnya menyebabkan banyak komplikasi fatal

pada penderita malaria seperti gagal ginjal akut, malaria biliosa, hipoglikemia,

blackwater fever, anemia berat, dan serebral malaria. Teori bahwa TNF-α yang

memegang peranan penting dalam komplikasi malaria juga didukung hasil laboratorium

yang menunjukkan orang dengan serebral malaria mempunyai nilai TNF-α (75,1

picogram/ml) yang lebih tinggi daripada penderita malaria tanpa komplikasi (36,9

picogram/ml) (Badan Litbang Kesehatan, 2006).

5. Lumbricus rubellus

a. Taksonomi

Kingdom : Animalia

Page 26: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Sub Kingdom : Metazoa

Filum : Annelida

Kelas : Oligochaeta

Ordo : Haplotaxida

Sub Ordo : Lumbricina

Famili : Lumbricidae

Genus : Lumbricus

Spesies : Lumbricus rubellus

(Wikipediab, 2009).

Cacing tanah Lumbricus rubellus secara umum mempunyai ciri-ciri: terdapat

segmen luar dan dalam pada tubuhnya, berambut, tidak mempunyai kerangka luar,

tubuhnya dilindungi oleh kutikula, dan tidak memiliki mata. Selain itu, pada

permukaan tubuhnya terdapat lendir yang berfungsi mempermudah pergerakannya di

tempat yang padat dan kasar. Sebagai pengganti mata, cacing tanah Lumbricus

rubellus memiliki prostomium yang merupakan organ syaraf perasa dan berbentuk

seperti bibir. Pada bagian akhir terdapat anus yang digunakan untuk mengeluarkan

sisa-sisa makanan dan tanah yang dimakannya. Kotoran yang keluar dari anus

tersebut sangat berguna bagi tanaman karena sangat kaya dengan unsur hara. Kotoran

tersebut dikenal dengan nama kascing. Cacing tanah Lumbricus rubellus bereaksi

negatif terhadap sinar matahari atau sinar lainnya, sinar ini dapat mematikan hanya

dalam waktu satu menit.

Page 27: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Gambar 5. Lumbricus rubellus (Earthworm, 2009)

Siklus hidup cacing tanah Lumbricus rubellus secara umum, dimulai dari telur,

cacing muda, cacing produktif, dan cacing tua. Berbagai penelitian menunjukkan

lama siklus hidupnya hingga mati mencapai 1-5 tahun.

Cacing tanah Lumbricus rubellus mempunyai banyak manfaat bagi kehidupan

manusia misalnya berperan sebagai penghasil pupuk organik, sebagai pendaur ulang

limbah, sebagai bahan baku pakan ternak dan ikan, sebagai umpan memancing,

sebagai makanan burung, sebagai bahan baku obat dan kosmetika, dan sebagai bahan

baku makanan dan minuman (Palungkun, 1999).

b. Kandungan

Cacing tanah Lumbricus rubellus (dalam kondisi kering) memiliki kandungan

protein tinggi (64-76%), lemak (7-10%), kalsium (0,55%), fosfor (1%), serat kasar

(1,08%), dan auxin sebagai zat perangsang tumbuh untuk tanaman. Protein yang

sangat tinggi terdiri dari setidaknya sembilan macam asam amino esensial dan empat

macam asam amino non-esensial.

Berbagai penelitian menunjukkan bahwa cacing tanah Lumbricus rubellus

mengandung enzim fibrinolitik (lumbrokinase), lumbrofebrin, lumbricin I,

peroksidase, katalase, dan selulose, yang mana enzim-enzim ini berguna dalam

pengobatan. Selain itu, kandungan asam arakhidonat dalam lumbrofebrin dapat

Page 28: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

menurunkan panas tubuh yang disebabkan infeksi (Mihara et al., 1991; Palungkun,

1999).

c. Karakteristik Lumbrokinase

Enzim fibrinolitik (lumbrokinase) memiliki beberapa karakteristik :

1) Dapat menghidrolisis tidak hanya fibrin yang kaya plasminogen, tetapi juga fibrin

yang bebas plasminogen.

2) Aktivitas fibrinolitiknya sekitar 100 CU (plasmin units) atau 250 IU (urokinase

units)/gram berat badan.

3) Memiliki berat molekul rata-rata 20.000.

4) Stabil di panas.

5) Memiliki pH optimal antara 7.4-9.

6) Purifikasi terhadap enzim ini telah dilakukan dan didapatkan 3 fraksi dari enzim

ini. Tiga fraksi ini kemudian di subdivisikan lagi. F-I dibagi menjadi F-I-0, F-I-1,

F-I-2. F-II tidak dapat dibagi, dan F-III dibagi menjadi F-III-1 dan F-III-2.

7) F-I mewakili enzim yang mirip kimotripsin. F-III mewakili enzim yang mirip

tripsin, dan F-II tidak mirip kimotripsin, tripsin, ataupun elastase.

8) Diisopropyl fluorophosphates (DFP) dan soybean trypsin inhibitor (SBTI)

menghambat enzim ini, tapi anti-plasmin (t-AMCHA) hanya sedikit

memperlihatkan efek penghambatan ini.

9) Enzim ini dihasilkan dari saluran pencernaan cacing tanah Lumbricus rubellus,

terutama bagian faring, tembolok, empedal, dan anterior intestinum.

10) Memiliki berat molekul sekitar 72 bp (base pairs).

Page 29: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

(Mihara et al., 1991).

Enzim yang memiliki aktivitas fibrinolitik dengan aktivitas mirip protease serin,

yaitu kelompok F-III (Kayaputri, 2008).

6. Plasmodium berghei ANKA

a. Taksonomi

Kingdom : Protista

Filum : Apicomplexa

Kelas : Aconoidasida

Ordo : Haemosporida

Famili : Plasmodiidae

Genus : Plasmodium

Spesies : Plasmodium berghei

(Leids Universitair Medisch Centrum, 2008)

Plasmodium berghei adalah protozoa uniseluler yang ditransmisikan melalui

nyamuk Anopheles dan masuk ke pembuluh darah lewat gigitan nyamuk betina.

Plasmodium berghei memiliki 14 kromosom, dan ukuran genomnya hampir sama

dengan Plasmodium falciparum, yaitu sekitar 25-30 Mb. Hasil studi melaporkan

malaria akibat infeksi Plasmodium berghei analog dengan malaria yang terjadi pada

manusia dan hewan primata lain, terutama pada aspek-aspek penting seperti struktur,

fisiologi, dan siklus hidup. Infeksi Plasmodium berghei juga berpengaruh pada otak

dan dapat menyebabkan komplikasi serebral pada hewan coba. Gejala-gejala yang

Page 30: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

terjadi pun hampir mirip dengan serebral malaria pada manusia yang terinfeksi

Plasmodium falciparum (Leids Universitair Medisch Centrum, 2008).

Plasmodium berghei adalah model yang baik untuk penelitian malaria, karena :

1) Teknologi penanaman in vitro dan adanya skala besar produksi dan purifikasi

pada setiap siklus hidup yang berbeda.

2) Pengetahuan dalam pengorganisasian dan sekuensi genom.

3) Metodologi untuk memodifikasi genetik parasit.

4) Adanya klon yang terkarakterisasi dengan baik dan genetik yang dapat

dimodifikasi.

Pemeliharaan Plasmodium berghei di laboratorium dapat dilakukan dengan cara :

1) Menyimpan darah mencit yang mengandung parasit dalam suhu -70O atau dalam

nitrogen cair.

2) Memeliharanya dalam makhluk hidup (pasase), yang merupakan cara

pemeliharaan kelangsungan perkembangan aseksual.

b. Siklus Hidup

Siklus hidup Plasmodium berghei secara umum adalah :

1) Fase perkembangan sporozoit dan pre-eritrosit.

Infeksi dimulai ketika nyamuk yang telah terinfeksi plasmodium menggigit host,

yang mana ketika menggigit, nyamuk juga menginokulasi haploid sporozoit pada

aliran darah.

2) Fase perkembangan eritrosit.

Page 31: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Haploid merozoit yang dilepaskan dalam bentuk skizon pada hepar menginvasi

sel darah merah.

Tabel 2. Karakteristik Plasmodium berghei (Leids Universitair Medisch Centrum, 2008).

P.berghei Human parasites

Merozoit per skizon 12-18 8-16 (32)

Lebih suka retikulosit Ya Ya/Tidak

Serempak menginfeksi darah Tidak Ya/Tidak

Suhu optimum transmisi nyamuk 19-21 >26

Ukuran ookista (µm) <45 50-60

Sporozoit di kelenjar nyamuk (hari setelah

infeksi)

13-14 Tergantung suhu

Rata-rata diameter pre-eritrosit skizon (µm) 27 45-60

Durasi siklus pre-eritrosit (jam) 48-52 6-15 hari

Durasi siklus aseksual di dalam darah (jam) 22-24 48-72

Waktu perkembangan gametosit (jam) 26-30 48 jam-12 hari

Waktu perkembangan ookinet (jam) 18-24 12-24

Mikrogamet (µm) 15 16-25

Sporozoit (µm) 11-12 10-14

Ookinet (µm) 10-12 11-20

3) Fase fertilisasi dan perkembangan zigot di tikus.

Hanya gametosit matur yang dapat berkembang pada midgut nyamuk. Ini

melibatkan pelepasan aktif gametosit dari sel darah merah. Gametosit betina

Page 32: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

berdiferensiasi menjadi tunggal, sferis gamet betina (makrogamet), sedangkan

gametosit jantan memproduksi delapan gamet.

4) Fase Ookista dan sporozoit.

Ookista yang matur dan motil melewati epitel midgut nyamuk dengan menginvasi

sel epitelium dan berdiam diantara dasar membran sel dengan lamina basal

dinding midgut nyamuk (Leids Universitair Medisch Centrum, 2008).

7. Mencit Swiss

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Kelas : Mammalia

Ordo : Rodentia

Famili : Muridae

Subfamili : Murinae

Genus : Mus

Spesies : Mus Musculus

(Wikipediaa, 2009).

Page 33: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Gambar 6. Mencit Swiss (Sumber : Dokumentasi pribadi, 2009)

Hasil sekuensi genom Mus musculus yang selesai pada tahun 2002 menyebutkan

genom haploid Mus musculus panjangnya mencapai 3 miliar basa, yang mirip dengan

genom pada manusia (Wikipediaa, 2009).

Mus musculus cukup sensitif terhadap infeksi parasit dan memiliki reaksi

pengobatan yang cukup baik, serta mencit ini relatif lebih tahan terhadap infeksi

Plasmodium berghei daripada strain yang lain meskipun tidak diobati (Suwarni et al.,

1994).

8. Klorokuin

Klorokuin ditemukan pada tahun 1934 oleh seorang berkebangsaan Jerman, Hans

Andersag (CDC, 2004). Klorokuin merupakan obat pilihan dalam pengobatan dan

kemoprofilaksis malaria yang disebabkan P.vivak, P.malariae, P.ovale, P.falciparum,

yang bekerja pada fase eritrosit aseksusal (Emiliana, 2008).

Hingga saat ini, klorokuin masih merupakan drug of choice (obat pilihan) dalam

penanganan infeksi malaria, namun untuk pengobatan akibat P.falciparum peranannya

Page 34: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

mulai tergantikan akibat timbulnya resistensi secara luas terhadap klorokuin, salah satu

sebab resistensi ini adalah mutasi pada gen pfcrt dan pfmdr1, yaitu gen yang mengkode

protein transmembran dalam vakuola makanan sehingga adanya mutasi ini menyebabkan

konsentrasi klorokuin dalam vakuola makanan menjadi berkurang (Djimde et al., 2001;

White, 2003).

B. KERANGKA PEMIKIRAN

Plasmodium berghei ANKA

Page 35: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Keterangan : menghambat

C. HIPOTESIS

Ekspresi gen TNF-α pada mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dan diterapi

kombinasi klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus menunjukkan hasil yang lebih baik

(mempunyai kadar TNF-α yang lebih rendah) dibanding mencit yang diinfeksi Plasmodium

Parasite-Red Blood Cell (P-RBC)

ruptur

· Pengeluaran merozoit · Pengeluaran toksin

TNF-α

Komplikasi Fatal (Serebral malaria, Anemia, dlll)

Cytoadherence & Rosetting

Mortalitas & Morbiditas

Klorokuin + serbuk Lumbricus rubellus (Lumbrokinase, Lumbrofibrin, Lumbricin I, ?

Page 36: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

berghei ANKA dan diterapi klorokuin; dan diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dan

diterapi Lumbricus rubellus.

Page 37: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

BAB III

METODE PENELITIAN

A. JENIS PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik.

B. LOKASI PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret Surakarta dan Laboratorium Biomedik Terpadu (berbasis

molekuler) Fakultas Kedokteran UNS.

C. SUBYEK PENELITIAN

Subyek penelitian ini adalah Mencit Swiss yang diinfeksi Plasmodium berghei ANKA.

Mencit Swiss sebanyak 25 ekor (akan dibagi ke dalam 5 kelompok, masing-masing

kelompok terdiri dari 5 ekor mencit) didapatkan dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan

(UPHP) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, sedangkan biakan Plasmodium berghei

ANKA didapatkan dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta.

D. TEKNIK SAMPLING

Teknik yang digunakan untuk pengambilan sampel mencit ini adalah Purposive Sampling,

dengan restriksi (pembatasan) sebagai berikut:

1) Jenis mencit : Mencit Swiss

2) Umur mencit : 3 bulan

3) Berat badan mencit : + 20-30 gram

4) Jenis kelamin mencit : Jantan

Page 38: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

E. IDENTIFIKASI VARIABEL PENELITIAN

1. Variabel Bebas:

a. Plasmodium berghei ANKA

b. klorokuin tablet

c. serbuk Lumbricus rubellus

2. Variabel Tergantung:

a. derajat parasitemia

b. ekspresi gen TNF-α

3. Variabel Perancu (Confounding Factor) :

a. Dapat dikendalikan :

1) Spesies mencit

2) Umur mencit

3) Suhu ruangan

4) Infeksi sekunder (infeksi akibat bakteri, virus, jamur, dll)

5) Ketelitian pengamatan

b.Tidak dapat dikendalikan :

1) Variasi genetik

2) Metabolisme mencit

F. DEFINISI OPERASIONAL

1. Plasmodium berghei ANKA

Sampel P. berghei didapatkan dari Lab. Parasitologi UGM berupa biakan dalam 1

ekor mencit Swiss. Darah diambil setelah parasitemia mencapai 30-40%. Selanjutnya

Page 39: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

parasit dikultur pada 5 ekor mencit donor untuk memperbanyak sampel. Setelah

parasitemia pada 5 ekor mencit donor tersebut mencapai 30-40% (±107parasit), maka

darah mencit tersebut digunakan sebagai sumber pembuatan inokulum.

2. Klorokuin

Klorokuin tablet ditentukan dosisnya dengan dikonversikan terhadap berat badan

mencit (lihat Lampiran 1), dosis pada manusia mengacu pada Syarif, dkk (2007).

Hari I : 600 mg x 0.0026 = 1.56 mg

Hari II : 600 mg x 0.0026 = 1.56 mg

Hari III : 300 mg x 0.0026 = 0.8 mg

Klorokuin diencerkan dengan aquadest (1.56mg/250µl aquades), diberikan per oral

dengan sonde (Wijayanti, 2003).

3. Serbuk Lumbricus rubellus

Serbuk Lumbricus rubellus yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan

produk dari Dawa’aul Yum, Surakarta, dalam bentuk kapsul masing-masing 200 mg.

Dosis serbuk cacing ditentukan dengan cara dikonversikan terhadap berat badan

mencit. Dosis didasarkan pada perhitungan dosis manusia yaitu 3000 mg, 4000 mg, 5000

mg. Dosis yang akan diterapikan selanjutnya dikonversi ke dosis mencit yang dikalikan

0,0026 (Lampiran 1). Sehingga kelompok III dan IV mendapat dosis sebesar 3000 mg x

0,0026 = 7,8 mg.

Serbuk Lumbricus rubellus yang akan diberikan kepada mencit diseduh terlebih

dahulu dengan air panas, ditunggu hingga serbuk Lumbricus rubellus larut kemudian

diberikan per oral dengan menggunakan sonde.

Page 40: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

4. Ekspresi Gen TNF-α

Total RNA diambil dari organ hati dengan cara isolasi total RNA, kemudian

dilakukan RT-PCR, dan elektroforesis. Hasil yang didapatkan dari elektroforesis berupa

gambaran pita-pita band di foto kemudian hasil foto di-scanning dan diolah dengan

menggunakan ATTO Software. Hasilnya berupa gambaran % ekspresi gen TNF-α secara

kuantitatif. Skala variabel : rasio.

5. Variabel perancu

Jenis mencit : Mencit Swiss. Skala variabel : nominal

Umur mencit : 3 bulan. Skala variabel : interval

(Keduanya dikendalikan dengan restriksi pada waktu pengambilan sampel)

Infeksi sekunder oleh organisme selain Plasmodium berghei ANKA dicegah

dengan tindakan yang aseptik pada saat inokulasi dan pada waktu terapi per oral. Selain

itu juga dengan menjaga kebersihan kandang mencit. Stres mencit dikendalikan dengan

adaptasi mencit sebelum pemberian perlakuan.

Page 41: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

G. ALUR PENELITIAN

P. berghei ANKA diinokulasikan ke Mencit Swiss dan diberi perlakuan

Mencit Swiss

P. berghei ANKA dalam darah mencit donor dari UGM

P. berghei diperbanyak dalam 5 ekor mencit donor

III V

Diambil sampel dari organ hati

Isolasi total RNA

RT-PCR β-actin RT-PCR TNF-α

Elektroforesis dan visualisasi

fotograf

I II IV

Analisis ekspresi gen TNF-α dengan ATTO software

Analisis statistik Kruskal Wallis

Page 42: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Keterangan:

Kelompok I : tanpa perlakuan

Kelompok II : mencit diinfeksi Plasmodium berghei ANKA tanpa diberikan terapi

Kelompok III : mencit diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dengan diberikan terapi

klorokuin

Kelompok IV : mencit diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dengan diberikan terapi

klorokuin dan Lumbricus rubellus

Kelompok V : mencit diinfeksi Plasmodium berghei ANKA dengan diberikan terapi

Lumbricus rubellus

H. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

a. Pemeliharaan mencit : kandang mencit, ram kawat, alas kandang, tempat

makanan, tempat minuman, sikat.

b. Perlakuan pada mencit : gunting tajam, gelas objek, spuit 3 ml, spuit 1 ml, jarum

suntik G22, mikroskop binokuler, minyak emersi, pipet tetes, kanula/sonde,

stereofoam, timbangan digital Ohauss, gelas beker, tabung flacon, porselen

penggerus obat, label, tisu, lap.

c. Pengambilan data : silinder tertutup tembus pandang, sarung tangan, gunting

tajam, aluminium foil, pinset, pins fiksasi, spuit 3 ml dan jarum suntik G22.

d. PCR : Mesin thermal Cycler, Tabung ependorf 0,2 ml atau 1,5 ml, mikropipet,

Tip Pipet, Vortex, Mesin Sentrifugasi, Rak

e. Satu set alat elekotroforesis

Page 43: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

f. Analisis data : ATTO software.

2. Bahan

a. Plasmodium berghei ANKA

b. Serbuk klorokuin difosfat

c. Serbuk cacing tanah Lumbricus rubellus

d. Pakan mencit (pelet BR-1)

e. RPMI 1640 (zat pengencer)

f. Eter

g. Heparin

h. Cat giemsa

i. Minyak emersi

j. PBS formalin 10%

k. Reagen TRIzol

l. Kloroform

m. Alkohol 70%

n. Larutan SDS 0,5%

o. Deoxynucleoside triphosphates (dNTP)

p. Buffer PCR (10mM Tris, 50 mMKCL, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatin, 0,01

NP40, 0,01% Tween 20, 0,01% Triton X-100)

q. Dithiothreitol

r. Dietilpirokarbonat

s. DDW (De-ionized Distilled Water)

Page 44: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

t. Mineral oil

u. Antikoagulan EDTA

v. Air mineral galon

w. Taq polymerase

x. Oligonukleotida (primer)

y. Buffer TAE

z. Ethidium bromide (10 mg/ml)

aa. Agarose

bb. DNA ladder

cc. Loading dye

dd. Satu pasang Primer gen TNF-α

ee. Satu pasang Primer β-actin

I. CARA KERJA

1) Kultur Plasmodium berghei in vivo ( perbanyakan parasit)

a) Darah donor sebanyak ±1 ml (dari seekor mencit donor dari UGM) yang

mengandung ±107 parasit diinokulasikan terhadap 5 ekor mencit donor, masing-

masing 0,2 ml secara intra peritoneal.

b) Diamati derajat parasitemia mulai hari ke-4 post infeksi. Darah diambil dengan

memotong ujung ekor mencit.

c) Setelah derajat parasitemia mencapai 30-40% (6-7 hari post infeksi), mencit

dimatikan dengan inhalasi eter.

Page 45: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

d) Mencit diletakkan pada styrofoam, kemudian dibuka kulit di daerah thorax, dibuka

diafragma, perhatikan jantung yang masih berdenyut.

e) Dilakukan cardiac puncture terhadap ventrikel sinister dengan spuit 3ml dan jarum

suntik G22.

f) Didapatkan masing-masing 1,2-1,5 ml darah mencit donor yang mengandung

Plasmodium berghei, kemudian dimasukkan ke tabung reaksi bersamaan heparin

dengan perbandingan 90% : 10%.

g) Semua darah dicampur untuk homogenisasi jumlah parasit.

h) Darah diinokulasikan menggunakan spuit 1 ml pada mencit uji masing-masing 0,2

ml.

2) Perlakuan terhadap Mencit

a) Mencit uji diinokulasi dengan darah yang mengandung Plasmodium berghei ANKA

sebanyak 0.2 ml (mengandung ±107 Plasmodium berghei stadium eritrositik),

kemudian dicampur dengan RPMI 1640 untuk pengenceran. Inokulasi dilakukan

secara intra peritoneal menggunakan spuit 1 ml dan jarum suntik G22.

b) Pemberian perlakuan berbeda-beda sesuai kelompok

Kelompok I : tanpa perlakuan

Kelompok II : tanpa terapi (hanya diinfeksi Plasmodium berghei ANKA)

Kelompok III : diterapi dengan klorokuin per oral menggunakan sonde, dosis 1.56

mg pada hari pertama dan kedua pasca infeksi, kemudian 0.8 mg

pada hari ke-3 pasca infeksi.

Kelompok IV : diterapi dengan kombinasi klorokuin (dosis sama seperti kelompok

III) dan ekstrak Lumbricus rubellus 7.8 mg

Page 46: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Kelompok V : diterapi dengan ekstrak Lumbricus rubellus 7.8 mg

3) Penentuan Parasitemia

Diperiksa dengan membuat sediaan apus darah tipis dari ujung ekor mulai hari ke-4

post infeksi

a) darah diambil dengan memotong ujung ekor mencit (1 mm)

b) darah diteteskan pada gelas obyek, kemudian diapus dengan gelas obyek yang lain,

dan dikeringkan pada suhu kamar

c) kemudian gelas obyek digenangi dengan cat giemsa selama ± 45 menit, lalu dicuci

pada air mengalir, dan dikeringkan pada suhu kamar

d) Apusan darah diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan

minyak emersi. Dilakukan pemeriksaan pada tiga lapang pandang yang

mengandung ± 200 eritrosit, dengan susunan tidak menumpuk, dihitung eritrosit

terinfeksi parasit per 1000 eritrosit, berdasarkan rumus:

Derajat parasitemia = P-RBC X 100%

(P-RBC + RBC normal)

4) Pengambilan Sampel Hati

a) Setelah derajat parasitemia mencit uji mencapai 30-40% (± 6 hari post infeksi),

mencit semua kelompok dimatikan dengan cara diletakkan dalam wadah tertutup

yang sudah ditetesi eter.

b) Mencit diletakkan terlentang dan difiksasi.

c) Perut dibuka, organ hati diambil dan dipotong 1 g untuk diisolasi total RNA-nya.

5) Pemeriksaan ekspresi gen TNF-α dan β-actin

Page 47: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

a. Ekstrasi RNA (Lampiran 2, 3, dan 4)

1) Homogenasi

Homogenasi dilakukan dengan menggunakan 1 ml reagen TRIzol untuk 1 g

jaringan dengan memakai power homogenizer. Volume sampel tidak lebih

dari 10% volume reagen TRIzol. Homogenasi dilakukan dengan kecepatan

12,000 x g selama 10 menit, diulang 3 kali, hingga seluruh jaringan hancur.

2) Fase Separasi

a) Sampel yang sudah dihomogenasi diinkubasi selama 5 menit pada suhu

ruang agar kompleks Nukleoprotein terdisosiasi secara sempurna.

b) Kloroform sebanyak 0,2 ml per 1 ml reagen TRIzol dimasukkan ke

dalam tabung.

c) Tabung ditutup dengan kencang dan dikocok secara kuat selama 15

detik.

d) Tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit.

e) Sentrifugasi sampel tidak lebih dari 12.000 x g selama 15 menit pada

suhu 20 C.

f) Selama sentrifugasi, campuran akan terpisah menjadi berwarna merah

pada bagian bawah, fase fenol-kloroform, interfase, dan paling atas

adalah aqueous yang tidak berwarna. Volume dari fase aqueous sekitar

60% dari total volume TRIzol yang digunakan untuk homogenisasi.

3) Presipitasi RNA

Page 48: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

a) Fase aqueous dipindahkan ke tabung yang baru.

b) Presipitasi RNA dari fase aqueous dengan mencampurkannya dengan

alkohol isopropil.

c) Alkohol isopropil yang digunakan sebanyak 0,5 ml tiap 1 ml reagen

TRIzol.

d) Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan disentrifugasi

pada 12.000 x g selama 10 menit pada suhu 20 C.

e) Presipitat RNA sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi, bentuknya gel

seperti pelet pada tepi dan dasar tabung.

4) Pencucian RNA

a) Supernatan diambil.

b) Pelet RNA dicuci sekali dengan etanol 75% (1 ml etanol 75% untuk tiap 1

ml reagen TRIzol).

c) Sampel diaduk dan disentrifugsi pada 7500 x g selama 5 menit pada suhu

20 C.

5) Pemisahan RNA

a) Pelet RNA dikeringkan selama 5-10 menit dengan membiarkannya di

udara atau menggunakan vacum. Pengeringan RNA dilakukan secara

perlahan-lahan.

b) Saring RNA dalam larutan 0,5% SDS dengan cara melewatkan larutan

beberapa saat melalui pipette tip dan diinkubasi selama 10 menit pada

suhu 550 C.

Page 49: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

6. Penentuan konsentrasi RNA menggunakan spektrofotometer dengan OD 260

didapatkan konentrasi RNA 40 µg/µl.

b. RT-PCR

mRNA yang didapat diubah menjadi cDNA, untuk selanjutnya dilakukan RT-

PCR. Langkah-langkah dalam reaksi reverse transcriptase (RT) adalah sebagai

berikut:

1) Komponen-komponen berikut dicampur dalam tabung Eppendorf :

a) mRNA yang akan diamplifikasi: 100 ng RNA total.

b) Primer : 50 pmol primer

TNF-α (sense: 5’-AAG CCT GTA GCC CAT GTT GT-3’ dan antisense:

5’-CAG ATA GAT GGG CTC ATA CC-3’), β-actin (sense: 5’-CCA

GAG CAA GAG AGG CAT CC-3’ dan antisense: 5’-GTG GTG GTG

AAG CTG TAG CC-3’).

c) dNTP : masing-masing 500 µM

d) 1x buffer PCR enzim transkriptase balik (2 µl)

e) Dithiothreitol : 1 mM (konsentrasi final)

f) Penghambat RNase: 2-5 unit

g) Ditambahkan dietilpirokarbonat, untuk membuat volume akhir menjadi

20 µl.

2) Inkubasi pada suhu 370 C selama 1 jam

Setelah reaksi transkripsi balik selesai, PCR dapat dilakukan dengan cara

sebagai berikut :

Page 50: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

a) Tempat untuk PCR dan mikropipet dibersihkan dengan menggunakan

alkohol 70%.

b) Peralatan yang diperlukan dipersiapkan seperti: Ice box, tip (steril),

mikropipet 10 µl dan 200 µl, tabung PCR (0,2 ml)

c) Solution yang akan digunakan dipersiapkan yang, terdiri atas

(1)cDNA sebagai template

(2) PCR Kit

PCR Kit yang digunakan adalah SuperScriptTM III One Step RT-PCR

System with Platinum® Taq DNA Polymerase dengan merk Invitrogen,

yang terdiri dari:

1. Platinum® Taq Mix (50 µL)

2. 2X reaction mix (terdiri dari o,4 mM dari setiap dNTP; 3.2 mM

MgSO4) (1 µL)

3. 5-mM Magnesium Sulfate (500 µL)

(3) Primer

Primer sekuen yang digunakan adalah TNF-α (sense: 5’-AAG CCT

GTA GCC CAT GTT GT-3’ dan antisense: 5’-CAG ATA GAT GGG

CTC ATA CC-3’), β-actin (sense: 5’-CCA GAG CAA GAG AGG

CAT CC-3’ dan antisense: 5’-GTG GTG GTG AAG CTG TAG CC-3’).

d) Proses PCR untuk TNF-α adalah sebagai berikut :

(1) Larutan 2x PCR Master mix (25 µl) dimasukan ke dalam tabung PCR.

(2) DNA template (1 µl) dan primer sense (1 µl), antisense (1 µl) dimasukan

ke dalam tabung PCR.

Page 51: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

(3) Superscript (2 µl) dimasukan ke dalam tabung PCR.

(4) DDW (De-ionized Distilled Water) (2 µl) dimasukan ke dalam tabung

PCR.

(5) Pippeting seluruh reaksi dilakukan secara perlahan dengan menggunakan

mikropipet (100 µl), jangan sampai terbentuk gelembung udara.

(6) Mineral Oil (18 µl) ditambahkan untuk mencegah penguapan selama

proses PCR.

(7) Sampel diletakkan pada mesin PCR dan amplifikasi dilakukan dengan

kondisi sebagai berikut :

Sintetis cDNA 550 C (30’)

Denaturasi 940 C (2’)

Amplifikasi PCR

Denaturasi 940 C (15”)

Annealing 600 C (1’) 35 siklus

Extention 680 C (1’)

Extra Extention 680 C (5’)

(8) Setelah PCR selesai, sampel hasil PCR kemudian disimpan dalam lemari

es 40 C sebelum kemudian di-loading pada Agarose Gel Elektroforesis

untuk visualisasi DNA yang terbentuk.

e) Proses PCR untuk β-actin adalah sebagai berikut :

dilakukan PCR terhadap β-actin sebab β-actin adalah housekeeping genes

dimana housekeeping genes didefinisikan sebagai gen yang ada di semua

jaringan untuk menjaga fungsi selular. Housekeeping genes berfungsi untuk

Page 52: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

menormalkan variasi yang ada diantara sampel, dan β-actin sudah secara luas

digunakan sebagai housekeeping genes (de Kok et al., 2005; Ferrari &

Aitken., 2006; Selvey et al., 2008).

(1) Larutan 2x PCR Master mix (25 µl) dimasukan ke dalam tabung PCR.

(2) DNA template (1 µl) dan primer sense (1 µl), antisense (1 µl) dimasukan

ke dalam tabung PCR.

(3) Superscript (2 µl) dimasukan ke dalam tabung PCR.

(4) DDW (De-ionized Distilled Water) (2 µl) dimasukan ke dalam tabung

PCR.

(5) Mineral Oil (18 µl) ditambahkan untuk mencegah penguapan selama

proses PCR.

(6) Pippeting seluruh reaksi dilakukan secara perlahan dengan menggunakan

mikropipet 100 µl, jangan sampai terbentuk gelembung udara.

(7) Sampel dimasukkan pada mesin PCR dan amplifikasi dilakukan dengan

kondisi sebagai berikut :

Sintesis cDNA 550 C (30’)

Denaturasi 940 C (2’)

Amplifikasi PCR

Denaturasi 940 C (15”)

Annealing 600 C (1’) 30 siklus

Extention 680 C (1’)

Extra Extention 680 C (5’)

Page 53: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

(8) Setelah PCR selesai, sampel hasil PCR kemudian disimpan dalam lemari

es 40 C sebelum kemudian di loading pada Agarose Gel Elektroforesis

untuk visualisasi DNA yang terbentuk.

f) Proses PCR masing-masing kelompok dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Elektroforesis

Untuk analisis semikuantitatif, 15 µl dari tiap produk PCR di-running pada 1.5%

agarose gel, dengan staining ethidium bromide dan dibuat foto.

1) Persiapan Agar

a) 1XTBE buffer (200 ml) disiapkan dalam gelas Erlenmeyer.

b) Agarose (0,2 gr) ditimbang.

c) Agarose dimasukkan ke dalam TBE buffer.

d) Microwave oven dinyalakan pada suhu 90-100OC dan secara berkala

gelas digoyang-goyangkan agar campuran merata dan agar tidak ada yang

terbuang saat mendidih.

e) Dinginkan pada suhu kamar setelah mendidih

f) Saat suhu mulai dingin, SYBR (20 µl) dimasukkan ke dalam campuran,

dan gelas digoyang-goyangkan agar merata.

2) Persiapan Pembuatan Gel

a) Persiapan peralatan pembuatan gel dan sisir yang akan digunakan.

b) Sisir diapsang pada posisi yang dikehendaki.

c) Campuran agar dituang ke dalam bak pembuatan gel, sampai sedikit di

atas pangkal jari-jari sisir.

Page 54: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

3) Persiapan elektroforesis

a) Persiapan alat-alat elektroforesis (bak, penutup, kabel daya)

b) Gel ditempatkan pada wadahnya di bak elektroforesis

c) 0.5XTBE buffer (sebagai elektroforesis buffer) dituangkan sampai sedikit

di atas permukaan gel (sekitar 300 mL 0.5 XTBE buffer)

d) Kabel disambungkan sesuai kutubnya, set voltase dari durasi waktu sesuai

target

e) Daya dinyalakan untuk melihat bahwa alat bekerja dengan baik.

Tandanya : timbul gelembung pada kutub negatif (hitam) yang bergerak

ke atas dan menuju ke kutub positif

f) Setelah alat dipastikan, daya listrik dimatikan lagi.

4) Persiapan loading sampel

a) Persiapan tabung-tabung kecil, isi dengan sampel 5 µL (produk PCR) +

1µL loading-dye

b) Ladder DNA (DNA marker) disiapkan sebanyak 5 µL + 1 µL loading dye

c) Marker dan sampel dimasukkan, mulai dari lubang paling kiri untuk

marker, dan berturut-turut ke kanan sample no 1, 2, 3, dst

d) Setelah semua sampel terisikan, bak elektroforesis ditutup dengan penutup

e) Sambungan kabel daya dipasang kembali

f) Daya dinyalakan, dilihat timbulnya gelembung seperti saat mencoba

sebelum dipakai

g) Setelah timbul gelembung, berarti proses elektroforesis sudah berjalan

Page 55: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

h) Suhu elektroforesis diperhatikan, kalau panas meninggi dan timbulnya

gelembung perlahan, harus diturunkan voltasenya

i) Sampel akan bergerak, dengan indikator pergerakan loading-dye

j) Setelah loading-dye bergerak cukup mendekati kutub positif,

elektroforesis dihentikan.

5) Persiapan pengambilan hasil

a) Gel diambil dari bak elektroforesis

b) Ditempatkan pada tempat pemotretan

c) Lampu UV dinyalakan

d) Posisi gel diatur pada posisi yang tepat

e) Setelah tercapai posisi yang tepat, gambar diambil dengan kamera digital

f) Gambar yang diperoleh diolah sesuai kebutuhan

d) Analisis ekspresi gen

Untuk kualifikasi, fotograf hasil PCR tersebut di-scanning dengan INH software.

Untuk setiap sampel, produk dari PCR tersebut dibandingkan terhadap ekspresi

β-actin mRNA sehingga didapatkan nilai yang akurat dan valuable dari produk

PCR tersebut.

J. ANALISIS DATA

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji Anova

dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test untuk membandingkan perbedaan mean antar

kelompok. Jika data tidak memenuhi syarat untuk uji one-way Anova, sebaran data tidak

normal (p< 0,05) dan varians data tidak sama meskipun sudah ditransformasi, digunakan uji

Page 56: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

alternatifnya yaitu uji Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih dari dua

kelompok. Dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney, untuk membandingkan

perbedaan mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release 16.0

Page 57: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

BAB IV

HASIL PENELITIAN

Pengambilan data derajat parasitemia dan % ekspresi gen TNF-α telah dilakukan di

Laboratorium Parasitologi dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UNS pada tanggal

8 Juni 2009 – 28 Oktober 2009.

A. Derajat Parasitemia

Pada tanggal 15 Oktober 2009, semua mencit (kecuali kelompok I) diinokulasi

Plasmodium berghei ANKA dengan konsentrasi parasitemia 106/ 200 µl, untuk kemudian

tanggal 19 Oktober (saat semua parasit telah menginvasi dan berkembang di dalam eritrosit

mencit) dimulai pengecekan derajat parasitemia selama 4 hari (hingga mencit pada kelompok II

mati semua).

Derajat parasitemia dihitung dengan mengambil apusan darah tipis yang diambil dari

ujung ekor mencit. Preparat apusan darah tipis ini kemudian dicat dengan giemsa dan diamati di

bawah mikroskop binokuler dengan perbesaran 1000x. didapatkan gambaran apusan darah tipis

(Gambar 7).

Pengamatan derajat parasitemia dilakukan pada 3 lapang pandang per slide kemudian dihitung

berdasarkan rumus :

Derajat parasitemia = P-RBC X 100%.

(P-RBC + RBC normal)

Page 58: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Gambar 7. Infeksi Plasmodium berghei ANKA pada eritrosit. ( ) Plasmodium berghei sediaan darah tipis fase trofozoit. (Sumber : Dokumentasi pribadi, 2009).

Dari hasil pengamatan derajat parasitemia didapatkan data sebagai berikut :

Tabel 3. Rata-rata derajat parasitemia untuk setiap kelompok perlakuan Derajat parasitemia (%)

Hari ke-

Kelompok I (tidak diberi perlakuan)

Kelompok II (infeksi P.berghei)

Kelompok III (infeksi P.berghei + Klorokuin)

Kelompok IV (infeksi

P.berghei + Klorokuin dan

L. rubellus)

Kelompok V (infeksi

P.berghei + L. rubellus)

1 - 19,180 9,900 6,400 31,530

2 - 35,780 8,225 5,790 48,200

3 - 50,200 7,836 5,530 49,760

4 - 68,540 7,030 5,610 51,520

Rata-

rata

- 43,425 8,247 5,832 45,252

Page 59: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Gambar 8. Grafik rata-rata derajat parasitemia setiap kelompok perlakuan.

B. Ekspresi Gen TNF-α

Ekspresi gen TNF-α dinyatakan dalam persentase (%). Untuk melihat ekspresi gen TNF-

α diambil 3 sampel (berupa organ hati) pada setiap kelompok. Sampel kemudian di isolasi RNA,

RT-PCR dan elektroforesis. Hasil elektroforesis dianalisis semikuantitatif menggunakan ATTO

software, dan dirasio terhadap ekspresi β-actin. Hasil akhir berupa ekspresi gen TNF-α dalam

bentuk persentase (Lampiran 5). Rata-rata % ekspresi gen TNF-α pada setiap kelompok

perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4 dan Gambar 9.

Kemudian dilakukan uji parametrik (one-way ANOVA) untuk melihat adanya perbedaan

antar kelompok. Tetapi, syarat untuk uji parametrik one-way ANOVA tidak terpenuhi (sebaran

data tidak normal) (Tabel 5), maka dilanjutkan dengan uji non-parametrik (Kruskal Wallis).

Hasil uji Kruskal Wallis memberikan nilai p< 0.05 yang berarti paling tidak ada dua kelompok

yang memiliki perbedaan bermakna.

Page 60: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Tabel 4. Rata-rata % ekspresi gen TNF-α pada setiap kelompok perlakuan.

% ekspresi TNF-α No Kelompok PCR 1 PCR 2 PCR 3

Rata-rata

1 I 2,00 1,00 2,90 1,96

2 II 99,00 100,00 100,00 99,66

3 III 49,00 45,00 44,10 46,03

4 IV 21,00 24,00 21,60 22,20

5 V 51,00 41,00 48,00 46,60

Gambar 9. Grafik rata-rata % ekspresi gen TNF-α pada setiap kelompok perlakuan

Untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan bermakna dilanjutkan dengan uji

Mann-Whitney, adanya perbedaan bermakna antar kelompok ditunjukkan dengan nilai p< 0,05.

Page 61: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Berikut ini disajikan tabel uji normalitas (untuk lebih lengkapnya lihat Lampiran 6), uji Kruskal

Wallis (Lampiran 7), dan uji Mann-Whitney (Lampiran 8) antar kelompok:

Tabel 5. Hasil Uji Normalitas

Kelompok Nilai Uji Normalitas

I 0,942

II 0,000

III 0,331

IV 0,363

V 0,567

Pada kelompok II data tidak memiliki sebaran normal, sehingga dilanjutkan dengan uji non-

parametrik (Kruskal-Wallis).

Tabel 6. Hasil Uji Kruskal Wallis

Test Statisticsa,b

Ekspresi

Asymp. Sig. .012

a. Kruskal Wallis Test

Tabel 7. Hasil Uji Mann Whitney

Hasil Uji Kruskal Wallis memberikan nilai p< 0.05 yang berarti paling tidak terdapat dua

kelompok yang memiliki perbedaan bermakna untuk mengetahui kelompok mana yang

memiliki perbedaan bermakna dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney.

Hasil uji Mann-Whitney menunjukkan bahwa antar kelompok pada penelitian ini memiliki

perbedaan yang signifikan, yang ditunjukkan dengan nilai p< 0,05.

Page 62: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

No Kelompok Hasil uji Mann-Whitney Keterangan

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I-II

I-III

I-IV

I-V

II-III

II-IV

II-V

III-IV

III-V

IV-V

-1.993

-1.964

-1.964

-1.964

-1.964

-1.993

-1.993

-1.964

-.218

-1.964

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Signifikan

Page 63: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

BAB V

PEMBAHASAN

Dalam penelitian ini diamati dua parameter yaitu derajat parasitemia dan analisis gen

TNF-α. Mencit sebanyak 25 ekor dibagi ke dalam 5 kelompok, dimana masing-masing

kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Setelah mencit diinfeksi Plasmodium berghei ANKA,

diamati derajat parasitemianya dengan cara mengambil apusan darah dari ujung ekor mencit.

Derajat parasitemia tertinggi didapatkan pada kelompok II, dimana mencit hanya diinfeksi

Gambar 10. Gambaran elektroforesis ekspresi gen TNF-α dibandingkan dengan ekspresi β- actin yang berfungsi menormalkan variasi diantara sampel pada organ hati. Gambar terbawah merupakan ekspresi gen TNF-α secara kuantitatif. Ket: Thr – (Thromboles – atau Lr.rubellus -) Thr + (Thromboles + atau Lr.rubellus +)

Page 64: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

oleh Plasmodium berghei ANKA dan tidak diberikan terapi apapun. Derajat parasitemia

yang tinggi menunjukkan seberapa luasnya infeksi malaria ke dalam eritrosit. Eritrosit yang

rusak akibat pecahnya skizon, akan mengeluarkan toksin dan merozoit. Toksin dan merozoit

akan menginduksi sitokin pro-inflamasi dari sel-sel seperti makrofag, endotelium, dll.

Eritrosit yang rusak menyebabkan timbulnya banyak komplikasi pada malaria, seperti

anemia berat, blackwater fever, dan serebral malaria. Komplikasi-komplikasi ini

mempercepat kematian mencit malaria.

Derajat parasitemia pada kelompok III (infeksi Plasmodium berghei ANKA dan terapi

klorokuin) mengalami penurunan setelah diberikan klorokuin. Hal ini menguatkan bahwa

klorokuin efektif untuk membunuh parasit eritrosit aseksual (Emiliana, 2008). Gambaran

parasit pada kelompok III adalah P-RBC fase trofozoit yang mengalami penurunan

jumlahnya. Klorokuin adalah obat antimalaria yang bekerja pada fase eritrosit dan tidak

efektif dalam fase hepatis (Emiliana, 2008). Mencit pada kelompok ini rata-rata dapat

bertahan hidup hingga hari ke-13 pasca diinfeksi Plasmodium berghei. Organ hati pada

kelompok ini ternyata mengalami pembesaran dan berwarna hitam. Pembesaran hati ini

diduga akibat sekuestrasi dan cytoadherence yang menyebabkan obstruksi pada pembuluh

darah di hati dan limpa (Zulkarnain & Setiawan, 2007). Warna hitam pada organ hati

diakibatkan oleh timbunan hemozoin. Sewaktu berada dalam eritrosit, Plasmodium

memetabolisme hemoglobin sebagai sumber energi utama, dari hasil metabolisme ini

dihasilkan partikel heme yang akan terakumulasi dalam partikel-partikel kristal dalam

vakuola-vakuola digestif. Formasi dari partikel-partikel kristal berpigmen inilah yang disebut

hemozoin (Goldberg et al., 1990). Hal inilah yang menjelaskan mengapa mencit pada

kelompok III lebih cepat mati daripada mencit pada kelompok V meskipun gambaran derajat

Page 65: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

parasitemia menunjukkan penurunan. Klorokuin tidak mampu menurunkan kadar sitokin pro-

inflamasi (terlihat pada hasil RT-PCR). Padahal, TNF-α diyakini sebagai penyebab utama

patogenesis komplikasi pada malaria, jadi meskipun parasit di dalam eritrosit banyak yang

mati, tetap saja klorokuin tidak mampu mencegah produksi pro-inflamasi sitokin akibat

toksin malaria (haemozoin, GPI).

Pada kelompok IV, dimana diberikan terapi kombinasi klorokuin dan Lumbricus

rubellus terlihat gambaran yang paling baik. Derajat parasitemia mengalami penurunan

paling tinggi. Mencit pada kelompok ini adalah mencit dengan lama hidup terlama. Saat

dilakukan otopsi organ hati, ditemukan organ hati tidak mengalami pembesaran serta warna

organ ini merah segar (normal). Terapi kombinasi berdasarkan hasil penelitian ini merupakan

terapi yang paling baik untuk mengatasi malaria, selain membunuh parasit eritrosit aseksual

(efek dari klorokuin), kadar TNF-α pun mengalami penurunan (efek dari Lumbricus

rubellus), hal itu ditunjukkan dengan lama hidup mencit dan berhasilnya pencegahan ke arah

komplikasi yang terlihat dari masih bagusnya organ hati dan limpa. Lumbricus rubellus sejak

dulu diketahui memiliki efek antikoagulan dan antiinflamasi (Noda et al., 1992).

Antikoagulan pada Lumbricus rubellus dapat menghidrolisis trombus yang terdapat pada

pembuluh darah, seperti diketahui pada penderita malaria terdapat banyak trombus akibat

proses sekuestrasi, cytoadherence, dan rosetting. Antikoagulan pada Lumbricus rubellus

memiliki aktivitas fibrinolitik yang tinggi serta stabil dalam panas (Woo et al., 1996). Efek

antiinflamasi Lumbricus rubellus diketahui hampir sama seperti efek antiinflamasi yang

dimiliki aspirin (Balamurugan et al., 2006)

Kelompok V dimana mencit yang diinfeksi oleh Plasmodium berghei ANKA diterapi

dengan Lumbricus rubellus saja. Derajat parasitemia mencit pada kelompok ini tidak jauh

Page 66: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

berbeda dengan gambaran pada kelompok II, dimana derajat parasitemia selalu tinggi dan

tidak mengalami penurunan berarti setelah diterapi Lumbricus rubellus. Akibatnya, mencit

pada kelompok ini rata-rata mati bersamaan dengan kelompok dua yaitu pada hari ke-5.

Ketika di otopsi, organ hati mencit masih baik (berwarna merah dan belum mengalami

pembesaran). Hal-hal ini menguatkan bahwa Lumbricus rubellus tidak memiliki efek

membunuh parasit eritrosit (derajat parasitemia tetap tinggi), dan juga Lumbricus rubellus

memiliki efek antikoagulan yang mencegah pembentukan trombus (sekuestrasi,

cytoadherence, rosetting) sehingga gambaran organ hati masih baik.

Parameter kedua dalam penelitian ini adalah ekspresi gen TNF-α. Ekspresi gen TNF-

α ini didapatkan dari organ hati. Pengukuran ekspresi gen TNF-α dilakukan sebanyak 3x dari

setiap kelompok. Pertama-tama, organ hati ini diisolasi terlebih dulu RNA-nya kemudian

dilakukan RT-PCR, lalu hasil RT-PCR dilihat melalui elektroforesis. Hasil elektroforesis

berupa gambaran pita-pita band dianalisis semikuantitatif menggunakan ATTO software.

Ekspresi gen TNF-α pada kelompok III dan kelompok IV memiliki perbedaan yang

signifikan, dengan kelompok IV memiliki kadar ekspresi gen TNF-α yang lebih rendah

dibanding kelompok III. Hal ini membuktikkan bahwa Lumbricus rubellus memiliki peranan

terhadap penurunan kadar ekspresi gen TNF-α. Pada kelompok III kadar ekspresi gen TNF-α

juga lebih rendah dari kelompok II tapi tidak serendah kelompok IV kemungkinan

disebabkan berkurangnya jumlah eritrosit yang rusak. Salah satu penyebab produksi TNF-α

yang berlebihan adalah akibat eritrosit rusak dimana kerusakan ini diakibatkan toksin yang

dikeluarkan saat eritrosit ruptur (Bate & Kwiatkowski., 1994). Dengan pemberian klorokuin

maka secara otomatis jumlah eritrosit yang rusak akan berkurang, yang akhirnya berpengaruh

pada kadar TNF-α.

Page 67: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Ekspresi gen TNF-α pada kelompok IV dan kelompok V memiliki perbedaan yang

signifikan, dengan kelompok IV memiliki kadar ekspresi gen TNF-α yang lebih rendah

dibanding kelompok V. Hal ini membuktikkan bahwa Lumbricus rubellus akan lebih baik

apabila digunakan bersama dengan klorokuin dibanding digunakan sendiri, sebab Lumbricus

rubellus tidak memiliki efek anti parasit (Wardhani, 2008). Hal ini terlihat pada kelompok V

dimana terjadi ketidakseimbangan antara efek antiinflamasi Lumbricus rubellus dengan tetap

banyaknya jumlah eritrosit yang rusak, sehingga kadar TNF-α tidak banyak mengalami

penurunan.

Banyak penelitian dikembangkan untuk mencari obat yang dapat menurunkan kadar

TNF-α, diantaranya pentoxifylline. Hasil studi pada kasus malaria menggunakan

pentoxifylline di beberapa negara menunjukkan kadar TNF-α mengalami penurunan, dan juga

mortalitas malaria menurun. Namun, studi dengan skala lebih kecil justru menunjukkan hasil

yang berkebalikan. Oleh karena itu, penggunaan pentoxifylline sebagai terapi pendukung

dalam malaria masih membutuhkan banyak penelitian lebih lanjut (Delgado et al., 1998).

Selain itu, dikembangkan pula Anti-TNF α monoklonal antibodi. Pada percobaan

klinis dengan dosis single (250, 500, 1000, 2000 units/kg) pada 17 pasien dewasa dengan

malaria falciparum berat ditemukan adanya penurunan gejala-gejala klinik seperti demam.

Akan tetapi, saat percobaan dengan metode double-blind di Gambia ditemukan monoklonal

antibodi ini tidak meningkatkan lama hidup pada pasien-pasien serebral malaria dan terkait

dengan timbulnya sequele-sequele neurologis (Van Hensbroek et al., 1996).

Hingga saat ini masih dibutukan sebuah terapi pendukung malaria yang aman atau

memiliki efek samping minimal, dan dari hasil penelitian ini Lumbricus rubellus ke

depannya berpotensi digunakan sebagai terapi pendukung pada malaria. Selain itu,

Page 68: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Lumbricus rubellus disini memiliki beberapa keunggulan, selain berasal dari alam,

antikoagulan dalam Lumbricus rubellus relatif stabil karena tidak terpengaruh oleh panas

atau asam, hidrofilik, dan tidak terpengaruh oleh tripsin sehingga tidak akan hancur bila

dicerna oleh enzim-enzim pencernaan (Paik et al, 1997). Selain itu, Lumbricus rubellus tidak

seperti klorokuin yang apabila digunakan akan merusak hati (karena timbunan hemozoin).

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Terapi kombinasi klorokuin dan serbuk Lumbricus rubellus pada penderita malaria

menunjukkan hasil yang lebih baik (mempunyai kadar TNF-α yang lebih rendah) dibanding

terapi hanya dengan menggunakan klorokuin atau Lumbricus rubellus saja.

B. Saran

Page 69: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Dapat dilakukan studi lebih lanjut untuk melihat efek terapi kombinasi klorokuin dengan

Lumbricus rubellus terutama mengenai :

1. Pengaruh terapi kombinasi ini terhadap sitokin pro-inflamasi lainnya seperti IL-1, IL-

6, dll.

2. Pengaruh terapi kombinasi ini pada organ otak karena seperti diketahui obstruksi

pembuluh darah pada otak merupakan sebab utama terjadinya serebral malaria.

3. Dilakukan uji kimiawi terhadap Lumbricus rubellus.

Page 70: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

DAFTAR PUSTAKA

Abbas & Lichtman. 2000. Cellular and Molecular Immunology. Philadelphia: Elvesier Saunders.

Afandi, D.; Sampurna, B.; Sutanto, I.; Marwoto, J.W.; Chairani, N.; Himawan, S. et al. 2008.

Autopsy findings in severe malaria – a case report. Med J Indones; 17 : 210-5 Allergy Research Group®. 2008. Lumbrokinase (Hypoallergenic). http://www.

AllergyResearchGroup.com (20 Mei 2009).

Badan Litbang Kesehatan. 2006. Malaria. http://digilib.litbang.depkes.go.id/gdl.php?mod=browser&op=read&id=jkpkbppk-gdl-res-1994-emiliana-785-malaria (27 Mei 2009).

Balamurugan, M.; Prakash, M.; Partasarathi, K.; Cooper, E.L.; Ranganathan, L.S. 2006.

Effect of earthworm paste (Lampito mauriti Kinberg) on the anti-inflammatory, anti-oxidative, haematological and serum biochemical indices of rat (Rattus norvegicus). Evid Based Complement Altern Med. 2: 1-3.

Bate, C.A.W.; Taverne, J.; Playfair, J.H.L. 1988. Malarial parasites induce TNF production

by machrophages. Immunology. 64: 227 Bate & Kwiatkowski. 1994. Stimulators of tumour necrosis factor production released by

damaged erythrocytes. Immunology. 83: 256-261 Center for Disease Control and Prevention. 2004. The impact of malaria, a leading cause of

death worldwide. http://www.cdc.gov/malaria/impact/index.htm (2 Maret 2009). Clark, I.A.; Ilschner, S.; Macmicking, J.D. et al. 1990. TNF and Plasmodium berghei

ANKA-induced cerebral malaria. Immunology Letters 25, 195-198. Clark, I.A.; Budd, A.C.; Alleva, L.M.; Cowden, W.B. 2006. Human Malarial Disease: a

Consequence of Inflammatory Cytokine Release. Malaria Journal. 5:85 De Kok; Roelafs; Giesendorf; Pennings; Waas; Feuth; Swinkels; Span. 2005. Normalization

of gene expression measurements in tumor tissues comparison of 13 endogenous control genes. Laboratory Investigation. 85: 154-159

Delgado; Munoz-Elias; Kan Y; Gozes; Fridkin; Brenneman, et al. 1998. Vasoactive intestinal

peptide and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide inhibit TNF-α transcriptional activation by regulating nuclear factor. kB & cAMP response element binding protein. J Biol Chem. 273: 31427-36

Page 71: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Departemen Kesehatan RI. 2003. Pedoman Tatalaksana Kasus Malaria. Jakarta: Direktorat Jendral PPM&PL Direktorat Pemberantasan Penyakit Bersumber Binatang. pp: 1-3-4.

Djimde, et al. 2001. A molecular marker for chloroquine-resistant falciparum malaria

[abstract]. N Engl J Med. 344(4): 257-63 Earthworm. 2009. Lumbricus genus (assorted species, including: Lumbricus terrestris and

Lumbricus rubellus). http://www.associatedcontent.com/article/454578/raising_earthworms_which_worms_to_choose_pg2.html (11 Februari 2009).

Emiliana. 2008. Malaria Berat. Cermin Dunia Kedokteran no.75. Eurosurveillance. 2007. Dengue worldwide: an overview of the current situation and the

implications for Europe. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?PublicationType=W&Volume=12&Issue=25&OrderNumber=1 (10 Juli 2010).

Ferrari & Aitken. 2006. Mining housekeeping genes with a naïve bayes classifier. BMC

genomics. 7: 277 Gandahusada, S.; Ilahude, H.H.D.; Pribadi, W. 1998. Parasitologi Kedokteran. Jakarta :

Balai Penerbit FKUI. Goldberg, D.E.; Slater, A.F.G.; Cerami, A.; Henderson, G.B. 1990. Hemoglobin degradation

in the malaria parasite Plasmodium falciparum : an ordered process in a unique organelle. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 87, pp. 2931-2935.

Grau, G.E.; Fajardo, L.J.; Piquet, P.F. et al. 1987. Tumour Necrosis Factor (cachectin) as an

essential mediator in murine cerebral malaria. Science 237, 1210-1212. Grau; Taylor; Molyneux; Wirima; Vassalli; Hommel et al. 1989. Tumor necrosis factor and

disease severity in children with falciparum malaria. N Engl J Med 320: 1586-1591 Harijanto, Paul. 2007, ‘Malaria’, in Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Jilid III, ed. Sudoyo,

Setiyohadi, Alwi, Simadibrata, Setiati. Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FK UI, Jakarta.

Hermsen, C.C.; Crommert, J.V.D.; Fredrix, H.; Sauerwein, R.W.; Eling, W.M.C. 1997.

Circulating Tumour Necrosis Factor α is not involved in the development of cerebral malaria in Plasmodium berghei-infected C57BI mice. Parasite Immunology. 19 : 571-577.

Ho & White, N.J. 1999. Molecular mechanisms of cytoadherence in malaria. Am J Physiol

Cell Physiol. 276: 1231-1242

Page 72: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Kayaputri, I.L. 2008. Studi pendahuluan gen pengkode Lumbrokinase dari cacing tanah

Lumbricus rubellus. http://www.prohealth.com/library/showarticle.cfm?id=364&t= (AR)http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse&op=read&id=jbptitbpp-gdl-indiralant-31365 (itb) (23 Mei 2009).

Kremsner; Winkler; Brabdts; Wilding; Jenne; Graninger et al. 1995. Prediction of

accelerated cure in Plasmodium falciparum malaria by the elevated capacity of tumour necrosis factor production. Am J Trop Med Hyg 53: 532-538

Kumar, Sanjeev.; Karnad, D.R.; Vaingankar, Janhavi.; Thatte, U.M.; Krishnan, Anand.;

Rege, N.N. 2003. Serum tumour necrosis factor α levels in severe malaria: effect of partial exchange transfusion. Intensive Care Med 29:1857-1858

Leids Universitair Medisch Centrum. 2008. General Introduction P.berghei Model.

http://www.lume.nl/con/1040/81028091348221/810281121192556/811070740182556/ (13 Maret 2009).

Lou; Lucas; Grau. 2001. Pathogenesis of cerebral malaria: recent experimental data and

possible application for humans. Clin Microbiol Rev 14: 812-820 Loutan; Plancherel; Soulier-Lauper; Pascual; Subilia; Chavrolet, et al. 1992. Serum TNF in

patients with severe malaria treated by exchange transfusion. Trop med Parasitol. 43: 285-6.

Mihara, H.; Sumi, H.; Yoneta, T.; Mizumoto, H.; Ikeda, R.; Seiki M.; Maruyama M. 1991. A

Novel Fibrinolytic Enzyme Extracted from the Eathworm, Lumbricus rubellus . Japan J Physiol (41): 461-462-471.

Miller, L.H.; Baruch, D.I.; Marsh, K.; Doumbo, O.K. 2002. The pathogenic basis of malaria.

Nature. 415:673-679. Mohanty, S.; Patel D.K.; Pati S.S.; Mishra S.S. 2006. Adjuvant therapy in cerebral malaria.

Indian J Med Res 124. pp: 245-260. Murphy GS.; Basri H.; Purnomo; Andersen EM.; Bangs MJ.; Mount DL, et al. 1993. Vivax

malaria resistant to treatment and prophylaxsis with chloroquine. Lancet. 341: 96-100.

Neill, A.L. & Hunt, N.H. 1995. Effects of endotoxin and dexamethasone on cerebral malaria

in mice. Parasitology 111, 443-454. Noda, N.; Tsunefuka, S.; Tanaka, R.; Miyahara, K. 1992. Chem. Pharm. Bull. 40. 2756.

Page 73: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Paik, S.R.; Woo, J.I.; Kim, G.M.; Cho, J.M.; Yu, K.H.; Chang, C.S. 1997. Deoxyribonucleic Acid was Responsible for the Anticoagulatory Effect of an Earthworm, Lumbricus rubellus. J. Biochem. Mol. Biol. Vol. 30. No.1. pp.37-40

Palungkun, R. 1999. Sukses Beternak Cacing Tanah Lumbricus rubellus. Jakarta : Penebar

Swadaya. Perlmann, P & Blomberg, M.T. 2002. Malaria and the Immune System in Humans. Chem

Immunol. Vol.80, pp 229-242. Rosenthal, Philip J. 2008. Artesunate for the Treatment of Severe Falciparum Malaria. The

New England Journal of Medicine. Vol. 358, Iss. 17, pg. 1829. Selvey; Thompson; Matthael; Lea; Irving; Griffiths. 2008. Β-actin- an unsuitable internal

control for RT-PCR. Moleculare Cellular Probes. Vol.15 Issues.5 page 307-311 Suhardjono D. 1995. Percobaan Hewan Laboratorium. Yogyakarta: Gadjah Mada University

Press, hal: 207.

Suwarni ; Tuti, S.; Dewi, R.M.; Marwoto, H.A. 1994. Pengaruh Klorokuin terhadap Jumlah Parasit pada Mencit yang Diinfeksi dengan P.berghei. Cermin Dunia Kedokteran. (96): 60.

Syarif, Amir & Zunilda. 2007, ‘Obat Malaria’, in Farmakologi dan Terapi, ed. Sulistia,

Rianto, Nafrialdi, Elysabeth. Penerbit Gaya Baru, Jakarta. Taverne J.; Bate C.A.W.; Playfair J.H.L. 1989. Induction of TNF in vitro as a model for the

identification of toxic malaria antigens. Lymphokine Res. 8:317-322 Van Hensbroek; Palmer; Onyiorah; Schneider; Jaffar; Dolan, et al. 1996. The effect of

monoclonal antibody to tumor necrosis factor on survival from childhood cerebral malaria. J Infect Dis. 174: 1091-7

Wardhani, Y.F. 2008. Efek Serbuk Cacing Lumbricus rubellus terhadap Lama Hidup dan

Derajat Parasitemia pada Mencit Swiss yang Diinfeksi oleh Plasmodium Berghei. Universitas Sebelas Maret Surakarta. Skripsi.

White, N.J. 2003. Malaria. In: Manson’s Tropical Disease. 21th ed. ELST with Saunders. Wijayanti, M.A. 2003. Efek Imunisasi Terhadap Peningkatan Kadar Interleukin-2 dan

Interferon-γ pada Mencit Swiss selama Infeksi Plasmodium berghei. Berkala Ilmu Kedokteran. 35 (1) : 14-15.

Wikipediaa. 2009. Mus musculus. http://www.en.wikipedia.org/wiki/Plasmodium_berghei (2

Maret 2009).

Page 74: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian

Wikipediab. 2009. Lumbricus rubellus. http://en.wikipedia.org/wiki/Mus_musculus (2 Maret 2009).

Woo, J.I.; ahk, Y.K.; Yu, K.H.; Paik, S.R.; Chang, C.S. 1996. J. Biochem. Mol. Biol. 29. 500 World Health Organisation. 2000. Severe falciparum malaria. Trans R Soc Trop Med Hyg 94

[Suppl 1]: 1-90 Zein, Umar. 2005. Penanganan Terkini Malaria Falciparum. e-USU Repsository Universitas

Sumatera Utara. Zulkarnain & Setiawan. 2007, ‘Malaria Berat’, in Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Jilid III,

ed. Sudoyo, Setiyohadi, Alwi, Simadibrata, Setiati. Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FK UI, Jakarta.

Page 75: PENGARUH TERAPI KOMBINASI KLOROKUIN DAN SERBUK/Pengaruh...Lumbricus rubellus yang memiliki efek fibrinolitik ini banyak digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit inflamasi. Penelitian